Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Caenorhabditis elegans Health Üzerinde Etkisi Olan Mikrobiyal İzolatların Yüksek Verimli Taraması

Published: April 28, 2022 doi: 10.3791/63860
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Division of Biomedical and Life Sciences, Lancaster University
* These authors contributed equally

Summary

Bağırsak mikropları, konakçılarının sağlığını spesifik veya korunmuş mekanizmalar yoluyla olumlu veya olumsuz yönde etkileyebilir. Caenorhabditis elegans , bu tür mikropları taramak için uygun bir platformdur. Mevcut protokol, solucan sağlığı için bir vekil olarak kullanılan nematod stres direnci üzerindeki etki için 48 bakteri izolatının yüksek verimli taramasını açıklamaktadır.

Abstract

Küçük boyutu, kısa ömrü ve kolay genetiği ile Caenorhabditis elegans , mikrobiyal izolatların konakçı fizyolojisi üzerindeki etkisini incelemek için uygun bir platform sunar. Aynı zamanda ölürken mavi renkte floresan yapar ve ölümü tespit etmek için uygun bir araç sağlar. Bu özellik, yüksek verimli etiketsiz C. elegans hayatta kalma testleri (LFASS) geliştirmek için kullanılmıştır. Bunlar, popülasyon medyan ölüm zamanının türetilebileceği çok kuyulu plakalara yerleştirilmiş solucan popülasyonlarının hızlandırılmış floresan kaydını içerir. Bu çalışma, C. elegans'ın şiddetli ısı ve oksidatif streslere duyarlılığı üzerindeki etkileri için birden fazla mikrobiyal izolatı aynı anda taramak için LFASS yaklaşımını benimsemiştir. Özellikle probiyotikleri ön taramak için kullanılabilecek bu tür mikrobiyal tarama boru hattı, konakçı sağlığı için bir vekil olarak şiddetli stres direnci kullanarak burada bildirilmiştir. Protokol, hem C. elegans bağırsak mikrobiyotasının izole koleksiyonlarının hem de senkron solucan popülasyonlarının tahliller için birleştirilmeden önce çok kuyulu dizilerde nasıl yetiştirileceğini açıklar. Verilen örnek, paralel olarak iki stres tahlilinde 47 bakteri izolatının ve iki solucan suşu üzerinde bir kontrol suşunun test edilmesini kapsamaktadır. Bununla birlikte, yaklaşım boru hattı kolayca ölçeklenebilir ve diğer birçok yöntemin taranması için uygulanabilir. Böylece, C. elegans sağlığını etkileyen biyolojik ve biyokimyasal koşulların multiparametrik bir manzarasını hızlı bir şekilde araştırmak için çok yönlü bir kurulum sağlar.

Introduction

İnsan vücudu, öncelikle bağırsak, cilt ve mukozal ortamlarda bulunan tahmini 10-100 trilyon canlı mikrobiyal hücreyi (bakteri, arkea mantarı) barındırır1. Sağlıklı bir durumda, bunlar vitamin üretimi, bağışıklık sisteminin olgunlaşması, patojenlere karşı doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık tepkilerinin uyarılması, yağ metabolizmasının düzenlenmesi, stres yanıtlarının modülasyonu ve daha fazlası dahil olmak üzere konakçılarına büyüme ve gelişme, hastalık başlangıcı ve yaşlanma üzerinde etkili olan faydalar sağlar 2,3,4,5 . Bağırsak mikrobiyotası da yaşam boyunca önemli ölçüde gelişir. En şiddetli evrim bebeklik ve erken çocuklukdöneminde meydana gelir 6, ancak Bifidobacterium bolluğunda bir azalma ve Clostridium, Lactobacillus, Enterobacteriaceae ve Enterococcus türlerinde bir artış da dahil olmak üzere yaşla birlikte önemli değişiklikler meydana gelir7. Yaşam tarzı, dysbiosis'e (faydalı bakteri kaybı, fırsatçı bakterilerin aşırı büyümesi) yol açan bağırsak mikrobiyal bileşimini daha da değiştirebilir, enflamatuar bağırsak hastalığı, diyabet ve obezite5 gibi çeşitli patolojilere neden olabilir, ancak aynı zamanda Alzheimer ve Parkinson hastalıklarına da katkıda bulunabilir 8,9,10,11.

Bu gerçekleşme, bağırsak fizyolojisi (şimdi içindeki mikroplar dahil) ve sinir sistemi arasındaki etkileşimlerin hayvan metabolizmasının ve fizyolojik işlevlerin ana düzenleyicisi olarak kabul edildiği bağırsak-beyin ekseni (GBA) kavramının rafine edilmesine kritik katkıda bulunmuştur12. Bununla birlikte, mikrobiyotanın bağırsak-beyin sinyalizasyonundaki kesin rolü ve ilişkili etki mekanizmaları tam olarak anlaşılmaktan uzaktır13. Bağırsak mikrobiyotasının sağlıklı yaşlanmanın önemli bir belirleyicisi olmasıyla, bakterilerin yaşlanma sürecini nasıl modüle ettiği yoğun bir araştırma ve tartışma konusu haline gelmiştir 6,14,15.

Yuvarlak kurt Caenorhabditis elegans'ın, diğer türlerde olduğu gibi, Bacteroidetes, Firmicutes ve Actinobacteria16,17,18,19,20 tarafından domine edilen iyi niyetli bir bağırsak mikrobiyotasına ev sahipliği yaptığının gösterilmesiyle, konakçı-bağırsak kommensal etkileşimlerini incelemek için deneysel bir platform olarak hızlı yükselişi21,22,23,24 ,25,26 araştırma cephaneliğimizi önemli ölçüde genişletti26,27,28,29. Özellikle, C. elegans'ın gen-diyet, gen-ilaç, gen-patojen vb. etkileşimlerini incelemesi için mevcut olan yüksek verimli deneysel yaklaşımlar, bakteriyel izolatların ve kokteyllerin C. elegans sağlığını ve yaşlanmasını nasıl etkilediğini hızlı bir şekilde keşfetmek için uyarlanabilir.

Mevcut protokol, probiyotikleri tanımlamak için kullanılabilecek sağlık için bir vekil olarak C. elegans stres direnci üzerindeki etkileri için çok kuyulu plakalara yerleştirilmiş bakteri izolatlarının veya karışımlarının dizilerini bir kerede taramak için deneysel bir boru hattını tanımlamaktadır. Bir floresan plaka okuyucu kullanarak otomatik stres direnci analizi için solucanları işlemeden önce büyük solucan popülasyonlarının nasıl yetiştirileceğini ve bakteri dizilerinin 96 ve 384 kuyucuklu plaka formatlarında nasıl ele alınacağını detaylandırır (Şekil 1). Yaklaşım, ölüm floresansı31 fenomeninden yararlanan etiketsiz otomatik hayatta kalma tahlillerine (LFASS)30 dayanmaktadır; burada ölmekte olan solucanlar, ölüm zamanını belirlemek için kullanılabilecek bir mavi floresan patlaması üretir. Mavi floresan, C. elegans bağırsak granüllerinde (lizozom ile ilişkili bir tür organel) depolanan antranilik asidin glukozil esterleri tarafından yayılır ve bu da ölüm üzerine solucan bağırsağında nekrotik bir kaskad tetiklendiğinde patlar31.

Figure 1
Şekil 1: C. elegans'ın strese karşı direnci üzerinde etkisi olan bakteriyel izolatların yüksek verimli taranması için deneysel iş akışı . (A) Solucan ve bakteri bakımı ve tahlil kurulumu için zaman çizelgesi. (B) 96 kuyucuklu bakteri plakası dizisi kurulumu ve kullanımı. (C) 384 delikli sonsuz plaka kurulumu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu çalışma için paralel olarak kullanılan iki C. elegans suşu Bristol N2 vahşi tipi ve HT1890: daf-16 (mgDf50) idi ve benzer oranlarda büyüyordu. Bununla birlikte, protokol, benzer büyüme oranlarına sahip iki suşun herhangi bir kombinasyonu ile çoğaltılabilir. Diğer suşları paralel olarak test ederken (örneğin, vahşi tip ve yavaş büyüyen daf-2 mutantları), farklı büyüme oranlarının dikkate alınması gerektiğini ve buna göre protokolün ayarlanması gerektiğini unutmayın. Aşağıdaki protokoldeki solucan ve bakterilerin zaman çizelgeleri ve miktarları, tetraplikatlardaki iki LFASS tahlilinde iki solucan suşu üzerinde 48 bakteri izolatının paralel testi için optimize edilmiştir. Paralel olarak daha fazla koşul test edilecekse ayarlamalara ihtiyaç duyulacaktır. Escherichia coli OP50 bakteri suşu, Minnesota Üniversitesi Caenorhabditis Genetik Merkezi'nden (CGC) elde edildi. 48 bakteri izolatı Schulenburg laboratuvarından elde edildi ve LB agarında tutuldu.

1. C. elegans OP50'de kültürleme (Gün 1 - 8)

NOT: Mevcut yaklaşım, C. elegans hermafroditlerini her aşamada katı bir ortamda yetiştirmeyi amaçlamaktadır ve hala yaygın olarak kullanılan standart büyüme koşulları32,33'e mümkün olduğunca yakın kalmak için gereksiz diyet değişikliklerini (yani, NA22 gibi alternatif daha hızlı büyüyen E. coli suşları veya yumurta plakaları gibi daha zengin büyüme ortamları kullanarak) önlemeyi amaçlamaktadır. Solucan büyüme sıcaklığı (burada 15 ° C'ye ayarlanmıştır), kullanılan C. elegans suşlarına bağlıdır ve ayarlanması gerekebilir (örneğin, sıcaklığa duyarlı bir fenotip veya biyobelirtecin ekspresyonunu önlemek veya tetiklemek için). Solucan yetiştiriciliği hakkında bilgi için lütfen referans33'e bakınız.

  1. Solucan suşu başına sekiz adet 6 cm çapında NGM plakası (10 mL nematod büyüme ortamı agar, NGM, Ek Dosya 1)32,33 hazırlayın ve oda sıcaklığında 1 gün kurumaya bırakın.
  2. 50 mL'lik bir konik tüp içinde 25 mL OP50 ortamında (Ek Dosya 1) taze yetiştirilmiş bir Lysogeny Broth agar (LB agar, Ek Dosya 1) plakasından tek bir bakteri klonu tohumlayarak E. coli OP50 bakterilerinin doymuş bir sıvı kültürünü hazırlayın. Kültürü bir çalkalayıcı inkübatörde gece boyunca 37 ° C'de büyütün.
  3. Suş başına sekiz adet 6 cm'lik NGM plakasını, plaka başına 100 μL doymuş sıvı kültürü olan E. coli OP50 ile aşılayın ve plakaları kullanımdan önce 2 gün boyunca 20 ° C'de tutun.
  4. Bir neşter kullanarak, yakın zamanda aç kalmış bir NGM plakasından solucanlarla 0,5 cm'lik kare bir agar parçasını kesin ve sekiz aşılanmış 6 cm'lik NGM plakasının her birine aktarın ve bu plakaları 3 gün boyunca (veya solucanlar yiyeceği bitirene kadar) 20 ° C'de inkübe edin.
  5. Solucan suşu başına beş adet 15 cm'lik NGM plakası hazırlayın (plaka başına 30 mL NGM ortamı) ve 3 mL OP50 ile aşılayın. Gece boyunca 37 ° C'de inkübe etmeden önce plakaları kurumaya bırakın. Sonraki adımlarda kullanana kadar plakaları 20 ° C'de tutun.
  6. Bir P-1000 pipet kullanarak, solucanları yeniden askıya almak için 6 cm'lik NGM plakalarına (Adım 1.1.) 3 mL'ye kadar steril M9 tamponu (Ek Dosya 1) ekleyin ve solucan çözeltisini tek bir 15 mL konik tüpte gerinim başına sekiz plakanın hepsinden toplayın.
    1. 4 °C'de 2 dakika boyunca 142 x g'de santrifüj. Bir P-5000 pipet veya steril bir Pasteur pipet veya uç ile donatılmış bir su pompası kullanarak süpernatantı dikkatlice çıkarın. Solucan peletini yıkamak için 10 mL steril M9 tamponu ekleyin. 2x tekrarlayın.
    2. Süpernatantı (mümkün olduğunca) çıkarın ve solucanları bir pipet kullanarak 15 cm OP50 aşılanmış bir NGM plakasına (Adım 1.5.) aktarın. 0,5 mL konsantre OP50 kültürü ekleyin.
    3. Konsantre OP50 yapmak için, dört adet 1 L LB şişesinin her birini 2 mL OP50 başlangıç kültürü (Adım 1.2'de hazırlanmıştır) ile aşılayın ve 37 ° C'de ve 160 x g'de 6 saat boyunca sallanan bir inkübatörde büyütün. Bakterileri 3057 x g ve 20 °C'de 15 dakika boyunca toplayın. Süper nantantı atın, bakteri peletlerini 6 mL OP50 ortamı ile yeniden askıya alın ve steril 50 mL konik bir tüpte toplayın.
      NOT: Bakteriler 4 °C'de 1 haftaya kadar saklanabilir.
  7. Her solucan suşunu 15 cm çapında bir NGM plakası üzerinde 15 °C'de 3-4 gün boyunca büyütün ve solucanları günde 0,5 mL konsantre OP50 ile yeniden besleyin.
    1. Solucanlar yiyeceği neredeyse bitirdikten sonra, M9 tamponunda toplayın ve yıkayın (Adım 1.6.1.), her solucan suş kültürünü iki adet 15 cm NGM plakasına aktarın (Adım 1.5.) ve solucanları 20 ° C'de popülasyonun ~% 95'i yerçekimi yetişkinleri olana kadar yayar (vahşi tip Bristol N2 için yaklaşık 24 saat sürecektir).
      NOT: Yerçekimi yetişkinleri, solucan içindeki yumurtaların varlığı ile karakterize edilir ve ideal plaka, çok fazla larva olmadan plakaya serilmiş yumurtadan çıkmamış yumurtaların bolluğuna da sahip olmalıdır33.

2. Bağırsak mikrobiyota izolatı koleksiyonlarının bakımı (9. Gün)

  1. 48 bakteri izolatını ayrı ayrı 6 cm LB agar plakalarına çizin ve 20 ° C'de 48 saat boyunca büyüyün.
    NOT: Bakteriler daha erken gerekirse 24-36 saat boyunca 25 ° C'de yetiştirilebilir, ancak daha uzun 20 ° C büyüme potansiyel kirleticilerin tespit edilmesine izin verir.
  2. Çok sayıda C. elegan'ı senkronize edin.
    1. Standart yumurta hazırlama yöntemi33'ü izleyerek yetişkin solucanları ağartın ve sonraki adımlarda tüm L1 larvalarının yumurtadan çıkmasına ve eşzamanlı olarak büyümesine izin vermek için yumurtaları 15 ° C'de 24 saat boyunca iki tohumlanmamış 15 cm NGM plakasına aktarın.
      DİKKAT: Ağartıcı çözeltilerini kullanırken dikkatli olun.

3. Büyük C. elegans kültürlerinin yetiştirilmesi (10. Gün)

  1. Yumurtadan çıktıktan sonra, L1 larvalarını (Adım 2.2.1'den.) temiz bir konik 15 mL tüpte 3-4 mL M9 içinde toplayın. Bir slayt veya plaka üzerine dört adet 10 μL damla solucan çözeltisi pipetleyin ve stereomikroskop altında her damladaki solucan sayısını 16x büyütmede sayın. Solucan çözeltisinin tüm damlalarından larva sayısının ortalamasını alarak çözeltinin solucan konsantrasyonunu belirleyin. Bu değeri kalan hacimle çarpın ve her bir suş için toplam solucan sayısını tahmin edin.
    NOT: Bu aşamada suş başına 46.000-50.000 L1 larva daha sonra 384 kuyucuklu bir plakayı veya iki yarım plakayı doldurmak için gereklidir.
    1. Her bir suş için, tüm L1 larvalarını daha önce 3 mL OP50 (Adım 1.5.) ile aşılanmış ve 0.5 mL konsantre OP50 ile yeniden tohumlanmış iki adet 15 cm NGM plakasına (plaka başına 23.000-25.000 L1) aktarın.
  2. 15 °C'de inkübe edin, solucanlar L4 aşamasına ulaşana kadar gerektiğinde günde 0,5 mL konsantre OP50 ile doldurun.
    NOT: L4 aşaması, biraz daha koyu bir bağırsak ve vulvanın sonunda32,33'ü oluşturacağı yarım disk veya hilal şeklinde beyaz bir yama ile karakterize edilir.
  3. Aşağıdaki adımları izleyerek 96 delikli NGM-agaroz plakaları hazırlayın.
    1. Her bir kuyucuğu 125 μL NGM-agaroz (tahlil başına dört plaka) ile doldurarak sekiz adet 96 kuyucuklu NGM-agaroz plakası hazırlayın.
      NOT: Sonraki adımlarda bazıları kirlenirse bazı ekstra plakaların plakalanması önerilir. Tahlilleri paralel olarak çalıştırmak için iki plaka okuyucu gerekecektir, ancak 6 saat kadar kısa bir süre boyunca çalıştırılabildiğinden, ısı gerilimi tahlili ile başlayarak art arda da çalıştırılabilirler. Bu plakalar için, %<4 kül agar, agaroz ile değiştirilir ( Malzeme Tablosuna bakınız), NGM tapaları boyunca daha yavaş ve daha eşit kurumasını sağlar ve daha iyi geri kazanım için solucan yuvasını azaltır.
    2. Kuyuların eşit ve kabarcıksız bir şekilde doldurulduğundan emin olun. İşlem sırasında karışımın katılaşmasını önlemek için 70 ° C'ye ayarlanmış bir ısı bloğu kullanın (çok kuyulu plakanın plastiğinden yavaş ısı transferi ile, NGM-agaroz sadece yaklaşık 55-60 ° C'ye kadar ısınabilir). Kuyucukların içindeki kabarcıkları gidermek için, steril bir alevle ısıtılan iğne kullanın.
    3. 96 delikli plakaların ters çevirmeden önce steril bir ortamda oda sıcaklığına ayarlanmasına izin verin (yoğuşmayı önlemek için kapağı aşağı indirin) ve 4 °C'de temiz bir kutuda ihtiyaç duyulana kadar saklayın.
  4. 11. Günde, solucanları Adım 3.2'den kontrol edin, kontaminasyonun ortaya çıkmadığından ve solucanların hala dolu olduğundan emin olun.
  5. 12. Günde, solucanları Adım 3.1.'den kontrol edin, herhangi bir kirlenmenin ortaya çıkmadığından ve solucanların hala dolu olduğundan emin olun. Ayrıca, solucanların gelişim aşamasını kontrol edin.
    NOT: Kullanılan L4 veya L4 + 24 saat solucanlar gibi solucanın cinsiyeti/suşu ve gelişim aşaması, solucanların maruz kaldığı tedavilere bağlıdır. Burada, vahşi tip hermafroditler 36 saat boyunca L4'ten bakteriyel izolatlara maruz bırakıldı.

4. Solucanları yeniden beslemek için bağırsak mikrobiyota izolatı koleksiyonlarının hazırlanması

  1. LB agar plakalarındaki bakteri büyümesini Adım 2.1'den itibaren izleyin. ve 20 ° C'de kuluçkaya devam edin.
    NOT: İdeal olmasa da, bazı klonların büyümemesi veya kontaminasyonları ortaya çıkarmaması durumunda, bakteriler temiz stoklardan 6 cm LB plakalarına yeniden çizilebilir ve deneye hazır olmak için 24 saat boyunca 25-28 ° C'de yetiştirilebilir.
  2. Test edilen bakteri toplama için 96 kuyucuklu bir dizi düzeni tanımlayın, sonraki adımlarda sistematik plaka tohumlamayı ve veri analizini kolaylaştırın (Ek Tablo 1).
  3. Bakteri kütlesini her 6 cm'lik bakteri plakasından toplayın (Adım 4.1.) ve 1 mL M9 tamponu içeren etiketli 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Bunu, tek kullanımlık 2 mm çapında steril plastik halka veya 5 mm çapında metal halka kullanarak gerçekleştirin. Bakteri suşları arasındaki metal halkayı% 100 etanol içine batırarak, alevlendirerek ve 5 saniye soğutarak sterilize edin.
  4. Bakteriyel peletler tamamen yeniden askıya alınana kadar mikrosantrifüj tüplerini vorteks edin (bakteri suşuna bağlı olarak, bu ~ 1-10 s sürebilir).
  5. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 9.300 x g'da döndürün, 700 μL süpernatan çıkarın ve bakteriyel peleti vorteks yaparak yeniden askıya alın.
  6. Her bakteri süspansiyonunun 200 μL'sini, Adım 4.2'de belirtilen düzene göre boş steril 96 delikli bir plakanın tek bir kuyucuğuna aktarın.
  7. Bu plakadan, çok kanallı bir pipet kullanarak sekiz adet 96 delikli NGM-agaroz plakasını (Adım 3.3'te hazırlanmıştır.) 10 μL bakteri çözeltisi ile aşılayın ve kapak 24 saat boyunca 25 ° C'de açık olacak şekilde inkübe edin. Plaka kurumasına ve bakteriyel aerobik büyümeye izin vermek ve aşırı yoğuşmayı önlemek için plakaları kapatmayın.
  8. Adım 4.6'da hazırlanan 96 delikli süspansiyon plakasını kapatın. temiz yapışkan sızdırmazlık filmi ile ( bakınız Malzeme Tablosu) ve 15 °C'de 5 güne kadar saklayın. Bu, gerektiğinde solucanın yeniden beslenmesi için kullanılacaktır.

5. LFASS ısı şoku ve oksidatif tahlil kurulumu (Gün 13 - 14)

  1. Adım 3.5'teki plakalara bakarak, solucanların gelişim aşamasını değerlendirin. Solucanların% >90'ı L434'e ulaştığında, solucanları 15 mL konik tüplerde 10 mL'ye kadar steril M9 çözeltisinde toplayın.
  2. Solucanları, 4 ° C'de 2 dakika boyunca 142 x g'de döndürerek, süpernatanı çıkararak ve OP50 bakterilerinden kurtulmak için her yıkama arasına 10 mL taze steril M9 ekleyerek kapsamlı bir şekilde (en az 4x) yıkayın. Solucan peletini 10 mL M9'da yeniden askıya alın.
  3. 50 μL solucan çözeltisini, 950 μL M9 içeren düşük yüzeyli bir bağlama tüpüne aktarın (bkz. Solucan çökelmesini önlemek için tüp içeriğini nazikçe karıştırdıktan sonra, 3-4 ayrı 10 μL damlayı bir cam slayta veya bir NGM plakasına aktarmak için ıslatılmış düşük bağlantılı bir pipet ucunu hızlı bir şekilde kullanın ve solucan sayılarını bir stereomikroskop altında 16x büyütmede sayın (bkz. 3-4 damladan gelen sayımların ortalamasını alın ve solucan çözeltisindeki mikrolitre başına solucan sayısını belirleyin (bkz. Adım 3.1.).
  4. 8 μL'de ~ 120 solucana ulaşmak için 10 mL tüpteki solucan konsantrasyonunu ayarlayın. Çözelti Adım 5.2'de hazırlanmışsa. yeterince konsantre değilse, solucanları aşağı doğru döndürün ve 8 μL başına 120 solucana ulaşmak için M9'u buna göre çıkarın.
  5. Adım 4.7'den itibaren sekiz adet 96 delikli NGM-agaroz plakasının kuyucuklarının her birine 8 μL solucan çözeltisi (~120 solucan) aktarın. Solucan kaybını sınırlamak için düşük tutma ipuçları kullandığınızdan emin olun. Büyük yetişkin solucanların yetişkin solucanlar üzerindeki mekanik stresi sınırlamasına izin vermek için uç uçlarını kesmek de gerekebilir.
    NOT: Tahlil, güvenilir bir şekilde çalışmak için en az 30 canlı sağlıklı solucan gerektirir, ancak kuyu başına yaklaşık 100 solucanla en iyi şekilde çalışır.
  6. Solucan ve bakteri tohumlu 96 delikli NGM-agaroz plakalarını 36 saat boyunca 25 °C'de inkübe edin.
  7. Plakaları 12-24 saat arasında kontrol edin ve solucanların boyunca dolu kalmasını sağlayın. Yeniden besleme gerekiyorsa, Adım 4.8'de 15 ° C'de depolanan 96 kuyucuklu bakteri dizisi plakasındaki bakterileri yeniden askıya alın ve 36 saatlik kuluçka süresinin bitiminden önce solucanların açlık riski altında olduğu 96 kuyucuklu NGM-agaroz plakalarına karşılık gelen bakteri çözeltisinin 10 μL'sine kadar ekleyin (aç solucanlar çok farklı sonuçlar üretecektir, bu yüzden bu çok önemlidir).
    NOT: Aşağıdaki adımların 15. günde gerçekleştirilmesi gerekir. Tahlil işlemine başlamadan önce, okuma yüksekliğini optimize etmek gerekebilir. En uygun okuma, kuyunun dibinden 20-50 μm yukarıda elde edilecektir. Bu, plaka okuyucunun modeline bağlı olacaktır. Bazıları Z-tarama imkanı sunarken, diğerleri manuel yükseklik girişine izin verir. En yüksek mavi floresan (365 nm/430 nm) sinyalinin algılandığı seviyede optimum yüksekliği ayarlayın. Bazı plaka okuyucular, yapışkan hücre tahlilleri için optimize edilmiş sabit bir yükseklikte çalışabilir ve LFASS tahlilleri için ideal olmayabilir.
  8. 36 saat sonra, 96 delikli plakanın her bir kuyucuğuna 30 μL M9 dağıtın.
    NOT: Termal gerilim analizleri için, plaka okuyucunun testi gerçekleştirmek için gerekli sıcaklığa ulaşmış olması ve önceden açılması gerekebilir. Mevcut protokol, öldürme hızını en üst düzeye çıkarmak için 42 ° C kullanır, ancak yaklaşım 30 ° C'nin üzerindeki diğer sıcaklıklar için de geçerlidir.
  9. Düşük tutma uçları kullanarak solucanları (yaklaşık 20 μL) ayarlanmış düzenlere göre 384 delikli plakaya aktarın (büyük solucanların yetişkin solucanlar için mekanik stresi azaltmasına izin vermek için uçların ucunu kesmeyi düşünün).
    NOT: Bu çalışmada, burada açıklanan iki tahlil için iki farklı plaka okuyucu ayarı kullanılmıştır (termal stres ve oksidatif stres) ve bu nedenle bu iki tahlil için amaçlanan numuneler aynı 384 delikli plakada kaplanmamalıdır.
  10. Plaka okuyucuların doğru şekilde ayarlandığından emin olun (Tablo 1).
  11. 384 kuyucuklu plakaları daha fazla M9 ile doldurun ve kuyu başına 60 μL'lik bir son hacim elde edin. Termal gerilme testi için, 40 μL M9 ekleyin ve t-BHP kaynaklı oksidatif stres için, 6 μl t-BHP'ye 34 μl M9 ekleyin (bkz.
    1. Tahlili t-BHP ekledikten sonraki 2 dakika içinde başlatın (ideal olarak, tüm solucanlar aynı anda t-BHP'ye maruz bırakılmalıdır, tahlil süresi çözünürlüğü 2 dakikadır). Mümkün değilse, medyan ölüm zamanının daha sonra ayarlanmasına izin vermek için tahlil başlamadan önce t-BHP'yi pipetlemek için harcanan süreyi tahmin etmek için bir zamanlayıcı kullanın.
  12. Plakaları şeffaf kapaklarıyla kapatın. 384 delikli plakaların kenarlarını maskeleme bandı ile kapatın (plaka ve kapağın üzerine bantlama), bandın kapağın üzerinden veya plakanın altından geçmemesini sağlayın. Tahlil sırasında buharlaşmayı en aza indirirken hava değişimine izin vermek için bir neşter kullanarak kapak ve plaka arasındaki bandı aralıklarla kesin.
  13. Plakayı plaka okuyucuya yerleştirin (bkz. Malzeme Tablosu) ve çalıştırmaya başlayın. 365 nm'de heyecanlanmayı hedefleyin ve 6-12 saat boyunca her 2 dakikada bir 435 nm'de emisyon tespit edin (Tablo 1).
    NOT: Tipik olarak, 42 °C ısı gerilimi testleri için 6 saat ve %7 t-BHP oksidatif stres tahlilleri için 8 saat yeterlidir.

6. Plaka okuyucu veri işleme

  1. Ham floresan verilerini plaka okuyucudan virgülle veya sekmeyle ayrılmış .txt, .csv veya .xls /.xlsx biçimlerinde kaydedin ve ardından xls /.xlsx biçimine dönüştürün. Veri biçimine bağlı olarak, bunları LFASS analizi için gereken excel sayfası düzeniyle eşleşecek şekilde yeniden düzenleyin. Referans30'da verilen ayrıntılı talimatları izleyin.
    NOT: Veriler manuel olarak analiz edilebilirken, her zaman serisini normalleştirerek ve ölüm floresansının maksimum yarıya ulaştığı zamanı arayarak, LFASS rutin30'u çalıştıran Matlab'da otomatik analiz yapılabilir.
  2. Matlab (sürüm 2014a veya üzeri) ve LFASS yazılım paketini https://github.com/ABA80/LFASS'den indirip yükleyin. İçinde sağlanan yönergeleri ve ek açıklamaları izleyin.
    NOT: Şekil 1C, yaklaşımın kısa bir açıklamasını vermektedir. LFASS rutinini çalıştırmak için Matlab gereklidir. Alternatif olarak, Matlab kodu, tescilli olan uygulama işlevi dışında Oracle'a çevrilebilir. Yeni yumuşatma ve sigmoid işlevleri, tamamen açık kaynaklı bir platformda kullanımı sağlamak için yeniden yazılabilir.
  3. LFASS analizleri arasında, LFASS analizi veri klasöründeki tüm dosyaları işleyeceğinden ve Sonuçlar klasöründeki dosyaların üzerine yazacağından verileri ve sonuçları yeni bir konuma taşıyın.

7. Veri denetimi

  1. Excel dosyasını açın ve satırları 384 kuyucuklu plakadaki kuyu konumuna göre etiketleyin. Ek Dosya 2, ısı şoku testi için oluşturulan ham floresan verilerinin excel dosyasının bir örneğini gösterir. Solucanı ve bakteri suşlarını etiketlemek için 384 delikli plakadaki kuyu konumunu kullanın.
  2. Matlab analizinden önce, excel'deki verileri görsel olarak inceleyin ve temsili bir kuyu için zaman içindeki floresan yoğunluğunu çizin. Kullanılan plaka okuyucuya bağlı olarak, veriler gürültülü olabilir, ancak net bir tepe noktası göstermelidir. Özellikle:
    1. Bir zirvenin gürültüden önemli ölçüde farklı olmayacağı bir floresan değeri belirleyin (LFASS'de böyle bir eşik belirlemek, boş kuyuları hariç tutarak analizi hızlandıracaktır).
    2. Floresan dalgalanmalarının yükselmeden önce sönümlendiği en erken zaman noktasına dikkat edin (hayvanlar 30 dakikaya kadar kuvvetli bir şekilde çarpabilir ve bu da hızlı dalgalanan mavi floresan okumalarına yol açabilir).
      NOT: Tepe noktası, bu erken zaman noktalarını eğri uygulama penceresinden hariç tutarak iyileştirilebilir.
    3. Eğri uyumu için kullanılacakları için minimum ve maksimum floresan değerlerinin düşmesi beklenen zaman noktalarına dikkat edin (bu aralıkları tanımlamak için birkaç kuyuya bakın).
    4. Floresan zirvelerinin genliklerinin kuyular arasında önemli ölçüde farklılık gösterip göstermediğini kontrol edin, aşağıdaki formülü kullanarak daha fazla analiz yapmadan önce verileri normalleştirin:
      Normalleştirilmiş floresankuyusu n (t) = (Floresankuyusu n [t] - minimum floresan kuyusu [Dt]) / (maksimum floresan kuyusu [Dt] - minimum floresan kuyusu [Dt])
      burada "n" geçerli kuyu sayısı, "t" zaman noktasıdır ve "Dt" tahlil için zaman noktaları dizisidir.

8. LFASS veri işleme

NOT: Ayrıntılar https://github.com/ABA80/LFASS ve Referans30'un ek materyallerinde verilmiştir.

  1. LFASS klasöründe, biri analiz edilecek veriler ve diğeri sonuçlar için olmak üzere iki alt klasör oluşturun, örneğin, "verilerim" ve "sonuçlar".
  2. Veri incelemesinden sonra tahlil excel veri dosyasını LFASS alt klasörü "verilerim" klasörüne kopyalayın.
  3. MATLAB'ı başlatın, LFASS klasörüne gidin, komut penceresinde fitfolder yazın ve çalıştırın (Ek Dosya 3). Ardından ekrandaki talimatları izleyin.
  4. "fitfolder" yazdıktan sonra, sistem excel dosyasının bulunduğu klasörün adını, örneğin 'verilerim'i sorar. Veri klasörünüzün adını yazın (bu örnekte, "verilerim").
  5. İstenen çeşitli parametreleri sağlayarak ekrandaki talimatları izleyin.
    1. Geçerli protokoldeki ardışık ölçümler arasındaki zaman aralığı için "2" girin (bunu belirtmek, sonuçların zaman noktası birimleri yerine dakika cinsinden ifade edilmesini sağlar).
      NOT: Zaman aralığı, floresan ölçümlerini az ya da çok sık yapmak için (zaman çözünürlüğünü azaltmak veya artırmak için) ve ayrıca plaka okuyucu özelliklerine bağlı olarak değiştirilebilir (yani, yeterince hızlı ölçümler gerçekleştiremeyen plaka okuyucular için zaman aralığının arttırılması gerekebilir). Deneysel zaman aralığını her zaman LFASS rutini ile eşleştirdiğinizden emin olun.
    2. Sigmoid uyumunu sınırlamak için "0,95" (uyumu artırmak için gerektiğinde değiştirilebilir) yazarak üst tolerans eşiğini ve "0,05" yazarak (uyumu iyileştirmek için gerektiğinde değiştirilebilir) alt tolerans eşiğini atayın.
      NOT: Diğer zaman parametreleri, veri incelemesinden alınan kullanıcı notlarına dayanmaktadır (Adım 7.2.).
  6. İstendiğinde EVET için "y" veya HAYIR için "n" yazarak takılı ve pürüzsüzleştirilmiş eğrilerin görüntülenip görüntülenmeyeceğini seçin. Yakınsak uyumları görsel olarak incelemek için ilkini seçin.
    NOT: İkincisi, düzgünleştirilmiş tüm verileri görselleştirmek için kullanışlıdır, ancak çok fazla açılır grafik oluşturduğundan genellikle seçilmez. Bunu takiben, Matlab, tek seferde birden fazla excel dosyası işleniyorsa 1-10 dakika sürebilen LFASS rutinini yürütecektir. Eğrileri olan açılır pencereler, Adım 8.6'daki seçime göre görünecektir. Ek Dosya 4A, takılı bir eğrinin bir örneğini gösterir.
  7. (1) gürültü olarak tanımlanan eğrileri analiz etmeyi veya (2) kötü takılmış eğrileri [y/n] seçeneğiyle yeniden düzenlemeyi seçin. Onaylamak için y ve reddetmek için n yazın.
    NOT: Özellikle çok sayıda kötü takılmış veya takılmamış eğri varsa, yeniden takmanın onaylanması önerilir. Bu, kullanıcının ekranda göründükleri gibi her eğri için özel eğri uydurma parametreleri sağlamasına ve yalnızca sigmoid uyumu için daha önceki ve sonraki sınırları istemesine olanak tanır. Gerektiği kadar denenebilir.
  8. Veriler analiz edildikten sonra Matlab'ı kapatın ve LFASS klasörünü açın.
  9. Sonuç dosyaları otomatik olarak Sonuçlar klasörüne kaydedildiğinden, LFASS alt klasörü Sonuçlarım'a .txt.
    NOT: Matlab üç .txt dosyası oluşturur: "Toplu donanımlı.txt", "Toplu ve gürültü donanımlı.txt" ve "Yeniden Takılı.txt". İlk ikisi, bir bilgisayarın çökmesi veya düzeltme sırasında kullanıcı hatası durumunda önlem olarak kaydedilir. En doğru eksiksiz analizi içeren dosya "Refitted.txt" dir.
  10. Refitted.txt dosyasını Microsoft Excel ile açın ve daha fazla işlem için .xls olarak kaydedin. Ek Dosya 4B, böyle bir sonuç dosyasının bir örneğini gösterir.
    NOT: Her kuyucuk için (satırlar halinde düzenlenmiş), solucan popülasyonunun medyan ölüm zamanının tahminlerini veren sütunlarda üç değer verilmiştir: "Ham": deneysel veri zirvesinin yarı maksimumunda kesişen zamanı bildirir; "Toplu donanımlı": toplu olarak takılan eğrinin yarı maksimumunda kesişme süresini bildirir; "Refitted": Yeniden takılan eğrinin maksimum yarısında kesişme süresini bildirir.
  11. Dosyayı .xls biçimde, güvenli bir konumda kopya olarak kaydedin. Bunu yapmamak, LFASS yordamının bir sonraki çalıştırmasında dosyaların üzerine yazılma riski taşır.
    NOT: Sonuçlar daha sonra grafik veya istatistiksel analiz için daha fazla işlenebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

LFASS testleri, stres direncine ve yaşlanmaya katkıda bulunan çok sayıda genetik ve mikrobiyota parametresinin taranması gibi aynı anda birden fazla test koşulunun sağlam, yüksek verimli ve hızlı bir şekilde taranmasını sağlar. Deneyin birden çok test koşullarından oluşan kapsamlı bir veri kümesi elde etmesi yalnızca 2-3 hafta sürer. L4 + 36 h yetişkin vahşi tip solucan popülasyonları, 36 saat boyunca 48 bağırsak mikrobiyal izolatı üzerinde 36 saatlik bir kültürden sonra 42 °C termal strese ve% 7 t-BHP kaynaklı oksidatif strese maruz bırakıldı. Tahlil dört kez gerçekleştirildi ve her koşul her tahlilde dört kez tekrarlandı. Test edilen tüm koşullarda, medyan ölüm süresi, termal stres testi için 40-130 dakika ve t-BHP kaynaklı oksidatif stres testi için 90-240 dakika arasında değişmiştir. Erken yetişkinlik termal stres testleri genellikle oksidatif stres testlerinden daha tutarlı sonuçlar ve daha az gün içi ve gün içi değişkenlik gösterir ve sonraki uzun ömürlülüğün daha iyi belirleyicileridir30. Farklı mikrobiyal diyetlerle beslenen solucanların medyan ölüm zamanındaki fark, bağırsak kommensallerinin konakçı stres direncini nasıl etkilediğini kesin olarak örneklemektedir. Şekil 2, Bristol N2 vahşi tip solucanlar için ilgilenilen iki bağırsak mikrobiyota izolatı ve standart laboratuvar suşu E. coli OP50 üzerindeki 16 biyolojik replikasyondan elde edilen tipik sonuçları göstermektedir.

Figure 2
Şekil 2: İki bakteri izolatı ve bir kontrol suşu üzerinde yetiştirilen solucanlardan elde edilen eşleştirilmiş ısı/oksidatif stres direnci testlerinden elde edilen temsili sonuçlar. (A) Isı stresi testi. Vahşi tip solucanlar, MYb11 (Pseudomonas lurida) veya MYb115 (Pseudomonassp.) bakteriyel izolatları veya OP50 kontrol bakterileri üzerinde 36 saat boyunca beslendi. MYb11 anlamlı derecede erken bir medyan ölüm zamanına yol açmıştır (p < 0.001). (B) Oksidatif stres testi. Vahşi tip solucanlar, MYb11 veya MYb115 bakteri izolatları veya OP50 kontrol bakterileri üzerinde 36 saat boyunca beslendi. MYb11 anlamlı derecede erken bir medyan ölüm zamanına yol açtı (p < 0.05). Dört örnek setinde 120-150 solucan analiz edildi ve her deney dörtlü olarak gerçekleştirildi. Düşük kaliteli / kötü takılmış verilere sahip kuyular, eksik değerlere yol açtı. Kutu çizim gösterimleri tek kuyucuk değerlerini, minimum, medyan ve maksimum değerleri gösterir. *Tek yönlü ANOVA ile p < 0.05 ve ***p < 0.001'de istatistiksel anlamlılığı gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

A
Parametre Ayar Yorum
Sıcaklık 25 °C
Floresan uyarma 365 nm 10 nm bant genişliği
Floresan emisyonu 430 mil 20 nm bant genişliği
Flaş sayısı 8 yanıp sönme, 1ms yerleşme süresi
Kazanç 100 karşı 130 Numuneye bağlı olarak ayarlanmalıdır. Tahlil başlangıcında 2-5 k okuma değerini hedefleyin
Gecikme süresi 1 μs
Entegrasyon süresi 30 μs
Okuma zaman aralığı Her 2 dakikada bir Gerilim şiddetine, süresine ve zaman aralığına bağlı olarak ayarlama gerekebilir (%7 t-BHP'de 8 saat yeterlidir)
Süre 8-12 saat
Okuma yönü Aşağıdan
B
Parametre Ayar Yorum
Sıcaklık 42 °C
Floresan uyarma 365 nm 10 nm bant genişliği
Floresan emisyonu 430 mil 20 nm bant genişliği
Flaş sayısı 8 yanıp sönme, 1ms yerleşme süresi
Kazanç 100 karşı 130 Numuneye bağlı olarak ayarlanmalıdır. Tahlil başlangıcında 2-5 k okuma değerini hedefleyin
Gecikme süresi 1 μs
Entegrasyon süresi 30 μs
Okuma zaman aralığı Her 2 dakikada bir Gerilim şiddetine, süresine ve zaman aralığına bağlı olarak ayarlama gerekebilir (42 °C'de 6 saat yeterlidir)
Süre 6-12 saat
Okuma yönü Aşağıdan

Tablo 1: Oksidatif ve ısı gerilme testi ayarları. Bu çalışmada kullanılan floresan plaka okuyucuları üzerinde oksidatif (A) ve ısı (B) stres testleri için kullanılan ayar örnekleri.

Ek Dosya 1: Medya, arabellek ve kültür tarifleri. Bu çalışmada kullanılan farklı ortam, tampon ve kültürlerin bileşimi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Dosya 2: Dışa aktarıldıktan ve excel .xls formatına dönüştürüldükten sonra plaka okuyucudan ham floresan verileri. (A) Excel dosyası, bir ısı şoku testi için ham floresan verilerini gösterir. Ham floresan verileri 2 dakikalık zaman aralığında gösterilir. (B) 384 delikli plaka üzerinde "kuyu konumu" bulunan sütun vurgulanır, bu da solucan ve bakteri suşlarını etiketlemek için kullanılabilir. (C) Dosya solucan ve bakteri suşları ile etiketlenmiştir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Dosya 3: Matlab kullanarak LFASS analizi. (A) Matlab'da LFASS klasörünü açtıktan sonra bir komut penceresi açılır. (B) Programı başlatmak için komut penceresine "fitfolder" yazılır ve analiz edilecek dosya ile klasörün adı belirtilir. (C) Program analiz için veri excel dosyasını bulduğunda, kullanıcı istenen çeşitli parametreleri sağlayarak ekrandaki talimatları izlemelidir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Dosya 4: Matlab kullanılarak LFASS verileri analiz edildi. (A) Matlab analizi yoluyla takılan bir eğri örneği, burada siyah çizgi önceki zaman sınırına karşılık gelen zaman noktasını ve mavi çizgi eğri uydurma için daha sonraki zaman sınırını gösterir. Takılan sigmoid eğri kırmızı renkle görüntülenir. (B) Matlab tarafından oluşturulan sonuç dosyası .xls formatında açılır. Değerler vurgulanır ve sayı biçiminde görüntülenir. İkinci sütun, ham veri eğrisindeki değerin ilk olarak maksimum değerin %50'sini aştığı zamanı sağlar. Üçüncü sütun, takılan eğrinin değerinin, toplu montaj analizi sırasında belirlenen maksimum değerin% 50'sine eşit olduğu zamanı sağlar. Dördüncü sütun, takılı eğrideki değerin, parti analizi ve gerektiğinde son yeniden montajdan sonra maksimum değerin% 50'sine eşit olduğu zamanı sağlar. Dördüncü sütun, bu nedenle, en güvenilir sonucu sağlamalıdır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Tablo 1: Örnek deneysel plaka düzenleri. (A) İki ayrı solucan suşu üzerinde 47 farklı solucan bağırsağı mikrobiyota bakteri izolatını test etmek için 96 kuyucuklu plaka düzeni, kontrol olarak canlı OP50 kullanılıyor. Çalıştırılan her tahlil için bu plakanın dört kopyası gereklidir. (B) Isı veya oksidatif gerilme tahlilleri için 384 kuyucuklu düzen, (A)'daki önceki 96 delikli plaka tahliline karşılık gelir. Bu kurulum, her koşul için tetraplikasyonların gerçekleştirilmesine izin verir ve her solucan suşu kendi OP50 kontrolüne sahiptir. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

C. elegans, küçük boyutu, şeffaflığı, hızlı gelişimi, kısa ömrü, ucuzluğu ve kullanım kolaylığı nedeniyle aynı anda birden fazla deneysel parametreyi hızlı bir şekilde taramak için birçok avantaj sunar. Oldukça basit genomu, vücut planı, sinir sistemi, bağırsak ve mikrobiyomu, ancak insanlara yeterince karmaşık ve benzer, biyoaktif etkinlik veya toksisite için test ederken mekanik anlayışın kazanılabileceği güçlü bir klinik öncesi model haline getirmektedir. Hastalıklar için mikrobiyal müdahalelerin geliştirilmesine olan ilgi arttıkça 8,9,34,35, probiyotikleri hızlı bir şekilde araştırmak için bu tür klinik öncesi modellerden yararlanmak, mikropların büyük ölçüde kullanılmayan ve neredeyse sınırsız terapötik potansiyeli ile çekici bir seçenektir34. Burada açıklanan protokol, çevresel bakterilerin C. elegans sağlığı üzerindeki etkisini incelemek için uygundur, ancak başka amaçlar için kolayca uyarlanabilir.

Çok yönlü -lük
Bu işlem hattını oluşturan farklı "modüller", deneye veya laboratuvara özgü gereksinimleri karşılayacak şekilde uyarlanabilir. Örneğin, bakteriyel izolatlar bakteriyel karışımlar, bakteriyel mutantlar veya RNAi üreten bakteriler için ikame edilebilir ve kurulum, konakçı-mikrop etkileşimlerinde yer alan bakteriyel genleri taramak, stres direncinde yer alan konakçı genleri taramak veya tanımlanmış bakteri topluluklarının bir parçası olarak bireysel mikropların etkisini incelemek için kullanılabilir. Bu yöntem, tek bir solucanın genetik arka planında birkaç bakteri izolatının taranmasını açıklar. Bununla birlikte, tahlil ölçeklenebilir ve aynı anda birden fazla konakçı ve bakteriyel genotip incelenebilir. Bu, konakçı gen-mikrop gen-diyet etkileşimleri hakkında fikir edinmek için diferansiyel ilaç tedavileri ve / veya diyet rejimleri ile daha da birleştirilebilir.

Protokol henüz diğer nematod türleri üzerinde denenmemiştir, ancak C. remanei ve C. briggsae için de doğrudan uygulanabilir olmalıdır ve C. elegans30 ile morfolojik, boyut ve ölüm floresan özelliklerini paylaşan L3 evre parazitik nematod türlerine uygulanabilir. Son olarak, diğer stresörler (juglone, paraquat, arsenat, diğer sıcaklıklar) tamamlayıcı veya doğrulayıcı bilgi sağlamak için aynı boru hattı içinde kullanılabilir.

Potansiyel zorluklar
Tahlillerden önce solucan ve bakteri yetiştirmek için 12. güne kadar yapılan zaman yatırımı önemlidir, ancak yaklaşımın verimi nedeniyle, toplanan verilerin genişliğinden çok daha ağır basmaktadır. Bununla birlikte, bu tür tahlillerin planlanmasında özen gösterilmesi, hazırlık adımlarını tekrarlayarak zaman kaybetmekten kaçınmak için çok önemlidir, çünkü materyaller tahliller başlayabildiği zamana kadar yetersiz kalır. Başlıca erken sorunlar arasında numune kontaminasyonu (solucanlar veya bakteriler), zayıf senkronize solucan popülasyonları ve materyallerin tükenmesi (solucan popülasyonları yiyeceklerini beklenenden daha hızlı yerler ve hayvanları planlanandan daha sık yeniden besler veya transfer ederler).

Kontaminasyonları önleme
Protokolün ölçeği ve süresi nedeniyle, önemli bir potansiyel sorun, ortaya çıkması kesinlikle sonuçları karıştıracak olan mantar ve bakteriler tarafından kontaminasyondur. İdeal kurulum, bu nedenle, steril sarf malzemeleri kullanarak, deney tezgahının üzerinde doğrudan hava akışı olmayan klimalı ve hava filtreli özel bir laboratuvar alanıdır. Bununla birlikte, düzenli temizlik prosedürlerini gözlemlemek (işten önce ve sonra bankları dekontamine etmek, plaka kutularını temizlemek ve steril sarf malzemeleri kullanmak) ve kapalı bir alanda bir alevle çalışmak (koridorlardan, açık kapıların yakınındaki alanlardan ve pencerelerden kaçının) genellikle temiz bir ortam sağlamak için yeterlidir. Adım 2.2.1.'de yumurta hazırlamadan önce hafif kontaminasyonlar meydana gelirse, ağartma prosedürü bunlarla ilgilenir ve protokol planlandığı gibi ilerleyebilir. Tersine, test bakteri plakalarına geçmeden önce büyüyen solucan popülasyonunu etkileyen kontaminasyonlar, bu girişimin sonunu işaret edecek ve protokolün Adım 1'den itibaren yeniden başlatılması gerekecektir. Daha sonraki kontaminasyonlar, tek bakteri suşlarını veya test koşullarını etkileme eğiliminde olacaktır. Kapsamlarına bağlı olarak, protokolü devam ettirmeye veya yeniden başlatmaya değer olabilir.

Solucan senkronizasyonu
Solucanlar geliştiğinde ve büyüdüğünde termal ve oksidatif zorluklara karşı direnç değiştikçe, LFASS testleri yapıldığında farklı gelişim aşamalarına yol açan test koşulları kolayca karşılaştırılamaz. Son nokta tahlilleri için iyi senkronize edilmiş popülasyonlar üretmek esastır. Tahliller L4 veya L4 + 48 h aşamalarında toplu olarak toplanan solucanlar üzerinde yapıldığından, mükemmel aşamalandırılmış solucanları toplamak için bir solucan sıralayıcısı veya başka bir sıralama prosedürünün yokluğunda, solucan popülasyonları L1'de çok iyi senkronize edilmelidir. Test kohortunu büyütmeden önce yavruların tüm canlı yumurtaların yumurtadan çıkması için yeterince uzun süre yiyeceklerden uzak tutulması sağlanmalıdır (20 ° C'de >15 saat ve 15 ° C'de >18 saat). Genotip, sıcaklıktan da etkilenen gelişimsel zamanlamadaki yayılmayı etkileyebilir. 15 ° C'de büyüyen solucan popülasyonları, solucan popülasyonu genişleme aşamasında (özellikle insülin sinyal mutantlarıyla çalışırken) sıcaklığa duyarlı mutasyonların etkisini sınırlarken bunun üzerinde daha iyi kontrol sağlar. L4 veya L4 + 48 h'den mikropların etkilerini incelemenin ana nedeni, farklı bir diyetin gelişimsel etkisini atlamak ve canlı bağırsak bakterilerinin diyet üzerindeki etkilerinden ziyade etkilerini incelemektir. Farklı bakteri izolatları veya karışımları üzerinde daha erken bir larva aşamasında yetiştirilen solucanlar kaçınılmaz olarak düzensiz gelişim oranlarına ve senkronizasyon kaybına yol açacaktır.

Mavi floresana güvenmenin sonuçları
LFASS tahlillerinde bireysel solucan takibine veya Sytox green36 gibi ek reaktiflere ihtiyaç duymadan ölümü tespit edebilmek, bunun yerine geleneksel solucan biyobelirteçleriyle örtüşmesi muhtemel olmayan bir floresan aralığında endojen bir sinyalden yararlanmak açık bir faydadır. Bununla birlikte, solucan ölüm floresansının birçok test koşulunda tutarlı bir şekilde tespit edilebilmesini sağlamak kritik öneme sahiptir. Tahlil, floresan nicelemesine değil, dinamiklerine dayanmakla birlikte, medyan ölüm zamanını (TOD) doğru bir şekilde tahmin etmek için solucanlar tarafından yeterli floresan yayılması gerekir. Tahlil, tek solucan ölümünün çözülmesine izin vermediğinden, ölmekte olan bireyler tarafından yayılan mavi floresan patlamalarının, tek bir popülasyon floresan zirvesi vermek için floresan birikimi için yeterli zamansal örtüşmeye sahip olması gerekir. Ancak o zaman medyan TOD doğru bir şekilde çıkarılabilir. Bu, yeterli düzeyde mavi floresan üretemeyen solucanların, özellikle tdo-2 ve kynu-130,31 gibi kinürenin yolunun bazı mutantlarını ve açlıktan ölen hayvanları içeren bu protokolde kullanılamayacağı anlamına gelir. Bu nedenle, solucanların boyunca dolu koşullarda tutulmasını sağlamak önemlidir. Bu özellikle, HT115 tahrikli RNAi ekranlarını gerçekleştirirken bir sorun olabilir, çünkü IPTG ile desteklenmiş NGM ortamında HT115 çimleri ve antibiyotikler OP50 çimlerinden daha ince olma eğilimindedir. Bu nedenle, tahlillere yol açan günlerde solucan gıda arzının izlenmesi kritik öneme sahiptir.

Ölüm floresansı dinamiklerinin bir başka sonucu, tahlil ne kadar hızlı olursa, aynı popülasyondan solucanlar daha senkronize bir şekilde öleceği ve daha tanımlanmış bir popülasyon ölüm floresan zirvesi üreteceği için duyarlılığın o kadar iyi olmasıdır. Bu nedenle, tahlil ne kadar uzun olursa, iyi ölüm floresan zirveleri üretmek için gereken popülasyon büyüklüğü o kadar büyük olur. Eat-2 ve daf-2 30 gibi düşük metabolizmaya sahip mutantlar da daha az floresan yayacak ve kuyu başına daha yüksek sayılar gerektirecektir. Kuyu başına 10-15 vahşi tip solucan, hepsini 4 saat içinde öldüren 42 ° C'lik bir termal stres testi için yeterli olsa da, aynı tahlilde daf-2 (e1370) solucanları için bu miktarın neredeyse iki katı ve 24 saatlik bir süre boyunca solucanları öldürecek bir tahlil için >100 vahşi tip solucan gereklidir.

Çevresel bakteriyel izolatlar bağlamında, farklı mikrobiyal metabolizma, mavi floresan bileşikleri üreten kinürenin yolunu da farklı şekilde etkileyebilir. Bu nedenle, bazı bakteri izolatları daha düşük tepe ölüm floresansına yol açarken, diğerleri OP50'den daha yüksek zirvelere yol açar. Sonuç olarak, tüm olasılıkları barındırmak için kuyu başına yeterli solucan hedeflenmelidir.

Son olarak, plaka okuma parametrelerini doğru bir şekilde optimize etmek çok önemlidir. Bu protokol, floresan uyarma ve emisyon parametrelerinin ayarlanmasını ve okumaların ideal olarak yapılması gereken derinliği kapsar. Tek bir tahlilde birden fazla koşulda muhtemelen geniş bir ölüm floresan verimi yelpazesiyle, zayıf sinyallerin tespit edildiğinden ancak dedektörlerin asla doymadığından emin olmak önemlidir. Yüksek dinamik aralıklara sahip dedektörlü aletler bu nedenle daha iyi performans gösterecektir.

Yöntemin sınırlamaları
Burada açıklanan yöntem sağlam ve esnektir ve çeşitli koşullara kolayca uyarlanabilir. Kolaylık sağlamak için, önemli kısıtlamalar ve sınırlamalar, devreye girdikleri protokol boyunca belirtilmiştir. Kısaca, ölümün endojen bir belirteci olarak ölüm floresansına güvenmek, bu tahlillerin hem bir gücü hem de bir sınırlamasıdır.

Sınırlı sayıda spesifik diyet koşulu altında (düşük triptofan diyetleri veya açlık) ve triptofan metabolizmasını etkileyen mutant koşullarda (yani, tdo-2, kynu-1, bazı daf-2 alelleri), ölüm floresansı (DF), tepe floresansının tespit edilmesinin zor olduğu ve TOD tahminlerinin daha az güvenilir olduğu ölçüde güçlü bir şekilde zayıflatılabilir.

Tersine, bazı mikroplar, uyarma ve emisyon spektrumları DF sinyalleri (yani Enterococcus faecalis) ile örtüşen mavi floresan bileşikler üretebilir. Dinamikleri DF'den farklı olsa da ve genellikle ayrılabilse de, analizi karıştırabilirler.

Daha sonra, tahliller ölmekte olan bireysel solucanlardan gelen sinyallerin birikmesine dayanır, ancak DF zamanla söndürülür. Bu nedenle, solucanlar birbirinden çok uzakta ölürse, bireysel floresan zirveleri bir popülasyon zirvesi üretmekte başarısız olacak ve popülasyon medyan TOD'sinin ölçülmesini önleyecektir. Tahlil ne kadar yavaş öldürürse, her kuyucukta gereken solucan sayısı30 kadar yüksek olur. Bu nedenle, kuyu başına 10-15 yetişkin solucan, solucanların yarısını 2 saat içinde öldüren 42 ° C'lik bir ısı stresi testi için yeterlidir, ancak 12 saat içinde solucanların yarısını öldüren bakteriyel bir hızlı öldürme testi için kuyu başına 70'ten fazla solucan gereklidir.

Son olarak, kullanıcıların gerekli dalga boylarında hızlandırılmış floresan ölçümleri yapabilen bu tür testleri gerçekleştirmek için bir plaka okuyucuya erişmeleri gerekir. Uyarma ve emisyon dalga boyları da sistemler arasında biraz değişebilir ve belirtildiği gibi nematod türleri arasında değişebilir30.

Diğer C. elegans tahlilleri ile karşılaştırma ve tamamlayıcılık
Son 10-15 yılda, C. elegans sağlığını aynı anda birden fazla koşulda değerlendirmek, çeşitli stratejiler kullanmak ve farklı seviyelerde veri derinliği ve genişliği sunmak için birçok tahlil geliştirilmiştir 30,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45, 46. Çoklu solucan izleme algoritmalarına sahip kamera dizileri ve tarayıcılar ve / veya mikrofabrikasyon bireysel solucan dizileri 37,38,39,40,41,43 kullanılarak, kullanım ömürleri boyunca birçok solucanı aynı anda otomatik olarak izlemek için birçok güçlü tahlil geliştirilmiştir. . Konakçı-mikrop etkileşimleri bağlamında, yukarıda açıklanan protokole benzer yaklaşımlar, ancak DF'ye dayanmayan, bakteriyel enfeksiyonlarda yer alan C. elegans genlerinin genom çapında RNAi taramasını da sağlamıştır46,47,48. Bununla birlikte, bu yüksek verimli analizler, solucanların sıvı içinde işlenmesine dayanır; bu, çapraz kontaminasyon risklerinin artması ve sıvı kültürünün konakçı ve mikrobiyal metabolizmaları etkilemesi nedeniyle aynı anda birden fazla bakteri türüyle uğraşırken arzu edilmez. Bu nedenle, geleneksel enfeksiyon, stres, sağlık süresi ve uzun ömür tahlillerinde, C. elegans katı ortamda yetiştirilen bakteriyel çimler üzerinde korunur ve yaşlandırılır. Bu protokolde de olduğu gibi, bu boru hattıyla gerçekleştirilen ekranlardan elde edilen sonuçlar, ekran isabetleriyle aşağı akış doğrulayıcı deneylerin sonucunu daha kolay ilişkilendirebilir ve tahmin edebilir.

LFASS yaklaşımının avantajları Referans30'da iyi bir şekilde ele alınmıştır. Benzer çalışmalar için yeniden kullanılabilecek daha ayrıntılı sürekli görüntüleme kurulumlarıyla karşılaştırıldığında, LFASS daha ucuzdur (medyan TOD'nin ihtiyaç duyulan tek okuma olması şartıyla) ve basitliği, çok fazla teknik yetenek veya özel ekipman gerektirmediği anlamına gelir. LFASS esas olarak derinlik üzerindeki genişlik ile ilgilidir. LFASS verileri, bir solucan popülasyonunun medyan ölüm zamanı ve bir kinürenin yolu çıktısının dolaylı olarak okunması dışında bilgi sağlamaz. Tersine, daha düşük ama yine de iyi verimle, karmaşık özellikler, solucanların tüm ömrü boyunca diğer tahlillerden 37,38,39,40,41,43 ölçülebilir ve bu da onları bir LFASS ekranından isabetleri incelemek için mükemmel aşağı akış yaklaşımları haline getirir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Acknowledgments

CGC Minnesota'ya (Madison, ABD, NIH - P40 OD010440) solucan suşları sağladığı için ve OP50 ve Pr. Hinrich Schulenburg'a (CAU, Kiel, Almanya) burada tasvir edilen tüm çevresel mikrobiyal izolatları sağladıkları için teşekkür ederiz. Bu çalışma AB'ye UKRI-BBSRC hibesi ile finanse edilmiştir (BB / S017127 / 1). JM, Lancaster Üniversitesi FHM doktora bursu ile finanse edilmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 cm diameter plates (Non-vented) Fisher Scientific 10720052 Venting is not necessary for bacterial cultures
15 cm diameter plates (Vented) Fisher Scientific 168381
384-well black, transparent flat bottom plates Corning 3712 or 3762 Not essential to be sterile for fast stress assays
6 cm diameter plates (Vented) Fisher Scientific 150288 Venting is necessary for worm cultures to avoid hypoxia
96-well transparent plates (Biolite) Thermo 130188
Agar (<4% ash) Sigma-Aldrich 102218041 Good quality agar is important for the structural integrity of the culture media, to avoid worm burrowing
Agarose Fisher Scientific BP1356
Avanti Centrifuge J-26 XP Beckman coulter
Bleach Honeywell 425044
Calcium chloride Sigma-Aldrich C5080
Centrifuge 5415 R Eppendorf
Centrifuge 5810 R Eppendorf
Cholesterol Sigma-Aldrich C8667
LB agar Difco 240110
LB broth Invitrogen 12795084
LoBind tips VWR 732-1488 Lo-bind reduce worm loss during transfers
LoBind tubes Eppendorf 22431081
Magnesium sulfate Fisher Scientific M/1100/53
Plate reader- infinite M nano+ Tecan Monochromator setup enables fluorescence tuning but adequate filter-based setups may be used
Plate reader- Spark Tecan
Potassium phosphate monobasic Honeywell P0662
Sodium chloride Sigma-Aldrich S/3160/63
Stereomicroscope setup with transillumination base Leica MZ6, or M80 Magnification from 0.6-0.8x up to 40-60x is necessary, as is a good quality transillumination base with a deformable, titable or slidable mirror to adjust contrast
t-BHP (tert-Butyl hydroperoxide) Sigma-Aldrich 458139
Transparent adhesive seals Nunc Fisher Scientific 101706871 It is important that it is transparent and that it can tolerate the temperatures involved in the assays.
Tryptophan Sigma-Aldrich 1278-7099
Yeast extract Fisher Scientific BP1422

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Krishna, S., et al. Integrating microbiome network: establishing linkages between plants, microbes and human health. The Open Microbiology Journal. 13, 330-342 (2019).
  2. Amon, P., Sanderson, I. What is the microbiome. Archives of Disease in Childhood - Education & Practice Edition. 102 (5), 257-260 (2017).
  3. Belkaid, Y., Harrison, O. J. Homeostatic immunity and the microbiota. Immunity. 46 (4), 562-576 (2017).
  4. Cabreiro, F., Gems, D. Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans. EMBO Molecular Medicine. 5 (9), 1300-1310 (2013).
  5. Vaga, S., et al. Compositional and functional differences of the mucosal microbiota along the intestine of healthy individuals. Scientific Reports. 10 (1), 14977 (2020).
  6. Nagpal, R., et al. Gut microbiome and aging: Physiological and mechanistic insights. Nutrition and Healthy Aging. 4 (4), 267-285 (2018).
  7. Mitsuoka, T. Establishment of intestinal bacteriology. Biosci Microbiota Food Health. 33 (3), 99-116 (2014).
  8. Bonfili, L., et al. Microbiota modulation as preventative and therapeutic approach in Alzheimer's disease. The FEBS Journal. 288 (9), 2836-2855 (2021).
  9. Vendrik, K. E. W., et al. Fecal microbiota transplantation in neurological disorders. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 98 (2020).
  10. Wang, Q., et al. The role of gut dysbiosis in Parkinson's disease: mechanistic insights and therapeutic options. Brain. 144 (9), 2571-2593 (2021).
  11. Zhu, X., et al. The relationship between the gut microbiome and neurodegenerative diseases. Neuroscience Bulletin. 37 (10), 1510-1522 (2021).
  12. Miller, I. The gut-brain axis: historical reflections. Microbial Ecology in Health and Disease. 29 (1), 1542921 (2018).
  13. Foster, J. A., Rinaman, L., Cryan, J. F. Stress & the gut-brain axis: Regulation by the microbiome. Neurobiology of Stress. 7, 124-136 (2017).
  14. Coman, V., Vodnar, D. C. Gut microbiota and old age: Modulating factors and interventions for healthy longevity. Experimental Gerontology. 141, 111095 (2020).
  15. Conway, J., Duggal, N. A. Ageing of the gut microbiome: Potential influences on immune senescence and inflammageing. Ageing Research Reviews. 68, 101323 (2021).
  16. Berg, M., et al. Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments. The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).
  17. Dirksen, P., et al. CeMbio - The Caenorhabditis elegans Microbiome Resource. G3: Genes, Genomes, Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).
  18. Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14, 38 (2016).
  19. Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Felix, M. A., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (27), 3941-3949 (2016).
  20. Zimmermann, J., et al. The functional repertoire contained within the native microbiota of the model nematode Caenorhabditis elegans. The ISME Journal. 14 (1), 26-38 (2020).
  21. Dinic, M., et al. Host-commensal interaction promotes health and lifespan in Caenorhabditis elegans through the activation of HLH-30/TFEB-mediated autophagy. Aging. 13 (6), 8040-8054 (2021).
  22. Goya, M. E., et al. Probiotic Bacillus subtilis protects against alpha-Synuclein aggregation in C. elegans. Cell Reports. 30 (2), 367-380 (2020).
  23. Hacariz, O., Viau, C., Karimian, F., Xia, J. The symbiotic relationship between Caenorhabditis elegans and members of its microbiome contributes to worm fitness and lifespan extension. BMC Genomics. 22 (1), 364 (2021).
  24. Shin, M. G., et al. Bacteria-derived metabolite, methylglyoxal, modulates the longevity of C. elegans through TORC2/SGK-1/DAF-16 signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (29), 17142-17150 (2020).
  25. Zhang, F., et al. Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut. Current Biology. 31 (12), 2603-2618 (2021).
  26. Zhang, F., et al. High-throughput assessment of changes in the Caenorhabditis elegans gut microbiome. Methods in Molecular Biology. 2144, 131-144 (2020).
  27. Chan, J. P., et al. Using bacterial transcriptomics to investigate targets of host-bacterial interactions in Caenorhabditis elegans. Scientific Reports. 9 (1), 5545 (2019).
  28. Hartsough, L. A., et al. Optogenetic control of gut bacterial metabolism to promote longevity. Elife. 9, 56849 (2020).
  29. Pryor, R., et al. Host-microbe-drug-nutrient screen identifies bacterial effectors of Metformin therapy. Cell. 178 (6), 1299-1312 (2019).
  30. Benedetto, A., et al. New label-free automated survival assays reveal unexpected stress resistance patterns during C. elegans aging. Aging Cell. 18 (5), 12998 (2019).
  31. Coburn, C., et al. Anthranilate fluorescence marks a calcium-propagated necrotic wave that promotes organismal death in C. elegans. PLOS Biology. 11 (7), 1001613 (2013).
  32. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
  33. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  34. Naomi, R., et al. Probiotics for Alzheimer's disease: a systematic review. Nutrients. 14 (1), 20 (2021).
  35. Zheng, S. Y., et al. Potential roles of gut microbiota and microbial metabolites in Parkinson's disease. Ageing Research Reviews. 69, 101347 (2021).
  36. Gill, M. S., Olsen, A., Sampayo, J. N., Lithgow, G. J. An automated high-throughput assay for survival of the nematode Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology and Medicine. 35 (6), 558-565 (2003).
  37. Park, H. -E. H., Jung, Y., Lee, S. -J. V. Survival assays using Caenorhabditis elegans. Molecules and Cells. 40 (2), 90-99 (2017).
  38. Partridge, F. A., et al. An automated high-throughput system for phenotypic screening of chemical libraries on C. elegans and parasitic nematodes. International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance. 8 (1), 8-21 (2018).
  39. Rahman, M., et al. NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10 (1), 16190 (2020).
  40. Stroustrup, N., et al. The Caenorhabditis elegans lifespan machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).
  41. Xian, B., et al. WormFarm: a quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
  42. Brown, A. E., Schafer, W. R. Unrestrained worms bridled by the light. Nature Methods. 8 (2), 129-130 (2011).
  43. Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. Elife. 6, 26652 (2017).
  44. Jushaj, A., et al. Optimized criteria for locomotion-based healthspan evaluation in C. elegans using the WorMotel system. PLoS One. 15 (3), 0229583 (2020).
  45. Nambyiah, P., Brown, A. E. X. Quantitative behavioural phenotyping to investigate anaesthesia induced neurobehavioural impairment. Scientific Reports. 11 (1), 19398 (2021).
  46. Squiban, B., Belougne, J., Ewbank, J., Zugasti, O. Quantitative and automated high-throughput genome-wide RNAi screens in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (60), e3448 (2012).
  47. Zugasti, O., et al. Activation of a G protein-coupled receptor by its endogenous ligand triggers the innate immune response of Caenorhabditis elegans. Nature Immunology. 15 (9), 833-838 (2014).
  48. Zugasti, O., et al. A quantitative genome-wide RNAi screen in C. elegans for antifungal innate immunity genes. BMC Biology. 14, 35 (2016).

Tags

Biyoloji Sayı 182
<em>Caenorhabditis elegans</em> Health Üzerinde Etkisi Olan Mikrobiyal İzolatların Yüksek Verimli Taraması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ali, I., Martin, J.,… More

Ali, I., Martin, J., Zárate-Potes, A., Benedetto, A. High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health. J. Vis. Exp. (182), e63860, doi:10.3791/63860 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter