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Biology

केनोरहाब्डाइटिस एलिगेंस स्वास्थ्य पर प्रभाव के साथ माइक्रोबियल आइसोलेट्स की उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग

Published: April 28, 2022 doi: 10.3791/63860
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Division of Biomedical and Life Sciences, Lancaster University
* These authors contributed equally

Summary

आंत के रोगाणु विशिष्ट या संरक्षित तंत्र के माध्यम से अपने मेजबान के स्वास्थ्य को सकारात्मक या नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकते हैं। केनोरहाब्डिस एलिगेंस ऐसे रोगाणुओं के लिए स्क्रीन करने के लिए एक सुविधाजनक मंच है। वर्तमान प्रोटोकॉल नेमाटोड तनाव प्रतिरोध पर प्रभाव के लिए 48 बैक्टीरियल आइसोलेट्स की उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग का वर्णन करता है, जिसका उपयोग कृमि स्वास्थ्य के लिए प्रॉक्सी के रूप में किया जाता है।

Abstract

अपने छोटे आकार, छोटे जीवनकाल और आसान आनुवंशिकी के साथ, केनोरहाबिटिस एलिगेंस मेजबान शरीर विज्ञान पर माइक्रोबियल आइसोलेट्स के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक सुविधाजनक मंच प्रदान करता है। यह मरने पर नीले रंग में भी फूलता है, जो मृत्यु को इंगित करने का एक सुविधाजनक साधन प्रदान करता है। इस गुण का उपयोग उच्च-थ्रूपुट लेबल-फ्री सी एलिगेंस सर्वाइवल एसेस (एलएफएएसएस) विकसित करने के लिए किया गया है। इनमें मल्टीवेल प्लेटों में स्थापित कृमि आबादी की टाइम-लैप्स फ्लोरेसेंस रिकॉर्डिंग शामिल है, जिससे मृत्यु का जनसंख्या औसत समय प्राप्त किया जा सकता है। वर्तमान अध्ययन गंभीर गर्मी और ऑक्सीडेटिव तनाव के लिए सी एलिगेंस संवेदनशीलता पर प्रभाव के लिए एक बार में कई माइक्रोबियल आइसोलेट्स को स्क्रीन करने के लिए एलएफएएसएस दृष्टिकोण को अपनाता है। इस तरह की माइक्रोबियल स्क्रीनिंग पाइपलाइन, जिसका उपयोग विशेष रूप से प्रोबायोटिक्स को प्रीस्क्रीन करने के लिए किया जा सकता है, मेजबान स्वास्थ्य के लिए प्रॉक्सी के रूप में गंभीर तनाव प्रतिरोध का उपयोग करके यहां बताया गया है। प्रोटोकॉल बताता है कि सी एलिगेंस आंत माइक्रोबायोटा दोनों को मल्टीवेल सरणियों में अलग-अलग संग्रह और तुल्यकालिक कृमि आबादी को कैसे विकसित किया जाए, इससे पहले कि उन्हें परख के लिए संयोजित किया जाए। प्रदान किए गए उदाहरण में 47 बैक्टीरियल आइसोलेट्स के परीक्षण और दो कृमि उपभेदों पर एक नियंत्रण तनाव शामिल है, समानांतर में दो तनाव परखों में। हालांकि, दृष्टिकोण पाइपलाइन आसानी से स्केलेबल है और कई अन्य तौर-तरीकों की स्क्रीनिंग के लिए लागू है। इस प्रकार, यह जैविक और जैव रासायनिक स्थितियों के एक बहुपैरामीट्रिक परिदृश्य का तेजी से सर्वेक्षण करने के लिए एक बहुमुखी सेटअप प्रदान करता है जो सी एलिगेंस स्वास्थ्य को प्रभावित करता है ।

Introduction

मानव शरीर अनुमानित 10-100 ट्रिलियन जीवित माइक्रोबियल कोशिकाओं (बैक्टीरिया, आर्किया कवक) को आश्रय देता है, जो मुख्य रूप से आंत, त्वचा और श्लैष्मिकवातावरण में पाए जाते हैं। एक स्वस्थ अवस्था में, ये अपने मेजबान को लाभ प्रदान करते हैं, जिसमें विटामिन उत्पादन, प्रतिरक्षा प्रणाली की परिपक्वता, रोगजनकों के लिए जन्मजात और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की उत्तेजना, वसा चयापचय का विनियमन, तनाव प्रतिक्रियाओं का मॉड्यूलेशन, और बहुत कुछ, विकास और विकास, रोग की शुरुआत और उम्र बढ़ने पर प्रभाव पड़ता है। . आंत माइक्रोबायोटा भी पूरे जीवन में काफी विकसित होता है। सबसे कठोर विकास शैशवावस्था और प्रारंभिक बचपन6 के दौरान होता है, लेकिन उम्र के साथ महत्वपूर्ण परिवर्तन भी होते हैं, जिसमें बिफीडोबैक्टीरियम बहुतायत में कमी और क्लोस्ट्रीडियम, लैक्टोबैसिलस, एंटरोबैक्टीरिया और एंटरोकोकस प्रजातियों में वृद्धि शामिलहै। जीवनशैली आंत माइक्रोबियल संरचना को और बदल सकती है जिससे डिस्बिओसिस (लाभकारी बैक्टीरिया का नुकसान, अवसरवादी बैक्टीरिया का अतिवृद्धि) हो सकता है, जिसके परिणामस्वरूप सूजन आंत्र रोग, मधुमेह और मोटापा5 जैसे विभिन्न विकृति हो सकती है, लेकिन अल्जाइमर और पार्किंसंस रोग 8,9,10,11 में भी योगदान देती है।

इस अहसास ने आंत-मस्तिष्क अक्ष (जीबीए) की अवधारणा को परिष्कृत करने में गंभीर रूप से योगदान दिया है, जहां आंत शरीर विज्ञान (अब इसके भीतर रोगाणुओं सहित) और तंत्रिका तंत्र के बीच बातचीत को पशु चयापचय औरशारीरिक कार्यों का मुख्य नियामक माना जाता है। हालांकि, आंत-मस्तिष्क सिग्नलिंग में माइक्रोबायोटा की सटीक भूमिका और कार्रवाई के संबंधित तंत्र पूरी तरहसे समझ में आने से बहुत दूर हैं। आंत माइक्रोबायोटा स्वस्थ उम्र बढ़ने का एक प्रमुख निर्धारक होने के साथ, बैक्टीरिया उम्र बढ़ने की प्रक्रिया को कैसे संशोधित करते हैं, यह गहन शोध और विवाद का विषय बन गया है 6,14,15.

इस प्रदर्शन के साथ कि राउंडवर्म केनोरहाब्डिस एलिगेंस एक बोनाफाइड आंत माइक्रोबायोटा का प्रभुत्व रखता है - जैसा कि अन्य प्रजातियों में - बैक्टेरोइड्स, फर्मिक्यूट्स और एक्टिनोबैक्टीरिया16,17,18,19,20 द्वारा, मेजबान-आंत कॉमेंसल इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक प्रयोगात्मक मंच के रूप में इसकी तेजी से वृद्धि 21,22,23,24 25,26 ने हमारे जांच शस्त्रागारको 26,27,28,29 में काफी विस्तारित किया है। विशेष रूप से, जीन-आहार, जीन-दवा, जीन-रोगज़नक़, आदि इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए सी एलिगेंस के लिए उपलब्ध उच्च-थ्रूपुट प्रयोगात्मक दृष्टिकोण, तेजी से यह पता लगाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है कि बैक्टीरियल आइसोलेट्स और कॉकटेल सी एलिगेंस के स्वास्थ्य और उम्र बढ़ने को कैसे प्रभावित करते हैं।

वर्तमान प्रोटोकॉल स्वास्थ्य के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में सी एलिगेंस तनाव प्रतिरोध पर प्रभाव के लिए मल्टीवेल प्लेटों में सेट बैक्टीरियल आइसोलेट्स या मिश्रण के एक बार में स्क्रीन करने के लिए एक प्रयोगात्मक पाइपलाइन का वर्णन करता है, जिसका उपयोग प्रोबायोटिक्स की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। यह विवरण देता है कि प्रतिदीप्ति प्लेट रीडर (चित्रा 1) का उपयोग करके स्वचालित तनाव प्रतिरोध विश्लेषण के लिए कीड़े को संसाधित करने से पहले 96- और 384-वेल प्लेट प्रारूपों में बड़ी कृमि आबादी को कैसे विकसित किया जाए और जीवाणु सरणियों को कैसे संभाला जाए। यह दृष्टिकोण लेबल-मुक्त स्वचालित उत्तरजीविता परख (एलएफएएसएस) 30 पर आधारित है जो मृत्यु प्रतिदीप्ति31 की घटना का फायदा उठाता है, जिससे मरने वाले कीड़े नीले प्रतिदीप्ति का एक विस्फोट पैदा करते हैं जिसका उपयोग मृत्यु के समय को इंगित करने के लिए किया जा सकता है। नीली प्रतिदीप्ति सी एलिगेंस आंत कणिकाओं (एक प्रकार का लाइसोसोम-संबंधित अंग) में संग्रहीत एंथ्रेनिलिक एसिड के ग्लूकोसिल एस्टर द्वारा उत्सर्जित होती है, जो मृत्यु पर कृमि आंत में एक नेक्रोटिक कैस्केड ट्रिगर होने पर फटजाती है।

Figure 1
चित्रा 1: तनाव के लिए सी एलिगेंस प्रतिरोध पर प्रभाव के साथ बैक्टीरियल आइसोलेट्स की उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए प्रायोगिक वर्कफ़्लो। (ए) कृमि और जीवाणु रखरखाव और परख सेटअप के लिए समयरेखा। (बी) 96-वेल बैक्टीरियल प्लेट सरणी सेटअप और हैंडलिंग। (सी) 384-वेल वर्म प्लेट सेटअप। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Protocol

वर्तमान अध्ययन के लिए समानांतर में उपयोग किए जाने वाले दो सी एलिगेंस उपभेद ब्रिस्टल एन 2 जंगली प्रकार और एचटी 1890: डीएएफ -16 (एमजीडीएफ 50) थे, जो समान दरों पर बढ़ते हैं। हालांकि, प्रोटोकॉल को दो उपभेदों के किसी भी संयोजन के साथ दोहराया जा सकता है जिनकी विकास दर समान है। ध्यान दें कि, समानांतर में अन्य उपभेदों का परीक्षण करते समय (उदाहरण के लिए, जंगली प्रकार और धीमी गति से बढ़ने वाले डीएएफ -2 उत्परिवर्ती), अलग-अलग विकास दर पर विचार किया जाना चाहिए, और तदनुसार, प्रोटोकॉल को समायोजित करने की आवश्यकता है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल में कीड़े और बैक्टीरिया के टाइमस्केल और मात्रा को टेट्राप्लिकेट्स में दो एलएफएएसएस परखों में दो वर्म उपभेदों पर 48 बैक्टीरियल आइसोलेट्स के समानांतर परीक्षण के लिए अनुकूलित किया गया है। यदि समानांतर में अधिक स्थितियों का परीक्षण किया जाना है तो समायोजन की आवश्यकता होगी। एस्चेरिचिया कोलाई ओपी 50 बैक्टीरिया स्ट्रेन को केनोरहाब्डिस जेनेटिक्स सेंटर (सीजीसी), मिनेसोटा विश्वविद्यालय से प्राप्त किया गया था। 48 बैक्टीरियल आइसोलेट्स शूलेनबर्ग लैब से प्राप्त किए गए थे और एलबी एगर पर बनाए रखा गया था।

1. ओपी 50 पर खेती करने वाले सी एलिगेंस (दिन 1 - 8)

नोट: वर्तमान दृष्टिकोण का उद्देश्य सभी चरणों में एक ठोस माध्यम पर सी एलिगेंस हर्मैप्रोडाइट्स को विकसित करना है और अनावश्यक आहार परिवर्तनों से बचना है (यानी, वैकल्पिक तेजी से बढ़ने वाले ई कोलाई उपभेदों जैसे एनए 22 या समृद्ध विकास मीडिया जैसे अंडे की प्लेटों का उपयोग करके) मानक विकास स्थितियों32,33 के करीब रहने के लिए जो अभी भी व्यापक रूप से उपयोग किए जाते हैं। कृमि विकास तापमान (यहां 15 डिग्री सेल्सियस पर सेट) सी एलिगेंस स्ट्रेन (ओं) पर निर्भर करता है और इसे समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है (उदाहरण के लिए, तापमान-संवेदनशील फेनोटाइप या बायोमार्कर की अभिव्यक्ति से बचने या ट्रिगर करने के लिए)। कृमि पालन के बारे में जानकारी के लिए, कृपया संदर्भ33 देखें।

  1. आठ 6 सेमी व्यास एनजीएम प्लेटें तैयार करें (नेमाटोड ग्रोथ मीडिया एगर, एनजीएम, पूरक फ़ाइल 1) 32,33 प्रति कृमि तनाव के 10 एमएल और उन्हें कमरे के तापमान पर 1 दिन तक सूखने दें।
  2. ई. कोलाई ओपी 50 बैक्टीरिया की संतृप्त तरल संस्कृति तैयार करें, जिसमें 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में ओपी 50 माध्यम (पूरक फ़ाइल 1) के 25 एमएल में ताजा उगाए गए लाइसोजेनी ब्रोथ एगर (एलबी आगर, पूरक फाइल 1) प्लेट से एक एकल जीवाणु क्लोन को बीज ति किया जाए। एक शेकर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर संस्कृति उगाएं।
  3. प्रति प्लेट ई कोलाई ओपी 50 के संतृप्त तरल संस्कृति के 100 μL के साथ प्रति तनाव आठ 6 सेमी एनजीएम प्लेटों को टीका लगाएं और उपयोग से पहले 2 दिनों के लिए प्लेटों को 20 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  4. एक स्केलपेल का उपयोग करके, हाल ही में भूखे एनजीएम प्लेट से कीड़े के साथ 0.5 सेमी के एक वर्गाकार एगर टुकड़े को काटें और आठ टीका लगाए गए 6 सेमी एनजीएम प्लेटों में से प्रत्येक पर स्थानांतरित करें और इन प्लेटों को 3 दिनों के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें (या जब तक कीड़े भोजन समाप्त नहीं कर लेते)।
  5. प्रति कृमि तनाव (प्रति प्लेट एनजीएम माध्यम के 30 एमएल) पांच 15 सेमी एनजीएम प्लेट तैयार करें और ओपी 50 के 3 एमएल के साथ टीका लगाएं। प्लेटों को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करने से पहले सूखने दें। प्लेटों को 20 डिग्री सेल्सियस पर रखें जब तक कि बाद के चरणों में उपयोग न करें।
  6. पी -1000 पिपेट का उपयोग करके, कीड़े को पुन: निलंबित करने के लिए 6 सेमी एनजीएम प्लेटों (चरण 1.1.) में बाँझ एम 9 बफर (पूरक फ़ाइल 1) के 3 एमएल तक जोड़ें, और एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में प्रति तनाव सभी आठ प्लेटों से कृमि समाधान एकत्र करें।
    1. सेंट्रीफ्यूज 142 x g पर 2 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर। पी -5000 पिपेट या बाँझ पाश्चर पिपेट या टिप से लैस पानी के पंप का उपयोग करके सुपरनैटेंट को सावधानीपूर्वक हटा दें। कृमि गोली को धोने के लिए बाँझ एम 9 बफर के 10 एमएल जोड़ें। 2x दोहराएं।
    2. सुपरनैटेंट (जितना संभव हो) को हटा दें और पिपेट का उपयोग करके 15 सेमी ओपी 50 टीका एनजीएम प्लेट (चरण 1.5.) पर कीड़े को स्थानांतरित करें। केंद्रित OP50 संस्कृति के 0.5 एमएल जोड़ें।
    3. केंद्रित ओपी 50 बनाने के लिए, एलबी की चार 1 एल बोतलों में से प्रत्येक को ओपी 50 स्टार्टर कल्चर के 2 एमएल (चरण 1.2 में तैयार) के साथ टीका लगाएं, और 37 डिग्री सेल्सियस और 160 एक्स जी पर 6 घंटे के लिए एक हिलने वाले इनक्यूबेटर में उगाएं। 15 मिनट के लिए 3057 x g और 20 °C पर बैक्टीरिया को गोली मार दें। सुपरनैटेंट को छोड़ दें, ओपी 50 माध्यम के 6 एमएल के साथ बैक्टीरिया के छर्रों को फिर से निलंबित करें, और एक बाँझ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में इकट्ठा करें।
      नोट: बैक्टीरिया को 1 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  7. प्रत्येक कृमि तनाव को 15 सेमी व्यास वाले एनजीएम प्लेट पर 3-4 दिनों के लिए 15 डिग्री सेल्सियस पर उगाएं, जिसमें कीड़े को प्रतिदिन 0.5 एमएल केंद्रित ओपी 50 के साथ फिर से खिलाया जाता है।
    1. एक बार जब कीड़े भोजन लगभग समाप्त कर लेते हैं, तो एम 9 बफर (चरण 1.6.1) में इकट्ठा और धोते हैं, प्रत्येक कृमि तनाव संस्कृति को दो 15 सेमी एनजीएम प्लेटों (चरण 1.5.) में स्थानांतरित करते हैं, और 20 डिग्री सेल्सियस पर कीड़े का प्रसार करते हैं जब तक कि ~ 95% आबादी गुरुत्वाकर्षण वयस्क नहीं हो जाती है (जंगली प्रकार ब्रिस्टल एन 2 के लिए लगभग 24 घंटे लगेंगे)।
      नोट: ग्रेविड वयस्कों को कीड़े के भीतर अंडे की उपस्थिति की विशेषता होती है, और आदर्श प्लेट में बहुत अधिक लार्वा33 के बिना प्लेट पर रखे गए बिना अंडे की बहुतायत भी होनी चाहिए।

2. आंत माइक्रोबायोटा आइसोलेट संग्रह का रखरखाव (दिन 9)

  1. 48 बैक्टीरियल अलग-अलग 6 सेमी एलबी एगर प्लेटों पर अलग-अलग होते हैं और 20 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे तक बढ़ते हैं।
    नोट: यदि जल्दी से आवश्यक हो तो बैक्टीरिया को 24-36 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर उगाया जा सकता है, लेकिन लंबे समय तक 20 डिग्री सेल्सियस की वृद्धि संभावित दूषित पदार्थों को खोजने की अनुमति देती है।
  2. बड़ी संख्या में सी एलिगेंस सिंक्रनाइज़ करें।
    1. मानक अंडा तैयार करने की विधि33 का पालन करके ब्लीच ने वयस्क कीड़े को जन्म दिया और अंडे को 15 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए दो गैर-बीजित 15 सेमी एनजीएम प्लेटों पर स्थानांतरित किया ताकि सभी एल 1 लार्वा को बाद के चरणों में तुल्यकालिक रूप से बढ़ने की अनुमति मिल सके।
      सावधानी: ब्लीच समाधानों को संभालते समय सावधान रहें।

एलिगेंस संस्कृतियों का विकास (दिन 10)

