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Biology

Hochdurchsatz-Screening mikrobieller Isolate mit Auswirkungen auf die Gesundheit von Caenorhabditis elegans

Published: April 28, 2022 doi: 10.3791/63860
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Division of Biomedical and Life Sciences, Lancaster University
* These authors contributed equally

Summary

Darmmikroben können die Gesundheit ihres Wirts über spezifische oder konservierte Mechanismen positiv oder negativ beeinflussen. Caenorhabditis elegans ist eine bequeme Plattform, um nach solchen Mikroben zu suchen. Das vorliegende Protokoll beschreibt das Hochdurchsatz-Screening von 48 Bakterienisolaten auf Auswirkungen auf die Nematoden-Stressresistenz, die als Proxy für die Gesundheit von Würmern verwendet werden.

Abstract

Mit seiner geringen Größe, kurzen Lebensdauer und einfachen Genetik bietet Caenorhabditis elegans eine bequeme Plattform, um die Auswirkungen mikrobieller Isolate auf die Wirtsphysiologie zu untersuchen. Es fluoresziert auch blau, wenn es stirbt, was eine bequeme Möglichkeit bietet, den Tod zu lokalisieren. Diese Eigenschaft wurde genutzt, um markierungsfreie C. elegans-Überlebenstests (LFASS) mit hohem Durchsatz zu entwickeln. Dabei handelt es sich um die Zeitraffer-Fluoreszenzaufzeichnung von Wurmpopulationen in Multiwell-Platten, aus denen die mediane Todeszeit der Population abgeleitet werden kann. Die vorliegende Studie wendet den LFASS-Ansatz an, um mehrere mikrobielle Isolate gleichzeitig auf die Auswirkungen auf die Anfälligkeit von C. elegans gegenüber starker Hitze und oxidativem Stress zu untersuchen. Eine solche mikrobielle Screening-Pipeline, die insbesondere zum Vorscreening von Probiotika verwendet werden kann, wobei schwere Stressresistenz als Proxy für die Gesundheit des Wirts verwendet wird, wird hier berichtet. Das Protokoll beschreibt, wie sowohl C. elegans-Darmmikrobiota-Isolatsammlungen als auch synchrone Wurmpopulationen in Multiwell-Arrays gezüchtet werden, bevor sie für die Assays kombiniert werden. Das vorgelegte Beispiel umfasst die Prüfung von 47 Bakterienisolaten und einem Kontrollstamm auf zwei Wurmstämme in zwei parallelen Stressassays. Die Ansatzpipeline ist jedoch leicht skalierbar und auf das Screening vieler anderer Modalitäten anwendbar. Somit bietet es ein vielseitiges Setup, um schnell eine multiparametrische Landschaft biologischer und biochemischer Bedingungen zu untersuchen, die sich auf die Gesundheit von C. elegans auswirken.

Introduction

Der menschliche Körper beherbergt schätzungsweise 10-100 Billionen lebende mikrobielle Zellen (Bakterien, Archaeenpilze), die hauptsächlich in der Darm-, Haut- und Schleimhautumgebung vorkommen1. In einem gesunden Zustand bieten diese ihrem Wirt Vorteile, einschließlich Vitaminproduktion, Reifung des Immunsystems, Stimulation angeborener und adaptiver Immunantworten auf Krankheitserreger, Regulierung des Fettstoffwechsels, Modulation von Stressreaktionen und mehr, mit Auswirkungen auf Wachstum und Entwicklung, Krankheitsbeginn und Alterung 2,3,4,5 . Die Darmmikrobiota entwickelt sich auch im Laufe des Lebens erheblich. Die drastischste Entwicklung findet im Säuglingsalter und in der frühen Kindheit statt6, aber auch mit zunehmendem Alter treten signifikante Veränderungen auf, einschließlich einer Abnahme der Bifidobacterium-Häufigkeit und einer Zunahme von Clostridium, Lactobacillus, Enterobacteriaceae und Enterococcus-Arten 7. Der Lebensstil kann die mikrobielle Zusammensetzung des Darms weiter verändern, was zu Dysbiose führt (Verlust nützlicher Bakterien, übermäßiges Wachstum opportunistischer Bakterien), was zu verschiedenen Pathologien wie entzündlichen Darmerkrankungen, Diabetes und Fettleibigkeit führt5, aber auch zu Alzheimer und Parkinson beiträgt 8,9,10,11.

Diese Erkenntnis hat entscheidend dazu beigetragen, das Konzept der Darm-Hirn-Achse (GBA) zu verfeinern, bei der Wechselwirkungen zwischen der Darmphysiologie (die jetzt die darin enthaltenen Mikroben einschließt) und dem Nervensystem als Hauptregulator des tierischen Stoffwechsels und der physiologischen Funktionen angesehen werden12. Die genaue Rolle der Mikrobiota bei der Darm-Hirn-Signalübertragung und die damit verbundenen Wirkmechanismen sind jedoch noch lange nicht vollständig verstanden13. Da die Darmmikrobiota eine Schlüsseldeterminante für gesundes Altern ist, ist die Art und Weise, wie Bakterien den Alterungsprozess modulieren, Gegenstand intensiver Forschung und Kontroversen geworden 6,14,15.

Mit dem Nachweis, dass der Spulwurm Caenorhabditis elegans eine bonafide Darmmikrobiota beherbergt, die - wie bei anderen Arten - von Bacteroidetes, Firmicutes und Actinobacteria dominiert wird 16,17,18,19,20, sein rasanter Aufstieg als experimentelle Plattform zur Untersuchung kommensaler Interaktionen zwischen Wirt und Darm21,22,23,24 ,25,26 hat unser Ermittlungsarsenal 26,27,28,29 erheblich erweitert. Insbesondere Hochdurchsatz-experimentelle Ansätze, die für C. elegans zur Verfügung stehen, um Gen-Diät-, Gen-Medikament-, Gen-Pathogen-Interaktionen usw. zu untersuchen, können angepasst werden, um schnell zu untersuchen, wie bakterielle Isolate und Cocktails die Gesundheit und das Altern von C. elegans beeinflussen.

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine experimentelle Pipeline, um sofort Arrays von Bakterienisolaten oder Mischungen in Multiwell-Platten auf Auswirkungen auf die Stressresistenz von C. elegans als Proxy für die Gesundheit zu untersuchen, die zur Identifizierung von Probiotika verwendet werden können. Es wird detailliert beschrieben, wie große Wurmpopulationen gezüchtet und bakterielle Arrays in 96- und 384-Well-Plattenformaten gehandhabt werden, bevor Würmer für die automatisierte Stressresistenzanalyse mit einem Fluoreszenzplattenleser verarbeitet werden (Abbildung 1). Der Ansatz basiert auf markierungsfreien automatisierten Überlebensassays (LFASS)30, die das Phänomen der Todesfluoreszenz31 ausnutzen, wobei sterbende Würmer einen Ausbruch blauer Fluoreszenz erzeugen, mit dem der Zeitpunkt des Todes bestimmt werden kann. Blaue Fluoreszenz wird von Glucosylestern der Anthranilsäure emittiert, die in C. elegans-Darmgranulaten (einer Art Lysosomen-verwandter Organelle) gespeichert sind, die platzen, wenn eine nekrotische Kaskade im Wurmdarm nach dem Tod ausgelöstwird 31.

Figure 1
Abbildung 1: Experimenteller Workflow für das Hochdurchsatz-Screening von Bakterienisolaten mit Auswirkungen auf die Stressresistenz von C. elegans . (A) Zeitplan für die Erhaltung von Würmern und Bakterien und den Aufbau des Assays. (B) 96-Well-Aufbau und Handhabung bakterieller Plattenarrays. (C) 384-Well-Schneckenplatten-Setup. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Protocol

Die beiden parallel für die vorliegende Studie verwendeten C. elegans-Stämme waren der Bristol N2-Wildtyp und HT1890: daf-16(mgDf50), die mit ähnlichen Raten wachsen. Das Protokoll kann jedoch mit einer beliebigen Kombination von zwei Stämmen repliziert werden, die ähnliche Wachstumsraten aufweisen. Beachten Sie, dass beim parallelen Testen anderer Stämme (z. B. Wildtyp- und langsam wachsende Daf-2-Mutanten) unterschiedliche Wachstumsraten berücksichtigt werden müssen und das Protokoll entsprechend angepasst werden muss. Die Zeitskalen und Mengen von Würmern und Bakterien im folgenden Protokoll sind für die parallele Prüfung von 48 Bakterienisolaten auf zwei Wurmstämme in zwei LFASS-Assays in Tetraplikaten optimiert. Anpassungen sind erforderlich, wenn mehrere Bedingungen parallel getestet werden sollen. Escherichia Coli Der OP50-Bakterienstamm wurde vom Caenorhabditis Genetics Center (CGC) der University of Minnesota bezogen. Die 48 Bakterienisolate wurden aus dem Labor Schulenburg gewonnen und auf LB-Agar gehalten.

1. C. elegans-Kultivierung auf OP50 (Tage 1 - 8)

ANMERKUNG: Der derzeitige Ansatz zielt darauf ab, C. elegans-Hermaphroditen in allen Stadien auf einem festen Medium zu züchten und unnötige Ernährungsumstellungen zu vermeiden (d. H. Verwendung alternativer, schneller wachsender E. coli-Stämme wie NA22 oder reicherer Wachstumsmedien wie Eierplatten), um so nah wie möglich an den Standardwachstumsbedingungen32,33 zu bleiben, die immer noch weit verbreitet sind. Die Wurmwachstumstemperatur (hier auf 15 °C festgelegt) hängt von dem/den verwendeten C. elegans-Stamm(en) ab und muss möglicherweise angepasst werden (z. B. um die Expression eines temperaturempfindlichen Phänotyps oder Biomarkers zu vermeiden oder auszulösen). Informationen zur Wurmhaltung finden Sie in Referenz33.

  1. Bereiten Sie acht NGM-Platten mit 6 cm Durchmesser vor (10 mL Nematoden-Wachstumsmedien-Agar, NGM, Ergänzungsdatei 1)32,33 pro Schneckenstamm und lassen Sie sie 1 Tag bei Raumtemperatur trocknen.
  2. Bereiten Sie eine gesättigte flüssige Kultur von E. coli OP50-Bakterien vor, indem Sie einen einzelnen Bakterienklon aus einer frisch gewachsenen Lysogeny-Brühe-Agarplatte (LB-Agar, Supplementary File 1) in 25 ml OP50-Medium (Supplementary File 1) in einem 50-ml-konischen Röhrchen aussäen. Die Kultur über Nacht bei 37 °C in einem Shaker-Inkubator anbauen.
  3. Die acht 6 cm NGM-Platten pro Stamm werden mit 100 μL gesättigter flüssiger Kultur von E. coli OP50 pro Platte beimpft und die Platten vor Gebrauch 2 Tage lang bei 20 °C aufbewahrt.
  4. Schneiden Sie mit einem Skalpell ein quadratisches Agarstück von 0,5 cm mit Würmern von einer kürzlich ausgehungerten NGM-Platte auf jede der acht geimpften 6 cm NGM-Platten und inkubieren Sie diese Platten bei 20 ° C für 3 Tage (oder bis die Würmer das Futter beendet haben).
  5. Bereiten Sie fünf 15-cm-NGM-Platten pro Schneckenstamm vor (30 mL NGM-Medium pro Platte) und impfen Sie mit 3 ml OP50. Lassen Sie die Platten trocknen, bevor sie über Nacht bei 37 °C inkubieren. Halten Sie die Platten bis zur späteren Verwendung bei 20 °C.
  6. Geben Sie mit einer P-1000-Pipette bis zu 3 ml sterilen M9-Puffer (Zusatzdatei 1) zu den 6 cm NGM-Platten (Schritt 1.1), um die Würmer zu resuspendieren, und sammeln Sie die Schneckenlösung von allen acht Platten pro Stamm in einem einzigen konischen 15-ml-Röhrchen.
    1. Zentrifugieren bei 142 x g für 2 min bei 4 °C. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer P-5000-Pipette oder einer Wasserpumpe, die mit einer sterilen Pasteur-Pipette oder -Spitze ausgestattet ist. Fügen Sie 10 ml sterilen M9-Puffer hinzu, um das Schneckenpellet zu waschen. Wiederholen Sie 2x.
    2. Entfernen Sie den Überstand (so weit wie möglich) und übertragen Sie die Würmer mit einer Pipette auf eine 15 cm OP50 beimpfte NGM-Platte (Schritt 1.5). Fügen Sie 0,5 ml konzentrierte OP50-Kultur hinzu.
    3. Um konzentriertes OP50 herzustellen, beimpfen Sie jede der vier 1-Liter-Flaschen LB mit 2 ml OP50-Starterkultur (hergestellt in Schritt 1.2.) und wachsen Sie in einem Schüttelinkubator für 6 h bei 37 °C und 160 x g. Pelletieren Sie die Bakterien bei 3057 x g und 20 °C für 15 min. Verwerfen Sie den Überstand, resuspendieren Sie die Bakterienpellets mit 6 ml OP50-Medium und sammeln Sie sie in einem sterilen 50-ml-Konikuschen.
      HINWEIS: Bakterien können bei 4 °C bis zu 1 Woche gelagert werden.
  7. Züchten Sie jeden Wurmstamm auf einer NGM-Platte mit 15 cm Durchmesser für 3-4 Tage bei 15 °C, indem Sie die Würmer täglich mit 0,5 ml konzentriertem OP50 erneut füttern.
    1. Sobald die Würmer das Futter fast aufgebraucht haben, sammeln und waschen Sie es im M9-Puffer (Schritt 1.6.1), übertragen Sie jede Wurmstammkultur auf zwei 15-cm-NGM-Platten (Schritt 1.5.) und vermehren Sie Würmer bei 20 ° C, bis ~95% der Population gravide Erwachsene sind (es dauert etwa 24 Stunden für Wildtyp Bristol N2).
      HINWEIS: Gravide Erwachsene zeichnen sich durch das Vorhandensein von Eiern im Wurm aus, und die ideale Platte sollte auch eine Fülle von ungeschlüpften Eiern auf dem Teller ohne zu viele Larven haben33.

2. Pflege der Darmmikrobiota-Isolatsammlungen (Tag 9)

  1. Die 48 Bakterienisolate auf einzelne 6 cm LB Agarplatten streifen und 48 h bei 20 °C wachsen lassen.
    HINWEIS: Bakterien können bei 25 ° C für 24-36 h früher gezüchtet werden, aber das längere Wachstum von 20 ° C ermöglicht es, potenzielle Verunreinigungen zu erkennen.
  2. Synchronisieren Sie eine große Anzahl von C. elegans.
    1. Gravide adulte Würmer werden nach der Standard-Eizubereitungsmethode33 gebleicht und die Eier für 24 h bei 15 °C auf zwei ungesäte 15-cm-NGM-Platten überführt, damit alle L1-Larven in den folgenden Schritten synchron schlüpfen und wachsen können.
      ACHTUNG: Seien Sie vorsichtig beim Umgang mit Bleichlösungen.

