Summary
장내 미생물은 특정 또는 보존 메커니즘을 통해 숙주의 건강에 긍정적 또는 부정적 영향을 미칠 수 있습니다. Caenorhabditis elegans 는 그러한 미생물을 스크리닝하는 편리한 플랫폼입니다. 본 프로토콜은 웜 건강의 대용으로 사용되는 선충 스트레스 저항성에 미치는 영향에 대한 48개의 박테리아 분리주의 고처리량 스크리닝을 설명합니다.
Abstract
작은 크기, 짧은 수명 및 쉬운 유전학을 갖춘 Caenorhabditis elegans 는 미생물 분리가 숙주 생리학에 미치는 영향을 연구할 수 있는 편리한 플랫폼을 제공합니다. 또한 죽을 때 파란색으로 형광을 발하여 죽음을 정확히 찾아내는 편리한 수단을 제공합니다. 이 특성은 고처리량 무표지 C. 엘레간스 생존 분석법(LFASS)을 개발하는 데 활용되었습니다. 여기에는 멀티웰 플레이트에 설정된 웜 개체군의 시간 경과 형광 기록이 포함되며, 이로부터 개체군 사망 중앙값을 도출할 수 있습니다. 본 연구는 심한 열 및 산화 스트레스에 대한 C. elegans 감수성에 대한 영향에 대해 한 번에 여러 미생물 분리 물을 스크리닝하기 위해 LFASS 접근법을 채택합니다. 이러한 미생물 스크리닝 파이프라인은 특히 숙주 건강에 대한 대용으로 심각한 스트레스 저항성을 사용하여 프로바이오틱스를 사전 스크리닝하는 데 사용될 수 있습니다. 이 프로토콜은 분석을 위해 결합하기 전에 멀티웰 어레이에서 C. elegans 장내 미생물 분리 컬렉션과 동기 웜 개체군을 모두 성장시키는 방법을 설명합니다. 제공된 예에서는 2개의 웜 균주에 대한 47개의 박테리아 분리주와 1개의 대조 균주를 두 개의 스트레스 분석에서 병렬로 테스트하는 방법을 다룹니다. 그러나 접근 파이프라인은 쉽게 확장할 수 있으며 다른 많은 양식의 스크리닝에 적용할 수 있습니다. 따라서 C. elegans 건강에 영향을 미치는 생물학적 및 생화학적 조건의 다중 매개변수 환경을 신속하게 조사할 수 있는 다목적 설정을 제공합니다.
Introduction
인체에는 주로 장, 피부 및점막 환경에서 발견되는 약 10-100조 개의 살아있는 미생물 세포(박테리아, 고세균 균류)가 있습니다1. 건강한 상태에서 이들은 비타민 생산, 면역 체계의 성숙, 병원체에 대한 선천성 및 적응성 면역 반응의 자극, 지방 대사 조절, 스트레스 반응의 조절 등을 포함하여 숙주에게 이점을 제공하며 성장 및 발달, 질병 발병 및 노화에 영향을 미칩니다 2,3,4,5 . 장내 미생물은 또한 평생 동안 상당히 진화합니다. 가장 급격한 진화는 유아기와 유아기에 발생하지만6, 비피도박테리움 풍부도의 감소와 클로스트리디움, 락토바실러스, 장내세균 및 엔테로코커스 종7의 증가를 포함하여 연령에 따라 상당한 변화도 발생합니다. 생활 습관은 dysbiosis(유익한 박테리아의 손실, 기회 박테리아의 과증식)로 이어지는 장내 미생물 구성을 더욱 변화시켜 염증성 장 질환, 당뇨병 및 비만5과 같은 다양한 병리를 유발할 수 있지만 알츠하이머 및 파킨슨병 8,9,10,11에도 기여할 수 있습니다.
이러한 실현은 장 생리학(현재 그 안에 있는 미생물 포함)과 신경계 간의 상호 작용이 동물의 대사 및 생리 기능의 주요 조절자로 간주되는 장-뇌 축(GBA)의 개념을 개선하는 데 결정적으로 기여했습니다12. 그러나 장-뇌 신호 전달에서 미생물총의 정확한 역할과 관련 작용 메커니즘은 완전히 이해되지 않았습니다13. 장내 미생물총이 건강한 노화의 핵심 결정 요인이기 때문에 박테리아가 노화 과정을 조절하는 방법은 강렬한 연구와 논쟁의 대상이 되었습니다 6,14,15.
회충 Caenorhabditis elegans가 박테로이데테스, 피르미쿠테스 및 방선균 16,17,18,19,20에 의해 다른 종에서와 마찬가지로 지배하는 보나피드 장내 미생물총을 숙주한다는 입증과 함께, 숙주-장 공생 상호 작용을 연구하기 위한 실험 플랫폼으로서의 급속한 부상21,22,23,24 ,25,26은 우리의 수사 무기고26,27,28,29를 크게 확장했습니다. 특히, C. elegans가 유전자-식단, 유전자-약물, 유전자-병원체 등의 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있는 고처리량 실험 접근 방식을 적용하여 박테리아 분리 및 칵테일이 C. elegans의 건강과 노화에 미치는 영향을 빠르게 탐색할 수 있습니다.
본 프로토콜은 프로바이오틱스를 식별하는 데 사용할 수 있는 건강의 대용물로서 C. elegans 스트레스 저항성에 미치는 영향을 위해 멀티웰 플레이트에 설정된 박테리아 분리 또는 혼합물의 어레이를 한 번에 스크리닝하는 실험 파이프라인을 설명합니다. 형광 플레이트 판독기를 사용하여 자동화된 응력 저항 분석을 위해 웜을 처리하기 전에 큰 벌레 개체군을 늘리고 96웰 및 384웰 플레이트 형식으로 박테리아 어레이를 처리하는 방법을 자세히 설명합니다(그림 1). 이 접근법은 사멸 형광 31 현상을 이용하는 무표지 자동 생존 분석법(LFASS)30을 기반으로 하며, 이를 통해 죽어가는 벌레는 사망 시간을 정확히 찾아내는 데 사용할 수 있는 청색 형광을 생성합니다. 청색 형광은 C. elegans 장 과립(리소좀 관련 소기관의 일종)에 저장된 안트라닐산의 글루코실 에스테르에 의해 방출되며, 사망 시 벌레 장에서 괴사 캐스케이드가 촉발될 때 파열됩니다.31.
그림 1: 스트레스에 대한 C. elegans 저항성에 영향을 미치는 박테리아 분리주의 고처리량 스크리닝을 위한 실험 워크플로 . (A) 웜 및 박테리아 유지 관리 및 분석 설정 일정. (B) 96웰 박테리아 플레이트 어레이 설정 및 취급. (C) 384웰 웜 플레이트 설정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Protocol
본 연구를 위해 병행하여 사용된 두 개의 C. elegans 균주는 브리스톨 N2 야생형과 HT1890: daf-16(mgDf50)으로 유사한 속도로 성장합니다. 그러나, 프로토콜은 유사한 성장률을 갖는 두 균주의 임의의 조합으로 복제될 수 있다. 다른 균주(예: 야생형 및 느리게 성장하는 daf-2 돌연변이체)를 병렬로 테스트할 때 다른 성장 속도를 고려해야 하므로 프로토콜을 조정해야 합니다. 다음 프로토콜에서 웜 및 박테리아의 시간 척도와 양은 사배신체의 두 LFASS 분석에서 두 개의 웜 균주에 대한 48개의 박테리아 분리주의 병렬 테스트에 최적화되어 있습니다. 더 많은 조건을 동시에 테스트하려면 조정이 필요합니다. 대장균 OP50 박테리아 균주는 미네소타 대학의 Caenorhabditis Genetics Center (CGC)로부터 입수하였다. 48 개의 박테리아 분리 물은 Schulenburg 실험실에서 얻어졌으며 LB 한천에서 유지되었습니다.
1. C. OP50에서 배양하는 엘레 간스 (1-8 일)
참고: 현재의 접근법은 모든 단계에서 고체 배지에서 C. elegans 자웅동체를 성장시키는 것을 목표로 하고 불필요한 식이 변화(즉, NA22와 같은 대체 빠르게 성장하는 대장균 균주 또는 계란 플레이트와 같은 더 풍부한 성장 배지 사용)를 피하여 여전히 널리 사용되는 표준 성장 조건(32,33)에 가능한 한 가깝게 유지합니다. 웜 성장 온도(여기서는 15°C로 설정)는 사용된 C. 엘레간스 균주(들)에 따라 달라지며, 조정이 필요할 수 있다(예를 들어, 온도에 민감한 표현형 또는 바이오마커의 발현을 피하거나 촉발하기 위해). 벌레 축산에 관한 정보는 참고자료33을 참조하시기 바랍니다.
- 벌레 균주 당 직경 6cm의 NGM 플레이트 10mL (선충 성장 배지 한천 10mL, NGM, 보충 파일 1) 32,33을 준비하고 실온에서 1 일 동안 건조시킵니다.
- 50mL 원뿔형 튜브에 25mL의 OP50 배지(보충 파일 1)에 갓 재배한 Lysogeny Broth 한천(LB 한천, 보충 파일 1) 플레이트에서 단일 박테리아 클론을 파종하여 대장균 OP50 박테리아의 포화 액체 배양물을 준비합니다. 배양물을 진탕기 배양기에서 37°C에서 밤새 성장시킨다.
- 균주당 8개의 6cm NGM 플레이트를 플레이트당 E. coli OP50의 포화 액체 배양액 100μL로 접종하고 사용하기 전에 플레이트를 2일 동안 20°C에 유지합니다.
- 메스를 사용하여 최근에 굶주린 NGM 플레이트에서 벌레와 함께 0.5cm의 정사각형 한천 덩어리를 잘라내어 8개의 접종된 6cm NGM 플레이트 각각에 옮기고 이 플레이트를 20°C에서 3일 동안(또는 벌레가 음식을 다 먹을 때까지) 배양합니다.
- 웜 균주당 5개의 15cm NGM 플레이트(플레이트당 NGM 배지 30mL)를 준비하고 3mL의 OP50을 접종합니다. 플레이트를 37°C에서 밤새 배양하기 전에 건조시키십시오. 이후 단계에서 사용할 때까지 플레이트를 20°C에 보관하십시오.
- P-1000 피펫을 사용하여 6cm NGM 플레이트에 최대 3mL의 멸균 M9 버퍼(보충 파일 1.1)를 추가하여 웜을 재현탁하고 단일 15mL 원뿔형 튜브에 균주당 8개의 플레이트 모두에서 웜 용액을 수집합니다.
- 142 x g 에서 4 °C에서 2분 동안 원심분리합니다. P-5000 피펫 또는 멸균 파스퇴르 피펫 또는 팁이 장착된 워터 펌프를 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 멸균 M9 버퍼 10mL를 추가하여 웜 펠릿을 세척합니다. 2 번 반복하십시오.
- 상청액을 제거하고(가능한 한 많이) 피펫을 사용하여 웜을 15cm OP50 접종된 NGM 플레이트(단계 1.5)에 옮깁니다. 농축된 OP50 배양액 0.5mL를 추가합니다.
- 농축된 OP50을 만들기 위해, 4개의 1L LB 병에 각각 2mL의 OP50 스타터 배양물(단계 1.2에서 제조)을 접종하고, 37°C 및 160 x g에서 6시간 동안 진탕 인큐베이터에서 성장시킨다. 박테리아를 3057 x g 및 20°C에서 15분 동안 펠릿화합니다. 상청액을 버리고 박테리아 펠릿을 6mL의 OP50 배지로 재현탁하고 멸균 50mL 원추형 튜브에 수집합니다.
알림: 박테리아는 4 ° C에서 최대 1 주일 동안 보관할 수 있습니다.
- 각 웜 균주를 직경 15cm NGM 플레이트에서 15°C에서 3-4일 동안 성장시키려면 매일 0.5mL의 농축 OP50을 웜에 다시 공급합니다.
- 벌레가 음식을 거의 다 먹었 으면 M9 완충액에서 수집 및 세척하고 (단계 1.6.1.), 각 벌레 균주 배양을 두 개의 15cm NGM 플레이트 (단계 1.5.)로 옮기고 인구의 ~ 95 %가 중력 성인이 될 때까지 20 ° C에서 벌레를 번식시킵니다 (야생형 Bristol N2의 경우 약 24 시간이 소요됩니다).
참고: Gravid 성인은 벌레 내에 알이 존재하는 것이 특징이며, 이상적인 판에는 너무 많은 유충 없이 접시에 부화되지 않은 알이 많이 놓여 있어야 합니다33.
- 벌레가 음식을 거의 다 먹었 으면 M9 완충액에서 수집 및 세척하고 (단계 1.6.1.), 각 벌레 균주 배양을 두 개의 15cm NGM 플레이트 (단계 1.5.)로 옮기고 인구의 ~ 95 %가 중력 성인이 될 때까지 20 ° C에서 벌레를 번식시킵니다 (야생형 Bristol N2의 경우 약 24 시간이 소요됩니다).
2. 장내 미생물 분리 수집 유지 (9 일차)
- 개별 6cm LB 한천 플레이트에 48 개의 박테리아 분리 물을 줄무늬로 만들고 20 ° C에서 48 시간 동안 성장시킵니다.
알림: 박테리아는 더 빨리 필요한 경우 25 ° C에서 24-36 시간 동안 성장할 수 있지만 20 ° C 성장이 길면 잠재적 인 오염 물질을 발견 할 수 있습니다. - 많은 수의 C. 엘레 간을 동기화하십시오.
- 표준 알 준비 방법33 에 따라 성충을 표백하고 알을 파종되지 않은 15cm NGM 플레이트 2개에 15°C에서 24시간 동안 옮겨 모든 L1 유충이 후속 단계에서 동시에 부화하고 성장할 수 있도록 합니다.
주의 : 표백제를 취급 할 때주의하십시오.
- 표준 알 준비 방법33 에 따라 성충을 표백하고 알을 파종되지 않은 15cm NGM 플레이트 2개에 15°C에서 24시간 동안 옮겨 모든 L1 유충이 후속 단계에서 동시에 부화하고 성장할 수 있도록 합니다.
3. 성장하는 큰 C. 엘레 간스 문화 (10 일차)
- 부화되면 깨끗한 원추형 15mL 튜브에서 3-4mL의 M9에 L1 유충(2.2.1단계에서)을 수집합니다. 4개의 10μL 웜 용액을 슬라이드 또는 플레이트에 피펫팅하고 실체 현미경으로 16x 배율로 각 방울의 웜 수를 계산합니다. 웜 용액의 모든 방울에서 유충의 수를 평균하여 용액의 웜 농도를 결정하십시오. 이 값에 남은 부피를 곱하고 각 균주에 대한 총 웜 수를 추정합니다.
참고 : 균주 당 46,000-50,000 L1 유충은 나중에 384 웰 플레이트 또는 두 개의 하프 플레이트를 채우기 위해 필요합니다.- 각 균주에 대해 모든 L1 유충을 이전에 3mL의 OP50을 접종한 2개의 15cm NGM 플레이트(플레이트당 23,000-25,000L1)로 옮기고(단계 1.5.) 0.5mL의 농축된 OP50으로 다시 시딩했습니다.
- 15 ° C에서 배양하고 벌레가 L4 단계에 도달 할 때까지 필요에 따라 매일 0.5mL의 농축 OP50을 보충합니다.
알림: L4 단계는 약간 더 어두운 장과 외음부가 결국32,33을 형성하는 반 디스크 또는 초승달 모양의 흰색 패치가 특징입니다. - 아래 단계에 따라 96웰 NGM-아가로스 플레이트를 준비합니다.
- 각 웰에 125μL의 NGM-아가로스(분석당 플레이트 4개)를 채워 8개의 96웰 NGM-아가로스 플레이트를 준비합니다.
알림: 후속 단계에서 일부가 오염된 경우 일부 추가 플레이트를 플레이팅하는 것이 좋습니다. 분석을 병렬로 실행하려면 두 개의 플레이트 리더가 필요하지만 최소 6시간 동안 실행할 수 있으므로 열 스트레스 분석부터 연속적으로 실행할 수도 있습니다. 이 플레이트의 경우 <4% 애쉬 한천이 아가로스로 대체되어( 재료 표 참조) NGM 플러그를 가로질러 더 느리고 균일하게 건조되고 더 나은 회복을 위해 웜 굴착을 줄입니다. - 우물이 고르게 채워지고 기포가 없는지 확인하십시오. 70°C로 설정된 열 블록(멀티웰 플레이트의 플라스틱을 통한 느린 열 전달로 NGM-아가로스는 약 55-60°C까지만 가열될 수 있음)을 사용하여 공정 중에 혼합물이 응고되는 것을 방지합니다. 우물 내의 기포를 제거하려면 멸균 화염 가열 바늘을 사용하십시오.
- 96웰 플레이트를 뒤집기 전에 멸균 환경에서 실온으로 설정하고(응결을 방지하기 위해 뚜껑을 내림) 필요할 때까지 클린 박스에 4°C에서 보관하십시오.
- 각 웰에 125μL의 NGM-아가로스(분석당 플레이트 4개)를 채워 8개의 96웰 NGM-아가로스 플레이트를 준비합니다.
- 11일차에 3.2단계의 웜을 확인하여 오염이 나타나지 않고 웜이 여전히 가득 차 있는지 확인합니다.
- 12일차에 3.1단계의 웜을 확인하여 오염이 나타나지 않고 웜이 여전히 가득 차 있는지 확인합니다. 또한 웜의 발달 단계를 확인하십시오.
알림: 사용된 L4 또는 L4 + 24h 웜과 같은 웜의 성별/변형 및 발달 단계는 웜이 받는 처리에 따라 다릅니다. 여기에서 야생형 자웅동체는 L4의 박테리아 분리물에 36시간 동안 노출되었습니다.
4. 벌레를 다시 먹이기 위한 장내 미생물 분리 수집 준비
- 2.1단계에서 LB 한천 플레이트의 박테리아 성장을 모니터링합니다. 20°C에서 계속 배양한다.
알림: 이상적이지는 않지만 일부 클론이 자라지 않거나 오염이 드러나지 않는 경우 박테리아를 깨끗한 재고에서 6cm LB 플레이트로 다시 줄무늬로 만들고 실험 준비를 위해 25-28 ° C에서 24 시간 동안 성장할 수 있습니다. - 테스트 중인 박테리아 수집에 대한 96웰 어레이 레이아웃을 정의하여 후속 단계에서 체계적인 플레이트 파종 및 데이터 분석을 용이하게 합니다(보충 표 1).
- 각 6cm 박테리아 플레이트에서 박테리아 덩어리를 수집하고(단계 4.1.), 1mL의 M9 완충액을 포함하는 표지된 1.5mL 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다. 일회용 2mm 직경의 멸균 플라스틱 루프 또는 5mm 직경의 금속 루프를 사용하여 이 작업을 수행합니다. 박테리아 균주 사이의 금속 고리를 100% 에탄올에 담그고 불태우고 5초 동안 냉각하여 소독합니다.
- 박테리아 펠릿이 완전히 재현탁될 때까지 미세 원심분리기 튜브를 소용돌이합니다(박테리아 균주에 따라 ~1-10초가 소요될 수 있음).
- 실온에서 5분 동안 9,300 x g 로 스핀다운하고, 700μL의 상청액을 제거하고, 와동하여 박테리아 펠릿을 재현탁시킵니다.
- 200μL의 각 박테리아 현탁액을 단계 4.2에 명시된 레이아웃에 따라 빈 멸균 96웰 플레이트의 단일 웰로 옮깁니다.
- 이 플레이트에서 8개의 96웰 NGM-아가로스 플레이트(단계 3.3에서 준비됨)에 멀티채널 피펫을 사용하여 10μL의 박테리아 용액을 접종하고 뚜껑을 덮고 25°C에서 24시간 동안 배양합니다. 플레이트 건조 및 박테리아 호기성 성장을 허용하고 과도한 응결을 방지하기 위해 플레이트를 밀봉하지 마십시오.
- 단계 4.6에서 제조된 96-웰 현탁액을 밀봉한다. 깨끗한 접착 밀봉 필름( 재료 표 참조)으로 15°C에서 최대 5일 동안 보관하십시오. 이것은 필요에 따라 웜 재 공급에 사용됩니다.
5. LFASS 열 충격 및 산화 분석 설정 (13 일 - 14 일)
- 3.5단계의 플레이트를 보고 웜의 발달 단계를 평가합니다. 웜의 >90%가 L434에 도달하면 15mL 원뿔형 튜브에 최대 10mL의 멸균 M9 용액에 웜을 수집합니다.
- 4 ° C에서 2 분 동안 142 x g 로 회전하고 상청액을 제거한 다음 각 세척 사이에 10mL의 신선한 멸균 M9를 추가하여 벌레를 광범위하게 (최소 50 배) 세척합니다. 웜 펠릿을 M9 10mL에 재현탁합니다.
- 50μL의 웜 용액을 950μL의 M9가 들어있는 낮은 표면 결합 튜브( 재료 표 참조)로 옮깁니다. 웜 침전을 방지하기 위해 튜브 내용물을 부드럽게 혼합한 후 습식 저바인딩 피펫 팁을 사용하여 3-4개의 개별 10μL 방울을 유리 슬라이드 또는 NGM 플레이트에 옮기고 실체 현미경( 재료 표 참조)으로 16배 배율로 웜 수를 계산합니다. 3-4 방울의 카운트를 평균화하고 웜 용액에서 마이크로 리터 당 웜 수를 결정합니다 (3.1 단계 참조).
- 10mL 튜브의 웜 농도를 조정하여 8μL에서 ~120개의 웜에 도달합니다. 용액이 단계 5.2에서 준비되면. 충분히 농축되지 않은 경우 웜을 스핀다운하고 그에 따라 M9를 제거하여 8μL당 120개의 웜에 도달합니다.
- 8μL의 웜 용액(~120 웜)을 다중 채널 피펫 또는 반복 피펫을 사용하여 단계 4.7의 96웰 NGM-아가로스 플레이트 8개의 각 웰로 옮깁니다. 낮은 보존 팁을 사용하여 웜 손실을 제한해야 합니다. 큰 성인 벌레가 성인 벌레에 대한 기계적 스트레스를 제한 할 수 있도록 팁 끝을 잘라야 할 수도 있습니다.
알림: 분석이 안정적으로 작동하려면 최소 30개의 살아있는 건강한 벌레가 필요하지만 우물당 약 100개의 벌레에서 가장 잘 작동합니다. - 벌레와 박테리아 시드 96웰 NGM-아가로스 플레이트를 25°C에서 36시간 동안 배양합니다.
- 12-24 시간 사이에 플레이트를 확인하여 웜이 전체적으로 가득 차 있는지 확인하십시오. 재공급이 필요한 경우 단계 4.8에서 15°C에 보관된 96웰 박테리아 어레이 플레이트 내의 박테리아를 재현탁하고 36시간 잠복기가 끝나기 전에 벌레가 기아 위험이 있는 96웰 NGM-아가로스 플레이트에 최대 10μL의 해당 박테리아 용액을 추가합니다(굶주린 벌레는 크게 다른 결과를 생성합니다. 그래서 이것은 매우 중요합니다).
참고: 다음 단계는 15일째에 수행해야 합니다. 분석을 시작하기 전에 판독 높이를 최적화해야 할 수도 있습니다. 최적의 판독 값은 우물 바닥에서 20-50 μm 위에 달성됩니다. 이것은 플레이트 리더의 모델에 따라 다릅니다. 일부는 Z-스캔의 가능성을 제공하는 반면 다른 일부는 수동 높이 입력을 허용합니다. 가장 높은 청색 형광(365nm/430nm) 신호가 감지되는 수준에서 최적의 높이를 설정합니다. 일부 플레이트 리더는 부착성 세포 분석에 최적화된 고정 높이에서 작동할 수 있으며 LFASS 분석에는 적합하지 않을 수 있습니다. - 36시간 후, 30μL의 M9를 96웰 플레이트의 각 웰에 분주합니다.
알림: 열 응력 분석의 경우 플레이트 리더가 분석을 수행하는 데 필요한 온도에 도달해야 하며 미리 켜야 할 수 있습니다. 현재 프로토콜은 킬링 속도를 최대화하기 위해 42 ° C를 사용하지만이 접근법은 30 ° C 이상의 다른 온도에도 적용됩니다. - 낮은 머무름 팁을 사용하여 설정된 레이아웃에 따라 웜(약 20μL)을 384웰 플레이트로 옮깁니다(큰 웜이 성충의 기계적 스트레스를 줄일 수 있도록 팁 끝을 잘라내는 것을 고려하십시오).
참고: 본 연구에서는 여기에 설명된 두 가지 분석(열 응력 및 산화 스트레스)에 대해 두 가지 다른 플레이트 리더 설정이 사용되므로 이 두 분석용 샘플을 동일한 384웰 플레이트에 도말해서는 안 됩니다. - 플레이트 리더가 올바르게 설정되었는지 확인하십시오(표 1).
- 384웰 플레이트에 더 많은 M9를 채워 웰당 60μL의 최종 부피를 목표로 합니다. 열 응력 분석의 경우 40μL의 M9를 추가하고 t-BHP 유도 산화 스트레스의 경우 34μl의 t-BHP에 6μl의 M9를 추가합니다(재료 표 참조).
- t-BHP를 추가한 후 2분 이내에 분석을 시작합니다(이상적으로는 모든 웜이 t-BHP에 동시에 노출되어야 하며 분석 시간 분해능은 2분). 가능하지 않은 경우 타이머를 사용하여 분석 시작 전에 t-BHP를 피펫팅하는 데 소요된 시간을 추정하여 나중에 사망 시간의 중앙값을 조정할 수 있습니다.
- 투명한 뚜껑으로 판을 닫으십시오. 384웰 플레이트의 가장자리를 마스킹 테이프(플레이트와 뚜껑 위에 테이핑)로 밀봉하여 테이프가 뚜껑 위나 플레이트 아래로 들어가지 않도록 합니다. 메스를 사용하여 간격을두고 뚜껑과 플레이트 사이의 테이프를 잘라 분석 중 증발을 최소화하면서 공기 교환을 허용합니다.
- 플레이트를 플레이트 리더에 삽입하고( 재료 표 참조) 실행을 시작합니다. 365nm에서 여기하는 것을 목표로 하고 435nm에서 6-12시간 동안 2분마다 방출을 감지합니다(표 1).
참고: 일반적으로 6°C 열 스트레스 분석에는 42시간, 8% t-BHP 산화 스트레스 분석에는 7시간이면 충분합니다.
6. 플레이트 리더 데이터 처리
- 플레이트 판독기의 원시 형광 데이터를 쉼표 또는 탭으로 구분된 .txt, .csv 또는 .xls /.xlsx 형식으로 저장한 다음 xls /.xlsx 형식으로 변환합니다. 데이터 형식에 따라 LFASS 분석에 필요한 Excel 시트 레이아웃과 일치하도록 재구성합니다. 참고자료30에 제공된 자세한 지침을 따르십시오.
참고: 데이터를 수동으로 분석할 수 있는 반면, 각 시계열을 정규화하고 사멸 형광이 절반 최대값에 도달하는 시간을 찾고, LFASS 루틴(30)을 실행하는 Matlab에서 자동화된 분석을 수행할 수 있습니다. - https://github.com/ABA80/LFASS 에서 Matlab(버전 2014a 이상) 및 LFASS 소프트웨어 패키지를 다운로드하여 설치합니다. 그 안에 제공된 지침과 주석을 따르십시오.
참고: 그림 1C 는 접근 방식에 대한 간략한 설명을 제공합니다. 매트랩은 LFASS 루틴을 실행하는 데 필요합니다. 또는 Matlab 코드를 독점적 인 피팅 기능을 제외하고 Oracle로 변환 할 수 있습니다. 새로운 스무딩 및 시그모이드 함수를 다시 작성하여 완전한 오픈 소스 플랫폼에서 사용할 수 있습니다. - LFASS 분석이 데이터 폴더의 모든 파일을 처리하고 결과 폴더의 파일을 덮어쓰므로 LFASS 분석 간에 데이터와 결과를 새 위치로 이동합니다.
7. 데이터 검사
- Excel 파일을 열고 384웰 플레이트의 웰 위치에 따라 행에 레이블을 지정합니다. 보충 파일 2 는 열 충격 분석을 위해 생성된 원시 형광 데이터의 엑셀 파일의 예를 나타낸다. 384웰 플레이트의 웰 위치를 사용하여 웜 및 박테리아 균주에 레이블을 지정합니다.
- Matlab 분석에 앞서 Excel에서 데이터를 육안으로 검사하여 시간 경과에 따른 형광 강도를 플로팅하여 대표적인 웰을 만듭니다. 사용되는 플레이트 리더에 따라 데이터에 노이즈가 있을 수 있지만 명확한 피크가 표시되어야 합니다. 특히:
- 피크가 노이즈와 크게 다르지 않은 형광 값을 결정합니다 (LFASS에서 이러한 임계 값을 설정하면 빈 웰을 제외하여 분석 속도가 빨라집니다).
- 형광 변동이 상승하기 전에 약화되는 가장 빠른 시점에 유의하십시오(동물은 최대 30분 동안 격렬하게 부딪혀 파란색 형광 판독값이 빠르게 변동할 수 있음).
참고: 피크 피팅은 곡선 피팅 창에서 이러한 초기 시점을 제외하여 개선할 수 있습니다. - 최소 및 최대 형광 값이 떨어질 것으로 예상되는 시점(이러한 범위를 식별하기 위해 여러 웰 살펴보기)은 곡선 피팅에 사용되므로 기록해 두십시오.
- 형광 피크의 진폭이 웰간에 크게 다른지 확인하고 다음 공식을 사용하여 추가 분석하기 전에 데이터를 정규화하십시오.
정규화된 형광 웰 n(t) = (형광 웰n[t] - 최소 형광 웰 [Dt]) / (최대 형광 웰 [Dt] - 최소 형광 웰 [Dt])
여기서 "n"은 현재 웰 수이고, "t"는 시점이며, "Dt"는 분석에 대한 일련의 시점입니다.
8. LFASS 데이터 처리
참고: 자세한 내용은 https://github.com/ABA80/LFASS 및 참고자료30의 보충 자료에 나와 있습니다.
- LFASS 폴더 내에 두 개의 하위 폴더를 생성하는데, 하나는 분석할 데이터용이고 다른 하나는 결과용(예: "내 데이터" 및 "결과")입니다.
- 데이터 검사 후 분석 엑셀 데이터 파일을 LFASS 하위 폴더 "내 데이터"에 복사합니다.
- MATLAB을 시작하고 LFASS 폴더로 이동한 다음 명령 창에서 fitfolder 를 입력하고 실행합니다(보조 파일 3). 그런 다음 화면의 지시를 따릅니다.
- "fitfolder"를 입력하면 시스템은 Excel 파일이있는 폴더의 이름 (예 : '내 데이터')을 묻습니다. 데이터 폴더의 이름을 입력합니다(이 예에서는 "내 데이터").
- 화면의 지시에 따라 요청된 다양한 매개변수를 제공합니다.
- 현재 프로토콜에서 연속 측정 사이의 시간 간격에 "2"를 입력합니다(이를 지정하면 결과가 시간 포인트 단위 대신 분 단위로 표현될 수 있음).
참고: 시간 간격은 형광 측정을 다소 자주(시간 분해능을 낮추거나 늘리기 위해) 수행하도록 수정할 수 있으며 플레이트 판독기 기능에 따라 수정할 수도 있습니다(즉, 충분히 빠른 측정을 수행할 수 없는 플레이트 판독기의 경우 시간 간격을 늘려야 할 수 있음). 항상 실험 시간 간격이 LFASS 루틴과 일치하는지 확인하십시오. - 시그모이드 피팅을 제한하기 위해 "0.95"(피팅을 개선하기 위해 필요에 따라 변경할 수 있음)를 입력하여 공차 상한 임계값을 할당하고 "0.05"(피팅을 개선하기 위해 필요에 따라 변경할 수 있음)를 입력하여 공차 하한 임계값을 지정합니다.
알림: 다른 시간 매개 변수는 데이터 검사의 사용자 메모를 기반으로합니다 (7.2 단계).
- 현재 프로토콜에서 연속 측정 사이의 시간 간격에 "2"를 입력합니다(이를 지정하면 결과가 시간 포인트 단위 대신 분 단위로 표현될 수 있음).
- 프롬프트가 표시되면 YES에 "y"를 입력하거나 NO에 "n"을 입력하여 적합 및 평활화된 곡선을 표시할지 여부를 선택합니다. 수렴 피팅을 육안으로 검사하려면 전자를 선택합니다.
참고: 후자는 모든 평활 데이터를 시각화하는 데 유용하지만 너무 많은 팝업 그래프를 생성하기 때문에 일반적으로 선택되지 않습니다. 그런 다음 Matlab은 LFASS 루틴을 실행하며 여러 Excel 파일을 한 번에 처리하는 경우 1-10분이 소요될 수 있습니다. 8.6단계의 선택에 따라 곡선이 있는 팝업 창이 나타납니다. 보충 파일 4A 는 적합된 곡선의 예를 나타낸다. - (1) 노이즈로 식별된 곡선을 분석할지 또는 (2) [y/n] 옵션을 사용하여 적합하지 않은 곡선을 다시 추가할지 선택합니다. 승인하려면 y 를 입력하고 거부하려면 n 을 입력합니다.
참고: 특히 적합하지 않거나 적합하지 않은 곡선이 많은 경우 재적합을 승인하는 것이 좋습니다. 이를 통해 사용자는 화면에 나타나는 각 곡선에 대한 맞춤형 곡선 피팅 매개변수를 제공하고 시그모이드 피팅에 대한 이전 및 이후 경계만 요청할 수 있습니다. 필요한 만큼 시도할 수 있습니다. - 데이터가 분석되면 Matlab을 닫고 LFASS 폴더를 엽니다.
- LFASS 하위 폴더 내 결과를 클릭하면 결과 파일이 결과 폴더에 .txt로 자동 저장됩니다.
참고: Matlab은 "배치 피팅.txt", "배치 및 노이즈 피팅.txt" 및 "재장착.txt"의 세 가지 .txt 파일을 생성합니다. 이전 두 개는 다시 장착하는 동안 컴퓨터 충돌 또는 사용자 오류가 발생할 경우 예방 조치로 저장됩니다. 가장 정확한 전체 분석이 포함된 파일은 "재적합.txt입니다. - Microsoft Excel에서 Refitted.txt 파일을 열고 추가 처리를 위해 .xls로 저장합니다. 보충 파일(4b )은 이러한 결과 파일의 예를 나타낸다.
참고 : 각 웰 (행으로 구성)에 대해 웜 개체군의 사망 시간 중앙값을 추정하는 세 가지 값이 열에 제공됩니다. "원시": 실험 데이터 피크의 절반 최대치에서 교차하는 시간을보고합니다. "배치 피팅": 배치 피팅 곡선의 절반 최대값에서 교차하는 시간을 보고합니다. "재적합": 재적합된 곡선의 최대 절반에서 교차하는 시간을 보고합니다. - 파일을 .xls 형식으로 안전한 위치에 복사본으로 저장합니다. 이렇게 하지 않으면 LFASS 루틴의 다음 실행 중에 파일을 겹쳐쓸 위험이 있습니다.
참고: 그런 다음 그래프 또는 통계 분석을 위해 결과를 추가로 처리할 수 있습니다.
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Representative Results
LFASS 분석은 스트레스 저항성 및 노화에 기여하는 수많은 유전 및 미생물 매개 변수를 스크리닝하는 것과 같이 한 번에 여러 테스트 조건에 대한 강력하고 높은 처리량의 신속한 스크리닝을 제공합니다. 실험이 여러 테스트 조건의 광범위한 데이터 세트를 얻는 데 2-3 주 밖에 걸리지 않습니다. L4+36시간 성체 야생형 웜 개체군은 36시간 동안 48개의 장내 미생물 분리물에서 36시간 배양한 후 42°C 열 스트레스 및 7% t-BHP 유도 산화 스트레스에 노출되었습니다. 분석은 4회 수행되었으며, 각 조건은 각 분석에서 4회 복제되었습니다. 테스트된 모든 조건에서 사망 시간의 중앙값은 열 응력 분석의 경우 40-130분, t-BHP 유도 산화 스트레스 분석의 경우 90-240분 사이였습니다. 초기 성인기 열 스트레스 분석은 일반적으로 산화 스트레스 분석보다 더 일관된 결과와 더 적은 일간 및 일중 변동성을 나타내며 후속 수명의 더 나은 예측 인자입니다30. 다른 미생물 식단을 먹인 벌레의 사망 시간 중앙값의 차이는 장 공생이 숙주 스트레스 저항에 어떻게 영향을 미치는지를 결정적으로 보여줍니다. 그림 2는 관심 있는 2개의 장내 미생물총과 표준 실험실 균주 E. coli OP50에 대한 Bristol N2 야생형 벌레에 대한 16개의 생물학적 복제물의 전형적인 결과를 보여줍니다.
그림 2: 두 개의 박테리아 분리 균주와 대조 균주에서 성장한 웜의 쌍을 이루는 열/산화 스트레스 저항 분석의 대표적인 결과. (A) 열 스트레스 분석. 야생형 벌레는 MYb11 (슈도모나스 루리다) 또는 MYb115 (슈도모나스프) 박테리아 분리 물 또는 OP50 대조 박테리아에서 36 시간 동안 먹이를 주었다. MYb11은 사망 시간의 중앙값을 상당히 일찍 초래했습니다(p < 0.001). (B) 산화 스트레스 분석. 야생형 벌레는 MYb11 또는 MYb115 박테리아 분리 물 또는 OP50 대조 박테리아에서 36 시간 동안 먹였습니다. MYb11은 사망 시간의 중앙값을 상당히 일찍 초래했습니다(p < 0.05). 120-150 웜을 4 세트의 샘플로 분석했으며 각 실험은 4 분에서 수행되었습니다. 품질이 좋지 않거나 데이터가 제대로 맞지 않는 유정은 누락된 값으로 이어졌습니다. 상자 그림 표현은 단일 웰 값, 최소값, 중위수 및 최대값을 나타냅니다. *p < 0.05 및 ***p < 0.001에서 일원 분산 분석을 사용하여 통계적 유의성을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| A | |||
| 매개 변수 | 설정 | 주석 | |
| 온도 | 25 °C | ||
| 형광 여기 | 365 나노미터 | 10nm 대역폭 | |
| 형광 방출 | 430 나노미터 | 20nm 대역폭 | |
| 플래시 횟수 | 8회 깜박임, 1ms 안정화 시간 | ||
| 이득 | 100에서 130 | 샘플에 따라 조정됩니다. 분석 시작 시 2-5k 판독 값 목표 | |
| 지연 시간 | 1 μs | ||
| 통합 시간 | 30 μs | ||
| 읽기 시간 간격 | 2분마다 | 스트레스 심각도에 따라 지속 시간 및 시간 간격을 조정해야 할 수 있습니다(7% t-BHP에서 8시간이면 충분함). | |
| 기간 | 8-12시간 | ||
| 방향 읽기 | 아래에서 | ||
| B | |||
| 매개 변수 | 설정 | 주석 | |
| 온도 | 42 °C | ||
| 형광 여기 | 365 나노미터 | 10nm 대역폭 | |
| 형광 방출 | 430 나노미터 | 20nm 대역폭 | |
| 플래시 횟수 | 8회 깜박임, 1ms 안정화 시간 | ||
| 이득 | 100에서 130 | 샘플에 따라 조정됩니다. 분석 시작 시 2-5k 판독 값 목표 | |
| 지연 시간 | 1 μs | ||
| 통합 시간 | 30 μs | ||
| 읽기 시간 간격 | 2분마다 | 스트레스 심각도에 따라 지속 시간 및 시간 간격을 조정해야 할 수 있습니다(42°C에서 6시간이면 충분). | |
| 기간 | 6-12시간 | ||
| 방향 읽기 | 아래에서 | ||
표 1: 산화 및 열 스트레스 분석 설정. 이 연구에 사용된 형광판 판독기의 산화(A) 및 열(B) 응력 분석에 사용된 설정의 예.
보충 파일 1: 미디어, 버퍼 및 배양 레시피. 본 연구에 사용된 상이한 배지, 완충액 및 배양물의 조성. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 2: 플레이트 리더의 원시 형광 데이터를 내보내고 엑셀 .xls 형식으로 변환한 후. (A) 엑셀 파일은 열 충격 분석에 대한 원시 형광 데이터를 보여줍니다. 원시 형광 데이터는 2분 시간 간격으로 표시됩니다. (B) 384웰 플레이트에 "웰 위치"가 있는 컬럼이 강조 표시되어 웜 및 박테리아 균주를 표시하는 데 사용할 수 있습니다. (C) 파일에 웜 및 박테리아 균주가 표시되어 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 3: 매트랩을 사용한 LFASS 분석. (A) Matlab에서 LFASS 폴더를 열면 명령 창이 나타납니다. (B) 명령 창에 "fitfolder"를 입력하여 프로그램을 시작하고 분석 할 파일이있는 폴더 이름이 표시됩니다. (C) 프로그램이 분석을 위해 데이터 엑셀 파일을 찾으면 사용자는 요청된 다양한 매개변수를 제공하여 화면의 지시에 따라야 합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 4: Matlab을 사용하여 LFASS 데이터를 분석했습니다. (A) Matlab 분석을 통한 곡선 피팅의 예로, 여기서 검은색 선은 이전 시간 경계에 해당하는 시점을 나타내고 파란색 선은 곡선 피팅에 대한 이후 시간 경계에 해당하는 시점을 나타냅니다. 적합된 시그모이드 곡선은 빨간색으로 표시됩니다. (B) Matlab에서 생성 된 결과 파일이 .xls 형식으로 열립니다. 값이 강조 표시되고 숫자 형식으로 표시됩니다. 두 번째 열은 원시 데이터 곡선의 값이 최대값의 50%를 처음 초과하는 시간을 제공합니다. 세 번째 열은 배치 피팅 해석 중에 결정된 적합 곡선의 값이 최대값의 50%와 같은 시간을 제공합니다. 네 번째 열은 배치 분석 후 적합 곡선의 값이 최대값의 50%와 같고 필요한 경우 최종 재적합 후 시간을 제공합니다. 따라서 네 번째 열은 가장 신뢰할 수 있는 결과를 제공해야 합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 1: 실험 플레이트 레이아웃의 예. (A) 두 개의 개별 웜 균주에서 47 개의 서로 다른 웜 장내 미생물 박테리아 분리 물을 테스트하기위한 96 웰 플레이트 레이아웃, 살아있는 OP50이 대조군으로 사용됩니다. 이 플레이트의 사본은 실행되는 각 분석에 대해 4 개의 사본이 필요합니다. (B) (A)의 이전 96웰 플레이트 분석에 해당하는 열 또는 산화 스트레스 분석을 위한 384웰 레이아웃. 이 설정을 통해 각 조건에 대해 테트라플리케이트를 수행할 수 있으며 각 웜 균주에는 자체 OP50 제어가 있습니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
C. elegans는 작은 크기, 투명성, 빠른 개발, 짧은 수명, 저렴한 가격 및 취급 용이성으로 인해 한 번에 여러 실험 매개 변수를 신속하게 스크리닝하는 데 많은 이점을 제공합니다. 게놈, 신체 계획, 신경계, 장 및 미생물군집이 상당히 단순하지만 인간과 충분히 복잡하고 유사하기 때문에 생체 활성 효능 또는 독성을 테스트하는 동안 기계론적 통찰력을 얻을 수 있는 강력한 전임상 모델입니다. 질병 8,9,34,35에 대한 미생물 개입 개발에 대한 관심이 증가함에 따라, 이러한 전임상 모델을 활용하여 프로바이오틱스를 신속하게 조사하는 것은 미생물 34의 거의 미개발 및 거의 무제한의 치료 잠재력을 가진 매력적인 옵션입니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 환경 박테리아가 C. elegans 건강에 미치는 영향을 연구하는 데 적합하지만 다른 목적으로 쉽게 적용 할 수 있습니다.
다재
이 파이프라인을 구성하는 다양한 "모듈"은 실험 또는 실험실별 요구 사항에 맞게 조정할 수 있습니다. 예를 들어, 박테리아 분리는 박테리아 혼합물, 박테리아 돌연변이체 또는 RNAi 생성 박테리아를 대체할 수 있으며, 이 설정은 숙주-미생물 상호 작용에 관여하는 박테리아 유전자를 스크리닝하거나, 스트레스 저항과 관련된 숙주 유전자를 스크리닝하거나, 정의된 박테리아 군집의 일부로서 개별 미생물의 영향을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 단일 웜의 유전 적 배경에서 여러 박테리아 분리 물의 스크리닝을 설명합니다. 그러나 분석은 확장 가능하며 여러 숙주 및 박테리아 유전자형을 한 번에 연구 할 수 있습니다. 이것은 숙주 유전자-미생물 유전자-식이 상호 작용에 대한 통찰력을 얻기 위해 차별적 약물 치료 및/또는 식이 요법과 추가로 결합될 수 있습니다.
이 프로토콜은 아직 다른 선충 종에 대해 시도되지 않았지만 C. remanei 및 C. briggsae에도 직접 적용 할 수 있어야하며 C. elegans30과 형태 학적, 크기 및 사멸 형광 특징을 공유하는 L3 단계 기생 선충 종에도 적용될 수 있습니다. 마지막으로, 다른 스트레스 요인 (juglone, paraquat, arsenate, 기타 온도)을 동일한 파이프 라인 내에서 사용하여 보완 또는 확인 정보를 제공 할 수 있습니다.
잠재적인 과제
분석 전에 벌레와 박테리아를 성장시키기 위해 12일째까지 투자하는 시간은 중요하지만 접근 방식의 처리량으로 인해 수집된 데이터의 폭보다 훨씬 큽니다. 그럼에도 불구하고 이러한 분석을 계획할 때 주의는 분석이 시작될 때까지 재료가 차선책이기 때문에 준비 단계를 반복하여 시간 낭비를 방지하는 데 필수적입니다. 주요 초기 문제에는 샘플 오염(벌레 또는 박테리아), 동기화되지 않은 벌레 개체군, 재료 부족(벌레 개체군이 예상보다 빨리 음식을 먹고 계획보다 더 자주 동물을 다시 먹이거나 옮기는 것)이 포함됩니다.
오염 방지
프로토콜의 규모와 기간으로 인해 한 가지 주요 잠재적 문제는 곰팡이와 박테리아에 의한 오염이며, 그 발생은 확실히 결과를 혼란스럽게 할 것입니다. 따라서 이상적인 설정은 멸균 소모품을 사용하여 실험 벤치 위의 직접적인 공기 흐름이 없는 에어컨 및 공기 여과된 전용 실험실 공간입니다. 그러나 정기적 인 청소 절차 (작업 전후 벤치 오염 제거, 플레이트 박스 청소 및 멸균 소모품 사용)를 준수하고 밀폐 된 공간 (복도, 열린 문 근처의 공간 및 창문을 피하십시오)에서 화염으로 작업하는 것만으로도 일반적으로 깨끗한 환경을 유지하기에 충분합니다. 2.2.1 단계에서 계란을 준비하기 전에 가벼운 오염이 발생하면 표백 절차가이를 처리하고 프로토콜이 계획대로 진행될 수 있습니다. 반대로, 테스트 박테리아 플레이트로 옮기기 전에 증가하는 웜 개체군에 영향을 미치는 오염은 해당 시도의 끝을 의미하며 프로토콜은 1단계부터 다시 시작해야 합니다. 나중에 오염은 단일 박테리아 균주 또는 시험 조건에 영향을 미치는 경향이 있습니다. 범위에 따라 프로토콜을 계속 진행하거나 다시 시작할 가치가 있습니다.
웜 동기화
웜이 발달하고 성장할 때 열 및 산화 문제에 대한 내성이 변하기 때문에 LFASS 분석이 수행될 때까지 다른 발달 단계로 이어지는 테스트 조건을 쉽게 비교할 수 없습니다. 종말점 분석을 위해 잘 동기화된 모집단을 산출하는 것이 필수적입니다. L4 또는 L4 + 48 h 단계에서 대량으로 수집 된 웜에 대해 분석이 수행되므로 완벽하게 준비된 웜을 수집하기위한 웜 분류기 또는 기타 분류 절차가없는 경우 웜 개체군은 L1에서 매우 잘 동기화되어야합니다. 부화한 새끼는 테스트 코호트를 성장시키기 전에 모든 살아있는 알이 부화할 수 있을 만큼 충분히 오랫동안 먹이를 먹지 않도록 해야 합니다(20°C에서 >15시간, 15°C에서 >18시간). 유전자형은 발달시기의 확산에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 온도의 영향을받습니다. 15°C에서 웜 개체군을 늘리면 이를 더 잘 제어할 수 있으며 웜 개체군 확장 단계(특히 인슐린 신호 돌연변이로 작업할 때) 온도에 민감한 돌연변이의 영향을 제한할 수 있습니다. L4 또는 L4 + 48 h에서 미생물의 영향을 연구하는 주된 이유는 다른식이 요법의 발달 영향을 우회하고식이 요법에 미치는 영향보다는 살아있는 장내 세균의 영향을 연구하는 것입니다. 다른 박테리아 분리 물 또는 혼합물에서 초기 애벌레 단계에서 자란 벌레는 필연적으로 고르지 않은 발달 속도와 동기화 상실로 이어질 것입니다.
청색 형광에 의존한 결과
개별 웜 추적 또는 Sytox green36과 같은 추가 시약 없이 LFASS 분석에서 사망을 정확히 찾아낼 수 있지만 대신 기존 웜 바이오마커와 겹치지 않는 형광 범위의 내인성 신호를 활용하는 것은 분명한 이점입니다. 그러나 많은 테스트 조건에서 웜 사멸 형광을 일관되게 검출할 수 있도록 하는 것이 여전히 중요합니다. 분석은 형광 정량화가 아니라 역학에 의존하지만, 사망 시간 중앙값(TOD)을 정확하게 추정하려면 웜에서 충분한 형광을 방출해야 합니다. 분석이 단일 벌레 사망의 해결을 허용하지 않기 때문에, 죽어가는 개체에 의해 방출되는 청색 형광 파열은 단일 집단 형광 피크를 제공하기 위해 형광 축적을 위한 충분한 시간적 중첩을 가질 필요가 있습니다. 그래야만 TOD 중앙값을 정확하게 추론 할 수 있습니다. 이는 충분한 수준의 청색 형광을 생산할 수 없는 벌레가 이 프로토콜에서 사용될 수 없음을 의미하며, 특히 tdo-2 및 kynu-130,31과 같은 키누레닌 경로의 일부 돌연변이와 굶주린 동물을 포함합니다. 따라서 웜이 전체적으로 완전한 상태로 유지되도록하는 것이 중요합니다. 이것은 IPTG와 항생제가 보충된 NGM 배지에서 HT115 잔디가 OP50 잔디보다 얇은 경향이 있기 때문에 HT115 구동 RNAi 스크리닝을 수행할 때 특히 문제가 될 수 있습니다. 따라서 분석으로 이어지는 며칠 동안 벌레 먹이 공급을 모니터링하는 것이 중요합니다.
사멸 형광의 역학의 또 다른 결과는 동일한 집단의 웜이 더 동기적으로 죽고 더 정의된 집단 사멸 형광 피크를 생성하기 때문에 분석이 빠를수록 민감도가 더 좋다는 것입니다. 따라서, 분석이 길수록, 양호한 사멸 형광 피크를 생성하는 데 필요한 집단 크기가 커진다. eat-2 및 daf-230과 같이 신진 대사가 낮은 돌연변이는 형광을 덜 방출하고 우물 당 더 높은 수를 필요로합니다. 우물 당 10-15 개의 야생형 웜은 4 시간 이내에 모두 죽이는 42 ° C 열 응력 분석에 충분하지만 동일한 분석에서 daf-2 (e1370) 웜에는 그 양의 거의 두 배가 필요하며 24 시간 동안 웜을 죽이는 분석에는 > 100 개의 야생형 웜이 필요합니다.
환경 박테리아 분리의 맥락에서, 다른 미생물 대사는 또한 청색 형광 화합물을 생성하는 키누레닌 경로에 차별적으로 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 일부 박테리아 분리는 더 낮은 피크 사멸 형광으로 이어지는 반면 다른 박테리아는 OP50보다 높은 피크로 이어집니다. 결과적으로 모든 사태를 수용 할 수 있도록 우물 당 충분한 벌레를 목표로해야합니다.
마지막으로, 플레이트 판독 파라미터를 올바르게 최적화하는 것이 필수적입니다. 이 프로토콜은 형광 여기 및 방출 매개 변수의 설정과 판독이 이상적으로 수행되어야하는 깊이를 다룹니다. 단일 분석에서 여러 조건에 걸쳐 광범위한 사멸 형광 수율이 있을 수 있으므로 약한 신호가 검출되지만 검출기가 절대 포화되지 않도록 하는 것이 중요합니다. 따라서 높은 동적 범위를 자랑하는 검출기가 있는 기기는 더 나은 성능을 발휘합니다.
방법의 한계
여기에 설명된 방법은 견고하고 유연하며 다양한 조건에 쉽게 적용할 수 있습니다. 편의를 위해 주요 제한 사항 및 제한 사항이 작동하는 프로토콜을 따라 언급됩니다. 간단히 말해서, 사망의 내인성 마커로서 사망 형광에 대한 의존은 이러한 분석의 강점이자 한계입니다.
제한된 수의 특정식이 조건 (낮은 트립토판 식단 또는 기아) 및 트립토판 대사에 영향을 미치는 돌연변이 조건 (즉, tdo-2, kynu-1, 일부 daf-2 대립 유전자)에서 사멸 형광 (DF)은 피크 형광을 검출하기 어렵고 TOD 추정치가 신뢰성이 떨어지는 정도까지 강하게 약화 될 수 있습니다.
반대로, 일부 미생물은 여기 및 방출 스펙트럼이 DF 신호 (즉, Enterococcus faecalis)와 겹치는 청색 형광 화합물을 생성 할 수 있습니다. 이들의 역학은 DF와 다르며 종종 분리될 수 있지만 분석을 혼동할 수 있습니다.
다음으로, 분석은 죽어가는 개별 웜의 신호 누적에 의존하지만 DF는 시간이 지남에 따라 담금질됩니다. 따라서 벌레가 너무 멀리 떨어져 죽으면 개별 형광 피크가 인구 피크를 생성하지 못하여 개체군 중앙값 TOD를 측정할 수 없습니다. 분석이 느리게 죽일수록, 각 웰(30)에 요구되는 웜 수가 높아진다. 따라서 우물당 10-15개의 성충은 2시간 이내에 벌레의 절반을 죽이는 42°C 열 스트레스 분석에 충분하지만 12시간 내에 벌레의 절반을 죽이는 박테리아 고속 살상 분석에는 우물당 70개 이상의 벌레가 필요합니다.
마지막으로, 사용자는 필요한 파장에서 타임 랩스 형광 측정을 수행할 수 있는 분석을 수행하기 위해 플레이트 리더에 액세스해야 합니다. 여기 및 방출 파장은 또한 시스템마다 약간 다를 수 있으며 언급 된 바와 같이 선충류 종간에 다를 수 있습니다30.
다른 C. 엘레간스 분석과의 비교 및 상보성
지난 10-15 년 동안 다양한 전략을 사용하고 다양한 수준의 데이터 깊이와 폭을 제공하여 한 번에 여러 조건에서 C. elegans 건강을 평가하기위한 많은 분석법이 개발되었습니다. 30,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45, 46. 다중 웜 추적 알고리즘 및/또는 미세 제작된 개별 웜 어레이 37,38,39,40,41,43이 있는 카메라 어레이 및 스캐너를 사용하여 수명 기간 동안 고체 배지에서 한 번에 많은 웜을 자동으로 모니터링하기 위해 몇 가지 강력한 분석법이 개발되었습니다. . 숙주-미생물 상호작용의 맥락에서, DF에 의존하지 않고 상술한 프로토콜에 대한 유사한 접근법은 또한 박테리아 감염에 관여하는 C. elegans 유전자의 게놈 전체 RNAi 스크리닝을 가능하게 하였다46,47,48. 그러나 이러한 고처리량 분석은 전체적으로 액체에서 웜을 처리하는 데 의존하며, 이는 교차 오염의 위험이 증가하고 액체 배양이 숙주 및 미생물 대사에 영향을 미치기 때문에 한 번에 여러 박테리아 유형을 처리할 때 바람직하지 않습니다. 따라서 전통적인 감염, 스트레스, 건강 수명 및 수명 분석에서 C. elegans는 고체 배지에서 자란 박테리아 잔디에서 유지되고 숙성됩니다. 이 프로토콜의 경우와 마찬가지로 이 파이프라인으로 수행된 스크린의 결과는 스크린 히트가 있는 다운스트림 확인 실험의 결과와 더 쉽게 관련되고 예측될 수 있습니다.
LFASS 접근 방식 자체의 장점은 참조30에서 잘 다루었습니다. 유사한 연구를 위해 용도를 변경할 수 있는 보다 정교한 연속 이미징 설정과 비교할 때 LFASS는 더 저렴하고(중앙 TOD가 필요한 유일한 판독값인 경우) 단순성으로 인해 많은 기술적 능력이나 특수 장비가 필요하지 않습니다. LFASS는 주로 깊이보다 폭에 관한 것입니다. LFASS 데이터는 웜 개체군의 사망 시간 중앙값과 키누레닌 경로 출력의 간접 판독값 이외의 정보를 제공하지 않습니다. 반대로, 처리량은 낮지만 여전히 괜찮은 처리량으로 웜의 전체 수명 동안 다른 분석 37,38,39,40,41,43에서 복잡한 특성을 측정할 수 있으므로 LFASS 화면에서 히트를 연구하는 탁월한 다운스트림 접근 방식이 됩니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
웜 균주를 제공한 CGC 미네소타(미국 매디슨, NIH - P40 OD010440)와 여기에 묘사된 모든 환경 미생물 분리물을 제공한 OP50 및 Pr. Hinrich Schulenburg(CAU, Kiel, 독일)에 감사드립니다. 이 작업은 AB에 대한 UKRI-BBSRC 보조금(BB/S017127/1)으로 자금을 지원받았습니다. JM은 랭커스터 대학교 FHM PhD 장학금으로 자금을 지원합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm diameter plates (Non-vented) | Fisher Scientific | 10720052 | Venting is not necessary for bacterial cultures |
| 15 cm diameter plates (Vented) | Fisher Scientific | 168381 | |
| 384-well black, transparent flat bottom plates | Corning | 3712 or 3762 | Not essential to be sterile for fast stress assays |
| 6 cm diameter plates (Vented) | Fisher Scientific | 150288 | Venting is necessary for worm cultures to avoid hypoxia |
| 96-well transparent plates (Biolite) | Thermo | 130188 | |
| Agar (<4% ash) | Sigma-Aldrich | 102218041 | Good quality agar is important for the structural integrity of the culture media, to avoid worm burrowing |
| Agarose | Fisher Scientific | BP1356 | |
| Avanti Centrifuge J-26 XP | Beckman coulter | ||
| Bleach | Honeywell | 425044 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Centrifuge 5415 R | Eppendorf | ||
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | ||
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| LB agar | Difco | 240110 | |
| LB broth | Invitrogen | 12795084 | |
| LoBind tips | VWR | 732-1488 | Lo-bind reduce worm loss during transfers |
| LoBind tubes | Eppendorf | 22431081 | |
| Magnesium sulfate | Fisher Scientific | M/1100/53 | |
| Plate reader- infinite M nano+ | Tecan | Monochromator setup enables fluorescence tuning but adequate filter-based setups may be used | |
| Plate reader- Spark | Tecan | ||
| Potassium phosphate monobasic | Honeywell | P0662 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S/3160/63 | |
| Stereomicroscope setup with transillumination base | Leica | MZ6, or M80 | Magnification from 0.6-0.8x up to 40-60x is necessary, as is a good quality transillumination base with a deformable, titable or slidable mirror to adjust contrast |
| t-BHP (tert-Butyl hydroperoxide) | Sigma-Aldrich | 458139 | |
| Transparent adhesive seals Nunc | Fisher Scientific | 101706871 | It is important that it is transparent and that it can tolerate the temperatures involved in the assays. |
| Tryptophan | Sigma-Aldrich | 1278-7099 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422 |
References
- Krishna, S., et al. Integrating microbiome network: establishing linkages between plants, microbes and human health. The Open Microbiology Journal. 13, 330-342 (2019).
- Amon, P., Sanderson, I.
- Belkaid, Y., Harrison, O. J.
- Cabreiro, F., Gems, D. Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans. EMBO Molecular Medicine. 5 (9), 1300-1310 (2013).
- Vaga, S., et al. Compositional and functional differences of the mucosal microbiota along the intestine of healthy individuals. Scientific Reports. 10 (1), 14977 (2020).
- Nagpal, R., et al. Gut microbiome and aging: Physiological and mechanistic insights. Nutrition and Healthy Aging. 4 (4), 267-285 (2018).
- Mitsuoka, T.
- Bonfili, L., et al. Microbiota modulation as preventative and therapeutic approach in Alzheimer's disease. The FEBS Journal. 288 (9), 2836-2855 (2021).
- Vendrik, K. E. W., et al. Fecal microbiota transplantation in neurological disorders. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 98 (2020).
- Wang, Q., et al. The role of gut dysbiosis in Parkinson's disease: mechanistic insights and therapeutic options. Brain. 144 (9), 2571-2593 (2021).
- Zhu, X., et al. The relationship between the gut microbiome and neurodegenerative diseases. Neuroscience Bulletin. 37 (10), 1510-1522 (2021).
- Miller, I.
- Foster, J. A., Rinaman, L., Cryan, J. F. Stress & the gut-brain axis: Regulation by the microbiome. Neurobiology of Stress. 7, 124-136 (2017).
- Coman, V., Vodnar, D. C. Gut microbiota and old age: Modulating factors and interventions for healthy longevity. Experimental Gerontology. 141, 111095 (2020).
- Conway, J., Duggal, N. A. Ageing of the gut microbiome: Potential influences on immune senescence and inflammageing. Ageing Research Reviews. 68, 101323 (2021).
- Berg, M., et al. Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments. The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).
- Dirksen, P., et al. CeMbio - The Caenorhabditis elegans Microbiome Resource. G3: Genes, Genomes, Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).
- Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14, 38 (2016).
- Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Felix, M. A., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (27), 3941-3949 (2016).
- Zimmermann, J., et al. The functional repertoire contained within the native microbiota of the model nematode Caenorhabditis elegans. The ISME Journal. 14 (1), 26-38 (2020).
- Dinic, M., et al. Host-commensal interaction promotes health and lifespan in Caenorhabditis elegans through the activation of HLH-30/TFEB-mediated autophagy. Aging. 13 (6), 8040-8054 (2021).
- Goya, M. E., et al. Probiotic Bacillus subtilis protects against alpha-Synuclein aggregation in C. elegans. Cell Reports. 30 (2), 367-380 (2020).
- Hacariz, O., Viau, C., Karimian, F., Xia, J. The symbiotic relationship between Caenorhabditis elegans and members of its microbiome contributes to worm fitness and lifespan extension. BMC Genomics. 22 (1), 364 (2021).
- Shin, M. G., et al. Bacteria-derived metabolite, methylglyoxal, modulates the longevity of C. elegans through TORC2/SGK-1/DAF-16 signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (29), 17142-17150 (2020).
- Zhang, F., et al. Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut. Current Biology. 31 (12), 2603-2618 (2021).
- Zhang, F., et al. High-throughput assessment of changes in the Caenorhabditis elegans gut microbiome. Methods in Molecular Biology. 2144, 131-144 (2020).
- Chan, J. P., et al. Using bacterial transcriptomics to investigate targets of host-bacterial interactions in Caenorhabditis elegans. Scientific Reports. 9 (1), 5545 (2019).
- Hartsough, L. A., et al. Optogenetic control of gut bacterial metabolism to promote longevity. Elife. 9, 56849 (2020).
- Pryor, R., et al. Host-microbe-drug-nutrient screen identifies bacterial effectors of Metformin therapy. Cell. 178 (6), 1299-1312 (2019).
- Benedetto, A., et al. New label-free automated survival assays reveal unexpected stress resistance patterns during C. elegans aging. Aging Cell. 18 (5), 12998 (2019).
- Coburn, C., et al. Anthranilate fluorescence marks a calcium-propagated necrotic wave that promotes organismal death in C. elegans. PLOS Biology. 11 (7), 1001613 (2013).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Stiernagle, T.
- Naomi, R., et al. Probiotics for Alzheimer's disease: a systematic review. Nutrients. 14 (1), 20 (2021).
- Zheng, S. Y., et al. Potential roles of gut microbiota and microbial metabolites in Parkinson's disease. Ageing Research Reviews. 69, 101347 (2021).
- Gill, M. S., Olsen, A., Sampayo, J. N., Lithgow, G. J. An automated high-throughput assay for survival of the nematode Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology and Medicine. 35 (6), 558-565 (2003).
- Park, H. -E. H., Jung, Y., Lee, S. -J. V. Survival assays using Caenorhabditis elegans. Molecules and Cells. 40 (2), 90-99 (2017).
- Partridge, F. A., et al. An automated high-throughput system for phenotypic screening of chemical libraries on C. elegans and parasitic nematodes. International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance. 8 (1), 8-21 (2018).
- Rahman, M., et al. NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10 (1), 16190 (2020).
- Stroustrup, N., et al. The Caenorhabditis elegans lifespan machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).
- Xian, B., et al. WormFarm: a quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
- Brown, A. E., Schafer, W. R. Unrestrained worms bridled by the light. Nature Methods. 8 (2), 129-130 (2011).
- Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. Elife. 6, 26652 (2017).
- Jushaj, A., et al. Optimized criteria for locomotion-based healthspan evaluation in C. elegans using the WorMotel system. PLoS One. 15 (3), 0229583 (2020).
- Nambyiah, P., Brown, A. E. X. Quantitative behavioural phenotyping to investigate anaesthesia induced neurobehavioural impairment. Scientific Reports. 11 (1), 19398 (2021).
- Squiban, B., Belougne, J., Ewbank, J., Zugasti, O. Quantitative and automated high-throughput genome-wide RNAi screens in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (60), e3448 (2012).
- Zugasti, O., et al. Activation of a G protein-coupled receptor by its endogenous ligand triggers the innate immune response of Caenorhabditis elegans. Nature Immunology. 15 (9), 833-838 (2014).
- Zugasti, O., et al. A quantitative genome-wide RNAi screen in C. elegans for antifungal innate immunity genes. BMC Biology. 14, 35 (2016).
