Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Screening med hög genomströmning av mikrobiella isolat med inverkan på Caenorhabditis elegans hälsa

Published: April 28, 2022 doi: 10.3791/63860
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Division of Biomedical and Life Sciences, Lancaster University
* These authors contributed equally

Summary

Tarmmikrober kan positivt eller negativt påverka värdens hälsa via specifika eller konserverade mekanismer. Caenorhabditis elegans är en bekväm plattform för att screena för sådana mikrober. Detta protokoll beskriver screening med hög genomströmning av 48 bakterieisolat för påverkan på nematodstressresistens, som används som en proxy för maskhälsa.

Abstract

Med sin lilla storlek, korta livslängd och enkla genetik erbjuder Caenorhabditis elegans en bekväm plattform för att studera effekterna av mikrobiella isolat på värdfysiologin. Det fluorescerar också i blått när det dör, vilket ger ett bekvämt sätt att hitta döden. Denna egenskap har utnyttjats för att utveckla etikettfria C. elegans survival assays (LFASS) med hög genomströmning. Dessa involverar time-lapse fluorescensregistrering av maskpopulationer i multiwellplattor, från vilka populationens mediantid för döden kan härledas. Denna studie antar LFASS-metoden för att screena flera mikrobiella isolat samtidigt för effekterna på C. elegans mottaglighet för svår värme och oxidativa påfrestningar. Sådan mikrobiell screening pipeline, som särskilt kan användas för att prescreena probiotika, med hjälp av svår stressresistens som en proxy för värd hälsa rapporteras här. Protokollet beskriver hur man odlar både C. elegans tarmmikrobiota-isolatsamlingar och synkrona maskpopulationer i multiwell-arrays innan de kombineras för analyserna. Exemplet som tillhandahålls omfattar testning av 47 bakterieisolat och en kontrollstam på två maskstammar, i två stressanalyser parallellt. Tillvägagångssättspipelinen är dock lätt skalbar och tillämplig på screening av många andra metoder. Således ger det en mångsidig inställning för att snabbt kartlägga ett multiparametriskt landskap av biologiska och biokemiska förhållanden som påverkar C. elegans hälsa.

Introduction

Människokroppen har uppskattningsvis 10-100 biljoner levande mikrobiella celler (bakterier, archaea-svampar), som främst finns i tarm-, hud- och slemhinnemiljöerna1. I ett hälsosamt tillstånd ger dessa fördelar för sin värd, inklusive vitaminproduktion, mognad av immunsystemet, stimulering av medfödda och adaptiva immunsvar mot patogener, reglering av fettmetabolism, modulering av stressreaktioner och mer, med inverkan på tillväxt och utveckling, sjukdomsdebut och åldrande 2,3,4,5 . Tarmmikrobiotan utvecklas också avsevärt under hela livet. Den mest drastiska utvecklingen sker under spädbarn och tidig barndom6, men betydande förändringar sker också med åldern, inklusive en minskning av Bifidobacterium överflöd och en ökning av Clostridium, Lactobacillus, Enterobacteriaceae, och Enterococcus arter7. Livsstil kan ytterligare förändra tarmens mikrobiella sammansättning som leder till dysbios (förlust av fördelaktiga bakterier, överväxt av opportunistiska bakterier), vilket resulterar i olika patologier som inflammatorisk tarmsjukdom, diabetes och fetma5, men också bidrar till Alzheimers och Parkinsons sjukdomar 8,9,10,11.

Denna insikt har kritiskt bidragit till att förfina begreppet tarm-hjärnaxeln (GBA), där interaktioner mellan tarmfysiologi (nu inklusive mikroberna i den) och nervsystemet anses vara den viktigaste regulatorn för djurmetabolism och fysiologiska funktioner12. Emellertid, den exakta rollen av mikrobiota i tarm-hjärna signalering och de associerade verkningsmekanismerna är långt ifrån helt förstådd13. Med tarmmikrobiota som en viktig determinant för hälsosamt åldrande har hur bakterier modulerar åldringsprocessen blivit föremål för intensiv forskning och kontrovers 6,14,15.

Med demonstrationen att rundmask Caenorhabditis elegans är värd för en bonafide tarmmikrobiota dominerad-som i andra arter-av Bacteroidetes, Firmicutes och Actinobacteria 16,17,18,19,20, dess snabba uppgång som en experimentell plattform för att studera värd-tarm kommensala interaktioner 21,22,23,24 ,25,26 har avsevärt utökat vår utredningsarsenal26,27,28,29. I synnerhet kan experimentella metoder med hög genomströmning tillgängliga för C. elegans för att studera gen-diet, gen-läkemedel, gen-patogen, etc. interaktioner, anpassas för att snabbt utforska hur bakterieisolat och cocktails påverkar C. elegans hälsa och åldrande.

Detta protokoll beskriver en experimentell pipeline för att på en gång screena arrays av bakterieisolat eller blandningar som sätts i multiwell plattor för effekter på C. elegans stressresistens som en proxy för hälsa, som kan användas för att identifiera probiotika. Den beskriver hur man odlar stora maskpopulationer och hanterar bakteriella arrayer i 96- och 384-brunnsplattformat innan man bearbetar maskar för automatiserad stressmotståndsanalys med hjälp av en fluorescensplattläsare (figur 1). Tillvägagångssättet bygger på etikettfria automatiserade överlevnadsanalyser (LFASS)30 som utnyttjar fenomenet dödsfluorescens31, där döende maskar producerar en explosion av blå fluorescens som kan användas för att fastställa dödstiden. Blå fluorescens avges av glukosylestrar av anthranilsyra lagrade i C. elegans tarmgranulat (en typ av lysosomrelaterad organell), som spricker när en nekrotisk kaskad utlöses i masktarmen vid döden31.

Figure 1
Figur 1: Experimentellt arbetsflöde för screening med hög genomströmning av bakterieisolat med inverkan på C. elegans motståndskraft mot stress . (A) Tidslinje för underhåll och analys av mask och bakterier. (B) Installation och hantering av bakterieplattor med 96 brunnar. (C) Installation av maskplattor med 384 brunnar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De två C. elegans-stammarna som användes parallellt för den aktuella studien var Bristol N2 vild typ och HT1890: daf-16 (mgDf50), som växer i liknande takt. Protokollet kan dock replikeras med valfri kombination av två stammar som har liknande tillväxthastigheter. Observera att vid testning av andra stammar parallellt (till exempel vilda och långsamt växande daf-2-mutanter ) måste olika tillväxthastigheter beaktas, och följaktligen måste protokollet justeras. Tidsskalorna och mängderna av maskar och bakterier i följande protokoll är optimerade för parallell testning av 48 bakterieisolat på två maskstammar i två LFASS-analyser i tetraplikater. Justeringar kommer att behövas om fler villkor ska testas parallellt. Escherichia coli OP50-bakteriestammen erhölls från Caenorhabditis Genetics Center (CGC), University of Minnesota. De 48 bakterieisolaten erhölls från Schulenburg-laboratoriet och upprätthölls på LB-agar.

1. C. elegans odling på OP50 (dag 1 - 8)

OBS: Det nuvarande tillvägagångssättet syftar till att odla C. elegans hermafroditer på ett fast medium i alla stadier och undviker onödiga kostförändringar (dvs. med hjälp av alternativa snabbare växande E. coli-stammar som NA22 eller rikare tillväxtmedier som äggplattor) för att förbli så nära som möjligt till standardtillväxtförhållandena32,33 som fortfarande används i stor utsträckning. Masktillväxttemperaturen (här inställd på 15 °C) beror på vilken eller vilka C. elegans-stammar som används och kan behöva justeras (t.ex. för att undvika eller utlösa uttrycket av en temperaturkänslig fenotyp eller biomarkör). För information om maskodling, se referens33.