  1. एक बार हैच करने के बाद, एल 1 लार्वा (चरण 2.2.1 से) को एक साफ शंक्वाकार 15 एमएल ट्यूब में एम 9 के 3-4 एमएल में इकट्ठा करें। पिपेट एक स्लाइड या प्लेट पर कृमि घोल की चार 10 μL बूंदों को गिनें और 16x आवर्धन पर स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत प्रत्येक बूंद में कीड़े की संख्या की गणना करें। कृमि घोल की सभी बूंदों से लार्वा की संख्या का औसत निकालकर घोल की कृमि सांद्रता का निर्धारण करें। इस मान को बाएं आयतन से गुणा करें और प्रत्येक तनाव के लिए कुल कृमि गणना का अनुमान लगाएं।
    नोट: इस स्तर पर 46,000-50,000 एल 1 लार्वा प्रति स्ट्रेन बाद में 384-वेल प्लेट या दो हाफ-प्लेट्स को भरने की आवश्यकता होती है।
    1. प्रत्येक स्ट्रेन के लिए, सभी एल 1 लार्वा को दो 15 सेमी एनजीएम प्लेटों (23,000-25,000 एल 1 प्रति प्लेट) पर स्थानांतरित करें, जिन्हें पहले ओपी 50 के 3 एमएल (चरण 1.5) के साथ टीका लगाया गया था और 0.5 एमएल केंद्रित ओपी 50 के साथ फिर से बीज दिया गया था।
  2. 15 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, प्रतिदिन 0.5 एमएल केंद्रित ओपी 50 के साथ शीर्ष पर रहें जब तक कि कीड़े एल 4 चरण तक नहीं पहुंच जाते।
    नोट: एल 4 चरण को थोड़ी गहरी आंत और एक अर्ध-डिस्क या अर्धचंद्राकार सफेद पैच की विशेषता है जहां योनी अंततः32,33 का निर्माण करेगी।
  3. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए 96-अच्छी तरह से एनजीएम-अगारोस प्लेटें तैयार करें।
    1. प्रत्येक कुएं को एनजीएम-अगारोस (प्रति परख चार प्लेटें) के 125 μL से भरकर आठ 96-अच्छी तरह से एनजीएम-अगारोस प्लेटें तैयार करें।
      नोट: कुछ अतिरिक्त प्लेटों को प्लेट करने की सिफारिश की जाती है यदि कुछ बाद के चरणों में दूषित हो जाते हैं। समानांतर में परख चलाने के लिए दो प्लेट रीडर की आवश्यकता होगी, लेकिन उन्हें गर्मी तनाव परख के साथ शुरू करके क्रमिक रूप से भी चलाया जा सकता है क्योंकि इसे 6 घंटे से कम समय तक चलाया जा सकता है। इन प्लेटों के लिए, <4% राख आगर को अगारोस ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ प्रतिस्थापित किया जाता है, जो एनजीएम प्लग में धीमी गति से और अधिक सुखाने में सक्षम होता है और बेहतर वसूली के लिए कृमि बिलों को कम करता है।
    2. सुनिश्चित करें कि कुएं समान रूप से भरे हुए हैं और बुलबुले मुक्त हैं। प्रक्रिया के दौरान मिश्रण को ठोस होने से रोकने के लिए 70 डिग्री सेल्सियस (मल्टीवेल प्लेट के प्लास्टिक के माध्यम से धीमी गर्मी हस्तांतरण के साथ, एनजीएम-अगारोस केवल 55-60 डिग्री सेल्सियस तक गर्म हो सकता है) पर सेट किए गए हीट ब्लॉक का उपयोग करें। कुओं के भीतर बुलबुले को हटाने के लिए, बाँझ लौ-गर्म सुई का उपयोग करें।
    3. 96-वेल प्लेटों को इनवर्टिंग (संक्षेपण को रोकने के लिए ढक्कन नीचे) से पहले बाँझ वातावरण में कमरे के तापमान पर सेट करने दें और आवश्यकता होने तक एक साफ बॉक्स में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. 11 वें दिन, चरण 3.2 से कीड़े की जाँच करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि कोई संदूषण दिखाई नहीं दिया है और कीड़े अभी भी भरे हुए हैं।
  5. 12 वें दिन, चरण 3.1 से कीड़े की जाँच करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि कोई संदूषण दिखाई नहीं दिया है और कीड़े अभी भी भरे हुए हैं। इसके अलावा, कीड़े के विकास चरण की जांच करें।
    तनाव और कृमि के विकास चरण, जैसे कि एल 4 या एल 4 + 24 एच कीड़े का उपयोग किया जाता है, उन उपचारों पर निर्भर करते हैं जो कीड़े के अधीन होते हैं। यहां, जंगली प्रकार के हेर्मैफ्रोडाइट्स को 36 घंटे के लिए एल 4 से बैक्टीरियल आइसोलेट्स के संपर्क में लाया गया था।

4. कीड़े को फिर से खिलाने के लिए आंत माइक्रोबायोटा आइसोलेट संग्रह तैयार करना

  1. चरण 2.1 से एलबी एगर प्लेटों पर जीवाणु वृद्धि की निगरानी करें। और 20 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करना जारी रखें।
    नोट: हालांकि यह आदर्श नहीं है, अगर कुछ क्लोन बढ़ते नहीं हैं या संदूषण प्रकट नहीं करते हैं, तो बैक्टीरिया को 6 सेमी एलबी प्लेटों पर साफ स्टॉक से फिर से खींचा जा सकता है और प्रयोग के लिए तैयार होने के लिए 24 घंटे के लिए 25-28 डिग्री सेल्सियस पर उगाया जा सकता है।
  2. परीक्षण किए जा रहे जीवाणु संग्रह के लिए 96-वेल सरणी लेआउट को परिभाषित करें, बाद के चरणों में व्यवस्थित प्लेट सीडिंग और डेटा विश्लेषण की सुविधा प्रदान करें (पूरक तालिका 1)।
  3. प्रत्येक 6 सेमी बैक्टीरियल प्लेट (चरण 4.1.) से जीवाणु द्रव्यमान एकत्र करें, और इसे 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 1 एमएल एम 9 बफर होता है। या तो एकल-उपयोग 2 मिमी व्यास बाँझ प्लास्टिक लूप या 5 मिमी व्यास धातु लूप का उपयोग करके ऐसा करें। बैक्टीरिया के उपभेदों के बीच धातु लूप को 100% इथेनॉल में डुबोकर, फ्लेमिंग और 5 सेकंड के लिए ठंडा करके निष्फल करें।
  4. जब तक बैक्टीरिया के छर्रों को पूरी तरह से निलंबित नहीं किया जाता है तब तक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को भंवर (जीवाणु तनाव के आधार पर, इसमें ~ 1-10 सेकंड लग सकते हैं)।
  5. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 9,300 x g पर स्पिन करें, 700 μL सुपरनैटेंट को हटा दें, और भंवर द्वारा जीवाणु गोली को फिर से निलंबित करें।
  6. चरण 4.2 में निर्धारित लेआउट के अनुसार प्रत्येक जीवाणु निलंबन के 200 μL को एक खाली बाँझ 96-वेल प्लेट के एक कुएं में स्थानांतरित करें।
  7. इस प्लेट से, मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके 10 μL जीवाणु समाधान के साथ आठ 96-वेल एनजीएम-अगारोस प्लेटों (चरण 3.3 में तैयार) को टीका लगाएं और 24 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर ढक्कन के साथ इनक्यूबेट करें। प्लेट सुखाने और बैक्टीरियल एरोबिक विकास की अनुमति देने और अतिरिक्त संघनन से बचने के लिए प्लेटों को सील न करें।
  8. चरण 4.6 में तैयार 96-वेल सस्पेंशन प्लेट को सील करें। साफ चिपकने वाली सीलिंग फिल्म के साथ ( सामग्री की तालिका देखें), और 5 दिनों तक 15 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। इसका उपयोग आवश्यकतानुसार कृमि को फिर से खिलाने के लिए किया जाएगा।

5. एलएफएएसएस गर्मी का झटका और ऑक्सीडेटिव परख सेटअप (दिन 13 - 14)

  1. चरण 3.5 से प्लेटों को देखते हुए, कीड़े के विकास चरण का आकलन करें। एक बार जब >90% कीड़े एल 434 तक पहुंच जाते हैं, तो 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में बाँझ एम 9 समाधान के 10 एमएल तक कीड़े एकत्र करें।
  2. ओपी 50 बैक्टीरिया से छुटकारा पाने के लिए 2 मिनट के लिए 142 x g पर 142 x g पर घूमकर, सतह पर तैरने वाले को हटाकर, और ओपी 50 बैक्टीरिया से छुटकारा पाने के लिए प्रत्येक धोने के बीच 10 एमएल ताजा बाँझ एम 9 जोड़कर कीड़े को बड़े पैमाने पर (कम से कम 4x) धोएं। एम 9 के 10 एमएल में कृमि गोली को पुन: निलंबित करें।
  3. 50 μL कृमि समाधान को कम सतह बाइंडिंग ट्यूब में स्थानांतरित करें ( सामग्री की तालिका देखें) जिसमें M9 का 950 μL होता है। कृमि अवसादन से बचने के लिए ट्यूब सामग्री को धीरे-धीरे मिलाने के बाद, कांच की स्लाइड या एनजीएम प्लेट पर 3-4 अलग 10 μL बूंदों को स्थानांतरित करने के लिए गीले लो-बाइंड पिपेट टिप का उपयोग करें, और 16x आवर्धन पर स्टीरियोमाइक्रोस्कोप ( सामग्री की तालिका देखें) के तहत कीड़े की संख्या की गणना करें। 3-4 बूंदों से गणना का औसत निकालें और कृमि समाधान में प्रति माइक्रोलीटर कीड़े की संख्या निर्धारित करें (चरण 3.1 देखें)।
  4. 8 μL में ~ 120 कीड़े तक पहुंचने के लिए 10 एमएल ट्यूब में कृमि एकाग्रता को समायोजित करें। यदि समाधान चरण 5.2 में तैयार किया गया है। पर्याप्त रूप से केंद्रित नहीं है, कीड़े को नीचे घुमाएं और तदनुसार एम 9 को हटा दें ताकि प्रति 8 μL 120 कीड़े तक पहुंच सकें।
  5. चरण 4.7 से आठ 96-वेल एनजीएम-अगारोस प्लेटों के प्रत्येक कुओं में 8 μL कृमि घोल (~ 120 कीड़े) स्थानांतरित करें, एक मल्टीचैनल पाइपेट या रिपीट पिपेट का उपयोग करके। कृमि हानि को सीमित करने के लिए कम प्रतिधारण युक्तियों का उपयोग करना सुनिश्चित करें। वयस्क कीड़े पर यांत्रिक तनाव को सीमित करने के लिए बड़े वयस्क कीड़े की अनुमति देने के लिए टिप सिरों को काटना भी आवश्यक हो सकता है।
    नोट: परख को विश्वसनीय रूप से काम करने के लिए कम से कम 30 जीवित स्वस्थ कीड़े की आवश्यकता होती है, लेकिन प्रति कुएं लगभग 100 कीड़े के साथ सबसे अच्छा काम करता है।
  6. कीड़े और जीवाणु-बीज वाले 96-अच्छी तरह से एनजीएम-अगारोस प्लेटों को 36 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  7. 12-24 घंटे के बीच प्लेटों की जांच करें, यह सुनिश्चित करें कि कीड़े पूरे समय भरे रहें। यदि पुन: भोजन की आवश्यकता होती है, तो चरण 4.8 में 15 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत 96-वेल बैक्टीरियल सरणी प्लेट के भीतर बैक्टीरिया को फिर से निलंबित करें, और 96-वेल एनजीएम-अगारोस प्लेटों में संबंधित जीवाणु समाधान के 10 μL तक जोड़ें, जहां कीड़े को 36 घंटे की इनक्यूबेशन अवधि के अंत से पहले भुखमरी का खतरा होता है (भूखे कीड़े काफी भिन्न परिणाम उत्पन्न करेंगे, इसलिए यह बहुत महत्वपूर्ण है)।
    नोट: 15 वें दिन निम्नलिखित चरणों का संचालन करने की आवश्यकता है। परख शुरू करने से पहले, पढ़ने की ऊंचाई को अनुकूलित करना आवश्यक हो सकता है। इष्टतम रीडिंग कुएं के तल से 20-50 μm ऊपर प्राप्त की जाएगी। यह प्लेट रीडर के मॉडल पर निर्भर करेगा। कुछ जेड-स्कैन की संभावना प्रदान करते हैं, जबकि अन्य मैन्युअल ऊंचाई इनपुट की अनुमति देते हैं। उस स्तर पर इष्टतम ऊंचाई सेट करें जहां उच्चतम नीली प्रतिदीप्ति (365 एनएम / 430 एनएम) संकेत का पता लगाया जाता है। कुछ प्लेट-रीडर अनुयायी सेल परख के लिए अनुकूलित एक निश्चित ऊंचाई पर काम कर सकते हैं और एलएफएएसएस परख के लिए आदर्श नहीं हो सकते हैं।
  8. 36 घंटे के बाद, 96-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में एम 9 के 30 μL वितरित करें।
    नोट: थर्मल तनाव परख के लिए, प्लेट रीडर को परख करने के लिए आवश्यक तापमान तक पहुंचने की आवश्यकता होती है और समय से पहले चालू करने की आवश्यकता हो सकती है। वर्तमान प्रोटोकॉल हत्या की गति को अधिकतम करने के लिए 42 डिग्री सेल्सियस का उपयोग करता है, लेकिन दृष्टिकोण 30 डिग्री सेल्सियस से ऊपर के अन्य तापमानों पर लागू होता है।
  9. कम-प्रतिधारण युक्तियों का उपयोग करके सेट लेआउट के अनुसार 384-वेल प्लेट में कीड़े (लगभग 20 μL) स्थानांतरित करें (वयस्क कीड़े के लिए यांत्रिक तनाव को कम करने के लिए बड़े कीड़े को अनुमति देने के लिए युक्तियों के अंत को काटने पर विचार करें)।
    नोट: वर्तमान अध्ययन के लिए, यहां वर्णित दो परखों (थर्मल तनाव और ऑक्सीडेटिव तनाव) के लिए दो अलग-अलग प्लेट रीडर सेटिंग्स का उपयोग किया जाता है, और इस प्रकार इन दो परखों के लिए अभिप्रेत नमूने एक ही 384-वेल प्लेट में नहीं चढ़ाए जाने चाहिए।
  10. सुनिश्चित करें कि प्लेट रीडर ठीक से सेट किए गए हैं (तालिका 1)।
  11. अधिक एम 9 के साथ 384-वेल प्लेटों को टॉप अप करें, प्रति अच्छी तरह से 60 μL की अंतिम मात्रा का लक्ष्य रखें। थर्मल तनाव परख के लिए, एम 9 के 40 μL जोड़ें, और t-BHP-प्रेरित ऑक्सीडेटिव तनाव के लिए, T-BHP के 6 μl में M9 के 34 μl जोड़ें (सामग्री की तालिका देखें)।
    1. टी-बीएचपी जोड़ने के 2 मिनट के भीतर परख शुरू करें (आदर्श रूप से, सभी कीड़े को एक साथ टी-बीएचपी के संपर्क में लाया जाना चाहिए, परख समय संकल्प 2 मिनट है)। यदि संभव नहीं है, तो परख की शुरुआत से पहले टी-बीएचपी को पाइप करने में बिताए गए समय का अनुमान लगाने के लिए टाइमर का उपयोग करें ताकि मृत्यु के औसत समय के बाद के समायोजन की अनुमति मिल सके।
  12. प्लेटों को उनके पारदर्शी ढक्कन के साथ बंद करें। मास्किंग टेप (प्लेट और ढक्कन पर टैपिंग) के साथ 384-वेल प्लेटों के किनारों को सील करें, यह सुनिश्चित करें कि टेप ढक्कन के ऊपर या प्लेट के नीचे न जाए। परख के दौरान वाष्पीकरण को कम करते हुए हवा के आदान-प्रदान की अनुमति देने के लिए स्केलपेल का उपयोग करके अंतराल पर ढक्कन और प्लेट के बीच टेप को स्लीट करें।
  13. प्लेट को प्लेट रीडर में डालें ( सामग्री तालिका देखें) और रन शुरू करें। 365 एनएम पर उत्तेजित करने और 6-12 घंटे के लिए हर 2 मिनट में 435 एनएम पर उत्सर्जन का पता लगाने का लक्ष्य रखें (तालिका 1)।
    नोट: आमतौर पर, 6 घंटे 42 डिग्री सेल्सियस गर्मी तनाव परख के लिए पर्याप्त है और 7% टी-बीएचपी ऑक्सीडेटिव तनाव परख के लिए 8 घंटे पर्याप्त है।

6. प्लेट-रीडर डेटा हैंडलिंग

  1. प्लेट-रीडर से कच्चे फ्लोरेसेंस डेटा को अल्पविराम- या टैब-पृथक .txt, .csv, या .xls / .xlsx प्रारूपों के रूप में सहेजें, और फिर एक्सएलएस / .xlsx प्रारूप में परिवर्तित करें। डेटा प्रारूप के आधार पर, उन्हें LFASS विश्लेषण के लिए आवश्यक एक्सेल शीट लेआउट से मेल खाने के लिए पुनर्गठित करें। संदर्भ30 में दिए गए विस्तृत निर्देशों का पालन करें।
    नोट: जबकि डेटा का मैन्युअल रूप से विश्लेषण किया जा सकता है, प्रत्येक समय श्रृंखला को सामान्य करना और उस समय की तलाश करना जब मृत्यु प्रतिदीप्ति आधे अधिकतम तक पहुंच जाती है, स्वचालित विश्लेषण एलएफएएसएस रूटीन30 चलाने वाले मैटलैब में किया जा सकता है।
  2. डाउनलोड और matlab (संस्करण 2014a या उसके बाद के संस्करण) और LFASS सॉफ़्टवेयर पैकेज़ को https://github.com/ABA80/LFASS से स्थापित करें। इसके भीतर दिए गए दिशानिर्देशों और एनोटेशन का पालन करें।
    नोट: चित्रा 1 सी दृष्टिकोण का एक संक्षिप्त विवरण देता है। LFASS रूटीन चलाने के लिए Matlab की आवश्यकता होती है। वैकल्पिक रूप से, मैटलैब कोड को ओरेकल में अनुवादित किया जा सकता है, फिटिंग फ़ंक्शन को छोड़कर, जो मालिकाना है। पूरी तरह से ओपन-सोर्स प्लेटफॉर्म में उपयोग को सक्षम करने के लिए नए स्मूथिंग और सिग्मोइड फ़ंक्शंस को फिर से लिखा जा सकता है।
  3. LFASS विश्लेषण के बीच, डेटा और परिणामों को एक नए स्थान पर ले जाएं क्योंकि LFASS विश्लेषण डेटा फ़ोल्डर में सभी फ़ाइलों को संसाधित करेगा और परिणाम फ़ोल्डर में फ़ाइलों को अधिलेखित करेगा।

7. डेटा निरीक्षण

  1. एक्सेल फ़ाइल खोलें और 384-वेल प्लेट पर अच्छी तरह से स्थिति के अनुसार पंक्तियों को लेबल करें। पूरक फ़ाइल 2 हीट शॉक परख के लिए उत्पन्न कच्चे प्रतिदीप्ति डेटा की एक्सेल फ़ाइल का एक उदाहरण दिखाता है। कृमि और जीवाणु उपभेदों को लेबल करने के लिए 384-वेल प्लेट पर अच्छी तरह से स्थिति का उपयोग करें।
  2. मैटलैब विश्लेषण से पहले, एक्सेल में डेटा का नेत्रहीन निरीक्षण करें, एक प्रतिनिधि के लिए समय के साथ प्रतिदीप्ति तीव्रता को प्लॉट करें। उपयोग किए गए प्लेट-रीडर के आधार पर, डेटा शोर हो सकता है लेकिन एक स्पष्ट शिखर प्रदर्शित करना चाहिए। विशेष रूप से:
    1. एक प्रतिदीप्ति मान निर्धारित करें जिसके नीचे एक शिखर शोर से काफी अलग नहीं होगा (एलएफएएसएस में ऐसी सीमा स्थापित करने से खाली कुओं को छोड़कर विश्लेषण में तेजी आएगी)।
    2. सबसे पहले समय बिंदु पर ध्यान दें जब प्रतिदीप्ति में उतार-चढ़ाव बढ़ने से पहले कम हो जाता है (जानवर 30 मिनट तक जोर से पिटाई कर सकते हैं, जिससे तेजी से उतार-चढ़ाव वाला नीला फ्लोरेसेंस रीडिंग हो सकता है)।
      नोट: वक्र फिटिंग विंडो से इन शुरुआती टाइमपॉइंट्स को बाहर करके पीक फिटिंग में सुधार किया जा सकता है।
    3. उन समय बिंदुओं पर ध्यान दें जिनके बीच न्यूनतम और अधिकतम प्रतिदीप्ति मान गिरने की उम्मीद है (इन श्रेणियों की पहचान करने के लिए कई कुओं को देखें) क्योंकि उनका उपयोग वक्र फिटिंग के लिए किया जाएगा।
    4. जांचें कि क्या प्रतिदीप्ति चोटियों के आयाम कुओं के बीच काफी भिन्न होते हैं, निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके आगे के विश्लेषण से पहले डेटा को सामान्य करें:
      सामान्यीकृत फ्लोरेसेंस वेलएन (टी) = (फ्लोरेसेंस वेलएन [टी] - न्यूनतम फ्लोरेसेंस वेल [डीटी]) / (अधिकतम फ्लोरेसेंस वेल [डीटी] - न्यूनतम फ्लोरेसेंस वेल [डीटी])
      जहां "एन" वर्तमान अच्छी संख्या है, "टी" टाइमपॉइंट है, और "डीटी" परख के लिए समय बिंदुओं की श्रृंखला है।

8. एलएफएएसएस डेटा प्रोसेसिंग

नोट: विवरण https://github.com/ABA80/LFASS और संदर्भ30 की पूरक सामग्री में प्रदान किए जाते हैं।

  1. LFASS फ़ोल्डर के भीतर दो सबफ़ोल्डर बनाएँ, एक डेटा का विश्लेषण करने के लिए और एक परिणामों के लिए, उदाहरण के लिए, "मेरा डेटा" और "परिणाम"।
  2. डेटा निरीक्षण के बाद LFASS सबफ़ोल्डर "मेरा डेटा" में परख एक्सेल डेटा फ़ाइल की प्रतिलिपि बनाएँ।
  3. MATLAB लॉन्च करें, LFASS फ़ोल्डर पर नेविगेट करें, कमांड विंडो (पूरक फ़ाइल 3) में फिटफ़ोल्डर टाइप करें और चलाएं। फिर ऑन-स्क्रीन निर्देशों का पालन करें।
  4. "फिटफ़ोल्डर" में टाइप करने के बाद, सिस्टम उस फ़ोल्डर का नाम पूछता है जिसमें एक्सेल फ़ाइल स्थित है, उदाहरण के लिए, 'मेरा डेटा'। अपने डेटा फ़ोल्डर का नाम टाइप करें (इस उदाहरण में, "मेरा डेटा")।
  5. अनुरोध किए गए विभिन्न पैरामीटर प्रदान करते हुए ऑन-स्क्रीन निर्देशों का पालन करें।
    1. वर्तमान प्रोटोकॉल में क्रमिक मापों के बीच समय अंतराल के लिए "2" दर्ज करें (इसे निर्दिष्ट करने से परिणामों को टाइमपॉइंट इकाइयों के बजाय मिनटों में व्यक्त किया जा सकता है)।
      नोट: समय अंतराल को प्रतिदीप्ति माप को कम या ज्यादा बार करने के लिए संशोधित किया जा सकता है (समय रिज़ॉल्यूशन को कम करने या बढ़ाने के लिए) और प्लेट रीडर क्षमताओं के आधार पर भी (यानी, प्लेट रीडर के लिए समय अंतराल बढ़ाने की आवश्यकता हो सकती है जो तेजी से पर्याप्त माप नहीं कर सकते हैं)। हमेशा LFASS दिनचर्या के साथ प्रयोगात्मक समय अंतराल से मेल खाना सुनिश्चित करें।
    2. सिग्मोइड फिट को बाधित करने के लिए "0.95" टाइप करके ऊपरी सहिष्णुता सीमा असाइन करें (इसे फिट में सुधार के लिए आवश्यकतानुसार बदला जा सकता है) और "0.05" टाइप करके कम सहनशीलता सीमा असाइन करें (इसे फिट में सुधार के लिए आवश्यकतानुसार बदला जा सकता है)।
      नोट: अन्य समय पैरामीटर डेटा निरीक्षण (चरण 7.2.) से उपयोगकर्ता नोट्स पर आधारित हैं।
  6. संकेत मिलने पर हां के लिए "वाई" या नहीं के लिए "एन" टाइप करके फिट किए गए और चिकने कर्व्स को प्रदर्शित करना है या नहीं, यह चुनें। अभिसरण फिट का नेत्रहीन निरीक्षण करने के लिए, पूर्व का चयन करें।
    नोट: उत्तरार्द्ध सभी चिकनी डेटा की कल्पना करने के लिए उपयोगी है लेकिन आमतौर पर चयनित नहीं होता है क्योंकि यह बहुत अधिक पॉप-अप ग्राफ़ उत्पन्न करता है। इसके बाद, मैटलैब एलएफएएसएस रूटीन को निष्पादित करेगा, जिसमें 1-10 मिनट लग सकते हैं यदि एक बार में कई एक्सेल फाइलें संसाधित की जा रही हैं। चरण 8.6 में चयन के अनुसार वक्रों के साथ पॉप-अप विंडो दिखाई देंगी। पूरक फ़ाइल 4 ए एक फिट किए गए वक्र का एक उदाहरण दिखाता है।
  7. चुनें कि (1) शोर के रूप में पहचाने जाने वाले वक्रों का विश्लेषण करना है या (2) खराब फिट किए गए वक्रों को [वाई / एन] विकल्प के साथ फिट करना है। अनुमोदन करने के लिए y टाइप करें और अस्वीकार करने के लिए n .
    नोट: रीफिटिंग को मंजूरी देने की सिफारिश की जाती है, खासकर अगर कई खराब फिट या अनफिटेड कर्व्स हैं। यह उपयोगकर्ता को प्रत्येक वक्र के लिए अनुरूप वक्र फिटिंग पैरामीटर प्रदान करने की अनुमति देगा क्योंकि वे स्क्रीन पर दिखाई देते हैं और केवल सिग्मोइड फिट के लिए पहले और बाद की सीमाओं के लिए पूछते हैं। इसे जितनी बार आवश्यक हो उतनी बार प्रयास किया जा सकता है।
  8. एक बार डेटा का विश्लेषण करने के बाद, मैटलैब बंद करें और एलएफएएस फ़ोल्डर खोलें।
  9. LFASS सबफ़ोल्डर मेरे परिणामों पर क्लिक करें, क्योंकि परिणाम फ़ाइलें परिणाम फ़ोल्डर में स्वचालित रूप से सहेजी जाती हैं जैसा कि .txt है।
    नोट: मैटलैब तीन .txt फाइलें उत्पन्न करता है: "बैच-फिटेड.txt", "बैच और शोर-फिट.txt", और "रिफिटेड.txt"। पूर्व दो को कंप्यूटर क्रैश या रीफिटिंग के दौरान उपयोगकर्ता त्रुटि के मामले में एहतियात के रूप में सहेजा जाता है। सबसे सटीक पूर्ण विश्लेषण वाली फ़ाइल "रीफिट्ड.txt" है।
  10. फ़ाइल Refitted.txt Microsoft Excel के साथ खोलें और आगे की प्रक्रिया के लिए .xls के रूप में सहेजें. पूरक फ़ाइल 4B ऐसी परिणाम फ़ाइल का एक उदाहरण दिखाता है।
    नोट: प्रत्येक अच्छी तरह से (पंक्तियों में संगठित) के लिए, कॉलम में तीन मान प्रदान किए जाते हैं जो कृमि आबादी की मृत्यु के औसत समय का अनुमान देते हैं: "कच्चा": प्रयोगात्मक डेटा शिखर के आधे-अधिकतम पर प्रतिच्छेद करने वाले समय की रिपोर्ट; "बैच-फिटेड": बैच-फिटेड वक्र के आधे-अधिकतम पर प्रतिच्छेद करने के समय की रिपोर्ट करता है; "रीफिट्ड": रीफिट किए गए वक्र के आधे-अधिकतम पर प्रतिच्छेद करने के समय की रिपोर्ट करता है।
  11. फ़ाइल को .xls स्वरूप में किसी सुरक्षित स्थान पर प्रतिलिपि के रूप में सहेजें. ऐसा करने में विफल रहने पर LFASS दिनचर्या के अगले रन के दौरान फ़ाइलों के ओवरराइट होने का जोखिम होगा।
    नोट: परिणामों को ग्राफिंग या सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए आगे संसाधित किया जा सकता है।

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Representative Results

एलएफएएसएस परख एक साथ कई परीक्षण स्थितियों की मजबूत, उच्च-थ्रूपुट और तेजी से स्क्रीनिंग प्रदान करते हैं, जैसे कि कई आनुवंशिक और माइक्रोबायोटा मापदंडों की स्क्रीनिंग जो तनाव प्रतिरोध और उम्र बढ़ने में योगदान करते हैं। कई परीक्षण स्थितियों का एक व्यापक डेटासेट प्राप्त करने के लिए प्रयोग के लिए केवल 2-3 सप्ताह लगते हैं। एल 4 + 36 एच वयस्क जंगली-प्रकार की कीड़े की आबादी को 36 घंटे के लिए 48 आंत माइक्रोबियल आइसोलेट्स पर 36 घंटे की संस्कृति के बाद 42 डिग्री सेल्सियस थर्मल तनाव और 7% टी-बीएचपी-प्रेरित ऑक्सीडेटिव तनाव के संपर्क में लाया गया था। परख चार बार की गई थी, प्रत्येक परख में प्रत्येक स्थिति को चार बार दोहराया गया था। परीक्षण की गई सभी स्थितियों में, थर्मल तनाव परख के लिए मृत्यु का औसत समय 40-130 मिनट और टी-बीएचपी प्रेरित ऑक्सीडेटिव तनाव परख के लिए 90-240 मिनट के बीच भिन्न था। प्रारंभिक वयस्कता थर्मल तनाव परख आमतौर पर ऑक्सीडेटिव तनाव परख की तुलना में अधिक सुसंगत परिणाम और कम अंतर-दिन और इंट्रा-डे परिवर्तनशीलता प्रदर्शित करते हैं और बाद में दीर्घायु30 के बेहतर भविष्यवक्ता हैं। विभिन्न माइक्रोबियल आहारों पर खिलाए गए कीड़े की मृत्यु के औसत समय में अंतर निर्णायक रूप से उदाहरण देता है कि आंत के कैंसर मेजबान तनाव प्रतिरोध को कैसे प्रभावित करते हैं। चित्रा 2 ब्रिस्टल एन 2 जंगली प्रकार के कीड़े के लिए रुचि के दो आंत माइक्रोबायोटा आइसोलेट्स और मानक प्रयोगशाला तनाव ई कोलाई ओपी 50 पर 16 जैविक प्रतिकृतियों के विशिष्ट परिणाम दिखाता है।

Figure 2
चित्र 2: दो बैक्टीरियल आइसोलेट्स और एक नियंत्रण तनाव पर उगाए गए कीड़े से युग्मित गर्मी / ऑक्सीडेटिव तनाव प्रतिरोध परख के प्रतिनिधि परिणाम। जंगली प्रकार के कीड़े को या तो एमवाईबी 11 (स्यूडोमोनास लुरिडा) या एमवाईबी 115 (स्यूडोमोनास्प) बैक्टीरियल आइसोलेट्स या ओपी 50 नियंत्रण बैक्टीरिया पर 36 घंटे के लिए खिलाया गया था। MYb11 ने मृत्यु के काफी पहले औसत समय (पी < 0.001) को जन्म दिया। (बी) ऑक्सीडेटिव तनाव परख। जंगली प्रकार के कीड़े को एमवाईबी 11 या एमवाईबी 115 बैक्टीरियल आइसोलेट्स या ओपी 50 नियंत्रण बैक्टीरिया पर 36 घंटे के लिए खिलाया गया था। MYb11 ने मृत्यु के काफी पहले औसत समय (पी < 0.05) को जन्म दिया। नमूनों के चार सेटों में 120-150 कीड़े का विश्लेषण किया गया था, और प्रत्येक प्रयोग चतुष्कोणीय में किया गया था। खराब गुणवत्ता वाले / खराब फिट किए गए डेटा वाले कुओं ने मूल्यों को गायब कर दिया। बॉक्स प्लॉट प्रतिनिधित्व एकल अच्छी तरह से मूल्यों, न्यूनतम, माध्य और अधिकतम मूल्यों को इंगित करता है। * एक तरफा एनोवा के साथ पी < 0.05 और *** पी < 0.001 पर सांख्यिकीय महत्व को इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

एक
प्राचल सेटिंग टिप्पणी
तापमान 25 °C
प्रतिदीप्ति उत्तेजना 365 एनएम 10 एनएम बैंडविड्थ
प्रतिदीप्ति उत्सर्जन 430 एनएम 20 एनएम बैंडविड्थ
चमक की संख्या 8 चमक, 1 m स्थिर समय
लाभ 100 से 130 नमूने के आधार पर समायोजित किया जाना। परख की शुरुआत में 2-5 k पठन मूल्य का लक्ष्य
अंतराल समय 1 μs
एकीकरण का समय 30 μs
समय अंतराल पढ़ें हर 2 मिनट तनाव की गंभीरता, अवधि और समय अंतराल के आधार पर समायोजन की आवश्यकता हो सकती है (7% टी-बीएचपी पर 8 घंटे पर्याप्त है)
अवधि 8-12 घंटे
दिशा पढ़ें नीचे से
B
प्राचल सेटिंग टिप्पणी
तापमान 42 °C
प्रतिदीप्ति उत्तेजना 365 एनएम 10 एनएम बैंडविड्थ
प्रतिदीप्ति उत्सर्जन 430 एनएम 20 एनएम बैंडविड्थ
चमक की संख्या 8 चमक, 1 m स्थिर समय
लाभ 100 से 130 नमूने के आधार पर समायोजित किया जाना। परख की शुरुआत में 2-5 k पठन मूल्य का लक्ष्य
अंतराल समय 1 μs
एकीकरण का समय 30 μs
समय अंतराल पढ़ें हर 2 मिनट तनाव की गंभीरता, अवधि और समय अंतराल के आधार पर समायोजन की आवश्यकता हो सकती है (42 डिग्री सेल्सियस पर 6 घंटे पर्याप्त है)
अवधि 6-12 घंटे
दिशा पढ़ें नीचे से

तालिका 1: ऑक्सीडेटिव और गर्मी तनाव परख सेटिंग्स। इस अध्ययन में उपयोग किए गए फ्लोरेसेंस प्लेट रीडर पर ऑक्सीडेटिव (ए) और गर्मी (बी) तनाव परख के लिए उपयोग की जाने वाली सेटिंग्स के उदाहरण।

पूरक फ़ाइल 1: मीडिया, बफर और संस्कृति व्यंजनों। वर्तमान अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले विभिन्न मीडिया, बफर और संस्कृतियों की संरचना। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 2: निर्यात किए जाने के बाद प्लेट रीडर से कच्चे प्रतिदीप्ति डेटा और एक्सेल .xls प्रारूप में परिवर्तित किया गया। (ए) एक्सेल फ़ाइल हीट शॉक परख के लिए कच्चे प्रतिदीप्ति डेटा को दिखाती है। कच्चे प्रतिदीप्ति डेटा को 2 मिनट के समय अंतराल पर दिखाया गया है। (बी) 384-वेल प्लेट पर "अच्छी स्थिति" वाले कॉलम पर प्रकाश डाला गया है, जिसका उपयोग कृमि और जीवाणु उपभेदों को लेबल करने के लिए किया जा सकता है। (सी) फ़ाइल को कृमि और जीवाणु उपभेदों के साथ लेबल किया गया है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 3: MATLAB का उपयोग कर LFASS विश्लेषण। (ए) मैटलैब में एलएफएएसएस फ़ोल्डर खोलने के बाद, एक कमांड विंडो पॉप अप होती है। (बी) प्रोग्राम शुरू करने के लिए कमांड विंडो में "फिटफ़ोल्डर" टाइप किया जाता है, और विश्लेषण की जाने वाली फ़ाइल के साथ फ़ोल्डर का नाम इंगित किया जाता है। (सी) एक बार जब प्रोग्राम विश्लेषण के लिए डेटा एक्सेल फ़ाइल पाता है, तो उपयोगकर्ता को अनुरोध किए गए विभिन्न पैरामीटर प्रदान करते हुए ऑन-स्क्रीन निर्देशों का पालन करना होगा। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 4: मैटलैब का उपयोग करके एलएफएएसएस डेटा का विश्लेषण किया। (ए) मैटलैब विश्लेषण के माध्यम से फिट किए गए वक्र का एक उदाहरण, जहां काली रेखा वक्र फिटिंग के लिए पहले की समय सीमा के अनुरूप समय बिंदु और बाद की समय सीमा के अनुरूप नीली रेखा को इंगित करती है। फिट किए गए सिग्मोइड वक्र को लाल रंग में प्रदर्शित किया जाता है। (बी) मैटलैब द्वारा उत्पन्न परिणाम फ़ाइल .xls प्रारूप में खोली जाती है। मान हाइलाइट किए जाते हैं और संख्या स्वरूप में प्रदर्शित होते हैं. दूसरा कॉलम वह समय प्रदान करता है जब कच्चे डेटा वक्र पर मान पहली बार अधिकतम मान के 50% से अधिक होता है। तीसरा कॉलम वह समय प्रदान करता है जब फिट किए गए वक्र का मान अधिकतम मूल्य के 50% के बराबर होता है, जैसा कि बैच-फिटिंग विश्लेषण के दौरान निर्धारित किया गया है। चौथा कॉलम वह समय प्रदान करता है जिस पर फिट किए गए वक्र पर मूल्य बैच विश्लेषण और जहां आवश्यक हो अंतिम रीफिटिंग के बाद अधिकतम मूल्य के 50% के बराबर होता है। इस प्रकार, चौथे कॉलम को सबसे विश्वसनीय परिणाम प्रदान करना चाहिए। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका 1: उदाहरण प्रयोगात्मक प्लेट लेआउट। (ए) 47 अलग-अलग कृमि आंत माइक्रोबायोटा बैक्टीरियल आइसोलेट्स के परीक्षण के लिए 96-वेल प्लेट लेआउट दो अलग-अलग कृमि उपभेदों पर, जिसमें लाइव ओपी 50 को नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा रहा है। चलाए जा रहे प्रत्येक परख के लिए इस प्लेट की चार प्रतियों की आवश्यकता होती है। (बी) गर्मी या ऑक्सीडेटिव तनाव परख के लिए 384-वेल लेआउट, (ए) में पिछले 96-वेल प्लेट परख के अनुरूप। यह सेटअप टेट्राप्लिकेट्स को प्रत्येक स्थिति के लिए करने की अनुमति देता है, जिसमें प्रत्येक कृमि तनाव का अपना ओपी 50 नियंत्रण होता है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

एलिगेंस अपने छोटे आकार, पारदर्शिता, तेजी से विकास, छोटे जीवनकाल, सस्तीता और हैंडलिंग में आसानी के कारण एक साथ कई प्रयोगात्मक मापदंडों की तेजी से स्क्रीनिंग के लिए कई फायदे प्रदान करता है। इसका काफी सरल जीनोम, बॉडी प्लान, तंत्रिका तंत्र, आंत और माइक्रोबायोम, फिर भी जटिल और मनुष्यों के समान है, इसे एक शक्तिशाली प्रीक्लिनिकल मॉडल बनाता है, जहां बायोएक्टिव प्रभावकारिता या विषाक्तता के परीक्षण के दौरान यंत्रवत अंतर्दृष्टि प्राप्त की जा सकती है। चूंकि रोगों 8,9,34,35 के लिए माइक्रोबियल हस्तक्षेप विकसित करने में रुचि बढ़ रही है, प्रोबायोटिक्स की तेजी से जांच करने के लिए ऐसे प्रीक्लिनिकल मॉडल का लाभ उठाना रोगाणुओं की बड़े पैमाने पर अप्रयुक्त और लगभग असीमित चिकित्सीय क्षमता के साथ एक आकर्षक विकल्प है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल सी एलिगेंस स्वास्थ्य पर पर्यावरणीय बैक्टीरिया के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है, लेकिन अन्य उद्देश्यों के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।

बहुमुखी प्रतिभा
इस पाइपलाइन को बनाने वाले विभिन्न "मॉड्यूल" को प्रयोग- या प्रयोगशाला-विशिष्ट आवश्यकताओं से मेल खाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, बैक्टीरियल आइसोलेट्स को बैक्टीरियल मिश्रण, बैक्टीरियल म्यूटेंट, या आरएनएआई-उत्पादक बैक्टीरिया के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है, और सेटअप का उपयोग मेजबान-माइक्रोब इंटरैक्शन में शामिल बैक्टीरिया जीन के लिए स्क्रीन करने, तनाव प्रतिरोध में शामिल मेजबान जीन के लिए स्क्रीन करने या परिभाषित जीवाणु समुदायों के हिस्से के रूप में व्यक्तिगत रोगाणुओं के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। यह विधि एक कीड़े की आनुवंशिक पृष्ठभूमि में कई जीवाणु आइसोलेट्स की स्क्रीनिंग का वर्णन करती है। हालांकि, परख स्केलेबल है, और एक बार में कई मेजबान और जीवाणु जीनोटाइप का अध्ययन किया जा सकता है। मेजबान जीन-माइक्रोब जीन-आहार इंटरैक्शन में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए इसे अंतर दवा उपचार और / या आहार आहार के साथ जोड़ा जा सकता है।

प्रोटोकॉल को अभी तक अन्य नेमाटोड प्रजातियों पर प्रयास किया जाना है, लेकिन यह सीधे सी रेमानेई और सी ब्रिग्से पर भी लागू होना चाहिए, और यह एल 3 चरण परजीवी नेमाटोड प्रजातियों पर लागू हो सकता है जो सी एलिगेंस30 के साथ रूपात्मक, आकार और मृत्यु प्रतिदीप्ति विशेषताओं को साझा करते हैं। अंत में, पूरक या पुष्टित्मक जानकारी प्रदान करने के लिए अन्य तनावों (जुगलोन, पैराक्वाट, आर्सेनेट, अन्य तापमान) का उपयोग एक ही पाइपलाइन के भीतर किया जा सकता है।

संभावित चुनौतियां
परख से पहले कीड़े और बैक्टीरिया को विकसित करने के लिए 12 वें दिन तक का समय निवेश महत्वपूर्ण है, लेकिन दृष्टिकोण के थ्रूपुट के कारण, यह एकत्र किए गए डेटा की चौड़ाई से कहीं अधिक है। फिर भी, तैयारी के चरणों को दोहराकर समय बर्बाद करने से बचने के लिए इस तरह की परख की योजना बनाने में सावधानी आवश्यक है क्योंकि जब तक परख शुरू हो सकती है तब तक सामग्री कम हो जाती है। मुख्य शुरुआती मुद्दों में नमूना संदूषण (कीड़े या बैक्टीरिया), खराब सिंक्रनाइज़ कृमि आबादी, और सामग्री की कमी शामिल है (कृमि आबादी अपने भोजन के माध्यम से अपेक्षा से अधिक तेजी से खाती है और जानवरों को योजना से अधिक बार फिर से खिलाती है या स्थानांतरित करती है)।

संदूषण से बचें
प्रोटोकॉल के पैमाने और अवधि के कारण, एक प्रमुख संभावित मुद्दा कवक और बैक्टीरिया द्वारा संदूषण है, जिसकी घटना निश्चित रूप से परिणामों को भ्रमित करेगी। आदर्श सेटअप, इस प्रकार, बाँझ उपभोग्य सामग्रियों का उपयोग करके प्रयोगात्मक बेंच के ऊपर सीधे एयरफ्लो के बिना एक वातानुकूलित और एयर-फ़िल्टर किया गया समर्पित लैब स्पेस है। हालांकि, नियमित सफाई प्रक्रियाओं का पालन करना (काम से पहले और बाद में बेंचों को दूषित करना, प्लेट बक्से की सफाई करना, और बाँझ उपभोग्य सामग्रियों का उपयोग करना) और एक निहित स्थान में लौ द्वारा काम करना (दालान, खुले दरवाजों के पास की जगह और खिड़कियों से बचें) आमतौर पर स्वच्छ वातावरण बनाए रखने के लिए पर्याप्त होते हैं। यदि चरण 2.2.1 में अंडे की तैयारी से पहले हल्के संदूषण होते हैं, तो विरंजन प्रक्रिया उनकी देखभाल करेगी, और प्रोटोकॉल योजना के अनुसार प्रगति कर सकता है। इसके विपरीत, परीक्षण बैक्टीरिया प्लेटों पर स्थानांतरित करने से पहले बढ़ती कृमि आबादी को प्रभावित करने वाले संदूषण उस प्रयास के अंत का संकेत देंगे, और प्रोटोकॉल को चरण 1 से फिर से शुरू करने की आवश्यकता होगी। बाद में संदूषण एकल जीवाणु उपभेदों या परीक्षण स्थितियों को प्रभावित करेंगे। उनकी सीमा के आधार पर, यह प्रोटोकॉल पर जाने या फिर से शुरू करने के लायक हो सकता है।

कृमि सिंक्रनाइज़ेशन
चूंकि थर्मल और ऑक्सीडेटिव चुनौतियों का प्रतिरोध बदलता है जब कीड़े विकसित होते हैं और बढ़ते हैं, इसलिए एलएफएएसएस परख किए जाने तक विभिन्न विकास चरणों का नेतृत्व करने वाली परीक्षण स्थितियों की तुलना आसानी से नहीं की जा सकती है। एंडपॉइंट परख के लिए अच्छी तरह से सिंक्रनाइज़ आबादी उत्पन्न करना आवश्यक है। चूंकि एल 4 या एल 4 + 48 एच चरणों में थोक में एकत्र किए गए कीड़े पर परीक्षण किया जाता है, पूरी तरह से मंचित कीड़े को इकट्ठा करने के लिए कृमि सॉर्टर या अन्य छंटाई प्रक्रिया की अनुपस्थिति में, कृमि आबादी को एल 1 पर बहुत अच्छी तरह से सिंक्रनाइज़ किया जाना चाहिए। यह सुनिश्चित किया जाना चाहिए कि परीक्षण समूह (>15 घंटे 20 डिग्री सेल्सियस पर और >18 घंटे 15 डिग्री सेल्सियस) बढ़ने से पहले सभी जीवित अंडों को बाहर निकालने के लिए सभी जीवित अंडों के लिए पर्याप्त समय तक भोजन से दूर रखा जाए। जीनोटाइप विकास के समय में प्रसार को प्रभावित कर सकता है, जो तापमान से भी प्रभावित होता है। 15 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ती कृमि आबादी कृमि जनसंख्या विस्तार चरण (विशेष रूप से इंसुलिन सिग्नलिंग म्यूटेंट के साथ काम करते समय) के दौरान तापमान-संवेदनशील उत्परिवर्तन के प्रभाव को सीमित करते हुए इस पर बेहतर नियंत्रण देती है। एल 4 या एल 4 + 48 एच से रोगाणुओं के प्रभावों का अध्ययन करने का मुख्य कारण एक अलग आहार के विकास ता्मक प्रभाव को बायपास करना और आहार पर उनके प्रभाव के बजाय जीवित आंत बैक्टीरिया के प्रभाव का अध्ययन करना है। विभिन्न जीवाणु आइसोलेट्स या मिश्रण पर पहले लार्वा चरण में उगाए गए कीड़े अनिवार्य रूप से असमान विकास दर और सिंक्रनाइज़ के नुकसान का कारण बनेंगे।

नीले प्रतिदीप्ति पर भरोसा करने के परिणाम
व्यक्तिगत कृमि ट्रैकिंग या अतिरिक्त अभिकर्मकों जैसे कि साइटॉक्स ग्रीन36 की आवश्यकता के बिना एलएफएएसएस परख में मृत्यु को इंगित करने में सक्षम होना, लेकिन इसके बजाय एक प्रतिदीप्ति सीमा में एक अंतर्जात संकेत का फायदा उठाना जो पारंपरिक कृमि बायोमार्कर के साथ ओवरलैप होने की संभावना नहीं है, एक स्पष्ट लाभ है। हालांकि, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि कृमि मृत्यु प्रतिदीप्ति को कई परीक्षण स्थितियों में लगातार पता लगाया जा सकता है। जबकि परख प्रतिदीप्ति परिमाणीकरण पर भरोसा नहीं करता है, लेकिन इसकी गतिशीलता पर निर्भर करता है, मृत्यु के औसत समय (टीओडी) का सटीक अनुमान लगाने के लिए कीड़े द्वारा पर्याप्त प्रतिदीप्ति को अभी भी उत्सर्जित करने की आवश्यकता है। चूंकि परख एकल कृमि मृत्यु के समाधान की अनुमति नहीं देती है, इसलिए मरने वाले व्यक्तियों द्वारा उत्सर्जित नीले प्रतिदीप्ति विस्फोट को एकल जनसंख्या प्रतिदीप्ति शिखर देने के लिए प्रतिदीप्ति संचय के लिए पर्याप्त अस्थायी ओवरलैप की आवश्यकता होती है। केवल तभी औसत टीओडी का सटीक अनुमान लगाया जा सकता है। इसका मतलब है कि नीले प्रतिदीप्ति के पर्याप्त स्तर का उत्पादन करने में असमर्थ कीड़े का उपयोग इस प्रोटोकॉल में नहीं किया जा सकता है, जिसमें विशेष रूप से किनुरेनिन मार्ग के कुछ उत्परिवर्ती शामिल हैं जैसे कि टीडीओ -2 और किनू -1 30,31, साथ ही भूखे जानवर भी। इसलिए, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि कीड़े को पूरे समय परिपूर्ण परिस्थितियों में रखा जाए। यह विशेष रूप से एक मुद्दा हो सकता है जब एचटी 115-संचालित आरएनएआई स्क्रीन का प्रदर्शन किया जाता है क्योंकि एनटीपीजी और एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक एनजीएम माध्यम पर एचटी 115 लॉन ओपी 50 लॉन की तुलना में पतले होते हैं। इस प्रकार, परीक्षण ों के लिए अग्रणी दिनों के दौरान कृमि खाद्य आपूर्ति की निगरानी करना महत्वपूर्ण है।

मृत्यु प्रतिदीप्ति की गतिशीलता का एक और परिणाम यह है कि परख जितनी जल्दी होगी, संवेदनशीलता उतनी ही बेहतर होगी, क्योंकि एक ही आबादी के कीड़े अधिक तुल्यकालिक रूप से मर जाएंगे और अधिक परिभाषित जनसंख्या मृत्यु प्रतिदीप्ति शिखर का उत्पादन करेंगे। इस प्रकार, परख जितनी लंबी होगी, अच्छी मृत्यु प्रतिदीप्ति चोटियों को उत्पन्न करने के लिए आवश्यक जनसंख्या का आकार उतना ही बड़ा होगा। कम चयापचय वाले उत्परिवर्ती, जैसे कि ईट -2 और डीएएफ -230, भी कम प्रतिदीप्ति देंगे और प्रति अच्छी तरह से उच्च संख्या की आवश्यकता होगी। जबकि प्रति कुएं 10-15 जंगली-प्रकार के कीड़े 42 डिग्री सेल्सियस थर्मल तनाव परख के लिए पर्याप्त हैं जो उन सभी को 4 घंटे के भीतर मार देता है, एक ही परख में डीएएफ -2 (ई 1370) कीड़े के लिए लगभग दोगुनी मात्रा की आवश्यकता होती है, और >100 जंगली प्रकार के कीड़े एक परख के लिए आवश्यक होते हैं जो 24 घंटे की अवधि में कीड़े को मार देगा।

पर्यावरणीय जीवाणु आइसोलेट्स के संदर्भ में, अलग-अलग माइक्रोबियल चयापचय भी किनुरेनिन मार्ग को अलग-अलग प्रभावित कर सकते हैं जो नीले फ्लोरेसिंग यौगिकों का उत्पादन करता है। इसलिए, कुछ बैक्टीरियल आइसोलेट्स कम पीक डेथ फ्लोरेसेंस का कारण बनते हैं, जबकि अन्य ओपी 50 की तुलना में उच्च चोटियों का कारण बनते हैं। नतीजतन, किसी को सभी घटनाओं को समायोजित करने के लिए प्रति अच्छी तरह से पर्याप्त कीड़े का लक्ष्य रखने की आवश्यकता होती है।

अंत में, प्लेट-रीडिंग मापदंडों को सही ढंग से अनुकूलित करना आवश्यक है। यह प्रोटोकॉल प्रतिदीप्ति उत्तेजना और उत्सर्जन मापदंडों की स्थापना और गहराई को कवर करता है जिस पर रीडिंग आदर्श रूप से की जानी चाहिए। एक ही परख में कई स्थितियों में मृत्यु प्रतिदीप्ति उपज की संभवतः विस्तृत श्रृंखला के साथ, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि कमजोर संकेतों का पता लगाया जाता है लेकिन डिटेक्टरकभी संतृप्त नहीं होते हैं। डिटेक्टरों के साथ उपकरण जो उच्च गतिशील रेंज का दावा करते हैं, इस प्रकार, बेहतर प्रदर्शन करेंगे।

विधि की सीमाएँ
यहां वर्णित विधि मजबूत और लचीली है और इसे विभिन्न परिस्थितियों के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है। सुविधा के लिए, प्रोटोकॉल के साथ प्रमुख प्रतिबंधों और सीमाओं का उल्लेख किया गया है जहां वे खेल में आते हैं। संक्षेप में, मृत्यु के अंतर्जात मार्कर के रूप में मृत्यु प्रतिदीप्ति पर निर्भरता इन परखों की ताकत और सीमा दोनों है।

सीमित संख्या में विशिष्ट आहार स्थितियों (कम ट्रिप्टोफैन आहार या भुखमरी) और ट्रिप्टोफैन चयापचय को प्रभावित करने वाली उत्परिवर्ती स्थितियों (यानी, टीडीओ -2, किनू -1, कुछ डीएएफ -2 एलील्स) में, मृत्यु प्रतिदीप्ति (डीएफ) दृढ़ता से क्षीण हो सकती है, इस हद तक कि पीक फ्लोरेसेंस का पता लगाना मुश्किल है और टीओडी अनुमान कम विश्वसनीय हैं।

इसके विपरीत, कुछ रोगाणु नीले फ्लोरेसिंग यौगिकों का उत्पादन कर सकते हैं जिनके उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा डीएफ संकेतों (यानी, एंटरोकोकस फिकेलिस) के साथ ओवरलैप होते हैं। जबकि उनकी गतिशीलता डीएफ से भिन्न होती है और अक्सर अयुग्मित हो सकती है, वे विश्लेषण को भ्रमित कर सकते हैं।

इसके बाद, परख मरने वाले व्यक्तिगत कीड़े से संकेतों के संयोजन पर भरोसा करते हैं, लेकिन डीएफ समय के साथ बुझा दिया जाता है। इसलिए, यदि कीड़े बहुत दूर मर जाते हैं, तो व्यक्तिगत प्रतिदीप्ति चोटियां जनसंख्या शिखर का उत्पादन करने में विफल रहेंगी, जिससे जनसंख्या औसत टीओडी के माप को रोका जा सकेगा। परख जितनी धीमी होती है, प्रत्येक कुएं30 में आवश्यक कीड़े की संख्या उतनी ही अधिक होती है। इसलिए, प्रति कुएं 10-15 वयस्क कीड़े 42 डिग्री सेल्सियस गर्मी तनाव परख के लिए पर्याप्त हैं जो 2 घंटे के भीतर आधे कीड़े को मारता है, लेकिन बैक्टीरिया की तेजी से मारने वाली परख के लिए प्रति कुएं 70 से अधिक कीड़े आवश्यक हैं जो 12 घंटे में आधे कीड़े को मारते हैं।

अंत में, उपयोगकर्ताओं को इस तरह के परीक्षण करने के लिए एक प्लेट रीडर तक पहुंच की आवश्यकता होती है जो आवश्यक तरंग दैर्ध्य पर समय-चूक प्रतिदीप्ति माप कर सकते हैं। उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य भी सिस्टम के बीच थोड़ा भिन्न हो सकते हैं और नेमाटोड प्रजातियों के बीच भिन्न हो सकते हैं, जैसा कि उल्लेख किया गयाहै।

अन्य सी एलिगेंस परख के साथ तुलना और पूरकता
पिछले 10-15 वर्षों में, एक साथ कई स्थितियों में सी एलिगेंस स्वास्थ्य का आकलन करने के लिए कई परख विकसित किए गए हैं, रणनीतियों की विविधता को नियोजित करते हुए और डेटा गहराई और चौड़ाईके विभिन्न स्तरों की पेशकश करते हुए 30,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45, 46. मल्टी-वर्म ट्रैकिंग एल्गोरिदम और / या माइक्रोफैब्रिकेटेड व्यक्तिगत कृमि सरणी 37,38,39,40,41,43 के साथ कैमरा सरणी और स्कैनर का उपयोग करके, उनके जीवनकाल में ठोस मीडिया पर एक साथ कई कीड़े की स्वचालित रूप से निगरानी करने के लिए कई शक्तिशाली परख विशेष रूप से विकसित किए गए हैं . मेजबान-माइक्रोब इंटरैक्शन के संदर्भ में, ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल के समान दृष्टिकोण लेकिन डीएफ पर भरोसा नहीं करने से बैक्टीरिया के संक्रमण में शामिल सी एलिगेंस जीन की जीनोम-वाइड आरएनएआई स्क्रीनिंग भी सक्षम हो गई है। हालांकि, ये उच्च-थ्रूपुट परख पूरे तरल में कीड़े को संभालने पर भरोसा करते हैं, जो क्रॉस-संदूषण के बढ़ते जोखिमों के कारण एक साथ कई जीवाणु प्रकारों से निपटने पर वांछनीय नहीं है और क्योंकि तरल संस्कृति मेजबान और माइक्रोबियल चयापचय को प्रभावित करती है। इसलिए, पारंपरिक संक्रमण, तनाव, स्वास्थ्य और दीर्घायु परख में, सी एलिगेंस को ठोस मीडिया पर उगाए गए जीवाणु लॉन पर बनाए रखा जाता है और वृद्ध किया जाता है। जैसा कि इस प्रोटोकॉल में भी होता है, इस पाइपलाइन के साथ किए गए स्क्रीन के परिणाम स्क्रीन हिट के साथ डाउनस्ट्रीम पुष्टिकरण प्रयोगों के परिणाम से अधिक आसानी से संबंधित और भविष्यवाणी कर सकते हैं।

एलएफएएसएस दृष्टिकोण के लाभों को संदर्भ30 में अच्छी तरह से कवर किया गया है। अधिक विस्तृत निरंतर इमेजिंग सेटअप की तुलना में जिन्हें समान अध्ययनों के लिए पुनर्निर्मित किया जा सकता है, एलएफएएसएस सस्ता है (बशर्ते औसत टीओडी एकमात्र रीडआउट की आवश्यकता है), और इसकी सादगी का मतलब है कि इसे बहुत तकनीकी क्षमता या विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं है। LFASS मुख्य रूप से गहराई से चौड़ाई के बारे में है। एलएफएएसएस डेटा एक कृमि आबादी की मृत्यु के औसत समय और किनुरेनिन मार्ग आउटपुट के अप्रत्यक्ष रीडआउट के अलावा अन्य जानकारी प्रदान नहीं करता है। इसके विपरीत, कम लेकिन अभी भी सभ्य थ्रूपुट के साथ, जटिल लक्षणों को कीड़े के पूरे जीवनकालमें 37,38,39,40,41,43 अन्य परखों से मापा जा सकता है, जिससे उन्हें एलएफएएसएस स्क्रीन से हिट का अध्ययन करने के लिए उत्कृष्ट डाउनस्ट्रीम दृष्टिकोण मिलता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम सीजीसी मिनेसोटा (मैडिसन, यूएसए, एनआईएच - पी 40 ओडी 010440) को कृमि उपभेदों को प्रदान करने के लिए और ओपी 50 और पीआर हिनरिच शूलेनबर्ग (सीएयू, कील, जर्मनी) को यहां चित्रित सभी पर्यावरणीय माइक्रोबियल आइसोलेट्स प्रदान करने के लिए धन्यवाद देते हैं। इस काम को एबी (बीबी / एस 017127/1) को यूकेआरआई-बीबीएसआरसी अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था। जेएम को लैंकेस्टर विश्वविद्यालय एफएचएम पीएचडी छात्रवृत्ति द्वारा वित्त पोषित किया जाता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 cm diameter plates (Non-vented) Fisher Scientific 10720052 Venting is not necessary for bacterial cultures
15 cm diameter plates (Vented) Fisher Scientific 168381
384-well black, transparent flat bottom plates Corning 3712 or 3762 Not essential to be sterile for fast stress assays
6 cm diameter plates (Vented) Fisher Scientific 150288 Venting is necessary for worm cultures to avoid hypoxia
96-well transparent plates (Biolite) Thermo 130188
Agar (<4% ash) Sigma-Aldrich 102218041 Good quality agar is important for the structural integrity of the culture media, to avoid worm burrowing
Agarose Fisher Scientific BP1356
Avanti Centrifuge J-26 XP Beckman coulter
Bleach Honeywell 425044
Calcium chloride Sigma-Aldrich C5080
Centrifuge 5415 R Eppendorf
Centrifuge 5810 R Eppendorf
Cholesterol Sigma-Aldrich C8667
LB agar Difco 240110
LB broth Invitrogen 12795084
LoBind tips VWR 732-1488 Lo-bind reduce worm loss during transfers
LoBind tubes Eppendorf 22431081
Magnesium sulfate Fisher Scientific M/1100/53
Plate reader- infinite M nano+ Tecan Monochromator setup enables fluorescence tuning but adequate filter-based setups may be used
Plate reader- Spark Tecan
Potassium phosphate monobasic Honeywell P0662
Sodium chloride Sigma-Aldrich S/3160/63
Stereomicroscope setup with transillumination base Leica MZ6, or M80 Magnification from 0.6-0.8x up to 40-60x is necessary, as is a good quality transillumination base with a deformable, titable or slidable mirror to adjust contrast
t-BHP (tert-Butyl hydroperoxide) Sigma-Aldrich 458139
Transparent adhesive seals Nunc Fisher Scientific 101706871 It is important that it is transparent and that it can tolerate the temperatures involved in the assays.
Tryptophan Sigma-Aldrich 1278-7099
Yeast extract Fisher Scientific BP1422

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जीव विज्ञान अंक 182
<em>केनोरहाब्डाइटिस एलिगेंस</em> स्वास्थ्य पर प्रभाव के साथ माइक्रोबियल आइसोलेट्स की उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग
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Ali, I., Martin, J., Zárate-Potes, A., Benedetto, A. High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health. J. Vis. Exp. (182), e63860, doi:10.3791/63860 (2022).

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