Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Dissektion von Maus-Fettdepots und zur Isolierung und Verdauung entsprechender Arterien, um die Endothelzellpopulation freizusetzen und dann zu identifizieren. Frisch isolierte Zellen, die in nachgeschalteten Anwendungen eingesetzt werden, werden das Verständnis der vaskulären Zellbiologie und der Mechanismen vaskulärer Dysfunktion voranbringen.
Abstract
Vaskuläre Endothelzellen, die die Wand des Gefäßsystems auskleiden, spielen eine wichtige Rolle bei einer Vielzahl von physiologischen Prozessen, einschließlich der Regulierung des Gefäßtonus, der Barrierefunktionen und der Angiogenese. Die Endothelzelldysfunktion ist ein charakteristischer Prädiktor und ein wichtiger Treiber für das Fortschreiten schwerer kardiovaskulärer Erkrankungen, aber die zugrunde liegenden Mechanismen sind noch wenig verstanden. Die Fähigkeit, Endothelzellen aus verschiedenen Gefäßbetten in ihrer nativen Form zu isolieren und zu analysieren, wird einen Einblick in die Prozesse von Herz-Kreislauf-Erkrankungen geben. Dieses Protokoll stellt das Verfahren zur Dissektion von subkutanem und mesenterialem Fettgewebe der Maus vor, gefolgt von der Isolierung ihres jeweiligen arteriellen Gefäßsystems. Die isolierten Arterien werden dann mit einem spezifischen Cocktail von Verdauungsenzymen verdaut, die sich auf die Freisetzung funktionell lebensfähiger Endothelzellen konzentrieren. Das verdaute Gewebe wird mittels Durchflusszytometrie-Analyse unter Verwendung von CD31+/CD45−-Zellen als Marker für die positive Identifizierung von Endothelzellen beurteilt. Zellen können für sofortige nachgeschaltete funktionelle Assays sortiert oder zur Erzeugung primärer Zelllinien verwendet werden. Die Technik der Isolierung und Verdauung von Arterien aus verschiedenen Gefäßbetten wird Forschern die Möglichkeit bieten, frisch isolierte Gefäßzellen aus Arterien von Interesse zu bewerten und eine breite Palette von Funktionstests an bestimmten Zelltypen durchzuführen.
Introduction
Endothelzellen sind für ihre wichtige Rolle in einer Vielzahl von physiologischen Prozessen bekannt, einschließlich Barrierefunktionen, Angiogenese und Gefäßtonusregulation 1,2. Obwohl die Endothelzelldysfunktion bei der Förderung von Atherosklerose, Bluthochdruck, Diabetes usw. gut dokumentiert ist, sind die zugrunde liegenden Mechanismen, die die endotheliale Dysfunktion antreiben, nach wie vor schlecht verstanden und unterscheiden sich wahrscheinlich zwischen verschiedenen Gefäßbetten 2,3,4. Die Bemühungen, diese pathologischen Mechanismen der Endothelzelldysfunktion zu entschlüsseln, werden durch den begrenzten Zugang zu einer reinen Population von Endothelzellen aus Geweben und/oder die phänotypischen Veränderungen von Endothelzellen in Kultur 5,6 in Frage gestellt. Daher wird die Möglichkeit, Endothelzellen aus verschiedenen Gefäßbetten in ihrer nativen Form zu isolieren und zu analysieren, einen Einblick in die Prozesse von Herz-Kreislauf-Erkrankungen geben.
Dieses Protokoll stellt das Verfahren zur Sezierung von subkutanem und mesenterialem Fettgewebe von Mäusen vor, gefolgt von der Isolierung ihres jeweiligen arteriellen Gefäßsystems. Funktionell lebensfähige Endothelzellen, die die Arterienwände auskleiden, werden mit einem spezifischen Enzymcocktail freigesetzt. Besondere Sorgfalt wurde darauf verwendet, die Bedingungen des Verdauungsprotokolls zu optimieren, um eine ausreichende Ausbeute an Endothelzellen aus <1 mg Ausgangsgewebe zu erhalten, während die biomolekularen Marker für die Analyse intakt bleiben. Als nächstes werden isolierte Endothelzellen mittels Durchflusszytometrie identifiziert. Das Vorhandensein von CD31 (PECAM) wird in erster Linie zur Identifizierung von Endothelzellen verwendet. Aufgrund der Expression von CD31 in anderen Zelltypen, darunter mehrere hämatopoetischen Ursprungs, die auch CD45 exprimieren, wurde die Reinheit der isolierten Endothelzellen durch den Ausschluss von Zellen, die sowohl CD31 als auch CD45exprimieren 5,6,7,8, weiter erhöht. Darüber hinaus sollten Forscher abhängig von der Forschungsfrage und den zu verwendenden nachgelagerten Anwendungen die Auswahl eines umfangreichen Panels positiver und negativer Selektionsmarker in Betracht ziehen, um die Reinheit der interessierenden Zellpopulation zu optimieren.
Obwohl die Technik der Sezierung und Isolierung von Fettdepotarterien in den früheren Publikationen 9,10,11,12,13 verwendet wurde, muss noch ein detailliertes Protokoll vorgelegt werden, das die Isolierung eingebetteter Arterien beschreibt. Die Demonstration der Technik zur Isolierung und Verdauung von Arterien aus verschiedenen Gefäßbetten einer bestimmten Art von Interesse wird Forschern die Möglichkeit bieten, frisch isolierte Gefäßzellen aus Arterien von Interesse zu bewerten und eine breite Palette von Funktionstests an bestimmten Zelltypen durchzuführen. Die Tests können unter anderem Durchflusszytometrie zur Zellsortierung und Membranproteinexpression5,8, Elektrophysiologie zur Ionenkanalaktivität9, molekulares Profiling (Proteomik/genomische Analysen usw.) umfassen. 14,15 und die Erzeugung primärer Zelllinien für das Wirkstoffscreening in vitro16,17.
Protocol
Die Verwendung von Tieren in diesen Studien wurde von der University of Delaware, Institutional Animal Care and Use Committee (# 1372) genehmigt.
1. Gewebedissektion und -reinigung
HINWEIS: Im Videoprotokoll werden 10 bis 12 Wochen alte C57BL/6J-Mäuse verwendet. In Abbildung 1 finden Sie das Schema und das gewünschte Ergebnis der Gewebedissektion und der Reinigung der Arterien sowie die Liste der Verbrauchsmaterialien und Herstellerinformationen in der Materialtabelle .
- Euthanasieren Sie die Maus durch CO2 -Erstickung, gefolgt von zervikaler Dislokation.
- Sichern Sie die Maus mit Sezierstiften und besprühen Sie die ventrale Oberfläche mit 70% Ethanol.
- Isolierung von subkutanem Fettgewebe an jedem Hinterbein
HINWEIS: Sezierwerkzeuge benötigt: gerade Bonner Schere (9 cm) und stumpfe, gebogene Graefe-Pinzette.- Verwenden Sie eine Pinzette, um die Haut direkt über den Genitalien anzuheben und einen kleinen (2 mm) Schnitt in die Haut zu machen.
- Führen Sie die Spitze der Schere in die Inzisionsstelle ein und machen Sie einen 4-5 cm langen Mittellinienschnitt, beginnend mit dem ersten Schnitt und kranial zur Basis des Brustbeins. Seien Sie vorsichtig, um nicht in die Bauchhöhle einzudringen.
- Machen Sie einen 1 cm langen seitlichen Einschnitt, der sich seitlich von der Mittellinie unmittelbar unterhalb der Vorderbeine erstreckt.
- Machen Sie einen diagonalen 1 cm langen Schnitt zwischen Hinterbein und Genitalien.
- Machen Sie kleine Schnitte entlang der Mittellinien-Hautschnitte, um das zugehörige Bindegewebe abzuziehen und das subkutane Fettdepot freizulegen. Stecken Sie die Haut fest.
- Identifizieren Sie das "C-förmige" subkutane Fettgewebe und die Arterie / Vene, die senkrecht zur Bauchhöhle verläuft.
- Beginnen Sie von der Unterseite der C-Form in der Nähe der Genitalien und greifen Sie sanft das Fettgewebe, um das Bindegewebe freizulegen. Machen Sie kleine Schnitte im Bindegewebe, um das Fett von der Haut zu trennen. Vermeiden Sie es, das exponierte Gefäßsystem zu stören.
- Das Bindegewebe wird weiter seziert, bis das subkutane Fettgewebe intakt entfernt werden kann. Trennen Sie die freiliegende Arterie vorsichtig vom umgebenden Bindegewebe.
- Lagern Sie das isolierte subkutane Fett im HEPES-Puffer auf Eis, bis Sie bereit sind, das interessierende Gefäßbett zu isolieren.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.3.3.-1.3.5. für das verbleibende hintere subkutane Fettdepot.
- Isolierung des mesenterialen Fettdepots
HINWEIS: Sezierwerkzeuge benötigt: gerade Bonner Schere (9 cm), Graefe-Pinzette, eine #5-Pinzette, gerade Irisschere und gebogene Bonn-Schere (9 cm).- Verwenden Sie die Graefe-Pinzette, um die dünne Peritonealhöhlenwand über der Harnblase anzuheben und einen kleinen Schnitt mit einer geraden Schere zu machen.
- Heben Sie langsam die durchdrungene Peritonealhöhlenwand an, führen Sie vorsichtig die gerade Irisschere in die Inzisionsstelle ein und machen Sie einen 4-5 cm langen Schnitt von der Harnblase zum Brustbein.
- Machen Sie zwei 1 cm lange horizontale Schnitte mit der geraden Irisschere, die sich seitlich von der Mittellinie bis unmittelbar über das Hinterbein und unter das Vorderbein erstrecken. Verwenden Sie die Graefe-Pinzette, um die Bauchmuskulatur zurückzuziehen und die Peritonealeingeweide freizulegen.
- Wiederholen Sie Schritt 1.4.3. auf der gegenüberliegenden Seite.
- Verwenden Sie die Zange # 5, um den Darm aus der viszeralen Höhle zu heben, um das mesenteriale Fett freizulegen.
- Verwenden Sie die gebogene Schere und die # 5 Pinzette, um das Fett entlang des Dickdarms zu trennen, beginnend vom Blind bis zu dem Punkt, an dem der Dickdarm aus dem Blickfeld absteigt.
- Kehren Sie zum Fäkal zurück und verwenden Sie die gebogene Schere und die # 5 Pinzette, um das Fett entlang des Dünndarms zur Bauchspeicheldrüse zu trennen. Entfernen Sie einen kleinen Teil der Bauchspeicheldrüse, um das mesenteriale Fett vollständig zu isolieren.
HINWEIS: Das Entfernen eines kleinen Teils der Bauchspeicheldrüse zusammen mit dem mesenterialen Fett kann bei der Reinigung der Arterien helfen, da es während der Reinigung Stabilität bietet. - Lagern Sie das isolierte mesenteriale Fett im HEPES-Puffer auf Eis, bis die Mesenterialarterien isoliert werden können.
- Isolierung der jeweiligen Arterien aus subkutanem und mesenterialem Fettgewebe
HINWEIS: Sezierwerkzeuge werden benötigt: eine Sezierschale und ein Stereoskop mit einer Lichtquelle, einem Paar # 55 Pinzetten und einem Paar # 5 Pinzetten.- Geben Sie ~ 10 ml kalten HEPES-Puffer in die Sezierschale und übertragen Sie das Fettgewebe mit der #5-Pinzette in die Schale.
- Verwenden Sie das Stereoskop bei 1-facher Vergrößerung, um das Fettgewebe zu betrachten und zu positionieren, um das/die Arterien-Venenpaar(e) freizulegen (Abbildung 2).
- Verwenden Sie die Zange #55, um das parenchymale Fett vorsichtig aus der Arterie zu entfernen. Entfernen Sie kleine Fettstücke auf einmal und beobachten Sie sorgfältig Arterie / Venenpaare unter dem Stereoskop, um das interessierende Gefäßsystem zu identifizieren und zu vermeiden.
ANMERKUNG: Stellen Sie die Vergrößerung und die Lichtquelle entsprechend ein, um die Arterien zu reinigen. Erhöhen Sie die Vergrößerung und Lichtintensität, um die Arterien besser zu sehen, wenn Fett entfernt wird. Die Feinreinigung der Arterien sollte unter 4-5-facher Vergrößerung erfolgen. Es ist wichtig, zwischen Bindegewebe (Kollagenen), Venen und Arterien zu unterscheiden. Bindegewebe und Kollagenfasern haben ein schnurartiges Aussehen ohne Zweige, sind gestreift und haben eine weißliche Farbe. Im Gegensatz zu Kollagenfasern und Bindegewebe sind Arterien und Venen transparent und haben mehrere Zweige mit einem definierten Lumen. Kleine Arterien und Venen können ähnlich aussehen, wenn sie frei von Parenchymgewebe sind. Das Vorhandensein von Blut im Lumen kann weiter helfen, die Arterien aus Venen zu identifizieren. Venen haben dünnere Blutgefäßwände und ein größeres Lumen und enthalten mehr Blut im Vergleich zu vergleichbar großen Arterien. - Wiederholen Sie Schritt 1.5.3. bis die Arterien vollständig frei von parenchymalem Fettgewebe sind.
- Verwenden Sie #5 Pinzetten, um die gereinigten Arterien in einen neuen Schlauch mit frischem HEPES-Puffer zu übertragen und auf Eis zu halten, bis sie für die Verdauung bereit sind.
2. Verdauung isolierter Arterien zur Isolierung von Endothelzellen
HINWEIS: Bitte beachten Sie Abbildung 2 für das Schema der Gewebeverdauung und Isolierung von Endothelzellen und die Materialtabelle für eine vollständige Liste der für das Protokoll benötigten Verbrauchsmaterialien.
- Fügen Sie jeweils 1 mg Dispase und Elastase zu jedem 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen hinzu. Fügen Sie 2 ml Dissoziationslösung zu jedem Röhrchen hinzu. Wirbeln und bei 37 °C inkubieren, bis sie sich vollständig aufgelöst haben. Verwenden Sie die #5-Pinzette, um die gereinigten Arterien (Schritt 1.5.5.) in die jeweiligen Probenröhrchen zu übertragen. Die Endkonzentration jedes Enzyms beträgt 0,5 mg/ml.
- Bei 37 °C für 1 h unter leichtem Rühren durch Inversion alle 10-15 min inkubieren, so dass die Arterien in Lösung suspendiert sind, um einen konsistenten und gleichmäßigen Kontakt zwischen den Enzymen und Arterien aufrechtzuerhalten.
- Wiegen Sie 1 mg Kollagenase Typ I pro Probe und fügen Sie es in neue Röhrchen hinzu.
- Lassen Sie die Arterien am Boden der Röhre absetzen. Entfernen Sie 500 μL des Puffers von oben, ohne die Arterien zu stören, und geben Sie ihn in dafür vorgesehene Röhrchen, die Kollagenase enthalten. Vortex und geben Sie die Lösung zu den jeweiligen Proben in den ursprünglichen Probenröhrchen zurück. Die Endkonzentration der Kollagenase Typ I beträgt 0,5 mg / ml.
- Bei 37 °C 15 min inkubieren. Stellen Sie sicher, dass sich die Arterien nach kurzem Schütteln des Probenröhrchens in Stücke trennen. Wenn sich die Arterien nach der Störung nicht in Stücke trennen, inkubieren Sie in 5-Minuten-Schritten, bis der arterielle Zusammenbruch sichtbar ist.
- Verwenden Sie eine Glaspipette, trituieren Sie das verdaute Gewebe 10x-15x, um die Zellen mechanisch zu dissoziieren.
- Die Lösung und das verdaute Gewebe durch ein 70-μm-Zellsieb oder ein Durchflusszytometrie-Röhrchensieb leiten, um Einzelzellsuspensionen zu erhalten.
3. Färbung von Endothelzellen vor der Durchflusszytometrie
HINWEIS: Die Färbung und Verarbeitung von Endothelzellen erfolgt auf Eis, um die Zelllebensfähigkeit zu verbessern, sofern nicht angewiesen. Die 5 mL Polystyrol-Rundbodenröhrchen werden bei 1.163 x g für 3 min bei Raumtemperatur (RT) zentrifugiert.
- Zentrifugieren Sie die einzelligen Suspensionen bei 1.163 x g für 3 min bei RT.
- Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml PBS + 5% BSA für 30 min bei RT.
HINWEIS: Forscher sollten erwägen, FC-Rezeptoren abhängig vom Zelltyp, dem interessierenden Ziel und dem verwendeten Antikörper zu blockieren18,19. - Fügen Sie 1 μL Zelllebensfähigkeitsfärbung (405 nm Anregung) hinzu (Tabelle der Materialien) und inkubieren Sie im Dunkeln für 30 min bei RT.
- Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 1.163 x g für 3 min bei RT. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 200 μL PBS + 1% BSA.
- Zu den Proben werden primäre Antikörper konjugiert zu CD31 (CD31-PE, 0,75 μg/Probe) und CD45 (CD45-FITC, 2,5 μg/Probe) hinzugefügt und auf einer Wippe im Kühlschrank für 15 min inkubiert, nachdem die Proben mit Aluminiumfolie abgedeckt wurden.
HINWEIS: Um eine reine Population von Endothelzellen zu identifizieren und/oder zu erhalten, untersuchen Sie sowohl CD31 als auch CD45 mit CD31- und CD45-konjugierten primären Antikörpern mit ausgeprägter Anregungs-/Emissionsfluoreszenz und Gate/Sort-Zellen mit einem CD31+CD45−-Expressionsprofil. Eine Kompensation kann in Abhängigkeit von den verwendeten Fluorophorenerforderlich sein 18,20,21. - Waschen Sie die Zellen, indem Sie 1 ml PBS + 1% BSA direkt in die Zellsuspension geben.
- Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 1.163 x g für 3 min bei RT. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie in 200 μL 1% Formaldehyd mit 0,1% BSA. Im Kühlschrank mit Aluminiumfolie abgedeckt aufbewahren, bis sie für die Durchflusszytometrie bereit sind.
HINWEIS: Die Zellausbeute wird durch die Reduzierung der Wasch- und Zentrifugationsschritte verbessert. Diese müssen möglicherweise je nach Ergebnisansatz geändert werden. Die Fixierprobe sollte innerhalb von 24 h analysiert werden.
Representative Results
Abbildung 1 zeigt einen schematischen Überblick über den Workflow. Das Schema hebt die im Protokolltext näher beschriebenen Protokollschritte hervor. Abbildung 2 zeigt Bilder von subkutanem Fettgewebe (Abbildung 2A, links) nach Dissektion und einer subkutanen Arterienarkade (Abbildung 2A, rechts) nach Reinigung des Parenchymgewebes. Abbildung 2 zeigt auch das mesenteriale Fett (Abbildung 2B, links) nach der Dissektion und die mesenteriale arterielle Arkade (Abbildung 2B, rechts) nach der Reinigung des Parenchymgewebes.
Das hier vorgestellte Protokoll soll Forschern helfen, die möglicherweise daran interessiert sind, a) verschiedene Fettdepot-Gefäßbetten in grundlagenwissenschaftlichen Ansätzen und/oder Krankheitsmodellen zu vergleichen, b) die Verdauung von Gefäßbetten vor der Isolierung von Gefäßzellen von Interesse für die nachgeschaltete Anwendung und c) die Verwendung von Durchflusszytometrie zur Identifizierung von Gefäßzellen von Interesse (Abbildung 3 ) für eine Vielzahl von Anwendungen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Proteinexpressionsanalysen, wie sie hier durchgeführt werden (Abbildung 4). Abbildung 3 zeigt ein Beispiel für unseren Ansatz zur Identifizierung von Endothelzellen aus verdauten Mausarterien mittels Durchflusszytometrie. Zellpräparate, die aus verdauten subkutanen (Abbildung 3A) oder mesenterialen (Abbildung 3B) Fettarterien gewonnen wurden, wurden vor der Fixierung und Identifizierung lebensfähiger CD31+CD45−-Endothelzellen mittels Durchflusszytometrie mit CD31-PE, CD45-FITC und einem Zelllebensfähigkeitsfarbstoff gefärbt, wie es in ähnlicher Weise an anderer Stelle durchgeführtwurde 8. Die Zelllebensfähigkeitsfärbung ermöglichte die Identifizierung nur der lebensfähigen Zellen, die das Isolierungs- und Verdauungsprotokoll vor der Fixierung überlebten. Die Verwendung dieser Methode wird es den Forschern ermöglichen, die Expression oder Funktion lebensfähiger Gefäßzellen von Interesse zu beurteilen.
Um festzustellen, ob Endothelzellen, die aus verschiedenen Fettdepotgefäßen isoliert wurden, Unterschiede in der Membranproteinexpression aufwiesen, wurden isolierte Zellen auf die Fettsäuretranslokase CD36 untersucht (Abbildung 4), da sich dieses Membranprotein kürzlich als essentiell für die endothelial vermittelte Verteilung von Fettsäuren an Gewebe erwiesenhat 22 . Daher kann die Bestimmung der relativen Expressionsunterschiede zwischen Membran-CD36, beispielsweise in verschiedenen Gefäßbetten, a) vorhandene Daten über die unterschiedliche Präferenz für die Fettsäureverwertung zwischen verschiedenen Geweben unterstützen und/oder b) potenzielle neue Unterschiede in der Gewebeverteilung von Fettsäuren in Gesundheit und Krankheit aufdecken. Aus den gleichen Präparaten verdauter Gefäßzellen, die in Abbildung 3 veranschaulicht sind, wurden CD31+CD45−CD36+-Endothelzellen im subkutanen (Abbildung 4A) und mesenterialen (Abbildung 4B) Fettgewebe identifiziert, und die CD36-Expression wurde in dieser Population in jedem Gefäßbett quantifiziert. Abbildung 4C und Abbildung 4D zeigen, dass sowohl der Prozentsatz der Endothelzellen, die CD36 exprimieren, als auch die Intensität der CD36-Expression in subkutanen Endothelzellen größer waren als in mesenterialen Endothelzellen. Diese vorläufigen Ergebnisse unterstützen die Verwendung unserer Methodik, um deutliche Unterschiede zwischen Gefäßbetten zu identifizieren.
Abbildung 1: Arbeitsschema zur Isolierung von Endothelzellen aus subkutanem und viszeralem Fettgewebe für nachgeschaltete Anwendungen . (A)10-12 Wochen alte C57BL/6J-Mäuse wurden eingeschläfert und zur Demonstration dieses Verfahrens verwendet. (Bi) Zuerst wird das subkutane Fett entfernt. (Bii) Anschließend wird das mesenteriale (viszerale) Fettgewebe entfernt. Die weißen gestrichelten Linien zeigen die Lage der subkutanen (links) und mesenterialen (rechts) Fettdepots nach der Dissektion und Entfernung an. Die jeweiligen Arterien sind für nachgeschaltete Anwendungen isoliert. (C) In diesem Protokoll werden isolierte Arterien als nächstes mit einem spezifischen Enzymcocktail als erster Schritt zur Freisetzung funktionell lebensfähiger Endothelzellen verdaut. (D) Isolierte Endothelzellen werden identifiziert, indem vor der Durchflusszytometrie-Analyse unter Verwendung konjugierter Antikörper nach CD31+- und CD45−-Zellen gesucht wird. Zellen mit einem Expressionsprofil von CD31+/CD45− sind die Endothelzellen, die für weitere Analysen von Interesse sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Isoliertes subkutanes und viszerales Fettgewebe und entsprechende Arterien. (A) Links: Isoliertes "C-förmiges" subkutanes Fettgewebe aus den Hintergliedmaßen. Ein Hauptast der subkutanen Fettarterie, gekennzeichnet durch Pfeil (1), wird sichtbar, wenn parenchymales Fett entfernt wird. Rechts: Isolierte subkutane Fettarterien. (B) Links: Das mesenteriale (viszerale) Fettgewebe wird aus dem Darm isoliert. Rechts: Die jeweilige arterielle Arkade wird isoliert, indem das Parenchymgewebe entfernt wird. Zwischen den Bildern von Fett (5 mm) und Arterien (1 mm) werden unterschiedliche Schuppen verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Identifizierung von Endothelzellen nach arterieller Gewebeverdauung mittels Durchflusszytometrie. Repräsentative Diagramme, die Zellen zeigen, die aus isolierten (A) subkutanen oder (B) mesenterialen Fettarterien befreit wurden. Die Zellen wurden vor der Fixierung konjugierten Antikörpern ausgesetzt, die auf extrazelluläre Epitope von CD31 (PE) und CD45 (FITC) abzielten. Die Durchflusszytometrie wurde verwendet, um die CD31+CD45− Endothelzellpopulation zu identifizieren. Eine Zelllebensfähigkeitsfärbung wurde verwendet, um nur die Zellen auszuwählen, die die Isolierungs- und Verdauungsprotokolle für nachfolgende Analysen überlebten. Darüber hinaus wird eine geeignete Ansteuerung in diesem Stadium eine beabsichtigte Zellpopulation weiter von kontaminierenden Zellen trennen, sollte die Größe des interessierenden Zelltyps bekannt sein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Analyse der CD36-Membranexpression in subkutanen vs. mesenterialen Fettarterienendothelzellen mittels Durchflusszytometrie. Repräsentative Populationsdiagramme und Histogramme, die die endotheliale CD36 (APC)-Membranexpression in (A) subkutanen oder (B) mesenterialen Fettarterien zeigen. (C) Prozentsatz der Endothelzellen (ECs), die CD36 in subkutanen vs. mesenterialen ECs exprimieren (n = 5, 3 Männer, 2 Frauen; *p < 0,05 nach dem studentischen t-Test). (D) Normalisierte EC-Membran-CD36-Expression in subkutanen vs. mesenterialen Fettarterien (n = 5, 3 Männer, 2 Frauen; *p < 0,05 nach dem studentischen t-Test). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Discussion
Endotheliale Dysfunktion ist ein Vorläufer schwerer Krankheitszustände, die wahrscheinlich die Entwicklung von Atherosklerose, Bluthochdruck und Schlaganfall vorantreiben 3,23. Während die identifizierten Mechanismen, die der endothelialen Dysfunktion in einem bestimmten pathologischen Zustand zugrunde liegen, vielfältig sind, werden unterschiedliche Gefäßbetten wahrscheinlich differentiell durch pathologische Zustände beeinflusst 4,24. Darüber hinaus induzieren verschiedene kardiovaskuläre Risikofaktoren (z. B. Fettleibigkeit, Bluthochdruck, Dyslipidämie, Rauchen, Diabetes) Funktionsstörungen durch eine Vielzahl unterschiedlicher Mechanismen23,25. Daher ist es wichtig, Endothelzellpopulationen aus etablierten Tiermodellen von Krankheiten oder zugänglichem menschlichem Gewebe zu isolieren und Assays an Zellen durchzuführen, die unmittelbar aus der In-vivo-Umgebung entfernt wurden. Die Isolierung von Zellen auf diese Weise hat einen einzigartigen Vorteil gegenüber der Untersuchung von Zellen in Kultur, da sie frei von kulturinduzierten phänotypischen Veränderungen sind 5,6. Darüber hinaus informiert die Einbeziehung einer heterogenen Endothelzellpopulation, wie sie in vivo 26,27 beobachtet wurde (und die durch flussunterstützte Zellsortierung weiter getrennt werden kann), von einem lebenden Organismus die In-vivo-Umgebung besser. Schließlich ist diese Methode auf die Untersuchung zahlreicher Tiermodelle und möglicherweise menschlicher Gewebe anwendbar und kann zur Erzeugung primärer Zellkulturlinien verwendet werden, wenn ein solcher Bedarf gerechtfertigt ist.
Der kritische Schritt in diesem Protokoll und der Schritt, der am meisten für verschiedene Gefäßbetten oder Zelltypen angepasst werden muss, die hier nicht vorgestellt werden, ist die Verdauung von vaskulärem Gewebe. Dieser Schritt muss für die Zellgesundheit optimiert werden, ohne die Zellausbeute zu verringern. Die verwendeten spezifischen Enzyme und die Dauer der Verdauung sind entscheidend für die Optimierung der Zellgesundheit und des Zellertrags, um nachgeschaltete Assays adäquat durchführen zu können. Für die Identifizierung der Membranexpression von CD36, wie sie durch Durchflusszytometrie in subkutanen und mesenterialen Endothelzellen nachgewiesen wurde (Abbildung 4), wurde eine modifizierte Version des ursprünglich für die Patch-Clamp-Elektrophysiologie28 konzipierten Aufschlussprotokolls entwickelt. Dies beinhaltete eine Verlängerung der Kollagenase-I-Verdauungszeit auf 30 Minuten, um die Zellausbeute zu erhöhen und die Anforderungen der Durchflusszytometrie besser zu erfüllen, verglichen mit dem, was für Patch-Clamp-Studien erforderlich ist. Da diese Modifikation die Zellgesundheit bis zu einem gewissen Grad beeinträchtigen kann, wurde in den Durchflusszytometrie-Analysen eine Zelllebensfähigkeitsfärbung verwendet, um sicherzustellen, dass nur lebensfähige Endothelzellen nach diesem Protokoll bewertet wurden (Abbildung 3). Es wird empfohlen, dass Studien, die darauf abzielen, Zellen aus vaskulärem Gewebe zu isolieren, vor der Bewertung des gewünschten Ansatzes einen Marker für die Zelllebensfähigkeit enthalten sollten.
Das beschriebene Protokoll reicht aus, um lebensfähige Endothelzellen für Analysen und nachgeschaltete Anwendungen aus ≤1 mg arteriellen Proben von Mäusen freizusetzen; Wenn jedoch die interessierenden Arterien aus verschiedenen Geweben oder Organismen (z. B. Menschen) isoliert würden, was zu signifikant unterschiedlichen arteriellen Massen führen würde, müsste man den Verdauungsenzymgehalt und die Dauer der Inkubation optimieren, um die interessierende Zellpopulation effizient zu isolieren. Für einige Gefäßbetten, die mit noch kleineren Mengen an Ausgangsgewebe beginnen als die hier vorgestellten subkutanen und mesenterialen Betten (z. B. Koronararterien), kann eine Ansammlung von Arterien aus mehreren Mäusen pro Probe erforderlich sein. In der Tat kann dies ein notwendiger Schritt für jedes gegebene Gefäßbett sein, da der Ergebnisansatz eine relativ hohe Zellausbeute erfordert. Eine wesentliche Einschränkung besteht darin, dass aufgrund der Art der Schwankungen pro Probenaufschluss die Zellausbeuten manchmal zwischen den Chargen signifikant unterschiedlich sein können, selbst wenn sie aus demselben Gefäßbett stammen. Dies kann zu Problemen bei der Analyse von Daten führen und sollte gegebenenfalls durch Normalisierung berücksichtigt werden. Zum Beispiel war die CD36-Expression in den Rohdaten aufgrund von Veränderungen der Zellausbeute über einzelne Proben subkutaner und mesenterialer Fettarterien extrem variabel. Daher wurden die Rohdaten auf die mittlere Fluoreszenzintensität von CD31+CD45− normalisiert, wobei davon ausgegangen wurde, dass diese Methode Chargenunterschiede korrigieren würde (Abbildung 4). Natürlich können je nach Ansatz anspruchsvollere statistische Analysen und Normalisierungsmethoden erforderlich sein.
Zusammenfassend stellt dieser Artikel eine Methode vor, um subkutane und mesenteriale Arterien von Mäusen zu sezieren, zu isolieren und zu verdauen, um die Expression und / oder Funktion von endothelialen Zielen von Interesse zu untersuchen. Mit Modifikationen des vorgestellten Protokolls können verschiedene Gefäßbetten und Zelltypen (z.B. glatte Muskelzellen) untersucht werden. Dieses Protokoll, als Grundlage für eine Vielzahl verfügbarer experimenteller Ansätze, hat das Potenzial, das Verständnis der vaskulären Zellbiologie und der Mechanismen vaskulärer Dysfunktion voranzutreiben.
Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
In liebevoller Erinnerung an Rich West, einen brillanten Wissenschaftler, Kollegen und lieben Freund. Wir möchten der University of Delaware Flow Cytometry and BioImaging Core als Teil des Delaware Biotechnology Institute für ihre laufenden Beiträge zu unseren Studien danken. Wir danken auch Emma Hudgins für die sorgfältige Sichtung und Bearbeitung des Manuskripts. Unsere Arbeit wird vom National Institute of General Medical Sciences P20GM113125-6564 (I.S. Fancher) unterstützt. Dieses Projekt wurde auch vom Delaware INBRE-Programm unterstützt, mit einem Zuschuss des NIGMS (P20GM103446) von den National Institutes of Health und dem Bundesstaat Delaware (I.S. Fancher) und einem University of Delaware General University Research Grant (I.S. Fancher). Dieser Inhalt liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten der NIH dar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue dissection tools | |||
| 5 forceps (2) | Fine Science Tools | 11252-00 | For isolation of mesenteric adipose depot and arteries transfer |
| 55 forceps (2) | Fine Science Tools | 11295-51 | For parenchymal adipose removal |
| Curved Bonn scissors | Fine Science Tools | 14061-10 | For isolation of mesenteric adipose depot |
| Graefe forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | For general dissection steps and isolation of subcutaneous adipose depot |
| Straight Bonn scissor | Fine Science Tools | 14060-09 | For general dissection steps and isolation of subcutaneous adipose depot |
| Stereoscope with light source | Laxco | Z230PT40 | For parenchymal adipose removal and artery isolation |
| Digestive enzymes for Artery Digestion | |||
| Collagenase Type I | Wothington-BioChem | LS004194 | |
| Dispase (Neutral Protease) | Wothington-BioChem | LS02110 | |
| Elastase | Wothington-BioChem | LS002292 | |
| Solutions Recipes | |||
| HEPES Buffer, pH 7.4 | Final concentration | ||
| Calcium chloride dihydrate | J.T.Baker | 1332-1 | 2 mM |
| Dextrose (D-glucose) anhydrous | Fisher | D16-500 | 10 mM |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | 10 mM |
| Magnesium Chloride | Fisher | M33-500 | 1 mM |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | 5 mM |
| Sodium chloride | Oxoid | LP0005 | 145 mM |
| Dissociation Solution, pH 7.30-7.40 | |||
| Dextrose (D-glucose) anhydrous | Fisher | D16-500 | 10 mM |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | 10 mM |
| Magnesium Chloride | Fisher | M33-500 | 2 mM |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | 56 mM |
| Sodium chloride | Oxoid | LP0005 | 55 mM |
| Sodium L-Glutamate monohydrate | TCI | G0188 | 80 mM |
| Flow Cytometry Analyses | |||
| 5 mL Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Falcon | 352235 | |
| CD31-PE | Miltenyi Biotec | 130-119-653 | 0.75µg/sample |
| CD36-APC | R&D Systems | AF2519 | 2.5µg/ sample |
| CD45-FITC | BioLegend | 103108 | 2.5µg/ sample |
| Live/Dead Fixable Violet Dead Cell Staining kit (cell viability stain) | Invitrogen | L34955 | 1µL/sample |
References
- Krüger-Genge, A., Blocki, A., Franke, R. P., Jung, F. Vascular endothelial cell biology: An update. International Journal of Molecular Sciences. 20 (18), 4411 (2019).
- Choi, S., Kim, J. A., Kim, K. C., Suh, S. H. Isolation and in vitro culture of vascular endothelial cells from mice. The Korean Journal of Physiology & Pharmacology. 19 (1), 35-42 (2015).
- Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: Testing and clinical relevance. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
- Nunan, E., et al. Obesity as a premature aging phenotype - Implications for sarcopenic obesity. Geroscience. , (2022).
- van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nature Protocols. 3 (6), 1085-1091 (2008).
- Dong, Q. G., et al. A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17 (8), 1599-1604 (1997).
- Amici, S. A., Dong, J., Guerau-de-Arellano, M. Molecular mechanisms modulating the phenotype of macrophages and microglia. Frontiers in Immunology. 8, 1520 (2017).
- Patel, J., et al. Functional definition of progenitors versus mature endothelial cells reveals key SoxF-dependent differentiation process. Circulation. 135 (8), 786-805 (2017).
- Ahn, S. J., et al. Inwardly rectifying K+ channels are major contributors to flow-induced vasodilatation in resistance arteries. The Journal of Physiology. 595 (7), 2339-2364 (2017).
- Bagchi, D. P., MacDougald, O. A. Identification and dissection of diverse mouse adipose depots. Journal of Visualized Experiments. (149), e59499 (2019).
- Ahn, S. J., et al. Cholesterol-induced suppression of endothelial Kir channels is a driver of impairment of arteriolar flow-induced vasodilation in humans. Hypertension. 79 (1), 126-138 (2022).
- Ahn, S. J., et al. Differential effects of obesity on visceral versus subcutaneous adipose arteries: Role of shear-activated Kir2.1 and alterations to the glycocalyx. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 322 (2), 156-166 (2022).
- Fancher, I. S., et al. Impairment of flow-sensitive inwardly rectifying K(+) channels via disruption of glycocalyx mediates obesity-induced endothelial dysfunction. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40 (9), 240-255 (2020).
- van Beijnum, J. R., et al. Gene expression of tumor angiogenesis dissected: Specific targeting of colon cancer angiogenic vasculature. Blood. 108 (7), 2339-2348 (2006).
- Hida, K., et al. Tumor-associated endothelial cells with cytogenetic abnormalities. Cancer Research. 64 (22), 8249-8255 (2004).
- Ades, E. W., et al. HMEC-1: Establishment of an immortalized human microvascular endothelial cell line. Journal of Investigative Dermatology. 99 (6), 683-690 (1992).
- Grange, C., et al. Isolation and characterization of human breast tumor-derived endothelial cells. Oncology Reports. 15 (2), 381-386 (2006).
- Liao, X., Makris, M., Luo, X. M. Fluorescence-activated cell sorting for purification of plasmacytoid dendritic cells from the mouse bone marrow. Journal of Visualized Experiments. (117), e54641 (2016).
- De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis, N. J. Isolating and immunostaining lymphocytes and dendritic cells from murine Peyer's patches. Journal of Visualized Experiments. (73), e50167 (2013).
- Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. Analysis of cell suspensions isolated from solid tissues by spectral flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (123), e55578 (2017).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. (41), e1546 (2010).
- Son, N. -H., et al. Endothelial cell CD36 optimizes tissue fatty acid uptake. The Journal of Clinical Investigation. 128 (10), 4329-4342 (2018).
- Bakker, W., Eringa, E. C., Sipkema, P., van Hinsbergh, V. W. M. Endothelial dysfunction and diabetes: roles of hyperglycemia, impaired insulin signaling and obesity. Cell and Tissue Research. 335 (1), 165-189 (2008).
- Farb, M. G., Gokce, N. Visceral adiposopathy: A vascular perspective. Hormone Molecular Biology and Clinical Investigation. 21 (2), 125-136 (2015).
- Williams, I. L., Wheatcroft, S. B., Shah, A. M., Kearney, M. T. Obesity, atherosclerosis and the vascular endothelium: mechanisms of reduced nitric oxide bioavailability in obese humans. International Journal of Obesity. 26 (6), 754-764 (2002).
- Cleuren, A. C. A., et al. The in vivo endothelial cell translatome is highly heterogeneous across vascular beds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (47), 23618-23624 (2019).
- Aird, W. C.
- Sonkusare, S. K., Dalsgaard, T., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Inward rectifier potassium (Kir2.1) channels as end-stage boosters of endothelium-dependent vasodilators. The Journal of Physiology. 594 (12), 3271-3285 (2016).
