Summary
פרוטוקול זה מפרט שיטה לכריתת מחסני שומן של עכברים ולבידוד ועיכול של העורקים המתאימים כדי לשחרר ולאחר מכן לזהות את אוכלוסיית תאי האנדותל. תאים מבודדים טריים המשמשים ביישומים במורד הזרם יקדמו את ההבנה של הביולוגיה של תאי כלי הדם והמנגנונים של תפקוד לקוי של כלי הדם.
Abstract
תאי אנדותל וסקולריים המרפדים את דופן מערכת כלי הדם ממלאים תפקידים חשובים במגוון תהליכים פיזיולוגיים, כולל ויסות טונוס כלי הדם, תפקודי מחסום ואנגיוגנזה. תפקוד לקוי של תאי האנדותל הוא מנבא סימן היכר ומניע מרכזי להתקדמות מחלות לב וכלי דם קשות, אך המנגנונים הבסיסיים עדיין אינם מובנים היטב. היכולת לבודד ולבצע ניתוחים על תאי אנדותל ממיטות כלי דם שונות בצורתם הטבעית תיתן תובנה לגבי תהליכים של מחלות לב וכלי דם. פרוטוקול זה מציג את ההליך לכריתה של רקמות שומן תת עוריות ומזנטריות של עכברים, ולאחר מכן בידוד של כלי הדם העורקיים שלהם. לאחר מכן מתעכלים העורקים המבודדים באמצעות קוקטייל ספציפי של אנזימי עיכול המתמקד בשחרור תאי אנדותל בעלי יכולת תפקודית. הרקמה המעוכלת מוערכת על ידי ניתוח ציטומטריה של זרימה באמצעות תאי CD31+/CD45− כסמנים לזיהוי חיובי של תאי אנדותל. ניתן למיין תאים עבור מבחנים פונקציונליים מיידיים במורד הזרם או להשתמש בהם ליצירת קווי תאים ראשוניים. הטכניקה של בידוד ועיכול עורקים מערוגות כלי דם שונות תספק לחוקרים אפשרויות להעריך תאי כלי דם שבודדו טריים מעורקים מעניינים ותאפשר להם לבצע מגוון רחב של בדיקות תפקודיות על סוגי תאים ספציפיים.
Introduction
תאי אנדותל מוכרים היטב בזכות תפקידיהם החשובים במגוון תהליכים פיזיולוגיים, כולל תפקודי מחסום, אנגיוגנזה וויסות טונוס כלי הדם 1,2. למרות שתפקוד לקוי של תאי האנדותל מתועד היטב בקידום טרשת עורקים, יתר לחץ דם, סוכרת וכו', המנגנונים הבסיסיים המניעים תפקוד לקוי של האנדותל עדיין אינם מובנים היטב וככל הנראה שונים בין מיטות כלי דם שונות 2,3,4. המאמץ לפענח את המנגנונים הפתולוגיים הללו של תפקוד לקוי של תאי האנדותל מאותגר על ידי הגישה המוגבלת לאוכלוסייה טהורה של תאי אנדותל מרקמות ו/או השינויים הפנוטיפיים של תאי האנדותל בתרבית 5,6. לכן, היכולת לבודד ולבצע ניתוחים על תאי אנדותל ממיטות כלי דם שונות בצורתם הטבעית תיתן תובנה לגבי תהליכים של מחלות לב וכלי דם.
פרוטוקול זה מציג את ההליך לנתח רקמות שומן תת עוריות ומזנטריות מעכברים, ולאחר מכן בידוד של כלי הדם העורקיים שלהם. תאי אנדותל בעלי יכולת תפקודית המרפדים את דפנות העורקים משתחררים באמצעות קוקטייל מסוים של אנזימים. טיפול מיוחד נלקח כדי לייעל את התנאים של פרוטוקול העיכול כדי להשיג תשואה מספקת של תאי אנדותל מ <1 מ"ג של רקמת המוצא תוך שמירה על סמנים ביומולקולריים שלמים לניתוח. תאי אנדותל מבודדים מזוהים בשלב הבא באמצעות ציטומטריה של זרימה. נוכחותו של CD31 (PECAM) משמשת בעיקר לזיהוי תאי אנדותל. בשל הביטוי של CD31 בסוגי תאים אחרים, כולל כמה ממוצא המטופוייטי המבטא גם CD45, טוהר תאי האנדותל המבודדים שופר עוד יותר על ידי אי הכללת תאים המבטאים הן CD31 והן CD45 5,6,7,8. יתר על כן, בהתאם לשאלת המחקר וליישומים במורד הזרם שיש להשתמש בהם, החוקרים צריכים לשקול לבחור פאנל נרחב של סמני בחירה חיוביים ושליליים כדי לייעל את טוהר אוכלוסיית התאים המעניינת.
למרות שהטכניקה של ניתוח ובידוד עורקי מחסן השומן שימשה בפרסומים הקודמים 9,10,11,12,13, פרוטוקול מפורט המתאר את בידוד העורקים המשובצים טרם הוצג. הדגמת הטכניקה לבידוד ועיכול של עורקים מערוגות כלי דם שונות ממין נתון של עניין תספק לחוקרים אפשרויות להעריך תאי כלי דם שבודדו טריים מעורקים מעניינים ותאפשר להם לבצע מגוון רחב של בדיקות תפקודיות על סוגי תאים ספציפיים. הבדיקות עשויות לכלול, בין היתר, ציטומטריה של זרימה למיון תאים וביטוי חלבוני ממברנה5,8, אלקטרופיזיולוגיה לפעילות תעלות יונים9, פרופיל מולקולרי (פרוטאומיקה/אנליזות גנומיות וכו'). 14,15, ויצירת קווי תאים ראשוניים לבדיקת תרופות במבחנה16,17.
Protocol
השימוש בבעלי חיים במחקרים אלה אושר על ידי אוניברסיטת דלאוור, הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (#1372).
1. דיסקציה וניקוי רקמות
הערה: עכברי C57BL/6J בני 10 עד 12 שבועות משמשים בפרוטוקול הווידאו. אנא עיין באיור 1 עבור הסכימה והתוצאה הרצויה של כריתת רקמות וניקוי עורקים ועיין בטבלת החומרים לקבלת רשימת החומרים המתכלים ופרטי היצרן.
- להרדים את העכבר על ידי חנק CO2 ואחריו נקע צוואר הרחם.
- אבטח את העכבר באמצעות פיני נתיחה ורסס את משטח הגחון ב-70% אתנול.
- בידוד של רקמות שומן תת עוריות הממוקמות על ידי כל חלק אחורי
הערה: דרושים כלי ניתור: מספריים ישרים של בון (9 ס"מ) ומלקחיים קהים ומעוקלים של Graefe.- השתמש מלקחיים כדי להרים את העור ממש מעל איברי המין ולעשות חתך קטן (2 מ"מ) בעור.
- מכניסים את קצה המספריים לאתר החתך ומבצעים חתך של 4-5 ס"מ בקו האמצע, המתחיל בחתך הראשוני ומנתח באופן גולגולתי לבסיס עצם החזה. היזהר לא לחדור את חלל הבטן.
- בצע חתך רוחבי של 1 ס"מ, המשתרע לרוחב מקו האמצע מיד מתחת לפורלימב.
- בצע חתך אלכסוני של 1 ס"מ בין האחוריים לאיברי המין.
- בצעו חתכים קטנים לאורך חתכים בעור בקו האמצע כדי לקלף את רקמת החיבור הקשורה ולחשוף את מחסן השומן התת עורי. הצמידו את העור כלפי מטה.
- זהה את רקמת השומן התת-עורית "בצורת C" ואת העורק/וריד העובר בניצב לחלל הבטן.
- התחל מתחתית צורת C ליד איברי המין ותפס בעדינות את רקמת השומן כדי לחשוף את רקמות החיבור. בצע חתכים קטנים ברקמת החיבור כדי להפריד את השומן מהעור. הימנע מהפרעה לכלי הדם החשופים.
- המשיכו לנתח את רקמת החיבור עד שניתן יהיה להסיר את רקמת השומן התת עורית בשלמותה. יש להפריד בזהירות את העורק החשוף מרקמת החיבור המקיפה אותו.
- אחסנו את השומן התת עורי המבודד במאגר HEPES על הקרח עד שיהיה מוכן לבודד את מצע כלי הדם המעניין.
- חזור על שלבים 1.3.3.-1.3.5. עבור מחסן השומן התת עורי האחורי הנותר.
- בידוד מחסן השומן המזנטרי
הערה: כלי ניתוח דרושים: מספריים בון ישר (9 ס"מ), מלקחיים Graefe, זוג מלקחיים #5, מספריים איריס ישר, ומספריים בון מעוקל (9 ס"מ).- השתמש במלקחיים Graefe כדי להרים את דופן חלל הצפק הדק מעל שלפוחית השתן ולעשות חתך קטן באמצעות מספריים ישרים.
- מרימים באיטיות את דופן חלל הצפק החודר, מכניסים בזהירות את מספריים הקשתית הישרה לאתר החתך, ומבצעים חתך של 4-5 ס"מ משלפוחית השתן לעצם החזה.
- בצע שני חתכים אופקיים באורך 1 ס"מ עם מספריים קשתית ישרה, המשתרעים לרוחב מקו האמצע עד מיד מעל האחורית ומתחת לפורלימב. השתמש מלקחיים Graefe כדי לקלף בחזרה את שרירי הבטן ולחשוף את הקרביים הצפק.
- חזור על שלב 1.4.3. בצד הנגדי.
- השתמש בזוג מלקחיים #5 כדי להרים את המעיים מתוך חלל הקרביים כדי לחשוף את השומן המזנטרי.
- השתמש במספריים המעוקלים ובמלקחיים #5 כדי להפריד את השומן לאורך המעי הגס, החל מהקומקום ועד למקום שבו המעי הגס יורד מהעין.
- חזרו לקאקום והשתמשו במספריים המעוקלים ובמלקחיים #5 כדי להפריד את השומן לאורך המעי הדק ללבלב. הסר חלק קטן של הלבלב כדי לבודד לחלוטין את השומן mesenteric.
הערה: הסרת חלק קטן מהלבלב יחד עם השומן המזנטרי עשויה לסייע בניקוי העורקים מכיוון שהיא מספקת יציבות במהלך הניקוי. - אחסנו את השומן המזנטרי המבודד במאגר HEPES על הקרח עד שיהיה מוכן לבודד את העורקים המזנטריים.
- בידוד העורקים המתאימים מרקמות שומן תת עוריות ומזנטריות
הערה: דרושים כלי ניתור: צלחת ניתוח וסטריאוסקופ עם מקור אור, זוג מלקחיים #55 וזוג מלקחיים #5.- מניחים ~ 10 מ"ל של חיץ HEPES קר לתוך צלחת הניתח ולהעביר את רקמת השומן לצלחת באמצעות מלקחיים #5.
- השתמשו בסטריאוסקופ בהגדלה של פי 1 כדי לראות ולמקם את רקמת השומן כדי לחשוף את צמד העורקים/ורידים (איור 2).
- השתמש מלקחיים #55 כדי להסיר בזהירות את השומן parenchymal מן העורק. הסר חתיכות קטנות של שומן בכל פעם ובחן בזהירות זוגות עורקים / ורידים מתחת לסטריאוסקופ כדי לזהות ולהימנע מפגיעה בכלי הדם של העניין.
הערה: התאימו את ההגדלה ואת מקור האור בהתאם לניקוי העורקים. הגדל את ההגדלה ואת עוצמת האור כדי לראות טוב יותר את העורקים כאשר השומן מוסר. ניקוי עדין של העורקים צריך להיעשות תחת הגדלה 4x-5x. חשוב להבחין בין רקמות חיבור (קולגן), ורידים ועורקים. רקמות חיבור וסיבי קולגן יש מראה דמוי חוט ללא ענפים, הם striated, ויש להם צבע לבנבן. שלא כמו סיבי קולגן ורקמות חיבור, עורקים וורידים הם שקופים ויש להם ענפים מרובים עם לומן מוגדר. עורקים וורידים קטנים עשויים להיראות דומים במראה כאשר הם נטולי רקמה פרנכימלית. נוכחות של דם לומן יכול עוד לעזור אחד לזהות את העורקים מן הוורידים. לוורידים דפנות כלי דם דקות יותר ולומן גדול יותר והם מכילים יותר דם בהשוואה לעורקים בגודל דומה. - חזור על שלב 1.5.3. עד שהעורקים ריקים לחלוטין מרקמת שומן פרנכימלית.
- השתמש #5 מלקחיים כדי להעביר את העורקים הנקיים לצינור חדש עם חיץ HEPES טרי ולשמור על קרח עד מוכן לעיכול.
2. עיכול של עורקים מבודדים לבידוד של תאי אנדותל
הערה: עיין באיור 2 עבור הסכימה של עיכול רקמות ובידוד תאי אנדותל וטבלת החומרים לקבלת רשימה מלאה של החומרים הדרושים לפרוטוקול.
- יש להוסיף 1 מ"ג כל אחד של פסולת ואלסטאז לכל צינור מיקרוצנטריפוגה של 2 מ"ל. הוסף 2 מ"ל של תמיסת דיסוציאציה לכל צינור. מערבולות ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס עד מומס לחלוטין. השתמש במלקחיים #5 כדי להעביר את העורקים המנוקים (שלב 1.5.5.) לצינורות הדגימה המתאימים. הריכוז הסופי של כל אנזים הוא 0.5 מ"ג/מ"ל.
- דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1 שעה עם תסיסה עדינה על ידי היפוך כל 10-15 דקות, כך העורקים תלויים בתמיסה כדי לשמור על מגע עקבי ואחיד בין האנזימים והעורקים.
- שקלו 1 מ"ג של קולגן מסוג I לכל דגימה והוסיפו אותו לצינורות חדשים.
- אפשרו לעורקים להתיישב בתחתית הצינור. הסר 500 μL של החיץ מהחלק העליון מבלי להפריע לעורקים ולהעביר אותו לתוך צינורות ייעודיים המכילים collagenase. מערבולת ומחזירים את התמיסה לדגימות המתאימות בצינורות הדגימה המקוריים. הריכוז הסופי של קולגן מסוג I הוא 0.5 מ"ג/מ"ל.
- דגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. ודא שהעורקים נפרדים לחתיכות לאחר טלטול קצר של צינור הדגימה. אם העורקים אינם נפרדים לחתיכות לאחר הפרעה, דוגרים במרווחים של 5 דקות עד לפירוק העורקים הנראה לעין.
- באמצעות פיפטה זכוכית, טריטואר נמרץ את הרקמה המעוכלת 10x-15x כדי לנתק את התאים באופן מכני.
- העבר את התמיסה והרקמה המעוכלת דרך מסננת תאים בגודל 70 מיקרומטר או מסננת צינור ציטומטריה של זרימה כדי לקבל תרחיפים חד-תאיים.
3. צביעת תאי האנדותל לפני זרימת ציטומטריה
הערה: צביעה ועיבוד של תאי אנדותל מתבצעים על קרח כדי לשפר את כדאיות התא, אלא אם כן ניתנה הוראה לכך. צינורות הפוליסטירן בעלי התחתית העגולה של 5 מ"ל עוברים צנטריפוגה בעוצמה של 1,163 x גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
- צנטריפוגה של מתלים חד-תאיים ב-1,163 x g למשך 3 דקות ב-RT.
- הסר את supernatant ו להשעות את גלולת התא ב 1 מ"ל של PBS + 5% BSA במשך 30 דקות ב RT.
הערה: חוקרים צריכים לשקול לחסום קולטני FC בהתאם לסוג התא, יעד העניין והנוגדנים שבהם נעשה שימושב-18,19. - הוסף 1 μL של כתם כדאיות התא (405 ננומטר עירור) (טבלת חומרים) ודגירה בחושך במשך 30 דקות ב- RT.
- צנטריפוגה של מתלה התא ב 1,163 x g במשך 3 דקות ב RT. להשעות את גלולת התא ב 200 μL של PBS + 1% BSA.
- לדגימות, הוסיפו נוגדנים ראשוניים המצומדים ל-CD31 (CD31-PE, 0.75 מיקרוגרם/דגימה) ו-CD45 (CD45-FITC, 2.5 מיקרוגרם/דגימה) ודגרה על נדנדה במקרר למשך 15 דקות לאחר כיסוי הדגימות ברדיד אלומיניום.
הערה: כדי לזהות ו/או להשיג אוכלוסייה טהורה של תאי אנדותל, יש לבדוק הן את CD31 והן את CD45 באמצעות נוגדנים ראשוניים מצומדים מסוג CD31 ו-CD45 עם פלואורסצנטיות עירור/פליטה מובהקת ותאי שער/מיון עם פרופיל ביטוי CD31+CD45−. פיצוי עשוי להידרש בהתאם פלואורופורים בשימוש 18,20,21. - לשטוף את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של PBS + 1% BSA ישירות להשעיית התא.
- צנטריפוגה של מתלה התא ב-1,163 x גרם למשך 3 דקות ב-RT. הסר את הסופר-נאטנט והשהה ב-200 μL של 1% פורמלדהיד עם 0.1% BSA. יש לאחסן במקרר המכוסה ברדיד אלומיניום עד שיהיה מוכן לציטומטריה של זרימה.
הערה: תפוקת התאים משופרת על-ידי הפחתת שלבי הכביסה והצנטריפוגה. ייתכן שיהיה צורך לשנות אותם בהתאם לגישת התוצאה. יש לנתח את המדגם ב- fixative תוך 24 שעות.
Representative Results
שרטוט של זרימת העבודה מוצג באיור 1. הסכימה מדגישה את שלבי הפרוטוקול המתוארים ביתר פירוט בטקסט הפרוטוקול. איור 2 מראה תמונות של שומן תת-עורי (איור 2A, משמאל) לאחר דיסקציה וארקייד עורקים תת-עוריים (איור 2A, מימין) לאחר ניקוי הרקמה הפרנכימלית. איור 2 מראה גם את השומן המזנטרי (איור 2B, משמאל) לאחר הדיסקציה ואת ארקייד העורקים המזנטרי (איור 2B, מימין) לאחר ניקוי הרקמה הפרנכימלית.
הפרוטוקול המוצג כאן נועד לסייע לחוקרים שעשויים להתעניין א) בהשוואה בין ערוגות שונות של כלי דם במחסן השומן בגישות מדעיות בסיסיות ו/או מודלים של מחלות, ב) עיכול של ערוגות כלי דם לפני בידוד תאי כלי דם בעלי עניין ליישום במורד הזרם, ו-ג) שימוש בציטומטריה של זרימה כדי לזהות תאים וסקולריים בעלי עניין (איור 3) ) עבור מגוון יישומים, כולל, אך לא רק, ניתוחי ביטוי חלבונים כפי שבוצעו כאן (איור 4). איור 3 מפרט דוגמה לגישה שלנו לזיהוי תאי אנדותל מעורקי עכבר מעוכלים באמצעות ציטומטריה של זרימה. תכשירי תאים שהתקבלו מעורקי שומן תת-עוריים מעוכלים (איור 3A) או מזנטריים (איור 3B) הוכתמו ב-CD31-PE, CD45-FITC ובצבע כדאיות התא לפני הקיבוע והזיהוי של תאי אנדותל CD31+CD45− בני קיימא באמצעות ציטומטריה של זרימה, כפי שבוצע באופן דומה במקומות אחרים8. כתם הכדאיות של התא איפשר לזהות רק את התאים בני הקיימא ששרדו את פרוטוקול הבידוד והעיכול לפני הקיבוע. השימוש בשיטה זו יאפשר לחוקרים להעריך את הביטוי או התפקוד של תאי כלי דם בני קיימא בעלי עניין.
כדי לקבוע אם תאי אנדותל שבודדו מכלי דם שונים של מחסן שומן הציגו הבדלים בביטוי חלבוני הממברנה, נבדקו תאים מבודדים עבור טרנסלוקאז של חומצת שומן, CD36 (איור 4), שכן חלבון ממברנה זה הוכח לאחרונה כחיוני בהפצה בתיווך אנדותל של חומצות שומן לרקמות22 . לכן, קביעת הבדלי הביטוי היחסיים בין ממברנה CD36, למשל, בערוגות כלי דם נפרדות עשויה א) לתמוך בנתונים קיימים לגבי העדפה דיפרנציאלית לניצול חומצות שומן בין רקמות שונות ו/או ב) לחשוף הבדלים פוטנציאליים חדשים בהתפלגות חומצות שומן בבריאות ובמחלות ברקמות שונות. מאותן תכשירים של תאי כלי דם מעוכלים המודגמים באיור 3, CD31+CD45−CD36+ תאי אנדותל זוהו בשומן תת-עורי (איור 4A) ומזנטרי (איור 4B), וביטוי CD36 כומת באוכלוסייה זו בכל מיטת כלי דם. איור 4C ואיור 4D מגלים שגם אחוז תאי האנדותל המבטאים CD36 וגם עוצמת הביטוי של CD36 היו גדולים יותר בתאי אנדותל תת-עוריים בהשוואה לאלה שנצפו בתאי אנדותל מזנטריים. ממצאים ראשוניים אלה תומכים בשימוש במתודולוגיה שלנו כדי לזהות הבדלים מובחנים בין מיטות כלי דם.
איור 1: תוכנית עבודה לבידוד תאי אנדותל מרקמות שומן תת-עוריות וקרביות עבור יישומים במורד הזרם . (A)עכברי C57BL/6J בני 10-12 שבועות הומתו ושימשו להדגמת הליך זה. (ב) ראשית, השומן התת עורי מוסר. (בי) לאחר מכן, רקמת השומן mesenteric (הקרביים) מוסרת לאחר מכן. הקווים המקווקווים הלבנים מציינים את מיקומם של מחסני השומן התת-עוריים (משמאל) והמזנטריים (מימין) לאחר הנתיחה וההסרה. העורקים המתאימים מבודדים עבור יישומים במורד הזרם. (C) בפרוטוקול זה, עורקים מבודדים מתעכלים לאחר מכן באמצעות קוקטייל אנזים ספציפי כצעד ראשון בשחרור תאי אנדותל בעלי יכולת תפקודית. (D) תאי אנדותל מבודדים מזוהים על ידי בדיקה של תאי CD31+ ו-CD45− באמצעות נוגדנים מצומדים לפני ניתוח ציטומטריה של זרימה. תאים עם פרופיל ביטוי של CD31+/CD45− הם תאי האנדותל המעניינים לניתוחים נוספים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: רקמות שומן תת-עוריות וקרביות מבודדות ועורקים בהתאמה. (A) משמאל: רקמת שומן תת-עורית "בצורת C" מבודדת מגפיים אחוריים. ענף מרכזי של עורק השומן התת עורי, המסומן בחץ (1), מתגלה כאשר מסירים את השומן הפרנכימלי. מימין: עורקי שומן תת עוריים מבודדים. (B) משמאל: רקמת השומן המזנטרית (הקרבית) מבודדת מהמעיים. מימין: ארקייד העורקים המתאים מבודד על ידי הסרת הרקמה הפרנכימלית. קשקשים שונים משמשים בין תמונות של שומן (5 מ"מ) ועורקים (1 מ"מ). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: זיהוי תאי אנדותל לאחר עיכול רקמת העורקים באמצעות ציטומטריה של זרימה. חלקות מייצגות המציגות תאים ששוחררו מעורקי שומן מבודדים (A) תת-עוריים או (B) מזנטריים. התאים נחשפו לנוגדנים מצומדים שהתמקדו באפיטופים חוץ-תאיים של CD31 (PE) ו-CD45 (FITC) לפני הקיבוע. ציטומטריה של זרימה שימשה לזיהוי אוכלוסיית תאי האנדותל CD31+CD45−. כתם כדאיות התאים שימש לבחירת התאים ששרדו רק את פרוטוקולי הבידוד והעיכול לניתוחים הבאים. בנוסף, גריסה מתאימה בשלב זה תפריד עוד יותר את אוכלוסיית התאים המיועדים מתאים מזהמים אם גודל סוג התא יהיה ידוע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: ניתוח של ביטוי ממברנת CD36 בתאי אנדותל עוריים לעומת מזנטריים באמצעות ציטומטריה של זרימה. חלקות אוכלוסייה מייצגות והיסטוגרמות המראות ביטוי ממברנת אנדותל CD36 (APC) ב-(A) עורית או (B) עורקי שומן מזנטריים. (C) אחוז תאי האנדותל (ECs) המבטאים CD36 ב-ECs תת-עוריים לעומת מזנטריים (n = 5, 3 זכרים, 2 נקבות; *p < 0.05 לאחר מבחן t של סטודנט). (D) ביטוי CD36 מנורמל של ממברנת EC בעורקי שומן תת-עוריים לעומת מזנטריים (n = 5, 3 זכרים, 2 נקבות; *p < 0.05 לאחר מבחן t של סטודנט). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Discussion
תפקוד לקוי של האנדותל הוא מבשר למצבי מחלה קשים, ככל הנראה גורם להתפתחות טרשת עורקים, יתר לחץ דם ושבץמוחי 3,23. בעוד שהמנגנונים שזוהו העומדים בבסיס תפקוד לקוי של האנדותל במצב פתולוגי נתון הם רבים, מיטות כלי דם נפרדות עשויות להיות מושפעות באופן דיפרנציאלי מתנאים פתולוגיים 4,24. יתר על כן, גורמי סיכון קרדיווסקולריים שונים (למשל, השמנת יתר, יתר לחץ דם, דיסליפידמיה, עישון, סוכרת) גורמים לתפקוד לקוי באמצעות מגוון מנגנונים שונים23,25. לכן, חיוני לבודד אוכלוסיות של תאי אנדותל ממודלים מבוססים של מחלות או רקמות אנושיות נגישות ולבצע בדיקות על תאים שהוסרו מיד מסביבת ה-in vivo. לבידוד תאים בדרך זו יש יתרון ייחודי על פני חקר תאים בתרבית בכך שהם ריקים משינויים פנוטיפיים הנגרמים על ידי תרבית 5,6. יתר על כן, הכללת אוכלוסיית תאי אנדותל הטרוגנית, כפי שנצפתה ב- vivo26,27 (וניתן להפריד זאת עוד יותר באמצעות מיון תאים בסיוע זרימה), מאורגניזם חי מודיעה טוב יותר על סביבת ה- in vivo. לבסוף, שיטה זו ישימה לחקר מודלים רבים של בעלי חיים ורקמות אנושיות פוטנציאליות וניתן להשתמש בה ליצירת קווי תרבית תאים ראשוניים, אם צורך כזה מוצדק.
השלב הקריטי בפרוטוקול זה, והצעד שידרוש את ההתאמה הרבה ביותר עבור מיטות כלי דם שונות או סוגי תאים שאינם מוצגים כאן, הוא עיכול של רקמת כלי הדם. שלב זה חייב להיות ממוטב לבריאות התא מבלי להפחית את תפוקת התאים. האנזימים הספציפיים שבהם נעשה שימוש ומשך העיכול הם קריטיים למיטוב בריאות התאים ולתפוקה כדי להיות מסוגלים לבצע בדיקות נאותות במורד הזרם. לצורך זיהוי ביטוי ממברנה של CD36, כפי שזוהה על-ידי ציטומטריה של זרימה בתאי אנדותל תת-עוריים ומזנטריים (איור 4), פותחה גרסה שונה של פרוטוקול העיכול שתוכנן במקור עבור אלקטרופיזיולוגיה של מהדק טלאי28 . זה כלל הארכה של זמן העיכול של קולגןאז I ל-30 דקות כדי להגדיל את תפוקת התאים כדי לעמוד טוב יותר בדרישות של ציטומטריה של זרימה לעומת מה שנדרש במחקרי הידוק טלאי. מאחר ששינוי זה עשוי להשפיע במידה מסוימת על בריאות התא, נעשה שימוש בכתם של כדאיות התא בניתוחי ציטומטריה של זרימה כדי להבטיח שרק תאי אנדותל בני קיימא הוערכו בעקבות פרוטוקול זה (איור 3). מומלץ כי מחקרים שמטרתם לבודד תאים מרקמת כלי הדם צריכים לכלול סמן לכדאיות התא לפני הערכת הגישה הרצויה.
הפרוטוקול המתואר מספיק כדי לשחרר תאי אנדותל בני קיימא לניתוח ויישומים במורד הזרם מדגימות עורקים של ≤1 מ"ג שמקורן בעכברים; עם זאת, אם העורקים המעניינים היו מבודדים מרקמות או אורגניזמים שונים (למשל, בני אדם) שגרמו למסות עורקים שונות באופן משמעותי, היה צורך לייעל את תכולת אנזימי העיכול ואת משך הדגירה כדי לבודד ביעילות את אוכלוסיית התאים המעניינים. עבור חלק ממיטות כלי הדם המתחילות בכמויות קטנות עוד יותר של רקמת מוצא מאשר הערוגות התת-עוריות והמזנטריות המוצגות כאן (למשל, עורקים כליליים), ייתכן שיהיה צורך באיגום עורקים ממספר עכברים לכל דגימה. ואכן, זה עשוי להיות צעד הכרחי עבור כל מיטת כלי דם נתונה בהתחשב בכך שגישת התוצאה דורשת תפוקת תאים גבוהה יחסית. מגבלה מרכזית היא שבשל אופי השינויים בכל עיכול דגימה, תפוקת התאים יכולה לעתים להיות שונה באופן משמעותי בין אצוות, גם כאשר הם מגיעים מאותה מיטת כלי דם. זה יכול לגרום לבעיות בעת ניתוח נתונים ויש לקחת בחשבון באמצעות נורמליזציה בעת הצורך. לדוגמה, ביטוי CD36 היה משתנה מאוד בנתונים הגולמיים עקב שינויים בתפוקת התאים על פני דגימות בודדות של עורקי שומן תת-עוריים ומזנטריים. לכן, הנתונים הגולמיים נורמלו ל-CD31+CD45− עוצמת פלואורסצנטיות ממוצעת מתוך הנחה ששיטה זו תתקן הבדלי אצווה (איור 4). כמובן, בהתאם לגישה, ניתוחים סטטיסטיים מתוחכמים יותר ושיטות נורמליזציה עשויים להידרש.
לסיכום, מאמר זה מציג שיטה לנתח, לבודד ולעכל עורקים תת-עוריים ומזנטריים מעכברים כדי לחקור את הביטוי ו/או התפקוד של מטרות אנדותל מעניינות. באמצעות שינויים בפרוטוקול המוצג, ניתן לחקור מיטות כלי דם וסוגי תאים שונים (למשל, תאי שריר חלקים). לפרוטוקול זה, כבסיס לשפע של גישות ניסיוניות זמינות, יש פוטנציאל לקדם את ההבנה של ביולוגיה של תאי כלי דם ומנגנונים של תפקוד לקוי של כלי הדם.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים.
Acknowledgments
לזכרו האוהב של ריץ' ווסט, מדען מבריק, עמית וחבר יקר. ברצוננו להודות לאוניברסיטת דלאוור לציטומטריה של זרימה וליבת ההדמיה הביולוגית כחלק מהמכון לביוטכנולוגיה של דלאוור על תרומתם המתמשכת למחקרינו. ברצוננו להודות גם לאמה הודג'ינס על הסקירה והעריכה הקפדנית של כתב היד. העבודה שלנו נתמכת על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית P20GM113125-6564 (I.S. Fancher). פרויקט זה נתמך גם על ידי תוכנית INBRE של דלאוור, עם מענק מה- NIGMS (P20GM103446) מהמכונים הלאומיים לבריאות ומדינת דלאוור (I.S. Fancher), ומענק מחקר של אוניברסיטת דלאוור הכללית (I.S. Fancher). תוכן זה הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את העמדות הרשמיות של NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue dissection tools | |||
| 5 forceps (2) | Fine Science Tools | 11252-00 | For isolation of mesenteric adipose depot and arteries transfer |
| 55 forceps (2) | Fine Science Tools | 11295-51 | For parenchymal adipose removal |
| Curved Bonn scissors | Fine Science Tools | 14061-10 | For isolation of mesenteric adipose depot |
| Graefe forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | For general dissection steps and isolation of subcutaneous adipose depot |
| Straight Bonn scissor | Fine Science Tools | 14060-09 | For general dissection steps and isolation of subcutaneous adipose depot |
| Stereoscope with light source | Laxco | Z230PT40 | For parenchymal adipose removal and artery isolation |
| Digestive enzymes for Artery Digestion | |||
| Collagenase Type I | Wothington-BioChem | LS004194 | |
| Dispase (Neutral Protease) | Wothington-BioChem | LS02110 | |
| Elastase | Wothington-BioChem | LS002292 | |
| Solutions Recipes | |||
| HEPES Buffer, pH 7.4 | Final concentration | ||
| Calcium chloride dihydrate | J.T.Baker | 1332-1 | 2 mM |
| Dextrose (D-glucose) anhydrous | Fisher | D16-500 | 10 mM |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | 10 mM |
| Magnesium Chloride | Fisher | M33-500 | 1 mM |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | 5 mM |
| Sodium chloride | Oxoid | LP0005 | 145 mM |
| Dissociation Solution, pH 7.30-7.40 | |||
| Dextrose (D-glucose) anhydrous | Fisher | D16-500 | 10 mM |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | 10 mM |
| Magnesium Chloride | Fisher | M33-500 | 2 mM |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | 56 mM |
| Sodium chloride | Oxoid | LP0005 | 55 mM |
| Sodium L-Glutamate monohydrate | TCI | G0188 | 80 mM |
| Flow Cytometry Analyses | |||
| 5 mL Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Falcon | 352235 | |
| CD31-PE | Miltenyi Biotec | 130-119-653 | 0.75µg/sample |
| CD36-APC | R&D Systems | AF2519 | 2.5µg/ sample |
| CD45-FITC | BioLegend | 103108 | 2.5µg/ sample |
| Live/Dead Fixable Violet Dead Cell Staining kit (cell viability stain) | Invitrogen | L34955 | 1µL/sample |
References
- Krüger-Genge, A., Blocki, A., Franke, R. P., Jung, F. Vascular endothelial cell biology: An update. International Journal of Molecular Sciences. 20 (18), 4411 (2019).
- Choi, S., Kim, J. A., Kim, K. C., Suh, S. H. Isolation and in vitro culture of vascular endothelial cells from mice. The Korean Journal of Physiology & Pharmacology. 19 (1), 35-42 (2015).
- Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: Testing and clinical relevance. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
- Nunan, E., et al. Obesity as a premature aging phenotype - Implications for sarcopenic obesity. Geroscience. , (2022).
- van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nature Protocols. 3 (6), 1085-1091 (2008).
- Dong, Q. G., et al. A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17 (8), 1599-1604 (1997).
- Amici, S. A., Dong, J., Guerau-de-Arellano, M. Molecular mechanisms modulating the phenotype of macrophages and microglia. Frontiers in Immunology. 8, 1520 (2017).
- Patel, J., et al. Functional definition of progenitors versus mature endothelial cells reveals key SoxF-dependent differentiation process. Circulation. 135 (8), 786-805 (2017).
- Ahn, S. J., et al. Inwardly rectifying K+ channels are major contributors to flow-induced vasodilatation in resistance arteries. The Journal of Physiology. 595 (7), 2339-2364 (2017).
- Bagchi, D. P., MacDougald, O. A. Identification and dissection of diverse mouse adipose depots. Journal of Visualized Experiments. (149), e59499 (2019).
- Ahn, S. J., et al. Cholesterol-induced suppression of endothelial Kir channels is a driver of impairment of arteriolar flow-induced vasodilation in humans. Hypertension. 79 (1), 126-138 (2022).
- Ahn, S. J., et al. Differential effects of obesity on visceral versus subcutaneous adipose arteries: Role of shear-activated Kir2.1 and alterations to the glycocalyx. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 322 (2), 156-166 (2022).
- Fancher, I. S., et al. Impairment of flow-sensitive inwardly rectifying K(+) channels via disruption of glycocalyx mediates obesity-induced endothelial dysfunction. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40 (9), 240-255 (2020).
- van Beijnum, J. R., et al. Gene expression of tumor angiogenesis dissected: Specific targeting of colon cancer angiogenic vasculature. Blood. 108 (7), 2339-2348 (2006).
- Hida, K., et al. Tumor-associated endothelial cells with cytogenetic abnormalities. Cancer Research. 64 (22), 8249-8255 (2004).
- Ades, E. W., et al. HMEC-1: Establishment of an immortalized human microvascular endothelial cell line. Journal of Investigative Dermatology. 99 (6), 683-690 (1992).
- Grange, C., et al. Isolation and characterization of human breast tumor-derived endothelial cells. Oncology Reports. 15 (2), 381-386 (2006).
- Liao, X., Makris, M., Luo, X. M. Fluorescence-activated cell sorting for purification of plasmacytoid dendritic cells from the mouse bone marrow. Journal of Visualized Experiments. (117), e54641 (2016).
- De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis, N. J. Isolating and immunostaining lymphocytes and dendritic cells from murine Peyer's patches. Journal of Visualized Experiments. (73), e50167 (2013).
- Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. Analysis of cell suspensions isolated from solid tissues by spectral flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (123), e55578 (2017).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. (41), e1546 (2010).
- Son, N. -H., et al. Endothelial cell CD36 optimizes tissue fatty acid uptake. The Journal of Clinical Investigation. 128 (10), 4329-4342 (2018).
- Bakker, W., Eringa, E. C., Sipkema, P., van Hinsbergh, V. W. M. Endothelial dysfunction and diabetes: roles of hyperglycemia, impaired insulin signaling and obesity. Cell and Tissue Research. 335 (1), 165-189 (2008).
- Farb, M. G., Gokce, N. Visceral adiposopathy: A vascular perspective. Hormone Molecular Biology and Clinical Investigation. 21 (2), 125-136 (2015).
- Williams, I. L., Wheatcroft, S. B., Shah, A. M., Kearney, M. T. Obesity, atherosclerosis and the vascular endothelium: mechanisms of reduced nitric oxide bioavailability in obese humans. International Journal of Obesity. 26 (6), 754-764 (2002).
- Cleuren, A. C. A., et al. The in vivo endothelial cell translatome is highly heterogeneous across vascular beds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (47), 23618-23624 (2019).
- Aird, W. C.
- Sonkusare, S. K., Dalsgaard, T., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Inward rectifier potassium (Kir2.1) channels as end-stage boosters of endothelium-dependent vasodilators. The Journal of Physiology. 594 (12), 3271-3285 (2016).
