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Biology

Detección de alto rendimiento de aislados microbianos con impacto en la salud de Caenorhabditis elegans

Published: April 28, 2022 doi: 10.3791/63860
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Division of Biomedical and Life Sciences, Lancaster University
* These authors contributed equally

Summary

Los microbios intestinales pueden afectar positiva o negativamente la salud de su huésped a través de mecanismos específicos o conservados. Caenorhabditis elegans es una plataforma conveniente para detectar tales microbios. El presente protocolo describe el cribado de alto rendimiento de 48 aislados bacterianos para determinar su impacto en la resistencia al estrés de los nematodos, utilizados como sustitutos de la salud de los gusanos.

Abstract

Con su pequeño tamaño, corta vida útil y genética fácil, Caenorhabditis elegans ofrece una plataforma conveniente para estudiar el impacto de los aislados microbianos en la fisiología del huésped. También fluoresce en azul cuando muere, proporcionando un medio conveniente para identificar la muerte. Esta propiedad se ha explotado para desarrollar ensayos de supervivencia de C. elegans (LFASS) de alto rendimiento y sin etiquetas. Estos implican el registro de fluorescencia de lapso de tiempo de poblaciones de gusanos colocadas en placas de múltiples pocillos, de las cuales se puede derivar el tiempo medio de muerte de la población. El presente estudio adopta el enfoque LFASS para detectar múltiples aislados microbianos a la vez para detectar los efectos sobre la susceptibilidad de C. elegans al calor severo y al estrés oxidativo. Aquí se informa de esta tubería de detección microbiana, que se puede utilizar en particular para preseleccionar probióticos, utilizando resistencia severa al estrés como un indicador de la salud del huésped. El protocolo describe cómo cultivar colecciones aisladas de microbiota intestinal de C. elegans y poblaciones de gusanos sincrónicos en matrices de pozos múltiples antes de combinarlos para los ensayos. El ejemplo proporcionado cubre la prueba de 47 aislados bacterianos y una cepa de control en dos cepas de gusanos, en dos ensayos de estrés en paralelo. Sin embargo, la tubería de enfoque es fácilmente escalable y aplicable a la selección de muchas otras modalidades. Por lo tanto, proporciona una configuración versátil para estudiar rápidamente un paisaje multiparamétrico de condiciones biológicas y bioquímicas que afectan la salud de C. elegans.

Introduction

El cuerpo humano alberga un estimado de 10-100 billones de células microbianas vivas (bacterias, hongos arquea), que se encuentran principalmente en el intestino, la piel y los ambientes de la mucosa1. En un estado saludable, estos proporcionan beneficios a su huésped, incluida la producción de vitaminas, la maduración del sistema inmunológico, la estimulación de las respuestas inmunes innatas y adaptativas a los patógenos, la regulación del metabolismo de las grasas, la modulación de las respuestas al estrés y más, con un impacto en el crecimiento y el desarrollo, el inicio de la enfermedad y el envejecimiento 2,3,4,5 . La microbiota intestinal también evoluciona considerablemente a lo largo de la vida. La evolución más drástica ocurre durante la infancia y la primera infancia6, pero también ocurren cambios significativos con la edad, incluyendo una disminución en la abundancia de Bifidobacterium y un aumento en las especies de Clostridium, Lactobacillus, Enterobacteriaceae y Enterococcus 7. El estilo de vida puede alterar aún más la composición microbiana intestinal que conduce a la disbiosis (pérdida de bacterias beneficiosas, crecimiento excesivo de bacterias oportunistas), lo que resulta en diversas patologías como la enfermedad inflamatoria intestinal, la diabetes y la obesidad5, pero también contribuye a las enfermedades de Alzheimer y Parkinson 8,9,10,11.

Esta comprensión ha contribuido críticamente a refinar el concepto del eje intestino-cerebro (GBA), donde las interacciones entre la fisiología intestinal (ahora incluyendo los microbios dentro de ella) y el sistema nervioso se consideran el principal regulador del metabolismo animal y las funciones fisiológicas12. Sin embargo, el papel preciso de la microbiota en la señalización intestino-cerebro y los mecanismos de acción asociados están lejos de ser completamente comprendidos13. Dado que la microbiota intestinal es un determinante clave del envejecimiento saludable, la forma en que las bacterias modulan el proceso de envejecimiento se ha convertido en un tema de intensa investigación y controversia 6,14,15.

Con la demostración de que el gusano redondo Caenorhabditis elegans alberga una microbiota intestinal de buena fe dominada, como en otras especies, por Bacteroidetes, Firmicutes y Actinobacteria 16,17,18,19,20, su rápido aumento como plataforma experimental para estudiar las interacciones comensales huésped-intestino21,22,23,24 ,25,26 ha ampliado significativamente nuestro arsenal de investigación26,27,28,29. En particular, los enfoques experimentales de alto rendimiento disponibles para que C. elegans estudien las interacciones gen-dieta, gen-fármaco, gen-patógeno, etc., se pueden adaptar para explorar rápidamente cómo los aislados bacterianos y los cócteles afectan la salud y el envejecimiento de C. elegans.

El presente protocolo describe una tubería experimental para examinar a la vez matrices de aislados o mezclas bacterianas colocadas en placas de múltiples pocillos para detectar efectos sobre la resistencia al estrés de C. elegans como un indicador de la salud, que puede usarse para identificar probióticos. Detalla cómo cultivar grandes poblaciones de gusanos y manejar matrices bacterianas en formatos de placas de 96 y 384 pocillos antes de procesar gusanos para el análisis automatizado de resistencia al estrés utilizando un lector de placas de fluorescencia (Figura 1). El enfoque se basa en ensayos automatizados de supervivencia sin etiquetas (LFASS)30 que explotan el fenómeno de la fluorescencia de muerte31, mediante el cual los gusanos moribundos producen una explosión de fluorescencia azul que puede usarse para determinar el momento de la muerte. La fluorescencia azul es emitida por ésteres glucosílicos de ácido antranílico almacenados en gránulos intestinales de C. elegans (un tipo de orgánulo relacionado con lisosomas), que estallan cuando se desencadena una cascada necrótica en el intestino del gusano al morir31.

Figure 1
Figura 1: Flujo de trabajo experimental para el cribado de alto rendimiento de aislados bacterianos con impacto en la resistencia de C. elegans al estrés . (A) Línea de tiempo para el mantenimiento de gusanos y bacterias y la configuración del ensayo. (B) Configuración y manejo de la matriz de placas bacterianas de 96 pocillos. (C) Configuración de placa de tornillo sin fin de 384 pocillos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Protocol

Las dos cepas de C. elegans utilizadas en paralelo para el presente estudio fueron Bristol N2 wild type y HT1890: daf-16(mgDf50), que crecen a tasas similares. Sin embargo, el protocolo se puede replicar con cualquier combinación de dos cepas que tengan tasas de crecimiento similares. Tenga en cuenta que, al probar otras cepas en paralelo (por ejemplo, mutantes daf-2 de tipo salvaje y de crecimiento lento), se deben considerar diferentes tasas de crecimiento y, en consecuencia, se debe ajustar el protocolo. Las escalas de tiempo y las cantidades de gusanos y bacterias en el siguiente protocolo están optimizadas para pruebas paralelas de 48 aislados bacterianos en dos cepas de gusanos en dos ensayos LFASS en tetraplicados. Se necesitarán ajustes si se van a probar más condiciones en paralelo. Escherichia coli La cepa de la bacteria OP50 se obtuvo del Centro de Genética Caenorhabditis (CGC) de la Universidad de Minnesota. Los 48 aislados bacterianos se obtuvieron del laboratorio de Schulenburg y se mantuvieron en agar LB.

1. Cultivo de C. elegans en OP50 (Días 1 - 8)

NOTA: El enfoque actual tiene como objetivo cultivar C. elegans hermafroditas en un medio sólido en todas las etapas y evita cambios dietéticos innecesarios (es decir, utilizando cepas alternativas de E. coli de crecimiento más rápido como NA22 o medios de crecimiento más ricos como las placas de huevo) para permanecer lo más cerca posible de las condiciones de crecimiento estándar32,33 que todavía se usan ampliamente. La temperatura de crecimiento del gusano (aquí fijada en 15 °C) depende de la(s) cepa(s) de C. elegans utilizada(s) y puede ser necesario ajustarla (por ejemplo, para evitar o desencadenar la expresión de un fenotipo o biomarcador sensible a la temperatura). Para obtener información sobre la cría de lombrices, consulte la referencia33.

  1. Preparar ocho placas NGM de 6 cm de diámetro (10 mL de agar de medios de crecimiento de nematodos, NGM, Archivo Suplementario 1)32,33 por cepa de gusano y dejar secar durante 1 día a temperatura ambiente.
  2. Preparar un cultivo líquido saturado de la bacteria E. coli OP50 sembrando un solo clon bacteriano de una placa de agar caldo de lisogenia recién cultivado (agar LB, archivo suplementario 1) en 25 ml de medio OP50 (archivo suplementario 1) en un tubo cónico de 50 ml. Cultivar el cultivo durante la noche a 37 °C en una incubadora agitadora.
  3. Inocular las ocho placas NGM de 6 cm por cepa con 100 μL de cultivo líquido saturado de E. coli OP50 por placa y mantener las placas a 20 °C durante 2 días antes de su uso.
  4. Usando un bisturí, cortar y transferir un trozo cuadrado de agar de 0,5 cm con gusanos de una placa NGM recientemente hambrienta a cada una de las ocho placas NGM de 6 cm inoculadas e incubar estas placas a 20 °C durante 3 días (o hasta que los gusanos terminen la comida).
  5. Preparar cinco placas NGM de 15 cm por cepa de gusano (30 mL de medio NGM por placa) e inocular con 3 mL de OP50. Deje secar las placas antes de incubar a 37 °C durante la noche. Conservar las placas a 20 °C hasta su uso en pasos posteriores.
  6. Con una pipeta P-1000, añadir hasta 3 ml de tampón M9 estéril (archivo complementario 1) a las placas NGM de 6 cm (paso 1.1.) para resuspender los gusanos y recoger la solución de gusano de las ocho placas por cepa en un solo tubo cónico de 15 ml.
    1. Centrifugar a 142 x g durante 2 min a 4 °C. Retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta P-5000 o una bomba de agua equipada con una pipeta o punta estéril Pasteur. Agregue 10 ml de tampón M9 estéril para lavar el pellet de lombriz. Repita 2x.
    2. Retirar el sobrenadante (tanto como sea posible) y transferir los gusanos a una placa NGM inoculada OP50 de 15 cm (Paso 1.5.) utilizando una pipeta. Añadir 0,5 ml de cultivo concentrado de OP50.
    3. Para hacer OP50 concentrado, inocular cada uno de los cuatro frascos de 1 L de LB con 2 ml de cultivo iniciador OP50 (preparado en el Paso 1.2.) y cultivar en una incubadora de agitación durante 6 h a 37 °C y 160 x g. Granular las bacterias a 3057 x g y 20 °C durante 15 min. Deseche el sobrenadante, resuspenda los gránulos bacterianos con 6 ml de medio OP50 y recoja en un tubo cónico estéril de 50 ml.
      NOTA: Las bacterias pueden almacenarse a 4 °C durante un máximo de 1 semana.
  7. Cultivar cada cepa de gusano en una placa NGM de 15 cm de diámetro durante 3-4 días a 15 °C realimentando a los gusanos con 0,5 ml de OP50 concentrado diariamente.
    1. Una vez que los gusanos hayan terminado casi el alimento, recolectar y lavar en tampón M9 (Paso 1.6.1.), transferir cada cultivo de cepa de gusano a dos placas NGM de 15 cm (Paso 1.5.) y propagar gusanos a 20 °C hasta que ~ 95% de la población sean adultos grávidos (tomará aproximadamente 24 h para Bristol N2 de tipo salvaje).
      NOTA: Los adultos grávidos se caracterizan por la presencia de huevos dentro del gusano, y la placa ideal también debe tener una abundancia de huevos no eclosionados puestos en la placa sin demasiadas larvas33.

2. Mantenimiento de las colecciones aisladas de microbiota intestinal (Día 9)

  1. Rayar los 48 aislados bacterianos en placas individuales de agar LB de 6 cm y crecer durante 48 h a 20 °C.
    NOTA: Las bacterias se pueden cultivar a 25 ° C durante 24-36 h si es necesario antes, pero el crecimiento más largo de 20 ° C permite detectar contaminantes potenciales.
  2. Sincronizar un gran número de C. elegans.
    1. Blanquear los gusanos adultos grávidos siguiendo el método estándar de preparación de huevos33 y transferir los huevos a dos placas NGM de 15 cm sin semillas durante 24 h a 15 °C para permitir que todas las larvas L1 eclosionen y crezcan sincrónicamente en los pasos siguientes.
      PRECAUCIÓN: Tenga cuidado al manipular soluciones de lejía.

3. Cultivo de grandes cultivos de C. elegans (Día 10)

  1. Una vez eclosionadas, recoger las larvas L1 (del Paso 2.2.1.) en 3-4 ml de M9 en un tubo cónico limpio de 15 ml. Pipetear cuatro gotas de 10 μL de solución de gusano en un portaobjetos o una placa y contar el número de gusanos en cada gota bajo un microscopio estereoscópico con un aumento de 16x. Determine la concentración de gusanos de la solución promediando el número de larvas de todas las gotas de solución de gusano. Multiplique este valor por el volumen restante y calcule el recuento total de gusanos para cada cepa.
    NOTA: Se requieren 46,000-50,000 larvas L1 por cepa en esta etapa para luego llenar una placa de 384 pocillos o dos medias placas.
    1. Para cada cepa, transferir todas las larvas L1 a dos placas NGM de 15 cm (23.000-25.000 L1 por placa) previamente inoculadas con 3 ml de OP50 (Paso 1.5.) y resembradas con 0,5 ml de OP50 concentrada.
  2. Incubar a 15 °C, rellenando con 0,5 ml de OP50 concentrado diariamente según sea necesario hasta que los gusanos alcancen la etapa L4.
    NOTA: La etapa L4 se caracteriza por un intestino ligeramente más oscuro y un parche blanco en forma de media disco o media luna donde la vulva eventualmente formará32,33.
  3. Prepare placas de 96 pocillos de NGM-agarosa siguiendo los pasos a continuación.
    1. Prepare ocho placas de NGM-agarosa de 96 pocillos llenando cada pocillo con 125 μL de NGM-agarosa (cuatro placas por ensayo).
      NOTA: Se recomienda emplatar algunas placas adicionales si algunas se contaminan en los pasos posteriores. Se requerirán dos lectores de placas para ejecutar ensayos en paralelo, pero también pueden ejecutarse sucesivamente comenzando con el ensayo de estrés por calor, ya que puede ejecutarse durante tan solo 6 h. Para estas placas, el agar ceniza <4% se sustituye con agarosa (ver Tabla de materiales), lo que permite un secado más lento y uniforme a través de los tapones NGM y reduce la madriguera de gusanos para una mejor recuperación.
    2. Asegúrese de que los pozos se llenen de manera uniforme y sin burbujas. Utilice un bloque de calor ajustado a 70 °C (con una transferencia de calor lenta a través del plástico de la placa de pocillos múltiples, la agarosa NGM solo puede calentarse hasta aproximadamente 55-60 °C) para evitar que la mezcla se solidifique durante el proceso. Para eliminar las burbujas dentro de los pozos, use una aguja estéril calentada por llama.
    3. Deje que las placas de 96 pocillos se fijen a temperatura ambiente en un ambiente estéril antes de invertirlas (tapar hacia abajo para evitar la condensación) y almacenar a 4 °C en una caja limpia hasta que sea necesario.
  4. El día 11, verifique los gusanos del Paso 3.2., asegurándose de que no hayan aparecido contaminaciones y que los gusanos aún estén repletos.
  5. El día 12, verifique los gusanos del Paso 3.1., asegurándose de que no hayan aparecido contaminaciones y que los gusanos aún estén repletos. Además, verifique la etapa de desarrollo de los gusanos.
    NOTA: El sexo/cepa y la etapa de desarrollo del gusano, como los gusanos L4 o L4 + 24 h utilizados, dependen de los tratamientos a los que se someten los gusanos. Aquí, los hermafroditas de tipo salvaje fueron expuestos a aislados bacterianos de L4 durante 36 h.

4. Preparación de colecciones aisladas de microbiota intestinal para realimentar gusanos

  1. Monitoree el crecimiento bacteriano en las placas de agar LB desde el Paso 2.1. y continuar incubando a 20 °C.
    NOTA: Si bien no es ideal, en caso de que algunos clones no crezcan o revelen contaminaciones, las bacterias pueden volver a rayarse de las existencias limpias en placas de 6 cm LB y crecer a 25-28 ° C durante 24 h para estar listas para el experimento.
  2. Definir un diseño de matriz de 96 pocillos para la recolección bacteriana que se está probando, facilitando la siembra sistemática de placas y el análisis de datos en los pasos posteriores (Tabla complementaria 1).
  3. Recoger la masa bacteriana de cada placa bacteriana de 6 cm (Paso 4.1.) y transferirla a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml marcado que contenga 1 ml de tampón M9. Realice esto utilizando un bucle de plástico estéril de 2 mm de diámetro de un solo uso o un bucle de metal de 5 mm de diámetro. Esterilice el bucle metálico entre las cepas bacterianas sumergiendo etanol al 100%, flameando y enfriando durante 5 s.
  4. Vortex los tubos de microcentrífuga hasta que los gránulos bacterianos estén completamente resuspendidos (dependiendo de la cepa bacteriana, esto puede tomar ~ 1-10 s).
  5. Girar hacia abajo a 9.300 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente, eliminar 700 μL de sobrenadante y resuspender el pellet bacteriano mediante vórtice.
  6. Transfiera 200 μL de cada suspensión bacteriana a un solo pocillo de una placa vacía estéril de 96 pocillos de acuerdo con el diseño establecido en el paso 4.2.
  7. A partir de esta placa, inocular ocho placas de 96 pocillos de AGM-agarosa (preparadas en la etapa 3.3.) con 10 μL de solución bacteriana utilizando una pipeta multicanal e incubar con la tapa puesta a 25 °C durante 24 h. No selle las placas para permitir el secado de la placa y el crecimiento aeróbico bacteriano y para evitar el exceso de condensación.
  8. Selle la placa de suspensión de 96 pocillos preparada en el paso 4.6. con película de sellado adhesiva limpia (ver Tabla de materiales) y conservar a 15 °C durante un máximo de 5 días. Esto se utilizará para la realimentación de gusanos según sea necesario.

5. Configuración del choque térmico y ensayo oxidativo LFASS (días 13 - 14)

  1. Mirando las placas del Paso 3.5., evalúe la etapa de desarrollo de los gusanos. Una vez que el >90% de los gusanos hayan alcanzado L434, recoger los gusanos en hasta 10 ml de solución estéril M9 en tubos cónicos de 15 ml.
  2. Lave los gusanos extensamente (al menos 4 veces) girando hacia abajo a 142 x g durante 2 minutos a 4 °C, retirando el sobrenadante y agregando 10 ml de M9 estéril fresco entre cada lavado para eliminar la bacteria OP50. Resuspender el pellet de lombriz en 10 mL de M9.
  3. Transfiera 50 μL de solución de gusano a un tubo de unión superficial baja (ver Tabla de materiales) que contenga 950 μL de M9. Después de mezclar suavemente el contenido del tubo para evitar la sedimentación de gusanos, use rápidamente una punta de pipeta húmeda de bajo enlace para transferir 3-4 gotas separadas de 10 μL a un portaobjetos de vidrio o una placa NGM, y cuente el número de gusanos bajo un microscopio estereoscópico (consulte la Tabla de materiales) con un aumento de 16x. Promedie los recuentos de las 3-4 gotas y determine el número de gusanos por microlitro en la solución de gusano (ver Paso 3.1.).
  4. Ajuste la concentración de gusanos en el tubo de 10 ml para alcanzar ~120 gusanos en 8 μL. Si la solución preparada en el paso 5.2. no está lo suficientemente concentrado, gire los gusanos hacia abajo y elimine M9 en consecuencia para alcanzar 120 gusanos por 8 μL.
  5. Transfiera 8 μL de solución de gusano (~120 gusanos) a cada uno de los pocillos de las ocho placas de 96 pocillos de angm-agarosa del paso 4.7., utilizando una pipeta multicanal o una pipeta repetida. Asegúrese de usar puntas de retención baja para limitar la pérdida de gusanos. También podría ser necesario cortar los extremos de la punta para permitir que los gusanos adultos grandes limiten el estrés mecánico en los gusanos adultos.
    NOTA: El ensayo requiere un mínimo de 30 gusanos vivos para funcionar de manera confiable, pero funciona mejor con aproximadamente 100 gusanos por pocillo.
  6. Incubar las placas de 96 pocillos de gnanomasa de 96 pocillos sembradas por gusanos y bacterias a 25 °C durante 36 h.
  7. Revise las placas entre las 12 y las 24 h, asegurándose de que los gusanos permanezcan repletos en todo momento. Si es necesario volver a alimentar, resuspender las bacterias dentro de la placa de matriz bacteriana de 96 pocillos almacenada a 15 °C en la etapa 4.8., y añadir hasta 10 μL de la solución bacteriana correspondiente a las placas de 96 pocillos de agarosa NGM en las que los gusanos corran riesgo de inanición antes de que finalice el período de incubación de 36 h (los gusanos hambrientos producirán resultados muy diferentes, así que esto es muy importante).
    NOTA: Los siguientes pasos deben llevarse a cabo el día 15. Antes de comenzar el ensayo, puede ser necesario optimizar la altura de lectura. La lectura óptima se logrará 20-50 μm por encima del fondo del pozo. Esto dependerá del modelo del lector de placas. Algunos ofrecen la posibilidad de un Z-scan, mientras que otros permiten la entrada manual de altura. Establezca la altura óptima en el nivel donde se detecta la señal de fluorescencia azul más alta (365 nm/430 nm). Algunos lectores de placas pueden funcionar a una altura fija optimizada para ensayos de células adherentes y pueden no ser ideales para ensayos LFASS.
  8. Después de 36 h, dispensar 30 μL de M9 en cada pocillo de la placa de 96 pocillos.
    NOTA: Para los ensayos de esfuerzo térmico, el lector de placas debe haber alcanzado la temperatura requerida para realizar el ensayo y es posible que deba encenderse con anticipación. El protocolo actual utiliza 42 ° C para maximizar la velocidad de muerte, pero el enfoque se aplica a otras temperaturas superiores a 30 ° C.
  9. Transfiera los gusanos (aproximadamente 20 μL) a la placa de 384 pocillos de acuerdo con los diseños establecidos, utilizando puntas de baja retención (considere cortar el extremo de las puntas para permitir que los gusanos grandes reduzcan el estrés mecánico de los gusanos adultos).
    NOTA: Para el presente estudio, se utilizan dos configuraciones diferentes de lector de placas para los dos ensayos descritos aquí (estrés térmico y estrés oxidativo) y, por lo tanto, las muestras destinadas a estos dos ensayos no deben chaparse en la misma placa de 384 pocillos.
  10. Asegúrese de que los lectores de placas estén configurados correctamente (Tabla 1).
  11. Rellene las placas de 384 pocillos con más M9, con el objetivo de obtener un volumen final de 60 μL por pocillo. Para el ensayo de estrés térmico, agregue 40 μL de M9, y para el estrés oxidativo inducido por t-BHP, agregue 34 μl de M9 en 6 μl de t-BHP (consulte la Tabla de materiales).
    1. Comience el ensayo dentro de los 2 minutos posteriores a la adición de t-BHP (idealmente, todos los gusanos deben estar expuestos a t-BHP simultáneamente, la resolución del tiempo de ensayo es de 2 min). Si no es posible, utilice un temporizador para estimar el tiempo empleado en pipetear t-BHP antes del inicio del ensayo para permitir el ajuste posterior de la mediana de tiempo de muerte.
  12. Cierre las placas con su tapa transparente. Selle los bordes de las placas de 384 pocillos con cinta adhesiva (pegando cinta adhesiva sobre la placa y la tapa), asegurándose de que la cinta no pase por encima de la tapa o debajo de la placa. Corte la cinta entre la tapa y la placa a intervalos con un bisturí para permitir el intercambio de aire y minimizar la evaporación durante el ensayo.
  13. Inserte la placa en el lector de placas (consulte Tabla de materiales) e inicie la ejecución. Trate de excitar a 365 nm y detectar la emisión a 435 nm cada 2 min durante 6-12 h (Tabla 1).
    NOTA: Normalmente, 6 h es suficiente para ensayos de estrés térmico a 42 °C y 8 h para ensayos de estrés oxidativo t-BHP al 7%.

6. Tratamiento de datos del lector de placas

  1. Guarde los datos de fluorescencia sin procesar del lector de placas como formatos .txt, .csv o .xls /.xlsx separados por comas o tabulaciones y, a continuación, conviértalos al formato xls /.xlsx. Dependiendo del formato de datos, reorganícelos para que coincidan con el diseño de hoja de Excel necesario para el análisis LFASS. Siga las instrucciones detalladas proporcionadas en la referencia30.
    NOTA: Mientras que los datos se pueden analizar manualmente, normalizando cada serie temporal y buscando el momento en que la fluorescencia de muerte alcanza la mitad máximo, el análisis automatizado se puede llevar a cabo en Matlab ejecutando la rutina LFASS30.
  2. Descargue e instale Matlab (versión 2014a o superior) y el paquete de software LFASS desde https://github.com/ABA80/LFASS. Siga las pautas y anotaciones proporcionadas en él.
    NOTA: La Figura 1C ofrece una breve descripción del enfoque. Matlab es necesario para ejecutar la rutina LFASS. Alternativamente, el código de Matlab puede ser traducido a Oracle, excepto para la función de ajuste, que es propietaria. Las nuevas funciones de suavizado y sigmoide se pueden reescribir para permitir su uso en una plataforma totalmente de código abierto.
  3. Entre análisis LFASS, mueva los datos y los resultados a una nueva ubicación, ya que el análisis LFASS procesará todos los archivos de la carpeta de datos y sobrescribirá los archivos de la carpeta Resultados.

7. Inspección de datos

  1. Abra el archivo de Excel y etiquete las filas de acuerdo con la posición del pozo en la placa de 384 pocillos. El archivo complementario 2 muestra un ejemplo del archivo Excel de los datos de fluorescencia sin procesar generados para el ensayo de choque térmico. Use la posición del pozo en la placa de 384 pocillos para etiquetar las cepas de gusanos y bacterias.
  2. Antes del análisis de Matlab, inspeccione visualmente los datos en Excel, trazando la intensidad de fluorescencia a lo largo del tiempo para un pozo representativo. Dependiendo del lector de placas utilizado, los datos pueden ser ruidosos, pero deben mostrar un pico claro. En particular:
    1. Determine un valor de fluorescencia por debajo del cual un pico no sería significativamente diferente del ruido (establecer dicho umbral en LFASS acelerará el análisis al excluir los pozos vacíos).
    2. Tenga en cuenta el punto de tiempo más temprano cuando las fluctuaciones de fluorescencia disminuyen antes de elevarse (los animales pueden golpear vigorosamente durante hasta 30 minutos, lo que lleva a lecturas de fluorescencia azul que fluctúan rápidamente).
      NOTA: La conexión de pico puede mejorarse excluyendo estos puntos de tiempo tempranos de la ventana de conexión de curva.
    3. Tenga en cuenta los puntos de tiempo entre los cuales se espera que caigan los valores de fluorescencia mínimos y máximos (observe varios pocillos para identificar estos rangos), ya que se utilizarán para el ajuste de curvas.
    4. Compruebe si las amplitudes de los picos de fluorescencia varían significativamente entre los pocillos, normalice los datos antes de realizar un análisis adicional utilizando la siguiente fórmula:
      Pozo de fluorescencia normalizada n (t) = (Pozo de fluorescencian [t] - pozo de fluorescencia mínima [Dt]) / (pozo de fluorescencia máxima [Dt] - pozo de fluorescencia mínima [Dt])
      donde "n" es el número de pozo actual, "t" es el punto de tiempo y "Dt" es la serie de puntos de tiempo para el ensayo.

8. Tratamiento de datos de LFASS

NOTA: Los detalles se proporcionan en https://github.com/ABA80/LFASS y en los materiales complementarios de la Referencia30.

  1. Cree dos subcarpetas dentro de la carpeta LFASS, una para los datos que se van a analizar y otra para los resultados, por ejemplo, "mis datos" y "resultados".
  2. Copie el archivo de datos excel del ensayo en la subcarpeta LFASS "mis datos" después de la inspección de datos.
  3. Inicie MATLAB, navegue hasta la carpeta LFASS , escriba y ejecute fitfolder en la ventana de comandos (Archivo complementario 3). A continuación, siga las instrucciones que aparecen en pantalla.
  4. Después de escribir "fitfolder", el sistema solicita el nombre de la carpeta en la que se encuentra el archivo de Excel, por ejemplo, 'mis datos'. Escriba el nombre de su carpeta de datos (en este ejemplo, "mis datos").
  5. Siga las instrucciones en pantalla, proporcionando los diversos parámetros solicitados.
    1. Introduzca "2" para el intervalo de tiempo entre mediciones sucesivas en el protocolo actual (especificar esto permite que los resultados se expresen en minutos en lugar de unidades de punto de tiempo).
      NOTA: El intervalo de tiempo se puede modificar para realizar mediciones de fluorescencia con más o menos frecuencia (para disminuir o aumentar la resolución de tiempo) y también dependiendo de las capacidades del lector de placas (es decir, es posible que sea necesario aumentar el intervalo de tiempo para los lectores de placas que no pueden realizar mediciones lo suficientemente rápidas). Asegúrese de hacer coincidir siempre el intervalo de tiempo experimental con la rutina LFASS.
    2. Asigne el umbral de tolerancia superior escribiendo "0.95" (esto se puede cambiar según sea necesario para mejorar el ajuste) y el umbral de tolerancia inferior escribiendo "0.05" (esto se puede cambiar según sea necesario para mejorar el ajuste) para restringir el ajuste sigmoide.
      NOTA: Otros parámetros de tiempo se basan en notas de usuario de la inspección de datos (Paso 7.2.).
  6. Elija si desea mostrar o no curvas ajustadas y suavizadas escribiendo "y" para SÍ o "n" para NO cuando se le solicite. Para inspeccionar visualmente los ajustes convergentes, seleccione el primero.
    NOTA: Este último es útil para visualizar todos los datos suavizados, pero generalmente no se selecciona porque genera demasiados gráficos emergentes. Después de esto, Matlab ejecutará la rutina LFASS, que puede tardar de 1 a 10 minutos si se procesan varios archivos de Excel de una sola vez. Las ventanas emergentes con curvas aparecerán de acuerdo con la selección en el Paso 8.6. El archivo complementario 4A muestra un ejemplo de una curva ajustada.
  7. Elija si desea (1) analizar curvas identificadas como ruido o (2) reacondicionar curvas mal ajustadas con una opción [y/n]. Escriba y para aprobar y n para rechazar.
    NOTA: Se recomienda aprobar el reacondicionamiento, especialmente si hay muchas curvas mal ajustadas o no ajustadas. Esto permitirá al usuario proporcionar parámetros de ajuste de curva personalizados para cada curva a medida que aparecen en la pantalla y solo solicitar límites anteriores y posteriores para el ajuste sigmoide. Se puede intentar tantas veces como sea necesario.
  8. Una vez analizados los datos, cierre Matlab y abra la carpeta LFASS .
  9. Haga clic en la subcarpeta LFASS Mis resultados, ya que los archivos de resultados se guardan automáticamente en la carpeta Resultados como .txt.
    NOTA: Matlab genera tres archivos .txt: "Batch-fitted.txt", "Batch and noise-fitted.txt" y "Refitted.txt". Los dos primeros se guardan como precaución en caso de un bloqueo de la computadora o un error del usuario durante el reajuste. El archivo que contiene el análisis completo más preciso es "Refitted.txt".
  10. Abra el archivo Refitted.txt con Microsoft Excel y guárdelo como .xls para su posterior procesamiento. El archivo complementario 4B muestra un ejemplo de dicho archivo de resultados.
    NOTA: Para cada pocillo (organizado en filas), se proporcionan tres valores en las columnas que dan estimaciones del tiempo medio de muerte de la población de gusanos: "Crudo": informa el tiempo de intersección en la mitad máximo del pico de datos experimentales; "Instalación por lotes": indica el tiempo de intersección en la mitad como máximo de la curva de instalación por lotes; "Reajustado": informa el tiempo de intersección en la mitad máxima de la curva reajustada.
  11. Guarde el archivo en formato .xls como copia en un lugar seguro. De lo contrario, se correrá el riesgo de que los archivos se sobrescriban durante la próxima ejecución de la rutina LFASS.
    NOTA: Los resultados se pueden procesar posteriormente para gráficos o análisis estadísticos.

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Representative Results

Los ensayos LFASS proporcionan una detección robusta, de alto rendimiento y rápida de múltiples condiciones de prueba a la vez, como la detección de numerosos parámetros genéticos y de microbiota que contribuyen a la resistencia al estrés y al envejecimiento. Solo toma 2-3 semanas para que el experimento adquiera un extenso conjunto de datos de múltiples condiciones de prueba. Las poblaciones de gusanos adultos de tipo salvaje L4 + 36 h fueron expuestas a 42 °C de estrés térmico y 7% de estrés oxidativo inducido por t-BHP después de un cultivo de 36 h en 48 aislados microbianos intestinales durante 36 h. El ensayo se realizó cuatro veces, con cada condición replicada cuatro veces en cada ensayo. En todas las condiciones probadas, el tiempo medio de muerte varió entre 40-130 min para el ensayo de estrés térmico y entre 90-240 min para el ensayo de estrés oxidativo inducido por t-BHP. Los ensayos de estrés térmico en la edad adulta temprana generalmente muestran resultados más consistentes y menos variabilidad interdía e intradía que los ensayos de estrés oxidativo y son mejores predictores de la longevidad posterior30. La diferencia en el tiempo medio de muerte de los gusanos alimentados con diferentes dietas microbianas ejemplifica de manera concluyente cómo los comensales intestinales afectan la resistencia al estrés del huésped. La Figura 2 muestra los resultados típicos de 16 réplicas biológicas para gusanos salvajes Bristol N2 en dos aislados de microbiota intestinal de interés y la cepa estándar de laboratorio E. coli OP50.

Figure 2
Figura 2: Resultados representativos de ensayos pareados de resistencia al calor / estrés oxidativo de gusanos cultivados en dos aislados bacterianos y una cepa de control. (A) Ensayo de estrés por calor. Los gusanos de tipo salvaje se alimentaron durante 36 h con aislados bacterianos MYb11 (Pseudomonas lurida) o MYb115 (Pseudomonassp.) o bacterias de control OP50. MYb11 condujo a una mediana de tiempo de muerte significativamente más temprana (p < 0,001). (B) Ensayo de estrés oxidativo. Los gusanos de tipo salvaje se alimentaron durante 36 h con aislados bacterianos MYb11 o MYb115 o bacterias de control OP50. MYb11 condujo a una mediana significativamente más temprana del tiempo de muerte (p < 0,05). Se analizaron 120-150 gusanos en cuatro conjuntos de muestras, y cada experimento se realizó en cuadruplicado. Los pozos con datos de mala calidad o mal ajustados dieron lugar a valores faltantes. Las representaciones de diagramas de caja indican valores de pozo único, valores mínimos, medianos y máximos. *Indica significación estadística a p < 0,05 y ***p < 0,001, con ANOVA unidireccional. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Un
Parámetro Ajuste Comentario
Temperatura 25 °C
Excitación fluorescente 365 nm Ancho de banda de 10 nm
Emisión de fluorescencia 430 nm Ancho de banda de 20 nm
Número de flashes 8 flashes, tiempo de asentamiento de 1 ms
Ganar De 100 a 130 A ajustar en función de la muestra. Apunte a un valor de lectura de 2-5 k al inicio del ensayo
Tiempo de retraso 1 μs
Tiempo de integración 30 μs
Intervalo de tiempo de lectura Cada 2 min Dependiendo de la gravedad del estrés, la duración y el intervalo de tiempo pueden necesitar ajustes (8 h es suficiente al 7% t-BHP)
Duración 8-12h
Leer dirección Desde abajo
B
Parámetro Ajuste Comentario
Temperatura 42 °C
Excitación fluorescente 365 nm Ancho de banda de 10 nm
Emisión de fluorescencia 430 nm Ancho de banda de 20 nm
Número de flashes 8 flashes, tiempo de asentamiento de 1 ms
Ganar De 100 a 130 A ajustar en función de la muestra. Apunte a un valor de lectura de 2-5 k al inicio del ensayo
Tiempo de retraso 1 μs
Tiempo de integración 30 μs
Intervalo de tiempo de lectura Cada 2 min Dependiendo de la gravedad del estrés, la duración y el intervalo de tiempo pueden necesitar ajustes (6 h es suficiente a 42 ° C)
Duración 6-12h
Leer dirección Desde abajo

Tabla 1: Ajustes de ensayo de estrés oxidativo y térmico. Ejemplos de ajustes utilizados para ensayos de estrés oxidativo (A) y calor (B) en los lectores de placas de fluorescencia utilizados en este estudio.

Archivo complementario 1: Recetas de medios, búfer y cultivo. Composición de diferentes medios, tampones y cultivos utilizados en el presente estudio. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 2: Datos de fluorescencia sin procesar del lector de placas después de ser exportados y convertidos al formato Excel .xls. (A) El archivo de Excel muestra los datos de fluorescencia sin procesar para un ensayo de choque térmico. Los datos de fluorescencia sin procesar se muestran en un intervalo de tiempo de 2 minutos. (B) Se resalta la columna con "posición de pozo" en la placa de 384 pocillos, que se puede usar para etiquetar las cepas de gusanos y bacterias. (C) El archivo está etiquetado con cepas de gusanos y bacterias. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 3: Análisis LFASS utilizando Matlab. (A) Después de abrir la carpeta LFASS en Matlab, aparece una ventana de comandos. (B) "fitfolder" se escribe en la ventana de comandos para iniciar el programa, y se indica el nombre de la carpeta con el archivo a analizar. (C) Una vez que el programa encuentra el archivo excel de datos para su análisis, el usuario debe seguir las instrucciones en pantalla, proporcionando los diversos parámetros solicitados. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 4: Análisis de datos LFASS utilizando Matlab. (A) Un ejemplo de una curva ajustada a través del análisis de Matlab, donde la línea negra indica el punto de tiempo correspondiente al límite de tiempo anterior y la línea azul el límite de tiempo posterior para el ajuste de curva. La curva sigmoide ajustada se muestra en rojo. (B) El archivo de resultados generado por Matlab se abre en formato .xls. Los valores se resaltan y se muestran en formato numérico. La segunda columna proporciona el momento en que el valor de la curva de datos sin procesar supera por primera vez el 50% del valor máximo. La tercera columna proporciona el momento en que el valor de la curva ajustada es igual al 50% del valor máximo, según lo determinado durante el análisis de ajuste por lotes. La cuarta columna proporciona el momento en que el valor en la curva ajustada es igual al 50% del valor máximo después del análisis del lote y el reacondicionamiento final cuando sea necesario. La cuarta columna debería, por lo tanto, proporcionar el resultado más fiable. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla complementaria 1: Ejemplos de diseños experimentales de placas. (A) Diseño de placa de 96 pocillos para probar 47 aislados bacterianos diferentes de microbiota intestinal de gusanos en dos cepas de gusanos separadas, con OP50 vivo utilizado como control. Se requieren cuatro copias de esta placa para cada ensayo que se esté realizando. (B) Diseño de 384 pocillos para ensayos de calor o estrés oxidativo, correspondiente al ensayo anterior de placa de 96 pocillos en (A). Esta configuración permite realizar tetraplicados para cada condición, y cada cepa de gusano tiene su propio control OP50. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

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Discussion

C. elegans ofrece muchas ventajas para examinar rápidamente múltiples parámetros experimentales a la vez, debido a su pequeño tamaño, transparencia, rápido desarrollo, corta vida útil, bajo costo y facilidad de manejo. Su genoma, plan corporal, sistema nervioso, intestino y microbioma considerablemente más simples, pero lo suficientemente complejos y similares a los humanos, lo convierten en un poderoso modelo preclínico, donde se puede obtener una visión mecanicista mientras se prueba la eficacia o toxicidad bioactiva. A medida que crece el interés en desarrollar intervenciones microbianas para enfermedades 8,9,34,35, aprovechar tales modelos preclínicos para investigar rápidamente los probióticos es una opción atractiva con el potencial terapéutico en gran parte sin explotar y casi ilimitado de los microbios 34. El protocolo descrito aquí es adecuado para estudiar el impacto de las bacterias ambientales en la salud de C. elegans, pero se puede adaptar fácilmente para otros fines.

Versatilidad
Los diferentes "módulos" que forman esta canalización se pueden adaptar para que coincidan con los requisitos específicos del experimento o del laboratorio. Por ejemplo, los aislados bacterianos pueden ser sustituidos por mezclas bacterianas, mutantes bacterianos o bacterias productoras de ARNi, y la configuración se puede utilizar para detectar genes bacterianos involucrados en las interacciones huésped-microbio, detectar genes del huésped involucrados en la resistencia al estrés o estudiar el impacto de microbios individuales como parte de comunidades bacterianas definidas. Este método describe el cribado de varios aislados bacterianos en el fondo genético de un solo gusano. Sin embargo, el ensayo es escalable y se pueden estudiar múltiples genotipos de huésped y bacterias a la vez. Esto se puede combinar aún más con tratamientos farmacológicos diferenciales y / o regímenes dietéticos para obtener información sobre las interacciones gen-microbio gen-dieta del huésped.

El protocolo aún no se ha intentado en otras especies de nematodos, pero también debería ser directamente aplicable a C. remanei y C. briggsae, y puede aplicarse a especies de nematodos parásitos en etapa L3 que comparten características morfológicas, de tamaño y fluorescencia de muerte con C. elegans30. Finalmente, se pueden usar otros factores estresantes (juglona, paraquat, arseniato, otras temperaturas) dentro de la misma tubería para proporcionar información complementaria o confirmatoria.

Posibles desafíos
La inversión de tiempo hasta el día 12 para cultivar gusanos y bacterias antes de los ensayos es significativa, pero debido al rendimiento del enfoque, es superada con creces por la amplitud de los datos recopilados. Sin embargo, el cuidado en la planificación de tales ensayos es esencial para evitar perder tiempo repitiendo los pasos de preparación porque los materiales no son óptimos en el momento en que pueden comenzar los ensayos. Los principales problemas iniciales incluyen la contaminación de la muestra (gusanos o bacterias), las poblaciones de gusanos mal sincronizadas y el agotamiento de materiales (las poblaciones de gusanos comen a través de sus alimentos más rápido de lo esperado y realimentan o transfieren animales con más frecuencia de lo planeado).

Evitar contaminaciones
Debido a la escala y duración del protocolo, un problema potencial importante es la contaminación por hongos y bacterias, cuya ocurrencia ciertamente confundiría los resultados. La configuración ideal es, por lo tanto, un espacio de laboratorio dedicado con aire acondicionado y filtrado de aire sin flujo de aire directo sobre el banco experimental, utilizando consumibles estériles. Sin embargo, observar los procedimientos de limpieza regulares (descontaminar bancos antes y después del trabajo, limpiar cajas de platos y usar consumibles estériles) y trabajar con llama en un espacio contenido (evite pasillos, espacios cerca de puertas abiertas y ventanas) generalmente son suficientes para mantener un ambiente limpio. Si se producen contaminaciones leves antes de la preparación del huevo en el Paso 2.2.1., el procedimiento de blanqueamiento se encargará de ellas y el protocolo puede progresar según lo planeado. Por el contrario, las contaminaciones que afectan a la creciente población de gusanos antes de transferirse a las placas bacterianas de prueba significarán el final de ese intento, y el protocolo deberá reiniciarse desde el Paso 1. Las contaminaciones posteriores tenderán a afectar cepas bacterianas individuales o condiciones de prueba. Dependiendo de su extensión, puede valer la pena continuar o reiniciar el protocolo.

Sincronización de gusanos
Como la resistencia a los desafíos térmicos y oxidativos cambia cuando los gusanos se desarrollan y crecen, las condiciones de prueba que conducen a diferentes etapas de desarrollo en el momento en que se llevan a cabo los ensayos LFASS no se pueden comparar fácilmente. Es esencial producir poblaciones bien sincronizadas para los ensayos de punto final. Como los ensayos se realizan en gusanos recolectados a granel en etapas L4 o L4 + 48 h, en ausencia de un clasificador de gusanos u otro procedimiento de clasificación para recolectar gusanos perfectamente estadificados, las poblaciones de gusanos deben estar muy bien sincronizadas en L1. Debe garantizarse que las crías se mantengan fuera de los alimentos el tiempo suficiente para que todos los huevos vivos eclosionen antes de crecer la cohorte de ensayo (>15 h a 20 °C y >18 h a 15 °C). El genotipo puede afectar la propagación en el momento del desarrollo, que también se ve afectado por la temperatura. El crecimiento de las poblaciones de gusanos a 15 °C proporciona un mejor control sobre esto al tiempo que limita el impacto de las mutaciones sensibles a la temperatura durante la fase de expansión de la población de gusanos (especialmente cuando se trabaja con mutantes de señalización de insulina). La razón principal para estudiar los efectos de los microbios de L4 o L4 + 48 h es evitar el impacto en el desarrollo de una dieta diferente y estudiar el impacto de las bacterias intestinales vivas en lugar de su impacto en la dieta. Los gusanos cultivados en una etapa larvaria más temprana en diferentes aislados o mezclas bacterianas conducirán inevitablemente a tasas de desarrollo desiguales y una pérdida de sincronía.

Consecuencias de confiar en la fluorescencia azul
Ser capaz de identificar la muerte en ensayos LFASS sin la necesidad de seguimiento individual de gusanos o reactivos adicionales como Sytox green36, pero en su lugar explotar una señal endógena en un rango de fluorescencia que es poco probable que se superponga con los biomarcadores tradicionales de gusanos, es un claro beneficio. Sin embargo, sigue siendo fundamental garantizar que la fluorescencia de muerte del gusano se pueda detectar de manera consistente en muchas condiciones de prueba. Si bien el ensayo no se basa en la cuantificación de fluorescencia sino en su dinámica, los gusanos aún deben emitir suficiente fluorescencia para estimar el tiempo medio de muerte (TOD) con precisión. Como el ensayo no permite la resolución de la muerte de un solo gusano, las ráfagas de fluorescencia azul emitidas por los individuos moribundos deben tener suficiente superposición temporal para que la acumulación de fluorescencia dé un solo pico de fluorescencia de la población. Solo entonces se puede inferir con precisión la mediana de TODD. Esto significa que los gusanos incapaces de producir niveles suficientes de fluorescencia azul no se pueden utilizar en este protocolo, que incluye en particular algunos mutantes de la vía de quinurenina como tdo-2 y kynu-130,31, así como animales hambrientos. Por lo tanto, es importante asegurarse de que los gusanos se mantengan en condiciones repletas en todo momento. Esto puede ser un problema cuando se realizan cribas de ARNi impulsadas por HT115, ya que los céspedes HT115 en medio NGM suplementado con IPTG y antibióticos tienden a ser más delgados que los céspedes OP50. El monitoreo del suministro de alimentos de gusanos durante los días previos a los ensayos es, por lo tanto, crítico.

Otra consecuencia de la dinámica de la fluorescencia de la muerte es que cuanto más rápido sea el ensayo, mejor será la sensibilidad, ya que los gusanos de la misma población morirán más sincrónicamente y producirán un pico de fluorescencia de muerte de la población más definido. Por lo tanto, cuanto más largo sea el ensayo, mayor será el tamaño de la población necesaria para generar buenos picos de fluorescencia de muerte. Los mutantes con metabolismos bajos, como eat-2 y daf-230, también emitirán menos fluorescencia y requerirán números más altos por pocillo. Mientras que 10-15 gusanos de tipo salvaje por pocillo son suficientes para un ensayo de estrés térmico de 42 °C que los mata a todos dentro de las 4 h, se requiere casi el doble de esa cantidad para los gusanos daf-2 (e1370) en el mismo ensayo, y se requieren >100 gusanos de tipo salvaje para un ensayo que mataría gusanos durante un período de 24 horas.

En el contexto de los aislados bacterianos ambientales, el metabolismo microbiano diferente también puede afectar diferencialmente la vía de quinurenina que produce los compuestos fluorescentes azules. Por lo tanto, algunos aislados bacterianos conducen a una fluorescencia de muerte máxima más baja, mientras que otros conducen a picos más altos que OP50. Como resultado, uno necesita apuntar a suficientes gusanos por pozo para acomodar todas las eventualidades.

Por último, es esencial optimizar correctamente los parámetros de lectura de placas. Este protocolo cubre el ajuste de los parámetros de excitación y emisión de fluorescencia y la profundidad a la que idealmente se deben realizar las lecturas. Con una posible amplia gama de rendimientos de fluorescencia de muerte en múltiples condiciones en un solo ensayo, es importante asegurarse de que se detecten señales débiles, pero que los detectores nunca estén saturados. Los instrumentos con detectores que cuentan con altos rangos dinámicos, por lo tanto, funcionarán mejor.

Limitaciones del método
El método descrito aquí es robusto y flexible y se puede adaptar fácilmente a diversas condiciones. Para mayor comodidad, las restricciones y limitaciones clave se mencionan a lo largo del protocolo donde entran en juego. En resumen, la dependencia de la fluorescencia de la muerte como un marcador endógeno de muerte es tanto una fortaleza como una limitación de estos ensayos.

Bajo un número limitado de condiciones dietéticas específicas (dietas bajas en triptófano o inanición) y en condiciones mutantes que afectan el metabolismo del triptófano (es decir, tdo-2, kynu-1, algunos alelos daf-2 ), la fluorescencia de muerte (DF) puede estar fuertemente atenuada, en la medida en que la fluorescencia máxima es difícil de detectar y las estimaciones de TOD son menos confiables.

Por el contrario, algunos microbios pueden producir compuestos fluorescentes azules cuyos espectros de excitación y emisión se superponen con señales de radiofrecuencia (es decir, Enterococcus faecalis). Si bien su dinámica difiere del DF y a menudo se puede desacoplar, pueden confundir el análisis.

A continuación, los ensayos se basan en la acumulación de señales de gusanos individuales moribundos, pero el DF se apaga con el tiempo. Por lo tanto, si los gusanos mueren demasiado separados, los picos de fluorescencia individuales no producirán un pico de población, impidiendo la medición de un TOD medio de población. Cuanto más lento sea el ensayo matando, mayor será el número de gusanos requerido en cada pocillo30. Por lo tanto, 10-15 gusanos adultos por pocillo son suficientes para un ensayo de estrés por calor de 42 ° C que mata a la mitad de los gusanos en 2 h, pero se necesitan más de 70 gusanos por pocillo para un ensayo bacteriano de eliminación rápida que mata a la mitad de los gusanos en 12 h.

Por último, los usuarios necesitan acceso a un lector de placas para realizar tales ensayos que pueden realizar mediciones de fluorescencia de lapso de tiempo en las longitudes de onda requeridas. Las longitudes de onda de excitación y emisión también pueden variar ligeramente entre sistemas y variar entre especies de nematodos, como se mencionó30.

Comparación y complementariedad con otros ensayos de C. elegans
En los últimos 10-15 años, se han desarrollado muchos ensayos para evaluar la salud de C. elegans en múltiples condiciones a la vez, empleando una diversidad de estrategias y ofreciendo diferentes niveles de profundidad y amplitud de datos 30,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45, 46. En particular, se han desarrollado varios ensayos potentes para monitorear automáticamente muchos gusanos a la vez en medios sólidos a lo largo de su vida útil, utilizando matrices de cámaras y escáneres con algoritmos de seguimiento de múltiples gusanos y / o matrices de gusanos individuales microfabricadas 37,38,39,40,41,43 . En el contexto de las interacciones huésped-microbio, enfoques similares al protocolo descrito anteriormente, pero sin depender de DF, también han permitido el cribado de ARNi de todo el genoma de los genes de C. elegans involucrados en infecciones bacterianas46,47,48. Sin embargo, estos ensayos de alto rendimiento se basan en el manejo de gusanos en líquido en todo momento, lo que no es deseable cuando se trata de múltiples tipos de bacterias a la vez debido a los mayores riesgos de contaminación cruzada y porque el cultivo líquido afecta el metabolismo microbiano y del huésped. Por lo tanto, en los ensayos tradicionales de infección, estrés, salud y longevidad, C. elegans se mantiene y envejece en céspedes bacterianos cultivados en medios sólidos. Como también es el caso en este protocolo, los resultados de las pantallas realizadas con esta canalización pueden relacionarse más fácilmente y predecir el resultado de los experimentos confirmatorios posteriores con golpes de pantalla.

Las ventajas del enfoque LFASS en sí mismo han sido bien cubiertas en la Referencia30. En comparación con configuraciones de imágenes continuas más elaboradas que podrían reutilizarse para estudios similares, LFASS es más barato (siempre que la mediana de TOD sea la única lectura necesaria), y su simplicidad significa que no requiere mucha capacidad técnica o equipo especializado. LFASS se trata principalmente de amplitud sobre profundidad. Los datos de LFASS no proporcionan información aparte del tiempo medio de muerte de una población de gusanos y una lectura indirecta de la salida de una vía de quinurenina. Por el contrario, con un rendimiento más bajo pero aún decente, los rasgos complejos se pueden medir a partir de otros ensayos 37,38,39,40,41,43 durante toda la vida útil de los gusanos, lo que los convierte en excelentes enfoques posteriores para estudiar los golpes de una pantalla LFASS.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos al CGC Minnesota (Madison, EUA, NIH - P40 OD010440) por proporcionar cepas de gusanos y OP50 y al Pr. Hinrich Schulenburg (CAU, Kiel, Alemania) por proporcionar todos los aislados microbianos ambientales representados aquí. Este trabajo fue financiado por una subvención UKRI-BBSRC a AB (BB / S017127 / 1). JM está financiado por una beca de doctorado FHM de la Universidad de Lancaster.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 cm diameter plates (Non-vented) Fisher Scientific 10720052 Venting is not necessary for bacterial cultures
15 cm diameter plates (Vented) Fisher Scientific 168381
384-well black, transparent flat bottom plates Corning 3712 or 3762 Not essential to be sterile for fast stress assays
6 cm diameter plates (Vented) Fisher Scientific 150288 Venting is necessary for worm cultures to avoid hypoxia
96-well transparent plates (Biolite) Thermo 130188
Agar (<4% ash) Sigma-Aldrich 102218041 Good quality agar is important for the structural integrity of the culture media, to avoid worm burrowing
Agarose Fisher Scientific BP1356
Avanti Centrifuge J-26 XP Beckman coulter
Bleach Honeywell 425044
Calcium chloride Sigma-Aldrich C5080
Centrifuge 5415 R Eppendorf
Centrifuge 5810 R Eppendorf
Cholesterol Sigma-Aldrich C8667
LB agar Difco 240110
LB broth Invitrogen 12795084
LoBind tips VWR 732-1488 Lo-bind reduce worm loss during transfers
LoBind tubes Eppendorf 22431081
Magnesium sulfate Fisher Scientific M/1100/53
Plate reader- infinite M nano+ Tecan Monochromator setup enables fluorescence tuning but adequate filter-based setups may be used
Plate reader- Spark Tecan
Potassium phosphate monobasic Honeywell P0662
Sodium chloride Sigma-Aldrich S/3160/63
Stereomicroscope setup with transillumination base Leica MZ6, or M80 Magnification from 0.6-0.8x up to 40-60x is necessary, as is a good quality transillumination base with a deformable, titable or slidable mirror to adjust contrast
t-BHP (tert-Butyl hydroperoxide) Sigma-Aldrich 458139
Transparent adhesive seals Nunc Fisher Scientific 101706871 It is important that it is transparent and that it can tolerate the temperatures involved in the assays.
Tryptophan Sigma-Aldrich 1278-7099
Yeast extract Fisher Scientific BP1422

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Biología Número 182
Detección de alto rendimiento de aislados microbianos con impacto en <em>la salud de Caenorhabditis elegans</em>
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Ali, I., Martin, J.,… More

Ali, I., Martin, J., Zárate-Potes, A., Benedetto, A. High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health. J. Vis. Exp. (182), e63860, doi:10.3791/63860 (2022).

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