Summary
Denne protokollen beskriver en metode for disseksjon av musefettdepoter og isolering og fordøyelse av respektive arterier for å frigjøre og deretter identifisere endotelcellepopulasjonen. Ferskt isolerte celler som brukes i nedstrøms applikasjoner vil fremme forståelsen av vaskulær cellebiologi og mekanismene for vaskulær dysfunksjon.
Abstract
Vaskulære endotelceller som fôrer veggen i det vaskulære systemet spiller viktige roller i en rekke fysiologiske prosesser, inkludert vaskulær toneregulering, barrierefunksjoner og angiogenese. Endotelcelledysfunksjon er en karakteristisk prediktor og viktig driver for utviklingen av alvorlige kardiovaskulære sykdommer, men de underliggende mekanismene forblir dårlig forstått. Evnen til å isolere og utføre analyser på endotelceller fra ulike vaskulære senger i sin opprinnelige form vil gi innsikt i prosessene ved hjerte- og karsykdommer. Denne protokollen presenterer prosedyren for disseksjon av mus subkutant og mesenterisk fettvev, etterfulgt av isolering av deres respektive arterielle vaskulatur. De isolerte arteriene fordøyes deretter ved hjelp av en spesifikk cocktail av fordøyelsesenzymer fokusert på å frigjøre funksjonelt levedyktige endotelceller. Fordøyd vev vurderes ved flowcytometrianalyse ved bruk av CD31+/CD45−celler som markører for positiv endotelcelleidentifisering. Celler kan sorteres for umiddelbare nedstrøms funksjonelle analyser eller brukes til å generere primære cellelinjer. Teknikken for å isolere og fordøye arterier fra forskjellige vaskulære senger vil gi muligheter for forskere å evaluere nyisolerte vaskulære celler fra arterier av interesse og tillate dem å utføre et bredt spekter av funksjonelle tester på bestemte celletyper.
Introduction
Endotelceller er godt kjent for sine viktige roller i en rekke fysiologiske prosesser, inkludert barrierefunksjoner, angiogenese og vaskulær toneregulering 1,2. Selv om endotelcelledysfunksjon er godt dokumentert for å fremme aterosklerose, hypertensjon, diabetes, etc., forblir de underliggende mekanismene som driver endoteldysfunksjon dårlig forstått og sannsynligvis varierer mellom forskjellige vaskulære senger 2,3,4. Forsøket på å avdekke disse patologiske mekanismene for endotelcelledysfunksjon utfordres av den begrensede tilgangen til en ren populasjon av endotelceller fra vev og/eller fenotypiske endringer av endotelceller i kultur 5,6. Derfor vil det å kunne isolere og utføre analyser på endotelceller fra ulike vaskulære senger i sin opprinnelige form gi innsikt i prosessene for hjerte- og karsykdommer.
Denne protokollen presenterer prosedyren for å dissekere subkutant og mesenterisk fettvev fra mus, etterfulgt av isolering av deres respektive arterielle vaskulatur. Funksjonelt levedyktige endotelceller som fôrer arterieveggene frigjøres ved hjelp av en bestemt cocktail av enzymer. Spesiell forsiktighet ble tatt for å optimalisere forholdene i fordøyelsesprotokollen for å oppnå tilstrekkelig utbytte av endotelceller fra <1 mg startvev samtidig som biomolekylære markører ble intakt for analyse. Isolerte endotelceller identifiseres deretter ved hjelp av flowcytometri. Tilstedeværelsen av CD31 (PECAM) brukes til primært å identifisere endotelceller. På grunn av ekspresjonen av CD31 i andre celletyper, inkludert flere av hematopoietisk opprinnelse som også uttrykker CD45, ble renheten til de isolerte endotelcellene ytterligere forbedret ved utelukkelse av celler som uttrykker både CD31 og CD45 5,6,7,8. Videre, avhengig av forskningsspørsmålet og nedstrømsapplikasjonene som skal brukes, bør forskere vurdere å velge et omfattende panel av positive og negative utvalgsmarkører for å optimalisere renheten til cellepopulasjonen av interesse.
Selv om teknikken for å dissekere og isolere fettdepotarterier har blitt brukt i de tidligere publikasjonene 9,10,11,12,13, har en detaljert protokoll som beskriver isolering av innebygde arterier ennå ikke blitt presentert. Å demonstrere teknikken for isolering og fordøyelse av arterier fra forskjellige vaskulære senger fra en gitt art av interesse, vil gi muligheter for forskere å evaluere nyisolerte vaskulære celler fra arterier av interesse og tillate dem å utføre et bredt spekter av funksjonelle tester på bestemte celletyper. Tester kan omfatte, men er ikke begrenset til, flowcytometri for cellesortering og membranproteinuttrykk5,8, elektrofysiologi for ionekanalaktivitet9, molekylær profilering (proteomikk/genomiske analyser etc.) 14,15, og genereringen av primære cellelinjer for narkotikascreening in vitro16,17.
Protocol
Bruken av dyr i disse studiene ble godkjent av University of Delaware, Institutional Animal Care and Use Committee (# 1372).
1. Vevdisseksjon og rengjøring
MERK: 10 til 12 uker gamle C57BL/6J-mus brukes i videoprotokollen. Se figur 1 for skjematisk og ønsket resultat av vevsdisseksjon og rengjøring av arterier, og se materialtabellen for listen over forsyninger og produsentinformasjon.
- Avliv musen ved CO2 kvelning etterfulgt av cervikal dislokasjon.
- Fest musen med disseksjonspinner og spray den ventrale overflaten med 70% etanol.
- Isolering av subkutant fettvev lokalisert av hver bakbenet
MERK: Dissekeringsverktøy som trengs: rett Bonn-saks (9 cm) og stumpe, buede Graefe-tang.- Bruk tang til å løfte huden rett over kjønnsorganene og gjør et lite (2 mm) snitt i huden.
- Sett saksespissen inn i snittstedet og lag et 4-5 cm midtlinjesnitt, som begynner ved det første snittet og dissekerer kranialt til bunnen av brystbenet. Vær forsiktig så du ikke trenger inn i bukhulen.
- Lag et 1 cm lateralt snitt, som strekker seg lateralt fra midtlinjen rett under forbenet.
- Lag et diagonalt 1 cm snitt mellom bakbenet og kjønnsorganene.
- Lag små kutt langs midtlinjehudsnittene for å skrelle bort det tilhørende bindevevet og eksponere det subkutane fettdepotet. Fest huden ned.
- Identifiser "C-formet" subkutant fettvev og arterie / vene som går vinkelrett på bukhulen.
- Start fra bunnen av C-formen nær kjønnsorganene og ta forsiktig tak i fettvevet for å eksponere bindevevet. Lag små kutt i bindevevet for å skille fettet fra huden. Unngå å forstyrre den eksponerte vaskulaturen.
- Fortsett å dissekere bort bindevevet til det subkutane fettvevet kan fjernes intakt. Skill forsiktig den eksponerte arterien fra det omkringliggende bindevevet.
- Oppbevar det isolerte subkutane fettet i HEPES-buffer på is til det er klart til å isolere vaskulærsengen av interesse.
- Gjenta trinn 1.3.3.-1.3.5. for det resterende bakre subkutane fettdepotet.
- Isolering av mesenterisk fettdepot
MERK: Dissekeringsverktøy som trengs: rett Bonn-saks (9 cm), Graefe-tang, et par #5 tang, rett irissaks og buet Bonn-saks (9 cm).- Bruk Graefe-tangen til å løfte den tynne bukhuleveggen over urinblæren og lag et lite snitt med rett saks.
- Løft sakte den penetrerte peritoneale hulromsveggen, sett forsiktig den rette irissaksen inn i snittstedet, og gjør et 4-5 cm snitt fra urinblæren til brystbenet.
- Lag to 1 cm lange horisontale snitt med den rette irissaksen, som strekker seg lateralt fra midtlinjen til rett over bakbenet og under forbenet. Bruk Graefe-tangen til å skrelle av magemuskulaturen og eksponere bukhinnvollene.
- Gjenta trinn 1.4.3. på motsatt side.
- Bruk paret #5 tang for å løfte tarmene ut av det viscerale hulrommet for å avsløre mesenterisk fett.
- Bruk den buede saksen og #5 tangen til å skille fettet langs tykktarmen, fra caecum til hvor tykktarmen kommer ned fra visningen.
- Gå tilbake til caecum og bruk den buede saksen og # 5 tang for å skille fettet langs tynntarmen til bukspyttkjertelen. Fjern en liten del av bukspyttkjertelen for å isolere mesenterisk fett helt.
MERK: Fjerning av en liten del av bukspyttkjertelen sammen med mesenterisk fett kan hjelpe til med å rense arteriene, da det gir stabilitet under rengjøring. - Oppbevar det isolerte mesenteriske fettet i HEPES-buffer på is til det er klart til å isolere mesenteriske arterier.
- Isolering av de respektive arteriene fra subkutant og mesenterisk fettvev
MERK: Dissekeringsverktøy som trengs: en dissekeringsfat og stereoskop med en lyskilde, et par # 55 tang og et par # 5 tang.- Plasser ~ 10 ml kald HEPES-buffer i dissekeringsfatet og overfør fettvevet til parabolen ved hjelp av # 5 tang.
- Bruk stereoskopet ved 1x forstørrelse for å vise og plassere fettvevet for å eksponere arterien / veneparet (e) (figur 2).
- Bruk # 55 tang for å forsiktig fjerne parenkymal fett fra arterien. Fjern små fettbiter om gangen og observer nøye arterie / venepar under stereoskopet for å identifisere og unngå å skade vaskulaturen av interesse.
NOTAT: Juster forstørrelsen og lyskilden tilsvarende for å rense arteriene. Øk forstørrelsen og lysintensiteten for bedre å se arteriene når fett fjernes. Fin rengjøring av arteriene bør gjøres under 4x-5x forstørrelse. Det er viktig å skille mellom bindevev (kollagener), vener og arterier. Bindevev og kollagenfibre har et strenglignende utseende uten grener, er strikket og har en hvitaktig farge. I motsetning til kollagenfibre og bindevev er arterier og vener gjennomsiktige og har flere grener med et definert lumen. Små arterier og vener kan virke like i utseende når de er fri for parenkymalt vev. Tilstedeværelsen av blod i lumen kan ytterligere hjelpe en til å identifisere arteriene fra vener. Vener har tynnere blodkarvegger og større lumen og inneholder mer blod sammenlignet med sammenlignbare arterier. - Gjenta trinn 1.5.3. til arteriene er helt tomme for parenkymalt fettvev.
- Bruk #5 tang for å overføre de rensede arteriene til et nytt rør med fersk HEPES-buffer og hold deg på is til den er klar for fordøyelsen.
2. Fordøyelse av isolerte arterier for isolering av endotelceller
MERK: Vennligst se figur 2 for skjematisk av vevsfordøyelse og isolering av endotelceller og materialtabellen for en komplett liste over forsyninger som trengs for protokollen.
- Tilsett 1 mg hver av dispase og elastase til hver 2 ml mikrosentrifuge tube. Tilsett 2 ml dissosiasjonsløsning til hvert rør. Virvel og rug ved 37 °C til den er helt oppløst. Bruk #5 tang for å overføre de rensede arteriene (trinn 1.5.5.) til de respektive prøverørene. Den endelige konsentrasjonen av hvert enzym er 0,5 mg / ml.
- Inkuber ved 37 °C i 1 time med mild omrøring ved inversjon hvert 10-15 minutt, slik at arteriene suspenderes i oppløsning for å opprettholde konsistent og jevn kontakt mellom enzymer og arterier.
- Vei 1 mg kollagenase type I per prøve og legg den til nye rør.
- La arteriene slå seg ned på bunnen av røret. Fjern 500 μL av bufferen fra toppen uten å forstyrre arteriene og overfør den til utpekte rør som inneholder kollagenase. Vortex og returner løsningen til de respektive prøvene i de opprinnelige prøverørene. Den endelige konsentrasjonen av kollagenase type I er 0,5 mg/ml.
- Inkuber ved 37 °C i 15 minutter. Sørg for at arteriene skilles i stykker etter kort risting av prøverøret. Hvis arteriene ikke separeres i stykker etter forstyrrelse, inkuberer du trinnvis i trinn på 5 minutter til arteriell sammenbrudd er synlig.
- Bruk en glasspipette til å triturere det fordøyede vevet kraftig 10x-15x for å dissosiere cellene mekanisk.
- Pass løsningen og fordøyd vev gjennom en 70 μm celle sil eller en flowcytometri rørsil for å oppnå enkeltcellesuspensjoner.
3. Farging av endotelceller før flowcytometri
MERK: Farging og behandling av endotelceller utføres på is for å forbedre cellens levedyktighet, med mindre det blir instruert. 5 ml polystyren rundbunnsrør sentrifugeres ved 1,163 x g i 3 minutter ved romtemperatur (RT).
- Sentrifuge enkeltcellesuspensjonene ved 1,163 x g i 3 minutter ved RT.
- Fjern supernatanten og resuspender cellepelleten i 1 ml PBS + 5% BSA i 30 minutter ved RT.
MERK: Forskere bør vurdere å blokkere FC-reseptorer avhengig av celletype, mål av interesse og antistoff brukt18,19. - Tilsett 1 μL celle levedyktighetsflekk (405 nm eksitasjon) (Materialtabell) og inkuber i mørket i 30 minutter ved RT.
- Sentrifuge cellesuspensjonen ved 1,163 x g i 3 minutter ved RT. Resuspender cellepelleten i 200 μL PBS + 1% BSA.
- I prøvene tilsettes primære antistoffer konjugert til CD31 (CD31-PE, 0,75 μg/prøve) og CD45 (CD45-FITC, 2,5 μg/prøve) og ruges på en rocker i kjøleskapet i 15 minutter etter å ha dekket prøvene med aluminiumsfolie.
MERK: For å identifisere og / eller oppnå en ren populasjon av endotelceller, sonde for både CD31 og CD45 ved bruk av CD31- og CD45-konjugerte primære antistoffer med distinkt eksitasjon / emisjonsfluorescens og gate / sorteringsceller med en CD31 + CD45 - uttrykksprofil. Kompensasjon kan være nødvendig avhengig av fluoroforene som brukes 18,20,21. - Vask cellene ved å tilsette 1 ml PBS + 1% BSA direkte til cellesuspensjonen.
- Sentrifuge cellesuspensjonen ved 1,163 x g i 3 minutter ved RT. Fjern supernatanten og resuspender i 200 μL 1% formaldehyd med 0,1% BSA. Oppbevares i kjøleskapet dekket med aluminiumsfolie til det er klart for flowcytometri.
MERK: Celleutbyttet forbedres ved å redusere vaske- og sentrifugeringstrinnene. Disse må kanskje endres avhengig av utfallsmetoden. Prøven i fiksativ skal analyseres innen 24 timer.
Representative Results
Et skjema over arbeidsflyten er vist i figur 1. Skjemaet fremhever protokolltrinnene som er beskrevet mer detaljert i protokollteksten. Figur 2 viser bilder av subkutant fett (figur 2A, venstre) etter disseksjon og arkade i underlivet (figur 2A, høyre) etter rengjøring av parenkymvevet. Figur 2 viser også mesenterisk fett (figur 2B, venstre) etter disseksjon og mesenterisk arteriell arkade (figur 2B, høyre) etter rengjøring av parenkymvevet.
Protokollen som presenteres her er utformet for å hjelpe forskere som potensielt er interessert i a) å sammenligne distinkte fettdepotvaskulatursenger i grunnleggende vitenskapelige tilnærminger og / eller sykdomsmodeller, b) fordøyelsen av vaskulære senger før isolering av vaskulære celler av interesse for nedstrøms applikasjon, og c) bruk av flowcytometri for å identifisere vaskulære celler av interesse (figur 3 ) for en rekke bruksområder, inkludert, men ikke begrenset til, proteinuttrykksanalyser som utført her (figur 4). Figur 3 beskriver et eksempel på vår tilnærming til å identifisere endotelceller fra fordøyede musearterier ved hjelp av flowcytometri. Cellepreparater fra fordøyd subkutan (figur 3A) eller mesenteriske (figur 3B) fettarterier ble farget med CD31-PE, CD45-FITC og et celle levedyktighetsfargestoff før fiksering og identifisering av levedyktige CD31 + CD45 - endotelceller ved bruk av flowcytometri, som tilsvarende utført andre steder8. Cellens levedyktighetsflekk tillot identifisering av bare de levedyktige cellene som overlevde isolasjons- og fordøyelsesprotokollen før fiksering. Bruken av denne metoden vil tillate forskere å vurdere uttrykket eller funksjonen til levedyktige vaskulære celler av interesse.
For å avgjøre om endotelceller isolert fra distinkt fettdepotvaskulatur viste forskjeller i membranproteinuttrykk, ble isolerte celler undersøkt for fettsyretransloken, CD36 (figur 4), da dette membranproteinet nylig ble vist å være essensielt i den endotelmedierte fordelingen av fettsyrer til vev22 . Derfor kan bestemmelse av de relative uttrykksforskjellene mellom membran CD36, for eksempel i forskjellige vaskulære senger, a) støtte eksisterende data om differensiell preferanse for fettsyreutnyttelse mellom forskjellige vev og / eller b) avdekke potensielle nye forskjeller i vevsfordeling av fettsyrer i helse og sykdom. Fra de samme preparatene av fordøyede vaskulære celler eksemplifisert i figur 3 ble CD31+CD45−CD36+ endotelceller identifisert i subkutane (figur 4A) og mesenteriske (figur 4B) fett, og CD36-ekspresjon ble kvantifisert i denne populasjonen i hver vaskulærseng. Figur 4C og figur 4D viser at både prosentandelen av endotelceller som uttrykker CD36 og intensiteten av CD36-ekspresjon var større i subkutane endotelceller sammenlignet med det som ble observert i mesenteriske endotelceller. Disse foreløpige funnene støtter bruken av vår metodikk for å identifisere tydelige forskjeller mellom vaskulære senger.
Figur 1: Arbeidsskjema for å isolere endotelceller fra subkutant og visceralt fettvev for nedstrøms applikasjoner . (A)10-12 uker gamle C57BL/6J-mus ble avlivet og brukt til å demonstrere denne prosedyren. (Bi) Først fjernes det subkutane fettet. (Bii) Deretter fjernes det mesenteriske (viscerale) fettvevet. De hvite stiplede linjene angir plasseringen av de subkutane (venstre) og mesenteriske (høyre) fettdepotene etter disseksjon og fjerning. De respektive arteriene er isolert for nedstrøms applikasjoner. (C) I denne protokollen blir isolerte arterier neste fordøyd ved hjelp av en spesifikk enzymcocktail som et første skritt i frigjøring av funksjonelt levedyktige endotelceller. (D) Isolerte endotelceller identifiseres ved sondering for CD31+- og CD45-celler ved bruk av konjugerte antistoffer før flowcytometrianalyse. Celler med en ekspresjonsprofil av CD31+/CD45− er endotelceller av interesse for ytterligere analyser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Isolert subkutant og visceralt fettvev og respektive arterier. (A) Venstre: Isolert "C-formet" subkutant fettvev fra bakben. En hovedgren av arteria subkutan fett, pilbetegnet (1), avdekkes når parenkymatisk fett fjernes. Høyre: Isolerte subkutane fettarterier. (B) Venstre: Det mesenteriske (viscerale) fettvevet er isolert fra tarmen. Høyre: Den respektive arterielle arkaden isoleres ved å fjerne det parenkymale vevet. Ulike skalaer brukes mellom bildene av fett (5 mm) og arterier (1 mm). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Identifisering av endotelceller etter arteriell vevsfordøyelse via flowcytometri. Representative plott som viser celler frigjort fra isolerte (A) subkutane eller (B) mesenteriske fettarterier. Celler ble eksponert for konjugerte antistoffer som rettet seg mot ekstracellulære epitoper av CD31 (PE) og CD45 (FITC) før fiksering. Flowcytometri ble brukt til å identifisere CD31+CD45− endotelcellepopulasjonen. En celle levedyktighetsflekk ble brukt til å velge bare cellene som overlevde isolasjons- og fordøyelsesprotokollene for påfølgende analyser. I tillegg vil passende gating på dette stadiet ytterligere skille en tiltenkt cellepopulasjon fra forurensende celler dersom størrelsen på celletypen av interesse er kjent. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Analyse av CD36 membranuttrykk i subkutane vs. mesenteriske fettarterie endotelceller via flowcytometri. Representative populasjonsplott og histogrammer som viser endotelial CD36 (APC) membranuttrykk i (A) subkutane eller (B) mesenteriske fettarterier. (C) Prosentandel av endotelceller (ECs) som uttrykker CD36 i subkutane vs. mesenteriske ECs (n = 5, 3 menn, 2 kvinner; * p < 0,05 etter Student t-test). (D) Normalisert EC-membran CD36-uttrykk i subkutane vs. mesenteriske fettarterier (n = 5, 3 menn, 2 kvinner; * p < 0,05 etter Student t-test). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Endoteldysfunksjon er en forløper for alvorlige sykdomstilstander, som sannsynligvis driver utviklingen av aterosklerose, hypertensjon og hjerneslag 3,23. Mens de identifiserte mekanismene som ligger til grunn for endoteldysfunksjon i en gitt patologisk tilstand er mange, vil distinkte vaskulære senger sannsynligvis bli differensielt påvirket av patologiske forhold 4,24. Videre induserer forskjellige kardiovaskulære risikofaktorer (f.eks. fedme, hypertensjon, dyslipidemi, røyking, diabetes) dysfunksjon gjennom en rekke forskjellige mekanismer23,25. Derfor er det avgjørende å isolere endotelcellepopulasjoner fra etablerte dyremodeller av sykdom eller tilgjengelig menneskelig vev og utføre analyser på celler som umiddelbart fjernes fra in vivo-miljøet. Å isolere celler på denne måten har en unik fordel i forhold til å studere celler i kultur ved at de er blottet for kulturinduserte fenotypiske endringer 5,6. Videre, inkludert en heterogen endotelcellepopulasjon, som observert in vivo26,27 (og som kan separeres ytterligere ved hjelp av flytassistert cellesortering), informerer en levende organisme bedre in vivo-miljøet. Endelig er denne metoden anvendelig for undersøkelse av mange dyremodeller og potensielt menneskelig vev og kan brukes til å generere primære cellekulturlinjer, dersom et slikt behov er berettiget.
Det kritiske trinnet i denne protokollen, og det trinnet som vil trenge mest justering for forskjellige vaskulære senger eller celletyper som ikke presenteres her, er fordøyelsen av vaskulært vev. Dette trinnet må optimaliseres for cellehelse uten å redusere celleutbyttet. De spesifikke enzymene som brukes og varigheten for fordøyelsen er avgjørende for å optimalisere cellehelsen og utbyttet for å kunne utføre nedstrøms analyser tilstrekkelig. For identifisering av membranuttrykk av CD36, som påvist ved flowcytometri i subkutane og mesenteriske endotelceller (figur 4), ble det utviklet en modifisert versjon av fordøyelsesprotokollen opprinnelig designet for patch-clamp elektrofysiologi28 . Dette inkluderte en utvidelse av kollagenase I fordøyelsestiden til 30 minutter for å øke celleutbyttet for bedre å møte kravene til flowcytometri vs. det som kreves for patch-clamp studier. Siden denne modifikasjonen til en viss grad kan påvirke cellehelsen, ble det brukt en celle levedyktighetsflekk i flowcytometrianalysene for å sikre at kun levedyktige endotelceller ble vurdert etter denne protokollen (figur 3). Det anbefales at studier som tar sikte på å isolere celler fra vaskulært vev, bør inkludere en markør for cellens levedyktighet før man vurderer ønsket tilnærming.
Den beskrevne protokollen er tilstrekkelig til å frigjøre levedyktige endotelceller for analyse og nedstrøms applikasjoner fra ≤1 mg arterielle prøver avledet fra mus; Men hvis arteriene av interesse skulle isoleres fra forskjellige vev eller organismer (f.eks. Mennesker) som ville resultere i betydelig forskjellige arterielle masser, måtte man optimalisere fordøyelsesenzyminnholdet og varigheten av inkubasjon for effektivt å isolere cellepopulasjonen av interesse. For noen vaskulære senger som begynner med enda mindre mengder startvev enn de subkutane og mesenteriske sengene som presenteres her (f.eks. Koronararteriene), kan det være nødvendig å samle arterier fra flere mus per prøve. Faktisk kan dette være et nødvendig skritt for en gitt vaskulær seng gitt at utfallsmetoden krever et relativt høyt celleutbytte. En stor begrensning er at på grunn av arten av variasjoner per prøvefordøyelse, kan celleutbyttet noen ganger være betydelig forskjellig på tvers av batcher, selv når de er fra samme vaskulære seng. Dette kan forårsake problemer ved analyse av data og bør redegjøres for via normalisering når det er hensiktsmessig. For eksempel var CD36-ekspresjon ekstremt variabelt i rådataene på grunn av endringer i celleutbyttet på tvers av individuelle prøver av subkutane og mesenteriske fettarterier. Rådata ble derfor normalisert til CD31+CD45− gjennomsnittlig fluorescensintensitet med antagelsen om at denne metoden ville korrigere for partiforskjeller (figur 4). Selvfølgelig, avhengig av tilnærmingen, kan det være nødvendig med mer sofistikerte statistiske analyser og normaliseringsmetoder.
Oppsummert presenterer dette papiret en metode for å dissekere, isolere og fordøye subkutane og mesenteriske arterier fra mus for å undersøke uttrykk og / eller funksjon av endotelmål av interesse. Med endringer i den presenterte protokollen kan forskjellige vaskulære senger og celletyper (f.eks. Glatte muskelceller) undersøkes. Denne protokollen, som grunnlag for en mengde tilgjengelige eksperimentelle tilnærminger, har potensial til å fremme forståelsen av vaskulær cellebiologi og mekanismer for vaskulær dysfunksjon.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Til kjærlig minne om Rich West, en strålende forsker, kollega og kjær venn. Vi vil gjerne takke University of Delaware Flow Cytometry og BioImaging Core som en del av Delaware Biotechnology Institute for deres pågående bidrag til våre studier. Vi vil også takke Emma Hudgins for nøye gjennomgang og redigering av manuskriptet. Vårt arbeid støttes av National Institute of General Medical Sciences P20GM113125-6564 (I.S. Fancher). Dette prosjektet ble også støttet av Delaware INBRE-programmet, med tilskudd fra NIGMS (P20GM103446) fra National Institutes of Health og State of Delaware (I.S. Fancher), og et University of Delaware General University Research-stipend (I.S. Fancher). Dette innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis NIHs offisielle synspunkter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue dissection tools | |||
| 5 forceps (2) | Fine Science Tools | 11252-00 | For isolation of mesenteric adipose depot and arteries transfer |
| 55 forceps (2) | Fine Science Tools | 11295-51 | For parenchymal adipose removal |
| Curved Bonn scissors | Fine Science Tools | 14061-10 | For isolation of mesenteric adipose depot |
| Graefe forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | For general dissection steps and isolation of subcutaneous adipose depot |
| Straight Bonn scissor | Fine Science Tools | 14060-09 | For general dissection steps and isolation of subcutaneous adipose depot |
| Stereoscope with light source | Laxco | Z230PT40 | For parenchymal adipose removal and artery isolation |
| Digestive enzymes for Artery Digestion | |||
| Collagenase Type I | Wothington-BioChem | LS004194 | |
| Dispase (Neutral Protease) | Wothington-BioChem | LS02110 | |
| Elastase | Wothington-BioChem | LS002292 | |
| Solutions Recipes | |||
| HEPES Buffer, pH 7.4 | Final concentration | ||
| Calcium chloride dihydrate | J.T.Baker | 1332-1 | 2 mM |
| Dextrose (D-glucose) anhydrous | Fisher | D16-500 | 10 mM |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | 10 mM |
| Magnesium Chloride | Fisher | M33-500 | 1 mM |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | 5 mM |
| Sodium chloride | Oxoid | LP0005 | 145 mM |
| Dissociation Solution, pH 7.30-7.40 | |||
| Dextrose (D-glucose) anhydrous | Fisher | D16-500 | 10 mM |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | 10 mM |
| Magnesium Chloride | Fisher | M33-500 | 2 mM |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | 56 mM |
| Sodium chloride | Oxoid | LP0005 | 55 mM |
| Sodium L-Glutamate monohydrate | TCI | G0188 | 80 mM |
| Flow Cytometry Analyses | |||
| 5 mL Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Falcon | 352235 | |
| CD31-PE | Miltenyi Biotec | 130-119-653 | 0.75µg/sample |
| CD36-APC | R&D Systems | AF2519 | 2.5µg/ sample |
| CD45-FITC | BioLegend | 103108 | 2.5µg/ sample |
| Live/Dead Fixable Violet Dead Cell Staining kit (cell viability stain) | Invitrogen | L34955 | 1µL/sample |
References
- Krüger-Genge, A., Blocki, A., Franke, R. P., Jung, F. Vascular endothelial cell biology: An update. International Journal of Molecular Sciences. 20 (18), 4411 (2019).
- Choi, S., Kim, J. A., Kim, K. C., Suh, S. H. Isolation and in vitro culture of vascular endothelial cells from mice. The Korean Journal of Physiology & Pharmacology. 19 (1), 35-42 (2015).
- Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: Testing and clinical relevance. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
- Nunan, E., et al. Obesity as a premature aging phenotype - Implications for sarcopenic obesity. Geroscience. , (2022).
- van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nature Protocols. 3 (6), 1085-1091 (2008).
- Dong, Q. G., et al. A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17 (8), 1599-1604 (1997).
- Amici, S. A., Dong, J., Guerau-de-Arellano, M. Molecular mechanisms modulating the phenotype of macrophages and microglia. Frontiers in Immunology. 8, 1520 (2017).
- Patel, J., et al. Functional definition of progenitors versus mature endothelial cells reveals key SoxF-dependent differentiation process. Circulation. 135 (8), 786-805 (2017).
- Ahn, S. J., et al. Inwardly rectifying K+ channels are major contributors to flow-induced vasodilatation in resistance arteries. The Journal of Physiology. 595 (7), 2339-2364 (2017).
- Bagchi, D. P., MacDougald, O. A. Identification and dissection of diverse mouse adipose depots. Journal of Visualized Experiments. (149), e59499 (2019).
- Ahn, S. J., et al. Cholesterol-induced suppression of endothelial Kir channels is a driver of impairment of arteriolar flow-induced vasodilation in humans. Hypertension. 79 (1), 126-138 (2022).
- Ahn, S. J., et al. Differential effects of obesity on visceral versus subcutaneous adipose arteries: Role of shear-activated Kir2.1 and alterations to the glycocalyx. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 322 (2), 156-166 (2022).
- Fancher, I. S., et al. Impairment of flow-sensitive inwardly rectifying K(+) channels via disruption of glycocalyx mediates obesity-induced endothelial dysfunction. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40 (9), 240-255 (2020).
- van Beijnum, J. R., et al. Gene expression of tumor angiogenesis dissected: Specific targeting of colon cancer angiogenic vasculature. Blood. 108 (7), 2339-2348 (2006).
- Hida, K., et al. Tumor-associated endothelial cells with cytogenetic abnormalities. Cancer Research. 64 (22), 8249-8255 (2004).
- Ades, E. W., et al. HMEC-1: Establishment of an immortalized human microvascular endothelial cell line. Journal of Investigative Dermatology. 99 (6), 683-690 (1992).
- Grange, C., et al. Isolation and characterization of human breast tumor-derived endothelial cells. Oncology Reports. 15 (2), 381-386 (2006).
- Liao, X., Makris, M., Luo, X. M. Fluorescence-activated cell sorting for purification of plasmacytoid dendritic cells from the mouse bone marrow. Journal of Visualized Experiments. (117), e54641 (2016).
- De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis, N. J. Isolating and immunostaining lymphocytes and dendritic cells from murine Peyer's patches. Journal of Visualized Experiments. (73), e50167 (2013).
- Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. Analysis of cell suspensions isolated from solid tissues by spectral flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (123), e55578 (2017).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. (41), e1546 (2010).
- Son, N. -H., et al. Endothelial cell CD36 optimizes tissue fatty acid uptake. The Journal of Clinical Investigation. 128 (10), 4329-4342 (2018).
- Bakker, W., Eringa, E. C., Sipkema, P., van Hinsbergh, V. W. M. Endothelial dysfunction and diabetes: roles of hyperglycemia, impaired insulin signaling and obesity. Cell and Tissue Research. 335 (1), 165-189 (2008).
- Farb, M. G., Gokce, N. Visceral adiposopathy: A vascular perspective. Hormone Molecular Biology and Clinical Investigation. 21 (2), 125-136 (2015).
- Williams, I. L., Wheatcroft, S. B., Shah, A. M., Kearney, M. T. Obesity, atherosclerosis and the vascular endothelium: mechanisms of reduced nitric oxide bioavailability in obese humans. International Journal of Obesity. 26 (6), 754-764 (2002).
- Cleuren, A. C. A., et al. The in vivo endothelial cell translatome is highly heterogeneous across vascular beds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (47), 23618-23624 (2019).
- Aird, W. C.
- Sonkusare, S. K., Dalsgaard, T., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Inward rectifier potassium (Kir2.1) channels as end-stage boosters of endothelium-dependent vasodilators. The Journal of Physiology. 594 (12), 3271-3285 (2016).
