Summary
该协议详细介绍了一种解剖小鼠脂肪库以及分离和消化各自动脉以释放然后鉴定内皮细胞群的方法。用于下游应用的新鲜分离细胞将促进对血管细胞生物学和血管功能障碍机制的理解。
Abstract
血管系统壁上的血管内皮细胞在各种生理过程中起重要作用，包括血管张力调节、屏障功能和血管生成。内皮细胞功能障碍是严重心血管疾病进展的标志性预测因子和主要驱动因素，但其潜在机制仍知之甚少。从各种血管床上以天然形式分离和分析内皮细胞的能力将深入了解心血管疾病的过程。该协议介绍了解剖小鼠皮下和肠系膜脂肪组织的程序，然后分离其各自的动脉脉管系统。然后使用特定的消化酶混合物消化分离的动脉，重点是释放功能上可行的内皮细胞。通过使用CD31 + / CD45 −细胞作为阳性内皮细胞鉴定的标志物的流式细胞术分析评估消化的组织。细胞可以分选用于直接下游功能测定或用于生成原代细胞系。从不同血管床分离和消化动脉的技术将为研究人员提供评估来自感兴趣动脉的新鲜分离的血管细胞的选择，并允许他们对特定细胞类型进行广泛的功能测试。
Introduction
内皮细胞因其在各种生理过程中的重要作用而得到广泛认可，包括屏障功能、血管生成和血管张力调节1，2。尽管内皮细胞功能障碍在促进动脉粥样硬化、高血压、糖尿病等方面有充分证据，但驱动内皮功能障碍的潜在机制仍然知之甚少，并且可能因不同的血管床而异2，3，4。揭示内皮细胞功能障碍的这些病理机制的努力受到从组织获得纯内皮细胞群的有限访问和/或培养物中内皮细胞的表型变化的挑战5，6。因此，能够以天然形式从各种血管床中分离和分析内皮细胞，将深入了解心血管疾病的过程。
该协议介绍了从小鼠身上解剖皮下和肠系膜脂肪组织的程序，然后分离它们各自的动脉脉管系统。动脉壁内衬的功能活内皮细胞使用特定的酶混合物释放。特别注意优化消化方案的条件，以从<1mg起始组织中获得足够的内皮细胞产量，同时保持生物分子标记物完整以进行分析。接下来使用流式细胞术鉴定分离的内皮细胞。CD31（PECAM）的存在主要用于识别内皮细胞。由于CD31在其他细胞类型中的表达，包括几种也表达CD45的造血来源，通过排除同时表达CD31和CD455，6，7，8的细胞，进一步提高了分离的内皮细胞的纯度。此外，根据研究问题和要采用的下游应用，研究人员应考虑选择一组广泛的正负选择标记，以优化目标细胞群的纯度。
尽管在以前的出版物9，10，11，12，13中已经使用了解剖和分离脂肪库动脉的技术，但尚未提出描述嵌入式动脉分离的详细协议。展示从给定感兴趣的物种的不同血管床中分离和消化动脉的技术将为研究人员提供评估来自感兴趣动脉的新鲜分离的血管细胞的选择，并允许他们对特定细胞类型进行广泛的功能测试。测试可能包括但不限于用于细胞分选和膜蛋白表达的流式细胞术5，8，离子通道活性的电生理学9，分子分析（蛋白质组学/基因组分析等）14，15，以及用于体外药物筛选的原代细胞系的产生16，17。
Protocol
在这些研究中使用动物得到了特拉华大学机构动物护理和使用委员会（#1372）的批准。
1. 组织解剖和清洁
注意：视频协议中使用10至12周龄的C57BL / 6J小鼠。有关组织解剖和清洁动脉的示意图和预期结果，请参阅 图1 ，有关耗材和制造商信息的列表，请参阅 材料表 。
- 通过CO2 窒息然后颈椎脱位对小鼠实施安乐死。
- 使用解剖针固定鼠标，并用70%乙醇喷洒腹面。
- 分离位于每个后肢的皮下脂肪组织
注意：需要解剖工具：直波恩剪刀（9厘米）和钝弯曲的格雷夫镊子。- 使用镊子将皮肤抬起生殖器正上方，并在皮肤上做一个小切口（2 毫米）。
- 将剪刀的尖端插入切口部位，做一个4-5厘米的中线切口，从最初的切口开始，颅骨解剖到胸骨的底部。小心不要穿透腹腔。
- 做一个1厘米的侧切口，从前肢正下方的中线横向延伸。
- 在后肢和生殖器之间做一个1厘米的对角线切口。
- 沿着中线皮肤切口做小切口，剥去相关的结缔组织并露出皮下脂肪库。将皮肤向下固定。
- 识别垂直于腹腔的“C 形”皮下脂肪组织和动脉/静脉。
- 从靠近生殖器的C形底部开始，轻轻抓住脂肪组织，露出结缔组织。在结缔组织中做小切口，将脂肪与皮肤分离。避免干扰暴露的脉管系统。
- 继续解剖结缔组织，直到皮下脂肪组织可以完整切除。小心地将暴露的动脉与周围的结缔组织分开。
- 将分离的皮下脂肪储存在冰上的HEPES缓冲液中，直到准备好分离感兴趣的血管床。
- 重复步骤 1.3.3.-1.3.5。对于剩余的后皮下脂肪库。
- 肠系膜脂肪库的分离
注意：需要解剖工具：直波恩剪刀（9 厘米）、格雷夫镊子、一对 #5 镊子、直虹膜剪刀和弯曲波恩剪刀（9 厘米）。- 使用格雷夫镊子将薄腹腔壁抬高到膀胱上方，并使用直剪刀做一个小切口。
- 慢慢提起穿透的腹膜腔壁，小心地将直虹膜剪刀插入切口部位，从膀胱到胸骨做一个4-5厘米的切口。
- 用直虹膜剪刀做两个1厘米长的水平切口，从中线横向延伸到后肢上方和前肢下方。使用格雷夫镊子剥离腹部肌肉组织并暴露腹膜内脏。
- 重复步骤 1.4.3。在对面。
- 使用一对#5镊子将肠子从内脏腔中取出，以露出肠系膜脂肪。
- 使用弯曲的剪刀和#5镊子沿着结肠分离脂肪，从盲肠开始到结肠从视野下降的地方。
- 返回盲肠，使用弯曲的剪刀和#5镊子将脂肪沿着小肠分离到胰腺。切除胰腺的一小部分以完全隔离肠系膜脂肪。
注意：切除一小部分胰腺和肠系膜脂肪可能有助于清洁动脉，因为它在清洁过程中提供稳定性。 - 将分离的肠系膜脂肪储存在冰上的HEPES缓冲液中，直到准备好分离肠系膜动脉。
- 从皮下和肠系膜脂肪组织中分离相应的动脉
注意：需要解剖工具：带光源的解剖盘和立体镜，一对#55镊子和一对#5镊子。- 将~10 mL冷HEPES缓冲液放入解剖盘中，并使用#5镊子将脂肪组织转移到培养皿中。
- 使用1倍放大倍率的立体镜查看和定位脂肪组织以暴露动脉/静脉对（图2）。
- 使用#55镊子小心地从动脉中取出实质脂肪。一次去除小块脂肪，并在立体镜下仔细观察动脉/静脉对，以识别并避免损坏感兴趣的脉管系统。
注意： 相应地调整放大倍数和光源以清洁动脉。增加放大倍数和光强度，以便在去除脂肪时更好地观察动脉。动脉的精细清洁应在4x-5x放大镜下进行。区分结缔组织（胶原蛋白）、静脉和动脉很重要。结缔组织和胶原纤维具有无分支的弦状外观，有条纹，颜色发白。与胶原纤维和结缔组织不同，动脉和静脉是透明的，并且具有多个分支和明确的管腔。小动脉和静脉在无实质组织时可能看起来相似。管腔中血液的存在可以进一步帮助人们从静脉中识别动脉。与同等大小的动脉相比，静脉具有更薄的血管壁和更大的管腔，并且含有更多的血液。 - 重复步骤 1.5.3。直到动脉完全没有实质脂肪组织。
- 使用#5镊子将清洁的动脉转移到带有新鲜HEPES缓冲液的新管中，并保持在冰上直到准备好消化。
2.消化分离动脉以分离内皮细胞
注意：请参阅 图2 ，了解组织消化和内皮细胞分离的示意图，以及材料 表 ，了解该方案所需的耗材的完整列表。
- 向每个 2 mL 微量离心管中分别加入 1 mg 分散酶和弹性蛋白酶。向每个试管中加入 2 mL 解离溶液。涡旋并在37°C孵育直至完全溶解。使用#5镊子将清洁的动脉（步骤1.5.5.）转移到相应的样品管中。每种酶的最终浓度为0.5mg/mL。
- 在37°C下孵育1小时，每10-15分钟通过倒置轻轻搅拌，使得动脉悬浮在溶液中以保持酶和动脉之间的一致和均匀接触。
- 称取每个样品1mg的I型胶原酶，并将其添加到新管中。
- 让动脉沉淀在管子底部。在不干扰动脉的情况下从顶部取出 500 μL 缓冲液，并将其转移到含有胶原酶的指定管中。涡旋并将溶液返回到原始样品管中的相应样品中。I型胶原酶的最终浓度为0.5毫克/毫升。
- 在37°C孵育15分钟。确保在样品管短暂摇晃后动脉分离成碎片。如果动脉在扰动后没有分离成碎片，则以 5 分钟为增量孵育，直到可见动脉破裂。
- 使用玻璃移液管，用力研磨消化的组织10x-15x以机械方式解离细胞。
- 将溶液和消化的组织通过70μm细胞过滤器或流式细胞术管过滤器以获得单细胞悬液。
3. 流式细胞术前内皮细胞染色
注意：除非有指示，否则内皮细胞的染色和处理在冰上进行以提高细胞活力。将 5 mL 聚苯乙烯圆底管在室温 （RT） 下以 1，163 x g 离心 3 分钟。
- 在室温下以1，163×g离心单细胞悬液3分钟。
- 除去上清液，并将细胞沉淀重悬于1mL PBS + 5%BSA中，在室温下重悬30分钟。
注意：研究人员应考虑阻断FC受体，具体取决于细胞类型，感兴趣的靶标和使用的抗体18，19。 - 加入 1 μL 细胞活力染色剂（405 nm 激发）（材料表），并在室温下在黑暗中孵育 30 分钟。
- 在室温下以 1，163 x g 离心细胞悬液 3 分钟。 将细胞沉淀重悬于 200 μL PBS + 1% BSA 中。
- 向样品中加入与CD31（CD31-PE，0.75μg/样品）和CD45（CD45-FITC，2.5μg/样品）偶联的一抗，并在用铝箔覆盖样品后在冰箱的摇杆上孵育15分钟。
注意：要鉴定和/或获得纯的内皮细胞群，请使用具有不同激发/发射荧光的CD31和CD45偶联一抗以及具有CD31 + CD45−表达谱的门/分选细胞来探测CD31和CD45。根据所使用的荧光团18，20，21，可能需要补偿。 - 通过将 1 mL PBS + 1% BSA 直接添加到细胞悬液中来洗涤细胞。
- 在室温下以 1，163 x g 离心细胞悬液 3 分钟。 除去上清液并重悬于 200 μL 含有 0.1% BSA 的 1% 甲醛中。存放在用铝箔覆盖的冰箱中，直到准备好进行流式细胞术。
注意：通过减少洗涤和离心步骤来提高细胞产量。这些可能需要根据结果方法进行更改。固定剂中的样品应在24小时内进行分析。
Representative Results
工作流程示意图如图 1 所示。原理图突出显示了协议文本中更详细描述的协议步骤。图 2 显示了解剖后的皮下脂肪（图2A，左）和清洁实质组织后的皮下动脉弓（图2A，右）的图片。图 2 还显示了清扫后的肠系膜脂肪（图2B，左）和清洁实质组织后的肠系膜动脉弓（图2B，右）。
此处介绍的方案旨在帮助可能对以下方面感兴趣的研究人员：a）比较基础科学方法和/或疾病模型中不同的脂肪库脉管系统床，b）在分离感兴趣的血管细胞以进行下游应用之前消化血管床，以及c）使用流式细胞术鉴定感兴趣的血管细胞（图3），适用于各种应用，包括但不限于此处进行的蛋白质表达分析（图4）。图3详细介绍了我们使用流式细胞术从消化的小鼠动脉中鉴定内皮细胞的方法示例。从消化的皮下（图3A）或肠系膜（图3B）脂肪动脉获得的细胞制剂在使用流式细胞术固定和鉴定活的CD31 + CD45−内皮细胞之前，用CD31-PE，CD45-FITC和细胞活力染料染色，与其他地方类似8。细胞活力染色仅允许鉴定那些在固定前在分离和消化方案中存活下来的活细胞。这种方法的使用将使研究人员能够评估感兴趣的活血管细胞的表达或功能。
为了确定从不同的脂肪库脉管系统中分离的内皮细胞是否表现出膜蛋白表达的差异，对分离的细胞进行了脂肪酸转位酶CD36的探测（图4），因为这种膜蛋白最近被证明在内皮介导的脂肪酸向组织中的分布中是必不可少的22.因此，确定膜CD36之间的相对表达差异，例如，在不同的血管床中，可能a）支持关于不同组织之间脂肪酸利用差异偏好的现有数据和/或b）揭示健康和疾病中脂肪酸组织分布的潜在新差异。从图3所示的消化血管细胞的相同制剂中，在皮下（图4A）和肠系膜（图4B）脂肪中鉴定CD31 + CD45−CD36 +内皮细胞，并在每个血管床中量化该群体中的CD36表达。图4C和图4D显示，与肠系膜内皮细胞相比，皮下内皮细胞中表达CD36的内皮细胞百分比和CD36表达强度均更大。这些初步发现支持使用我们的方法来识别血管床之间的明显差异。
图1：从皮下和内脏脂肪组织中分离内皮细胞用于下游应用的工作方案 。 （A）对10-12周龄的C57BL / 6J小鼠实施安乐死并用于演示该过程。（二）首先，去除皮下脂肪。（二）然后，随后去除肠系膜（内脏）脂肪组织。白色虚线表示解剖和取出后皮下（左）和肠系膜（右）脂肪库的位置。相应的动脉被隔离用于下游应用。（C）在该协议中，接下来使用特定的酶混合物消化分离的动脉，作为释放功能上可行的内皮细胞的第一步。（D）在流式细胞术分析之前，通过使用偶联抗体探测CD31 +和CD45−细胞来鉴定分离的内皮细胞。表达谱为CD31 + / CD45− 的细胞是需要进一步分析的内皮细胞。 请点击此处查看此图的大图。
图2：分离的皮下和内脏脂肪组织以及各自的动脉 。 （A）左：从后肢分离出的“C形”皮下脂肪组织。皮下脂肪动脉的一个主要分支，用箭头 （1） 表示，在去除实质脂肪时显露出来。右：孤立的皮下脂肪动脉。（B）左：肠系膜（内脏）脂肪组织从肠道中分离出来。右：通过切除实质组织来隔离相应的动脉弓。在脂肪（5毫米）和动脉（1毫米）的图片之间使用不同的刻度。 请点击此处查看此图的大图。
图3：通过流式细胞术鉴定动脉组织消化后的内皮细胞。 代表性图显示从孤立的 （A） 皮下或 （B） 肠系膜脂肪动脉释放的细胞。细胞在固定前暴露于靶向CD31（PE）和CD45（FITC）细胞外表位的偶联抗体。流式细胞术用于鉴定CD31 + CD45−内皮细胞群。细胞活力染色用于仅选择在分离和消化方案中存活的细胞进行后续分析。此外，如果已知感兴趣的细胞类型的大小，则在此阶段进行适当的设门将进一步将预期的细胞群与污染细胞分开。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：通过流式细胞术分析皮下与肠系膜脂肪动脉内皮细胞中 CD36 膜表达。 代表性人群图和直方图显示 （A） 皮下或 （B） 肠系膜脂肪动脉中内皮 CD36 （APC） 膜表达。（C）在皮下与肠系膜EC中表达CD36的内皮细胞（ECs）的百分比（n = 5，3名男性，2名女性;*p <学生t检验后为0.05）。（D）皮下与肠系膜脂肪动脉中标准化EC膜CD36表达（n = 5，3男性，2女性;*p < 0.05，学生t检验后）。 请点击此处查看此图的大图。
Discussion
内皮功能障碍是严重疾病状态的前兆，可能导致动脉粥样硬化、高血压和卒中的发展3，23。虽然在给定病理条件下内皮功能障碍的已确定机制很多，但不同的血管床可能受到病理状况的不同影响4，24。此外，不同的心血管危险因素（例如，肥胖，高血压，血脂异常，吸烟，糖尿病）通过各种不同的机制诱发功能障碍23，25。因此，从已建立的疾病动物模型或可及的人体组织中分离内皮细胞群并对立即从体内环境中取出的细胞进行测定至关重要。与研究培养中的细胞相比，以这种方式分离细胞具有独特的优势，因为它们没有培养诱导的表型变化5，6。此外，包括异质内皮细胞群，如在体内观察到的26，27（并且可以使用流动辅助细胞分选进一步分离），从活生物体更好地告知体内环境。最后，该方法适用于多种动物模型和潜在人体组织的研究，如果需要，可用于生成原代细胞培养系。
该协议中的关键步骤，也是最需要针对此处未介绍的不同血管床或细胞类型进行调整的步骤，是血管组织的消化。此步骤必须针对细胞健康进行优化，而不会降低细胞产量。使用的特定酶和消化持续时间对于优化细胞健康和产量至关重要，以便能够充分进行下游测定。为了鉴定CD36的膜表达，如流式细胞术在皮下和肠系膜内皮细胞中检测到的那样（图4），开发了最初为膜片钳电生理学设计的消化方案的修改版本28 。这包括将胶原酶I消化时间延长至30分钟，以提高细胞产量，从而更好地满足流式细胞术的需求，而不是膜片钳研究所需的需求。由于这种修饰可能会在一定程度上影响细胞健康，因此在流式细胞术分析中使用了细胞活力染色剂，以确保按照该方案仅评估活的内皮细胞（图3）。建议旨在从血管组织中分离细胞的研究在评估所需方法之前应包括细胞活力标记。
所述方案足以从来自小鼠的≤1mg动脉样品中释放活的内皮细胞进行分析和下游应用;然而，如果要从不同的组织或生物体（例如人类）中分离出感兴趣的动脉，这将导致显着不同的动脉质量，则必须优化消化酶含量和孵育持续时间以有效地分离感兴趣的细胞群。对于一些起始组织量甚至比此处介绍的皮下和肠系膜床（例如冠状动脉）开始的血管床，每个样本可能需要汇集几只小鼠的动脉。事实上，对于任何给定的血管床来说，这可能是一个必要的步骤，因为结果方法需要相对较高的细胞产量。一个主要的限制是，由于每个样品消化的差异性质，即使来自同一血管床，不同批次的细胞产量有时也会显着不同。这可能会导致分析数据时出现问题，应在适当时通过规范化进行说明。例如，由于皮下和肠系膜脂肪动脉单个样本的细胞产量改变，CD36表达在原始数据中变化极大。因此，将原始数据归一化为CD31 + CD45−平均荧光强度，假设该方法将校正批次差异（图4）。当然，根据方法的不同，可能需要更复杂的统计分析和归一化方法。
总之，本文提出了一种解剖、分离和消化小鼠皮下动脉和肠系膜动脉的方法，以研究感兴趣的内皮靶标的表达和/或功能。通过修改所提出的方案，可以研究不同的血管床和细胞类型（例如，平滑肌细胞）。该协议作为大量可用实验方法的基础，有可能促进对血管细胞生物学和血管功能障碍机制的理解。
Disclosures
作者没有利益冲突。
Acknowledgments
怀念里奇·韦斯特，一位杰出的科学家、同事和亲爱的朋友。我们要感谢特拉华大学流式细胞术和生物成像核心作为特拉华生物技术研究所的一部分，感谢他们对我们研究的持续贡献。我们还要感谢艾玛·哈金斯对手稿的仔细审查和编辑。我们的工作得到了国家普通医学科学研究所P20GM113125-6564（I.S. Fancher）的支持。该项目还得到了特拉华州INBRE计划的支持，获得了美国国立卫生研究院和特拉华州（I.S. Fancher）的NIGMS（P20GM103446）的资助，以及特拉华大学普通大学研究基金（I.S. Fancher）。此内容完全由作者负责，并不一定代表NIH的官方观点。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue dissection tools | |||
| 5 forceps (2) | Fine Science Tools | 11252-00 | For isolation of mesenteric adipose depot and arteries transfer |
| 55 forceps (2) | Fine Science Tools | 11295-51 | For parenchymal adipose removal |
| Curved Bonn scissors | Fine Science Tools | 14061-10 | For isolation of mesenteric adipose depot |
| Graefe forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | For general dissection steps and isolation of subcutaneous adipose depot |
| Straight Bonn scissor | Fine Science Tools | 14060-09 | For general dissection steps and isolation of subcutaneous adipose depot |
| Stereoscope with light source | Laxco | Z230PT40 | For parenchymal adipose removal and artery isolation |
| Digestive enzymes for Artery Digestion | |||
| Collagenase Type I | Wothington-BioChem | LS004194 | |
| Dispase (Neutral Protease) | Wothington-BioChem | LS02110 | |
| Elastase | Wothington-BioChem | LS002292 | |
| Solutions Recipes | |||
| HEPES Buffer, pH 7.4 | Final concentration | ||
| Calcium chloride dihydrate | J.T.Baker | 1332-1 | 2 mM |
| Dextrose (D-glucose) anhydrous | Fisher | D16-500 | 10 mM |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | 10 mM |
| Magnesium Chloride | Fisher | M33-500 | 1 mM |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | 5 mM |
| Sodium chloride | Oxoid | LP0005 | 145 mM |
| Dissociation Solution, pH 7.30-7.40 | |||
| Dextrose (D-glucose) anhydrous | Fisher | D16-500 | 10 mM |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | 10 mM |
| Magnesium Chloride | Fisher | M33-500 | 2 mM |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | 56 mM |
| Sodium chloride | Oxoid | LP0005 | 55 mM |
| Sodium L-Glutamate monohydrate | TCI | G0188 | 80 mM |
| Flow Cytometry Analyses | |||
| 5 mL Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Falcon | 352235 | |
| CD31-PE | Miltenyi Biotec | 130-119-653 | 0.75µg/sample |
| CD36-APC | R&D Systems | AF2519 | 2.5µg/ sample |
| CD45-FITC | BioLegend | 103108 | 2.5µg/ sample |
| Live/Dead Fixable Violet Dead Cell Staining kit (cell viability stain) | Invitrogen | L34955 | 1µL/sample |
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