3. Anbau großer C. elegans-Kulturen (Tag 10)

  1. Nach dem Schlüpfen sammeln Sie die L1-Larven (aus Schritt 2.2.1.) in 3-4 ml M9 in einem sauberen konischen 15-ml-Röhrchen. Pipetten Sie vier 10-μL-Tropfen Wurmlösung auf einen Objektträger oder eine Platte und zählen Sie die Anzahl der Würmer in jedem Tropfen unter einem Stereomikroskop mit 16-facher Vergrößerung. Bestimmen Sie die Wurmkonzentration der Lösung, indem Sie die Anzahl der Larven aus allen Tropfen der Wurmlösung mitteln. Multiplizieren Sie diesen Wert mit dem verbleibenden Volumen und schätzen Sie die Gesamtzahl der Würmer für jeden Stamm.
    HINWEIS: 46.000-50.000 L1-Larven pro Stamm sind in diesem Stadium erforderlich, um später eine 384-Well-Platte oder zwei Halbplatten zu füllen.
    1. Übertragen Sie für jeden Stamm alle L1-Larven auf zwei 15-cm-NGM-Platten (23.000-25.000 L1 pro Platte), die zuvor mit 3 ml OP50 (Schritt 1.5.) beimpft und mit 0,5 ml konzentriertem OP50 erneut ausgesät wurden.
  2. Bei 15 °C inkubieren und bei Bedarf täglich 0,5 ml konzentriertes OP50 auffüllen, bis die Würmer das L4-Stadium erreichen.
    HINWEIS: Das L4-Stadium ist durch einen etwas dunkleren Darm und einen halbscheiben- oder halbmondförmigen weißen Fleck gekennzeichnet, in dem sich die Vulva schließlich32,33 bildet.
  3. Bereiten Sie 96-Well-NGM-Agarose-Platten nach den folgenden Schritten vor.
    1. Bereiten Sie acht 96-Well-NGM-Agarose-Platten vor, indem Sie jede Vertiefung mit 125 μL NGM-Agarose (vier Platten pro Assay) füllen.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, einige zusätzliche Platten zu verkleiden, wenn einige in den folgenden Schritten kontaminiert werden. Zwei Plattenleser werden benötigt, um die Assays parallel durchzuführen, aber sie können auch nacheinander mit dem Hitzespannungstest durchgeführt werden, da er nur 6 Stunden lang durchgeführt werden kann. Für diese Platten wird der <4% Ascheagar durch Agarose ersetzt (siehe Materialtabelle), was eine langsamere und gleichmäßigere Trocknung über die NGM-Pfropfen ermöglicht und das Eingraben von Schnecken für eine bessere Erholung reduziert.
    2. Stellen Sie sicher, dass die Vertiefungen gleichmäßig und blasenfrei gefüllt sind. Verwenden Sie einen auf 70 °C eingestellten Heizblock (bei langsamer Wärmeübertragung durch den Kunststoff der Multiwell-Platte darf sich die NGM-Agarose nur auf etwa 55-60 °C erhitzen), um zu verhindern, dass das Gemisch während des Prozesses erstarrt. Um Blasen in Vertiefungen zu entfernen, verwenden Sie eine sterile, flammenerhitzte Nadel.
    3. Lassen Sie die 96-Well-Platten vor dem Invertieren bei Raumtemperatur in einer sterilen Umgebung aushärten (Deckel nach unten, um Kondensation zu vermeiden) und lagern Sie sie bei 4 °C in einer sauberen Box, bis sie benötigt werden.
  4. Überprüfen Sie an Tag 11 die Würmer aus Schritt 3.2., um sicherzustellen, dass keine Verunreinigungen aufgetreten sind und die Würmer noch voll sind.
  5. Überprüfen Sie an Tag 12 die Würmer aus Schritt 3.1., um sicherzustellen, dass keine Verunreinigungen aufgetreten sind und die Würmer noch voll sind. Überprüfen Sie auch das Entwicklungsstadium der Würmer.
    HINWEIS: Das Geschlecht / der Stamm und das Entwicklungsstadium des Wurms, wie L4 oder L4 + 24 h Würmer, hängen von den Behandlungen ab, denen die Würmer unterzogen werden. Hier wurden Wildtyp-Hermaphroditen 36 h lang Bakterienisolaten aus L4 ausgesetzt.

4. Vorbereitung von Darmmikrobiota-Isolatsammlungen für die Wiederfütterung von Würmern

  1. Überwachen Sie das Bakterienwachstum auf den LB-Agarplatten ab Schritt 2.1. und weiter bei 20 °C inkubieren.
    HINWEIS: Obwohl es nicht ideal ist, können Bakterien für den Fall, dass einige Klone nicht wachsen oder Verunreinigungen aufdecken, aus sauberen Beständen auf 6 cm LB-Platten zurückgestreift und bei 25-28 ° C für 24 h gezüchtet werden, um für das Experiment bereit zu sein.
  2. Definieren Sie ein 96-Well-Array-Layout für die zu testende Bakteriensammlung, um eine systematische Plattenaussaat und Datenanalyse in den nachfolgenden Schritten zu erleichtern (Zusatztabelle 1).
  3. Sammeln Sie die Bakterienmasse von jeder 6 cm großen Bakterienplatte (Schritt 4.1.) und geben Sie sie in ein markiertes 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit 1 ml M9-Puffer. Verwenden Sie dazu entweder eine sterile Kunststoffschlaufe mit einem Durchmesser von 2 mm oder eine Metallschlaufe mit einem Durchmesser von 5 mm. Sterilisieren Sie die Metallschleife zwischen Bakterienstämmen, indem Sie 100% Ethanol eintauchen, brennen und 5 s lang abkühlen.
  4. Wirbeln Sie die Mikrozentrifugenröhrchen durch, bis die Bakterienpellets vollständig resuspendiert sind (je nach Bakterienstamm kann dies ~1-10 s dauern).
  5. Bei 9.300 x g für 5 min bei Raumtemperatur herunterdrehen, 700 μL Überstand entfernen und das Bakterienpellet durch Wirbeln resuspendieren.
  6. 200 μL jeder Bakteriensuspension werden gemäß dem in Schritt 4.2 beschriebenen Layout in eine einzige Vertiefung einer leeren sterilen 96-Well-Platte überführt.
  7. Von dieser Platte werden acht 96-Well-NGM-Agarose-Platten (hergestellt in Schritt 3.3) mit 10 μL Bakterienlösung unter Verwendung einer Mehrkanalpipette beimpft und mit aufgesetztem Deckel bei 25 °C für 24 h inkubiert. Versiegeln Sie die Platten nicht, um das Trocknen der Platten und das bakterielle aerobe Wachstum zu ermöglichen und übermäßige Kondensation zu vermeiden.
  8. Versiegeln Sie die in Schritt 4.6 vorbereitete 96-Well-Aufhängungsplatte. mit sauberer Klebefolie (siehe Materialtabelle) und bis zu 5 Tage bei 15 °C lagern. Dies wird bei Bedarf für die Wiederfütterung von Würmern verwendet.

5. LFASS Hitzeschock und oxidativer Assay Aufbau (Tage 13 - 14)

  1. Betrachten Sie die Platten aus Schritt 3.5. und beurteilen Sie das Entwicklungsstadium der Würmer. Sobald >90% der Würmer L434 erreicht haben, sammeln Sie die Würmer in bis zu 10 ml steriler M9-Lösung in 15 ml konischen Röhrchen.
  2. Waschen Sie die Würmer ausgiebig (mindestens 4x), indem Sie sie bei 142 x g für 2 min bei 4 ° C herunterdrehen, den Überstand entfernen und 10 ml frisches steriles M9 zwischen jeder Wäsche hinzufügen, um OP50-Bakterien loszuwerden. Resuspendieren Sie das Schneckenpellet in 10 ml M9.
  3. 50 μL Schneckenlösung in ein Binderohr mit niedriger Oberfläche (siehe Materialtabelle) mit 950 μL M9 überführen. Nachdem Sie den Röhrcheninhalt vorsichtig gemischt haben, um eine Wurmsedimentation zu vermeiden, verwenden Sie schnell eine benetzte Low-Bind-Pipettenspitze, um 3-4 separate 10-μL-Tropfen auf einen Glasobjektträger oder eine NGM-Platte zu übertragen und die Wurmzahlen unter einem Stereomikroskop (siehe Materialtabelle) bei 16-facher Vergrößerung zu zählen. Berechnen Sie den Durchschnitt der 3-4 Tropfen und bestimmen Sie die Anzahl der Würmer pro Mikroliter in der Wurmlösung (siehe Schritt 3.1).
  4. Stellen Sie die Wurmkonzentration im 10-ml-Röhrchen ein, um ~ 120 Würmer in 8 μL zu erreichen. Wenn die in Schritt 5.2 vorbereitete Lösung nicht konzentriert genug ist, drehen Sie die Würmer herunter und entfernen Sie M9 entsprechend, um 120 Würmer pro 8 μL zu erreichen.
  5. 8 μL Wurmlösung (~120 Würmer) werden mit einer Mehrkanalpipette oder einer Wiederholpipette in jede der Vertiefungen der acht 96-Well-NGM-Agaroseplatten aus Schritt 4.7 überführt. Stellen Sie sicher, dass Sie Tipps mit geringer Retention verwenden, um den Verlust von Würmern zu begrenzen. Es kann auch notwendig sein, die Spitzenenden zu schneiden, damit große erwachsene Würmer die mechanische Belastung erwachsener Würmer begrenzen können.
    HINWEIS: Der Assay erfordert mindestens 30 lebende gesunde Würmer, um zuverlässig zu arbeiten, funktioniert aber am besten mit etwa 100 Würmern pro Bohrloch.
  6. Die 96-Well-NGM-Agaroseplatten von Würmern und Bakterien bei 25 °C für 36 h inkubieren.
  7. Überprüfen Sie die Platten zwischen 12-24 h und stellen Sie sicher, dass die Würmer durchgehend voll bleiben. Wenn eine erneute Fütterung erforderlich ist, resuspendieren Sie die Bakterien innerhalb der 96-Well-Bakterien-Array-Platte, die in Schritt 4.8 bei 15 °C gelagert wurde, und geben Sie bis zu 10 μL der entsprechenden Bakterienlösung zu den 96-Well-NGM-Agarose-Platten, in denen Würmer vor Ablauf der 36-stündigen Inkubationszeit verhungert sind (ausgehungerte Würmer führen zu sehr unterschiedlichen Ergebnissen. Das ist also sehr wichtig).
    HINWEIS: Die folgenden Schritte müssen an Tag 15 durchgeführt werden. Vor Beginn des Assays kann es notwendig sein, die Lesehöhe zu optimieren. Der optimale Messwert wird 20-50 μm über dem Boden des Bohrlochs erreicht. Dies hängt vom Modell des Plattenlesers ab. Einige bieten die Möglichkeit eines Z-Scans, während andere eine manuelle Höheneingabe ermöglichen. Stellen Sie die optimale Höhe auf dem Niveau ein, auf dem das höchste blaue Fluoreszenzsignal (365 nm/430 nm) erkannt wird. Einige Plattenleser arbeiten möglicherweise in einer festen Höhe, die für adhärente Zellassays optimiert ist, und sind möglicherweise nicht ideal für LFASS-Assays.
  8. Nach 36 h 30 μL M9 in jede Vertiefung der 96-Well-Platte geben.
    HINWEIS: Für thermische Spannungstests muss das Plattenlesegerät die erforderliche Temperatur erreicht haben, um den Assay durchzuführen, und muss möglicherweise vorzeitig eingeschaltet werden. Das aktuelle Protokoll verwendet 42 ° C, um die Tötungsgeschwindigkeit zu maximieren, aber der Ansatz gilt für andere Temperaturen über 30 ° C.
  9. Transferschnecken (ca. 20 μL) auf die 384-Well-Platte nach festgelegten Layouts unter Verwendung von Spitzen mit geringer Retention (erwägen Sie, das Ende der Spitzen abzuschneiden, damit große Würmer die mechanische Belastung für erwachsene Würmer reduzieren können).
    ANMERKUNG: Für die vorliegende Studie werden für die beiden hier beschriebenen Assays (thermischer Stress und oxidativer Stress) zwei unterschiedliche Plattenleseeinstellungen verwendet, und daher dürfen Proben, die für diese beiden Assays bestimmt sind, nicht in dieselbe 384-Well-Platte plattiert werden.
  10. Stellen Sie sicher, dass die Plattenleser ordnungsgemäß eingerichtet sind (Tabelle 1).
  11. Füllen Sie die 384-Well-Platten mit mehr M9 auf, wobei ein Endvolumen von 60 μL pro Vertiefung angestrebt wird. Für die thermische Stressprobe fügen Sie 40 μL M9 hinzu, und für t-BHP-induzierten oxidativen Stress fügen Sie 34 μl M9 in 6 μl t-BHP hinzu (siehe Tabelle der Materialien).
    1. Beginnen Sie den Assay innerhalb von 2 Minuten nach Zugabe von t-BHP (idealerweise müssen alle Würmer gleichzeitig t-BHP ausgesetzt werden, wobei die Auflösung der Assayzeit 2 Minuten beträgt). Wenn dies nicht möglich ist, verwenden Sie einen Timer, um die Zeit zu schätzen, die für das Pipettieren von t-BHP vor Beginn des Assays aufgewendet wurde, um eine spätere Anpassung der mittleren Todeszeit zu ermöglichen.
  12. Verschließen Sie die Teller mit ihrem transparenten Deckel. Versiegeln Sie die Kanten der 384-Well-Platten mit Abdeckband (Klebeband über die Platte und den Deckel), um sicherzustellen, dass das Klebeband nicht über den Deckel oder unter die Platte geht. Schneiden Sie das Band zwischen Deckel und Platte in Abständen mit einem Skalpell auf, um den Luftaustausch zu ermöglichen und gleichzeitig die Verdunstung während des Assays zu minimieren.
  13. Legen Sie die Platte in das Plattenlesegerät ein (siehe Materialtabelle) und starten Sie den Lauf. Ziel ist die Anregung bei 365 nm und die Detektion der Emission bei 435 nm alle 2 min für 6-12 h (Tabelle 1).
    HINWEIS: Typischerweise reichen 6 h für 42 °C Hitzestress-Assays und 8 h für 7% t-BHP oxidative Stress-Assays.

6. Datenverarbeitung für Plattenleser

  1. Speichern Sie die rohen Fluoreszenzdaten aus dem Plattenlesegerät als komma- oder tabulatorgetrennte .txt-, .csv- oder .xls /.xlsx-Format, und konvertieren Sie sie dann in das xls /.xlsx-Format. Organisieren Sie sie je nach Datenformat neu, damit sie dem für die LFASS-Analyse erforderlichen Excel-Tabellenlayout entsprechen. Befolgen Sie die detaillierten Anweisungen in Referenz30.
    HINWEIS: Während Daten manuell analysiert werden können, indem jede Zeitreihe normalisiert und nach dem Zeitpunkt gesucht wird, zu dem die Todesfluoreszenz das halbe Maximum erreicht, kann eine automatisierte Analyse in Matlab durchgeführt werden, in dem die LFASS-Routine30 ausgeführt wird.
  2. Laden Sie Matlab (Version 2014a oder höher) und das LFASS-Softwarepaket von https://github.com/ABA80/LFASS herunter und installieren Sie es. Befolgen Sie die darin enthaltenen Richtlinien und Anmerkungen.
    ANMERKUNG: Abbildung 1C enthält eine kurze Beschreibung des Ansatzes. Matlab ist erforderlich, um die LFASS-Routine auszuführen. Alternativ kann der Matlab-Code in Oracle übersetzt werden, mit Ausnahme der Fitting-Funktion, die proprietär ist. Neue Glättungs- und Sigmoid-Funktionen können neu geschrieben werden, um die Verwendung in einer vollständig Open-Source-Plattform zu ermöglichen.
  3. Verschieben Sie zwischen LFASS-Analysen die Daten und Ergebnisse an einen neuen Speicherort, da die LFASS-Analyse alle Dateien im Datenordner verarbeitet und Dateien im Ergebnisordner überschreibt.

7. Dateneinsicht

  1. Öffnen Sie die Excel-Datei und beschriften Sie die Zeilen entsprechend der Well-Position auf der 384-Well-Platte. Die Zusatzdatei 2 zeigt ein Beispiel für die Excel-Datei der Rohfluoreszenzdaten, die für den Hitzeschocktest generiert wurden. Verwenden Sie die Well-Position auf der 384-Well-Platte, um den Wurm und die Bakterienstämme zu kennzeichnen.
  2. Untersuchen Sie vor der Matlab-Analyse die Daten visuell in Excel und zeichnen Sie die Fluoreszenzintensität im Laufe der Zeit für ein repräsentatives Bohrloch auf. Je nach verwendetem Plattenleser können die Daten verrauscht sein, sollten aber einen deutlichen Peak anzeigen. Besonders:
    1. Bestimmen Sie einen Fluoreszenzwert, unterhalb dessen sich ein Peak nicht signifikant vom Rauschen unterscheidet (die Festlegung eines solchen Schwellenwerts in LFASS beschleunigt die Analyse durch Ausschluss leerer Bohrlöcher).
    2. Beachten Sie den frühesten Zeitpunkt, zu dem Fluoreszenzschwankungen vor dem Aufgehen dämpfen (Tiere können bis zu 30 Minuten lang kräftig schlagen, was zu schnell schwankenden blauen Fluoreszenzwerten führt).
      HINWEIS: Die Peakanpassung kann verbessert werden, indem diese frühen Zeitpunkte aus dem Kurvenanpassungsfenster ausgeschlossen werden.
    3. Beachten Sie die Zeitpunkte, zwischen denen minimale und maximale Fluoreszenzwerte voraussichtlich fallen werden (schauen Sie sich mehrere Vertiefungen an, um diese Bereiche zu identifizieren), da sie für die Kurvenanpassung verwendet werden.
    4. Überprüfen Sie, ob die Amplituden der Fluoreszenzpeaks zwischen den Vertiefungen signifikant variieren, normalisieren Sie die Daten vor der weiteren Analyse mit der folgenden Formel:
      Normalisierte Fluoreszenzbohrung n (t) = (Fluoreszenzbrunnenn [t] - minimale Fluoreszenzbohrung [Dt]) / (maximale Fluoreszenzbohrung [Dt] - minimale Fluoreszenzmulde [Dt])
      Dabei ist "n" die aktuelle Bohrlochzahl, "t" der Zeitpunkt und "Dt" die Reihe von Zeitpunkten für den Assay.

8. LFASS Datenverarbeitung

HINWEIS: Einzelheiten finden Sie auf https://github.com/ABA80/LFASS und in den ergänzenden Materialien von Referenz30.

  1. Erstellen Sie zwei Unterordner innerhalb des LFASS-Ordners, einen für die zu analysierenden Daten und einen für Ergebnisse, z. B. "Meine Daten" und "Ergebnisse".
  2. Kopieren Sie die Assay-Excel-Datendatei nach der Dateninspektion in den LFASS-Unterordner "Meine Daten".
  3. Starten Sie MATLAB, navigieren Sie zum LFASS-Ordner , geben Sie fitfolder ein und führen Sie fitfolder im Befehlsfenster aus (Zusatzdatei 3). Folgen Sie dann den Anweisungen auf dem Bildschirm.
  4. Nach Eingabe von "fitfolder" fragt das System nach dem Namen des Ordners, in dem sich die Excel-Datei befindet, z.B. "Meine Daten". Geben Sie den Namen Ihres Datenordners ein (in diesem Beispiel "Meine Daten").
  5. Folgen Sie den Anweisungen auf dem Bildschirm und geben Sie die verschiedenen angeforderten Parameter an.
    1. Geben Sie "2" für das Zeitintervall zwischen aufeinanderfolgenden Messungen im aktuellen Protokoll ein (wenn Sie dies angeben, können die Ergebnisse in Minuten anstelle von Zeitpunkteinheiten ausgedrückt werden).
      HINWEIS: Das Zeitintervall kann geändert werden, um mehr oder weniger häufig Fluoreszenzmessungen durchzuführen (um die Zeitauflösung zu verringern oder zu erhöhen) und auch abhängig von den Fähigkeiten des Plattenlesers (d. H. Das Zeitintervall muss möglicherweise für Plattenleser erhöht werden, die nicht schnell genug Messungen durchführen können). Stellen Sie sicher, dass das experimentelle Zeitintervall immer mit der LFASS-Routine übereinstimmt.
    2. Weisen Sie den oberen Toleranzschwellenwert zu, indem Sie "0,95" eingeben (dies kann nach Bedarf geändert werden, um die Passform zu verbessern) und den unteren Toleranzschwellenwert, indem Sie "0,05" eingeben (dies kann nach Bedarf geändert werden, um die Anpassung zu verbessern), um die Sigmoidanpassung einzuschränken.
      HINWEIS: Andere Zeitparameter basieren auf Benutzernotizen aus der Datenprüfung (Schritt 7.2.).
  6. Wählen Sie aus, ob angepasste und geglättete Kurven angezeigt werden sollen oder nicht, indem Sie "y" für JA oder "n" für NEIN eingeben, wenn Sie dazu aufgefordert werden. Um die konvergierenden Passungen visuell zu prüfen, wählen Sie die erstere aus.
    HINWEIS: Letzteres ist nützlich, um alle geglätteten Daten zu visualisieren, wird aber normalerweise nicht ausgewählt, da es zu viele Popup-Diagramme generiert. Danach führt Matlab die LFASS-Routine aus, was 1-10 Minuten dauern kann, wenn mehrere Excel-Dateien gleichzeitig verarbeitet werden. Popup-Fenster mit Kurven werden entsprechend der Auswahl in Schritt 8.6 angezeigt. Die Zusatzdatei 4A zeigt ein Beispiel für eine angepasste Kurve.
  7. Wählen Sie, ob (1) als Rauschen identifizierte Kurven analysiert oder (2) schlecht angepasste Kurven mit einer Option [y/n] nachgerüstet werden sollen. Geben Sie y ein, um zu genehmigen, und n , um abzulehnen.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, eine Umrüstung zu genehmigen, insbesondere wenn viele schlecht angepasste oder nicht angepasste Kurven vorhanden sind. Auf diese Weise kann der Benutzer maßgeschneiderte Kurvenanpassungsparameter für jede Kurve angeben, wenn sie auf dem Bildschirm angezeigt wird, und nur nach früheren und späteren Grenzen für die Sigmoidanpassung fragen. Es kann so oft wie nötig versucht werden.
  8. Sobald die Daten analysiert sind, schließen Sie Matlab und öffnen Sie den LFASS-Ordner .
  9. Klicken Sie auf den LFASS-Unterordner Meine Ergebnisse, da die Ergebnisdateien automatisch im Ergebnisordner als .txt gespeichert werden.
    HINWEIS: Matlab generiert drei .txt Dateien: "Batch-fitted.txt", "Batch and noise-fitted.txt" und "Refitted.txt". Die ersten beiden werden als Vorsichtsmaßnahme für den Fall eines Computerabsturzes oder Benutzerfehlers während der Umrüstung gespeichert. Die Datei mit der genauesten vollständigen Analyse ist "Refitted.txt".
  10. Öffnen Sie die Datei Refitted.txt mit Microsoft Excel und speichern Sie sie zur weiteren Verarbeitung als .xls. Die Zusatzdatei 4B zeigt ein Beispiel für eine solche Ergebnisdatei.
    HINWEIS: Für jede Vertiefung (in Zeilen organisiert) werden in den Spalten drei Werte angegeben, die Schätzungen der mittleren Todeszeit der Wurmpopulation enthalten: "Raw": meldet die Zeit, die sich beim halben Maximum der experimentellen Datenspitze schneidet; "Batch-fitted": Gibt die Zeit an, die sich am halben Maximum der Batch-angepassten Kurve schneidet; "Refitted": Gibt die Zeit an, die sich am halben Maximum der neu angepassten Kurve schneidet.
  11. Speichern Sie die Datei im .xls Format als Kopie an einem sicheren Ort. Andernfalls besteht die Gefahr, dass die Dateien beim nächsten Durchlauf der LFASS-Routine überschrieben werden.
    HINWEIS: Die Ergebnisse können dann für die grafische Darstellung oder statistische Analyse weiterverarbeitet werden.

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Representative Results

LFASS-Assays bieten ein robustes, hohes Durchsatz- und schnelles Screening mehrerer Testbedingungen gleichzeitig, wie z. B. das Screening zahlreicher genetischer und Mikrobiota-Parameter, die zu Stressresistenz und Alterung beitragen. Es dauert nur 2-3 Wochen, bis das Experiment einen umfangreichen Datensatz mit mehreren Testbedingungen erhält. L4 + 36 h adulte Wildtyp-Wurmpopulationen wurden nach einer 36-stündigen Kultur an 48 Darmmikrobienisolaten für 36 h 42 °C thermischem Stress und 7% t-BHP-induziertem oxidativem Stress ausgesetzt. Der Assay wurde viermal durchgeführt, wobei jede Bedingung in jedem Assay viermal repliziert wurde. Unter allen getesteten Bedingungen variierte die mediane Todeszeit zwischen 40-130 min für den thermischen Stresstest und zwischen 90-240 min für den t-BHP-induzierten oxidativen Stresstest. Thermische Stresstests im frühen Erwachsenenalter zeigen in der Regel konsistentere Ergebnisse und weniger Variabilität zwischen und innerhalb des Tages als oxidative Stresstests und sind bessere Prädiktoren für die nachfolgende Langlebigkeit30. Der Unterschied in der medianen Todeszeit von Würmern, die mit verschiedenen mikrobiellen Diäten gefüttert wurden, veranschaulicht schlüssig, wie Darmkommensalen die Stressresistenz des Wirts beeinflussen. Abbildung 2 zeigt typische Ergebnisse von 16 biologischen Replikaten für Bristol N2-Wildtyp-Würmer auf zwei interessierenden Darmmikrobiota-Isolaten und dem Standard-Laborstamm E. coli OP50.

Figure 2
Abbildung 2: Repräsentative Ergebnisse von gepaarten Hitze-/Oxidationsstressresistenz-Assays von Würmern, die auf zwei Bakterienisolaten und einem Kontrollstamm gezüchtet wurden. (A) Hitzestress-Assay. Wildtyp-Würmer wurden 36 h lang entweder mit MYb11 (Pseudomonas lurida) oder MYb115 (Pseudomonassp.) Bakterienisolaten oder OP50-Kontrollbakterien gefüttert. MYb11 führte zu einer signifikant früheren medianen Todeszeit (p < 0,001). (B) Oxidativer Stress-Assay. Wildtyp-Würmer wurden 36 h lang entweder mit MYb11- oder MYb115-Bakterienisolaten oder OP50-Kontrollbakterien gefüttert. MYb11 führte zu einer signifikant früheren medianen Todeszeit (p < 0,05). 120-150 Würmer wurden in vier Probensätzen analysiert, und jedes Experiment wurde vierfach durchgeführt. Wells mit schlechter Qualität/schlecht angepassten Daten führten zu fehlenden Werten. Boxplot-Darstellungen geben einzelne Well-Werte, Minimal-, Median- und Maximalwerte an. *Zeigt statistische Signifikanz bei p < 0,05 und ***p < 0,001 an, mit unidirektionaler ANOVA. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ein
Parameter Einstellung Kommentar
Temperatur 25 °C
Fluoreszenzanregung 365 nm 10 nm Bandbreite
Fluoreszenzemission 430 nm 20 nm Bandbreite
Anzahl der Blitze 8 Blitze, 1ms Einschwingzeit
Gewinnen 100 bis 130 Je nach Probe einstellbar. Ziel eines Lesewerts von 2-5 k zu Beginn des Assays
Verzögerungszeit 1 μs
Integrationszeit 30 μs
Lesezeitintervall Alle 2 min Je nach Belastungsschwere, Dauer und Zeitintervall müssen möglicherweise angepasst werden (8 h reichen bei 7% t-BHP aus)
Dauer 8-12h
Fahrtrichtung lesen Von unten
B
Parameter Einstellung Kommentar
Temperatur 42 °C
Fluoreszenzanregung 365 nm 10 nm Bandbreite
Fluoreszenzemission 430 nm 20 nm Bandbreite
Anzahl der Blitze 8 Blitze, 1ms Einschwingzeit
Gewinnen 100 bis 130 Je nach Probe einstellbar. Ziel eines Lesewerts von 2-5 k zu Beginn des Assays
Verzögerungszeit 1 μs
Integrationszeit 30 μs
Lesezeitintervall Alle 2 min Je nach Belastungsstärke müssen Dauer und Zeitintervall angepasst werden (6 h reichen bei 42 °C)
Dauer 6-12h
Fahrtrichtung lesen Von unten

Tabelle 1: Einstellungen für oxidative und Hitzestress-Assays. Beispiele für Einstellungen für oxidative (A) und Wärme (B) Stresstests auf den in dieser Studie verwendeten Fluoreszenzplattenlesern.

Zusatzdatei 1: Medien-, Puffer- und Kulturrezepte. Zusammensetzung verschiedener Medien, Puffer und Kulturen, die in der vorliegenden Studie verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 2: Rohfluoreszenzdaten aus dem Plattenleser nach dem Export und der Konvertierung in Excel .xls Format. (A) Die Excel-Datei zeigt die Rohfluoreszenzdaten für einen Hitzeschock-Assay. Rohfluoreszenzdaten werden im Zeitintervall von 2 Minuten angezeigt. (B) Die Säule mit "Well-Position" auf der 384-Well-Platte ist hervorgehoben, mit der der Wurm und die Bakterienstämme gekennzeichnet werden können. (C) Die Datei ist mit Wurm- und Bakterienstämmen gekennzeichnet. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzungsdatei 3: LFASS-Analyse mit Matlab. (A) Nach dem Öffnen des LFASS-Ordners in Matlab öffnet sich ein Befehlsfenster. (B) "fitfolder" wird in das Befehlsfenster eingegeben, um das Programm zu starten, und der Name des Ordners mit der zu analysierenden Datei wird angezeigt. (C) Sobald das Programm die Daten-Excel-Datei zur Analyse gefunden hat, muss der Benutzer den Anweisungen auf dem Bildschirm folgen und die verschiedenen angeforderten Parameter angeben. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 4: Analysierte LFASS-Daten mit Matlab. (A) Beispiel für eine durch die Matlab-Analyse angepasste Kurve, wobei die schwarze Linie den Zeitpunkt angibt, der der früheren Zeitgrenze entspricht, und die blaue Linie die spätere Zeitgrenze für die Kurvenanpassung. Die angepasste Sigmoidkurve wird rot dargestellt. (B) Die von Matlab generierte Ergebnisdatei wird in .xls Format geöffnet. Die Werte werden hervorgehoben und im Zahlenformat angezeigt. Die zweite Spalte gibt den Zeitpunkt an, zu dem der Wert auf der Rohdatenkurve erstmals 50 % des Maximalwerts überschreitet. Die dritte Spalte gibt den Zeitpunkt an, zu dem der Wert der angepassten Kurve 50 % des Maximalwerts entspricht, der während der Chargenanpassungsanalyse ermittelt wurde. Die vierte Spalte gibt den Zeitpunkt an, zu dem der Wert auf der angepassten Kurve 50 % des Maximalwerts nach Chargenanalyse und ggf. endgültiger Neuanpassung entspricht. Die vierte Spalte sollte daher das zuverlässigste Ergebnis liefern. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 1: Beispiele für experimentelle Plattenlayouts. (A) 96-Well-Plattenlayout zum Testen von 47 verschiedenen Wurm-Darm-Mikrobiota-Bakterienisolaten an zwei separaten Wurmstämmen, wobei lebendes OP50 als Kontrolle verwendet wird. Für jeden durchgeführten Test sind vier Kopien dieser Platte erforderlich. (B) 384-Well-Layout für Wärme- oder oxidative Stress-Assays, entsprechend dem vorherigen 96-Well-Plattentest in (A). Dieser Aufbau ermöglicht die Durchführung von Tetraplikaten für jede Bedingung, wobei jeder Wurmstamm seine eigene OP50-Kontrolle hat. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

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Discussion

C. elegans bietet aufgrund seiner geringen Größe, Transparenz, schnellen Entwicklung, kurzen Lebensdauer, kostengünstigen und einfachen Handhabung viele Vorteile für das schnelle Screening mehrerer experimenteller Parameter auf einmal. Sein wesentlich einfacheres Genom, Körperplan, Nervensystem, Darm und Mikrobiom, aber komplex und ähnlich genug wie der Mensch, machen es zu einem leistungsstarken präklinischen Modell, in dem mechanistische Erkenntnisse gewonnen werden können, während bioaktive Wirksamkeit oder Toxizität getestet werden. Da das Interesse an der Entwicklung mikrobieller Interventionen für Krankheiten 8,9,34,35 wächst, ist die Nutzung solcher präklinischen Modelle zur schnellen Untersuchung von Probiotika eine attraktive Option mit dem weitgehend ungenutzten und nahezu unbegrenzten therapeutischen Potenzial von Mikroben 34. Das hier beschriebene Protokoll ist geeignet, um die Auswirkungen von Umweltbakterien auf die Gesundheit von C. elegans zu untersuchen, kann aber leicht für andere Zwecke angepasst werden.

Vielseitigkeit
Die verschiedenen "Module", die diese Pipeline bilden, können an experiment- oder laborspezifische Anforderungen angepasst werden. Zum Beispiel können bakterielle Isolate für Bakterienmischungen, bakterielle Mutanten oder RNAi-produzierende Bakterien ersetzt werden, und das Setup kann verwendet werden, um nach bakteriellen Genen zu suchen, die an Wirt-Mikroben-Interaktionen beteiligt sind, nach Wirtsgenen zu suchen, die an Stressresistenz beteiligt sind, oder den Einfluss einzelner Mikroben als Teil definierter Bakteriengemeinschaften zu untersuchen. Diese Methode beschreibt das Screening mehrerer Bakterienisolate im genetischen Hintergrund eines einzelnen Wurms. Der Assay ist jedoch skalierbar und mehrere Wirts- und Bakteriengenotypen können gleichzeitig untersucht werden. Dies kann weiter mit differentiellen medikamentösen Behandlungen und / oder Ernährungsschemata kombiniert werden, um Einblicke in die Interaktionen zwischen Wirtsgen, Mikrobenen und Ernährung zu erhalten.

Das Protokoll muss noch an anderen Nematodenarten versucht werden, aber es sollte auch direkt auf C. remanei und C. briggsae anwendbar sein, und es kann für parasitäre Nematodenarten im L3-Stadium gelten, die morphologische, Größen- und Todesfluoreszenzmerkmale mit C. elegans30 teilen. Schließlich können andere Stressoren (Juglon, Paraquat, Arsenat, andere Temperaturen) innerhalb derselben Pipeline verwendet werden, um ergänzende oder bestätigende Informationen bereitzustellen.

Mögliche Herausforderungen
Die Zeitinvestition bis zum 12. Tag, um Würmer und Bakterien vor den Assays zu züchten, ist erheblich, wird aber aufgrund des Durchsatzes des Ansatzes durch die Breite der gesammelten Daten bei weitem aufgewogen. Dennoch ist Sorgfalt bei der Planung solcher Assays unerlässlich, um Zeitverschwendung durch Wiederholung der Vorbereitungsschritte zu vermeiden, da die Materialien zu Beginn der Assays suboptimal sind. Zu den wichtigsten frühen Problemen gehören Probenkontamination (Würmer oder Bakterien), schlecht synchronisierte Wurmpopulationen und Materialmangel (Wurmpopulationen fressen sich schneller als erwartet durch ihre Nahrung und füttern oder transferieren Tiere häufiger als geplant).

Vermeidung von Verunreinigungen
Aufgrund des Umfangs und der Dauer des Protokolls ist ein großes potenzielles Problem die Kontamination durch Pilze und Bakterien, deren Auftreten die Ergebnisse sicherlich verwirren würde. Der ideale Aufbau ist daher ein klimatisierter und luftgefilterter dedizierter Laborraum ohne direkten Luftstrom über dem Versuchstisch mit sterilen Verbrauchsmaterialien. Die Einhaltung regelmäßiger Reinigungsverfahren (Dekontaminierung von Bänken vor und nach der Arbeit, Reinigung von Plattenkästen und Verwendung steriler Verbrauchsmaterialien) und das Arbeiten mit einer Flamme in einem geschlossenen Raum (vermeiden Sie Flure, Räume in der Nähe von offenen Türen und Fenstern) sind jedoch in der Regel ausreichend, um eine saubere Umgebung zu erhalten. Wenn vor der Eizubereitung in Schritt 2.2.1. leichte Verunreinigungen auftreten, kümmert sich das Bleichverfahren darum, und das Protokoll kann wie geplant fortschreiten. Umgekehrt bedeuten Kontaminationen, die die wachsende Wurmpopulation vor der Übertragung auf Testbakterienplatten betreffen, das Ende dieses Versuchs, und das Protokoll muss ab Schritt 1 neu gestartet werden. Spätere Kontaminationen neigen dazu, einzelne Bakterienstämme oder Testbedingungen zu beeinflussen. Je nach Umfang kann es sich lohnen, das Protokoll weiterzuführen oder neu zu starten.

Wurm-Synchronisation
Da sich die Resistenz gegen thermische und oxidative Herausforderungen ändert, wenn sich Würmer entwickeln und wachsen, können Testbedingungen, die zu unterschiedlichen Entwicklungsstadien führen, wenn LFASS-Assays durchgeführt werden, nicht ohne weiteres verglichen werden. Es ist wichtig, gut synchronisierte Populationen für Endpunkt-Assays zu erhalten. Da die Assays an Würmern durchgeführt werden, die in großen Mengen in L4- oder L4 + 48-Stunden-Stadien gesammelt werden, müssen die Wurmpopulationen bei L1 sehr gut synchronisiert sein, wenn kein Wurmsortierer oder ein anderes Sortierverfahren zur Sammlung perfekt inszenierter Würmer vorhanden ist. Es sollte sichergestellt werden, dass die Jungtiere lange genug vom Futter ferngehalten werden, damit alle lebenden Eier schlüpfen können, bevor die Testkohorte wächst (>15 h bei 20 °C und >18 h bei 15 °C). Der Genotyp kann die Ausbreitung des Entwicklungszeitpunkts beeinflussen, der auch von der Temperatur beeinflusst wird. Wachsende Wurmpopulationen bei 15 °C ermöglichen eine bessere Kontrolle darüber und begrenzen gleichzeitig die Auswirkungen temperaturempfindlicher Mutationen während der Expansionsphase der Wurmpopulation (insbesondere bei der Arbeit mit Insulinsignalmutanten). Der Hauptgrund für die Untersuchung der Auswirkungen von Mikroben aus L4 oder L4 + 48 h besteht darin, die Entwicklungsauswirkungen einer unterschiedlichen Ernährung zu umgehen und die Auswirkungen lebender Darmbakterien zu untersuchen, anstatt ihre Auswirkungen auf die Ernährung. Würmer, die in einem früheren Larvenstadium auf verschiedenen Bakterienisolaten oder -mischungen gezüchtet werden, führen unweigerlich zu ungleichmäßigen Entwicklungsraten und einem Verlust der Synchronität.

Folgen der Verwendung von blauer Fluoreszenz
Die Möglichkeit, den Tod in LFASS-Assays ohne individuelle Wurmverfolgung oder zusätzliche Reagenzien wie Sytox green36 zu lokalisieren, sondern stattdessen ein endogenes Signal in einem Fluoreszenzbereich zu nutzen, der sich wahrscheinlich nicht mit herkömmlichen Wurmbiomarkern überschneidet, ist ein klarer Vorteil. Es bleibt jedoch entscheidend sicherzustellen, dass die Fluoreszenz des Wurmtods unter vielen Testbedingungen konsistent nachgewiesen werden kann. Während der Assay nicht auf der Fluoreszenzquantifizierung, sondern auf seiner Dynamik beruht, muss von den Würmern noch genügend Fluoreszenz emittiert werden, um die mediane Todeszeit (TOD) genau abzuschätzen. Da der Assay keine Auflösung des Todes einzelner Würmer ermöglicht, müssen die blauen Fluoreszenzausbrüche, die von sterbenden Individuen emittiert werden, eine ausreichende zeitliche Überlappung aufweisen, damit die Fluoreszenzakkumulation einen einzelnen Fluoreszenzpeak der Population ausgibt. Nur dann kann der mediane TOD genau abgeleitet werden. Dies bedeutet, dass Würmer, die nicht in der Lage sind, ausreichende Mengen an blauer Fluoreszenz zu produzieren, nicht in diesem Protokoll verwendet werden können, das insbesondere einige Mutanten des Kynurenin-Signalwegs wie tdo-2 und Kynu-130,31 sowie ausgehungerte Tiere umfasst. Daher ist es wichtig sicherzustellen, dass Würmer durchgehend unter vollen Bedingungen gehalten werden. Dies kann insbesondere bei der Durchführung von HT115-gesteuerten RNAi-Screens ein Problem darstellen, da HT115-Rasenflächen auf NGM-Medium, ergänzt mit IPTG und Antibiotika, tendenziell dünner sind als OP50-Rasenflächen. Die Überwachung der Wurmfutterversorgung während der Tage vor den Tests ist daher von entscheidender Bedeutung.

Eine weitere Konsequenz der Dynamik der Todesfluoreszenz ist, dass je schneller der Assay ist, desto besser ist die Empfindlichkeit, da Würmer aus derselben Population synchroner sterben und einen definierteren Populationstodesfluoreszenzpeak erzeugen. Je länger der Assay ist, desto größer ist also die Populationsgröße, die benötigt wird, um gute Todesfluoreszenzspitzen zu erzeugen. Mutanten mit niedrigem Stoffwechsel, wie eat-2 und daf-2 30, geben auch weniger Fluoreszenz ab und benötigen höhere Zahlen pro Well. Während 10-15 Wildtyp-Würmer pro Bohrloch für einen thermischen Stresstest von 42 °C ausreichen, der alle innerhalb von 4 h tötet, ist für daf-2(e1370)-Würmer im selben Assay fast die doppelte Menge erforderlich, und >100 Wildtyp-Würmer sind für einen Assay erforderlich, der Würmer über einen Zeitraum von 24 Stunden töten würde.

Im Zusammenhang mit bakteriellen Umweltisolaten kann ein unterschiedlicher mikrobieller Stoffwechsel auch den Kynurenin-Signalweg unterschiedlich beeinflussen, der die blau fluoreszierenden Verbindungen produziert. Daher führen einige Bakterienisolate zu einer niedrigeren Peak-Death-Fluoreszenz, während andere zu höheren Peaks als OP50 führen. Infolgedessen muss man genügend Würmer pro Brunnen anstreben, um allen Eventualitäten gerecht zu werden.

Schließlich ist die korrekte Optimierung der Plattenleseparameter unerlässlich. Dieses Protokoll umfasst die Einstellung der Fluoreszenzanregungs- und Emissionsparameter sowie die Tiefe, in der die Messungen idealerweise durchgeführt werden sollten. Mit einem möglicherweise breiten Spektrum von Todesfluoreszenzerträgen über mehrere Bedingungen in einem einzigen Assay ist es wichtig sicherzustellen, dass schwache Signale detektiert werden, aber dass die Detektoren niemals gesättigt sind. Instrumente mit Detektoren mit hohen Dynamikbereichen werden daher eine bessere Leistung erbringen.

Einschränkungen der Methode
Die hier beschriebene Methode ist robust und flexibel und kann leicht an verschiedene Bedingungen angepasst werden. Der Einfachheit halber werden wichtige Einschränkungen und Einschränkungen entlang des Protokolls erwähnt, in dem sie ins Spiel kommen. Kurz gesagt, die Abhängigkeit von der Todesfluoreszenz als endogenem Todesmarker ist sowohl eine Stärke als auch eine Einschränkung dieser Assays.

Unter einer begrenzten Anzahl spezifischer Ernährungsbedingungen (niedrige Tryptophandiäten oder Hunger) und bei mutierten Bedingungen, die den Tryptophanstoffwechsel beeinflussen (d. h. tdo-2, kynu-1, einige daf-2-Allele ), kann die Todesfluoreszenz (DF) stark abgeschwächt werden, so dass die Spitzenfluoreszenz schwer zu erkennen ist und TOD-Schätzungen weniger zuverlässig sind.

Umgekehrt können einige Mikroben blau fluoreszierende Verbindungen produzieren, deren Anregungs- und Emissionsspektren sich mit DF-Signalen überschneiden (z. B. Enterococcus faecalis). Während sich ihre Dynamik von der DF unterscheidet und oft entkoppelt werden kann, können sie die Analyse verwirren.

Als nächstes beruhen die Assays auf der Kumulation von Signalen von sterbenden einzelnen Würmern, aber DF wird im Laufe der Zeit gelöscht. Wenn also Würmer zu weit voneinander entfernt sterben, erzeugen einzelne Fluoreszenzpeaks keinen Populationspeak, was die Messung eines Populationsmedian-TOD verhindert. Je langsamer der Assay tötet, desto höher ist die in jeder Vertiefung erforderliche Wurmzahl30. Daher sind 10-15 erwachsene Würmer pro Vertiefung ausreichend für einen 42 °C Hitzestresstest, der die Hälfte der Würmer innerhalb von 2 h tötet, aber über 70 Würmer pro Vertiefung sind für einen bakteriellen Fast-Tötungstest erforderlich, der die Hälfte der Würmer in 12 h tötet.

Schließlich benötigen Benutzer Zugang zu einem Plattenleser, um solche Assays durchzuführen, die Zeitraffer-Fluoreszenzmessungen bei den erforderlichen Wellenlängen durchführen können. Anregungs- und Emissionswellenlängen können auch leicht zwischen Systemen variieren und zwischen Nematodenarten variieren, wie bereitserwähnt 30.

Vergleich und Komplementarität mit anderen C. elegans-Assays
In den letzten 10-15 Jahren wurden viele Assays entwickelt, um die Gesundheit von C. elegans unter mehreren Bedingungen gleichzeitig zu bewerten, wobei eine Vielzahl von Strategien zum Einsatz kommen und unterschiedliche Ebenen der Datentiefe und -breite angeboten werden 30,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45, 46. Es wurden mehrere leistungsstarke Assays entwickelt, um viele Würmer gleichzeitig auf festen Medien über ihre gesamte Lebensdauer hinweg automatisch zu überwachen, wobei Kameraarrays und Scanner mit Multi-Wurm-Tracking-Algorithmen und/oder mikrofabrizierten individuellen Wurm-Arrays verwendet werden 37,38,39,40,41,43 . Im Zusammenhang mit Wirt-Mikroben-Interaktionen haben ähnliche Ansätze wie das oben beschriebene Protokoll, die sich jedoch nicht auf DF stützen, auch ein genomweites RNAi-Screening von C. elegans-Genen ermöglicht, die an bakteriellen Infektionen beteiligt sind46,47,48. Diese Hochdurchsatz-Assays beruhen jedoch auf der Behandlung von Würmern in Flüssigkeit, was aufgrund des erhöhten Risikos einer Kreuzkontamination und der Auswirkungen der Flüssigkultur auf den Wirts- und mikrobiellen Stoffwechsel nicht wünschenswert ist, wenn es sich um mehrere Bakterientypen gleichzeitig handelt. Daher werden C. elegans in traditionellen Infektions-, Stress-, Gesundheits- und Langlebigkeitstests auf Bakterienrasen gepflegt und gealtert, die auf festen Medien angebaut werden. Wie auch in diesem Protokoll können Ergebnisse von Screens, die mit dieser Pipeline durchgeführt werden, leichter mit den Ergebnissen nachgelagerter Bestätigungsexperimente mit Bildschirmtreffern in Beziehung gesetzt und vorhergesagt werden.

Die Vorteile des LFASS-Ansatzes selbst wurden in Referenz30 ausführlich behandelt. Im Vergleich zu aufwendigeren kontinuierlichen Bildgebungsaufbauten, die für ähnliche Studien wiederverwendet werden könnten, ist LFASS billiger (vorausgesetzt, der mediane TOD ist die einzige erforderliche Ablesung), und seine Einfachheit bedeutet, dass es nicht viel technische Fähigkeiten oder spezielle Ausrüstung erfordert. Bei LFASS geht es hauptsächlich um Breite über Tiefe. LFASS-Daten liefern keine anderen Informationen als die mediane Todeszeit einer Wurmpopulation und ein indirektes Auslesen eines Kynurenin-Signalwegs. Umgekehrt können bei niedrigerem, aber immer noch anständigem Durchsatz komplexe Merkmale aus anderen Assays 37,38,39,40,41,43 über die gesamte Lebensdauer von Würmern gemessen werden, was sie zu hervorragenden nachgeschalteten Ansätzen macht, um Treffer von einem LFASS-Screening aus zu untersuchen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgments

Wir danken dem CGC Minnesota (Madison, USA, NIH - P40 OD010440) für die Bereitstellung von Wurmstämmen und OP50 und Prof. Hinrich Schulenburg (CAU, Kiel, Deutschland) für die Bereitstellung aller hier abgebildeten Umweltmikrobiellen Isolate. Diese Arbeit wurde durch einen UKRI-BBSRC-Zuschuss an AB finanziert (BB/S017127/1). JM wird durch ein FHM-PhD-Stipendium der Lancaster University finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 cm diameter plates (Non-vented) Fisher Scientific 10720052 Venting is not necessary for bacterial cultures
15 cm diameter plates (Vented) Fisher Scientific 168381
384-well black, transparent flat bottom plates Corning 3712 or 3762 Not essential to be sterile for fast stress assays
6 cm diameter plates (Vented) Fisher Scientific 150288 Venting is necessary for worm cultures to avoid hypoxia
96-well transparent plates (Biolite) Thermo 130188
Agar (<4% ash) Sigma-Aldrich 102218041 Good quality agar is important for the structural integrity of the culture media, to avoid worm burrowing
Agarose Fisher Scientific BP1356
Avanti Centrifuge J-26 XP Beckman coulter
Bleach Honeywell 425044
Calcium chloride Sigma-Aldrich C5080
Centrifuge 5415 R Eppendorf
Centrifuge 5810 R Eppendorf
Cholesterol Sigma-Aldrich C8667
LB agar Difco 240110
LB broth Invitrogen 12795084
LoBind tips VWR 732-1488 Lo-bind reduce worm loss during transfers
LoBind tubes Eppendorf 22431081
Magnesium sulfate Fisher Scientific M/1100/53
Plate reader- infinite M nano+ Tecan Monochromator setup enables fluorescence tuning but adequate filter-based setups may be used
Plate reader- Spark Tecan
Potassium phosphate monobasic Honeywell P0662
Sodium chloride Sigma-Aldrich S/3160/63
Stereomicroscope setup with transillumination base Leica MZ6, or M80 Magnification from 0.6-0.8x up to 40-60x is necessary, as is a good quality transillumination base with a deformable, titable or slidable mirror to adjust contrast
t-BHP (tert-Butyl hydroperoxide) Sigma-Aldrich 458139
Transparent adhesive seals Nunc Fisher Scientific 101706871 It is important that it is transparent and that it can tolerate the temperatures involved in the assays.
Tryptophan Sigma-Aldrich 1278-7099
Yeast extract Fisher Scientific BP1422

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Biologie Ausgabe 182
Hochdurchsatz-Screening mikrobieller Isolate mit Auswirkungen auf die Gesundheit von <em>Caenorhabditis elegans</em>
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Ali, I., Martin, J.,… More

Ali, I., Martin, J., Zárate-Potes, A., Benedetto, A. High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health. J. Vis. Exp. (182), e63860, doi:10.3791/63860 (2022).

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