Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Millisekund hydrogen / deuterium-utveksling massespektrometri for studiet av alfa-synuclein strukturell dynamikk under fysiologiske forhold

Published: June 23, 2022 doi: 10.3791/64050
Automatic Translation
1, 1
1Living Systems Institute, Department of Biosciences, University of Exeter

Summary

Det strukturelle ensemblet av monomer alfa-synuclein påvirker dets fysiologiske funksjon og fysisk-kjemiske egenskaper. Denne protokollen beskriver hvordan man utfører millisekund hydrogen / deuterium-utveksling massespektrometri og påfølgende dataanalyser for å bestemme konformasjonsinformasjon om monomeren til dette iboende uordnede proteinet under fysiologiske forhold.

Abstract

Alfa-synuclein (aSyn) er et indre uordnet protein hvis fibrillære aggregater er rikelig i Lewy-legemer og nevritter, som er kjennetegnene til Parkinsons sykdom. Likevel involverer mye av sin biologiske aktivitet, så vel som aggregering, sentralt den løselige monomerformen av proteinet. Belysning av de molekylære mekanismene i aSyn biologi og patofysiologi krever strukturelt svært oppløste metoder og er følsom for biologiske forhold. Dens naturlig utfoldede, metastabile strukturer gjør monomer aSyn ugjennomtrengelig for mange strukturbiologiske teknikker. Her beskrives anvendelsen av en slik tilnærming: hydrogen / deuterium-utveksling massespektrometri (HDX-MS) på millisekund tidsskalaen for studier av proteiner med lav termodynamisk stabilitet og svake beskyttelsesfaktorer, for eksempel aSyn. På millisekundets tidsskala inneholder HDX-MS-data informasjon om løsningsmiddeltilgjengeligheten og hydrogenbundet struktur av aSyn, som går tapt ved lengre merkingstider, noe som til slutt gir strukturell oppløsning opp til aminosyrenivået. Derfor kan HDX-MS gi informasjon ved høye strukturelle og tidsmessige oppløsninger om konformasjonsdynamikk og termodynamikk, intra- og intermolekylære interaksjoner, og den strukturelle virkningen av mutasjoner eller endringer i miljøforhold. Selv om det er bredt anvendelig, demonstreres det hvordan man anskaffer, analyserer og tolker millisekund HDX-MS-målinger i monomere aSyn.

Introduction

Parkinsons sykdom (PD) er en nevrodegenerativ sykdom som påvirker millioner av mennesker over hele verden1. Det er preget av dannelsen av cytoplasmatiske inneslutninger kjent som Lewy-legemer og Lewy-neuritter i hjernens substantia nigra pars compacta-region. Disse cytoplasmatiske inneslutningene har vist seg å inneholde aggregater av det indre uordnede proteinet aSyn2. I PD og andre synukleinopatier transformerer aSyn fra en løselig uordnet tilstand til en uoppløselig, svært strukturert syk tilstand. I sin opprinnelige form vedtar monomere aSyn et bredt spekter av konformasjoner stabilisert av langdistanse elektrostatiske interaksjoner mellom N- og C-termini og hydrofobe interaksjoner mellom C-terminalen og ikke-amyloid beta-komponent (NAC) region 3,4,5,6. Eventuelle forstyrrelser i de stabiliserende interaksjonene, for eksempel mutasjoner, posttranslasjonelle modifikasjoner og endringer i det lokale miljøet, kan føre til feilfolding av monomeren, og dermed utløse prosessen med aggregering7.

Mens det finnes en enorm mengde forskning på oligomere og fibrillære former av aSyn 8,9,10,11, er det et avgjørende behov for å studere proteinets monomere form og bedre forstå hvilke konformatorer som er funksjonelle (og hvordan) og hvilke som er tilbøyelige til å samle 8,9,10,11 . Å være iboende uordnet, bare 14 kDa i størrelse og vanskelig å krystallisere, er aSyn-monomeren ikke mottagelig for de fleste strukturelle biologiske teknikker. Imidlertid er en teknikk som er i stand til å måle konformasjonsdynamikken til monomer aSyn millisekund HDX-MS, som nylig har generert viktige strukturelle observasjoner som ville være utfordrende eller umulig å oppnå ellers 12,13,14. Millisekund HDX-MS måler følsomt gjennomsnittet av proteinkonformasjonsensemblet ved å overvåke isotoputvekslingen ved amidhydrogensere, noe som indikerer løsemiddeltilgjengelighet og hydrogenbindingsnettverksdeltakelse av et bestemt proteinområde på millisekundets tidsskala. Det er nødvendig å understreke millisekundaspektet av HDX-MS, da aSyn på grunn av sin opprinnelig utfoldede, metastabile natur utviser veldig rask hydrogenutvekslingskinetikk som manifesterer seg godt under den nedre grensen for konvensjonelle HDX-MS-systemer. For eksempel har det meste av aSyn-molekylet fullstendig utvekslet hydrogen for deuterium under intracellulære forhold på mindre enn 1 s. Flere laboratorier har nå bygget hurtigblande instrumentering; i dette tilfellet brukes et prototype raskt blandende slukkeflytinstrument som er i stand til å utføre HDX-MS med en dødtid på 50 ms og en tidsmessig oppløsning på 1 ms15. Mens millisekund HDX-MS nylig har vært akutt viktig i studiet av aSyn, står det å være verdifullt for å studere iboende uordnede proteiner / regioner i større grad og et stort antall proteiner med løkker / regioner som bare er svakt stabile. For eksempel, peptidmedikamenter (f.eks. insulin; GLP-1/glukagon; tirzepatid) og peptidfusjonsproteiner (f.eks. HIV-hemmeren FN3-L35-T1144) er viktige legemiddelformater der struktur- og stabilitetsinformasjon i løsningsfasen kan være en kritisk inngang for beslutninger om legemiddelutvikling, og likevel er peptiddelen ofte bare svakt stabil og ugjennomtrengelig av HDX-MS på sekundene tidsskala 16,17,18,19,20 . Emergent HDX-MS metoder med merking i sekunder / minutter domener har vist seg å utlede strukturell informasjon for DNA G-quadruplexes, men det bør være mulig å utvide dette til mer variert oligonukleotid strukturer ved anvendelse av millisekund HDX-MS21.

HDX-MS-eksperimenter kan utføres på tre forskjellige nivåer: (1) bottom-up (hvor det merkede proteinet fordøyes proteolytisk), (2) middle-down (hvorved det merkede proteinet fordøyes proteolytisk, og de resulterende peptidene fragmenteres ytterligere ved myke fragmenteringsteknikker), og (3) top-down (hvorved myke fragmenteringsteknikker direkte fragmenterer det merkede proteinet)22 . Dermed tillater submolekylære HDX-MS-data oss å lokalisere utvekslingsadferden til bestemte regioner av et protein, noe som gjør det kritisk å ha tilstrekkelig sekvensdekning for slike eksperimenter. Den strukturelle oppløsningen til ethvert HDX-MS-eksperiment er avhengig av antall proteolytiske peptider eller fragmenter avledet fra proteinet ved fordøyelse eller myk fragmentering, henholdsvis. I hver av de tre eksperimenttypene som er skissert ovenfor, kartlegges endringen i amidutveksling ved hvert peptid / fragment tilbake på proteinets primære struktur for å indikere oppførselen til lokaliserte regioner av proteinet. Mens den høyeste strukturelle oppløsningen oppnås gjennom myk fragmentering, er beskrivelsen av disse eksperimentene utenfor omfanget av den nåværende studien, som fokuserer på måling av aSyn-monomerkonformasjoner. Utmerkede resultater kan oppnås med den ofte brukte "bottom-up" arbeidsflyten som er beskrevet her.

Her er det gitt prosedyrer for (1) hvordan man preparerer og håndterer aSyn-prøver og HDX-MS-buffere, (2) hvordan man utfører peptidkartlegging for et bottom-up HDX-MS-eksperiment, (3) hvordan man skaffer HDX-MS-data om monomere aSyn under fysiologiske forhold, spesielt i millisekund-tidsdomenet (ved hjelp av et spesialbygd instrument; alternative instrumenter for millisekundmerking er også beskrevet), og (4) hvordan du behandler og analyserer HDX-MS-dataene. Metoder som bruker monomer aSyn ved fysiologisk pH (7,40) i to løsningsforhold er eksemplifisert her. Selv om det er kritisk nyttig i studiet av aSyn, kan disse prosedyrene brukes på ethvert protein og er ikke begrenset til egentlig uordnede proteiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Proteinuttrykk og rensing av aSyn

  1. Forbered aSyn etter en tidligere publisert rapport9.
  2. Dialysere til en sikker lagringsbuffer (f.eks. Tris, pH 7.2 ).
  3. Om nødvendig, konsentrer prøven (f.eks. mikrosentrifugerør med spinnfilter ved bruk av 3 kDa MWCO, 14 000 x g i ca. 10-30 minutter, se Materialtabell).
    MERK: Det anbefales ikke å konsentrere seg for mye. Monomerensemblets integritet er ikke verifisert utover 25 μM.
  4. Aliquot og butikk ved −80 °C
    MERK: aSyn-monomerproteinet er stabilt i opptil 1 år under disse lagringsforholdene.

2. Klargjøring av HDX-buffer

MERK: Siden Tris har en høy temperaturkoeffisient, må pH-målingen justeres for temperaturen der HDX-reaksjonen skal gjøres, som er 20 °C i denne protokollen.

  1. Forbered likevektsbuffer for tilstand A og tilstand B ved å veie 0,002 mol Tris til 100 ml vann av LC-MS-klasse. For tilstand B, tilsett 29,8 mg KCl, 14,2 mg MgCl2, 36,8 g CaCl2 og 836 mg NaCl til Tris-bufferen. Juster pH til 7,40 ± 0,05.
    MERK: Likevektsbufferen må inneholde betingelsene som aSyn skal studeres under. I dette tilfellet er det 20 mM Tris ved pH 7,4 +/− salter.
  2. Forbered merkingsbuffer for tilstand A og tilstand B ved å veie 0,002 mol Tris i 100 ml deuterert vann. For tilstand B, tilsett 29,8 mg KCl, 14,2 mg MgCl2, 36,8 g CaCl2 og 836 mg NaCl til Tris-merkebufferen. pD for merkebufferen tilsvarer pH i likevektsbufferen. Siden pH = pD - 0,41, juster slik at pH-måleren leser 6,99 ± 0,0523,24.
    MERK: Merkebufferen må ha de samme komponentene som likevektsbufferen, bortsett fra at den fremstilles ved hjelp av deuterert vann.
  3. Forbered slukkebufferen ved å veie ut 0,010 mol Tris og 0,050 mol urea og lag opptil 100 ml med vann av LC-MS-kvalitet. Juster pH til 2,50 ± 0,05 ved 0,5 °C.
    MERK: En slukkebufferskjerm må utføres før HDX-eksperimenter for å identifisere den beste slukkebufferen for proteinet av interesse. Ulike konsentrasjoner og kombinasjoner av denaturanter (f.eks. Urea og guanidiniumhydroklorid) og reduksjonsmidler (f.eks. Tris (2-karboksyetyl) fosfin) screenes, sammen med fysiske parametere som fangstvolum og temperatur, for effektivt å utfolde og fordøye det slukkede proteinet. En slukkebuffer bestående av 100 mM Tris og 0,5 M urea ved pH 2,50 er optimal for denne studien.
  4. Forbered fordøyelseskolonne vaskebuffer ved å veie 0,125 mol guanidiniumhydroklorid i en Duran glassflaske. Tilsett 25 ml metanol og 250 mikroliter myresyre. Lag opptil 250 ml med vann av LC-MS-kvalitet.
    MERK: For Enzymate BEH pepsin-kolonnen (se Materialtabell), bruk en kolonnevaskbuffer på 0,5 M guanidiniumhydroklorid, 10% (v / v) metanol og 0,1% (v / v) maursyre.
  5. Klargjør sprøytens svake vask ved å pipettere 0,5 μL maursyre til 249,5 ml vann av typen LC-MS.
  6. Forbered sprøyten sterk vask ved å blande like deler av LC-MS-klasse vann, metanol, acetonitril og isopropanol. Tilsett maursyre til en endelig konsentrasjon på 2 % (v/v).
    MERK: For å forhindre krysskontaminering mellom de forskjellige bufferne og proteinet og for å muliggjøre rengjøring av injeksjonsporten, er det avgjørende at sprøytevaskeløsninger klargjøres og at strømningsbanen til ventilen (ofte kalt "vaskeforingen") er fullstendig primet med væske. Maursyren er valgfri for sprøyten svak vask.

3. Prosedyre for peptidkartlegging

  1. Klargjør eksemplet ved å følge trinnet nedenfor.
    1. Filter tinte aSyn proteinlager fra −80 °C fryseren med 0,22 μm sprøytefiltre. Mål absorbansen av det filtrerte stamproteinet ved 280 nm for å bestemme konsentrasjonen ved Beer-Lambert-loven. Fortynn proteinet til en konsentrasjon på 5 μM i likevektsbufferen (trinn 2.1).).
      MERK: Beer-Lambert-loven: A = εcl, hvor A er absorbans, ε er utryddelseskoeffisienten til proteinet ved den målte bølgelengden (280 nm her) med enhetene M−1cm−1, c er proteinkonsentrasjonen i M, og l er banelengden i cm. For villtype aSyn26 ε = 5960 M−1cm−1.
  2. Sett opp væskekromatografimetoden.
    1. Opprett en innløpsfil med en laste-/fangsttid på 3 minutter ved et trykk på 7000-9000 psi, etterfulgt av en gradient på 5 % acetonitril til 40 % acetonitril på 7 minutter, etterfulgt av gjentatte vasketrinn på 5 %-95 % acetonitrilvann i 10 minutter.
    2. Sørg for at låsespray (f.eks. leucin-enkefalin, se materialtabell) flyter ved 2000 psi og kobles til massespektrometerets kildelåsspraysonde.
  3. Sett opp massespektrometri MSE-metoder .
    MERK: MSE er en bredbåndsdatauavhengig innsamlingsmetode uten forløpermasseisolasjon. Derfor fragmenteres alle ioner innenfor det valgte m/z-området ytterligere ved hjelp av kollisjonsindusert dissosiasjon (CID)27.
    1. I MS-metodefilen velger du MSE Continuum og setter opp en anskaffelsestid mellom 2-10 min, elektrospraykilde og positiv oppløsningsmodus. Skaff MSE over 50-2000 Da, skanning hver 0,3 s.
    2. For funksjon 1 (lav energi), sett opp fellen og overfør kollisjonsenergiene til å være 4 V. For funksjon 2 (høy energi), sett opp rampeoverføringskollisjonsenergien til å være konstant ved 4V og fellekollisjonsenergien til å være som angitt i tabell 1 for hvert kartleggingsenerginivå.
      MERK: Ionemobilitet MSE-metoder kan også brukes. Alternative tilordningsmetoder (f.eks. dataavhengig innsamling eller DDA) kan brukes etter brukerens skjønn.
  4. Sett opp autosampler-roboten (se Materialtabell).
    1. Tilsett 50 μL av 5 μM proteinet til et hetteglass med total restitusjon. Plasser hetteglasset i en prøveposisjon i høyre kammer i HDX. Sørg for at dette kammeret er ved 0,5 °C.
    2. Tilsett ett reagens hetteglass med likevektsbuffer og to reagensflasker med merkebuffer til reagensposisjoner en, to og tre i HDX venstre kammer. Sørg for at dette kammeret er ved 20 °C ved å stille inn Peltier temperaturregulator (se materialtabell). Legg til ett reagens hetteglass med slukkebuffer for å reagensposisjonere ett i HDX høyre kammer.
    3. Legg til åtte hetteglass med total restitusjon i reaksjonsposisjonene til venstre kammer i HDX og åtte hetteglass med maksimal restitusjon i reaksjonsposisjonene til høyre kammer i HDX.
      MERK: For å sikre full rengjøring og maksimal reproduserbarhet av dispenserte volumer, anbefales det å utføre en sprøytevask og prime vask på autosamplersprøytene. Utfør for eksempel en sekvens med (1) svak vask, (2) sterk vask, (3) svak vask før du starter kartleggingseksperimentene. Denne sekvensen kan gjentas mye, og det anbefales å gjøre det opptil 20x eller til sprøyten er helt fuktet.
    4. Sett opp en eksempelliste med passende LC- og MS-metoder i planleggingsprogramvaren og start tidsplanen.
      MERK: For denne studien brukes Chronos som planleggingsprogramvare (se Materialtabell).
  5. Behandle tilordningsdataene.
    1. Identifiser peptider fra kartleggingseksperimentfilene ved hjelp av passende programvare (se Materialtabell).
    2. Importer peptididentifikasjonsdata til DynamX (se Materialtabell) ved hjelp av følgende peptidterskelparametere: minimum intensitet = 5000, minimum sekvenslengde = 0, maksimal sekvenslengde = 40, minimumsprodukter = 1, minimumsprodukter per aminosyre = 0,25, minimum påfølgende produkter = 2, minimum sumintensitet for produkter = 0, minimum score = 0 og maksimal MH+ Feil (ppm) = 0.
      MERK: Alternativt kan du utlede de optimaliserte innstillingene i henhold til en anbefalt arbeidsflyt28.
    3. Velg Data fra menyen og klikk på Importer PLGS-resultater. Klikk på Legg til for å velge de relevante datafilene for spektraloppgaven. Når alle er lagt til, klikker du på Neste og skriver inn filterinnstillingene ovenfor. Klikk deretter på Fullfør.
    4. Kurater isotopoppgaver manuelt for å få det endelige peptiddekningskartet over aSyn i DynamX.

4. Millisekund hydrogen / deuterium utveksling studie

  1. Rengjør FastHDX-prototypeinstrumentet (se Materialtabell) før du starter HDX-eksperimenter.
    1. Åpne den kompatible HDX-programvare-GUI-en og la systemet initialisere.
    2. Angi prøvekammertemperaturen som 20 °C og slukkekammeret som 0,5 °C. Klikk på Set for å bruke de nye temperaturene.
    3. Sett opp sentrifugerørene med vann av LC-MS-kvalitet ved alle innløp.
    4. Kontroller både venstre og høyre sprøyte i kategorien VVS-levering i kategorien VVS og klikk på Prime for å fjerne eventuelle latente luftbobler i slangene. Gjenta til alle boblene er borte.
    5. I kategorien Makroer merker du av i alle boksene for sprøytene. Klikk på Kalibrer sprøyters hjemmeposisjon. Klikk på Vask sprøytebelastningssløyfe. Klikk på Vask alle blandesløyfevolumer.
    6. Gjenta trinn 4.1.5. 1x mer.
    7. Hvis det oppstår bobler i buffersprøytene, må du degasere ved å koble fra sprøyten og kaste ut boblen vertikalt. Sett sprøyten på plass igjen og kalibrer på nytt til nullstilling.
  2. Sett opp FastHDX prototypeinstrumentet for HDX-eksperimenter.
    1. Tilsett 500 uL filtrert 5 μM aSyn i et hetteglass med total gjenvinning og plasser det i et kjøleskap på bordplaten for å forhindre temperaturindusert oligomerisering og aggregering.
    2. Legg til 50 ml likevekts-, merkings- og slukkebuffere til hver buffer (2. HDX-bufferforberedelse trinn 1-3) innløp i venstre og høyre kammer.
    3. Tilsett 50 ml kolonnevaskbuffer (2. HDX-buffer klargjøring trinn 4) til pepsinvaskeinnløpet.
    4. For å prime protein- og kolonnevaskelinjene 1x, sjekk både venstre og høyre sprøyte i Titrator Plumbing Delivery-fanen og klikk på Prime én gang.
      MERK: Ethvert påfølgende klikk på Prime vil føre til ytterligere gjentakelser av primærprosessen, noe som resulterer i forbruk av store mengder proteinprøve. Forsiktighet anbefales å unngå dette, selv når det er en forsinkelse i programvaren etter at et knappeklikk er forsøkt.
    5. Gjenta trinn 4.1.5. 1x.
    6. I kategorien Manuell slukk flyt angir du de nødvendige innstillingene, forklart i trinn 4.2.7.-4.2.10.
    7. For et tidskurseksperiment angir du tidene i millisekunder ved hjelp av knappen Symbolske prikker . Hvis replikasjoner kreves, legg til samme tidspunkt flere ganger, for eksempel for et tre eksemplar på 50 ms, må 50 50 50 angis. Eksempellisten i massespektrometerprogramvaren (MassLynx brukes her, se Materialtabell) må samsvare nøyaktig med disse tidspunktene.
      MERK: Massespektrometerets eksempellistefilnavn og/eller eksempeltekst bør brukes for å sikre en permanent registrering av HDX-merketidene som tilsvarer de som er angitt i FastHDX-programvare-GUI. Merketider for hver prøvekjøring lagres ikke andre steder.
    8. Angi at overlappingstid (minutter) skal være lengden på overlappingstiden. Her er klokken 3.00.
    9. Angi Vent på HPLC (min) = (overlappingstid + kjøretid + 1,5 min).
      Merk: For eksempel, for et eksperiment med 3 min overlapping og 17 min stigning, vil dette være 21,50 min.
    10. Klikk på Kjør tom-boksen bare hvis du kjører tomme eksperimenter mellom eksempelkjøringer. Hvis ja, må du kontrollere en oppføring (dvs. en gyldig rad i eksempellisten) i programvaren for den tomme kjøringen etter hver prøvekjøring.
    11. Når eksempellisten er klar på programvaren, markerer du de aktuelle oppføringene og starter kjøringen i programvaren ved å klikke på Play-knappen og FastHDX i programvaren.
      MERK: På grunn av hydrogen / deuterium scrambling, ms-bare metoder eller myk fragmentering teknikker (elektronoverføring dissosiasjon, elektronfangst dissosiasjon, og ultrafiolett foto-dissosiasjon) kan brukes bare29. For aSyn ved en fysiologisk pH på 7,40 er tidspunkter fra 50 ms til 300 s mest anvendelige, da disse dekker hele deuteriumopptakskurven8.

5. Databehandling

  1. Last inn filen med spektralt tildelte peptider fra peptidkartleggingseksperimentene. Åpne Fil-menyen og klikk på Åpne i DynamX-programvaren (se Materialtabeller).
  2. Importer råfiler til den foretrukne programvaren for massemåling (f.eks. DynamX, HDExaminer osv.). Åpne "Data" -menyen og klikk på MS-filer. Klikk på New State for å opprette tilstander for hver proteintilstand som studeres.
    1. Klikk på Ny eksponering for å legge til hvert HDX-tidspunkt. Klikk på Ny RAW for å importere de .raw filene. Dra hver .raw fil til riktig posisjon. Klikk på OK når du er ferdig.
  3. Tilordne isotoper automatisk først (dette er automatisk etter trinn 5.2. ovenfor), og kurater deretter isotopoppgaven manuelt for å sikre høy datakvalitet.
  4. Eksporter klyngedataene til en .csv fil med kolonner i følgende rekkefølge: proteinnavn, sekvensstartnummer, sekvenssluttnummer, sekvens, modifikasjon, fragment, maksimalt mulig opptak, masse av monoisotopiske arter, tilstandsnavn, eksponeringstid, filnavn, ladning, retensjonstid, intensitet og sentroid.
  5. Åpne Data-menyen i programvare for massemåling og klikk på Eksporter klyngedata.

6. Analyse av data

  1. Last inn de eksporterte klyngedataene i den foretrukne HDX-analyseprogramvaren. Her brukes HDfleX30 (se Materialtabell).
  2. Tilpass de eksperimentelle dataene for alle peptider og tilstander, og velg passende back-exchange korreksjonsmetoder for å få observerte hastighetskonstanter for HDX-reaksjonen.
  3. Beregn en global signifikansterskel ved den foretrukne metoden (HDfleX støtter flere alternativer for dette) og utfør hybrid signifikanstesting for å bestemme de signifikante forskjellene mellom statene sammenlignet med31,32.
    MERK: Hvis den observerte forskjellen er større enn den globale terskelen og p-verdien er mindre enn det valgte konfidensnivået (f.eks. 95 %), anses forskjellen som signifikant.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

På grunn av sin iboende uordnede natur er det vanskelig å fange opp de intrikate strukturelle endringene i aSyn ved fysiologisk pH. HDX-MS overvåker isotopisk utveksling ved ryggradsamidhydrogener, og undersøker proteinkonformasjonsdynamikken og interaksjonene. Det er en av de få teknikkene for å skaffe seg denne informasjonen ved høye strukturelle og tidsmessige oppløsninger. Denne protokollen er bredt anvendelig på et bredt spekter av proteiner og bufferbetingelser, og dette eksemplifiseres ved måling av utvekslingskinetikken til aSyn i to forskjellige løsningsforhold: Stat A og Stat B8, som definert i trinn 2.1.-2.2.

Først ble det utført et kartleggingsforsøk på aSyn, og et peptiddekningskart ble oppnådd, som vist i figur 1. Kartet dekker 100% av proteinsekvensen og har en gjennomsnittlig redundans på 3,79. Dekningsverdien på 100% indikerer at alle aminosyrene i proteinet ble funnet i proteinfordøyelsene og vil muliggjøre en omfattende analyse av utvekslingsatferden til aSyn. Redundansverdien indikerer antall overlappende peptider. En høyere redundansverdi øker den strukturelle oppløsningen til det endelige kartet, gitt subtraktiv utflating av dataene for overlappende peptider32.

Ved hjelp av prototypen av hurtigblandede slukkestrømningsinstrumenter (se Materialtabell) ble hdx-MS-data av høy kvalitet i millisekund-tidsskala på aSyn ved pH 7,4 i tilstand A og tilstand B samlet inn (figur 2). Etter isotopisk tildeling i DynamX ble det oppnådd "rå" deuteriumopptakskurver, som vist i figur 3A. Det viser opptakskurver for tre peptider valgt over hvert proteindomene. Deuterium-inkorporeringen over tid vises. X-aksen er på millisekundets tidsskala, som stemmer overens med den svært raske kinetikken til aSyn ved fysiologiske forhold. Den rødskyggede regionen viser dataene som vanligvis hentes fra konvensjonelle HDX-instrumenter, med startmålinger fra 30 s. Det er viktig at dette ikke kan reduseres ytterligere ved pH-manipulasjon for såkalt "tidsvinduutvidelse"; denne tilnærmingen er ugyldig for studiet av indre uordnede proteiner/regioner, da pH-skiftet vil forstyrre konformasjonsensemblet til det svakt stabile polypeptidet. Som det fremgår her, er det meste av aSyn fullt ut utvekslet med 1 s (figur 3C). Dette viser betydningen av millisekund HDX-målinger for monomere aSyn når den fulle kinetiske opptakskurven for utvekslingsreaksjonen fanges opp, noe som gir den mest nøyaktige målingen av monomerkonformasjonene.

HDfleX utførte back-exchange korreksjon ved hjelp av platå deuterium inkorporering. Datapunktene ble deretter montert i henhold til ligning 1, som gir en observert hastighetskonstant, kobs, indikativ for løsningsmiddeltilgjengeligheten og hydrogenbindingsaffeksjonen av det aktuelle peptidet (figur 3B).

Equation 1Ligning 1

hvor Dt er deuterium-inkorporeringen på tidspunkt t, nExp er antall eksponentielle faser, N er det maksimale antall labile hydrogener, kobs er den observerte valutakurskonstanten, og β er en strekkfaktor30,33.

Etter kurvetilpasning kan opptaksområdet under den monterte kurven beregnes ved å integrere den monterte funksjonen som beskriver opptakskurven i det eksperimentelle tidsvinduet. Statistisk signifikansanalyse mellom opptaksområdet i de to tilstandene ble utført. For det første ble en global signifikansgrense for opptaksområdet beregnet i HDfleX med et konfidensnivå på 95 %. Opptaksområdeforskjellplott ble deretter generert, og viste forskjellen mellom tilstand A og tilstand B ved to nivåer av strukturell oppløsning: peptidoppløsning (figur 4A) og aminosyreoppløsning (figur 4B). Peptidoppløsningsforskjellsplottet viser forskjellen i opptaksområde mellom tilstand A og tilstand B for hvert enkelt peptid, mens aminosyreoppløsningsforskjellsplottet viser forskjellen i opptaksområde mellom tilstand A og tilstand B flatet over hele aminosyresekvensen til aSyn30,34. Begge plottene indikerer et generelt større deuteriumopptak gjennom hele aSyn-monomeren i stat B sammenlignet med stat A. Dette funnet kan forsvares ved å undersøke deuteriumopptaksplottene i figur 3, der tilstand B-opptakskurven alltid er over tilstand A-opptakskurven. Videre kan man se at størrelsen på forskjellen i opptaksområdet er mye høyere ved C-terminalen. Igjen kan dette forsvares ved å spore tilbake til de opprinnelige opptakskurvene, der de C-terminale peptidene (peptidene 124-140 vist i figur 3) viser et mye større gap mellom opptakskurvene enn resten av proteinet. Avslutningsvis forårsaker løsningsbetingelsene i tilstand B en økning i løsningsmiddeleksponering eller reduksjon i hydrogenbindingsnettverksdeltakelse gjennom hele proteinet, men mer ved C-terminalen.

Figure 1
Figur 1: Peptiddekningskart over villtype aSyn med totalt 30 peptider og 100% sekvensdekning. De tre domenene til aSyn er uthevet som følger: N-terminus (blå), ikke-amyloid beta-komponentregion (gul) og C-ende (rød). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Arbeidsflyt for et millisekund HDX-MS-eksperiment på aSyn. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Eksempelopptaksplott fra tre peptider valgt på tvers av de tre domenene aSyn for tilstand A (gul) og tilstand B (blå). (A) Uegnet og ikke-tilbakebyttekorrigert opptaksplott. (B) Monterte og tilbakebyttekorrigerte opptaksplott. Det røde skyggelagte området representerer data som kan oppnås med konvensjonelle HDX-MS-systemer, vanligvis fra 30 s. Feilfelt tilsvarer standardavviket til de tre replikasjonene. (C) Varmekartplott av prosentandelen deuteriumopptak over aminosyresekvensen per tidspunkt. Fargelinjen representerer prosentandelen av deuteriumopptak. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Opptaksarealforskjell plotter ved maksimal kurve platåtid (14,084 ms). (A) Peptidresteroppløsningsplott viser hvert peptids opptaksarealforskjell mellom tilstand A og tilstand B. (B) Aminosyreoppløsningsplott som viser opptaksarealforskjellen mellom tilstand A og tilstand B flatet over aminosyresekvensen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Kartlegging av energinivå Rampe spenning (V)
Lav 20-40
Middels 25-45
Høy 30-50
Veldig høy 35-55

Tabell 1: Kartlegging av energinivåer og tilhørende overføringsrampespenninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne artikkelen beskrives følgende prosedyrer: (1) utføre peptidkartleggingseksperimenter på monomere aSyn for å oppnå den høyeste sekvensdekningen, (2) anskaffe millisekund HDX-MS-data på monomere aSyn under fysiologiske forhold, og (3) utføre dataanalyse og tolkning av de resulterende HDX-MS-dataene. De angitte prosedyrene er generelt enkle å utføre, hvert merkingseksperiment varer vanligvis bare rundt 8 timer i tre replikasjoner og åtte tidspunkter, og kartleggingseksperimentet varer bare rundt 2 timer. Gitt den helautomatiske instrumenteringen som brukes her, kan et komplett datasett anskaffes på 1 dag. Ved håndtering av prøver og tilberedning av buffere må det imidlertid tas hensyn til at målingene kommer fra svakt stabile protein (eller proteinregioner) i ønsket tilstand. Det er viktig at en tidligere studie viste at forskjellige lagringsforhold, som frysing og lyofilisering, resulterte i forskjellige aSyn-monomerkonformatorer, og at det er viktig å karakterisere den potensielle effekten av prøvehåndtering på aSyn-monomerkonformasjonsensemblet10. Faktisk er HDX-MS et svært følsomt mål for slike konformasjonsforstyrrelser, med et dynamisk område fra mikrosekunder til minst måneder. I tillegg, hvis du bare studerer aSyn-monomeren strengt, anbefales filtrering på det sterkeste for å fjerne uønskede oligomerer og fibriller som kan ha dannet seg i prøven ved lagring eller håndtering. Videre må HDX-MS-bufferne kontrolleres tett innen 0,05 av ønsket pH eller pD, da eventuelle avvik vil påvirke den iboende valutakursen betydelig og føre til uønskede feil. Det er også viktig å merke seg at sammenligninger mellom løsningsbetingelser for ethvert protein som er forskjellig i pH, temperatur eller saltsammensetning, vil endre den inneboende hastigheten. Derfor vil disse dataene kreve ytterligere korreksjoner, for eksempel å bruke en pH-justeringsfaktor35 eller en empirisk korreksjonsfaktor 8,30.

Når det gjelder instrumentering, er det ingen kommersielt tilgjengelige systemer som tillater innsamling av millisekund HDX-MS-data. Flere forskningsgrupper har utviklet sine egne systemer, fra slukkestrømssystemer 13,15,36 til mikrofluidiske chips 37,38,39 for å fange den raske utvekslingskinetikken til visse proteiner. En annen metode som har blitt brukt til å oppnå millisekund-tidsskala HDX-MS-data er kjent som tidsutvidelsesmetoden40,41, hvorved pH i bufferne reduseres for å bremse utvekslingskinetikken. Denne metoden gjelder imidlertid ikke for aSyn (eller for noen svakt stabile proteinegenskaper) da (1) senkingen av pH drastisk endrer ladningstettheten til proteinet og øker aggregeringshastigheten 8,42, og (2) aSyn-konformistene er bare metastabile og vil sannsynligvis bli forstyrret av disse pH-endringene. Av disse grunner anbefales det å opprettholde en konsistent pH i HDX-MS-bufferne når man studerer monomere aSyn-konformasjoner, med mindre fysiologisk relevante, og bruke et millisekund merkingsinstrument.

Det meste av aSyn-monomeren utveksles fullt ut innen 1 s, og på det meste tar det ca. 15 s å bytte helt ut med deuterium (figur 3) ved en fysiologisk relevant pH på 7,4 (reflekterer intracellulære cytosoliske forhold ved presynapse). Ved bruk av konvensjonelle HDX-MS-systemer er det ikke hensiktsmessig å starte ved 30 s, da HDX-MS-dataene tilsvarer platået av utvekslingsreaksjonen, noe som ikke gir noen nyttig konformasjonsinformasjon. Den nedre målegrensen for millisekund-HDX-instrumentet (tilsvarende en "dødtid" på 50 ms) muliggjør imidlertid overvåking av utvekslingsreaksjonen fra ~ 25% fullføring for aSyn-monomeren ved pH 7,4. Dette tillot oss å fange mesteparten av den kinetiske opptakskurven. Tilpasning av deuteriumopptakskurven til ligning 1 gir viktig kinetisk informasjon; det tilsvarer et estimat av den observerte hastighetskonstanten, kobs. Selv om det ikke er dekket her, er det mulig å utføre aggregeringskinetikkeksperimenter og undersøke fibrilmorfologier av aSyn under de samme løsningsbetingelsene som HDX-MS-eksperimentene siden HDX-MS er svært tolerant for et bredt spekter av buffere8. For eksempel kan kobs fra HDX-MS-eksperimentet korreleres med resultatene fra aggregeringseksperimentene for å få innsikt i hvilke konformasjoner som er mest utsatt for visse aggregeringsatferder og fibrilmorfologier.

For det enkle tilfellet med differensielle HDX-MS-eksperimenter, der to eller flere tilstander eller proteinvarianter skal sammenlignes, kan området under den tilpassede opptakskurven integreres for hver tilstand og sammenlignes med hverandre. I denne studien ble opptaksområdene for tilstand A og tilstand B sammenlignet på to forskjellige nivåer av strukturell oppløsning: peptidoppløsning og aminosyreoppløsning, som begge har forskjellige styrker og utfordringer. For eksempel reflekterer peptidoppløsningsdataene de rå spektraldataene nærmere og har gjennomgått minst behandling. Imidlertid tillater de "flate" aminosyreoppløsningsdataene at både peptid- og mykfragmenteringsinformasjon kombineres til en enkelt utgang i stedet for separate ikke-nedbrytbare utganger og til slutt presenterer dataene med den høyeste strukturelle oppløsningen. En begrensning ved massespektrometrideteksjon av HDX-merking er utfordringen med å oppnå aminosyreoppløsning. Mens "myk fragmentering" -teknikker, som elektronoverføringsdissosiasjon (ETD), elektronfangstdissosiasjon (ECD) og ultrafiolett fotodissosiasjon (UVPD), har vist seg å være effektive for å generere høyere oppløsninger, forblir de utfordrende, uforutsigbare og ineffektive 30,43,44,45,46,47,48.

Sammenlignet med andre strukturelle teknikker har millisekund HDX-MS den unike fordelen av å fange konformasjonsdynamikken til monomere aSyn ved høye strukturelle og tidsmessige oppløsninger. Siden monomerens raske utvekslingskinetikk ikke lenger er en begrensende faktor, kan videre studier utføres på monomere aSyn med forskjellige mutasjoner, posttranslasjonelle modifikasjoner, saltkomponenter og konsentrasjoner og bindingspartnere ved fysiologisk pH. Korrelering av HDX-MS-resultatene med funksjonelle studier, som aggregeringskinetikk og fibrilmorfologier, kan gi innsikt i konformatorer som enten fremmer normal cellulær funksjon eller er sykdomsutsatte. Til syvende og sist forventes det at slike millisekund HDX-MS kan være avgjørende for å oppdage målrettede stoffer som stabiliserer spesifikke fysiologisk tolererte konformatorer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

NS er finansiert av Universitetsrådets diamantjubileumsstipend. JJP støttes av et UKRI Future Leaders Fellowship [Grant number: MR/T02223X/1].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 × 100 mm ACQUITY BEH 1.7 μm C18 column  Waters Corporation 186002346 Analytical column
Acetonitrile HPLC grade >99.9% HiPerSolv VWR 20060.420 For LC mobile phases
CaCl2 Sigma Aldrich C5670 Salt for HDX buffers
Chronos Axel Semrau (Purchased from Waters Corporation) 667006090 Scheduling software to enable multiple HDX-MS sample injections automatically. Alternative software is available from other vendors e.g. HDXDirector or LEAP Shell
Deuterium chloride Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) DLM-2-50 For HDX labelling buffers
Deuterium oxide (99.9% D2O) Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) DLM-4 Deuterated water
DynamX 3.0 Waters Corporation 176016027 Isotopic assignment and deuterium incorporation calculation
Enzymate BEH Pepsin Column Waters Corporation 186007233 Pepsin digestion column
Formic Acid, 99.0% LC/MS Grade Fisher Scientific 10596814 For LC mobile phases
Guanidinium hydrochloride Sigma Aldrich RDD001-500G Chaotrope/Denaturant
HDfleX University of Exeter N/A https://ore.exeter.ac.uk/repository/handle/10871/127982
KCl Sigma Aldrich P3911 Salt for HDX buffers
LEAP HDX-2 CTC PAL sampling robot Waters Corporation 725000637 Autosampler robot
Leucine enkephalin Waters Corporation 186006013 For mass spectrometry lockspray calibration.
MassLynx Waters Corporation 667004007 Software controlling inlet methods and mass spectrometer
Maximum recovery vials Waters Corporation 600000670CV 100 pack including caps - used for quench tray in LEAP HDX-2
MgCl2 Sigma Aldrich M8266 Salt for HDX buffers
Millipore 0.22 µm syringe filters Millipore N9CA7069B Syringe filters
ms2min Applied Photophysics Ltd N/A fast-mix quench-flow millisecond hdx instrument
NaCl Sigma Aldrich S9888 Salt for HDX buffers
Peltier temperature controller LEAP Technologies Inc. HP115-COOL/D Peltier controller to set precise temperature of chambers in the LEAP robot.
ProteinLynx Global Server 3.0 Waters Corporation 715001030 Peptide identification software. Alternative software is available from other vendors.
Reagent pot caps Waters Corporation 186004632 100 pack
Reagent pots for LEAP HDX-2 Waters Corporation 186001420 100 pack excluding caps - used for buffers in LEAP HDX-2
Sodium deuteroxide (99.5% in D2O) Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) DLM-57 For HDX labelling buffers
Spin filter microcentrifuge tubes (3 kDa MWCO) Amicon (Merck Sigma Aldrich) UFC5003 Micro centrifuge tubes to concentrate protein. This facilitates buffer exchange and accurate sample loading for HDX-MS experiments.
Synapt G2-Si mass spectrometer Waters Corporation 176850035 Mass spectrometer
Total recovery vials Waters Corporation 600000671CV 100 pack including caps - used for labelling tray in LEAP HDX-2
Tris-HCl Sigma Aldrich T3253-250G Buffer
Trizma base Sigma Aldrich T60040-B2005 Buffer
Urea Sigma Aldrich U5378-1KG Chaotrope/Denaturant
VanGuard 2.1 x 5 mm ACQUITY BEH C18 column  Waters Corporation 186004623 Trap desalting column

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dorsey, E. R., et al. regional, and national burden of Parkinson's disease, 1990-2016: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet Neurology. 17 (11), 939-953 (2018).
  2. Breydo, L., Wu, J. W., Uversky, V. N. α-Synuclein misfolding and Parkinson's disease. Biochimica et Biophysica Acta (BBA): Molecular Basis of Disease. 1822 (2), 261-285 (2012).
  3. Dedmon, M. M., Lindorff-Larsen, K., Christodoulou, J., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. Mapping long-range interactions in α-synuclein using spin-label NMR and ensemble molecular dynamics simulations. Journal of the American Chemical Society. 127 (2), 476-477 (2005).
  4. Esteban-Martín, S., Silvestre-Ryan, J., Bertoncini, C. W., Salvatella, X. Identification of fibril-like tertiary contacts in soluble monomeric α-synuclein. Biophysical Journal. 105 (5), 1192-1198 (2013).
  5. McClendon, S., Rospigliosi, C. C., Eliezer, D. Charge neutralization and collapse of the C-terminal tail of alpha-synuclein at low pH. Protein Science. 18 (7), 1531-1540 (2009).
  6. Ranjan, P., Kumar, A. Perturbation in long-range contacts modulates the kinetics of amyloid formation in α-synuclein familial mutants. ACS Chemical Neuroscience. 8 (10), 2235-2246 (2017).
  7. Villar-Piqué, A., da Fonseca, T. L., Outeiro, T. F. Structure, function and toxicity of alpha-synuclein: the Bermuda triangle in synucleinopathies. Journal of Neurochemistry. 139, Suppl 1 240-255 (2015).
  8. Seetaloo, N., Zacharopoulou, M., Stephens, A. D., Schierle, G. S. K., Phillips, J. J. Local structural dynamics of alpha-synuclein correlate with aggregation in different physiological conditions. bioRxiv. , (2022).
  9. Stephens, A. D., et al. Extent of N-terminus exposure of monomeric alpha-synuclein determines its aggregation propensity. Nature Communications. 11 (1), 2820 (2020).
  10. Stephens, A. D., et al. Different structural conformers of monomeric α-synuclein identified after lyophilizing and freezing. Analytical Chemistry. 90 (11), 6975-6983 (2018).
  11. Lautenschläger, J., et al. C-terminal calcium binding of α-synuclein modulates synaptic vesicle interaction. Nature Communications. 9 (1), 712 (2018).
  12. Oganesyan, I., Lento, C., Tandon, A., Wilson, D. J. Conformational dynamics of α-synuclein during the interaction with phospholipid nanodiscs by millisecond hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (5), 1169-1179 (2021).
  13. Keppel, T. R., Weis, D. D. Analysis of disordered proteins using a simple apparatus for millisecond quench-flow H/D exchange. Analytical Chemistry. 85 (10), 5161-5168 (2013).
  14. Al-Naqshabandi, M. A., Weis, D. D. Quantifying protection in disordered proteins using millisecond hydrogen exchange-mass spectrometry and peptic reference peptides. Biochemistry. 56 (31), 4064-4072 (2017).
  15. Kish, M., et al. Allosteric regulation of glycogen phosphorylase solution phase structural dynamics at high spatial resolution. bioRxiv. , (2019).
  16. El-Amine, M., et al. Mechanisms of tolerance induction by a gene-transferred peptide-IgG fusion protein expressed in B lineage cells. Journal of Immunology. 165 (10), 5631-5636 (2000).
  17. Kishimoto, S., et al. Site-specific chemical conjugation of antibodies by using affinity peptide for the development of therapeutic antibody format. Bioconjugate Chemistry. 30 (3), 698-702 (2019).
  18. Xu, W., et al. A protein-based, long-acting HIV-1 fusion inhibitor with an improved pharmacokinetic profile. Pharmaceuticals. 15 (4), 424 (2022).
  19. Frías, J. P., et al. Tirzepatide versus semaglutide once weekly in patients with type 2 diabetes. The New England Journal of Medicine. 385 (6), 503-515 (2021).
  20. Gerstein, H. C., et al. Cardiovascular and renal outcomes with efpeglenatide in type 2 diabetes. The New England Journal of Medicine. 385 (10), 896-907 (2021).
  21. Largy, E., Gabelica, V. Native hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry of structured DNA oligonucleotides. Analytical Chemistry. 92 (6), 4402-4410 (2020).
  22. Marcsisin, S. R., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry: What is it and what can it tell us. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (3), 967-972 (2010).
  23. Glasoe, P. K., Long, F. A. Use of glass electrodes to measure acidities in deuterium oxide. Journal of Physical Chemistry. 64 (1), 188-190 (1960).
  24. Krȩzel, A., Bal, W. A formula for correlating pKa values determined in D2O and H2O. Journal of Inorganic Biochemistry. 98 (1), 161-166 (2004).
  25. Mayerhöfer, T. G., Pahlow, S., Popp, J. The Bouguer-Beer-Lambert law: Shining light on the obscure. ChemPhysChem. 21 (18), 2029-2046 (2020).
  26. Gasteiger, E., et al. The Proteomics Protocols Handbook. , Springer. New York. 571-607 (2005).
  27. Bateman, R. H., et al. A novel precursor ion discovery method on a hybrid quadrupole orthogonal acceleration time-of-flight (Q-TOF) mass spectrometer for studying protein phosphorylation. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 13 (7), 792-803 (2002).
  28. Sørensen, L., Salbo, R. Optimized workflow for selecting peptides for HDX-MS data analyses. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (11), 2278-2281 (2018).
  29. Demmers, J. A. A., Rijkers, D. T. S., Haverkamp, J., Killian, J. A., Heck, A. J. R. Factors affecting gas-phase deuterium scrambling in peptide ions and their implications for protein structure determination. Journal of the American Chemical Society. 124 (37), 11191-11198 (2002).
  30. Seetaloo, N., Kish, M., Phillips, J. J. HDfleX: Software for flexible high structural resolution of hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry data. Analytical Chemistry. 94 (11), 4557-4564 (2022).
  31. Hageman, T. S., Weis, D. D. Reliable identification of significant differences in differential hydrogen exchange-mass spectrometry measurements using a hybrid significance testing approach. Analytical Chemistry. 91 (13), 8008-8016 (2019).
  32. Hageman, T. S., Weis, D. D. A structural variant approach for establishing a detection limit in differential hydrogen exchange-mass spectrometry measurements. Analytical Chemistry. 91 (13), 8017-8024 (2019).
  33. Chetty, P. S., et al. Helical structure and stability in human apolipoprotein A-I by hydrogen exchange and mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (45), 19005-19010 (2009).
  34. Keppel, T. R., Weis, D. D. Mapping residual structure in intrinsically disordered proteins at residue resolution using millisecond hydrogen/deuterium exchange and residue averaging. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (4), 547-554 (2015).
  35. Li, J., Rodnin, M. V., Ladokhin, A. S., Gross, M. L. Hydrogen-deuterium exchange and mass spectrometry reveal the pH-dependent conformational changes of diphtheria toxin T domain. Biochemistry. 53 (43), 6849-6856 (2014).
  36. Roder, H., Elöve, G. A., Englander, S. W. Structural characterization of folding intermediates in cytochrome c by H-exchange labelling and proton NMR. Nature. 335 (6192), 700-704 (1988).
  37. Rob, T., et al. Measuring dynamics in weakly structured regions of proteins using microfluidics-enabled subsecond H/D exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 84 (8), 3771-3779 (2012).
  38. Rob, T., Gill, P. K., Golemi-Kotra, D., Wilson, D. J. An electrospray ms-coupled microfluidic device for sub-second hydrogen/deuterium exchange pulse-labelling reveals allosteric effects in enzyme inhibition. Lab on a Chip. 13 (13), 2528-2532 (2013).
  39. Svejdal, R. R., Dickinson, E. R., Sticker, D., Kutter, J. P., Rand, K. D. Thiol-ene microfluidic chip for performing hydrogen/deuterium exchange of proteins at subsecond time scales. Analytical Chemistry. 91 (2), 1309-1317 (2018).
  40. Goswami, D., et al. Time window expansion for HDX analysis of an intrinsically disordered protein. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 24 (10), 1584-1592 (2013).
  41. Coales, S. J., E, S. Y., Lee, J. E., Ma, A., Morrow, J. A., Hamuro, Y. Expansion of time window for mass spectrometric measurement of amide hydrogen/deuterium exchange reactions. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (24), 3585-3592 (2010).
  42. Hoyer, W., et al. Dependence of alpha-synuclein aggregate morphology on solution conditions. Journal of Molecular Biology. 322 (2), 383-393 (2002).
  43. Rand, K. D., Pringle, S. D., Morris, M., Engen, J. R., Brown, J. M. ETD in a traveling wave ion guide at tuned Z-spray ion source conditions allows for site-specific hydrogen/deuterium exchange measurements. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 22 (10), 1784-1793 (2011).
  44. Kan, Z. Y., Ye, X., Skinner, J. J., Mayne, L., Englander, S. W. ExMS2: An integrated solution for hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry data analysis. Analytical Chemistry. 91 (11), 7474-7481 (2019).
  45. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Characterizing short-lived protein folding intermediates by top-down hydrogen exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (20), 8591-8597 (2010).
  46. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry with top-down electron capture dissociation for characterizing structural transitions of a 17 kDa protein. Journal of the American Chemical Society. 131 (35), 12801-12808 (2009).
  47. Mistarz, U. H., et al. Photodissociation mass spectrometry accurately localizes sites of backbone deuteration in peptides. Analytical Chemistry. 90 (2), 1077-1080 (2017).
  48. Phillips, J. J., et al. Rate of asparagine deamidation in a monoclonal antibody correlating with hydrogen exchange rate at adjacent downstream residues. Analytical Chemistry. 89 (4), 2361-2368 (2017).

Tags

Nevrovitenskap utgave 184 Alfa-synuclein indre lidelse millisekund hydrogen / deuterium-utveksling massespektrometri dynamisk strukturbiologi
Millisekund hydrogen / deuterium-utveksling massespektrometri for studiet av alfa-synuclein strukturell dynamikk under fysiologiske forhold
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Seetaloo, N., Phillips, J. J.… More

Seetaloo, N., Phillips, J. J. Millisecond Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry for the Study of Alpha-Synuclein Structural Dynamics Under Physiological Conditions. J. Vis. Exp. (184), e64050, doi:10.3791/64050 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter