Summary
Detta protokoll beskriver en metod för dissektion av musfettdepåer och isolering och matsmältning av respektive artärer för att frigöra och sedan identifiera endotelcellpopulationen. Nyisolerade celler som används i nedströmsapplikationer kommer att främja förståelsen för vaskulär cellbiologi och mekanismerna för vaskulär dysfunktion.
Abstract
Vaskulära endotelceller som kantar kärlsystemets vägg spelar viktiga roller i en mängd olika fysiologiska processer, inklusive vaskulär tonreglering, barriärfunktioner och angiogenes. Endotelcellsdysfunktion är en kännetecknande prediktor och viktig drivkraft för utvecklingen av allvarliga hjärt-kärlsjukdomar, men de underliggande mekanismerna är fortfarande dåligt förstådda. Förmågan att isolera och utföra analyser på endotelceller från olika kärlbäddar i deras ursprungliga form kommer att ge insikt i processerna vid hjärt-kärlsjukdom. Detta protokoll presenterar proceduren för dissektion av mus subkutana och mesenteriska fettvävnader, följt av isolering av deras respektive arteriella vaskulatur. De isolerade artärerna smälts sedan med hjälp av en specifik cocktail av matsmältningsenzymer som fokuserar på att frigöra funktionellt livskraftiga endotelceller. Den smälta vävnaden bedöms genom flödescytometrianalys med hjälp av CD31+/CD45− celler som markörer för positiv endotelcellsidentifiering. Celler kan sorteras för omedelbara nedströms funktionella analyser eller användas för att generera primära cellinjer. Tekniken för att isolera och smälta artärer från olika vaskulära sängar kommer att ge alternativ för forskare att utvärdera nyligen isolerade vaskulära celler från artärer av intresse och låta dem utföra ett brett spektrum av funktionella tester på specifika celltyper.
Introduction
Endotelceller är välkända för sina viktiga roller i en mängd olika fysiologiska processer, inklusive barriärfunktioner, angiogenes och vaskulär tonreglering 1,2. Även om endotelcellsdysfunktion är väl dokumenterad för att främja åderförkalkning, högt blodtryck, diabetes etc., är de underliggande mekanismerna som driver endoteldysfunktion fortfarande dåligt förstådda och skiljer sig sannolikt mellan distinkta vaskulära sängar 2,3,4. Ansträngningen att avslöja dessa patologiska mekanismer för endotelcellsdysfunktion utmanas av den begränsade tillgången till en ren population av endotelceller från vävnader och / eller fenotypiska förändringar av endotelceller i odling 5,6. Att kunna isolera och utföra analyser på endotelceller från olika kärlbäddar i sin ursprungliga form kommer därför att ge insikt i processerna vid hjärt-kärlsjukdom.
Detta protokoll presenterar proceduren för att dissekera subkutana och mesenteriska fettvävnader från möss, följt av isolering av deras respektive arteriella vaskulatur. Funktionellt livskraftiga endotelceller som fodrar artärväggarna frigörs med hjälp av en specifik cocktail av enzymer. Särskild försiktighet vidtogs för att optimera villkoren för matsmältningsprotokollet för att erhålla ett tillräckligt utbyte av endotelceller från <1 mg startvävnad samtidigt som biomolekylära markörer hålls intakta för analys. Isolerade endotelceller identifieras därefter med hjälp av flödescytometri. Närvaron av CD31 (PECAM) används för att primärt identifiera endotelceller. På grund av uttrycket av CD31 i andra celltyper, inklusive flera av hematopoetiskt ursprung som också uttrycker CD45, förbättrades renheten hos de isolerade endotelcellerna ytterligare genom uteslutning av celler som uttrycker både CD31 och CD45 5,6,7,8. Dessutom, beroende på forskningsfrågan och de nedströms applikationer som ska användas, bör forskare överväga att välja en omfattande panel av positiva och negativa urvalsmarkörer för att optimera renheten hos cellpopulationen av intresse.
Även om tekniken för att dissekera och isolera fettdepåartärer har använts i de tidigare publikationerna 9,10,11,12,13, har ett detaljerat protokoll som beskriver isoleringen av inbäddade artärer ännu inte presenterats. Att demonstrera tekniken för isolering och matsmältning av artärer från olika vaskulära sängar från en given art av intresse kommer att ge alternativ för forskare att utvärdera nyisolerade vaskulära celler från artärer av intresse och låta dem utföra ett brett spektrum av funktionella tester på specifika celltyper. Tester kan inkludera men är inte begränsade till flödescytometri för cellsortering och membranproteinuttryck5,8, elektrofysiologi för jonkanalaktivitet9, molekylär profilering (proteomik / genomiska analyser etc.) 14,15, och generering av primära cellinjer för läkemedelsscreening in vitro16,17.
Protocol
Användningen av djur i dessa studier godkändes av University of Delaware, Institutional Animal Care and Use Committee (#1372).
1. Vävnadsdissektion och rengöring
OBS: 10- till 12-veckors gamla C57BL / 6J-möss används i videoprotokollet. Se figur 1 för schemat och det önskade resultatet av vävnadsdissektion och rengöringsartärer och se materialförteckningen för en förteckning över förbrukningsartiklar och information från tillverkaren.
- Avliva musen genom CO2-kvävning följt av livmoderhalsförskjutning.
- Säkra musen med dissektionsstift och spraya den ventrala ytan med 70% etanol.
- Isolering av subkutana fettvävnader belägna vid varje bakben
OBS: Dissekeringsverktyg behövs: rak Bonn-sax (9 cm) och trubbiga, böjda Graefe-pincett.- Använd pincett för att lyfta huden precis ovanför könsorganen och gör ett litet (2 mm) snitt i huden.
- Sätt in saxens spets i snittstället och gör ett snitt på 4-5 cm mittlinjen, som börjar vid det första snittet och dissekerar kranialt till bröstbenets botten. Var försiktig så att du inte tränger in i bukhålan.
- Gör ett 1 cm lateralt snitt, som sträcker sig i sidled från mittlinjen omedelbart under frambenet.
- Gör ett diagonalt 1 cm snitt mellan bakbenet och könsorganen.
- Gör små snitt längs mittlinjens hudsnitt för att skala bort den tillhörande bindväven och exponera den subkutana fettdepån. Fäst ner huden.
- Identifiera den "C-formade" subkutana fettvävnaden och artären / venen som löper vinkelrätt mot bukhålan.
- Börja från botten av C-formen nära könsorganen och ta försiktigt tag i fettvävnaden för att exponera bindväven. Gör små snitt i bindväven för att separera fettet från huden. Undvik att störa den exponerade kärlen.
- Fortsätt dissekera bort bindväven tills den subkutana fettvävnaden kan tas bort intakt. Separera försiktigt den exponerade artären från den omgivande bindväven.
- Förvara det isolerade subkutana fettet i HEPES-bufferten på is tills det är klart att isolera kärlbädden av intresse.
- Upprepa steg 1.3.3.-1.3.5. för den återstående bakre subkutana fettdepån.
- Isolering av den mesenteriska fettdepån
OBS: Dissekeringsverktyg behövs: rak Bonn-sax (9 cm), Graefe-pincett, ett par # 5-pincett, rak irissax och böjd Bonn-sax (9 cm).- Använd Graefe-tången för att lyfta den tunna bukhålans vägg ovanför urinblåsan och gör ett litet snitt med rak sax.
- Lyft långsamt den penetrerade bukhålans vägg, sätt försiktigt in den raka irisaxen i snittstället och gör ett snitt på 4-5 cm från urinblåsan till bröstbenet.
- Gör två 1 cm långa horisontella snitt med den raka irisaxen, som sträcker sig i sidled från mittlinjen till omedelbart ovanför bakbenet och under frambenet. Använd Graefe-tången för att dra tillbaka bukmuskulaturen och exponera bukhinnorna.
- Upprepa steg 1.4.3. på motsatt sida.
- Använd paret #5 pincett för att lyfta tarmarna ur visceralhålan för att avslöja det mesenteriska fettet.
- Använd den böjda saxen och # 5-tången för att separera fettet längs tjocktarmen, från caecum till där tjocktarmen sjunker från vyn.
- Återgå till caecum och använd den böjda saxen och #5 pincett för att separera fettet längs tunntarmen till bukspottkörteln. Ta bort en liten del av bukspottkörteln för att helt isolera det mesenteriska fettet.
OBS: Att ta bort en liten del av bukspottkörteln tillsammans med det mesenteriska fettet kan hjälpa till att rengöra artärerna eftersom det ger stabilitet under rengöring. - Förvara det isolerade mesenteriska fettet i HEPES-buffert på is tills det är klart att isolera de mesenteriska artärerna.
- Isolering av respektive artärer från subkutana och mesenteriska fettvävnader
OBS: Dissekeringsverktyg behövs: en dissekeringsskål och stereoskop med en ljuskälla, ett par # 55-pincett och ett par # 5-pincett.- Placera ~ 10 ml kall HEPES-buffert i dissekeringsskålen och överför fettvävnaden till skålen med hjälp av # 5-pincetten.
- Använd stereoskopet med 1x förstoring för att visa och placera fettvävnaden för att exponera artär-/venparet (figur 2).
- Använd # 55-tången för att försiktigt ta bort det parenkymala fettet från artären. Ta bort små fettbitar åt gången och observera noggrant artär-/venpar under stereoskopet för att identifiera och undvika att skada kärlen av intresse.
NOT: Justera förstoringen och ljuskällan i enlighet därmed för att rengöra artärerna. Öka förstoringen och ljusintensiteten för att bättre se artärerna när fett tas bort. Fin rengöring av artärerna bör göras under 4x-5x förstoring. Det är viktigt att skilja mellan bindväv (kollagener), vener och artärer. Bindvävnader och kollagenfibrer har ett strängliknande utseende utan grenar, är strimmiga och har en vitaktig färg. Till skillnad från kollagenfibrer och bindväv är artärer och vener transparenta och har flera grenar med en definierad lumen. Små artärer och vener kan se liknande ut när de är fria från parenkymal vävnad. Närvaron av blod i lumen kan ytterligare hjälpa en att identifiera artärerna från vener. Vener har tunnare blodkärlsväggar och en större lumen och innehåller mer blod jämfört med jämförbart stora artärer. - Upprepa steg 1.5.3. tills artärerna är helt tomma på parenkymal fettvävnad.
- Använd #5 pincett för att överföra de rengjorda artärerna till ett nytt rör med färsk HEPES-buffert och håll på is tills de är redo för matsmältning.
2. Digestion av isolerade artärer för isolering av endotelceller
OBS: Se figur 2 för schematisk uppslutning av vävnad och isolering av endotelceller och materialförteckningen för en fullständig lista över förnödenheter som behövs för protokollet.
- Tillsätt 1 mg vardera dispase och elastas till varje 2 ml mikrocentrifugrör. Tillsätt 2 ml dissociationslösning till varje rör. Virvel och inkubera vid 37 °C tills den är helt upplöst. Använd #5 pincett för att överföra de rengjorda artärerna (steg 1.5.5.) till respektive provrör. Den slutliga koncentrationen av varje enzym är 0,5 mg/ml.
- Inkubera vid 37 °C i 1 timme med mild omrörning genom inversion var 10-15 min, så att artärerna suspenderas i lösning för att upprätthålla konsekvent och enhetlig kontakt mellan enzymerna och artärerna.
- Väg 1 mg kollagenas typ I per prov och lägg det i nya rör.
- Låt artärerna sätta sig i botten av röret. Ta bort 500 μl av bufferten från toppen utan att störa artärerna och överför den till utsedda rör som innehåller kollagenas. Vortex och återför lösningen till respektive prov i de ursprungliga provrören. Den slutliga koncentrationen av kollagenas typ I är 0,5 mg/ml.
- Inkubera vid 37 °C i 15 minuter. Se till att artärerna separeras i bitar efter kort skakning av provröret. Om artärerna inte separeras i bitar efter störning, inkubera i steg om 5 minuter tills artärnedbrytningen är synlig.
- Använd en glaspipett och triturera kraftigt den smälta vävnaden 10x-15x för att mekaniskt dissociera cellerna.
- För lösningen och den smälta vävnaden genom en 70 μm cellsil eller en flödescytometrirörsil för att erhålla encelliga suspensioner.
3. Färgning av endotelceller före flödescytometri
OBS: Färgning och bearbetning av endotelceller utförs på is för att förbättra cellviabiliteten, såvida inte instrueras. De runda plaströren på 5 ml polystyren centrifugeras vid 1 163 x g i 3 minuter vid rumstemperatur (RT).
- Centrifugera encellssuspensionerna vid 1,163 x g i 3 minuter vid RT.
- Ta bort supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 1 ml PBS + 5% BSA i 30 min vid RT.
OBS: Forskare bör överväga att blockera FC-receptorer beroende på celltyp, mål av intresse och antikropp som används18,19. - Tillsätt 1 μl cellviabilitetsfläck (405 nm excitation) (materialtabell) och inkubera i mörker i 30 minuter vid RT.
- Centrifugera cellsuspensionen vid 1,163 x g i 3 min vid RT. Återsuspendera cellpelleten i 200 μl PBS + 1% BSA.
- Till proverna, tillsätt primära antikroppar konjugerade till CD31 (CD31-PE, 0,75 μg/prov) och CD45 (CD45-FITC, 2,5 μg/prov) och inkubera på en vippa i kylen i 15 minuter efter att proverna täckts med aluminiumfolie.
OBS: För att identifiera och / eller erhålla en ren population av endotelceller, sond för både CD31 och CD45 med användning av CD31- och CD45-konjugerade primära antikroppar med distinkt excitation / emissionsfluorescens och grind / sortera celler med en CD31 + CD45 − uttrycksprofil. Kompensation kan krävas beroende på vilka fluoroforer som används 18,20,21. - Tvätta cellerna genom att tillsätta 1 ml PBS + 1% BSA direkt till cellsuspensionen.
- Centrifugera cellsuspensionen vid 1,163 x g i 3 min vid RT. Ta bort supernatanten och återsuspendera i 200 μl 1% formaldehyd med 0,1% BSA. Förvara i kylskåpet täckt med aluminiumfolie tills det är klart för flödescytometri.
OBS: Cellutbytet förbättras genom att minska tvätt- och centrifugeringsstegen. Dessa kan behöva ändras beroende på resultatet. Provet i fixativ bör analyseras inom 24 timmar.
Representative Results
Ett schema över arbetsflödet visas i bild 1. Schemat belyser protokollstegen som beskrivs mer detaljerat i protokolltexten. Figur 2 visar bilder av subkutan fett (figur 2A, vänster) efter dissektion och en subkutan artärarkad (figur 2A, höger) efter rengöring av parenkymvävnaden. Figur 2 visar också det mesenteriska fettet (figur 2B, vänster) efter dissektion och den mesenteriska arteriella arkaden (figur 2B, höger) efter rengöring av parenkymvävnaden.
Protokollet som presenteras här är utformat för att hjälpa forskare som potentiellt är intresserade av att a) jämföra distinkta fettdepåvaskulaturbäddar i grundläggande vetenskapliga tillvägagångssätt och / eller sjukdomsmodeller, b) matsmältningen av vaskulära sängar före isolering av vaskulära celler av intresse för nedströms applicering, och c) användningen av flödescytometri för att identifiera vaskulära celler av intresse (Figur 3 ) för en rad olika tillämpningar, inklusive, men inte begränsat till, proteinuttrycksanalyser som utförs här (figur 4). Figur 3 beskriver ett exempel på vår metod för att identifiera endotelceller från smälta musartärer med hjälp av flödescytometri. Cellpreparat erhållna från smälta subkutana (figur 3A) eller mesenteriska (figur 3B) fettartärer färgades med CD31-PE, CD45-FITC och ett cellviabilitetsfärgämne före fixering och identifiering av livskraftiga CD31 + CD45- endotelceller med hjälp av flödescytometri, som på liknande sätt utfördes någon annanstans8. Cellviabilitetsfläcken möjliggjorde identifiering av endast de livskraftiga celler som överlevde isolerings- och matsmältningsprotokollet före fixering. Användningen av denna metod gör det möjligt för forskare att bedöma uttrycket eller funktionen hos livskraftiga vaskulära celler av intresse.
För att avgöra om endotelceller isolerade från distinkt fettdepåvaskulatur uppvisade skillnader i membranproteinuttryck, undersöktes isolerade celler för fettsyratranslocaset, CD36 (figur 4), eftersom detta membranprotein nyligen visade sig vara viktigt i den endotelmedierade fördelningen av fettsyror till vävnader22 . Därför kan bestämning av de relativa uttrycksskillnaderna mellan membran-CD36, till exempel i distinkta vaskulära bäddar, a) stödja befintliga data om differentiell preferens för fettsyrautnyttjande mellan olika vävnader och / eller b) avslöja potentiella nya skillnader i vävnadsfördelning av fettsyror i hälsa och sjukdom. Från samma preparat av smälta vaskulära celler som exemplifieras i figur 3 identifierades CD31 + CD45 − CD36 + endotelceller i subkutant (figur 4A) och mesenteriskt (figur 4B) fett, och CD36-uttryck kvantifierades i denna population i varje kärlbädd. Figur 4C och figur 4D visar att både andelen endotelceller som uttrycker CD36 och intensiteten av CD36-uttryck var större i subkutana endotelceller jämfört med den som observerades i mesenteriska endotelceller. Dessa preliminära resultat stöder användningen av vår metod för att identifiera tydliga skillnader mellan kärlbäddar.
Figur 1: Arbetsschema för att isolera endotelceller från subkutana och viscerala fettvävnader för nedströmstillämpningar . (A)10-12 veckor gamla C57BL/6J-möss avlivades och användes för att demonstrera detta förfarande. (Bi) Först avlägsnas det subkutana fettet. (Bii) Därefter avlägsnas den mesenteriska (viscerala) fettvävnaden. De vita streckade linjerna anger platserna för de subkutana (vänstra) och mesenteriska (högra) fettdepåerna efter dissektion och borttagning. Respektive artärer är isolerade för nedströmsapplikationer. (C) I detta protokoll smälts isolerade artärer nästa med hjälp av en specifik enzymcocktail som ett första steg för att frigöra funktionellt livskraftiga endotelceller. (D) Isolerade endotelceller identifieras genom sondering för CD31+ och CD45− celler med hjälp av konjugerade antikroppar före flödescytometrianalys. Celler med uttrycksprofilen CD31+/CD45− är endotelcellerna av intresse för ytterligare analyser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Isolerade subkutana och viscerala fettvävnader och respektive artärer. (A) Vänster: Isolerad "C-formad" subkutan fettvävnad från bakbenen. En huvudgren av den subkutana fettartären, betecknad med pil (1), avslöjas när parenkymalt fett avlägsnas. Höger: Isolerade subkutana fettartärer. (B) Vänster: Den mesenteriska (viscerala) fettvävnaden är isolerad från tarmen. Höger: Respektive arteriell arkad isoleras genom att ta bort den parenkymala vävnaden. Olika skalor används mellan bilderna av fett (5 mm) och artärer (1 mm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Identifiering av endotelceller efter artärvävnadssmältning via flödescytometri. Representativa diagram som visar celler befriade från isolerade (A) subkutana eller (B) mesenteriska fettartärer. Celler exponerades för konjugerade antikroppar som riktade sig mot extracellulära epitoper av CD31 (PE) och CD45 (FITC) före fixering. Flödescytometri användes för att identifiera CD31 + CD45- endotelcellpopulationen. En cellviabilitetsfläck användes för att endast välja de celler som överlevde isolerings- och matsmältningsprotokollen för efterföljande analyser. Dessutom kommer lämplig gating i detta skede att ytterligare separera en avsedd cellpopulation från förorenande celler om storleken på celltypen av intresse är känd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Analys av CD36-membranuttryck i subkutan kontra mesenterisk fettartärendotelceller via flödescytometri. Representativa populationsdiagram och histogram som visar endotelial CD36 (APC) membranuttryck i (A) subkutana eller (B) mesenteriska fettartärer. (C) Procentandel endotelceller (EC) som uttrycker CD36 i subkutana kontra mesenteriska ECs (n = 5, 3 män, 2 honor; *p < 0,05 efter Students t-test). (D) Normaliserat EC-membran CD36-uttryck i subkutana kontra mesenteriska fettartärer (n = 5, 3 män, 2 honor; *p < 0,05 efter Students t-test). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Endotelial dysfunktion är en föregångare till allvarliga sjukdomstillstånd, vilket sannolikt driver utvecklingen av åderförkalkning, högt blodtryck och stroke 3,23. Medan de identifierade mekanismerna som ligger till grund för endoteldysfunktion i ett givet patologiskt tillstånd är många, kommer distinkta vaskulära sängar sannolikt att påverkas differentiellt av patologiska tillstånd 4,24. Dessutom inducerar olika kardiovaskulära riskfaktorer (t.ex. fetma, högt blodtryck, dyslipidemi, rökning, diabetes) dysfunktion genom en mängd olika mekanismer23,25. Därför är det viktigt att isolera endotelcellpopulationer från etablerade djurmodeller av sjukdom eller tillgänglig mänsklig vävnad och utföra analyser på celler som omedelbart avlägsnas från in vivo-miljön. Att isolera celler på detta sätt har en unik fördel jämfört med att studera celler i odling genom att de är tomma på odlingsinducerade fenotypiska förändringar 5,6. Dessutom, inklusive en heterogen endotelcellpopulation, som observerats in vivo 26,27 (och som kan separeras ytterligare med hjälp av flödesassisterad cellsortering), från en levande organism informerar bättre in vivo-miljön. Slutligen är denna metod tillämplig på undersökning av många djurmodeller och potentiellt mänsklig vävnad och kan användas för att generera primära cellodlingslinjer, om ett sådant behov är motiverat.
Det kritiska steget i detta protokoll, och det steg som behöver mest justering för olika vaskulära sängar eller celltyper som inte presenteras här, är matsmältningen av kärlvävnad. Detta steg måste optimeras för cellhälsa utan att minska cellutbytet. De specifika enzymer som används och varaktigheten för matsmältningen är avgörande för att optimera cellhälsa och avkastning för att kunna utföra nedströmsanalyser på ett adekvat sätt. För identifiering av membranuttryck av CD36, som detekterats genom flödescytometri i subkutana och mesenteriska endotelceller (figur 4), utvecklades en modifierad version av matsmältningsprotokollet som ursprungligen var utformat för patch-clamp-elektrofysiologi28 . Detta inkluderade en förlängning av kollagenas I matsmältningstid till 30 min för att öka cellutbytet för att bättre möta kraven på flödescytometri jämfört med vad som krävs för patch-clamp-studier. Eftersom denna modifiering kan påverka cellhälsan i viss utsträckning användes en cellviabilitetsfläck i flödescytometrianalyserna för att säkerställa att endast livskraftiga endotelceller bedömdes enligt detta protokoll (figur 3). Det rekommenderas att studier som syftar till att isolera celler från kärlvävnad bör innehålla en markör för cellviabilitet innan man bedömer det önskade tillvägagångssättet.
Det beskrivna protokollet är tillräckligt för att frigöra livskraftiga endotelceller för analys och nedströms applikationer från ≤1 mg arteriella prover härledda från möss; Men om artärerna av intresse skulle isoleras från olika vävnader eller organismer (t.ex. människor) som skulle resultera i signifikant olika arteriella massor, skulle man behöva optimera matsmältningsenzyminnehållet och inkubationens varaktighet för att effektivt isolera cellpopulationen av intresse. För vissa vaskulära sängar som börjar med ännu mindre mängder startvävnad än de subkutana och mesenteriska sängarna som presenteras här (t.ex. kranskärl) kan sammanslagning av artärer från flera möss vara nödvändig per prov. Detta kan faktiskt vara ett nödvändigt steg för en viss kärlbädd med tanke på att resultatmetoden kräver ett relativt högt cellutbyte. En stor begränsning är att på grund av variationerna per provförtunning kan cellutbytet ibland vara signifikant olika över satser även från samma kärlbädd. Detta kan orsaka problem vid analys av data och bör redovisas via normalisering när det är lämpligt. Till exempel var CD36-uttrycket extremt variabelt i rådata på grund av förändringar i cellutbyten över enskilda prover av subkutana och mesenteriska fettartärer. Därför normaliserades rådata till CD31 + CD45 - genomsnittlig fluorescensintensitet med antagandet att denna metod skulle korrigera för batchskillnader (figur 4). Naturligtvis, beroende på tillvägagångssätt, kan mer sofistikerade statistiska analyser och normaliseringsmetoder krävas.
Sammanfattningsvis presenterar detta papper en metod för att dissekera, isolera och smälta subkutana och mesenteriska artärer från möss för att undersöka uttrycket och / eller funktionen hos endotelmål av intresse. Med modifieringar av det presenterade protokollet kan olika vaskulära sängar och celltyper (t.ex. glattmuskelceller) undersökas. Detta protokoll, som en grund för en uppsjö av tillgängliga experimentella tillvägagångssätt, har potential att främja förståelsen för vaskulär cellbiologi och mekanismer för vaskulär dysfunktion.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Till kärleksfullt minne av Rich West, en lysande forskare, kollega och kär vän. Vi vill tacka University of Delaware Flow Cytometry och BioImaging Core som en del av Delaware Biotechnology Institute för deras pågående bidrag till våra studier. Vi vill också tacka Emma Hudgins för den noggranna genomgången och redigeringen av manuskriptet. Vårt arbete stöds av National Institute of General Medical Sciences P20GM113125-6564 (I.S. Fancher). Detta projekt stöddes också av Delaware INBRE-programmet, med ett bidrag från NIGMS (P20GM103446) från National Institutes of Health och delstaten Delaware (I.S. Fancher) och ett University of Delaware General University Research-bidrag (I.S. Fancher). Detta innehåll är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis NIH: s officiella åsikter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue dissection tools | |||
| 5 forceps (2) | Fine Science Tools | 11252-00 | For isolation of mesenteric adipose depot and arteries transfer |
| 55 forceps (2) | Fine Science Tools | 11295-51 | For parenchymal adipose removal |
| Curved Bonn scissors | Fine Science Tools | 14061-10 | For isolation of mesenteric adipose depot |
| Graefe forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | For general dissection steps and isolation of subcutaneous adipose depot |
| Straight Bonn scissor | Fine Science Tools | 14060-09 | For general dissection steps and isolation of subcutaneous adipose depot |
| Stereoscope with light source | Laxco | Z230PT40 | For parenchymal adipose removal and artery isolation |
| Digestive enzymes for Artery Digestion | |||
| Collagenase Type I | Wothington-BioChem | LS004194 | |
| Dispase (Neutral Protease) | Wothington-BioChem | LS02110 | |
| Elastase | Wothington-BioChem | LS002292 | |
| Solutions Recipes | |||
| HEPES Buffer, pH 7.4 | Final concentration | ||
| Calcium chloride dihydrate | J.T.Baker | 1332-1 | 2 mM |
| Dextrose (D-glucose) anhydrous | Fisher | D16-500 | 10 mM |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | 10 mM |
| Magnesium Chloride | Fisher | M33-500 | 1 mM |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | 5 mM |
| Sodium chloride | Oxoid | LP0005 | 145 mM |
| Dissociation Solution, pH 7.30-7.40 | |||
| Dextrose (D-glucose) anhydrous | Fisher | D16-500 | 10 mM |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | 10 mM |
| Magnesium Chloride | Fisher | M33-500 | 2 mM |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | 56 mM |
| Sodium chloride | Oxoid | LP0005 | 55 mM |
| Sodium L-Glutamate monohydrate | TCI | G0188 | 80 mM |
| Flow Cytometry Analyses | |||
| 5 mL Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Falcon | 352235 | |
| CD31-PE | Miltenyi Biotec | 130-119-653 | 0.75µg/sample |
| CD36-APC | R&D Systems | AF2519 | 2.5µg/ sample |
| CD45-FITC | BioLegend | 103108 | 2.5µg/ sample |
| Live/Dead Fixable Violet Dead Cell Staining kit (cell viability stain) | Invitrogen | L34955 | 1µL/sample |
References
- Krüger-Genge, A., Blocki, A., Franke, R. P., Jung, F. Vascular endothelial cell biology: An update. International Journal of Molecular Sciences. 20 (18), 4411 (2019).
- Choi, S., Kim, J. A., Kim, K. C., Suh, S. H. Isolation and in vitro culture of vascular endothelial cells from mice. The Korean Journal of Physiology & Pharmacology. 19 (1), 35-42 (2015).
- Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: Testing and clinical relevance. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
- Nunan, E., et al. Obesity as a premature aging phenotype - Implications for sarcopenic obesity. Geroscience. , (2022).
- van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nature Protocols. 3 (6), 1085-1091 (2008).
- Dong, Q. G., et al. A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17 (8), 1599-1604 (1997).
- Amici, S. A., Dong, J., Guerau-de-Arellano, M. Molecular mechanisms modulating the phenotype of macrophages and microglia. Frontiers in Immunology. 8, 1520 (2017).
- Patel, J., et al. Functional definition of progenitors versus mature endothelial cells reveals key SoxF-dependent differentiation process. Circulation. 135 (8), 786-805 (2017).
- Ahn, S. J., et al. Inwardly rectifying K+ channels are major contributors to flow-induced vasodilatation in resistance arteries. The Journal of Physiology. 595 (7), 2339-2364 (2017).
- Bagchi, D. P., MacDougald, O. A. Identification and dissection of diverse mouse adipose depots. Journal of Visualized Experiments. (149), e59499 (2019).
- Ahn, S. J., et al. Cholesterol-induced suppression of endothelial Kir channels is a driver of impairment of arteriolar flow-induced vasodilation in humans. Hypertension. 79 (1), 126-138 (2022).
- Ahn, S. J., et al. Differential effects of obesity on visceral versus subcutaneous adipose arteries: Role of shear-activated Kir2.1 and alterations to the glycocalyx. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 322 (2), 156-166 (2022).
- Fancher, I. S., et al. Impairment of flow-sensitive inwardly rectifying K(+) channels via disruption of glycocalyx mediates obesity-induced endothelial dysfunction. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40 (9), 240-255 (2020).
- van Beijnum, J. R., et al. Gene expression of tumor angiogenesis dissected: Specific targeting of colon cancer angiogenic vasculature. Blood. 108 (7), 2339-2348 (2006).
- Hida, K., et al. Tumor-associated endothelial cells with cytogenetic abnormalities. Cancer Research. 64 (22), 8249-8255 (2004).
- Ades, E. W., et al. HMEC-1: Establishment of an immortalized human microvascular endothelial cell line. Journal of Investigative Dermatology. 99 (6), 683-690 (1992).
- Grange, C., et al. Isolation and characterization of human breast tumor-derived endothelial cells. Oncology Reports. 15 (2), 381-386 (2006).
- Liao, X., Makris, M., Luo, X. M. Fluorescence-activated cell sorting for purification of plasmacytoid dendritic cells from the mouse bone marrow. Journal of Visualized Experiments. (117), e54641 (2016).
- De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis, N. J. Isolating and immunostaining lymphocytes and dendritic cells from murine Peyer's patches. Journal of Visualized Experiments. (73), e50167 (2013).
- Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. Analysis of cell suspensions isolated from solid tissues by spectral flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (123), e55578 (2017).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. (41), e1546 (2010).
- Son, N. -H., et al. Endothelial cell CD36 optimizes tissue fatty acid uptake. The Journal of Clinical Investigation. 128 (10), 4329-4342 (2018).
- Bakker, W., Eringa, E. C., Sipkema, P., van Hinsbergh, V. W. M. Endothelial dysfunction and diabetes: roles of hyperglycemia, impaired insulin signaling and obesity. Cell and Tissue Research. 335 (1), 165-189 (2008).
- Farb, M. G., Gokce, N. Visceral adiposopathy: A vascular perspective. Hormone Molecular Biology and Clinical Investigation. 21 (2), 125-136 (2015).
- Williams, I. L., Wheatcroft, S. B., Shah, A. M., Kearney, M. T. Obesity, atherosclerosis and the vascular endothelium: mechanisms of reduced nitric oxide bioavailability in obese humans. International Journal of Obesity. 26 (6), 754-764 (2002).
- Cleuren, A. C. A., et al. The in vivo endothelial cell translatome is highly heterogeneous across vascular beds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (47), 23618-23624 (2019).
- Aird, W. C.
- Sonkusare, S. K., Dalsgaard, T., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Inward rectifier potassium (Kir2.1) channels as end-stage boosters of endothelium-dependent vasodilators. The Journal of Physiology. 594 (12), 3271-3285 (2016).
