Summary
Ce protocole détaille une méthode pour la dissection des dépôts adipeux de souris et l’isolement et la digestion des artères respectives pour libérer puis identifier la population de cellules endothéliales. Les cellules fraîchement isolées utilisées dans des applications en aval feront progresser la compréhension de la biologie cellulaire vasculaire et des mécanismes du dysfonctionnement vasculaire.
Abstract
Les cellules endothéliales vasculaires qui tapissent la paroi du système vasculaire jouent un rôle important dans divers processus physiologiques, notamment la régulation du tonus vasculaire, les fonctions de barrière et l’angiogenèse. Le dysfonctionnement des cellules endothéliales est un prédicteur caractéristique et un facteur majeur de la progression des maladies cardiovasculaires graves, mais les mécanismes sous-jacents restent mal compris. La possibilité d’isoler et d’effectuer des analyses sur des cellules endothéliales de divers lits vasculaires dans leur forme native donnera un aperçu des processus des maladies cardiovasculaires. Ce protocole présente la procédure de dissection des tissus adipeux sous-cutanés et mésentériques de souris, suivie de l’isolement de leur système vasculaire artériel respectif. Les artères isolées sont ensuite digérées à l’aide d’un cocktail spécifique d’enzymes digestives axées sur la libération de cellules endothéliales fonctionnellement viables. Le tissu digéré est évalué par cytométrie en flux à l’aide de cellules CD31+/CD45− comme marqueurs pour l’identification positive des cellules endothéliales. Les cellules peuvent être triées pour des tests fonctionnels immédiats en aval ou utilisées pour générer des lignées cellulaires primaires. La technique d’isolement et de digestion des artères de différents lits vasculaires offrira aux chercheurs des options pour évaluer les cellules vasculaires fraîchement isolées des artères d’intérêt et leur permettra d’effectuer un large éventail de tests fonctionnels sur des types de cellules spécifiques.
Introduction
Les cellules endothéliales sont bien reconnues pour leurs rôles importants dans une variété de processus physiologiques, y compris les fonctions de barrière, l’angiogenèse et la régulation du tonus vasculaire 1,2. Bien que le dysfonctionnement des cellules endothéliales soit bien documenté dans la promotion de l’athérosclérose, de l’hypertension, du diabète, etc., les mécanismes sous-jacents à l’origine du dysfonctionnement endothélial restent mal compris et diffèrent probablement entre des lits vasculaires distincts 2,3,4. L’effort pour démêler ces mécanismes pathologiques du dysfonctionnement des cellules endothéliales est remis en question par l’accès limité à une population pure de cellules endothéliales à partir de tissus et/ou les changements phénotypiques des cellules endothéliales en culture 5,6. Par conséquent, être capable d’isoler et d’effectuer des analyses sur des cellules endothéliales de divers lits vasculaires dans leur forme native donnera un aperçu des processus de la maladie cardiovasculaire.
Ce protocole présente la procédure de dissection des tissus adipeux sous-cutanés et mésentériques de souris, suivie de l’isolement de leur système vasculaire artériel respectif. Les cellules endothéliales fonctionnellement viables qui tapissent les parois artérielles sont libérées à l’aide d’un cocktail spécifique d’enzymes. Un soin particulier a été apporté à l’optimisation des conditions du protocole de digestion afin d’obtenir un rendement suffisant en cellules endothéliales à partir de <1 mg de tissu de départ tout en conservant les marqueurs biomoléculaires intacts pour l’analyse. Les cellules endothéliales isolées sont ensuite identifiées par cytométrie de flux. La présence de CD31 (PECAM) est principalement utilisée pour identifier les cellules endothéliales. En raison de l’expression de CD31 dans d’autres types cellulaires, y compris plusieurs d’origine hématopoïétique qui expriment également CD45, la pureté des cellules endothéliales isolées a été encore améliorée par l’exclusion des cellules exprimant à la fois CD31 et CD45 5,6,7,8. De plus, selon la question de recherche et les applications en aval à utiliser, les chercheurs devraient envisager de sélectionner un vaste panel de marqueurs de sélection positifs et négatifs afin d’optimiser la pureté de la population cellulaire d’intérêt.
Bien que la technique de dissection et d’isolement des artères dépôts adipeuses ait été utilisée dans les publications précédentes 9,10,11,12,13, un protocole détaillé décrivant l’isolement des artères encastrées n’a pas encore été présenté. La démonstration de la technique d’isolement et de digestion des artères de différents lits vasculaires d’une espèce d’intérêt donnée offrira aux chercheurs des options pour évaluer des cellules vasculaires fraîchement isolées provenant d’artères d’intérêt et leur permettra d’effectuer un large éventail de tests fonctionnels sur des types de cellules spécifiques. Les tests peuvent inclure, sans toutefois s’y limiter, la cytométrie en flux pour le tri cellulaire et l’expression des protéines membranaires5,8, l’électrophysiologie pour l’activité des canaux ioniques9, le profilage moléculaire (analyses protéomiques/génomiques, etc.) 14,15, et la génération de lignées cellulaires primaires pour le criblage de médicaments in vitro16,17.
Protocol
L’utilisation d’animaux dans ces études a été approuvée par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université du Delaware (#1372).
1. Dissection tissulaire et nettoyage
REMARQUE: Des souris C57BL / 6J âgées de 10 à 12 semaines sont utilisées dans le protocole vidéo. Veuillez consulter la figure 1 pour le schéma et le résultat souhaité de la dissection tissulaire et du nettoyage des artères et consulter le tableau des matériaux pour obtenir la liste des fournitures et des renseignements sur le fabricant.
- Euthanasier la souris par asphyxie au CO2 suivie d’une luxation cervicale.
- Fixez la souris à l’aide de broches de dissection et vaporisez la surface ventrale avec de l’éthanol à 70%.
- Isolement des tissus adipeux sous-cutanés situés par chaque membre postérieur
NOTE: Outils de dissection nécessaires: ciseaux Bonn droits (9 cm) et pinces Graefe émoussées et incurvées.- Utilisez des forceps pour soulever la peau juste au-dessus des organes génitaux et faites une petite incision (2 mm) dans la peau.
- Insérez la pointe des ciseaux dans le site de l’incision et faites une incision médiane de 4-5 cm, en commençant par l’incision initiale et en disséquant crânienne jusqu’à la base du sternum. Faites attention à ne pas pénétrer dans la cavité abdominale.
- Faites une incision latérale de 1 cm, s’étendant latéralement à partir de la ligne médiane immédiatement en dessous du membre antérieur.
- Faites une incision diagonale de 1 cm entre le membre postérieur et les organes génitaux.
- Faites de petites coupures le long des incisions cutanées médianes pour décoller le tissu conjonctif associé et exposer le dépôt adipeux sous-cutané. Épinglez la peau vers le bas.
- Identifier le tissu adipeux sous-cutané en forme de C et l’artère/veine perpendiculaire à la cavité abdominale.
- Commencez par le bas de la forme C près des organes génitaux et saisissez doucement le tissu adipeux pour exposer les tissus conjonctifs. Faites de petites coupures dans le tissu conjonctif pour séparer la graisse de la peau. Évitez de perturber le système vasculaire exposé.
- Continuez à disséquer le tissu conjonctif jusqu’à ce que le tissu adipeux sous-cutané puisse être retiré intact. Séparez soigneusement l’artère exposée du tissu conjonctif environnant.
- Entreposer le tissu adipeux sous-cutané isolé dans un tampon HEPES sur de la glace jusqu’à ce que vous soyez prêt à isoler le lit vasculaire d’intérêt.
- Répétez les étapes 1.3.3.-1.3.5. pour le dépôt adipeux sous-cutané postérieur restant.
- Isolement du dépôt adipeux mésentérique
NOTE: Outils de dissection nécessaires: ciseaux Bonn droits (9 cm), pinces Graefe, une paire de pinces #5, ciseaux à iris droit et ciseaux Bonn incurvés (9 cm).- Utilisez la pince Graefe pour soulever la mince paroi de la cavité péritonéale au-dessus de la vessie et faites une petite incision à l’aide de ciseaux droits.
- Soulevez lentement la paroi de la cavité péritonéale pénétrée, insérez soigneusement les ciseaux d’iris droits dans le site d’incision et faites une incision de 4 à 5 cm de la vessie au sternum.
- Faites deux incisions horizontales de 1 cm de long avec les ciseaux d’iris droits, s’étendant latéralement de la ligne médiane jusqu’immédiatement au-dessus du membre postérieur et au-dessous du membre antérieur. Utilisez la pince Graefe pour décoller la musculature abdominale et exposer les viscères péritonéaux.
- Répétez l’étape 1.4.3. de l’autre côté.
- Utilisez la paire de forceps #5 pour soulever les intestins hors de la cavité viscérale pour révéler le tissu adipeux mésentérique.
- Utilisez les ciseaux incurvés et la pince #5 pour séparer le tissu adipeux le long du côlon, en commençant par le cæcum jusqu’à l’endroit où le côlon descend de la vue.
- Retournez au cæcum et utilisez les ciseaux incurvés et les pinces #5 pour séparer le tissu adipeux le long de l’intestin grêle jusqu’au pancréas. Retirez une petite partie du pancréas pour isoler complètement le tissu adipeux mésentérique.
REMARQUE: L’ablation d’une petite partie du pancréas avec le tissu adipeux mésentérique peut aider à nettoyer les artères car elle assure la stabilité pendant le nettoyage. - Entreposer le tissu adipeux mésentérique isolé dans un tampon HEPES sur de la glace jusqu’à ce qu’il soit prêt à isoler les artères mésentériques.
- Isolement des artères respectives des tissus adipeux sous-cutanés et mésentériques
NOTE: Outils de dissection nécessaires: une antenne parabolique de dissection et un stéréoscope avec une source lumineuse, une paire de pinces #55 et une paire de pinces #5.- Placer ~10 ml de tampon HEPES froid dans la capsule de dissection et transférer le tissu adipeux dans la boîte à l’aide de la pince #5.
- Utilisez le stéréoscope à un grossissement 1x pour visualiser et positionner le tissu adipeux afin d’exposer la ou les paires artère/veine (Figure 2).
- Utilisez la pince #55 pour retirer soigneusement le parenchyme adipeux de l’artère. Retirez de petits morceaux de tissu adipeux à la fois et observez attentivement les paires artère/veine sous le stéréoscope pour identifier et éviter d’endommager le système vasculaire d’intérêt.
NOTE: Ajustez le grossissement et la source lumineuse en conséquence pour nettoyer les artères. Augmentez le grossissement et l’intensité lumineuse pour mieux voir les artères lorsque le tissu adipeux est retiré. Le nettoyage fin des artères doit être effectué sous grossissement 4x-5x. Il est important de faire la distinction entre les tissus conjonctifs (collagènes), les veines et les artères. Les tissus conjonctifs et les fibres de collagène ont un aspect de ficelle sans branches, sont striés et ont une couleur blanchâtre. Contrairement aux fibres de collagène et aux tissus conjonctifs, les artères et les veines sont transparentes et ont de multiples branches avec une lumière définie. Les petites artères et veines peuvent sembler similaires en apparence lorsqu’elles sont exemptes de tissu parenchymateux. La présence de sang dans la lumière peut aider à identifier les artères des veines. Les veines ont des parois de vaisseaux sanguins plus minces et une lumière plus grande et contiennent plus de sang que les artères de taille comparable. - Répétez l’étape 1.5.3. jusqu’à ce que les artères soient complètement vides de tissu adipeux parenchymateux.
- Utilisez la pince #5 pour transférer les artères nettoyées dans un nouveau tube avec un tampon HEPES frais et gardez sur la glace jusqu’à ce qu’elles soient prêtes pour la digestion.
2. Digestion des artères isolées pour l’isolement des cellules endothéliales
REMARQUE : Veuillez consulter la figure 2 pour le schéma de la digestion tissulaire et de l’isolement des cellules endothéliales et le tableau des matériaux pour une liste complète des fournitures nécessaires au protocole.
- Ajouter 1 mg de dispase et d’élastase dans chaque tube microcentrifuge de 2 mL. Ajouter 2 mL de solution de dissociation dans chaque tube. Vortex et incuber à 37 °C jusqu’à dissolution complète. Utilisez une pince #5 pour transférer les artères nettoyées (étape 1.5.5.) vers les tubes d’échantillonnage respectifs. La concentration finale de chaque enzyme est de 0,5 mg/mL.
- Incuber à 37 °C pendant 1 h avec une agitation douce par inversion toutes les 10-15 minutes, de sorte que les artères soient suspendues en solution pour maintenir un contact constant et uniforme entre les enzymes et les artères.
- Peser 1 mg de collagénase de type I par échantillon et l’ajouter à de nouveaux tubes.
- Laissez les artères se déposer au fond du tube. Retirez 500 μL du tampon par le haut sans perturber les artères et transférez-le dans des tubes désignés contenant de la collagénase. Vortex et retourner la solution aux échantillons respectifs dans les tubes d’échantillon d’origine. La concentration finale de collagénase de type I est de 0,5 mg/mL.
- Incuber à 37 °C pendant 15 min. Assurez-vous que les artères se séparent en morceaux après une brève secousse du tube à échantillon. Si les artères ne se séparent pas en morceaux à la suite d’une perturbation, incuber par incréments de 5 minutes jusqu’à ce que la rupture artérielle soit visible.
- À l’aide d’une pipette en verre, triturer vigoureusement le tissu digéré 10x-15x pour dissocier mécaniquement les cellules.
- Faire passer la solution et digérer le tissu à travers une passoire cellulaire de 70 μm ou une crépine à tube de cytométrie en flux pour obtenir des suspensions unicellulaires.
3. Coloration des cellules endothéliales avant la cytométrie en flux
NOTE: La coloration et le traitement des cellules endothéliales sont effectués sur glace pour améliorer la viabilité cellulaire, sauf instructions. Les tubes à fond rond en polystyrène de 5 mL sont centrifugés à 1 163 x g pendant 3 min à température ambiante (RT).
- Centrifuger les suspensions unicellulaires à 1 163 x g pendant 3 min à TA.
- Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de PBS + 5% BSA pendant 30 min à TA.
REMARQUE : Les chercheurs devraient envisager de bloquer les récepteurs FC en fonction du type de cellule, de la cible d’intérêt et de l’anticorps utilisé18,19. - Ajouter 1 μL de coloration de viabilité cellulaire (excitation de 405 nm) (Tableau des matériaux) et incuber dans l’obscurité pendant 30 min à TA.
- Centrifuger la suspension cellulaire à 1 163 x g pendant 3 min à TA. Resuspendre la pastille de la cellule dans 200 μL de PBS + 1% BSA.
- Ajouter aux échantillons des anticorps primaires conjugués à CD31 (CD31-PE, 0,75 μg/échantillon) et CD45 (CD45-FITC, 2,5 μg/échantillon) et incuber sur une bascule au réfrigérateur pendant 15 minutes après avoir recouvert les échantillons de papier d’aluminium.
NOTE : Pour identifier et/ou obtenir une population pure de cellules endothéliales, sonder à la fois CD31 et CD45 à l’aide d’anticorps primaires conjugués CD31 et CD45 avec une fluorescence d’excitation/émission distincte et des cellules porte/tri avec un profil d’expression CD31+CD45−. Une compensation peut être exigée en fonction des fluorophores utilisés 18,20,21. - Lavez les cellules en ajoutant 1 mL de PBS + 1% de BSA directement à la suspension cellulaire.
- Centrifuger la suspension cellulaire à 1 163 x g pendant 3 min à TA. Retirer le surnageant et remettre en suspension dans 200 μL de formaldéhyde à 1 % avec 0,1 % de BSA. Conserver au réfrigérateur recouvert de papier d’aluminium jusqu’à ce qu’il soit prêt pour la cytométrie en flux.
REMARQUE: Les rendements cellulaires sont améliorés en réduisant les étapes de lavage et de centrifugation. Ceux-ci peuvent devoir être modifiés en fonction de l’approche axée sur les résultats. L’échantillon en fixateur doit être analysé dans les 24 heures.
Representative Results
Un schéma du flux de travail est illustré à la figure 1. Le schéma met en évidence les étapes de protocole décrites plus en détail dans le texte du protocole. La figure 2 montre des images d’adipeux sous-cutané (figure 2A, à gauche) après une dissection et d’une arcade artérielle sous-cutanée (figure 2A, à droite) après le nettoyage du tissu parenchymateux. La figure 2 montre également l’adipeux mésentérique (figure 2B, à gauche) après la dissection et l’arcade artérielle mésentérique (figure 2B, à droite) après le nettoyage du tissu parenchymateux.
Le protocole présenté ici est conçu pour aider les chercheurs potentiellement intéressés par a) la comparaison de lits vasculaires dépôts adipeux distincts dans des approches scientifiques fondamentales et/ou des modèles de maladies, b) la digestion des lits vasculaires avant l’isolement des cellules vasculaires d’intérêt pour une application en aval, et c) l’utilisation de la cytométrie en flux pour identifier les cellules vasculaires d’intérêt (Figure 3 ) pour diverses applications, y compris, mais sans s’y limiter, les analyses d’expression protéique effectuées ici (figure 4). La figure 3 détaille un exemple de notre approche pour identifier les cellules endothéliales des artères de souris digérées en utilisant la cytométrie en flux. Les préparations cellulaires obtenues à partir d’artères adipeuses sous-cutanées digérées (Figure 3A) ou mésentériques (Figure 3B) ont été colorées avec CD31-PE, CD45-FITC et un colorant de viabilité cellulaire avant la fixation et l’identification de cellules endothéliales CD31+CD45− viables par cytométrie de flux, comme cela a été fait ailleurs8. La coloration de viabilité cellulaire n’a permis d’identifier que les cellules viables qui ont survécu au protocole d’isolement et de digestion avant la fixation. L’utilisation de cette méthode permettra aux chercheurs d’évaluer l’expression ou la fonction de cellules vasculaires viables d’intérêt.
Pour déterminer si les cellules endothéliales isolées d’un système vasculaire dépôt adipeux distinct présentaient des différences dans l’expression des protéines membranaires, des cellules isolées ont été sondées pour détecter la translocase d’acide gras, CD36 (Figure 4), car il a récemment été démontré que cette protéine membranaire était essentielle dans la distribution endothéliale des acides gras aux tissus22 . Par conséquent, la détermination des différences d’expression relative entre les CD36 membranaires, par exemple, dans des lits vasculaires distincts peut a) appuyer les données existantes concernant la préférence différentielle pour l’utilisation des acides gras entre différents tissus et/ou b) dévoiler de nouvelles différences potentielles dans la distribution tissulaire des acides gras dans la santé et la maladie. À partir des mêmes préparations de cellules vasculaires digérées illustrées à la figure 3, des cellules endothéliales CD31+CD45−CD36+ ont été identifiées dans les cellules adipeuses sous-cutanées (Figure 4A) et mésentériques (Figure 4B), et l’expression de CD36 a été quantifiée dans cette population dans chaque lit vasculaire. Les figures 4C et 4D révèlent que le pourcentage de cellules endothéliales exprimant CD36 et l’intensité de l’expression de CD36 étaient plus élevés dans les cellules endothéliales sous-cutanées que dans les cellules endothéliales mésentériques. Ces résultats préliminaires appuient l’utilisation de notre méthodologie pour identifier les différences distinctes entre les lits vasculaires.
Figure 1 : Schéma de travail pour isoler les cellules endothéliales des tissus adipeux sous-cutanés et viscéraux pour des applications en aval. (A) Des souris C57BL/6J âgées de 10 à 12 semaines ont été euthanasiées et utilisées pour démontrer cette procédure. (Bi) Tout d’abord, le tissu adipeux sous-cutané est enlevé. (Bii) Ensuite, le tissu adipeux mésentérique (viscéral) est ensuite enlevé. Les lignes pointillées blanches indiquent l’emplacement des dépôts adipeux sous-cutanés (à gauche) et mésentériques (à droite) après la dissection et le retrait. Les artères respectives sont isolées pour des applications en aval. (C) Dans ce protocole, les artères isolées sont ensuite digérées à l’aide d’un cocktail enzymatique spécifique comme première étape dans la libération de cellules endothéliales fonctionnellement viables. (D) Les cellules endothéliales isolées sont identifiées en sondant les cellules CD31+ et CD45− à l’aide d’anticorps conjugués avant l’analyse par cytométrie en flux. Les cellules ayant un profil d’expression de CD31+/CD45− sont les cellules endothéliales d’intérêt pour des analyses supplémentaires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Tissus adipeux sous-cutanés et viscéraux isolés et artères respectives. (A) À gauche : Tissu adipeux sous-cutané « en forme de C » isolé des membres postérieurs. Une branche majeure de l’artère adipeuse sous-cutanée, désignée par une flèche (1), est révélée lorsque le parenchyme adipeux est enlevé. À droite : Artères adipeuses sous-cutanées isolées. (B) À gauche : Le tissu adipeux mésentérique (viscéral) est isolé de l’intestin. À droite : L’arcade artérielle respective est isolée en enlevant le tissu parenchymateux. Différentes échelles sont utilisées entre les images de adipeux (5 mm) et d’artères (1 mm). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Identification des cellules endothéliales suite à la digestion du tissu artériel par cytométrie en flux. Tracés représentatifs montrant des cellules libérées des artères adipeuses isolées (A) sous-cutanées ou (B) mésentériques. Les cellules ont été exposées à des anticorps conjugués qui ciblaient les épitopes extracellulaires de CD31 (PE) et CD45 (FITC) avant la fixation. La cytométrie en flux a été utilisée pour identifier la population de cellules endothéliales CD31+CD45−. Une coloration de viabilité cellulaire a été utilisée pour sélectionner uniquement les cellules qui ont survécu aux protocoles d’isolement et de digestion pour les analyses ultérieures. De plus, un point de contrôle approprié à cette étape séparera davantage une population cellulaire visée des cellules contaminantes si la taille du type de cellule d’intérêt est connue. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Analyse de l’expression membranaire de CD36 dans les cellules endothéliales de l’artère adipeuse sous-cutanée par cytométrie en flux. Graphiques de population représentatifs et histogrammes montrant l’expression membranaire endothéliale de CD36 (APC) dans (A) les artères adipeuses sous-cutanées ou (B) mésentériques. (C) Pourcentage de cellules endothéliales (CE) exprimant CD36 dans les CE sous-cutanées par rapport aux CE mésentériques (n = 5, 3 hommes, 2 femmes; *p < 0,05 après le test t de Student). (D) Expression normalisée de CD36 dans la membrane EC dans les artères adipeuses sous-cutanées vs mésentériques (n = 5, 3 hommes, 2 femmes; *p < 0,05 après le test t de Student). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Discussion
Le dysfonctionnement endothélial est un précurseur d’états pathologiques graves, probablement à l’origine du développement de l’athérosclérose, de l’hypertension et des accidents vasculaires cérébraux 3,23. Bien que les mécanismes identifiés sous-jacents au dysfonctionnement endothélial dans un état pathologique donné soient nombreux, des lits vasculaires distincts sont susceptibles d’être influencés différemment par des conditions pathologiques 4,24. De plus, différents facteurs de risque cardiovasculaires (p. ex. obésité, hypertension, dyslipidémie, tabagisme, diabète) induisent un dysfonctionnement par divers mécanismes distincts23,25. Par conséquent, il est essentiel d’isoler les populations de cellules endothéliales à partir de modèles animaux établis de maladie ou de tissus humains accessibles et d’effectuer des tests sur des cellules immédiatement retirées de l’environnement in vivo. L’isolement des cellules de cette manière présente un avantage unique par rapport à l’étude des cellules en culture en ce sens qu’elles sont exemptes de changements phénotypiques induits par la culture 5,6. De plus, l’inclusion d’une population de cellules endothéliales hétérogènes, telle qu’observée in vivo 26,27 (et qui peut être séparée davantage par tri cellulaire assisté par flux), d’un organisme vivant informe mieux l’environnement in vivo. Enfin, cette méthode est applicable à l’étude de nombreux modèles animaux et potentiellement de tissus humains et peut être utilisée pour générer des lignées de culture cellulaire primaire, si un tel besoin est justifié.
L’étape critique de ce protocole, et l’étape qui nécessitera le plus d’ajustements pour différents lits vasculaires ou types de cellules non présentés ici, est la digestion du tissu vasculaire. Cette étape doit être optimisée pour la santé cellulaire sans diminuer le rendement cellulaire. Les enzymes spécifiques utilisées et la durée de la digestion sont essentielles pour optimiser la santé cellulaire et le rendement afin de pouvoir effectuer correctement les tests en aval. Pour l’identification de l’expression membranaire de CD36, telle que détectée par cytométrie en flux dans les cellules endothéliales sous-cutanées et mésentériques (Figure 4), une version modifiée du protocole de digestion conçu à l’origine pour l’électrophysiologie patch-clamp28 a été développée. Cela comprenait une extension du temps de digestion de la collagénase I à 30 minutes pour augmenter les rendements cellulaires afin de mieux répondre aux exigences de la cytométrie en flux par rapport à ce qui est requis pour les études patch-clamp. Comme cette modification peut avoir un impact sur la santé cellulaire dans une certaine mesure, une coloration de viabilité cellulaire a été utilisée dans les analyses de cytométrie en flux pour s’assurer que seules les cellules endothéliales viables étaient évaluées selon ce protocole (Figure 3). Il est recommandé que les études visant à isoler les cellules du tissu vasculaire incluent un marqueur de viabilité cellulaire avant d’évaluer l’approche souhaitée.
Le protocole décrit est suffisant pour libérer des cellules endothéliales viables pour analyse et applications en aval à partir d’échantillons artériels de ≤1 mg provenant de souris; Cependant, si les artères d’intérêt devaient être isolées de différents tissus ou organismes (p. ex. humains) qui entraîneraient des masses artérielles significativement différentes, il faudrait optimiser la teneur en enzymes de digestion et la durée d’incubation pour isoler efficacement la population cellulaire d’intérêt. Pour certains lits vasculaires qui commencent avec des quantités encore plus petites de tissu de départ que les lits sous-cutanés et mésentériques présentés ici (p. ex. artères coronaires), la mise en commun des artères de plusieurs souris peut être nécessaire par échantillon. En effet, cela peut être une étape nécessaire pour un lit vasculaire donné étant donné que l’approche des résultats nécessite un rendement cellulaire relativement élevé. Une limitation majeure est que, en raison de la nature des variations par digestion de l’échantillon, les rendements cellulaires peuvent parfois être significativement différents d’un lot à l’autre, même lorsqu’ils proviennent du même lit vasculaire. Cela peut entraîner des problèmes lors de l’analyse des données et doit être pris en compte via la normalisation le cas échéant. Par exemple, l’expression de CD36 était extrêmement variable dans les données brutes en raison des modifications des rendements cellulaires dans des échantillons individuels d’artères adipeuses sous-cutanées et mésentériques. Par conséquent, les données brutes ont été normalisées à l’intensité moyenne de fluorescence CD31+CD45− en supposant que cette méthode corrigerait les différences entre les lots (figure 4). Bien entendu, selon l’approche, des analyses statistiques et des méthodes de normalisation plus sophistiquées peuvent être nécessaires.
En résumé, cet article présente une méthode pour disséquer, isoler et digérer les artères sous-cutanées et mésentériques de souris afin d’étudier l’expression et / ou la fonction de cibles endothéliales d’intérêt. Avec des modifications au protocole présenté, différents lits vasculaires et types de cellules (par exemple, les cellules musculaires lisses) peuvent être étudiés. Ce protocole, en tant que fondement d’une pléthore d’approches expérimentales disponibles, a le potentiel de faire progresser la compréhension de la biologie cellulaire vasculaire et des mécanismes du dysfonctionnement vasculaire.
Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
À la mémoire affectueuse de Rich West, un brillant scientifique, collègue et ami cher. Nous tenons à remercier le noyau de cytométrie en flux et de bioimagerie de l’Université du Delaware dans le cadre du Delaware Biotechnology Institute pour leurs contributions continues à nos études. Nous tenons également à remercier Emma Hudgins pour l’examen et la révision minutieux du manuscrit. Notre travail est soutenu par l’Institut national des sciences médicales générales P20GM113125-6564 (I.S. Fancher). Ce projet a également été soutenu par le programme Delaware INBRE, avec une subvention du NIGMS (P20GM103446) des National Institutes of Health et de l’État du Delaware (I.S. Fancher), et une subvention de recherche de l’Université du Delaware General University (I.S. Fancher). Ce contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles des NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue dissection tools | |||
| 5 forceps (2) | Fine Science Tools | 11252-00 | For isolation of mesenteric adipose depot and arteries transfer |
| 55 forceps (2) | Fine Science Tools | 11295-51 | For parenchymal adipose removal |
| Curved Bonn scissors | Fine Science Tools | 14061-10 | For isolation of mesenteric adipose depot |
| Graefe forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | For general dissection steps and isolation of subcutaneous adipose depot |
| Straight Bonn scissor | Fine Science Tools | 14060-09 | For general dissection steps and isolation of subcutaneous adipose depot |
| Stereoscope with light source | Laxco | Z230PT40 | For parenchymal adipose removal and artery isolation |
| Digestive enzymes for Artery Digestion | |||
| Collagenase Type I | Wothington-BioChem | LS004194 | |
| Dispase (Neutral Protease) | Wothington-BioChem | LS02110 | |
| Elastase | Wothington-BioChem | LS002292 | |
| Solutions Recipes | |||
| HEPES Buffer, pH 7.4 | Final concentration | ||
| Calcium chloride dihydrate | J.T.Baker | 1332-1 | 2 mM |
| Dextrose (D-glucose) anhydrous | Fisher | D16-500 | 10 mM |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | 10 mM |
| Magnesium Chloride | Fisher | M33-500 | 1 mM |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | 5 mM |
| Sodium chloride | Oxoid | LP0005 | 145 mM |
| Dissociation Solution, pH 7.30-7.40 | |||
| Dextrose (D-glucose) anhydrous | Fisher | D16-500 | 10 mM |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | 10 mM |
| Magnesium Chloride | Fisher | M33-500 | 2 mM |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | 56 mM |
| Sodium chloride | Oxoid | LP0005 | 55 mM |
| Sodium L-Glutamate monohydrate | TCI | G0188 | 80 mM |
| Flow Cytometry Analyses | |||
| 5 mL Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Falcon | 352235 | |
| CD31-PE | Miltenyi Biotec | 130-119-653 | 0.75µg/sample |
| CD36-APC | R&D Systems | AF2519 | 2.5µg/ sample |
| CD45-FITC | BioLegend | 103108 | 2.5µg/ sample |
| Live/Dead Fixable Violet Dead Cell Staining kit (cell viability stain) | Invitrogen | L34955 | 1µL/sample |
References
- Krüger-Genge, A., Blocki, A., Franke, R. P., Jung, F. Vascular endothelial cell biology: An update. International Journal of Molecular Sciences. 20 (18), 4411 (2019).
- Choi, S., Kim, J. A., Kim, K. C., Suh, S. H. Isolation and in vitro culture of vascular endothelial cells from mice. The Korean Journal of Physiology & Pharmacology. 19 (1), 35-42 (2015).
- Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: Testing and clinical relevance. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
- Nunan, E., et al. Obesity as a premature aging phenotype - Implications for sarcopenic obesity. Geroscience. , (2022).
- van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nature Protocols. 3 (6), 1085-1091 (2008).
- Dong, Q. G., et al. A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17 (8), 1599-1604 (1997).
- Amici, S. A., Dong, J., Guerau-de-Arellano, M. Molecular mechanisms modulating the phenotype of macrophages and microglia. Frontiers in Immunology. 8, 1520 (2017).
- Patel, J., et al. Functional definition of progenitors versus mature endothelial cells reveals key SoxF-dependent differentiation process. Circulation. 135 (8), 786-805 (2017).
- Ahn, S. J., et al. Inwardly rectifying K+ channels are major contributors to flow-induced vasodilatation in resistance arteries. The Journal of Physiology. 595 (7), 2339-2364 (2017).
- Bagchi, D. P., MacDougald, O. A. Identification and dissection of diverse mouse adipose depots. Journal of Visualized Experiments. (149), e59499 (2019).
- Ahn, S. J., et al. Cholesterol-induced suppression of endothelial Kir channels is a driver of impairment of arteriolar flow-induced vasodilation in humans. Hypertension. 79 (1), 126-138 (2022).
- Ahn, S. J., et al. Differential effects of obesity on visceral versus subcutaneous adipose arteries: Role of shear-activated Kir2.1 and alterations to the glycocalyx. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 322 (2), 156-166 (2022).
- Fancher, I. S., et al. Impairment of flow-sensitive inwardly rectifying K(+) channels via disruption of glycocalyx mediates obesity-induced endothelial dysfunction. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40 (9), 240-255 (2020).
- van Beijnum, J. R., et al. Gene expression of tumor angiogenesis dissected: Specific targeting of colon cancer angiogenic vasculature. Blood. 108 (7), 2339-2348 (2006).
- Hida, K., et al. Tumor-associated endothelial cells with cytogenetic abnormalities. Cancer Research. 64 (22), 8249-8255 (2004).
- Ades, E. W., et al. HMEC-1: Establishment of an immortalized human microvascular endothelial cell line. Journal of Investigative Dermatology. 99 (6), 683-690 (1992).
- Grange, C., et al. Isolation and characterization of human breast tumor-derived endothelial cells. Oncology Reports. 15 (2), 381-386 (2006).
- Liao, X., Makris, M., Luo, X. M. Fluorescence-activated cell sorting for purification of plasmacytoid dendritic cells from the mouse bone marrow. Journal of Visualized Experiments. (117), e54641 (2016).
- De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis, N. J. Isolating and immunostaining lymphocytes and dendritic cells from murine Peyer's patches. Journal of Visualized Experiments. (73), e50167 (2013).
- Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. Analysis of cell suspensions isolated from solid tissues by spectral flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (123), e55578 (2017).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. (41), e1546 (2010).
- Son, N. -H., et al. Endothelial cell CD36 optimizes tissue fatty acid uptake. The Journal of Clinical Investigation. 128 (10), 4329-4342 (2018).
- Bakker, W., Eringa, E. C., Sipkema, P., van Hinsbergh, V. W. M. Endothelial dysfunction and diabetes: roles of hyperglycemia, impaired insulin signaling and obesity. Cell and Tissue Research. 335 (1), 165-189 (2008).
- Farb, M. G., Gokce, N. Visceral adiposopathy: A vascular perspective. Hormone Molecular Biology and Clinical Investigation. 21 (2), 125-136 (2015).
- Williams, I. L., Wheatcroft, S. B., Shah, A. M., Kearney, M. T. Obesity, atherosclerosis and the vascular endothelium: mechanisms of reduced nitric oxide bioavailability in obese humans. International Journal of Obesity. 26 (6), 754-764 (2002).
- Cleuren, A. C. A., et al. The in vivo endothelial cell translatome is highly heterogeneous across vascular beds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (47), 23618-23624 (2019).
- Aird, W. C.
- Sonkusare, S. K., Dalsgaard, T., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Inward rectifier potassium (Kir2.1) channels as end-stage boosters of endothelium-dependent vasodilators. The Journal of Physiology. 594 (12), 3271-3285 (2016).
