Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Flowcytometrianalyse af murinknoglemarv, hæmatopoietisk stam- og stamceller og stromale nicheceller

Published: September 28, 2022 doi: 10.3791/64248
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2,3,4
1Instituto de Investigação e Inovação em Saúde (i3S), Universidade do Porto, 2Department of Onco-Hematology, Instituto Português de Oncologia (IPO)-Porto, 3Unit of Biochemistry, Department of Biomedicine, Faculdade de Medicina da Universidade do Porto, 4Porto Comprehensive Cancer Center (P.CCC)

Summary

Her beskriver vi en simpel protokol til isolering og farvning af murinknoglemarvsceller til fænotype hæmopoietiske stam- og stamceller sammen med de understøttende nicheendotel- og mesenkymale stamceller. En metode til at berige celler placeret i endosteale og centrale knoglemarvsområder er også inkluderet.

Abstract

Knoglemarven (BM) er det bløde væv, der findes i knogler, hvor hæmatopoiesis, den proces, hvorved nye blodlegemer genereres, primært forekommer. Som sådan indeholder den hæmatopoietiske stam- og stamceller (HSPC'er) samt understøtter stromale celler, der bidrager til vedligeholdelse og regulering af HSPC'er. Hæmatologiske og andre BM-lidelser forstyrrer hæmatopoiesis ved at påvirke hæmatopoietiske celler direkte og / eller gennem ændring af BM-nichen. Her beskriver vi en metode til at studere hæmatopoiesis i sundhed og malignitet gennem fænotypisk analyse af murine BM HSPC'er og stromale nichepopulationer ved flowcytometri. Vores metode beskriver de nødvendige trin til at berige BM-celler i endosteale og centrale BM-fraktioner samt de passende gating-strategier til at identificere de to nøglenichecelletyper, der er involveret i HSPC-regulering, endotelceller og mesenkymale stamceller. Den fænotypiske analyse, der foreslås her, kan kombineres med musemutanter, sygdomsmodeller og funktionelle assays for at karakterisere HSPC-rummet og dets niche.

Introduction

Flowcytometri er en uvurderlig metode til at karakterisere og prospektivt isolere immun- og hæmatopoietiske celler. Det bruges også i stigende grad til at analysere stromale og epitelpopulationer af forskellige væv. Den hæmatopoietiske stamcelle (HSC) har unikke egenskaber ved selvfornyelse og multipotens. Hos voksne pattedyr befinder HSC'er sig primært i knoglemarven (BM), hvor de modtager hvile- og overlevelsessignaler fra det omgivende mikromiljø eller niche1. HSC'er defineres formelt i henhold til funktionelle assays2. Ikke desto mindre har flere skelsættende papirer vist nytten af flowcytometri til at identificere HSC'er. Gennem brug af begrænsede celleoverflademarkører er det muligt at skelne hæmatopoietiske populationer, der er højt beriget i HSC'er3. Flowcytometri er derfor en central metode i stamcellefeltet. Det er blevet brugt i vid udstrækning til at evaluere virkningen af formodede nichecelletyper og nichefaktorer på HSC'er. Ved at kombinere flowcytometri med billeddannelse og funktionelle assays har det vist sig, at HSC'er understøttes kritisk af perivaskulære mesenkymale stamceller (MSC'er) og endotelceller (EC'er). BM MSC'er er en heterogen gruppe og har forskellige cytokinbidrag4, men det er veletableret, at leptinreceptor (LepR) + MSC'er er nøglenicheceller1. BM EC'er er også meget heterogene og kan være en del af sinusoider, arterioler og type H / overgangsbeholdere5. Forskellige undersøgelser har vist disse forskellige EC'ers nuancerede bidrag. For eksempel er endosteale sinusformede EC'er rumligt tættere på hvilende HSC'er6, mens ikke-vandrende HSC'er med lavere niveauer af reaktive iltarter er placeret nær arteriolære EC'er7. Den endosteale versus centrale placering af nicher er også meget vigtig. Endosteal type H-kar er forbundet med perivaskulære stromale celler, der går tabt med aldring, hvilket fører til tab af HSC'er8. Ved akut myeloid leukæmi udvides centrale EC'er, mens endosteale kar og endosteale HSC'er går tabt9.

De fleste undersøgelser på området har fokuseret på selve hæmatopoiesen og på cellens ydre regulering af HSC'er. Det er imidlertid i stigende grad blevet anerkendt, at der er behov for bedre at karakterisere de nicher, der regulerer andre forfædre, nemlig multipotente forfædre (MPP'er), især i betragtning af at de er de vigtigste drivkræfter for hæmatopoiesis i steady state10. I modsætning til en fast hierarkisk struktur har nylige undersøgelser vist, at hæmatopoiesis er et kontinuum, hvor HSC'er differentierer sig til forudindtagede MPP'er på et tidligt stadium11. MPP'er er blevet opkaldt efter forskellige klassificeringsordninger12, men et nyligt konsensuspapir fra International Society for Experimental Hematology (ISEH) foreslog, at MPP'er skulle diskrimineres som tidlige MPP'er og i henhold til deres lymfoide (MPP-Ly), megakaryocytiske og erythroid (MPP-Mk / E) og myeloide (MPP-G / M) bias13. Brugen af flowcytometri vil være afgørende for yderligere at studere betydningen af BM-nicher i reguleringen af disse populationer. Nuværende flowcytometrimetoder bruger variable gating-strategier til at differentiere HSPC'er og identificere stromale celler, nemlig EC'er, ved hjælp af inkonsekvente markører. Målet med den nuværende metode er at præsentere en enkel og reproducerbar arbejdsgang for BM-farvning for at identificere HSPC-subpopulationer, heterogene grupper af EC'er og LepR + MSC'er. Vi mener, at denne teknik, selvom den er sammenlignelig med tidligere rapporterede metoder (se for eksempel reference 14), giver en opdateret og let at implementere protokol til fænotypisk analyse af hæmatopoietiske celler i de to funktionelle marvområder, endosteal og central BM 8,15 samt BM stromale nicheceller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De dyr, der anvendes i denne protokol, blev anbragt på i3S-dyreanlægget under specifikke patogenfrie forhold i en 12 timers lys-mørk cyklus og temperaturkontrolleret miljø. Fri adgang til standard gnaver chow og vand blev leveret. Alle dyrene modtog human pleje i henhold til de kriterier, der er skitseret af Federation of European Laboratory Animal Science Associations for pleje og håndtering af forsøgsdyr (EU-direktiv 2010/63/EU). Den eksperimentelle procedure udført på dyrene (eutanasi) blev godkendt af i3S Animal Ethics Committee (ref. DD_2019_15) og Direção-Geral de Alimentação e Veterinária. Detaljer om de materialer, der anvendes i hele denne protokol, findes i materialetabellen.

1. Tilberedning af opløsninger og farvning af cocktails

  1. Fosfatbufret saltvand (PBS): Fem PBS tabletter opløses i 1 liter destilleret vand. Opbevares ved stuetemperatur (RT).
  2. PBS 2% føtalt bovint serum (FBS): Tilsæt 10 ml FBS til 500 ml PBS. Opbevares ved 4 °C.
  3. Lysisbuffer for røde blodlegemer (RBC) (1x): Tilsæt 50 ml 10x RBC-lysisbuffer til 450 ml deioniseret vand. Opbevares ved 4 °C.
  4. Collagenase IV og dispase II opløsning: 30 mg collagenase IV og 60 mg dispase II opløses i 30 ml HBSS til en 1 mg/ml collagenase IV og 2 mg/ml dispase II opløsning. Forbered frisk før brug.
  5. Opløsning til blokering af Fc-receptorer: Tilsæt 10 μL renset CD16/32-antistof mod mus til 490 μL PBS 2% FBS. Forbered frisk eller den foregående dag. Opbevares ved 4 °C indtil brug.
  6. Farvestoffarvningsopløsning til fluorescerende cellelevedygtighed: Tilsæt 2 μL fluorescerende cellelevedygtighedsfarvestof til 1 ml PBS. Forbered frisk før brug.
  7. Biotin afstamning cocktail: Bland 100 μL af hvert af følgende antistoffer: biotin anti-mus CD3ε, biotin anti-mus CD4, biotin anti-mus CD8a, biotin anti-mus / human CD11b, biotin anti-mus / human CD45R / B220, biotin anti-mus Ly-6G / Ly-6C (Gr-1) og biotin anti-mus TER-119 / erythroid celler. Opbevares ved 4 °C indtil brug.
  8. HSC'er primære farvningscocktail: Tilsæt 10 μL biotinafstamningscocktail, 10 μL immunofluorescerende mærket 510 anti-mus CD150 (SLAM), 10 μL phycoerythrin (PE) anti-mus Flk2 (CD135), 10 μL peridinin-klorofylprotein (PerCP) anti-mus Ly-6A / E (Sca-1), 10 μL PE / cyanin7 anti-mus CD48 og 10 μL allophycocyanin (APC) / cyanin7 anti-mus CD117 (c-kit) til 940 μL PBS 2% FBS. Forbered frisk eller den foregående dag. Opbevares ved 4 °C beskyttet mod lys indtil brug.
  9. Stromal primær farvningscocktail: Tilsæt 5 μL museleptin R-biotinyleret antistof, 6,7 μL PE-antimuseendomucinantistof, 10 μL PerCP-antimus Ly-6A/E (Sca-1), 4 μL PE/cyanin7-antimus CD31, 10 μL APC/cyanin7-antimuse-CD45 og 10 μL APC/cyanin7-antimuse-TER-119/erythroidceller til 954 μL PBS 2% FBS. Forbered frisk eller den foregående dag. Opbevares ved 4 °C beskyttet mod lys indtil brug.
  10. HSC'er/stromal sekundær farvningsopløsning: Tilsæt 1 μL APC-streptavidin til 1 ml PBS 2% FBS. Forbered frisk eller den foregående dag. Opbevares ved 4 °C beskyttet mod lys indtil brug.
  11. ECs farvningscocktail: Tilsæt 10 μL PE-antimuseendomucinantistof, 10 μL PerCP-antimus Ly-6A / E (Sca-1), 10 μL PE / cyanin7 anti-mus CD31, 10 μL Alexa Fluor 647 anti-mus CD54 / ICAM-1, 10 μL APC / cyanin7 anti-mus CD45 og 10 μL APC / cyanin7 anti-mus TER-119 / erythroidceller til 940 μL PBS 2% FBS. Forbered frisk eller den foregående dag. Opbevares ved 4 °C beskyttet mod lys indtil brug.
  12. DAPI-farvningsopløsning: Tilsæt 1 dråbe DAPI-reagens til 500 μL PBS. Forbered frisk før brug.

2. Udtagning af prøver

  1. Aflive dyret ved cervikal dislokation (detaljer om de dyr, der er brugt til at producere de data, der præsenteres i denne undersøgelse, findes i supplerende tabel 1). Placer dyret med maven op på en petriskål og spray med 70% ethanol. Lav et snit over maven ved hjælp af en saks og træk huden helt væk til anklerne.
  2. Grib det ene ben og skær ved hjælp af en saks i bunden (hvor leddet mellem benet og hoften er) for at adskille det fra dyret. Dette trin vil også tjene som en sekundær bekræftende metode til eutanasi. Fjern foden fra benet ved at skære i anklen. Placer benet i iskold PBS 2% FBS. Gentag om nødvendigt trinnet med det andet ben.
  3. Grib hoftebenet og brug saks skåret bag det for at adskille det fra dyret. Placer hoftebenet i iskold PBS 2% FBS. Gentag om nødvendigt trinnet med den anden hofteknogle.
  4. Anbring benet (e) og hoftebenet (e) i en petriskål, og rengør knoglerne med en steril skalpel. Adskil skinnebenet og lårbenet ved at skære ved knæet med skalpellen. Placer de rene knogler i iskold PBS 2% FBS.

3. Prøvebehandling til analyse af hæmatopoietiske cellepopulationer i total knoglemarv

  1. Placer en lårben eller skinneben i en mørtel med iskold PBS 2% FBS og knus knoglen ved forsigtigt at trykke den mod mørtelvæggen ved hjælp af støderen. BM-celler frigives i opløsningen indeholdt i mørtel.
  2. Den resulterende cellesuspension pipetteres op og ned ved hjælp af en 10 ml pipette for at homogenisere og overføre til et 50 ml rør gennem en 40 μm cellesil placeret oven på røret.
  3. Hvis de knuste knogler ikke ser hvide ud på dette tidspunkt, tilsættes mere PBS 2% FBS til mørtlen og gentages knusningen, og pipette derefter op og ned og overføre opløsningen til det samme 50 ml rør gennem den samme 40 μm cellesi.
  4. Skyl mørtlen med lidt mere PBS 2% FBS og overfør opløsningen til det samme 50 ml rør gennem den samme 40 μm cellesi. 50 ml glasset centrifugeres ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C.
  5. Supernatanten kasseres, og cellepelletsen resuspenderes i 5 ml RBC-lysisbuffer (1x) ved RT ved pipettering op og ned flere gange. Efter en 2 minutters inkubation ved RT tilsættes 15 ml PBS 2% FBS.
  6. 50 ml glasset centrifugeres ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C. Hvis cellepillen stadig ser rødlig ud, skal du gå tilbage til trin 3.5. Hvis ikke, kasseres supernatanten, pelletsen resuspenderes i 200 μliter PBS, og cellesuspensionen overføres til en brønd med en 96-brønds V-bundplade til farvning.
  7. Pladen centrifugeres ved 500 x g i 3 minutter ved 4 °C. Supernatanten kasseres ved at vende pladen på absorberende papir og opslæmme pelletsen i 200 μl fluorescerende farvestofopløsning. Inkuber pladen i 15 minutter ved RT i mørke.
  8. Centrifugeringsplade ved 500 x g i 3 minutter ved 4 °C. Supernatanten kasseres ved at vende pladen på absorberende papir og genopslæmme pelletten i 200 μL PBS 2% FBS for at vaske.
  9. Pladen centrifugeres ved 500 x g i 3 minutter ved 4 °C, supernatanten kasseres ved at vende pladen på absorberende papir, og pelletpen resuspenderes i 100 μl Fc-receptorblokerende opløsning. Pladen inkuberes i 10 minutter ved 4 °C beskyttet mod lys.
  10. Tilsæt 100 μL PBS 2% FBS og pipette op og ned et par gange for at vaske. Pladen centrifugeres ved 500 x g i 3 minutter ved 4 °C, supernatanten kasseres ved at vende pladen på absorberende papir, og pelletpen opslæmmes igen i 100 μL HSC's primære farvningscocktail. Inkuber pladen i 15 minutter ved RT i mørke.
  11. Tilsæt 100 μL PBS 2% FBS og pipette op og ned et par gange for at vaske. Pladen centrifugeres ved 500 x g i 3 minutter ved 4 °C, supernatanten kasseres ved at vende pladen på absorberende papir, og pelletsen resuspenderes i 100 μL sekundær HSC-farvningsopløsning. Inkuber pladen i 15 minutter ved RT i mørke.
  12. Tilsæt 100 μL PBS 2% FBS og pipette op og ned et par gange for at vaske. Pladen centrifugeres ved 500 x g i 3 minutter ved 4 °C, og supernatanten kasseres ved at vende pladen på absorberende papir.
  13. Resuspender pellet i 250 μL PBS 2% FBS og overfør cellesuspensionen til et 5 ml polystyren rundbundet rør gennem en 40 μm cellesi. Hold på is beskyttet mod lys indtil flowcytometrianalyse.
    BEMÆRK: Hvis du er interesseret i at bestemme det absolutte antal hæmatopoietiske cellepopulationer, tilsættes Calibritperler til polystyrenrørene før analyse i cytometeret16.

4. Prøvebehandling til analyse af stromale cellepopulationer i total knoglemarv

  1. Placer en lårben eller skinneben i en mørtel med iskold PBS 2% FBS og knus knoglen ved forsigtigt at trykke den mod mørtelvæggen ved hjælp af støderen. Klip spidsen af en P1000-spids med en saks, og brug den til at overføre alt indholdet af mørtlen til et 50 ml rør (passér ikke gennem en cellesi).
  2. 50 ml reagensglas centrifugeres ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C, supernatanten kasseres, og pelletpen resuspenderes i 3 ml collagenase IV og dispase II-opløsning. Inkuber glasset ved 37 °C i 40 min.
  3. Fyld røret op til 25 ml med PBS 2% FBS og hvirvel til blanding. Overfør indholdet af 50 ml røret til et nyt 50 ml rør gennem en 100 μm cellesi. Tilsæt 15 ml PBS 2% FBS til det gamle 50 ml rør og overfør opløsningen til det samme nye 50 ml rør gennem den samme cellesi. Der centrifugeres ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C.
  4. Supernatanten kasseres, og cellepelletsen resuspenderes i 5 ml RBC-lysisbuffer (1x) ved RT ved pipettering op og ned flere gange. Efter en 2 minutters inkubation ved RT tilsættes 15 ml PBS 2% FBS.
  5. 50 ml glasset centrifugeres ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C. Hvis cellepillen stadig ser rødlig ud, skal du gå tilbage til trin 4.4. Hvis ikke, kasseres supernatanten, pelletsen resuspenderes i 200 μL PBS 2% FBS, og cellesuspensionen overføres til en brønd med en 96-brønds V-bundplade til farvning. Pladen centrifugeres ved 500 x g i 3 minutter ved 4 °C.
  6. Hvis du udfører stromalfarvning, skal du fortsætte til trin 4.7. Hvis du udfører EF-farvning, skal du fortsætte til trin 4.12.
  7. Supernatanten kasseres ved at vende pladen på absorberende papir og genopslæmme pelletten i 100 μL stromal primærfarvningscocktail. Inkuber pladen i 15 minutter ved RT i mørke.
  8. Tilsæt 100 μL PBS 2% FBS og pipette op og ned et par gange for at vaske. Pladen centrifugeres ved 500 x g i 3 minutter ved 4 °C, supernatanten kasseres ved at vende pladen på absorberende papir, og pelletsen resuspenderes i 100 μl stromal sekundærfarvningsopløsning. Inkuber pladen i 15 minutter ved RT i mørke.
  9. Tilsæt 100 μL PBS 2% FBS og pipette op og ned et par gange for at vaske. Pladen centrifugeres ved 500 x g i 3 minutter ved 4 °C. Supernatanten kasseres ved at vende pladen på absorberende papir.
  10. Resuspender pellet i 250 μL PBS 2% FBS og overfør cellesuspensionen til et 5 ml polystyren rundbundet rør gennem en 40 μm cellesi. Hold på is beskyttet mod lys.
  11. Lige før du går til cytometeret, tilsættes 35 μL DAPI-farvningsopløsning til røret indeholdende cellesuspensionen til flowcytometrianalyse og inkuberer røret ved RT i 5 minutter i mørke. Efter denne inkubation skal du holde isen beskyttet mod lys indtil flowcytometrianalyse.
  12. Supernatanten kasseres ved at vende pladen på absorberende papir, og pelletsen opslæmmes igen i 100 μL ECs farvningscocktail. Inkuber pladen i 15 minutter ved RT i mørke.
  13. Tilsæt 100 μL PBS 2% FBS og pipette op og ned et par gange for at vaske. Pladen centrifugeres ved 500 x g i 3 minutter ved 4 °C.
  14. Supernatanten kasseres ved at vende pladen på absorberende papir. Resuspender pellet i 250 μL PBS 2% FBS og overfør cellesuspensionen til et 5 ml polystyren rundbundet rør gennem en 40 μm cellesi. Hold på is beskyttet mod lys.
  15. Lige før du går til cytometeret, tilsættes 35 μL DAPI-farvningsopløsning til røret indeholdende cellesuspensionen til flowcytometrianalyse og inkuberer røret ved RT i 5 minutter i mørke. Efter denne inkubation skal du holde isen beskyttet mod lys indtil flowcytometrianalyse.
    BEMÆRK: Hvis du er interesseret i at bestemme det absolutte antal stromale og endotelcellepopulationer, tilsættes Calibrite Beads til polystyrenrørene før analyse i cytometeret16.

5. Prøvebehandling til analyse af hæmatopoietiske cellepopulationer i knust og skyllet BM

  1. Placer en lårben på en petriskål og skær enderne af knoglen ved hjælp af en steril skalpel.
  2. Den centrale del af knoglen (diafysen) skylles ved at føre 100 μL PBS 2% FBS gennem indersiden af knoglen én gang fra hver side ved hjælp af en 0,5 ml insulinsprøjte uden dødt volumen og opsamling af opløsningen i et mikrocentrifugeglas indeholdende 1 ml PBS 2% FBS. Derefter overføres cellesuspensionen til et 50 ml rør mærket som skyllet BM indeholdende 4 ml PBS 2% FBS. Hold på is.
  3. Placer enderne af knoglen i en mørtel med iskold PBS 2% FBS og knus ved forsigtigt at trykke den mod mørtelvæggen ved hjælp af støderen. Den resulterende cellesuspension pipetteres op og ned ved hjælp af en 10 ml pipette til homogenisering og overførsel til et 50 ml rør mærket som knust BM gennem en 40 μm cellesi.
  4. Hvis den knuste knogle ikke ser hvid ud på dette tidspunkt, tilsættes mere PBS 2% FBS til mørtel og gentages knusningen. Derefter pipetteres op og ned og opløsningen overføres til det samme 50 ml rør (knust BM) gennem den samme 40 μm cellesi.
  5. Skyl mørtlen med lidt mere PBS 2% FBS og overfør opløsningen til det samme 50 ml rør (knust BM) gennem den samme 40 μm cellesi.
  6. De 50 ml glas, der svarer til de skyllede og knuste prøver, centrifugeres ved 500 x g i 3 minutter ved 4 °C.
  7. Følg trin 3.5 til 3.13 (afsnit 3) med de skyllede og knuste BM-prøver.

6. Forberedelse af enkeltfarvekontroller (SCC'er) til flowcytometrianalyse

  1. Trin 3.1 til 3.6 (punkt 3) følges med en ekstra knogle fra et af de dyr, der ikke anvendes til hovedanalysen, og den endelige cellesuspension overføres til et mikrocentrifugerør indeholdende 1 ml PBS 2% FBS i stedet for en brønd med en 96-brønds V-bundplade.
  2. Overfør 100 μL af cellesuspensionen til 8 brønde i en 96-brønds V-bundplade, 100 μL i et 5 ml polystyren rundbundet rør indeholdende 100 μL PBS 2% FBS mærket som DAPI SCC, og den resterende cellesuspension i et 5 ml polystyren rundbundet rør indeholdende 100 μL PBS 2% FBS mærket som ufarvet. Hold rørene på is beskyttet mod lys.
  3. Pladen centrifugeres ved 500 x g i 3 minutter ved 4 °C, og supernatanterne kasseres ved at vende pladen på absorberende papir.
  4. Resuspender en pellet i 100 μL fluorescerende farvestoffarvningsopløsning og de resterende i 100 μL PBS 2% FBS.
  5. Der tilsættes 0,5 μL af følgende antistoffer, bortset fra afstamningscocktailen af antistoffer, for hvilke der tilsættes 2 μL og PECy7 CD31-antistoffet, for hvilket der tilsættes 0,3 μL, til hvert af hullerne med cellesuspension i PBS 2% FBS (et antistof pr. hul, samme antistoffer anvendt i hovedanalysepanelerne eller samme fluoroforantistoffer med lignende fluorescensintensitet og epitopoverflod): biotin afstamning cocktail, immunofluorescent tagged 510 anti-mus CD150 (SLAM), PE anti-mus Flk2 (CD135), PerCP anti-mus Ly-6A / E (Sca-1), immunofluorescerende mærket 647 anti-mus CD54 / ICAM-1, PE / cyanin7 anti-mus CD48 og APC / cyanin7 anti-mus CD117 (c-kit). Inkuber pladen i 15 minutter ved RT i mørke.
  6. Tilsæt 100 μL PBS 2% FBS til hvert hul og pipette op og ned et par gange for at vaske. Pladen centrifugeres ved 500 x g i 3 minutter ved 4 °C, og supernatanterne kasseres ved at vende pladen på absorberende papir.
  7. Resuspender alle pellets bortset fra den, der svarer til cellerne inkuberet med afstamningscocktailen af antistoffer i 180 μL PBS 2% FBS, og overfør cellesuspensionerne til 5 ml polystyren rundbundede rør gennem 40 μm cellesi. Hold på is beskyttet mod lys indtil flowcytometrianalyse.
  8. Resuspender cellerne inkuberet med afstamningscocktailen af antistoffer i 100 μL HSC'er/stromal sekundær farvningsopløsning. Inkuber pladen i 15 minutter ved RT i mørke.
  9. Tilsæt 100 μL PBS 2% FBS og pipette op og ned et par gange for at vaske. Pladen centrifugeres ved 500 x g i 3 minutter ved 4 °C.
  10. Resuspender pellet i 180 μL PBS 2% FBS og overfør cellesuspensionen til et 5 ml polystyren rundbundet rør gennem en 40 μm cellesi. Hold på is beskyttet mod lys indtil flowcytometrianalyse.
  11. Lige før du går til cytometeret, tilsættes 35 μL DAPI-farvningsopløsning til DAPI SCC-røret og inkuberer røret ved RT i 5 minutter i mørke. Efter denne inkubation skal du holde isen beskyttet mod lys indtil flowcytometrianalyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Repræsentative plots af flowcytometrianalyse af HSC'er og MPP'er i en sund ung voksen C57Bl/6-mus er vist i figur 1. Gating strategien følger den seneste harmoniseringsnomenklatur foreslået af ISEH13. Når man analyserer virkningen af en forstyrrelse, såsom infektion eller kræft, er det vigtigt at bruge en kontrolmus som reference for normale porte. FMO-kontroller (fluorescens-minus-one) kan være særligt nyttige til at afgrænse grænserne for portene, men det skal bemærkes, at blind opsætning af gategrænser baseret på FMO'er kan udelade målceller eller inkludere ikke-målceller. For eksempel, jo lavere intensiteten af CD48-sættet er, desto højere er berigelsen for hvilende langsigtede HSC'er17. Desuden er forskellige egenskaber ved visse populationer afhængige af intensiteten af specifikke markører. For eksempel er HSC'er, der udtrykker højere CD150-niveauer, mere myeloid-biased18.

De frekvenser og absolutte tal, der er opnået ved analysen af hæmatopoietiske cellepopulationer anvendt på i alt fire dyr, er vist i tabel 1.

Figur 2 viser repræsentative plots af flowcytometrianalyse af EC'er og MSC'er. Størstedelen af hæmatopoietiske celler ekskluderes efter en Ter119/CD45 negativ selektion. LepR+ MSC'er kan derefter let identificeres, mens ægte EC'er kræver en efterfølgende udvælgelse af Sca-1+ celler. Mens Sca-1 ofte anvendes i immunofluorescensundersøgelser til specifikt at markere arterioler, er dette ikke tilfældet i flowcytometri, da denne teknik er meget følsom, og EC'er udtrykker altid en vis (selvom lav) grad af Sca-1 på celleoverfladen. Ved ikke kun at vælge Sca-1+ celler, vil andre ikke-endotelceller blive inkluderet i analysen, såsom CD31-ekspressive myeloide celler, hvilket kan påvirke kvantificeringen af EC'er i BM betydeligt. EC'er kan analyseres som en hel population eller baseret på specifikke markører, der delvist afslører deres heterogenitet. Endomucin i kombination med CD31 er meget nyttigt til at identificere det funktionelt forskellige type H-endotel15 (figur 2). Desuden er det tidligere blevet vist, at ICAM-1-ekspression tillader diskrimination mellem arteriolære (aBMEC'er) og sinusformede EC'er (sBMEC'er) (figur 3)20.

De frekvenser og absolutte tal, der er opnået ved analyse af MSC'er og endotelcellepopulationer anvendt på i alt fire dyr, er vist i tabel 2 og tabel 3.

Selvom BM-funktionelle områder ikke er klart afgrænset i tydelige histologiske regioner, er det veletableret, at knogleforende endosteale områder og centrale BM-områder er beriget i visse celletyper og begivenheder (f.eks. frigivelse af blodplader / pro-blodplader fra megakaryocytter i sinusoiderne i centrale BM-områder). Det er derfor nyttigt at berige for celletyper i centrale og engotale områder for separat at analysere disse to rum. Vi anvendte en metode til at skylle diafysen for at berige for centrale celletyper og knuse metafysen for at berige for endosteale celletyper (figur 4A). Kvantificeringen af aBMEC'er og sBMEC'er i skyllet (centralt) og knust (endostealt) BM-væv (figur 4B) validerer anvendeligheden af denne mekaniske isolationsmetode, da aBMEC'er er notorisk mere rigelige i endosteale regioner, og sinusoider er hyppigere i centrale BM-områder.

Figure 1
Figur 1: Analyse af hæmatopoietiske cellepopulationer. Repræsentative plots, der viser gating-strategien til flowcytometrianalyse af hæmatopoietiske cellepopulationer i total BM ved hjælp af den medfølgende software. Forkortelser: FSC-H = forward scatter - højde, FSC-A = forward scatter - areal, Lin = afstamning, LKS = Lin- Sca-1+ c-Kit+ hæmatopoietiske stamceller, MPP'erLy = multipotente stamceller - lymfoid, MPP'erG/M = multipotente stamfædre - granulocyt/makrofag, MPP'erMk/E = multipotente stamfædre - megakaryocyt/erythrocyt, MPP'er = multipotente stamceller, HSC'er = hæmatopoietiske stamceller. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Analyse af stromale cellepopulationer. Repræsentative plots, der viser gating-strategien for flowcytometrianalyse af stromale celler i total BM ved hjælp af den medfølgende software. Forkortelser: FSC-H = forward scatter - højde, FSC-A = forward scatter - area, MSC'er = mesenkymale stamceller, LepR = leptinreceptor, EC'er = endotelceller. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Analyse af endotelceller. Repræsentative plots, der viser gating-strategien for flowcytometrianalysen af EC'er i total BM ved hjælp af den medfølgende software. Forkortelser: FSC-H = forward scatter - højde, FSC-A = forward scatter - area, ECs = endotelceller, aBMECs = arterielle knoglemarvsendotelceller, sBMECs = sinusformede knoglemarvsendotelceller. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Analyse af EF-populationer i centrale og engolaterale områder . (A) Repræsentation af de forskellige dele af en murin lang knogle. B) Plots, der viser de statistisk signifikante forskelle i frekvenserne af CD31+ endotelceller i aBMEC'er (beriget i den knuste prøve) og sBMEC'er (beriget i den skyllede prøve). Hver prik repræsenterer en mus (n = 9), og prøver parres. Den statistiske test, der blev brugt, var den parrede T-test. betegner tosidet P-værdi < 0,0001. Klik her for at se en større version af denne figur.

Cellepopulation Gennemsnit af frekvens af levende BM-celler ± SD (n=4) i total BM Gennemsnit af celletal ± SD (n = 4) pr. femur i total BM Gennemsnit af freq. af BM levende celler ± SD (n = 4) i endosteal BM Gennemsnit af freq. af BM levende celler ± SD (n = 4) i central BM
Lin- 3.05 ± 0.13 337610 ± 59414 3,56 ± 0,21 3.53 ± 0.19
LKS 0,096 ± 0,026 10206 ± 1794 0,102 ± 0,025 0,133 ± 0,022
MPP'erLy 0,058 ± 0,011 6141 ± 716 0,058 ± 0,011 0,085 ± 0,007
MPP'erG/M 0,011 ± 0,004 1233 ± 326 0,013 ± 0,003 0,014 ± 0,003
MPP'erMk/E 0,0010 ± 0,0002 113 ± 21 0,0014 ± 0,0004 0,0012 ± 0,0005
MPP'er 0,0092 ± 0,0045 940 ± 374 0,0105 ± 0,0048 0,0118 ± 0,0061
HSC'er 0,0054 ± 0,0023 572 ± 191 0,0055 ± 0,0023 0,0059 ± 0,0016

Tabel 1: Kvantitative data for hæmatopoietiske cellepopulationer. Gennemsnit af frekvens i BM levende celler af de forskellige hæmatopoietiske cellepopulationer analyseret i total, endosteal og central BM og celletal pr. lårben i total BM. Data vist som gennemsnit ± standardafvigelse (SD), n = 4.

Cellepopulation Gennemsnit af frekvens af BM levende celler ± SD (n = 4) Gennemsnit af celletal ± SD (n = 4) pr. skinneben
Ecs 0,080 ± 0,011 4523 ± 1521
Type H EC'er 0,041 ± 0,006 2299 ± 752
EF-systemer af type L 0,038 ± 0,005 2103 ± 736
MSC'er 0,180 ± 0,048 10270 ± 4282

Tabel 2: Kvantitative data for stromale cellepopulationer. Gennemsnit af frekvens i BM levende celler og celletal pr. skinneben for de forskellige stromale cellepopulationer analyseret i total BM. Data vist som gennemsnit ± standardafvigelse (SD), n = 4.

Cellepopulation Gennemsnit af frekvens af BM levende celler ± SD (n = 4) Gennemsnit af celletal ± SD (n = 4) pr. skinneben
Ecs 0,064 ± 0,006 2255 ± 150
aBMEC'er 0,041 ± 0,010 1419 ± 286
sBMEC'er 0,023 ± 0,006 819 ± 250

Tabel 3: Kvantitative data for endotelcellepopulationer. Gennemsnit af frekvens i BM levende celler og celletal pr. skinneben for de forskellige endotelcellepopulationer analyseret i total BM. Data vist som gennemsnit ± standardafvigelse (SD), n = 4.

Supplerende tabel 1: Oplysninger om de dyr, der er anvendt i undersøgelsen. Stamme, køn, alder og vægt af de dyr, der er anvendt til at producere dataene vist i figur 1, figur 2 og figur 3 og tabel 1, tabel 2 og tabel 3. Forkortelse: g = gram. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mens den beskrevne protokol er enkel og nem at udføre, bør der lægges særlig vægt på specifikke trin. For eksempel, når der opnås skyllet BM (trin 5.2), bør volumen eller antal gange, der er angivet for at passere PBS 2% FBS gennem indersiden af den centrale del af knoglen, ikke overskrides, da dette kan resultere i signifikant kontaminering af den skyllede prøve med endosteale cellepopulationer.

Ændringer i protokollen kan foretages for at lette dens udførelse af efterforskeren. Ved prøveekstraktion (sektion 2) kan ben og/eller knogler opbevares i PBS 2% FBS ved 4 °C i op til 24 timer, før prøvebehandling og analyse fortsættes. Denne tid bør dog minimeres, når det er muligt. Under inkubation med HSCs primære farvningscocktail (trin 3.10) og sekundær farvningscocktail (trin 3.11), mens en 15 minutters inkubation ved RT er angivet, kan denne byttes til en 30 minutters inkubation ved 4 °C.

Det samme gælder inkubation med stromal primær farvningscocktail (trin 4.7), stromal sekundær farvningsopløsning (trin 4.8), ECs farvningscocktail (trin 4.12) og inkubation med antistoffer mod SCC'er (trin 6.5); mens en 15 minutters inkubation ved RT er indiceret, kan dette byttes til en 30 minutters inkubation ved 4 °C.

En anden protokol for BM-isolering ved centrifugering af murin lange knogler blev for nylig beskrevet21. Mens denne protokol præsenterer fordelen ved hurtigere isolering af BM-cellerne, giver protokollen beskrevet her mulighed for analyse af cellepopulationer, der bor i forskellige områder af knoglerne.

En særlig begrænsning af den nuværende metode er, at den udelukkende er baseret på fænotypisk analyse ved flowcytometri. Dette er særlig relevant i forbindelse med HSC'er, som ville kræve yderligere funktionel validering. Denne metode kan imidlertid kombineres med sortering af berigede populationer og undersøgelse af disse celler i langsigtede rekonstitutionsassays og in vitro koloniassays.

Med hensyn til stromalcelleanalyse, navnlig MSC'er og EC'er, er det tidligere blevet vist, at på trods af optimeringen af BM-behandling til flowcytometrianalyse er et betydeligt antal celler ikke isoleret fra vævet, og der er en suboptimal kvantificering af disse celler sammenlignet med andre metoder såsom helmonteret billeddannelse19. Ikke desto mindre er flowcytometri yderst nyttig til at udføre den kvantitative og kvalitative analyse af BM EC'er og MSC'er og til prospektivt at isolere dem til funktionelle og ekspressionsassays.

En anden begrænsning af den nuværende metode er brugen af en mekanisk teknik til at adskille endosteale og centrale fraktioner, som til en vis grad uundgåeligt er forurenet af celler fra det andet rum. Ikke desto mindre viser kvantificeringen af aBMEC'er og sBMEC'er som forklaret i afsnittet om repræsentative resultater, at den mekaniske isolering er en robust metode til berigelse for cellepopulationer i disse områder.

Den beskrevne metode muliggør undersøgelse af hæmatopoiesis i forskellige indstillinger og stromale nicher af HSPC'er. Den fænotypiske analyse, der her præsenteres, kan være nyttig til at studere HSPC-nicher, når de kombineres med specifikke musemutanter, nemlig EC- og MSC Cre-linjer, der muliggør selektiv manipulation af genekspression i disse populationer. For eksempel kan linjerne Cdh5 (PAC) -CreERT222 og LepR-Cre23 bruges til at inducere ekspression af visse gener selektivt i henholdsvis EC'er og MSC'er. Metoden er nyttig til at studere deres indvirkning på stromale rum såvel som på HSPC'er. Tilgængelige Cre-linjer til undersøgelse af vaskulær BM-niche er for nylig blevet gennemgået i Mosteo et al.5. Den prospektive undersøgelse af LT-HSC'er uden transplantation har været begrænset af manglen på robuste reporterlinjer. Den nyligt beskrevne Mds1GFP/+Flt3Cre 6 har imidlertid vist sig at opnå høj berigelse af LT-HSC'er og god diskrimination fra downstream-forfædre, der udtrykker Flt324. Kombinationen af denne muselinje og andre hæmatopoietiske stammer, såsom Vav-iCre25, med flowcytometri vil muliggøre undersøgelsen af HSPC'er og deres forhold til nichen. Hæmatologiske maligniteter er ofte forbundet med forstyrrelsen af hæmatopoiesis fra de tidligste stadier, hvilket afspejles i ændringen af frekvenserne af hæmatopoietiske stam- og stamceller og af stromale populationer9 , som vi her har præsenteret for sunde C57Bl/6. Fremtidige undersøgelser bør undersøge anvendelsen af lignende metoder som den, der her er beskrevet ved hjælp af nyt udstyr baseret på spektralstrømningscytometri, der muliggør en mere omfattende fænotypisk karakterisering gennem analyse af flere markører (over 30 samtidigt).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.

Acknowledgments

LM blev støttet af et tilskud fra Lady Tata Memorial Trust. JR blev støttet af et ph.d.-stipendium fra Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT; FCT-stipendium UI/BD/150833/2021). ML blev støttet af et ph.d.-stipendium fra FCT (FCT fellowship 2021.04773.BD). DD blev støttet af tilskud fra American Society of Hematology, Pablove Foundation, FCT (EXPL/MED-ONC/0522/2021) og Portuguese Society of Hematology. Vi takker støtten fra Dr. Catarina Meireles og Emilia Cardoso fra Tracy-anlægget på i3s.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD54/ICAM-1 antibody BioLegend 116114
APC Streptavidin BioLegend 405207
APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) antibody BioLegend 105826
APC/Cyanine7 anti-mouse CD45 antibody BioLegend 103116
APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody BioLegend 116223
Biotin anti-mouse CD3ε antibody BioLegend 100304
Biotin anti-mouse CD4 antibody BioLegend 100404
Biotin anti-mouse CD8a antibody BioLegend 100704
Biotin anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antibody BioLegend 108404
Biotin anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody BioLegend 116204
Biotin anti-mouse/human CD11b antibody BioLegend 101204
Biotin anti-mouse/human CD45R/B220 antibody BioLegend 103204
Brilliant Violet 510 anti-mouse CD150 (SLAM) antibody BioLegend 115929
Calibrite 2 Color Beads BD Biosciences 349502
Collagenase IV Merck Life Science C1889
Dispase II Merck Life Science D4693
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin ThermoFisher Scientific 10500064
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) ThermoFisher Scientific 14175095
Mouse Leptin R Biotinylated Antibody R&D systems BAF497
NucBlue Fixed Cell Reagent (DAPI) ThermoFisher Scientific R37606 DAPI reagent
PE anti-mouse endomucin antibody ThermoFisher Scientific 12-5851-82
PE anti-mouse Flk2 (CD135) ThermoFisher Scientific 12-1351-82
PE/Cyanine7 anti-mouse CD31 antibody BioLegend 102524
PE/Cyanine7 anti-mouse CD48 antibody BioLegend 103424
PerCP anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) antibody BioLegend 108122
Phosphate-buffered saline (PBS) tablets Merck Life Science P4417
Purified anti-mouse CD16/32 antibody BioLegend 101302
RBC lysis buffer 10x BioLegend 420302
Zombie Violet Fixable Viability Dye BioLegend 423114 fluorescent dye

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Comazzetto, S., Shen, B., Morrison, S. J. Niches that regulate stem cells and hematopoiesis in adult bone marrow. Developmental Cell. 56 (13), 1848-1860 (2021).
  2. Purton, L. E., Scadden, D. T. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell Stem Cell. 1 (3), 263-270 (2007).
  3. Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
  4. Asada, N., et al. Differential cytokine contributions of perivascular haematopoietic stem cell niches. Nature Cell Biology. 19 (3), 214-223 (2017).
  5. Mosteo, L., et al. The dynamic interface between the bone marrow vascular niche and hematopoietic stem cells in myeloid malignancy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 635189 (2021).
  6. Christodoulou, C., et al. Live-animal imaging of native haematopoietic stem and progenitor cells. Nature. 578 (7794), 278-283 (2020).
  7. Itkin, T., et al. Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis. Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).
  8. Kusumbe, A. P., et al. Age-dependent modulation of vascular niches for haematopoietic stem cells. Nature. 532 (7599), 380-384 (2016).
  9. Duarte, D., et al. Inhibition of endosteal vascular niche remodeling rescues hematopoietic stem cell loss in AML. Cell Stem Cell. 22 (1), 64-77 (2018).
  10. Busch, K., et al. Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo. Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).
  11. Laurenti, E., Gottgens, B. From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).
  12. Pietras, E. M., et al. Functionally distinct subsets of lineage-biased multipotent progenitors control blood production in normal and regenerative conditions. Cell Stem Cell. 17 (1), 35-46 (2015).
  13. Challen, G. A., Pietras, E. M., Wallscheid, N. C., Signer, R. A. J. Simplified murine multipotent progenitor isolation scheme: Establishing a consensus approach for multipotent progenitor identification. Experimental Hematology. 104, 55-63 (2021).
  14. Mayle, A., Luo, M., Jeong, M., Goodell, M. A. Flow cytometry analysis of murine hematopoietic stem cells. Cytometry A. 83 (1), 27-37 (2013).
  15. Kusumbe, A. P., Ramasamy, S. K., Adams, R. H. Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone. Nature. 507 (7492), 323-328 (2014).
  16. Hawkins, E. D., et al. Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data. Nature Protocols. 2 (9), 2057-2067 (2007).
  17. Akinduro, O., et al. Proliferation dynamics of acute myeloid leukaemia and haematopoietic progenitors competing for bone marrow space. Nature Communications. 9 (1), 519 (2018).
  18. Beerman, I., et al. Functionally distinct hematopoietic stem cells modulate hematopoietic lineage potential during aging by a mechanism of clonal expansion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (12), 5465-5470 (2010).
  19. Gomariz, A., et al. Quantitative spatial analysis of haematopoiesis-regulating stromal cells in the bone marrow microenvironment by 3D microscopy. Nature Communications. 9 (1), 2532 (2018).
  20. Xu, C., et al. Stem cell factor is selectively secreted by arterial endothelial cells in bone marrow. Nature Communications. 9 (1), 2449 (2018).
  21. Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936 (2016).
  22. Wang, Y., et al. Ephrin-B2 controls VEGF-induced angiogenesis and lymphangiogenesis. Nature. 465 (7297), 483-486 (2010).
  23. DeFalco, J., et al. Virus-assisted mapping of neural inputs to a feeding center in the hypothalamus. Science. 291 (5513), 2608-2613 (2001).
  24. Boyer, S. W., Schroeder, A. V., Smith-Berdan, S., Forsberg, E. C. All hematopoietic cells develop from hematopoietic stem cells through Flk2/Flt3-positive progenitor cells. Cell Stem Cell. 9 (1), 64-73 (2011).
  25. Siegemund, S., Shepherd, J., Xiao, C., Sauer, K. hCD2-iCre and Vav-iCre mediated gene recombination patterns in murine hematopoietic cells. PLoS One. 10 (4), 0124661 (2015).

Tags

Tilbagetrækning nr. 187
Flowcytometrianalyse af murinknoglemarv, hæmatopoietisk stam- og stamceller og stromale nicheceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mosteo, L., Reis, J., Rocha, L.,… More

Mosteo, L., Reis, J., Rocha, L., Lopes, M., Duarte, D. Flow Cytometry Analysis of Murine Bone Marrow Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and Stromal Niche Cells. J. Vis. Exp. (187), e64248, doi:10.3791/64248 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter