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Biology

डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए अलग-अलग वसा डिपो से संवहनी एंडोथेलियल कोशिकाओं का अलगाव और पहचान

Published: June 10, 2022 doi: 10.3791/63999
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Department of Kinesiology and Applied Physiology, College of Health Sciences, University of Delaware, 2Division of Pulmonary, Critical Care, Sleep and Allergy, Department of Medicine, University of Illinois at Chicago, 3University of Delaware Flow Cytometry Core, Delaware Biotechnology Institute, University of Delaware

Summary

यह प्रोटोकॉल माउस वसा डिपो के विच्छेदन और एंडोथेलियल सेल आबादी को मुक्त करने और फिर पहचानने के लिए संबंधित धमनियों के अलगाव और पाचन के लिए एक विधि का विवरण देता है। डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों में उपयोग की जाने वाली ताजा पृथक कोशिकाएं संवहनी कोशिका जीव विज्ञान और संवहनी शिथिलता के तंत्र की समझ को आगे बढ़ाएंगी।

Abstract

संवहनी प्रणाली की दीवार को अस्तर करने वाली संवहनी एंडोथेलियल कोशिकाएं विभिन्न प्रकार की शारीरिक प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं, जिसमें संवहनी टोन विनियमन, बाधा कार्य और एंजियोजेनेसिस शामिल हैं। एंडोथेलियल सेल डिसफंक्शन गंभीर कार्डियोवैस्कुलर बीमारियों की प्रगति के लिए एक हॉलमार्क प्रेडिक्टर और प्रमुख चालक है, फिर भी अंतर्निहित तंत्र खराब समझ में आते हैं। अपने मूल रूप में विभिन्न संवहनी बिस्तरों से एंडोथेलियल कोशिकाओं पर विश्लेषण करने की क्षमता हृदय रोग की प्रक्रियाओं में अंतर्दृष्टि प्रदान करेगी। यह प्रोटोकॉल माउस चमड़े के नीचे और मेसेंटेरिक वसा ऊतकों के विच्छेदन के लिए प्रक्रिया प्रस्तुत करता है, इसके बाद उनके संबंधित धमनी वाहिका का अलगाव होता है। पृथक धमनियों को तब पाचन एंजाइमों के एक विशिष्ट कॉकटेल का उपयोग करके पचाया जाता है जो कार्यात्मक रूप से व्यवहार्य एंडोथेलियल कोशिकाओं को मुक्त करने पर केंद्रित होता है। पचे हुए ऊतक का मूल्यांकन सकारात्मक एंडोथेलियल सेल पहचान के लिए मार्कर के रूप में सीडी 31 + / सीडी 45 - कोशिकाओं का उपयोग करके फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण द्वारा किया जाता है। कोशिकाओं को तत्काल डाउनस्ट्रीम कार्यात्मक परख के लिए क्रमबद्ध किया जा सकता है या प्राथमिक सेल लाइनों को उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। विभिन्न संवहनी बिस्तरों से धमनियों को अलग करने और पचाने की तकनीक शोधकर्ताओं को रुचि की धमनियों से ताजा पृथक संवहनी कोशिकाओं का मूल्यांकन करने के लिए विकल्प प्रदान करेगी और उन्हें विशिष्ट सेल प्रकारों पर कार्यात्मक परीक्षणों की एक विस्तृत श्रृंखला करने की अनुमति देगी।

Introduction

एंडोथेलियल कोशिकाओं को विभिन्न प्रकार की शारीरिक प्रक्रियाओं में उनकी महत्वपूर्ण भूमिकाओं के लिए अच्छी तरह से मान्यता प्राप्त है, जिसमें बाधा कार्य, एंजियोजेनेसिस और संवहनी टोन विनियमन 1,2 शामिल हैं। यद्यपि एंडोथेलियल सेल डिसफंक्शन एथेरोस्क्लेरोसिस, उच्च रक्तचाप, मधुमेह आदि को बढ़ावा देने में अच्छी तरह से प्रलेखित है, एंडोथेलियल डिसफंक्शन को चलाने वाले अंतर्निहित तंत्र खराब समझ में आते हैं और संभवतः अलग-अलग संवहनी बेड 2,3,4 के बीच भिन्न होते हैं। एंडोथेलियल सेल डिसफंक्शन के इन पैथोलॉजिकल तंत्रों को उजागर करने के प्रयास को ऊतकों से एंडोथेलियल कोशिकाओं की शुद्ध आबादी तक सीमित पहुंच और / या संस्कृति 5,6 में एंडोथेलियल कोशिकाओं के फेनोटाइपिक परिवर्तनों द्वारा चुनौती दी जाती है। इसलिए, अपने मूल रूप में विभिन्न संवहनी बिस्तरों से एंडोथेलियल कोशिकाओं पर विश्लेषण करने में सक्षम होने से हृदय रोग की प्रक्रियाओं में अंतर्दृष्टि मिलेगी।

यह प्रोटोकॉल चूहों से चमड़े के नीचे और मेसेन्टेरिक वसा ऊतकों को विच्छेदित करने की प्रक्रिया प्रस्तुत करता है, इसके बाद उनके संबंधित धमनी वाहिका का अलगाव होता है। धमनी की दीवारों को अस्तर करने वाली कार्यात्मक रूप से व्यवहार्य एंडोथेलियल कोशिकाओं को एंजाइमों के एक विशिष्ट कॉकटेल का उपयोग करके मुक्त किया जाता है। विश्लेषण के लिए बायोमोलेक्यूलर मार्करों को बरकरार रखते हुए <1 मिलीग्राम शुरुआती ऊतक से एंडोथेलियल कोशिकाओं की पर्याप्त उपज प्राप्त करने के लिए पाचन प्रोटोकॉल की स्थितियों को अनुकूलित करने के लिए विशेष ध्यान रखा गया था। फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके पृथक एंडोथेलियल कोशिकाओं की पहचान की जाती है। सीडी 31 (पीईसीएएम) की उपस्थिति का उपयोग मुख्य रूप से एंडोथेलियल कोशिकाओं की पहचान करने के लिए किया जाता है। अन्य सेल प्रकारों में सीडी 31 की अभिव्यक्ति के कारण, जिसमें कई हेमटोपोइएटिक मूल शामिल हैं जो सीडी 45 को भी व्यक्त करते हैं, अलग-थलग एंडोथेलियल कोशिकाओं की शुद्धता को सीडी 31 और सीडी 45 5,6,7,8 दोनों को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं के बहिष्करण से और बढ़ाया गया था। इसके अलावा, अनुसंधान प्रश्न और नियोजित किए जाने वाले डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के आधार पर, शोधकर्ताओं को रुचि की सेल आबादी की शुद्धता को अनुकूलित करने के लिए सकारात्मक और नकारात्मक चयन मार्करों के एक व्यापक पैनल का चयन करने पर विचार करना चाहिए।

हालांकि एडीपोज डिपो धमनियों को विच्छेदित करने और अलग करने की तकनीक का उपयोग पिछलेप्रकाशनों 9,10,11,12,13 में किया गया है, एम्बेडेड धमनियों के अलगाव का वर्णन करने वाला एक विस्तृत प्रोटोकॉल अभी तक प्रस्तुत नहीं किया गया है। रुचि की किसी दी गई प्रजाति से विभिन्न संवहनी बिस्तरों से धमनियों के अलगाव और पाचन के लिए तकनीक का प्रदर्शन शोधकर्ताओं को रुचि की धमनियों से ताजा पृथक संवहनी कोशिकाओं का मूल्यांकन करने के लिए विकल्प प्रदान करेगा और उन्हें विशिष्ट सेल प्रकारों पर कार्यात्मक परीक्षणों की एक विस्तृत श्रृंखला करने की अनुमति देगा। परीक्षणों में सेल सॉर्टिंग और झिल्ली प्रोटीन अभिव्यक्ति 5,8 के लिए फ्लो साइटोमेट्री, आयन चैनल गतिविधि9 के लिए इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, आणविक प्रोफाइलिंग (प्रोटिओमिक्स / जीनोमिक विश्लेषण, आदि) शामिल हो सकते हैं लेकिन सीमित नहीं हैं। 14,15, और विट्रो 16,17 में दवा स्क्रीनिंग के लिए प्राथमिक सेल लाइनों की पीढ़ी।

Protocol

इन अध्ययनों में जानवरों के उपयोग को डेलावेयर विश्वविद्यालय, संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (# 1372) द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. ऊतक विच्छेदन और सफाई

नोट: वीडियो प्रोटोकॉल में 10- से 12 सप्ताह के C57BL / 6J चूहों का उपयोग किया जाता है। कृपया ऊतक विच्छेदन और सफाई धमनियों के योजनाबद्ध और वांछित परिणाम के लिए चित्रा 1 देखें और आपूर्ति और निर्माता जानकारी की सूची के लिए सामग्री की तालिका देखें।

  1. सीओ2 श्वासावरोध द्वारा माउस को यूथेनाइज़ करें, इसके बाद गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था।
  2. विच्छेदन पिन का उपयोग करके माउस को सुरक्षित करें और 70% इथेनॉल के साथ उदर सतह को स्प्रे करें।
  3. प्रत्येक हिंदलिम्ब द्वारा स्थित चमड़े के नीचे वसा ऊतकों का अलगाव
    नोट: आवश्यक उपकरण विच्छेदन: सीधे बॉन कैंची (9 सेमी) और कुंद, घुमावदार ग्रेफ फोर्स।
    1. जननांगों के ठीक ऊपर त्वचा को उठाने के लिए बल का उपयोग करें और त्वचा में एक छोटा (2 मिमी) चीरा लगाएं।
    2. कैंची के सिरे को चीरा स्थल में डालें और 4-5 सेमी मध्य रेखा चीरा लगाएं, जो प्रारंभिक चीरा से शुरू होता है और उरोस्थि के आधार पर कपाल को विच्छेदित करता है। पेट की गुहा में प्रवेश न करने के लिए सावधान रहें।
    3. फोरलिम्ब के ठीक नीचे मध्य रेखा से पार्श्व रूप से विस्तारित 1 सेमी पार्श्व चीरा लगाएं।
    4. हिण्डलिम्ब और जननांगों के बीच एक विकर्ण 1 सेमी चीरा लगाएं।
    5. संबंधित संयोजी ऊतक को छीलने और चमड़े के नीचे वसा डिपो को उजागर करने के लिए मध्य रेखा त्वचा चीरों के साथ छोटे कट बनाएं। त्वचा को नीचे पिन करें।
    6. "सी-आकार" चमड़े के नीचे वसा ऊतक और धमनी / नस की पहचान करें जो पेट की गुहा के लंबवत चलती है।
    7. जननांगों के पास सी आकार के नीचे से शुरू करें और संयोजी ऊतकों को उजागर करने के लिए धीरे से वसा ऊतक को पकड़ें। त्वचा से वसा को अलग करने के लिए संयोजी ऊतक में छोटे कटौती करें। उजागर वाहिका को परेशान करने से बचें।
    8. संयोजी ऊतक को तब तक विच्छेदित करना जारी रखें जब तक कि चमड़े के नीचे के वसा ऊतक को बरकरार नहीं हटाया जा सकता है। आसपास के संयोजी ऊतक से उजागर धमनी को सावधानीपूर्वक अलग करें।
    9. बर्फ पर एचईपीईएस बफर में पृथक चमड़े के नीचे वसा को तब तक स्टोर करें जब तक कि रुचि के संवहनी बिस्तर को अलग करने के लिए तैयार न हो।
    10. चरण 1.3.3.-1.3.5 दोहराएँ। शेष पीछे के चमड़े के नीचे वसा डिपो के लिए।
  4. मेसेंटेरिक वसा डिपो का अलगाव
    नोट: उपकरणों का विच्छेदन आवश्यक है: सीधे बॉन कैंची (9 सेमी), ग्रेफ फोर्स, # 5 फोर्स की एक जोड़ी, सीधी आईरिस कैंची, और घुमावदार बॉन कैंची (9 सेमी)।
    1. मूत्राशय के ऊपर पतली पेरिटोनियल गुहा की दीवार को उठाने के लिए ग्रेफ फोर्स का उपयोग करें और सीधी कैंची का उपयोग करके एक छोटा सा चीरा लगाएं।
    2. धीरे-धीरे प्रवेशित पेरिटोनियल गुहा की दीवार को उठाएं, सावधानी से सीधी आईरिस कैंची को चीरा साइट में डालें, और मूत्राशय से उरोस्थि तक 4-5 सेमी चीरा लगाएं।
    3. सीधी आइरिस कैंची के साथ दो 1 सेमी लंबे क्षैतिज चीरे लगाएं, जो मध्य रेखा से हिंडलिंब के ठीक ऊपर और अग्रभाग के नीचे तक फैले हुए हैं। पेट की मांसपेशियों को वापस छीलने और पेरिटोनियल विसरा को उजागर करने के लिए ग्रेफ फोर्स का उपयोग करें।
    4. चरण 1.4.3 दोहराएँ। विपरीत दिशा में।
    5. मेसेंटेरिक वसा को प्रकट करने के लिए आंतों को आंत गुहा से बाहर निकालने के लिए # 5 बल की जोड़ी का उपयोग करें।
    6. बृहदान्त्र के साथ वसा को अलग करने के लिए घुमावदार कैंची और # 5 बल का उपयोग करें, जो कि केकम से शुरू होता है जहां बृहदान्त्र दृश्य से उतरता है।
    7. केकम पर लौटें और छोटी आंत के साथ वसा को अग्न्याशय में अलग करने के लिए घुमावदार कैंची और # 5 बल का उपयोग करें। मेसेंटेरिक वसा को पूरी तरह से अलग करने के लिए अग्न्याशय के एक छोटे से हिस्से को हटा दें।
      नोट: मेसेन्टेरिक वसा के साथ अग्न्याशय के एक छोटे से हिस्से को हटाने से धमनियों को साफ करने में मदद मिल सकती है क्योंकि यह सफाई के दौरान स्थिरता प्रदान करता है।
    8. मेसेंटेरिक धमनियों को अलग करने के लिए तैयार होने तक बर्फ पर एचईपीईएस बफर में पृथक मेसेंटेरिक वसा को स्टोर करें।
  5. चमड़े के नीचे और मेसेंटेरिक वसा ऊतकों से संबंधित धमनियों का अलगाव
    नोट: आवश्यक उपकरण विच्छेदन: एक प्रकाश स्रोत के साथ एक विच्छेदित डिश और स्टीरियोस्कोप, # 55 फोर्स की एक जोड़ी, और # 5 फोर्सप्स की एक जोड़ी।
    1. विच्छेदन डिश में ~ 10 एमएल ठंडा एचईपीईएस बफर रखें और # 5 फोर्स का उपयोग करके वसा ऊतक को डिश में स्थानांतरित करें।
    2. शिरा जोड़ी (ओं) को उजागर करने के लिए वसा ऊतक को देखने और स्थिति में रखने के लिए 1x आवर्धन पर स्टीरियोस्कोप का उपयोग करें (चित्रा 2)।
    3. धमनी से पैरेन्काइमल वसा को सावधानीपूर्वक हटाने के लिए # 55 बल का उपयोग करें। एक समय में वसा के छोटे टुकड़ों को हटा दें और स्टीरियोस्कोप के नीचे धमनी / नस जोड़े का सावधानीपूर्वक निरीक्षण करें ताकि रुचि के वाहिका को पहचान सकें और नुकसान से बचा जा सके।
      नोट: धमनियों को साफ करने के लिए तदनुसार आवर्धन और प्रकाश स्रोत को समायोजित करें। वसा हटाने के रूप में धमनियों को बेहतर ढंग से देखने के लिए आवर्धन और प्रकाश तीव्रता बढ़ाएं। धमनियों की ठीक सफाई 4x-5x आवर्धन के तहत की जानी चाहिए। संयोजी ऊतकों (कोलेजन), नसों और धमनियों के बीच अंतर करना महत्वपूर्ण है। संयोजी ऊतकों और कोलेजन फाइबर में शाखाओं के बिना एक स्ट्रिंग जैसी उपस्थिति होती है, धारीदार होती है, और एक सफेद रंग होता है। कोलेजन फाइबर और संयोजी ऊतकों के विपरीत, धमनियां और नसें पारदर्शी होती हैं और एक परिभाषित लुमेन के साथ कई शाखाएं होती हैं। पैरेन्काइमल ऊतक से मुक्त होने पर छोटी धमनियां और नसें दिखने में समान दिखाई दे सकती हैं। लुमेन में रक्त की उपस्थिति नसों से धमनियों की पहचान करने में मदद कर सकती है। नसों में पतली रक्त वाहिका की दीवारें और एक बड़ा लुमेन होता है और तुलनात्मक आकार की धमनियों की तुलना में अधिक रक्त होता है।
    4. चरण 1.5.3 दोहराएँ। जब तक धमनियां पैरेन्काइमल वसा ऊतक से पूरी तरह से शून्य न हों।
    5. साफ की गई धमनियों को ताजा एचईपीईएस बफर के साथ एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए # 5 फोर्स का उपयोग करें और पाचन के लिए तैयार होने तक बर्फ पर रखें।

2. एंडोथेलियल कोशिकाओं के अलगाव के लिए पृथक धमनियों का पाचन

नोट: कृपया ऊतक पाचन और एंडोथेलियल कोशिकाओं के अलगाव के योजनाबद्ध के लिए चित्रा 2 और प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक आपूर्ति की पूरी सूची के लिए सामग्री की तालिका देखें।

  1. प्रत्येक 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 1 मिलीग्राम डिस्पेज़ और इलास्टेस जोड़ें। प्रत्येक ट्यूब में 2 एमएल पृथक्करण समाधान जोड़ें। भंवर और पूरी तरह से घुलने तक 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। साफ की गई धमनियों (चरण 1.5.5.) को संबंधित नमूना ट्यूबों में स्थानांतरित करने के लिए # 5 फोर्सप्स का उपयोग करें। प्रत्येक एंजाइम की अंतिम सांद्रता 0.5 मिलीग्राम / एमएल है।
  2. हर 10-15 मिनट में व्युत्क्रमण द्वारा कोमल आंदोलन के साथ 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, ताकि एंजाइमों और धमनियों के बीच लगातार और समान संपर्क बनाए रखने के लिए धमनियों को घोल में निलंबित कर दिया जाए।
  3. प्रति नमूने 1 मिलीग्राम कोलेजनेज टाइप 1 का वजन करें और इसे नई ट्यूबों में जोड़ें।
  4. धमनियों को ट्यूब के तल पर बसने दें। धमनियों को परेशान किए बिना बफर के 500 μL को ऊपर से हटा दें और इसे कोलेजनेज युक्त निर्दिष्ट ट्यूबों में स्थानांतरित करें। भंवर और मूल नमूना ट्यूबों में संबंधित नमूनों के लिए समाधान वापस करें। कोलेजनेज टाइप 1 की अंतिम एकाग्रता 0.5 मिलीग्राम / एमएल है।
  5. 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। सुनिश्चित करें कि नमूना ट्यूब के संक्षिप्त झटकों के बाद धमनियां टुकड़ों में अलग हो जाती हैं। यदि गड़बड़ी के बाद धमनियां टुकड़ों में अलग नहीं होती हैं, तो धमनी टूटने तक 5 मिनट की वृद्धि में सेक्यूबेट करें।
  6. ग्लास पिपेट का उपयोग करके, कोशिकाओं को यांत्रिक रूप से अलग करने के लिए पचे हुए ऊतक को 10x-15x को सख्ती से ट्राइट्यूरेट करें।
  7. एकल-सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए 70 μm सेल स्ट्रेनर या फ्लो साइटोमेट्री ट्यूब स्ट्रेनर के माध्यम से घोल और पचे हुए ऊतक को पास करें।

3. फ्लो साइटोमेट्री से पहले एंडोथेलियल कोशिकाओं का धुंधला होना

नोट: एंडोथेलियल कोशिकाओं के धुंधलापन और प्रसंस्करण को सेल व्यवहार्यता में सुधार के लिए बर्फ पर किया जाता है, जब तक कि निर्देश न दिया जाए। 5 एमएल पॉलीस्टाइनिन राउंड-बॉटम ट्यूबों को कमरे के तापमान (आरटी) पर 3 मिनट के लिए 1,163 x g पर सेंट्रीफ्यूज किया जाता है।

  1. आरटी पर 3 मिनट के लिए 1,163 x g पर एकल-सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें।
  2. सतह पर तैरने वाले को हटा दें और आरटी पर 30 मिनट के लिए पीबीएस + 5% बीएसए के 1 एमएल में सेल पेलेट को फिर से निलंबित करें।
    नोट: शोधकर्ताओं को सेल प्रकार, रुचि के लक्ष्य और18,19 का उपयोग किए गए एंटीबॉडी के आधार पर एफसी रिसेप्टर्स को अवरुद्ध करने पर विचार करना चाहिए।
  3. सेल व्यवहार्यता दाग (405 एनएम उत्तेजना) (सामग्री की तालिका) के 1 μL जोड़ें और आरटी में 30 मिनट के लिए अंधेरे में इनक्यूबेट करें।
  4. आरटी में 3 मिनट के लिए 1,163 x g पर सेल सस्पेंशन को सेंट्रीफ्यूज करें। सेल पेलेट को पीबीएस + 1% बीएसए के 200 μL में पुन: निलंबित करें।
  5. नमूनों में, सीडी 31 (सीडी 31-पीई, 0.75 μg / नमूना) और CD45 (CD45-FITC, 2.5 μg / नमूना) के संयुग्मित प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें और एल्यूमीनियम पन्नी के साथ नमूने को कवर करने के बाद 15 मिनट के लिए फ्रिज में एक रॉकर पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: एंडोथेलियल कोशिकाओं की शुद्ध आबादी की पहचान करने और / या प्राप्त करने के लिए, सीडी 31- और सीडी 45-संयुग्मित प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करके सीडी 31- और सीडी 45-संयुग्मित प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए जांच करें, जिसमें सीडी 31 + सीडी 45 - अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल के साथ अलग-अलग उत्तेजना / उत्सर्जन प्रतिदीप्ति और गेट / सॉर्ट कोशिकाएं हैं। 18,20,21 फ्लोरोफोरे के आधार पर मुआवजे की आवश्यकता हो सकती है।
  6. सेल निलंबन में सीधे पीबीएस + 1% बीएसए के 1 एमएल जोड़कर कोशिकाओं को धोएं।
  7. आरटी में 3 मिनट के लिए 1,163 x g पर सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को हटा दें और 0.1% बीएसए के साथ 1% फॉर्मलाडेहाइड के 200 μL में पुन: निलंबित करें। फ्लो साइटोमेट्री के लिए तैयार होने तक एल्यूमीनियम पन्नी से ढके फ्रिज में स्टोर करें।
    नोट: धोने और सेंट्रीफ्यूजेशन चरणों को कम करके सेल पैदावार में सुधार होता है। परिणाम दृष्टिकोण के आधार पर इन्हें बदलने की आवश्यकता हो सकती है। फिक्सेटिव में नमूना 24 घंटे के भीतर विश्लेषण किया जाना चाहिए।

Representative Results

वर्कफ़्लो का एक योजनाबद्ध चित्र 1 में दिखाया गया है। योजनाबद्ध प्रोटोकॉल पाठ में अधिक विस्तार से वर्णित प्रोटोकॉल चरणों पर प्रकाश डालता है। चित्र 2 में विच्छेदन के बाद चमड़े के नीचे वसा (चित्रा 2 ए, बाएं) और पैरेन्काइमल ऊतक की सफाई के बाद एक चमड़े के नीचे धमनी आर्केड (चित्रा 2 ए, दाएं) के चित्र दिखाए गए हैं। चित्र 2 में विच्छेदन के बाद मेसेंटेरिक वसा (चित्रा 2 बी, बाएं) और पैरेन्काइमल ऊतक की सफाई के बाद मेसेंटेरिक धमनी आर्केड (चित्रा 2 बी, दाएं) को भी दिखाया गया है।

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल संभावित रूप से रुचि रखने वाले शोधकर्ताओं की सहायता के लिए डिज़ाइन किया गया है ए) बुनियादी विज्ञान दृष्टिकोण और / या रोग मॉडल में अलग-अलग वसा डिपो वास्कुलचर बेड की तुलना करना, बी) डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोग के लिए रुचि की संवहनी कोशिकाओं के अलगाव से पहले संवहनी बिस्तरों का पाचन, और सी) रुचि की संवहनी कोशिकाओं की पहचान करने के लिए फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग (चित्रा 3) ) विभिन्न प्रकार के अनुप्रयोगों के लिए, जिनमें प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण शामिल हैं, लेकिन सीमित नहीं हैं, जैसा कि यहां किया गया है (चित्रा 4)। चित्रा 3 प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके पचने वाले माउस धमनियों से एंडोथेलियल कोशिकाओं की पहचान करने के लिए हमारे दृष्टिकोण का एक उदाहरण बताता है। डाइजेस्टेड चमड़े के नीचे (चित्रा 3 ए) या मेसेंटेरिक (चित्रा 3 बी) वसा धमनियों से प्राप्त सेल की तैयारी को सीडी 31-पीई, सीडी 45-एफआईटीसी, और फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके व्यवहार्य सीडी 31 + सीडी 45 - एंडोथेलियल कोशिकाओं के निर्धारण और पहचान से पहले सेल व्यवहार्यता डाई से दाग दिया गया था, जैसा कि इसी तरह कहीं और कियागया था। सेल व्यवहार्यता दाग ने केवल उन व्यवहार्य कोशिकाओं की पहचान के लिए अनुमति दी जो निर्धारण से पहले अलगाव और पाचन प्रोटोकॉल से बच गए थे। इस पद्धति का उपयोग शोधकर्ताओं को रुचि के व्यवहार्य संवहनी कोशिकाओं की अभिव्यक्ति या कार्य का आकलन करने की अनुमति देगा।

यह निर्धारित करने के लिए कि क्या अलग-अलग वसा डिपो वाहिका से पृथक एंडोथेलियल कोशिकाओं ने झिल्ली प्रोटीन अभिव्यक्ति में अंतर प्रदर्शित किया है, अलग-थलग कोशिकाओं को फैटी एसिड ट्रांसलोकेस, सीडी 36 (चित्रा 4) के लिए जांच की गई थी, क्योंकि इस झिल्ली प्रोटीन को हाल ही में ऊतकों में फैटी एसिड के एंडोथेलियल-मध्यस्थता वितरण में आवश्यक दिखाया गया था। . इसलिए, झिल्ली सीडी 36 के बीच सापेक्ष अभिव्यक्ति अंतर का निर्धारण, उदाहरण के लिए, अलग-अलग संवहनी बिस्तरों में ए) विभिन्न ऊतकों के बीच फैटी एसिड उपयोग के लिए अंतर वरीयता के बारे में मौजूदा डेटा का समर्थन कर सकता है और / या बी) स्वास्थ्य और बीमारी में फैटी एसिड के ऊतक वितरण में संभावित नए अंतर का खुलासा करता है। चित्रा 3 में उदाहरण दिए गए पचे हुए संवहनी कोशिकाओं की समान तैयारी से, सीडी 31 + सीडी 45-सीडी 36 + एंडोथेलियल कोशिकाओं को चमड़े के नीचे (चित्रा 4 ए) और मेसेंटेरिक (चित्रा 4 बी) वसा में पहचाना गया था, और सीडी 36 अभिव्यक्ति को प्रत्येक संवहनी बिस्तर में इस आबादी में परिमाणित किया गया था। चित्रा 4 सी और चित्रा 4 डी से पता चलता है कि सीडी 36 को व्यक्त करने वाली एंडोथेलियल कोशिकाओं का प्रतिशत और सीडी 36 अभिव्यक्ति की तीव्रता दोनों मेसेंटेरिक एंडोथेलियल कोशिकाओं की तुलना में चमड़े के नीचे एंडोथेलियल कोशिकाओं में अधिक थीं। ये प्रारंभिक निष्कर्ष संवहनी बिस्तरों के बीच अलग-अलग अंतरों की पहचान करने के लिए हमारी पद्धति के उपयोग का समर्थन करते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए चमड़े के नीचे और आंत के वसा ऊतकों से एंडोथेलियल कोशिकाओं को अलग करने के लिए कार्य योजना। (ए) 10-12 सप्ताह के सी 57बीएल / 6 जे चूहों को इच्छामृत्यु दी गई और इस प्रक्रिया को प्रदर्शित करने के लिए उपयोग किया गया। (बी) सबसे पहले, चमड़े के नीचे वसा हटा दी जाती है। (बी आई) फिर, मेसेंटेरिक (आंत) वसा ऊतक को बाद में हटा दिया जाता है। सफेद डैश्ड लाइनें विच्छेदन और हटाने के बाद चमड़े के नीचे (बाएं) और मेसेंटेरिक (दाएं) वसा डिपो के स्थानों को इंगित करती हैं। डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए संबंधित धमनियों को अलग किया जाता है। (सी) इस प्रोटोकॉल में, पृथक धमनियों को कार्यात्मक रूप से व्यवहार्य एंडोथेलियल कोशिकाओं को मुक्त करने में पहले कदम के रूप में एक विशिष्ट एंजाइम कॉकटेल का उपयोग करके पचाया जाता है। (डी) फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण से पहले संयुग्मित एंटीबॉडी का उपयोग करके सीडी 31 + और सीडी 45 - कोशिकाओं की जांच करके पृथक एंडोथेलियल कोशिकाओं की पहचान की जाती है। सीडी 31 + / सीडी 45 − की अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल वाली कोशिकाएं अतिरिक्त विश्लेषण के लिए रुचि की एंडोथेलियल कोशिकाएं हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: चमड़े के नीचे और आंत के वसा ऊतकों और संबंधित धमनियों को अलग करना। (ए) बाएं: हिंदलिम्ब्स से अलग "सी-आकार" चमड़े के नीचे वसा ऊतक। चमड़े के नीचे वसा धमनी की एक प्रमुख शाखा, जिसे तीर (1) द्वारा दर्शाया जाता है, तब प्रकट होता है जब पैरेन्काइमल वसा को हटा दिया जाता है। दाएं: अलग चमड़े के नीचे वसा धमनियां। (बी) बाएं: मेसेंटेरिक (आंत) वसा ऊतक आंत से अलग होता है। दाएं: संबंधित धमनी आर्केड को पैरेन्काइमल ऊतक को हटाकर अलग किया जाता है। वसा (5 मिमी) और धमनियों (1 मिमी) के चित्रों के बीच विभिन्न तराजू का उपयोग किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से धमनी ऊतक पाचन के बाद एंडोथेलियल कोशिकाओं की पहचान। पृथक (ए) चमड़े के नीचे या (बी) मेसेन्टेरिक वसा धमनियों से मुक्त कोशिकाओं को दिखाने वाले प्रतिनिधि भूखंड। कोशिकाओं को संयुग्मित एंटीबॉडी के संपर्क में लाया गया था जो निर्धारण से पहले सीडी 31 (पीई) और सीडी 45 (एफआईटीसी) के बाह्य एपिटोप्स को लक्षित करते थे। फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग सीडी 31 + सीडी 45 − एंडोथेलियल सेल आबादी की पहचान करने के लिए किया गया था। एक सेल व्यवहार्यता दाग का उपयोग केवल उन कोशिकाओं का चयन करने के लिए किया गया था जो बाद के विश्लेषणों के लिए अलगाव और पाचन प्रोटोकॉल से बच गए थे। इसके अलावा, इस स्तर पर उपयुक्त गेटिंग एक इच्छित सेल आबादी को दूषित कोशिकाओं से अलग कर देगी, अगर सेल प्रकार की रुचि का आकार ज्ञात होना चाहिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से चमड़े के नीचे बनाम मेसेंटेरिक वसा धमनी एंडोथेलियल कोशिकाओं में सीडी 36 झिल्ली अभिव्यक्ति का विश्लेषण। प्रतिनिधि जनसंख्या भूखंड और हिस्टोग्राम (ए) चमड़े के नीचे या (बी) मेसेन्टेरिक वसा धमनियों में एंडोथेलियल सीडी 36 (एपीसी) झिल्ली अभिव्यक्ति दिखाते हैं। (सी) चमड़े के नीचे बनाम मेसेंटेरिक ईसी (एन = 5, 3 पुरुष, 2 महिलाएं; * पी < 0.05 छात्र के टी-टेस्ट के बाद) में सीडी 36 व्यक्त करने वाली एंडोथेलियल कोशिकाओं (ईसी) का प्रतिशत। (डी) चमड़े के नीचे बनाम मेसेन्टेरिक वसा धमनियों में सामान्यीकृत ईसी झिल्ली सीडी 36 अभिव्यक्ति (एन = 5, 3 पुरुष, 2 महिलाएं; * पी < छात्र के टी-टेस्ट के बाद 0.05)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

एंडोथेलियल डिसफंक्शन गंभीर रोग अवस्थाओं का अग्रदूत है, संभवतः एथेरोस्क्लेरोसिस, उच्च रक्तचाप और स्ट्रोक3,23 के विकास को चलाता है। जबकि किसी दिए गए पैथोलॉजिकल स्थिति में एंडोथेलियल डिसफंक्शन अंतर्निहित पहचाने गए तंत्र कई हैं, अलग-अलग संवहनी बेड पैथोलॉजिकल स्थितियों4,24 से अलग-अलग प्रभावित होने की संभावना है। इसके अलावा, विभिन्न कार्डियोवैस्कुलर जोखिम कारक (जैसे, मोटापा, उच्च रक्तचाप, डिस्लिपिडेमिया, धूम्रपान, मधुमेह) विभिन्न प्रकार के अलग-अलगतंत्रों के माध्यम से शिथिलता को प्रेरित करते हैं। इसलिए, एंडोथेलियल सेल आबादी को बीमारी या सुलभ मानव ऊतक के स्थापित पशु मॉडल से अलग करना और विवो वातावरण से तुरंत हटाई गई कोशिकाओं पर परख करना महत्वपूर्ण है। इस तरह से कोशिकाओं को अलग करने से संस्कृति में कोशिकाओं का अध्ययन करने पर एक अनूठा लाभ होता है जिसमें वे संस्कृति-प्रेरित फेनोटाइपिकपरिवर्तनों से शून्य होते हैं 5,6. इसके अलावा, एक हेटेरोजेनस एंडोथेलियल सेल आबादी सहित, जैसा कि विवो26,27 में देखा गया है (और इसे प्रवाह-सहायता प्राप्त सेल सॉर्टिंग का उपयोग करके अलग किया जा सकता है), एक जीवित जीव से विवो वातावरण में बेहतर जानकारी देता है। अंत में, यह विधि कई पशु मॉडल और संभावित रूप से मानव ऊतक की जांच पर लागू होती है और इसका उपयोग प्राथमिक सेल संस्कृति लाइनों को उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है, अगर ऐसी आवश्यकता की आवश्यकता होती है।

इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम, और वह कदम जिसे विभिन्न संवहनी बिस्तरों या सेल प्रकारों के लिए सबसे अधिक समायोजित करने की आवश्यकता होगी, यहां प्रस्तुत नहीं किया गया है, संवहनी ऊतक का पाचन है। इस कदम को सेल उपज को कम किए बिना सेल स्वास्थ्य के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। उपयोग किए जाने वाले विशिष्ट एंजाइम और पाचन की अवधि सेल स्वास्थ्य और उपज को अनुकूलित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं ताकि डाउनस्ट्रीम परख को पर्याप्त रूप से करने में सक्षम हो सकें। सीडी 36 की झिल्ली अभिव्यक्ति की पहचान के लिए, जैसा कि चमड़े के नीचे और मेसेंटेरिक एंडोथेलियल कोशिकाओं (चित्रा 4) में फ्लो साइटोमेट्री द्वारा पता लगाया गया था, पाचन प्रोटोकॉल का एक संशोधित संस्करण मूल रूप से पैच-क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी28 के लिए डिज़ाइन किया गया था। इसमें फ्लो साइटोमेट्री बनाम पैच-क्लैंप अध्ययन के लिए आवश्यक मांगों को बेहतर ढंग से पूरा करने के लिए सेल पैदावार बढ़ाने के लिए कोलेजनेज आई पाचन समय का विस्तार 30 मिनट तक शामिल था। चूंकि यह संशोधन कुछ हद तक सेल स्वास्थ्य को प्रभावित कर सकता है, यह सुनिश्चित करने के लिए फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण में एक सेल व्यवहार्यता दाग का उपयोग किया गया था कि इस प्रोटोकॉल के बाद केवल व्यवहार्य एंडोथेलियल कोशिकाओं का मूल्यांकन किया गया था (चित्रा 3)। यह अनुशंसा की जाती है कि संवहनी ऊतक से कोशिकाओं को अलग करने के उद्देश्य से अध्ययन में वांछित दृष्टिकोण का आकलन करने से पहले सेल व्यवहार्यता के लिए एक मार्कर शामिल होना चाहिए।

वर्णित प्रोटोकॉल चूहों से प्राप्त ≤1 मिलीग्राम धमनी नमूनों से विश्लेषण और डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए व्यवहार्य एंडोथेलियल कोशिकाओं को मुक्त करने के लिए पर्याप्त है; हालांकि, यदि रुचि की धमनियों को विभिन्न ऊतकों या जीवों (जैसे, मनुष्यों) से अलग किया जाना था, जिसके परिणामस्वरूप काफी अलग धमनी द्रव्यमान होंगे, तो किसी को पाचन एंजाइम सामग्री और इनक्यूबेशन की अवधि को कुशलतापूर्वक अलग करने के लिए अनुकूलित करना होगा। कुछ संवहनी बिस्तरों के लिए जो यहां प्रस्तुत चमड़े के नीचे और मेसेंटेरिक बेड (जैसे, कोरोनरी धमनियों) की तुलना में शुरुआती ऊतक की छोटी मात्रा से शुरू होते हैं, प्रति नमूने कई चूहों से धमनियों की पूलिंग आवश्यक हो सकती है। दरअसल, यह किसी भी संवहनी बिस्तर के लिए एक आवश्यक कदम हो सकता है, यह देखते हुए कि परिणाम दृष्टिकोण के लिए अपेक्षाकृत उच्च सेल उपज की आवश्यकता होती है। एक बड़ी सीमा यह है कि, प्रति नमूना पाचन में भिन्नता की प्रकृति के कारण, सेल पैदावार कभी-कभी एक ही संवहनी बिस्तर से होने पर भी बैचों में काफी भिन्न हो सकती है। यह डेटा का विश्लेषण करते समय समस्याएं पैदा कर सकता है और उचित होने पर सामान्यीकरण के माध्यम से इसका हिसाब रखा जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, चमड़े के नीचे और मेसेंटेरिक वसा धमनियों के अलग-अलग नमूनों में सेल पैदावार में परिवर्तन के कारण कच्चे डेटा में सीडी 36 अभिव्यक्ति बेहद परिवर्तनशील थी। इसलिए, कच्चे डेटा को सीडी 31 + सीडी 45 − औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता के लिए सामान्यीकृत किया गया था, इस धारणा के साथ कि यह विधि बैच मतभेदों के लिए सही होगी (चित्रा 4)। बेशक, दृष्टिकोण के आधार पर, अधिक परिष्कृत सांख्यिकीय विश्लेषण और सामान्यीकरण विधियों की आवश्यकता हो सकती है।

सारांश में, यह पेपर रुचि के एंडोथेलियल लक्ष्यों की अभिव्यक्ति और / या कार्य की जांच करने के लिए चूहों से चमड़े के नीचे और मेसेंटेरिक धमनियों को विच्छेदित करने, अलग करने और पचाने की एक विधि प्रस्तुत करता है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल में संशोधन के साथ, विभिन्न संवहनी बिस्तर और सेल प्रकार (जैसे, चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं) की जांच की जा सकती है। यह प्रोटोकॉल, उपलब्ध प्रयोगात्मक दृष्टिकोणों की अधिकता के लिए एक नींव के रूप में, संवहनी कोशिका जीव विज्ञान और संवहनी शिथिलता के तंत्र की समझ को आगे बढ़ाने की क्षमता रखता है।

Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

रिच वेस्ट की प्यार भरी याद में, एक शानदार वैज्ञानिक, सहयोगी और प्रिय दोस्त। हम डेलावेयर फ्लो साइटोमेट्री और बायोइमेजिंग कोर विश्वविद्यालय को हमारे अध्ययन में उनके चल रहे योगदान के लिए डेलावेयर जैव प्रौद्योगिकी संस्थान के हिस्से के रूप में धन्यवाद देना चाहते हैं। हम पांडुलिपि की सावधानीपूर्वक समीक्षा और संपादन के लिए एम्मा हडगिन्स को भी धन्यवाद देना चाहते हैं। हमारा काम नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जनरल मेडिकल साइंसेज पी 20जीएम 113125-6564 (आईएस फैन्चर) द्वारा समर्थित है। इस परियोजना को डेलावेयर INBRE कार्यक्रम द्वारा भी समर्थित किया गया था, जिसमें राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान और डेलावेयर राज्य (आईएस फैन्चर) से NIGMS (P20GM103446) और डेलावेयर जनरल यूनिवर्सिटी रिसर्च ग्रांट (आईएस फैन्चर) के अनुदान के साथ। यह सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि एनआईएच के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करती है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tissue dissection tools
5 forceps (2) Fine Science Tools 11252-00 For isolation of mesenteric adipose depot and arteries transfer
55 forceps (2) Fine Science Tools 11295-51 For parenchymal adipose removal
Curved Bonn scissors Fine Science Tools 14061-10 For isolation of mesenteric adipose depot
Graefe forceps Fine Science Tools 11051-10 For general dissection steps and isolation of subcutaneous adipose depot
Straight Bonn scissor Fine Science Tools 14060-09 For general dissection steps and isolation of subcutaneous adipose depot
Stereoscope with light source Laxco Z230PT40 For parenchymal adipose removal and artery isolation
Digestive enzymes for Artery Digestion
Collagenase Type I Wothington-BioChem LS004194
Dispase (Neutral Protease) Wothington-BioChem LS02110
Elastase Wothington-BioChem LS002292
Solutions Recipes
HEPES Buffer, pH 7.4 Final concentration
Calcium chloride dihydrate J.T.Baker 1332-1 2 mM
Dextrose (D-glucose) anhydrous Fisher D16-500 10 mM
HEPES Fisher BP310-500 10 mM
Magnesium Chloride Fisher M33-500 1 mM
Potassium Chloride Fisher P217-500 5 mM
Sodium chloride Oxoid LP0005 145 mM
Dissociation Solution, pH 7.30-7.40
Dextrose (D-glucose) anhydrous Fisher D16-500 10 mM
HEPES Fisher BP310-500 10 mM
Magnesium Chloride Fisher M33-500 2 mM
Potassium Chloride Fisher P217-500 56 mM
Sodium chloride Oxoid LP0005 55 mM
Sodium L-Glutamate monohydrate TCI G0188 80 mM
Flow Cytometry Analyses
5 mL Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap Falcon 352235
CD31-PE Miltenyi Biotec 130-119-653 0.75µg/sample
CD36-APC R&D Systems AF2519 2.5µg/ sample
CD45-FITC BioLegend 103108 2.5µg/ sample
Live/Dead Fixable Violet Dead Cell Staining kit (cell viability stain) Invitrogen L34955 1µL/sample

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References

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जीव विज्ञान अंक 184 एंडोथेलियल कोशिकाएं वसा ऊतक पाचन प्रवाह साइटोमेट्री
डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए अलग-अलग वसा डिपो से संवहनी एंडोथेलियल कोशिकाओं का अलगाव और पहचान
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Nguyen, T., Ahn, S. J., West, R.,… More

Nguyen, T., Ahn, S. J., West, R., Fancher, I. S. Isolation and Identification of Vascular Endothelial Cells from Distinct Adipose Depots for Downstream Applications. J. Vis. Exp. (184), e63999, doi:10.3791/63999 (2022).

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