  1. Bered åtta NGM-plattor med en diameter på 6 cm (10 ml tillväxtmedieagar för nematod, NGM, tilläggsfil 1)32,33 per maskstam och låt dem torka i 1 dag vid rumstemperatur.
  2. Förbered en mättad flytande kultur av E. coli OP50-bakterier genom att så en enda bakterieklon från en nyodlad lysogenibuljongagar (LB-agar, tilläggsfil 1) i 25 ml OP50-medium (tilläggsfil 1) i ett 50 ml koniskt rör. Odla kulturen över natten vid 37 °C i en shakerinkubator.
  3. Inokulera de åtta 6 cm NGM-plattorna per stam med 100 μL mättad vätskekultur av E. coli OP50 per platta och håll plattorna vid 20 °C i 2 dagar före användning.
  4. Skär och överför med hjälp av en skalpell en fyrkantig agarbit på 0,5 cm med maskar från en nyligen utsvulten NGM-platta till var och en av de åtta inokulerade 6 cm NGM-plattorna och inkubera dessa plattor vid 20 ° C i 3 dagar (eller tills maskarna avslutar maten).
  5. Bered fem 15 cm NGM-plattor per maskstam (30 ml NGM-medium per platta) och inokulera med 3 ml OP50. Låt plattorna torka innan de inkuberas vid 37 °C över natten. Håll plattorna vid 20 °C tills de används i senare steg.
  6. Använd en P-1000-pipett och tillsätt upp till 3 ml steril M9-buffert (tilläggsfil 1) till 6 cm NGM-plattorna (steg 1.1.) för att återsuspendera maskarna och samla masklösningen från alla åtta plattorna per stam i ett enda 15 ml koniskt rör.
    1. Centrifugera vid 142 x g i 2 minuter vid 4 °C. Ta försiktigt bort supernatanten med en P-5000-pipett eller en vattenpump utrustad med en steril Pasteur-pipett eller spets. Tillsätt 10 ml steril M9-buffert för att tvätta maskpelleten. Upprepa 2x.
    2. Ta bort supernatanten (så mycket som möjligt) och överför maskarna till en 15 cm OP50 inokulerad NGM-platta (steg 1.5.) med en pipett. Tillsätt 0,5 ml koncentrerad OP50-kultur.
    3. För att göra koncentrerad OP50, inokulera var och en av fyra 1 L flaskor LB med 2 ml OP50 startkultur (beredd i steg 1.2.) och växa i en skakningsinkubator i 6 timmar vid 37 ° C och 160 x g. Pelletera bakterierna vid 3057 x g och 20 °C i 15 min. Kassera supernatanten, återsuspendera bakteriepelletsen med 6 ml OP50-medium och samla i ett sterilt 50 ml koniskt rör.
      OBS: Bakterier kan förvaras vid 4 °C i upp till 1 vecka.
  7. Odla varje maskstam på en NGM-platta med en diameter på 15 cm i 3-4 dagar vid 15 °C genom att mata maskarna med 0,5 ml koncentrerad OP50 dagligen.
    1. När maskarna nästan har avslutat maten, samla och tvätta i M9-buffert (steg 1.6.1), överför varje maskstamkultur till två 15 cm NGM-plattor (steg 1.5.) och föröka maskar vid 20 ° C tills ~ 95% av befolkningen är gravida vuxna (det tar cirka 24 timmar för vild typ Bristol N2).
      OBS: Gravida vuxna kännetecknas av närvaron av ägg i masken, och den ideala plattan bör också ha ett överflöd av oskadade ägg som läggs på tallriken utan för många larver33.

2. Underhåll av tarmmikrobiotaisolatsamlingar (dag 9)

  1. Stryk de 48 bakterieisolaten på enskilda 6 cm LB agarplattor och väx i 48 timmar vid 20 °C.
    OBS: Bakterier kan odlas vid 25 ° C i 24-36 timmar om det behövs tidigare, men den längre tillväxten på 20 ° C gör det möjligt att upptäcka potentiella föroreningar.
  2. Synkronisera ett stort antal C. elegans.
    1. Blek vuxna maskar genom att följa standardmetoden för äggberedning33 och överför äggen till två osådda 15 cm NGM-plattor i 24 timmar vid 15 °C så att alla L1-larver kan kläckas och växa synkront i de följande stegen.
      VARNING: Var försiktig när du hanterar blekmedelslösningar.

3. Växande stora C. elegans-kulturer (dag 10)

  1. När de har kläckts samlar du L1-larverna (från steg 2.2.1) i 3-4 ml M9 i ett rent koniskt 15 ml rör. Pipettera fyra 10 μL droppar masklösning på en bild eller en tallrik och räkna antalet maskar i varje droppe under ett stereomikroskop vid 16x förstoring. Bestäm maskkoncentrationen av lösningen genom att medelvärdet av antalet larver från alla droppar masklösning. Multiplicera detta värde med den vänstra volymen och uppskatta det totala maskantalet för varje stam.
    OBS: 46 000-50 000 L1 larver per stam krävs i detta skede för att senare fylla en 384-brunnsplatta eller två halvplattor.
    1. För varje stam, överför alla L1-larver till två 15 cm NGM-plattor (23 000-25 000 L1 per platta) som tidigare inokulerats med 3 ml OP50 (steg 1.5.) och omsådds med 0,5 ml koncentrerad OP50.
  2. Inkubera vid 15 °C och fyll på med 0,5 ml koncentrerad OP50 dagligen efter behov tills maskarna når L4-stadiet.
    OBS: L4-stadiet kännetecknas av en något mörkare tarm och en halvskiva eller halvmåneformad vit fläck där vulva så småningom kommer att bilda32,33.
  3. Förbered 96-brunns NGM-agarosplattor enligt stegen nedan.
    1. Förbered åtta 96-brunns NGM-agarosplattor genom att fylla varje brunn med 125 μL NGM-agaros (fyra plattor per analys).
      OBS: Det rekommenderas att plåta några extra plattor om några blir förorenade i de efterföljande stegen. Två plattläsare kommer att krävas för att köra analyser parallellt, men de kan också köras successivt med början med värmespänningsanalysen eftersom den kan köras i så lite som 6 timmar. För dessa plattor ersätts <4% askagar med agar med agaros (se materialtabell), vilket möjliggör långsammare och jämnare torkning över NGM-pluggarna och minskar maskgrävning för bättre återhämtning.
    2. Se till att brunnarna är fyllda jämnt och bubbelfria. Använd ett värmeblock inställt på 70 °C (med långsam värmeöverföring genom plasten på multiwellplattan kan NGM-agarosen bara värmas upp till cirka 55-60 °C) för att förhindra att blandningen stelnar under processen. För att ta bort bubblor i brunnar, använd en steril flamuppvärmd nål.
    3. Låt plattorna med 96 brunnar ställas in i rumstemperatur i en steril miljö innan de inverteras (locket nedåt för att förhindra kondens) och förvara vid 4 °C i en ren låda tills det behövs.
  4. På dag 11, kontrollera maskarna från steg 3.2., se till att inga föroreningar har uppstått och maskarna är fortfarande fyllda.
  5. På dag 12, kontrollera maskarna från steg 3.1., se till att inga föroreningar har uppstått och maskarna fortfarande är fyllda. Kontrollera också maskarnas utvecklingsstadium.
    OBS: Kön / stammen och maskens utvecklingsstadium, såsom L4 eller L4 + 24 h maskar som används, är beroende av de behandlingar maskarna utsätts för. Här utsattes hermafroditer av vild typ för bakterieisolat från L4 i 36 timmar.

4. Förbereda tarmmikrobiotaisolatsamlingar för återmatning av maskar

  1. Övervaka bakterietillväxt på LB-agarplattorna från steg 2.1. och fortsätta att inkubera vid 20 °C.
    OBS: Även om det inte är idealiskt, om vissa kloner inte växer eller avslöjar föroreningar, kan bakterier strykas om från rena lager på 6 cm LB-plattor och odlas vid 25-28 ° C i 24 timmar för att vara redo för experimentet.
  2. Definiera en 96-brunns matrislayout för bakteriesamlingen som testas, vilket underlättar systematisk plattsådd och dataanalys i de efterföljande stegen (kompletterande tabell 1).
  3. Samla bakteriemassan från varje 6 cm bakterieplatta (steg 4.1) och överför den till ett märkt 1,5 ml mikrocentrifugrör som innehåller 1 ml M9-buffert. Utför detta genom att använda antingen en steril plastögla med en diameter på 2 mm eller en metallögla med en diameter på 5 mm. Sterilisera metallslingan mellan bakteriestammar genom att doppa i 100% etanol, flamma och kyla ner i 5 s.
  4. Vortex mikrocentrifugrören tills bakteriepelletsen är helt resuspenderade (beroende på bakteriestammen kan detta ta ~ 1-10 s).
  5. Snurra ner vid 9 300 x g i 5 minuter vid rumstemperatur, ta bort 700 μL supernatant och återsuspendera bakteriepelleten genom virvel.
  6. Överför 200 μl av varje bakteriesuspension till en enda brunn i en tom steril 96-brunnsplatta enligt den layout som anges i steg 4.2.
  7. Inokulera åtta 96-brunns NGM-agarosplattor (beredda i steg 3.3) med 10 μl bakterielösning med hjälp av en flerkanalig pipett och inkubera med locket på vid 25 °C i 24 timmar. Försegla inte plattorna för att möjliggöra platttorkning och bakteriell aerob tillväxt och för att undvika överskott av kondens.
  8. Försegla den 96-brunns upphängningsplatta som förberetts i steg 4.6. med ren självhäftande tätningsfilm (se materialtabell) och förvaras vid 15 °C i upp till 5 dagar. Detta kommer att användas för återmatning av maskar efter behov.

5. LFASS värmechock och oxidativ analysinställning (dag 13 - 14)

  1. Titta på plattorna från steg 3.5., bedöma maskarnas utvecklingsstadium. När >90% av maskarna har nått L434, samla maskarna i upp till 10 ml steril M9-lösning i 15 ml koniska rör.
  2. Tvätta maskarna i stor utsträckning (minst 4x) genom att snurra ner vid 142 x g i 2 min vid 4 °C, ta bort supernatanten och tillsätt 10 ml färsk steril M9 mellan varje tvätt för att bli av med OP50-bakterier. Återsuspendera maskpelleten i 10 ml M9.
  3. Överför 50 μl masklösning till ett lågtådig ytbindningsrör (se materialförteckning) innehållande 950 μl M9. Efter att ha blandat rörinnehållet försiktigt för att undvika masksedimentering, använd snabbt en fuktad lågbindande pipettspets för att överföra 3-4 separata 10 μL droppar på en glasskiva eller en NGM-platta och räkna masknummer under ett stereomikroskop (se materialtabell) med 16x förstoring. Medelvärdet av antalet från 3-4 droppar och bestäm antalet maskar per mikroliter i masklösningen (se steg 3.1.).
  4. Justera maskkoncentrationen i 10 ml röret för att nå ~ 120 maskar i 8 μl. Om lösningen beretts i steg 5.2. är inte tillräckligt koncentrerad, snurra maskarna ner och ta bort M9 i enlighet därmed för att nå 120 maskar per 8 μl.
  5. Överför 8 μL masklösning (~ 120 maskar) till var och en av brunnarna i de åtta 96-brunns NGM-agarosplattorna från steg 4.7., med hjälp av en flerkanalig pipet eller en upprepad pipet. Se till att använda tips om låg retention för att begränsa maskförlust. Det kan också vara nödvändigt att klippa spetsändarna för att göra det möjligt för stora vuxna maskar att begränsa mekanisk stress på vuxna maskar.
    OBS: Analysen kräver minst 30 levande friska maskar för att fungera tillförlitligt men fungerar bäst med cirka 100 maskar per brunn.
  6. Inkubera mask- och bakteriesådda 96-brunns NGM-agarosplattor vid 25 °C i 36 timmar.
  7. Kontrollera plattorna mellan 12-24 timmar, se till att maskarna förblir fyllda hela tiden. Om återmatning krävs, återsuspendera bakterierna i den 96-brunns bakteriella matrisplattan som lagras vid 15 ° C i steg 4.8., och tillsätt upp till 10 μL av motsvarande bakterielösning till 96-brunns NGM-agarosplattorna där maskar riskerar att svälta före slutet av inkubationsperioden på 36 timmar (svältmaskar kommer att ge mycket olika resultat, så det här är väldigt viktigt).
    OBS: Följande steg måste genomföras på dag 15. Innan analysen påbörjas kan det vara nödvändigt att optimera läshöjden. Den optimala avläsningen uppnås 20-50 μm över brunnens botten. Detta kommer att bero på modellen för plattläsaren. Vissa erbjuder möjligheten till en Z-skanning, medan andra tillåter manuell höjdinmatning. Ställ in den optimala höjden på den nivå där den högsta blå fluorescenssignalen (365 nm / 430 nm) detekteras. Vissa plattläsare kan fungera i en fast höjd som är optimerad för vidhäftande cellanalyser och kanske inte är idealiska för LFASS-analyser.
  8. Efter 36 timmar, fördela 30 μL M9 i varje brunn på 96-brunnsplattan.
    OBS: För termiska spänningsanalyser måste plattläsaren ha nått den önskade temperaturen för att utföra analysen och kan behöva slås på i förväg. Det nuvarande protokollet använder 42 °C för att maximera dödingshastigheten, men tillvägagångssättet gäller andra temperaturer över 30 °C.
  9. Överför maskar (cirka 20 μL) till 384-brunnsplattan enligt inställda layouter, med hjälp av tips med låg retention (överväg att klippa av spetsarnas ände för att tillåta stora maskar att minska mekanisk stress för vuxna maskar).
    OBS: För den aktuella studien används två olika plattläsarinställningar för de två analyser som beskrivs här (termisk spänning och oxidativ spänning), och därför får prover avsedda för dessa två analyser inte pläteras i samma 384-brunnsplatta.
  10. Se till att plattläsarna är korrekt inställda (tabell 1).
  11. Fyll på 384-brunnsplattorna med mer M9, med sikte på en slutlig volym på 60 μL per brunn. För termisk spänningsanalys, tillsätt 40 μL M9, och för t-BHP-inducerad oxidativ spänning, tillsätt 34 μl M9 i 6 μl t-BHP (se Materialtabell).
    1. Starta analysen inom 2 minuter efter tillsats av t-BHP (helst måste alla maskar utsättas för t-BHP samtidigt, analystidsupplösningen är 2 min). Om det inte är möjligt, använd en timer för att uppskatta den tid som spenderas på att pipettera t-BHP innan analysen börjar för att möjliggöra senare justering av mediantiden för dödsfall.
  12. Stäng plattorna med sitt genomskinliga lock. Försegla kanterna på 384-brunnsplattorna med maskeringstejp (tejpning över plattan och locket), så att tejpen inte går över locket eller under plattan. Slit tejpen mellan lock och platta med jämna mellanrum med hjälp av en skalpell för att möjliggöra luftutbyte samtidigt som avdunstningen minimeras under analysen.
  13. Sätt i plattan i plattläsaren (se Materialförteckning) och starta körningen. Sikta på att excitera vid 365 nm och detektera utsläpp vid 435 nm var 2: e minut i 6-12 timmar (tabell 1).
    OBS: Vanligtvis räcker 6 timmar för 42 ° C värmespänningsanalyser och 8 h för 7% t-BHP oxidativa spänningsanalyser.

6. Datahantering med plattläsare

  1. Spara råfluorescensdata från plattläsaren som komma- eller tabbavgränsade .txt, .csv eller .xls /.xlsx-format och konvertera sedan till xls /.xlsx-format. Beroende på dataformatet omorganiserar du dem så att de matchar den Excel-arklayout som behövs för LFASS-analys. Följ de detaljerade instruktionerna i referens30.
    OBS: Medan data kan analyseras manuellt, normalisera varje tidsserie och leta efter den tid då dödsfluorescensen når hälften maximalt, kan automatiserad analys utföras i Matlab som kör LFASS-rutinen30.
  2. Ladda ner och installera Matlab (version 2014a eller senare) och LFASS-programvarupaketet från https://github.com/ABA80/LFASS. Följ riktlinjerna och anteckningarna i den.
    OBS: Figur 1C ger en kort beskrivning av tillvägagångssättet. Matlab krävs för att köra LFASS-rutinen. Alternativt kan Matlab-koden översättas till Oracle, förutom monteringsfunktionen, som är proprietär. Nya utjämnings- och sigmoidfunktioner kan skrivas om för att möjliggöra användning i en helt öppen källkodsplattform.
  3. Mellan LFASS-analyser flyttar du data och resultat till en ny plats eftersom LFASS-analysen bearbetar alla filer i datamappen och skriver över filer i mappen Resultat.

7. Inspektion av uppgifter

  1. Öppna excelfilen och märk raderna enligt brunnspositionen på 384-brunnsplattan. Tilläggsfil 2 visar ett exempel på excel-filen för de råa fluorescensdata som genereras för värmechockanalysen. Använd brunnspositionen på 384-brunnsplattan för att märka mask- och bakteriestammarna.
  2. Inför Matlab-analysen, inspektera visuellt data i excel och plotta fluorescensintensitet över tid för en representativ brunn. Beroende på vilken plattläsare som används kan data vara bullriga men bör visa en tydlig topp. I synnerhet:
    1. Bestäm ett fluorescensvärde under vilket en topp inte skulle skilja sig avsevärt från buller (att fastställa ett sådant tröskelvärde i LFASS kommer att påskynda analysen genom att utesluta tomma brunnar).
    2. Observera den tidigaste tidpunkten då fluorescensfluktuationer dämpas innan de stiger (djur kan slå kraftigt i upp till 30 minuter, vilket leder till snabbt fluktuerande blå fluorescensavläsningar).
      OBS: Topppassningen kan förbättras genom att utesluta dessa tidiga tidpunkter från kurvmonteringsfönstret.
    3. Notera de tidpunkter mellan vilka minimala och maximala fluorescensvärden förväntas falla (titta på flera brunnar för att identifiera dessa intervall) eftersom de kommer att användas för kurvpassning.
    4. Kontrollera om amplituderna för fluorescenstopparna varierar avsevärt mellan brunnarna, normalisera data före ytterligare analys med följande formel:
      Normaliserad fluorescensbrunn n (t) = (Fluorescensbrunnn [t] - minsta fluorescensbrunn [Dt]) / (maximal fluorescensbrunn [Dt] - minsta fluorescensbrunn [Dt])
      där "n" är det aktuella brunnsnumret, "t" är tidpunkten och "Dt" är serien av tidpunkter för analysen.

8. Behandling av LFASS-data

OBS: Närmare uppgifter lämnas i https://github.com/ABA80/LFASS och i det kompletterande materialet i referens30.

  1. Skapa två undermappar i LFASS-mappen, en för data som ska analyseras och en för resultat, till exempel "mina data" och "resultat".
  2. Kopiera analysen excel-datafilen till LFASS-undermappen "mina data" efter datainspektion.
  3. Starta MATLAB, navigera till LFASS-mappen , skriv och kör fitfolder i kommandofönstret (Tilläggsfil 3). Följ sedan instruktionerna på skärmen.
  4. Efter att ha skrivit in "fitfolder" ber systemet om namnet på mappen där Excel-filen finns, till exempel "mina data". Skriv in namnet på din datamapp (i det här exemplet "mina data").
  5. Följ instruktionerna på skärmen och ange de olika parametrarna som begärs.
    1. Ange "2" för tidsintervallet mellan successiva mätningar i det aktuella protokollet (genom att ange detta kan resultaten uttryckas i minuter istället för tidpunktsenheter).
      OBS: Tidsintervallet kan modifieras för att utföra fluorescensmätningar mer eller mindre ofta (för att minska eller öka tidsupplösningen) och även beroende på plattläsarfunktionerna (dvs. tidsintervallet kan behöva ökas för plattläsare som inte kan utföra tillräckligt snabba mätningar). Se till att alltid matcha det experimentella tidsintervallet med LFASS-rutinen.
    2. Tilldela den övre toleranströskeln genom att skriva "0,95" (detta kan ändras efter behov för att förbättra passformen) och den nedre toleranströskeln genom att skriva "0,05" (detta kan ändras efter behov för att förbättra passformen) för att begränsa sigmoidpassningen.
      OBS: Andra tidsparametrar baseras på användaranteckningar från datainspektionen (steg 7.2.).
  6. Välj om du vill visa eller inte monterade och utjämnade kurvor genom att skriva "y" för JA eller "n" för NEJ när du uppmanas till det. För att visuellt inspektera de konvergerande passningarna, välj den förra.
    Det senare är användbart för att visualisera alla utjämnade data men är vanligtvis inte valt eftersom det genererar för många popup-grafer. Efter detta kommer Matlab att utföra LFASS-rutinen, vilket kan ta 1-10 minuter om flera Excel-filer bearbetas på en gång. Popup-fönster med kurvor visas enligt valet i steg 8.6. Tilläggsfil 4A visar ett exempel på en monterad kurva.
  7. Välj om du vill (1) analysera kurvor som identifierats som brus eller (2) återställa dåligt anpassade kurvor med ett [y/n]-alternativ. Skriv y för att godkänna och n för att avvisa.
    OBS: Godkännande av ombyggnad rekommenderas, särskilt om det finns många dåligt monterade eller omonterade kurvor. Detta gör det möjligt för användaren att tillhandahålla skräddarsydda kurvanpassningsparametrar för varje kurva som de visas på skärmen och bara be om tidigare och senare gränser för sigmoidpassningen. Det kan försökas så många gånger som krävs.
  8. När data har analyserats stänger du Matlab och öppnar LFASS-mappen .
  9. Klicka på LFASS-undermappen Mina resultat, eftersom resultatfilerna sparas automatiskt i mappen Resultat som .txt.
    OBS: Matlab genererar tre .txt filer: "Batch-fitted.txt", "Batch and noise-fitted.txt" och "Refitted.txt". De två förstnämnda sparas som en försiktighetsåtgärd i händelse av en datorkrasch eller användarfel under ommonteringen. Filen som innehåller den mest exakta fullständiga analysen är "Refitted.txt".
  10. Öppna filen Refitted.txt med Microsoft Excel och spara som .xls för vidare bearbetning. Tilläggsfil 4B visar ett exempel på en sådan resultatfil.
    OBS: För varje brunn (organiserad i rader) tillhandahålls tre värden i kolumnerna som ger uppskattningar av mediantiden för maskpopulationens död: "Rå": rapporterar tiden som skär vid halvmaximum av experimentdatatoppen; "Partimonterad": rapporterar tiden för skärning vid halva gränsen för den satsmonterade kurvan. "Ommonterad": rapporterar tiden för att korsa vid halvgränsen för den ommonterade kurvan.
  11. Spara filen i .xls format som en kopia på en säker plats. Om du inte gör detta riskerar du att filerna skrivs över under nästa körning av LFASS-rutinen.
    OBS: Resultaten kan sedan bearbetas ytterligare för grafering eller statistisk analys.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

LFASS-analyser ger robust, hög genomströmning och snabb screening av flera testförhållanden samtidigt, såsom screening av många genetiska parametrar och mikrobiotaparametrar som bidrar till stressmotstånd och åldrande. Det tar bara 2–3 veckor för experimentet att få en omfattande datauppsättning med flera testförhållanden. L4 + 36 h vuxna vilda maskpopulationer utsattes för 42 ° C termisk stress och 7% t-BHP-inducerad oxidativ stress efter en 36 h odling på 48 tarmmikrobiella isolat i 36 timmar. Analysen utfördes fyra gånger, där varje tillstånd replikerades fyra gånger i varje analys. Under alla testade förhållanden varierade mediantiden för dödsfall mellan 40-130 min för termisk spänningsanalys och mellan 90-240 min för t-BHP-inducerad oxidativ stressanalys. Termiska stressanalyser i tidig vuxen ålder visar vanligtvis mer konsekventa resultat och mindre variation mellan dagar och intradagar än oxidativa stressanalyser och är bättre prediktorer för efterföljande livslängd30. Skillnaden i mediantiden för död för maskar som matas på olika mikrobiella dieter exemplifierar slutgiltigt hur tarmkommensaler påverkar värdens stressmotstånd. Figur 2 visar typiska resultat från 16 biologiska replikat för Bristol N2-maskar av vildtyp på två tarmmikrobiotaisolat av intresse och standardlaboratoriestammen E. coli OP50.

Figure 2
Figur 2: Representativa resultat från parade värme-/oxidativa stressresistensanalyser från maskar odlade på två bakterieisolat och en kontrollstam . (A) Analys av värmespänning. Maskar av vildtyp matades i 36 timmar på antingen MYb11 (Pseudomonas lurida) eller MYb115 (Pseudomonassp.) bakterieisolat eller OP50-kontrollbakterier. MYb11 ledde till en signifikant tidigare mediantid för dödsfall (p < 0,001). (B) Oxidativ stressanalys. Maskar av vild typ matades i 36 timmar på antingen MYb11- eller MYb115-bakterieisolat eller OP50-kontrollbakterier. MYb11 ledde till en signifikant tidigare mediantid för dödsfall (p < 0,05). 120-150 maskar analyserades i fyra uppsättningar prover, och varje experiment utfördes i fyrdubbla. Brunnar med dålig kvalitet/dåligt anpassade data ledde till saknade värden. Rutdiagramrepresentationer anger enskilda brunnsvärden, minimi-, median- och maximivärden. *Indikerar statistisk signifikans vid p < 0,05 och ***p < 0,001, med enkelriktad ANOVA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

A
Parameter Inställning Kommentar
Temperatur 25 °C
Fluorescens excitation 365 nm 10 nm bandbredd
Fluorescensutsläpp 430 nm 20 nm bandbredd
Antal blixtar 8 blixtar, 1 ms avvecklingstid
Vinst 100 till 130 Justeras beroende på prov. Sikta på 2-5 k läsvärde vid början av analysen
Fördröjningstid 1 μs
Tid för integration 30 miljoner kronor
Tidsintervall för läsning Var 2:e minut Beroende på stressens svårighetsgrad kan varaktighet och tidsintervall behöva justeras (8 h räcker vid 7% t-BHP)
Varaktighet 8-12 timmar
Läsriktning Underifrån
B
Parameter Inställning Kommentar
Temperatur 42 °C
Fluorescens excitation 365 nm 10 nm bandbredd
Fluorescensutsläpp 430 nm 20 nm bandbredd
Antal blixtar 8 blixtar, 1 ms avvecklingstid
Vinst 100 till 130 Justeras beroende på prov. Sikta på 2-5 k läsvärde vid början av analysen
Fördröjningstid 1 μs
Tid för integration 30 miljoner kronor
Tidsintervall för läsning Var 2:e minut Beroende på stressens svårighetsgrad kan varaktighet och tidsintervall behöva justeras (6 timmar räcker vid 42 °C)
Varaktighet 6-12 timmar
Läsriktning Underifrån

Tabell 1: Inställningar för oxidativ och värmestressanalys. Exempel på inställningar som används för oxidativa (A) och värme (B) spänningsanalyser på fluorescensplattläsare som används i denna studie.

Tilläggsfil 1: Medie-, buffert- och kulturrecept. Sammansättning av olika medier, buffertar och kulturer som används i denna studie. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tilläggsfil 2: Rå fluorescensdata från plattläsaren efter att ha exporterats och konverterats till excel .xls format. (A) Excel-filen visar råa fluorescensdata för en värmechockanalys. Rå fluorescensdata visas vid 2 minuters tidsintervall. (B) Kolonnen med "brunnsposition" på 384-brunnsplattan är markerad, som kan användas för att märka mask- och bakteriestammarna. (C) Filen är märkt med mask- och bakteriestammar. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tilläggsfil 3: LFASS-analys med Matlab. (A) Efter att ha öppnat LFASS-mappen i Matlab dyker ett kommandofönster upp. (B) "fitfolder" skrivs i kommandofönstret för att starta programmet, och mappens namn med filen som ska analyseras anges. (C) När programmet hittar data excel-filen för analys måste användaren följa instruktionerna på skärmen och tillhandahålla de olika parametrarna som begärs. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande fil 4: Analyserade LFASS-data med hjälp av Matlab. (A) Ett exempel på en kurva som monterats genom Matlab-analys, där den svarta linjen anger den tidpunkt som motsvarar den tidigare tidsgränsen och den blå linjen den senare tidsgränsen för kurvpassningen. Den monterade sigmoidkurvan visas i rött. (B) Resultatfilen som genereras av Matlab öppnas i .xls format. Värdena markeras och visas i talformat. Den andra kolumnen anger den tid då värdet på rådatakurvan först överskrider 50 % av det maximala värdet. Den tredje kolumnen anger den tid då den monterade kurvans värde är lika med 50 % av det maximala värdet, som bestämts under analysen av satsmontering. I den fjärde kolumnen anges den tidpunkt då värdet på den monterade kurvan är lika med 50 % av det maximala värdet efter satsanalys och slutlig ombyggnad vid behov. Den fjärde kolumnen bör således ge det mest tillförlitliga resultatet. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tilläggstabell 1: Exempel på experimentella plattlayouter. (A) 96-brunns plattlayout för testning av 47 olika bakterieisolat av masktarmmikrobiota på två separata maskstammar, där levande OP50 används som kontroll. Fyra kopior av denna platta krävs för varje analys som körs. (B) 384-brunnslayout för värme- eller oxidativa spänningsanalyser, motsvarande den tidigare 96-brunnsplattanalysen i (A). Denna inställning gör det möjligt att utföra tetraplicates för varje tillstånd, där varje maskstam har sin egen OP50-kontroll. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

C. elegans erbjuder många fördelar för att snabbt screena flera experimentella parametrar samtidigt, på grund av dess lilla storlek, transparens, snabba utveckling, korta livslängd, billighet och enkel hantering. Dess betydligt enklare genom, kroppsplan, nervsystem, tarm och mikrobiom, men ändå komplexa och tillräckligt lika människor, gör det till en kraftfull preklinisk modell, där mekanistisk insikt kan uppnås när man testar för bioaktiv effekt eller toxicitet. Eftersom intresset växer för att utveckla mikrobiella interventioner för sjukdomar 8,9,34,35, att dra nytta av sådana prekliniska modeller för att snabbt undersöka probiotika är ett attraktivt alternativ med den i stort sett outnyttjade och nästan obegränsade terapeutiska potentialen hos mikrober 34. Protokollet som beskrivs här är lämpligt för att studera miljöbakteriernas inverkan på C. elegans hälsa men kan lätt anpassas för andra ändamål.

Mångsidighet
De olika "modulerna" som bildar denna pipeline kan anpassas för att matcha experiment- eller labbspecifika krav. Till exempel kan bakterieisolat ersättas med bakterieblandningar, bakteriella mutanter eller RNAi-producerande bakterier, och installationen kan användas för att screena för bakteriegener som är involverade i värd-mikrobinteraktioner, screena för värdgener som är involverade i stressresistens eller studera effekterna av enskilda mikrober som en del av definierade bakteriesamhällen. Denna metod beskriver screening av flera bakterieisolat i en enda masks genetiska bakgrund. Analysen är dock skalbar och flera värd- och bakteriegenotyper kan studeras samtidigt. Detta kan kombineras ytterligare med differentiella läkemedelsbehandlingar och/eller kostregimer för att få insikt i värdgen-mikrob-gen-dietinteraktioner.

Protokollet har ännu inte prövats på andra nematodarter, men det bör också vara direkt tillämpligt på C. remanei och C. briggsae, och det kan gälla parasitiska nematodarter i L3-stadiet som delar morfologiska, storleks- och dödsfluorescensegenskaper med C. elegans30. Slutligen kan andra stressfaktorer (juglone, parakvat, arsenat, andra temperaturer) användas inom samma rörledning för att ge kompletterande eller bekräftande information.

Potentiella utmaningar
Tidsinvesteringen fram till dag 12 för att odla maskar och bakterier före analyserna är betydande, men på grund av metodens genomströmning uppvägs den långt av bredden på de insamlade uppgifterna. Ändå är det viktigt att planera sådana analyser för att undvika att slösa bort tid genom att upprepa förberedelsestegen eftersom material är suboptimala när analyserna kan börja. Huvudsakliga tidiga problem inkluderar provkontaminering (maskar eller bakterier), dåligt synkroniserade maskpopulationer och slut på material (maskpopulationer äter igenom maten snabbare än förväntat och återmatar eller överför djur oftare än planerat).

Undvika föroreningar
På grund av protokollets omfattning och varaktighet är en stor potentiell fråga kontaminering av svampar och bakterier, vars förekomst säkert skulle förvirra resultaten. Den idealiska installationen är således ett luftkonditionerat och luftfiltrerat dedikerat labbutrymme utan direkt luftflöde ovanför experimentbänken, med sterila förbrukningsvaror. Att observera regelbundna rengöringsprocedurer (dekontaminera bänkar före och efter arbete, rengöra plåtlådor och använda sterila förbrukningsvaror) och arbeta med en låga i ett inneslutet utrymme (undvik korridorer, utrymmen nära öppna dörrar och fönster) är dock vanligtvis tillräckliga för att upprätthålla en ren miljö. Om milda föroreningar inträffar före äggberedning i steg 2.2.1., kommer blekningsproceduren att ta hand om dem och protokollet kan fortskrida som planerat. Omvänt kommer kontamineringar som påverkar den växande maskpopulationen innan de överförs till testbakterieplattor att innebära slutet på det försöket, och protokollet måste startas om från steg 1. Senare kontamineringar tenderar att påverka enstaka bakteriestammar eller testförhållanden. Beroende på deras omfattning kan det vara värt att fortsätta eller starta om protokollet.

Synkronisering av maskar
Eftersom resistensen mot termiska och oxidativa utmaningar förändras när maskar utvecklas och växer, kan testförhållanden som leder till olika utvecklingsstadier när LFASS-analyser utförs inte lätt jämföras. Det är viktigt att ge välsynkroniserade populationer för slutpunktsanalyser. Eftersom analyserna utförs på maskar som samlas i bulk vid L4- eller L4 + 48 h-steg, i avsaknad av en masksorterare eller annan sorteringsprocedur för att samla perfekt iscensatta maskar, måste maskpopulationerna vara mycket väl synkroniserade vid L1. Det bör säkerställas att kläckningslingar hålls borta från föda tillräckligt länge för att alla levande ägg ska kunna kläckas innan testkohorten odlas (>15 timmar vid 20 °C och >18 timmar vid 15 °C). Genotyp kan påverka spridningen i utvecklingstiming, vilket också påverkas av temperaturen. Växande maskpopulationer vid 15 °C ger bättre kontroll över detta samtidigt som effekten av temperaturkänsliga mutationer begränsas under maskpopulationens expansionsfas (särskilt när man arbetar med insulinsignalerande mutanter). Den främsta anledningen till att studera effekterna av mikrober från L4 eller L4 + 48 h är att kringgå utvecklingseffekten av en annan diet och studera effekterna av levande tarmbakterier snarare än deras inverkan på kosten. Ormar som odlas i ett tidigare larvstadium på olika bakterieisolat eller blandningar kommer oundvikligen att leda till ojämna utvecklingshastigheter och förlust av synkronisering.

Konsekvenser av att förlita sig på blå fluorescens
Att kunna lokalisera döden i LFASS-analyser utan behov av individuell maskspårning eller ytterligare reagenser som Sytox green36, utan istället utnyttja en endogen signal i ett fluorescensområde som sannolikt inte kommer att överlappa med traditionella maskbiomarkörer, är en klar fördel. Det är dock fortfarande viktigt att säkerställa att maskdödsfluorescens kan detekteras konsekvent under många testförhållanden. Även om analysen inte förlitar sig på fluorescenskvantifiering utan på dess dynamik, måste tillräcklig fluorescens fortfarande avges av maskarna för att uppskatta mediantiden för döden (TOD) exakt. Eftersom analysen inte tillåter upplösning av enstaka maskdöd, måste de blå fluorescenssprängningarna som emitteras av döende individer ha tillräcklig tidsmässig överlappning för fluorescensackumulering för att ge ut en enda populationsfluorescenstopp. Först då kan median TOD härledas exakt. Detta innebär att maskar som inte kan producera tillräckliga nivåer av blå fluorescens inte kan användas i detta protokoll, som särskilt inkluderar vissa mutanter av kynureninvägen, såsom tdo-2 och kynu-130,31, samt utsvultna djur. Därför är det viktigt att se till att maskar hålls i fyllda förhållanden hela tiden. Detta kan särskilt vara ett problem när du utför HT115-drivna RNAi-skärmar eftersom HT115-gräsmattor på NGM-medium kompletterat med IPTG och antibiotika tenderar att vara tunnare än OP50-gräsmattor. Övervakning av maskmatförsörjningen under dagarna som leder till analyserna är således kritisk.

En annan konsekvens av dynamiken i dödsfluorescens är att ju snabbare analysen är, desto bättre känslighet, eftersom maskar från samma population kommer att dö mer synkront och producera en mer definierad befolkningsdödsfluorescenstopp. Ju längre analysen är, desto större är befolkningsstorleken som behövs för att generera goda dödsfluorescenstoppar. Mutanter med låg ämnesomsättning, såsom eat-2 och daf-230, kommer också att ge ut mindre fluorescens och kräva högre siffror per brunn. Medan 10-15 maskar av vildtyp per brunn är tillräckliga för en 42 ° C termisk spänningsanalys som dödar dem alla inom 4 timmar, krävs nästan dubbelt så mycket för daf-2 (e1370) maskar i samma analys, och > 100 vildtypsmaskar krävs för en analys som skulle döda maskar under en 24-timmarsperiod.

I samband med miljöbakterieisolat kan olika mikrobiella metabolismer också differentiellt påverka kynureninvägen som producerar de blå fluorescerande föreningarna. Därför leder vissa bakterieisolat till lägre toppdödsfluorescens, medan andra leder till högre toppar än OP50. Som ett resultat måste man sikta på tillräckligt med maskar per brunn för att tillgodose alla eventualiteter.

Slutligen är det viktigt att optimera plattavläsningsparametrarna korrekt. Detta protokoll täcker inställningen av fluorescensexcitations- och emissionsparametrar och djupet vid vilket avläsningar helst bör utföras. Med ett möjligen brett spektrum av dödsfluorescensutbyten över flera förhållanden i en enda analys är det viktigt att se till att svaga signaler detekteras men att detektorer aldrig mättas. Instrument med detektorer som har höga dynamiska omfång kommer därmed att fungera bättre.

Begränsningar av metoden
Metoden som beskrivs här är robust och flexibel och kan lätt anpassas till olika förhållanden. För enkelhets skyld nämns viktiga begränsningar och begränsningar längs protokollet där de spelar in. Kortfattat är beroendet av dödsfluorescens som en endogen dödsmarkör både en styrka och en begränsning av dessa analyser.

Under ett begränsat antal specifika kostförhållanden (dieter med låg tryptofan eller svält) och under muterade tillstånd som påverkar tryptofanmetabolismen (dvs. tdo-2, kynu-1, vissa daf-2-alleler ) kan dödsfluorescensen (DF) dämpas kraftigt, i den utsträckning att toppfluorescensen är svår att upptäcka och TOD-uppskattningarna är mindre tillförlitliga.

Omvänt kan vissa mikrober producera blå fluorescerande föreningar vars excitations- och emissionsspektra överlappar DF-signaler (dvs. Enterococcus faecalis). Även om deras dynamik skiljer sig från DF och ofta kan kopplas bort, kan de förvirra analysen.

Därefter förlitar sig analyserna på kumulation av signaler från döende enskilda maskar, men DF släcks över tiden. Därför, om maskar dör för långt ifrån varandra, kommer enskilda fluorescenstoppar inte att producera en populationstopp, vilket förhindrar mätning av en populationsmedian TOD. Ju långsammare analysen dödar, desto högre masknummer krävs i varje brunn30. Därför räcker det med 10-15 vuxna maskar per brunn för en värmestressanalys på 42 °C som dödar hälften av maskarna inom 2 timmar, men över 70 maskar per brunn är nödvändiga för en bakteriell snabbdödande analys som dödar hälften av maskarna på 12 timmar.

Slutligen behöver användare tillgång till en plattläsare för att utföra sådana analyser som kan utföra fluorescensmätningar med tidsfördröjning vid de önskade våglängderna. Excitations- och emissionsvåglängder kan också variera något mellan system och variera mellan nematodarter, som nämnts30.

Jämförelse och komplementaritet med andra C. elegans-analyser
Under de senaste 10-15 åren har många analyser utvecklats för att bedöma C. elegans hälsa under flera förhållanden samtidigt, med hjälp av en mångfald av strategier och erbjuder olika nivåer av datadjup och bredd 30,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45, 46. Flera kraftfulla analyser har särskilt utvecklats för att automatiskt övervaka många maskar samtidigt på fasta medier under hela deras livslängd, med hjälp av kameramatriser och skannrar med spårningsalgoritmer för flera maskar och / eller mikrofabricerade enskilda maskmatriser 37,38,39,40,41,43 . I samband med värd-mikrobinteraktioner har liknande tillvägagångssätt för protokollet som beskrivs ovan men inte förlitar sig på DF också möjliggjort genomomfattande RNAi-screening av C. elegans-gener som är involverade i bakterieinfektioner46,47,48. Dessa analyser med hög genomströmning är dock beroende av att hantera maskar i vätska hela tiden, vilket inte är önskvärt när man hanterar flera bakterietyper samtidigt på grund av de ökade riskerna för korskontaminering och eftersom flytande kultur påverkar värd- och mikrobiella metabolismer. Därför, i traditionella infektions-, stress-, hälsospan- och livslängdsanalyser, underhålls C. elegans och åldras på bakteriella gräsmattor som odlas på fasta medier. Som också är fallet i detta protokoll kan resultat från skärmar som utförs med denna pipeline lättare relateras till och förutsäga resultatet av nedströms bekräftande experiment med skärmträffar.

Fördelarna med själva LFASS-metoden har behandlats väl i referens30. Jämfört med mer detaljerade kontinuerliga bildinställningar som kan återanvändas för liknande studier är LFASS billigare (förutsatt att median TOD är den enda avläsningen som behövs), och dess enkelhet innebär att den inte kräver mycket teknisk förmåga eller specialutrustning. LFASS handlar främst om bredd över djup. LFASS-data ger ingen annan information än mediantiden för en maskpopulations död och en indirekt avläsning av en kynureninvägsutgång. Omvänt, med lägre men fortfarande anständig genomströmning, kan komplexa egenskaper mätas från andra analyser 37,38,39,40,41,43 under maskarnas hela livslängd, vilket gör dem till utmärkta nedströmsmetoder för att studera träffar från en LFASS-skärm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar CGC Minnesota (Madison, USA, NIH - P40 OD010440) för att tillhandahålla maskstammar och OP50 och Pr. Hinrich Schulenburg (CAU, Kiel, Tyskland) för att tillhandahålla alla miljömikrobiella isolat som visas här. Detta arbete finansierades av ett UKRI-BBSRC-bidrag till AB (BB/S017127/1). JM finansieras av ett doktorandstipendium från Lancaster University FHM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 cm diameter plates (Non-vented) Fisher Scientific 10720052 Venting is not necessary for bacterial cultures
15 cm diameter plates (Vented) Fisher Scientific 168381
384-well black, transparent flat bottom plates Corning 3712 or 3762 Not essential to be sterile for fast stress assays
6 cm diameter plates (Vented) Fisher Scientific 150288 Venting is necessary for worm cultures to avoid hypoxia
96-well transparent plates (Biolite) Thermo 130188
Agar (<4% ash) Sigma-Aldrich 102218041 Good quality agar is important for the structural integrity of the culture media, to avoid worm burrowing
Agarose Fisher Scientific BP1356
Avanti Centrifuge J-26 XP Beckman coulter
Bleach Honeywell 425044
Calcium chloride Sigma-Aldrich C5080
Centrifuge 5415 R Eppendorf
Centrifuge 5810 R Eppendorf
Cholesterol Sigma-Aldrich C8667
LB agar Difco 240110
LB broth Invitrogen 12795084
LoBind tips VWR 732-1488 Lo-bind reduce worm loss during transfers
LoBind tubes Eppendorf 22431081
Magnesium sulfate Fisher Scientific M/1100/53
Plate reader- infinite M nano+ Tecan Monochromator setup enables fluorescence tuning but adequate filter-based setups may be used
Plate reader- Spark Tecan
Potassium phosphate monobasic Honeywell P0662
Sodium chloride Sigma-Aldrich S/3160/63
Stereomicroscope setup with transillumination base Leica MZ6, or M80 Magnification from 0.6-0.8x up to 40-60x is necessary, as is a good quality transillumination base with a deformable, titable or slidable mirror to adjust contrast
t-BHP (tert-Butyl hydroperoxide) Sigma-Aldrich 458139
Transparent adhesive seals Nunc Fisher Scientific 101706871 It is important that it is transparent and that it can tolerate the temperatures involved in the assays.
Tryptophan Sigma-Aldrich 1278-7099
Yeast extract Fisher Scientific BP1422

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Krishna, S., et al. Integrating microbiome network: establishing linkages between plants, microbes and human health. The Open Microbiology Journal. 13, 330-342 (2019).
  2. Amon, P., Sanderson, I. What is the microbiome. Archives of Disease in Childhood - Education & Practice Edition. 102 (5), 257-260 (2017).
  3. Belkaid, Y., Harrison, O. J. Homeostatic immunity and the microbiota. Immunity. 46 (4), 562-576 (2017).
  4. Cabreiro, F., Gems, D. Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans. EMBO Molecular Medicine. 5 (9), 1300-1310 (2013).
  5. Vaga, S., et al. Compositional and functional differences of the mucosal microbiota along the intestine of healthy individuals. Scientific Reports. 10 (1), 14977 (2020).
  6. Nagpal, R., et al. Gut microbiome and aging: Physiological and mechanistic insights. Nutrition and Healthy Aging. 4 (4), 267-285 (2018).
  7. Mitsuoka, T. Establishment of intestinal bacteriology. Biosci Microbiota Food Health. 33 (3), 99-116 (2014).
  8. Bonfili, L., et al. Microbiota modulation as preventative and therapeutic approach in Alzheimer's disease. The FEBS Journal. 288 (9), 2836-2855 (2021).
  9. Vendrik, K. E. W., et al. Fecal microbiota transplantation in neurological disorders. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 98 (2020).
  10. Wang, Q., et al. The role of gut dysbiosis in Parkinson's disease: mechanistic insights and therapeutic options. Brain. 144 (9), 2571-2593 (2021).
  11. Zhu, X., et al. The relationship between the gut microbiome and neurodegenerative diseases. Neuroscience Bulletin. 37 (10), 1510-1522 (2021).
  12. Miller, I. The gut-brain axis: historical reflections. Microbial Ecology in Health and Disease. 29 (1), 1542921 (2018).
  13. Foster, J. A., Rinaman, L., Cryan, J. F. Stress & the gut-brain axis: Regulation by the microbiome. Neurobiology of Stress. 7, 124-136 (2017).
  14. Coman, V., Vodnar, D. C. Gut microbiota and old age: Modulating factors and interventions for healthy longevity. Experimental Gerontology. 141, 111095 (2020).
  15. Conway, J., Duggal, N. A. Ageing of the gut microbiome: Potential influences on immune senescence and inflammageing. Ageing Research Reviews. 68, 101323 (2021).
  16. Berg, M., et al. Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments. The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).
  17. Dirksen, P., et al. CeMbio - The Caenorhabditis elegans Microbiome Resource. G3: Genes, Genomes, Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).
  18. Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14, 38 (2016).
  19. Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Felix, M. A., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (27), 3941-3949 (2016).
  20. Zimmermann, J., et al. The functional repertoire contained within the native microbiota of the model nematode Caenorhabditis elegans. The ISME Journal. 14 (1), 26-38 (2020).
  21. Dinic, M., et al. Host-commensal interaction promotes health and lifespan in Caenorhabditis elegans through the activation of HLH-30/TFEB-mediated autophagy. Aging. 13 (6), 8040-8054 (2021).
  22. Goya, M. E., et al. Probiotic Bacillus subtilis protects against alpha-Synuclein aggregation in C. elegans. Cell Reports. 30 (2), 367-380 (2020).
  23. Hacariz, O., Viau, C., Karimian, F., Xia, J. The symbiotic relationship between Caenorhabditis elegans and members of its microbiome contributes to worm fitness and lifespan extension. BMC Genomics. 22 (1), 364 (2021).
  24. Shin, M. G., et al. Bacteria-derived metabolite, methylglyoxal, modulates the longevity of C. elegans through TORC2/SGK-1/DAF-16 signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (29), 17142-17150 (2020).
  25. Zhang, F., et al. Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut. Current Biology. 31 (12), 2603-2618 (2021).
  26. Zhang, F., et al. High-throughput assessment of changes in the Caenorhabditis elegans gut microbiome. Methods in Molecular Biology. 2144, 131-144 (2020).
  27. Chan, J. P., et al. Using bacterial transcriptomics to investigate targets of host-bacterial interactions in Caenorhabditis elegans. Scientific Reports. 9 (1), 5545 (2019).
  28. Hartsough, L. A., et al. Optogenetic control of gut bacterial metabolism to promote longevity. Elife. 9, 56849 (2020).
  29. Pryor, R., et al. Host-microbe-drug-nutrient screen identifies bacterial effectors of Metformin therapy. Cell. 178 (6), 1299-1312 (2019).
  30. Benedetto, A., et al. New label-free automated survival assays reveal unexpected stress resistance patterns during C. elegans aging. Aging Cell. 18 (5), 12998 (2019).
  31. Coburn, C., et al. Anthranilate fluorescence marks a calcium-propagated necrotic wave that promotes organismal death in C. elegans. PLOS Biology. 11 (7), 1001613 (2013).
  32. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
  33. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  34. Naomi, R., et al. Probiotics for Alzheimer's disease: a systematic review. Nutrients. 14 (1), 20 (2021).
  35. Zheng, S. Y., et al. Potential roles of gut microbiota and microbial metabolites in Parkinson's disease. Ageing Research Reviews. 69, 101347 (2021).
  36. Gill, M. S., Olsen, A., Sampayo, J. N., Lithgow, G. J. An automated high-throughput assay for survival of the nematode Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology and Medicine. 35 (6), 558-565 (2003).
  37. Park, H. -E. H., Jung, Y., Lee, S. -J. V. Survival assays using Caenorhabditis elegans. Molecules and Cells. 40 (2), 90-99 (2017).
  38. Partridge, F. A., et al. An automated high-throughput system for phenotypic screening of chemical libraries on C. elegans and parasitic nematodes. International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance. 8 (1), 8-21 (2018).
  39. Rahman, M., et al. NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10 (1), 16190 (2020).
  40. Stroustrup, N., et al. The Caenorhabditis elegans lifespan machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).
  41. Xian, B., et al. WormFarm: a quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
  42. Brown, A. E., Schafer, W. R. Unrestrained worms bridled by the light. Nature Methods. 8 (2), 129-130 (2011).
  43. Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. Elife. 6, 26652 (2017).
  44. Jushaj, A., et al. Optimized criteria for locomotion-based healthspan evaluation in C. elegans using the WorMotel system. PLoS One. 15 (3), 0229583 (2020).
  45. Nambyiah, P., Brown, A. E. X. Quantitative behavioural phenotyping to investigate anaesthesia induced neurobehavioural impairment. Scientific Reports. 11 (1), 19398 (2021).
  46. Squiban, B., Belougne, J., Ewbank, J., Zugasti, O. Quantitative and automated high-throughput genome-wide RNAi screens in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (60), e3448 (2012).
  47. Zugasti, O., et al. Activation of a G protein-coupled receptor by its endogenous ligand triggers the innate immune response of Caenorhabditis elegans. Nature Immunology. 15 (9), 833-838 (2014).
  48. Zugasti, O., et al. A quantitative genome-wide RNAi screen in C. elegans for antifungal innate immunity genes. BMC Biology. 14, 35 (2016).

Tags

Biologi utgåva 182
Screening med hög genomströmning av mikrobiella isolat med inverkan på <em>Caenorhabditis elegans</em> hälsa
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ali, I., Martin, J.,… More

Ali, I., Martin, J., Zárate-Potes, A., Benedetto, A. High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health. J. Vis. Exp. (182), e63860, doi:10.3791/63860 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter