Summary
Denne protokol beskriver en metode til dissektion af musefedtdepoter og isolering og fordøjelse af respektive arterier for at frigøre og derefter identificere endotelcellepopulationen. Frisk isolerede celler, der anvendes i downstream-applikationer, vil fremme forståelsen af vaskulær cellebiologi og mekanismerne for vaskulær dysfunktion.
Abstract
Vaskulære endotelceller, der forer væggen i det vaskulære system, spiller vigtige roller i en række fysiologiske processer, herunder vaskulær toneregulering, barrierefunktioner og angiogenese. Endotelcelledysfunktion er en kendetegnende forudsigelse og vigtig drivkraft for progression af alvorlige hjerte-kar-sygdomme, men de underliggende mekanismer forbliver dårligt forstået. Evnen til at isolere og udføre analyser på endotelceller fra forskellige vaskulære senge i deres oprindelige form vil give indsigt i processerne for hjerte-kar-sygdomme. Denne protokol præsenterer proceduren for dissektion af mus subkutane og mesenteriske fedtvæv efterfulgt af isolering af deres respektive arterielle vaskulatur. De isolerede arterier fordøjes derefter ved hjælp af en specifik cocktail af fordøjelsesenzymer med fokus på at frigøre funktionelt levedygtige endotelceller. Det fordøjede væv vurderes ved flowcytometrianalyse ved hjælp af CD31+/CD45− celler som markører for positiv endotelcelleidentifikation. Celler kan sorteres til øjeblikkelige nedstrøms funktionelle assays eller bruges til at generere primære cellelinjer. Teknikken til at isolere og fordøje arterier fra forskellige vaskulære senge vil give forskere mulighed for at evaluere frisk isolerede vaskulære celler fra arterier af interesse og give dem mulighed for at udføre en bred vifte af funktionelle tests på specifikke celletyper.
Introduction
Endotelceller er velkendte for deres vigtige roller i en række fysiologiske processer, herunder barrierefunktioner, angiogenese og vaskulær toneregulering 1,2. Selvom endotelcelledysfunktion er veldokumenteret til fremme af aterosklerose, hypertension, diabetes osv., Forbliver de underliggende mekanismer, der driver endoteldysfunktion, dårligt forstået og sandsynligvis adskiller sig mellem forskellige vaskulære senge 2,3,4. Bestræbelserne på at optrævle disse patologiske mekanismer for endotelcelledysfunktion udfordres af den begrænsede adgang til en ren population af endotelceller fra væv og/eller de fænotypiske ændringer af endotelceller i kultur 5,6. Derfor vil det at kunne isolere og udføre analyser på endotelceller fra forskellige karbede i deres oprindelige form give indsigt i processerne for hjerte-kar-sygdomme.
Denne protokol præsenterer proceduren for dissekering af subkutant og mesenterisk fedtvæv fra mus efterfulgt af isolering af deres respektive arterielle vaskulatur. Funktionelt levedygtige endotelceller, der forer arterievæggene, frigøres ved hjælp af en bestemt cocktail af enzymer. Der blev lagt særlig vægt på at optimere betingelserne i fordøjelsesprotokollen for at opnå et tilstrækkeligt udbytte af endotelceller fra <1 mg startvæv, samtidig med at biomolekylære markører blev holdt intakte til analyse. Isolerede endotelceller identificeres derefter ved hjælp af flowcytometri. Tilstedeværelsen af CD31 (PECAM) bruges til primært at identificere endotelceller. På grund af ekspressionen af CD31 i andre celletyper, herunder flere af hæmatopoietisk oprindelse, der også udtrykker CD45, blev renheden af de isolerede endotelceller yderligere forbedret ved udelukkelse af celler, der udtrykker både CD31 og CD45 5,6,7,8. Afhængigt af forskningsspørgsmålet og de downstream-applikationer, der skal anvendes, bør forskere desuden overveje at vælge et omfattende panel af positive og negative selektionsmarkører for at optimere renheden af cellepopulationen af interesse.
Selvom teknikken til dissekering og isolering af fedtdepotarterier er blevet brugt i de tidligere publikationer 9,10,11,12,13, er en detaljeret protokol, der beskriver isoleringen af indlejrede arterier, endnu ikke præsenteret. Demonstration af teknikken til isolering og fordøjelse af arterier fra forskellige vaskulære senge fra en given art af interesse vil give forskere mulighed for at evaluere friskisolerede vaskulære celler fra arterier af interesse og give dem mulighed for at udføre en bred vifte af funktionelle tests på specifikke celletyper. Test kan omfatte, men er ikke begrænset til, flowcytometri til cellesortering og membranproteinekspression5,8, elektrofysiologi for ionkanalaktivitet9, molekylær profilering (proteomics/genomiske analyser osv.) 14,15 og generering af primære cellelinjer til lægemiddelscreening in vitro16,17.
Protocol
Brugen af dyr i disse undersøgelser blev godkendt af University of Delaware, Institutional Animal Care and Use Committee (#1372).
1. Vævsdissektion og rengøring
BEMÆRK: 10- til 12 uger gamle C57BL/6J-mus bruges i videoprotokollen. Der henvises til figur 1 for det skematiske og det ønskede resultat af vævsdissektion og rengøringsarterier og henvises til materialetabellen for listen over forsyninger og producentoplysninger.
- Afliv musen ved CO2 -kvælning efterfulgt af cervikal dislokation.
- Fastgør musen ved hjælp af dissektionsstifter, og sprøjt den ventrale overflade med 70% ethanol.
- Isolering af subkutant fedtvæv placeret ved hver bagben
BEMÆRK: Dissekering af værktøjer er nødvendig: lige Bonn saks (9 cm) og stump, buede Graefe tang.- Brug tang til at løfte huden lige over kønsorganerne og lave et lille (2 mm) snit i huden.
- Indsæt spidsen af saksen i snitstedet og lav et 4-5 cm midterlinjesnit, der begynder ved det første snit og dissekerer kranielt til brystbenets bund. Vær forsigtig med ikke at trænge ind i bukhulen.
- Lav et 1 cm lateralt snit, der strækker sig sideværts fra midterlinjen umiddelbart under forbenet.
- Lav et diagonalt 1 cm snit mellem bagbenet og kønsorganerne.
- Lav små snit langs midterlinjens hudindsnit for at skrælle det tilhørende bindevæv væk og udsætte det subkutane fedtdepot. Fastgør huden ned.
- Identificer det "C-formede" subkutane fedtvæv og arterie / vene, der løber vinkelret på bukhulen.
- Start fra bunden af C-formen nær kønsorganerne og tag forsigtigt fat i fedtvævet for at udsætte bindevævet. Lav små snit i bindevævet for at adskille fedtet fra huden. Undgå at forstyrre den udsatte vaskulatur.
- Fortsæt med at dissekere bindevævet væk, indtil det subkutane fedtvæv kan fjernes intakt. Adskil forsigtigt den udsatte arterie fra det omgivende bindevæv.
- Opbevar det isolerede subkutane fedt i HEPES-bufferen på is, indtil det er klar til at isolere den vaskulære seng af interesse.
- Gentag trin 1.3.3.-1.3.5. for det resterende bageste subkutane fedtdepot.
- Isolering af depotet for mesenterisk fedt
BEMÆRK: Dissekering af værktøjer er nødvendig: lige Bonn saks (9 cm), Graefe tang, et par # 5 tang, lige iris saks og buet Bonn saks (9 cm).- Brug Graefe-tangen til at løfte den tynde bughulevæg over urinblæren og lav et lille snit ved hjælp af lige saks.
- Løft langsomt den penetrerede peritoneale hulrumsvæg, indsæt forsigtigt den lige irissaks i snitstedet, og lav et 4-5 cm snit fra urinblæren til brystbenet.
- Lav to 1 cm lange vandrette snit med den lige irissaks, der strækker sig sideværts fra midterlinjen til umiddelbart over bagbenet og under forbenet. Brug Graefe tang til at skrælle abdominal muskulaturen tilbage og udsætte peritoneal indvolde.
- Gentag trin 1.4.3. på den modsatte side.
- Brug parret #5 tang til at løfte tarmene ud af det viscerale hulrum for at afsløre det mesenteriske fedt.
- Brug den buede saks og # 5 tang til at adskille fedtet langs tyktarmen, startende fra caecum til hvor tyktarmen falder ned fra visningen.
- Vend tilbage til caecum og brug den buede saks og # 5 tang til at adskille fedtet langs tyndtarmen til bugspytkirtlen. Fjern en lille del af bugspytkirtlen for fuldstændigt at isolere det mesenteriske fedt.
BEMÆRK: Fjernelse af en lille del af bugspytkirtlen sammen med mesenterisk fedt kan hjælpe med at rense arterierne, da det giver stabilitet under rengøring. - Opbevar det isolerede mesenteriske fedt i HEPES-buffer på is, indtil det er klar til at isolere de mesenteriske arterier.
- Isolering af de respektive arterier fra subkutant og mesenterisk fedtvæv
BEMÆRK: Dissekering af værktøjer er nødvendige: en dissekeringsskål og stereoskop med en lyskilde, et par # 55 tang og et par # 5 tang.- Placer ~ 10 ml kold HEPES-buffer i dissekeringsskålen og overfør fedtvævet til skålen ved hjælp af # 5 tang.
- Brug stereoskopet ved 1x forstørrelse til at se og placere fedtvævet for at afsløre arterie/veneparret (-parrene) (figur 2).
- Brug #55 tang til forsigtigt at fjerne parenkymalt fedt fra arterien. Fjern små stykker fedt ad gangen, og observer omhyggeligt arterie / venepar under stereoskopet for at identificere og undgå at beskadige vaskulaturen af interesse.
SEDDEL: Juster forstørrelsen og lyskilden i overensstemmelse hermed for at rense arterierne. Forøg forstørrelsen og lysintensiteten for bedre at se arterierne, når fedt fjernes. Fin rengøring af arterierne skal ske under 4x-5x forstørrelse. Det er vigtigt at skelne mellem bindevæv (kollagener), vener og arterier. Bindevæv og kollagenfibre har et strenglignende udseende uden grene, er stribet og har en hvidlig farve. I modsætning til kollagenfibre og bindevæv er arterier og vener gennemsigtige og har flere grene med et defineret lumen. Små arterier og vener kan forekomme ens i udseende, når de er fri for parenkymalt væv. Tilstedeværelsen af blod i lumen kan yderligere hjælpe en med at identificere arterierne fra vener. Vener har tyndere blodkarvægge og et større lumen og indeholder mere blod sammenlignet med arterier af sammenlignelig størrelse. - Gentag trin 1.5.3. indtil arterierne er helt uden parenkymalt fedtvæv.
- Brug #5 tang til at overføre de rensede arterier til et nyt rør med frisk HEPES-buffer og hold på is, indtil de er klar til fordøjelsen.
2. Fordøjelse af isolerede arterier til isolering af endotelceller
BEMÆRK: Se figur 2 for skematisk behandling af vævsfordøjelse og isolering af endotelceller og materialetabellen for en komplet liste over forsyninger, der er nødvendige for protokollen.
- Der tilsættes 1 mg hver dispase og elastase til hvert 2 ml mikrocentrifugerør. Tilsæt 2 ml dissociationsopløsning til hvert rør. Hvirvel og inkuberes ved 37 °C, indtil den er helt opløst. Brug #5 tang til at overføre de rensede arterier (trin 1.5.5.) til de respektive prøverør. Den endelige koncentration af hvert enzym er 0,5 mg / ml.
- Inkuberes ved 37 °C i 1 time med blid omrøring ved inversion hvert 10.-15. minut, således at arterierne suspenderes i opløsning for at opretholde ensartet og ensartet kontakt mellem enzymerne og arterierne.
- Der vejes 1 mg collagenase type I pr. prøve, og der tilsættes nye rør.
- Lad arterierne sætte sig i bunden af røret. Fjern 500 μL af bufferen fra toppen uden at forstyrre arterierne og overfør den til udpegede rør indeholdende collagenase. Hvirvel og returner opløsningen til de respektive prøver i de originale prøverør. Den endelige koncentration af collagenase type I er 0,5 mg/ml.
- Inkuberes ved 37 °C i 15 min. Sørg for, at arterierne adskilles i stykker efter kort omrystning af prøverøret. Hvis arterierne ikke adskilles i stykker efter forstyrrelse, inkuberes i trin på 5 minutter, indtil arteriel nedbrydning er synlig.
- Brug en glaspipette til kraftigt at triturere det fordøjede væv 10x-15x for mekanisk at adskille cellerne.
- Opløsningen og det fordøjede væv ledes gennem en 70 μm cellesi eller en flowcytometrirørssi for at opnå encellesuspensioner.
3. Farvning af endotelceller inden flowcytometri
BEMÆRK: Farvning og behandling af endotelceller udføres på is for at forbedre cellens levedygtighed, medmindre det instrueres. 5 ml rundbundsrør af polystyren centrifugeres ved 1.163 x g i 3 minutter ved stuetemperatur (RT).
- Centrifuge enkeltcellesuspensionerne ved 1.163 x g i 3 minutter ved RT.
- Supernatanten fjernes, og cellepelleten gensuspenderes i 1 ml PBS + 5% BSA i 30 minutter ved RT.
BEMÆRK: Forskere bør overveje at blokere FC-receptorer afhængigt af celletype, mål af interesse og antistof, der anvendes18,19. - Tilsæt 1 μL cellelevedygtighedsplet (405 nm excitation) (materialetabel) og inkuber i mørke i 30 minutter ved RT.
- Centrifugering af cellesuspensionen ved 1.163 x g i 3 minutter ved RT. Resuspender cellepelleten i 200 μL PBS + 1% BSA.
- Til prøverne tilsættes primære antistoffer konjugeret til CD31 (CD31-PE, 0,75 μg / prøve) og CD45 (CD45-FITC, 2,5 μg / prøve) og inkuberes på en vippe i køleskabet i 15 minutter efter at have dækket prøverne med aluminiumsfolie.
BEMÆRK: For at identificere og / eller opnå en ren population af endotelceller, sonde for både CD31 og CD45 ved hjælp af CD31- og CD45-konjugerede primære antistoffer med tydelig excitation / emissionsfluorescens og gate / sorteringsceller med en CD31 + CD45-ekspressionsprofil. Kompensation kan være påkrævet afhængigt af de anvendte fluorophorer 18,20,21. - Cellerne vaskes ved at tilsætte 1 ml PBS + 1% BSA direkte til cellesuspensionen.
- Cellesuspensionen centrifugeres ved 1.163 x g i 3 minutter ved RT. Supernatanten fjernes og resuspenderes i 200 μL 1% formaldehyd med 0,1% BSA. Opbevares i køleskabet dækket med aluminiumsfolie, indtil det er klar til flowcytometri.
BEMÆRK: Celleudbyttet forbedres ved at reducere vaske- og centrifugeringstrinnene. Disse skal muligvis ændres afhængigt af resultattilgangen. Prøven i fikseringsmiddel skal analyseres inden for 24 timer.
Representative Results
En skematisk oversigt over arbejdsgangen er vist i figur 1. Skemaet fremhæver de protokoltrin, der er beskrevet mere detaljeret i protokolteksten. Figur 2 viser billeder af subkutant fedt (figur 2A, venstre) efter dissektion og en subkutan arteriearkade (figur 2A, højre) efter rengøring af parenkymalt væv. Figur 2 viser også det mesenteriske fedt (figur 2B, til venstre) efter dissektion og den mesenteriske arteriearkade (figur 2B, til højre) efter rensning af parenkymalt væv.
Protokollen, der præsenteres her, er designet til at hjælpe forskere, der potentielt er interesserede i a) sammenligning af forskellige fedtdepotvaskulatursenge i grundlæggende videnskabelige tilgange og / eller sygdomsmodeller, b) fordøjelsen af vaskulære senge inden isolering af vaskulære celler af interesse for downstream-anvendelse og c) brugen af flowcytometri til at identificere vaskulære celler af interesse (figur 3 ) til en række forskellige anvendelser, herunder, men ikke begrænset til, proteinekspressionsanalyser som udført her (figur 4). Figur 3 beskriver et eksempel på vores tilgang til at identificere endotelceller fra fordøjede musearterier ved hjælp af flowcytometri. Cellepræparater opnået fra fordøjede subkutane (figur 3A) eller mesenteriske (figur 3B) fedtarterier blev farvet med CD31-PE, CD45-FITC og et cellelevedygtighedsfarvestof inden fiksering og identifikation af levedygtige CD31 + CD45-endotelceller ved hjælp af flowcytometri, som tilsvarende udført andetsteds8. Cellelevedygtighedspletten tillod kun identifikation af de levedygtige celler, der overlevede isolations- og fordøjelsesprotokollen før fiksering. Anvendelsen af denne metode vil gøre det muligt for forskere at vurdere ekspressionen eller funktionen af levedygtige vaskulære celler af interesse.
For at afgøre, om endotelceller isoleret fra forskellige fedtdepotvaskulatur udviste forskelle i membranproteinekspression, blev isolerede celler undersøgt for fedtsyretranslocasen, CD36 (figur 4), da dette membranprotein for nylig viste sig at være essentielt i den endotelmedierede fordeling af fedtsyrer til væv22 . Derfor kan bestemmelse af de relative ekspressionsforskelle mellem membran CD36, for eksempel i forskellige vaskulære senge, a) understøtte eksisterende data vedrørende differentiel præference for fedtsyreudnyttelse blandt forskellige væv og / eller b) afsløre potentielle nye forskelle i vævsfordeling af fedtsyrer i sundhed og sygdom. Fra de samme præparater af fordøjede vaskulære celler eksemplificeret i figur 3 blev CD31 + CD45-CD36+ endotelceller identificeret i subkutan (figur 4A) og mesenterisk (figur 4B) fedt, og CD36-ekspression blev kvantificeret i denne population i hver vaskulær seng. Figur 4C og figur 4D afslører, at både procentdelen af endotelceller, der udtrykker CD36, og intensiteten af CD36-ekspression var større i subkutane endotelceller sammenlignet med den, der blev observeret i mesenteriske endotelceller. Disse foreløbige resultater understøtter brugen af vores metode til at identificere forskellige forskelle mellem vaskulære senge.
Figur 1: Arbejdsplan for isolering af endotelceller fra subkutant og visceralt fedtvæv til downstream-applikationer . (A) 10-12 uger gamle C57BL/6J-mus blev aflivet og brugt til at demonstrere denne procedure. (Bi) Først fjernes det subkutane fedt. (Bii) Derefter fjernes det mesenteriske (viscerale) fedtvæv efterfølgende. De hvide stiplede linjer angiver placeringen af de subkutane (venstre) og mesenteriske (højre) fedtdepoter efter dissektion og fjernelse. De respektive arterier er isoleret til downstream-applikationer. (C) I denne protokol fordøjes isolerede arterier derefter ved hjælp af en specifik enzymcocktail som et første skridt i frigørelsen af funktionelt levedygtige endotelceller. (D) Isolerede endotelceller identificeres ved sondering for CD31+ og CD45− celler ved anvendelse af konjugerede antistoffer inden flowcytometrianalyse. Celler med en ekspressionsprofil på CD31+/CD45− er endotelcellerne af interesse for yderligere analyser. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Isoleret subkutant og visceralt fedtvæv og respektive arterier. (A) Til venstre: Isoleret "C-formet" subkutant fedtvæv fra bagben. En større gren af den subkutane fedtarterie, betegnet med pil (1), afsløres, når parenkymal fedt fjernes. Til højre: Isolerede subkutane fedtarterier. (B) Til venstre: Det mesenteriske (viscerale) fedtvæv er isoleret fra tarmen. Til højre: Den respektive arterielle arkade isoleres ved at fjerne parenkymaltvævet. Forskellige skalaer bruges mellem billederne af fedt (5 mm) og arterier (1 mm). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Identifikation af endotelceller efter arteriel vævsfordøjelse via flowcytometri. Repræsentative plots, der viser celler befriet fra isolerede (A) subkutane eller (B) mesenteriske fedtarterier. Celler blev udsat for konjugerede antistoffer, der målrettede ekstracellulære epitoper af CD31 (PE) og CD45 (FITC) før fiksering. Flowcytometri blev brugt til at identificere CD31 + CD45- endotelcellepopulationen. En cellelevedygtighedsplet blev kun brugt til at udvælge de celler, der overlevede isolations- og fordøjelsesprotokollerne til efterfølgende analyser. Desuden vil passende gating på dette stadium yderligere adskille en tilsigtet cellepopulation fra forurenende celler, hvis størrelsen af celletypen af interesse er kendt. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Analyse af CD36-membranekspression i subkutane vs. mesenteriske fedtarterieendotelceller via flowcytometri. Repræsentative populationsplots og histogrammer, der viser endotel CD36 (APC) membranekspression i (A) subkutane eller (B) mesenteriske fedtarterier. (C) Procentdel af endotelceller (EC'er), der udtrykker CD36 i subkutane vs. mesenteriske EC'er (n = 5, 3 mænd, 2 kvinder; *p < 0,05 efter Student's t-test). (D) Normaliseret EC-membran CD36-ekspression i subkutane vs. mesenteriske fedtarterier (n = 5, 3 mænd, 2 kvinder; *p < 0,05 efter Student's t-test). Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Endotel dysfunktion er en forløber for alvorlige sygdomstilstande, der sandsynligvis driver udviklingen af aterosklerose, hypertension og slagtilfælde 3,23. Mens de identificerede mekanismer, der ligger til grund for endoteldysfunktion i en given patologisk tilstand, er mange, vil forskellige vaskulære senge sandsynligvis blive forskelligt påvirket af patologiske tilstande 4,24. Desuden inducerer forskellige kardiovaskulære risikofaktorer (f.eks. Fedme, hypertension, dyslipidæmi, rygning, diabetes) dysfunktion gennem en række forskellige mekanismer23,25. Derfor er det afgørende at isolere endotelcellepopulationer fra etablerede dyremodeller af sygdom eller tilgængeligt humant væv og udføre assays på celler, der straks fjernes fra in vivo-miljøet. Isolering af celler på denne måde har en unik fordel i forhold til at studere celler i kultur, idet de er uden kulturinducerede fænotypiske ændringer 5,6. Desuden informerer inkludering af en heterogen endotelcellepopulation, som observeret i vivo26,27 (og som kan adskilles yderligere ved hjælp af flowassisteret cellesortering), fra en levende organisme bedre in vivo-miljøet. Endelig kan denne metode anvendes til undersøgelse af adskillige dyremodeller og potentielt humant væv og kan bruges til at generere primære cellekulturlinjer, hvis et sådant behov er berettiget.
Det kritiske trin i denne protokol og det trin, der har mest brug for justering for forskellige vaskulære senge eller celletyper, der ikke præsenteres her, er fordøjelsen af vaskulært væv. Dette trin skal optimeres til cellesundhed uden at mindske celleudbyttet. De specifikke enzymer, der anvendes, og varigheden for fordøjelsen er afgørende for at optimere cellesundhed og udbytte for at kunne udføre nedstrøms assays tilstrækkeligt. Til identifikation af membranekspression af CD36, som detekteret ved flowcytometri i subkutane og mesenteriske endotelceller (figur 4), blev der udviklet en modificeret version af fordøjelsesprotokollen, der oprindeligt var designet til patch-clamp elektrofysiologi28 . Dette omfattede en forlængelse af kollagenasen I fordøjelsestid til 30 minutter for at øge celleudbyttet for bedre at imødekomme kravene til flowcytometri vs. hvad der kræves til patch-clamp-undersøgelser. Da denne ændring til en vis grad kan påvirke cellesundheden, blev der anvendt en cellelevedygtighedsplet i flowcytometrianalyserne for at sikre, at kun levedygtige endotelceller blev vurderet efter denne protokol (figur 3). Det anbefales, at undersøgelser, der har til formål at isolere celler fra vaskulært væv, bør omfatte en markør for cellernes levedygtighed, inden den ønskede fremgangsmåde vurderes.
Den beskrevne protokol er tilstrækkelig til at frigøre levedygtige endotelceller til analyse og downstream-applikationer fra ≤1 mg arterielle prøver afledt af mus; Men hvis arterierne af interesse skulle isoleres fra forskellige væv eller organismer (f.eks. Mennesker), der ville resultere i signifikant forskellige arterielle masser, ville man være nødt til at optimere fordøjelsesenzymindholdet og varigheden af inkubation for effektivt at isolere cellepopulationen af interesse. For nogle vaskulære senge, der begynder med endnu mindre mængder startvæv end de subkutane og mesenteriske senge, der præsenteres her (f.eks. Koronararterier), kan pooling af arterier fra flere mus være nødvendig pr. Prøve. Faktisk kan dette være et nødvendigt skridt for en given vaskulær seng, da resultattilgangen kræver et relativt højt celleudbytte. En væsentlig begrænsning er, at celleudbyttet på grund af arten af variationer pr. prøvefordøjelse undertiden kan være signifikant forskelligt på tværs af batcher, selv når de kommer fra den samme vaskulære seng. Dette kan forårsage problemer ved analyse af data og bør redegøres for via normalisering, når det er relevant. For eksempel var CD36-ekspression ekstremt variabel i rådata på grund af ændringer i celleudbytter på tværs af individuelle prøver af subkutane og mesenteriske fedtarterier. Derfor blev rådata normaliseret til CD31+CD45− gennemsnitlig fluorescensintensitet med den antagelse, at denne metode ville korrigere for batchforskelle (figur 4). Afhængigt af tilgangen kan der naturligvis være behov for mere sofistikerede statistiske analyser og normaliseringsmetoder.
Sammenfattende præsenterer dette papir en metode til at dissekere, isolere og fordøje subkutane og mesenteriske arterier fra mus for at undersøge ekspressionen og / eller funktionen af endotelmål af interesse. Med ændringer af den præsenterede protokol kan forskellige vaskulære senge og celletyper (f.eks. Glatte muskelceller) undersøges. Denne protokol, som et fundament for en overflod af tilgængelige eksperimentelle tilgange, har potentialet til at fremme forståelsen af vaskulær cellebiologi og mekanismer for vaskulær dysfunktion.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Til kærligt minde om Rich West, en strålende videnskabsmand, kollega og kære ven. Vi vil gerne takke University of Delaware Flow Cytometry og BioImaging Core som en del af Delaware Biotechnology Institute for deres løbende bidrag til vores undersøgelser. Vi vil også gerne takke Emma Hudgins for den omhyggelige gennemgang og redigering af manuskriptet. Vores arbejde støttes af National Institute of General Medical Sciences P20GM113125-6564 (I.S. Fancher). Dette projekt blev også støttet af Delaware INBRE-programmet med et tilskud fra NIGMS (P20GM103446) fra National Institutes of Health og staten Delaware (I.S. Fancher) og et University of Delaware General University Research-stipendium (I.S. Fancher). Dette indhold er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis NIH's officielle synspunkter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue dissection tools | |||
| 5 forceps (2) | Fine Science Tools | 11252-00 | For isolation of mesenteric adipose depot and arteries transfer |
| 55 forceps (2) | Fine Science Tools | 11295-51 | For parenchymal adipose removal |
| Curved Bonn scissors | Fine Science Tools | 14061-10 | For isolation of mesenteric adipose depot |
| Graefe forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | For general dissection steps and isolation of subcutaneous adipose depot |
| Straight Bonn scissor | Fine Science Tools | 14060-09 | For general dissection steps and isolation of subcutaneous adipose depot |
| Stereoscope with light source | Laxco | Z230PT40 | For parenchymal adipose removal and artery isolation |
| Digestive enzymes for Artery Digestion | |||
| Collagenase Type I | Wothington-BioChem | LS004194 | |
| Dispase (Neutral Protease) | Wothington-BioChem | LS02110 | |
| Elastase | Wothington-BioChem | LS002292 | |
| Solutions Recipes | |||
| HEPES Buffer, pH 7.4 | Final concentration | ||
| Calcium chloride dihydrate | J.T.Baker | 1332-1 | 2 mM |
| Dextrose (D-glucose) anhydrous | Fisher | D16-500 | 10 mM |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | 10 mM |
| Magnesium Chloride | Fisher | M33-500 | 1 mM |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | 5 mM |
| Sodium chloride | Oxoid | LP0005 | 145 mM |
| Dissociation Solution, pH 7.30-7.40 | |||
| Dextrose (D-glucose) anhydrous | Fisher | D16-500 | 10 mM |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | 10 mM |
| Magnesium Chloride | Fisher | M33-500 | 2 mM |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | 56 mM |
| Sodium chloride | Oxoid | LP0005 | 55 mM |
| Sodium L-Glutamate monohydrate | TCI | G0188 | 80 mM |
| Flow Cytometry Analyses | |||
| 5 mL Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Falcon | 352235 | |
| CD31-PE | Miltenyi Biotec | 130-119-653 | 0.75µg/sample |
| CD36-APC | R&D Systems | AF2519 | 2.5µg/ sample |
| CD45-FITC | BioLegend | 103108 | 2.5µg/ sample |
| Live/Dead Fixable Violet Dead Cell Staining kit (cell viability stain) | Invitrogen | L34955 | 1µL/sample |
References
- Krüger-Genge, A., Blocki, A., Franke, R. P., Jung, F. Vascular endothelial cell biology: An update. International Journal of Molecular Sciences. 20 (18), 4411 (2019).
- Choi, S., Kim, J. A., Kim, K. C., Suh, S. H. Isolation and in vitro culture of vascular endothelial cells from mice. The Korean Journal of Physiology & Pharmacology. 19 (1), 35-42 (2015).
- Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: Testing and clinical relevance. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
- Nunan, E., et al. Obesity as a premature aging phenotype - Implications for sarcopenic obesity. Geroscience. , (2022).
- van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nature Protocols. 3 (6), 1085-1091 (2008).
- Dong, Q. G., et al. A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17 (8), 1599-1604 (1997).
- Amici, S. A., Dong, J., Guerau-de-Arellano, M. Molecular mechanisms modulating the phenotype of macrophages and microglia. Frontiers in Immunology. 8, 1520 (2017).
- Patel, J., et al. Functional definition of progenitors versus mature endothelial cells reveals key SoxF-dependent differentiation process. Circulation. 135 (8), 786-805 (2017).
- Ahn, S. J., et al. Inwardly rectifying K+ channels are major contributors to flow-induced vasodilatation in resistance arteries. The Journal of Physiology. 595 (7), 2339-2364 (2017).
- Bagchi, D. P., MacDougald, O. A. Identification and dissection of diverse mouse adipose depots. Journal of Visualized Experiments. (149), e59499 (2019).
- Ahn, S. J., et al. Cholesterol-induced suppression of endothelial Kir channels is a driver of impairment of arteriolar flow-induced vasodilation in humans. Hypertension. 79 (1), 126-138 (2022).
- Ahn, S. J., et al. Differential effects of obesity on visceral versus subcutaneous adipose arteries: Role of shear-activated Kir2.1 and alterations to the glycocalyx. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 322 (2), 156-166 (2022).
- Fancher, I. S., et al. Impairment of flow-sensitive inwardly rectifying K(+) channels via disruption of glycocalyx mediates obesity-induced endothelial dysfunction. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40 (9), 240-255 (2020).
- van Beijnum, J. R., et al. Gene expression of tumor angiogenesis dissected: Specific targeting of colon cancer angiogenic vasculature. Blood. 108 (7), 2339-2348 (2006).
- Hida, K., et al. Tumor-associated endothelial cells with cytogenetic abnormalities. Cancer Research. 64 (22), 8249-8255 (2004).
- Ades, E. W., et al. HMEC-1: Establishment of an immortalized human microvascular endothelial cell line. Journal of Investigative Dermatology. 99 (6), 683-690 (1992).
- Grange, C., et al. Isolation and characterization of human breast tumor-derived endothelial cells. Oncology Reports. 15 (2), 381-386 (2006).
- Liao, X., Makris, M., Luo, X. M. Fluorescence-activated cell sorting for purification of plasmacytoid dendritic cells from the mouse bone marrow. Journal of Visualized Experiments. (117), e54641 (2016).
- De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis, N. J. Isolating and immunostaining lymphocytes and dendritic cells from murine Peyer's patches. Journal of Visualized Experiments. (73), e50167 (2013).
- Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. Analysis of cell suspensions isolated from solid tissues by spectral flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (123), e55578 (2017).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. (41), e1546 (2010).
- Son, N. -H., et al. Endothelial cell CD36 optimizes tissue fatty acid uptake. The Journal of Clinical Investigation. 128 (10), 4329-4342 (2018).
- Bakker, W., Eringa, E. C., Sipkema, P., van Hinsbergh, V. W. M. Endothelial dysfunction and diabetes: roles of hyperglycemia, impaired insulin signaling and obesity. Cell and Tissue Research. 335 (1), 165-189 (2008).
- Farb, M. G., Gokce, N. Visceral adiposopathy: A vascular perspective. Hormone Molecular Biology and Clinical Investigation. 21 (2), 125-136 (2015).
- Williams, I. L., Wheatcroft, S. B., Shah, A. M., Kearney, M. T. Obesity, atherosclerosis and the vascular endothelium: mechanisms of reduced nitric oxide bioavailability in obese humans. International Journal of Obesity. 26 (6), 754-764 (2002).
- Cleuren, A. C. A., et al. The in vivo endothelial cell translatome is highly heterogeneous across vascular beds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (47), 23618-23624 (2019).
- Aird, W. C.
- Sonkusare, S. K., Dalsgaard, T., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Inward rectifier potassium (Kir2.1) channels as end-stage boosters of endothelium-dependent vasodilators. The Journal of Physiology. 594 (12), 3271-3285 (2016).
