Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تصوير فائق الدقة للبروتينات المفرزة البكتيرية باستخدام توسيع الشفرة الوراثية

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/64382
Automatic Translation
1, 1
1Biochemistry & Molecular Biology, University of Texas Medical Branch

Summary

توفر هذه المقالة بروتوكولا مباشرا وواضحا لتسمية المستجيبات المفرزة للسالمونيلا باستخدام موقع توسيع الشفرة الوراثية (GCE) على وجه التحديد وتصوير التوطين تحت الخلوي للبروتينات المفرزة في خلايا هيلا باستخدام مجهر إعادة البناء البصري العشوائي المباشر (dSTORM)

Abstract

تمكن أنظمة الإفراز من النوع الثالث (T3SSs) البكتيريا سالبة الجرام من حقن بطارية من البروتينات المستجيبة مباشرة في السيتوسول للخلايا المضيفة حقيقية النواة. عند الدخول ، تقوم البروتينات المستجيبة المحقونة بتعديل مسارات الإشارات حقيقية النواة بشكل تعاوني وإعادة برمجة الوظائف الخلوية ، مما يتيح دخول البكتيريا وبقائها. توفر مراقبة وتوطين هذه البروتينات المستجيبة المفرزة في سياق العدوى بصمة لتحديد الواجهة الديناميكية للتفاعلات بين المضيف والممرض. ومع ذلك ، فإن وضع العلامات وتصوير البروتينات البكتيرية في الخلايا المضيفة دون تعطيل هيكلها / وظيفتها يمثل تحديا تقنيا.

إن بناء بروتينات الاندماج الفلورية لا يحل هذه المشكلة ، لأن بروتينات الاندماج تحشر الجهاز الإفرازي وبالتالي لا يتم إفرازها. للتغلب على هذه العقبات ، استخدمنا مؤخرا طريقة لوضع العلامات الفلورية الخاصة بالموقع على المستجيبات المفرزة البكتيرية ، بالإضافة إلى البروتينات الأخرى التي يصعب تصنيفها ، باستخدام توسيع الشفرة الوراثية (GCE). يوفر هذا البحث بروتوكولا كاملا خطوة بخطوة لتسمية المستجيبات المفرزة للسالمونيلا باستخدام موقع GCE على وجه التحديد ، متبوعا بتوجيهات لتصوير التوطين تحت الخلوي للبروتينات المفرزة في خلايا HeLa باستخدام مجهر إعادة البناء البصري العشوائي المباشر (dSTORM)

تشير النتائج الحديثة إلى أن دمج الأحماض الأمينية غير المتعارف عليها (ncAAs) عبر GCE ، متبوعا بوضع العلامات المتعامدة الحيوية مع الأصباغ المحتوية على التترازين ، هو تقنية قابلة للتطبيق لوضع العلامات الانتقائية وتصور البروتينات المفرزة البكتيرية وتحليل الصور اللاحقة في المضيف. الهدف من هذه المقالة هو توفير بروتوكول مباشر وواضح يمكن استخدامه من قبل الباحثين المهتمين بإجراء تصوير فائق الدقة باستخدام GCE لدراسة العمليات البيولوجية المختلفة في البكتيريا والفيروسات ، وكذلك التفاعلات بين المضيف والممرض.

Introduction

منذ فترة طويلة تعتبر الالتهابات البكتيرية خطرا خطيرا على صحة الإنسان. تستخدم مسببات الأمراض أنظمة دفاعية متطورة للغاية وقوية للغاية ومعقدة ، بالإضافة إلى مجموعة متنوعة من عوامل الفوعة البكتيرية (يشار إليها باسم البروتينات المستجيبة) للتهرب من الاستجابات المناعية للمضيف وإنشاء العدوى 1,2. ومع ذلك ، فإن الآليات الجزيئية الكامنة وراء هذه الأنظمة ودور البروتينات المستجيبة الفردية لا تزال غير معروفة إلى حد كبير بسبب ندرة الأساليب المناسبة للمتابعة المباشرة لمكونات البروتين الحاسمة والمستجيبات في الخلايا المضيفة أثناء التسبب في المرض.

أحد الأمثلة النموذجية هو السالمونيلا المعوية المصلية التيفية ، والتي تسبب التهاب المعدة والأمعاء الحاد. السالمونيلا يستخدم التيفيموريوم أنظمة إفراز من النوع الثالث (T3SS) لحقن مجموعة متنوعة من البروتينات المستجيبة مباشرة في الخلايا المضيفة. بمجرد دخول السالمونيلا إلى الخلية المضيفة ، فإنها تتواجد في حجرة حمضية مرتبطة بالغشاء ، تسمى الفجوة المحتوية على السالمونيلا (SCV) 3,4. ينشط الرقم الهيدروجيني الحمضي ل SCV جزيرة السالمونيلا المسببة للأمراض 2 (SPI-2) المشفرة T3SS وينقل وابل من 20 أو أكثر من البروتينات المستجيبة عبر الغشاء الفراغي إلى السيتوسول المضيف5،6،7،8. داخل المضيف ، تتلاعب هذه الكوكتيلات المعقدة من البروتينات المستجيبة بشكل منسق بمسارات إشارات الخلية المضيفة ، مما يؤدي إلى تكوين هياكل غشاء أنبوبي ديناميكية ومعقدة للغاية تمتد من SCV على طول الأنابيب الدقيقة ، والتي تسمى خيوط السالمونيلا التي يسببها (SIFs) ، والتي تمكن السالمونيلا من البقاء على قيد الحياة والتكاثر داخل الخلايا المضيفة9،10،11.

توفر طرق تصور وتتبع ومراقبة توطين المستجيبات البكتيرية ، وفحص الاتجار بها وتفاعلاتها داخل الخلايا المضيفة ، نظرة ثاقبة مهمة للآليات التي تقوم عليها الإمراضات البكتيرية. ثبت أن وضع العلامات وتوطين بروتينات المستجيب T3SS المفرزة في السالمونيلا داخل الخلايا المضيفة يمثل تحديا تقنيا12,13 ؛ ومع ذلك ، فإن تطوير البروتينات الفلورية المشفرة وراثيا قد حول قدرتنا على دراسة وتصور البروتينات داخل الأنظمة الحية. ومع ذلك ، فإن حجم البروتينات الفلورية (~ 25-30 كيلو دالتون)15 غالبا ما يكون مشابها أو أكبر من حجم البروتين محل الاهتمام (POI ؛ على سبيل المثال ، 13.65 كيلو دالتون ل SsaP ، 37.4 كيلو دالتون ل SifA). في الواقع ، غالبا ما يمنع وضع العلامات على البروتين الفلوري للمستجيبات إفراز المستجيب المسمى ويحشر T3SS14.

علاوة على ذلك ، فإن البروتينات الفلورية أقل استقرارا وتنبعث منها عدد قليل من الفوتونات قبل التبييض الضوئي ، مما يحد من استخدامها في التقنيات المجهرية فائقة الدقة16،17،18 ، لا سيما في الفحص المجهري لتوطين التنشيط الضوئي (PALM) ، STORM ، والمجهر المستنفد للانبعاثات المحفزة (STED). في حين أن الخصائص الفيزيائية الضوئية للأصباغ الفلورية العضوية تتفوق على تلك الخاصة بالبروتينات الفلورية ، فإن الطرق / التقنيات مثل CLIP / SNAP19,20 و Split-GFP 21 و ReAsH / FlAsH 22,23 و HA-Tags 24,25 تتطلب بروتينا إضافيا أو ملحقا ببتيديا قد يضعف وظيفة بنية البروتين المستجيب محل الاهتمام من خلال التدخل في التعديل أو الاتجار بعد الترجمة. تتضمن الطريقة البديلة التي تقلل من تعديل البروتين الضروري دمج NCAAs في POI أثناء الترجمة من خلال GCE. NCAAs إما فلورية أو يمكن صنعها فلورية عن طريق النقر على الكيمياء12،13،26،27،28.

باستخدام GCE ، يمكن إدخال NCAAs مع مجموعات صغيرة ووظيفية ومتعامدة حيويا (مثل مجموعة أزيد أو سيكلوبيروبين أو سيكلوكتين) في أي مكان تقريبا في البروتين المستهدف. في هذه الاستراتيجية، يتم تبديل كودون أصلي بكودون نادر مثل كودون توقف الكهرمان (TAG) في موضع محدد في جين POI. يتم التعبير عن البروتين المعدل لاحقا في الخلايا جنبا إلى جنب مع زوج متعامد من الأمينواسيل-الحمض النووي الريبي / الحمض النووي الريبي المتعامد. تم تصميم الموقع النشط لتخليق tRNA لاستقبال ncAA واحد معين فقط ، والذي يتم ربطه تساهميا بعد ذلك بنهاية 3'-end من tRNA الذي يتعرف على كودون العنبر. يتم إدخال ncAA ببساطة في وسط النمو ، ولكن يجب أن تمتصه الخلية وتصل إلى السيتوسول حيث يمكن ل aminoacyl-tRNA synthetase (aaRS) ربطه بالحمض النووي الريبي المتعامد. ثم يتم دمجها في نقطة الاهتمام في الموقع المحدد (انظر الشكل 1)12. وبالتالي ، تتيح GCE دمج عدد كبير من المجموعات التفاعلية المتعامدة الحيوية مثل الكيتون ، والأزيد ، والألكاين ، والسيكلوكتين ، والترانسسيكلوكتين ، والتترازين ، والنوربونين ، و α ، والأميد غير المشبع β ، و bicyclo [6.1.0] -nonyne في نقطة الاهتمام ، مما قد يتغلب على قيود طرق وضع العلامات على البروتين التقليدية12،26،27،28.

فتحت الاتجاهات الناشئة الحديثة في تقنيات التصوير فائقة الدقة آفاقا جديدة للتحقيق في الهياكل البيولوجية على المستوى الجزيئي. على وجه الخصوص ، أصبحت STORM ، وهي تقنية أحادية الجزيء ، قائمة على التوطين ، فائقة الدقة ، أداة لا تقدر بثمن لتصور الهياكل الخلوية حتى ~ 20-30 نانومتر وهي قادرة على التحقيق في العمليات البيولوجية جزيء واحد في كل مرة ، وبالتالي اكتشاف أدوار الجزيئات داخل الخلايا التي لم تكن معروفة بعد في الدراسات التقليدية ذات المتوسطالجماعي 13 . تتطلب تقنيات الجزيء الواحد والدقة الفائقة علامة صغيرة مع فلوروفورات عضوية ساطعة وقابلة للضوء للحصول على أفضل دقة. لقد أثبتنا مؤخرا أنه يمكن استخدام GCE لدمج مجسات مناسبة للتصوير فائق الدقة12.

اثنان من أفضل الخيارات لوضع العلامات على البروتين في الخلايا هما bicyclo [6.1.0] nonynelysine (BCN) و trans-cyclooctene-lysine (TCO ؛ كما هو موضح في الشكل 1) ، والتي يمكن ترميزها وراثيا باستخدام متغير من زوج tRNA / synthetase (يسمى هنا tRNA Pyl / PylRSAF) ، حيث يمثلPyl pyrrolysine ، ويمثل AF متحولا مزدوجا مصمما بشكل عقلاني (Y306A ، Y384F) مشتقا من Methanosarcina mazei الذي يشفر بشكل طبيعي pyrrolysine12 ، 29,30,31. من خلال تفاعل Diels-Alder cycloaddition (SPIEDAC) العكسي المعزز بالإجهاد ، تتفاعل هذه الأحماض الأمينية بشكل انتقائي كيميائيا مع اتحادات التترازين (الشكل 1)12،30،31. تفاعلات الإضافة الحلقية هذه سريعة بشكل استثنائي ومتوافقة مع الخلايا الحية. قد تكون أيضا فلورية ، إذا تم تشغيل الفلوروفور المناسب مع مجموعة Tetrazine12،26،32. تقدم هذه الورقة بروتوكولا محسنا لمراقبة ديناميكيات المستجيبات البكتيرية التي يتم توصيلها إلى الخلايا المضيفة باستخدام GCE ، يليها توطين تحت الخلية للبروتينات المفرزة في خلايا HeLa باستخدام dSTORM. تشير النتائج إلى أن دمج NCAA عبر GCE ، متبوعا بتفاعل نقر مع الأصباغ الحاملة للتترازين الفلورية ، يمثل طريقة متعددة الاستخدامات لوضع العلامات الانتقائية ، وتصور البروتينات المفرزة ، والتوطين دون الخلوي اللاحق في المضيف. ومع ذلك ، يمكن تعديل جميع المكونات والإجراءات المفصلة هنا أو استبدالها بحيث يمكن تكييف نظام الحملة العالمية للتعليم للتحقيق في الأسئلة البيولوجية الأخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. بناء البلازميد

  1. استنساخ الجين الذي يعبر عن POI إلى تعبير بلازميد (على سبيل المثال ، pET28a-sseJ 10TAG) الذي يعبر عن POI في E. coli BL21 (DE3). تسهل هذه الخطوة تحديد أن المسوخ وظيفية.
  2. لتصور المستجيبات المفرزة السالمونيلا في الخلايا المضيفة ، قم ببناء تعبير بلازميد (pWSK29-sseJ-HA) يعبر عن POI SseJ المستهدف تحت سيطرة المروج الأصلي ، كما هو موضح في التقارير السابقة7،12،24. باستخدام الطفرات الموجهة للموقع ، استبدل كودون فينيل ألانين -10 بكودون كهرماني (TAG) في SseJ (pWSK29-sseJ 10TAG-HA) ، مع ضمان شكل AAT-TAG-ACT33،34.
  3. بالإضافة إلى البلازميدات المذكورة أعلاه ، من أجل الدمج الجيني ل trans-cyclooct-2-en-L-lysine (TCO * A) في POI ، استخدم تعبيرا آخر plasmid (pEVOL-PylRS-AF)31 يحتوي على زوج tRNA / synthetase المتطور (tRNAPyl / PylRSAF ) الجينات المشفرة في البلازميد pEVOL.
    ملاحظة: يرد وصف مفصل لبروتوكولات البلازميد والاستنساخ في التقرير السابق30,31.
  4. استخدم مجموعات تحضير البلازميد المتاحة تجاريا للحصول على الحمض النووي البلازميد عالي الجودة. بالنسبة للحمض النووي المنقى ، فإن النسبة المثلى 260/280 هي ~ 1.8. تحقق من نقاء الحمض النووي باستخدام 1 ٪ هلام الاغاروز الكهربائي ، إذا لزم الأمر.

2. إعداد الثقافة البكتيرية

  1. الحصول على محولات مزدوجة لاختبار أن الطافر يعمل في الإشريكية القولونية
    1. خذ الخلايا المختصة BL21 من -80 درجة مئوية وقم بإذابة الثلج لمدة 20-30 دقيقة تقريبا.
    2. امزج 1-5 ميكرولتر من كل بلازميد (~ 50 نانوغرام من pEVOL-PylRS-AF و pET28a-sseJ 10TAG) مع 200 ميكرولتر من خلايا BL21 المختصة كيميائيا في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. خلط الخلايا المختصة وخليط البلازميد بلطف. احتضان لمدة 30 دقيقة على الجليد.
    3. صدمة حرارية لأنبوب الطرد المركزي الدقيق في حمام مائي 42 درجة مئوية لمدة 45 ثانية. ضع الأنابيب مرة أخرى على الثلج لمدة 2 دقيقة.
    4. أضف 1 مل من وسط LB الدافئ إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق وانقل الخليط بسرعة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في شاكر عند 250 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة. ضع جزءا من أو كل الخلايا المحولة على ألواح أجار LB التي تحتوي على مضادات حيوية مناسبة. احتضان الأطباق طوال الليل على حرارة 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: في هذا البروتوكول، استخدم 35 ميكروغرام/مل كلورامفينيكول و50 ميكروغرام/مل كاناميسين لاختيار pEVOL-PylRS-AF وpET28a-sseJ 10TAG، على التوالي. في خطوة التحويل ، قم بتقييم التحول الناجح باستخدام عناصر التحكم السلبية والإيجابية.
  2. نقل الطافر إلى السالمونيلا لتصور المستجيبات المفرزة السالمونيلا في الخلايا المضيفة:
    1. أضف 2-3 ميكرولتر من كل من pEVOL-PylRS-AF و pWSK29-sseJ 10TAG إلى 40-60 ميكرولتر من سلالة السالمونيلا التيفيموريوم 14028 ذات الكفاءة الكهربائية في أنبوب طرد مركزي دقيق مبرد. اخلطي الخليط برفق مع ماصة.
    2. نقل خليط التثقيب الكهربائي إلى كوفيت مبرد (فجوة قطب كهربائي 0.2 سم) ؛ اضبط إعدادات التثقيب الكهربائي على 2.5 كيلو فولت ، 200 Ω ، 25 ميكروفولت. ضع الكوفيت داخل غرفة التثقيب الكهربائي. تأكد من أن قطب الغرفة يتلامس بقوة مع كوفيت النبض الصغير.
    3. اضغط مع الاستمرار على زر النبض حتى يصدر صوتا.
    4. أضف على الفور 1 مل من وسط LB الدافئ إلى الكوفيت. انقل المحتويات بالكامل إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة.
    5. ضع جزءا من جزء أو كل خليط التثقيب الكهربائي من السالمونيلا على صفيحة أجار LB تحتوي على مضادات حيوية مناسبة. احتضان الأطباق طوال الليل على حرارة 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: في هذا البروتوكول ، تم استخدام 35 ميكروغرام / مل كلورامفينيكول و 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين لاختيار pEVOL-PylRS-AFو pWSK29-sseJ 10TAG ، على التوالي.
  3. إعداد الثقافة
    1. تلقيح مستعمرة واحدة من السالمونيلا أو الإشريكية القولونية في 5 مل من وسط LB يحتوي على المضادات الحيوية المناسبة. تنمو بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية ، ويهز عند 250 دورة في الدقيقة.

3. التعبير ووضع العلامات الفلورية للبروتينات الحاملة ل ncAA

  1. التعبير عن البروتينات الحاملة ل ncAA في الإشريكية القولونية
    1. نقل 100 ميكرولتر من المستنبت الأولي إلى 5 مل من وسط LB (تخفيف 1:50) يحتوي على 35 ميكروغرام/مل كلورامفينيكول و50 ميكروغرام/مل كاناميسين، تليها الحضانة عند 37 درجة مئوية مع الهز عند 250 دورة في الدقيقة حتى يصل OD600 إلى 0.4-0.6.
    2. تحضير 1 مللي متر TCO*A محلول مخزون (10 مل; الجدول 1).
    3. عندما تصل المستنبتات إلى OD600 = 0.4-0.6 ، استبدل وسائط LB ب LB جديد يحتوي على 1 mM TCO * A ، و 35 ميكروغرام / مل كلورامفينيكول ، و 50 ميكروغرام / مل كاناميسين.
      ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن إعداد حل مخزون TCO*A كما هو موضح في الخطوة 5.4.2.
    4. تحفيز التعبير عن البروتين في وجود 1 مليمتر IPTG ، 0.2 ٪ أرابينوز ويهز طوال الليل عند 34 درجة مئوية ، 250 دورة في الدقيقة. حصاد الخلايا البكتيرية عن طريق الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 11000 × غرام. قم بإزالة المادة الطافية وقم بتجميد الحبيبات عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى.
    5. لتجربة التحكم ، كرر نفس التجربة ولكن عبر عن البروتينات الحاملة ل ncAA في حالة عدم وجود ncAA. بالنسبة لوضع العلامات الفلورية في المختبر للبروتينات الحاملة ل ncAA في الإشريكية القولونية ، اتبع الإجراء التفصيلي الموضح في الخطوة 3.3.
  2. التعبير عن البروتينات الحاملة ل ncAA في السالمونيلا
    1. نقل 100 ميكرولتر من المستزرع الأولي إلى 5 مل من وسط LB (تخفيف 1:50) يحتوي على 35 ميكروغرام/مل كلورامفينيكول و100 ميكروغرام/مل أمبيسلين، تليها الحضانة عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة حتى يصل OD600 إلى 0.6.
    2. تحضير الوسط الأدنى N المعدل (MgM ، الرقم الهيدروجيني 5.6) كما هو موضح في الجدول 1.
    3. استبدل الوسط LB بوسط N-minimal المعدل (MgM) المكمل ب 1 mMM TCO*A (الجدول 1). تنمو البكتيريا على حرارة 34 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم أضف 0.2٪ أرابينوز ، 25 مجم / مل كلورامفينيكول ، و 100 مجم / مل أمبيسلين ، وقم بنمو الخلايا لمدة 6 ساعات أخرى ، واهتز عند 250 دورة في الدقيقة.
    4. بعد 6 ساعات ، اغسل البكتيريا 4 مرات على مدار 30 دقيقة ، باستخدام وسائط MgM (درجة الحموضة 5.6) الطازجة (الجدول 1) بدون ncAA. في خطوات الغسيل ، استخدم 972 × جم لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    5. قم بطرد البكتيريا ، وأعد تعليقها في 1x PBS buffer ، واحتضانها لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية في الظلام لإزالة NCAAs الزائدة. بعد 1 ساعة ، قم بطرد البكتيريا عند 3000 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة وتخزينها لاستخدامها مرة أخرى.
    6. بالنسبة لتجربة التحكم ، كرر نفس التجربة عن طريق التعبير عن البروتينات الحاملة ل ncAA في حالة عدم وجود ncAA.
  3. وضع العلامات الفلورية في المختبر للبروتينات الحاملة ل ncAA في السالمونيلا التيفيموريوم
    1. أعد تعليق خلايا السالمونيلا التي تعبر عن SseJ-F10TCO-HA في غياب أو وجود TCO * A (من الخطوة 3.2) في 1x PBS. اضبط OD600 إلى 4 في PBS. احتضان الخلايا ب 20 ميكرومتر جانيليا فلور 646-تيترازين (JF646-Tz) أو 20 ميكرومتر BDP-Fl-tetrazine (محاليل مخزون 5 مللي متر في DMSO) عند 37 درجة مئوية في الظلام ورجها لمدة 1-2 ساعة عند 250 دورة في الدقيقة.
    2. حبيبات الخلايا ، وغسل 3-4x مع PBS التي تحتوي على 5 ٪ DMSO و 0.2 ٪ Pluronic F-127 ، وإعادة تعليقها في PBS التي تحتوي على 5 ٪ DMSO ، واحتضان بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية في الظلام. اغسل 2x مرة أخرى باستخدام 1x PBS. في خطوات الغسيل ، استخدم 972 × جم لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    3. تخيل الخلايا على الفور باستخدام مجهر متحد البؤر أو قم بتثبيتها باستخدام 1.5٪ بارافورمالدهايد (PFA) في برنامج تلفزيوني لمدة 30-45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
    4. اغسل الخلايا الثابتة 2x باستخدام PBS وأخيرا في 50 mMNH 4Cl في PBS لمدة 15 دقيقة لإزالة PFA الزائد. أعد تعليق الخلايا في برنامج تلفزيوني وتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة لا تزيد عن 3-4 أيام. تخيل البكتيريا باستخدام المجهر متحد البؤر كما هو موضح في القسم 6.

4. التوصيف الكيميائي الحيوي للبروتينات الحاملة ل ncAA

  1. تحلل الخلية
    1. أعد تعليق الخلايا من القسم 3.1 في محلول التحلل (الجدول 1) واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لأكثر من 30 دقيقة. يبرد المزيج على الثلج لمدة 15 دقيقة.
      ملاحظة: حافظ على نسبة المخزن المؤقت للتحلل إلى وزن الخلية المستخدم إلى 1:10.
    2. قم بتقوية الخلايا المعاد تعليقها بينما لا تزال على الجليد. نبض لمدة 30 ثانية عند الإعداد 7 على الأقل 6x ، مع فجوات 1 دقيقة ، باستخدام صوتي (انظر جدول المواد).
    3. قم بتدوير الخلية المحللة عند 20500 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة (الحفاظ على 4 درجات مئوية أمر بالغ الأهمية). انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد وتخلص من الحبيبات.
  2. تحليل SDS-PAGE
    1. تحضير صبغة تحميل 5x SDS (الجدول 1). أضف 5 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحميل هلام SDS إلى 13 ميكرولتر من محلول الخلية. قم بإذابة البروتينات باستخدام محلول عينة كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) في أنبوب سعة 2 مل عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، وطرد الخليط عند 2000 × جم لمدة 50 ثانية ، وقم بتحميله على جل بولي أكريلاميد SDS بنسبة 12٪.
    2. قم بتجميع الكاسيت الهلامي ، وضعه في جهاز رحلان كهربائي هلامي ، وقم بتوصيل جهاز الرحلان الكهربائي بمصدر طاقة كهربائي. صب المخزن المؤقت الجاري ، وقم بتحميل علامات الوزن الجزيئي وعينات البروتين ، وقم بتشغيل الجل عند 100 فولت ، حتى يصل البروموفينول إلى قاع هلام الحل.
      ملاحظة: ابدأ التحليل على الفور ، حيث تميل المحللات المخزنة عند -20 درجة مئوية إلى فقدان الجودة بعد كل دورة تجميد وذوبان.
    3. وصمة عار الجل مع بقع البروتين الأزرق كوماسي.

5. وضع العلامات الحيوية المتعامدة للمستجيب المفرز للسالمونيلا SseJ-F10TCO-HA في خلايا هيلا

  1. استزراع خلايا هيلا والحفاظ عليها عند 37 درجة مئوية ، و 5٪ CO2 ، و 95٪ رطوبة في وسط النسر المعدل (DMEM) عالي الجلوكوز (4.5 جم / لتر) من Dulbecco ، مع 10٪ (v / v) FBS بالإضافة إلى البنسلين والستربتومايسين (1x).
  2. ثقافة البكتيريا 1 يوم قبل الإصابة. تلقيح مستعمرة واحدة من السالمونيلا 14028 التي تؤوي pEVOL-PylRS-AF و pWSK29-sseJ 10TAG في 5 مل من مرق LB القياسي المحتوي على المضادات الحيوية طوال الليل عند 37 درجة مئوية ، وتهتز عند 250 دورة في الدقيقة.
  3. خلايا هيلا البذور 1 يوم قبل الإصابة. خذ قارورة زراعة الأنسجة (T-75) التي تحتوي على خلايا HeLa عند التقاء ~ 80٪ ، على النحو الذي يحدده الفحص المجهري لكثافة الخلية. اغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني دافئ. افصل الخلايا ب 3 مل من التربسين الدافئ 0.25٪ / EDTA لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2.
    1. قم بإخماد التربسين باستخدام 2 مل من DMEM (+ 10٪ FBS). انقل محتويات القارورة بالكامل إلى أنبوب سعة 15 مل بعد إعادة تعليق الخلايا. أدر الخلايا على حرارة 1000 × جم لمدة 5 دقائق. أخرج المادة الطافية من الأنبوب. أعد تعليق حبيبات خلايا هيلا في وسط نمو مسخن مسبقا.
    2. استخدم مقياس الدم لفحص المعلق وعد الخلايا الموجودة. تحضير مخزون الخلايا المخففة في 1 × 105 خلايا / مل. بذرة 0.5 × 105 خلايا HeLa لكل بئر في 500 ميكرولتر من DMEM + 10٪ وسط نمو FBS في شريحة حجرة من ثمانية آبار. حافظ على شريحة الغرفة في حاضنة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 ، 95٪ رطوبة لمدة 24 ساعة.
  4. عدوى بكتيرية
    1. الاستزراع الفرعي السالمونيلا 14028 يؤوي pEVOL-PylRS-AF و pWSK29-sseJ 10TAG ، عن طريق تخفيف 100 ميكرولتر من الثقافة البكتيرية الليلية (من الخطوة 5.2) إلى 3 مل من وسط LB (تخفيف 1:30) يحتوي على 35 ميكروغرام / مل كلورامفينيكول و 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين ، تليها الحضانة عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة لمدة 5-7 ساعات.
      ملاحظة: خلال هذه المرحلة ، تصل الثقافات إلى المرحلة الأسية المتأخرة ، وتكون البكتيريا شديدة التوغل.
    2. قم بإعداد حل مخزون 100 مللي متر TCO * A ووسائط كاملة (الجدول 1).
    3. لبدء عدوى خلايا هيلا ، أخرج خلايا هيلا من الحاضنة واغسل الخلايا باستخدام DPBS المسخن مسبقا قبل إضافة 500 ميكرولتر من DMEM الطازج (+ 10٪ FBS) إلى كل بئر. ضع شريحة الغرفة مرة أخرى في حاضنة CO2 حتى تبدأ العدوى.
    4. بعد 5-7 ساعات من الحضانة ، قم بتخفيف استزراع السالمونيلا إلى OD600 = 0.2 في 1 مل من وسط نمو DMEM (~ 3 × 108 cfu / mL). أضف الكميات المطلوبة من لقاح السالمونيلا في كل بئر من شريحة الغرفة بحيث يكون تعدد العدوى (MOI) 100.
    5. احتضان الخلايا المصابة في حاضنة CO2 لمدة 30 دقيقة. اغسل الخلايا 3x باستخدام DPBS المسخن مسبقا لإزالة السالمونيلا خارج الخلية. اضبط هذه النقطة الزمنية على 0 ساعة بعد الإصابة. أضف 500 ميكرولتر من الوسط الكامل (الجدول 1) يحتوي على 100 ميكروغرام / مل جنتاميسين لمدة 1 ساعة. بعد 1 ساعة ، اغسل الخلايا 3x باستخدام DPBS. أضف 500 ميكرولتر من الوسط الكامل (من الخطوة 5.4.2; الجدول 1) تستكمل مع 0.2٪ أرابينوز ، 10 ميكروغرام / مل جنتاميسين لكل بئر من شريحة الغرفة.
    6. في تجربة التحكم، قم بإجراء عدوى مماثلة لخلايا هيلا بدون التكلفة الإجمالية للملكية*A.
    7. احتضان شريحة الغرفة لمدة 10 ساعات في حاضنة CO2 .
  5. انقر فوق الملصقات القائمة على الكيمياء في الخلايا الحية
    1. تابع تسمية الخلايا المصابة بالبكتيريا. سخن الوسط الكامل بدون TCO * A (الجدول 1).
    2. بعد 10 ساعات من الإصابة، استبدل الوسط الكامل بوسط كامل طازج بدون التكلفة الإجمالية للملكية*A واغسل خلايا هيلا 4 مرات على مدار 30 دقيقة لكل منها ب DPBS مسخن مسبقا، متبوعا بوسط كامل طازج (بدون التكلفة الإجمالية للملكية*A).
    3. قم بإعداد محلول مخزون صبغ تترازين 0.5 مللي متر في DMSO.
      ملاحظة: لوضع علامات على المستجيبات المفرزة السالمونيلا في الخلايا المضيفة ، يتم تقديم بروتوكولين. بالنسبة للبروتوكول 1 ، قم بإعداد خليط الصبغة عن طريق تخفيف مخزون JF646-Tz في 1x PBS يحتوي على 1٪ ملح صوديوم الكازين من حليب البقر بحيث يكون محلول العمل النهائي 2 ميكرومتر. بالنسبة للبروتوكول 2 ، قم بإعداد وسيط كامل دافئ (بدون FBS و TCO * A) وأضف 2 ميكرومتر JF646-Tz. اجعل خليط الصبغة هذا طازجا لكل جلسة وضع ملصقات. اعمل في الظلام إن أمكن (خفت الأضواء في غطاء المحرك و / أو الغرفة).
    4. بعد 12 ساعة بعد الإصابة ، استنشق الوسط من الخلايا. اغسل الخلية باستخدام DPBS 2x أو 3x المسخن مسبقا. في مجموعة واحدة من الآبار ، أضف 500 ميكرولتر من خليط محلول الصبغة الموصوف في البروتوكول 1 ، وفي مجموعة أخرى من الآبار من نفس شريحة الغرفة ، أضف 500 ميكرولتر من خليط محلول الصبغة الموصوف في البروتوكول 2 المذكور في الخطوة 5.5.3 والملاحظة اللاحقة. ضع شرائح الغرفة مرة أخرى في حاضنة CO 2 لمدة 1.5-2 ساعة.
    5. بعد 13.5-14 ساعة بعد الإصابة ، شطف خلايا هيلا 2x مع DPBS مسخن مسبقا. أضف 500 ميكرولتر من DMEM الطازج (مكمل ب FBS). ضع شريحة الحجرة مرة أخرى في الحاضنة لمدة 30 دقيقة. اغسل الخلايا باستخدام DPBS المسخن مسبقا متبوعا ب DMEM الطازج 4x على مدار 30 دقيقة.
    6. في 16 ساعة بعد الإصابة ، قم بإصلاح خلايا HeLa باستخدام PFA عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من 4٪ PFA في كل بئر وتحضينها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام. نضح من PFA ، وشطف 3x مع PBS ، وتخزين الخلايا في PBS عند 4 درجات مئوية في الظلام.
      ملاحظة: PFA مادة كيميائية شديدة السمية. تجنب الاستنشاق ، وكذلك ملامسة الجلد والعين. ارتداء معدات واقية عند المناولة. لتجنب تعرض العينة المصنفة للضوء ، أطفئ الضوء الموجود في غطاء زراعة الخلية.
  6. التلوين المناعي للبروتينات الموسومة ب HA
    1. نضح من برنامج تلفزيوني وشطف مرة واحدة في محلول مانع (الجدول 1).
    2. احتضان خلايا هيلا الثابتة بمحلول الأجسام المضادة الأولية القائم على PBS (الجدول 1) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. استخدم جسما مضادا أوليا للأرانب المضادة لحمض الهيالورونيك لتلطيخ SseJ المفرز (تخفيف 1: 500).
    3. بعد ساعة واحدة ، اغسل الخلايا برفق 2x مع 0.5 مل من 0.1٪ Tween-20 / 1x PBS. أثناء الغسيل بمحلول Tween / PBS ، احتضن الخلايا 3x مع 0.5 مل من 0.1٪ Tween20 / 1x PBS لمدة 5 دقائق.
    4. تمييع الأجسام المضادة الثانوية حمار مكافحة الأرانب 555 1: 500 في محلول الأجسام المضادة الثانوية واحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
    5. بعد ساعة واحدة ، اغسل الخلايا برفق 2x مع 0.5 مل من 0.1٪ Tween-20 / 1x PBS واحتضان 2x مع 0.5 مل من 0.1٪ Tween20 / 1x PBS لمدة 5 دقائق.
    6. اغسل الخلايا 3x ب 0.5 مل من 1x PBS وقم بتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية في الظلام.
      ملاحظة: يمكن تخزين الخلايا الثابتة لبضعة أسابيع في PBS عند 4 درجات مئوية. يجب إجراء التلوين المناعي في اللحظة الأخيرة.

6. التصوير البؤري

  1. استخدم مجهرا متحد البؤر ، مثل القرص الدوار (SD) أو مجهر STED.
    1. اضبط إعدادات الحصول على الصور، مثل وضع المسح الضوئي (XYZ) وسرعة المسح الضوئي (400 هرتز) والدقة (512 × 512) والتكبير (100x) وتكديس Z.
    2. استخدم مرشحات الإثارة / الانبعاثات الصحيحة ل DAPI و BDP-Tz و JF646 tetrazine.
      ملاحظة: بالنسبة لهذا البروتوكول ، تم إجراء التصوير متحد البؤر على نظام مجهر STED مزود بليزر ضوئي أبيض نابض ، مما يسمح باختيار الإثارة في نطاق 470-670 نانومتر وليزر ديود UV 405 نانومتر للإثارة عند 405 نانومتر و 488 نانومتر و 647 نانومتر. ووضعت نطاقات الانبعاثات المناسبة باستخدام مقسم الحزمة الصوتية البصرية المدمج بالاقتران مع الكشف الطيفي متعدد النطاقات القابل للضبط القائم على المنشور للنظام البؤري.
    3. احصل على الصور باستخدام هدف غمر الزيت 100× / 1.4.

7. تصوير فائق الدقة (dSTORM)

  1. قم بتشغيل المجهر قبل 3 ساعات من التصوير للسماح بالتوازن الحراري (من المرجح أن يحدث الانجراف إذا بدأ التصوير قبل ذلك). قم بتبريد الكاميرا إلى -70 درجة مئوية.
  2. في هذه الأثناء ، قم بإعداد مخزن مؤقت جديد للتصوير GLOX-BME (الجدول 1).
  3. جلب الخلايا إلى المجهر. ضع حجرة التصوير على مرحلة المجهر في حامل العينة. في الحامل ، تأكد من أن العينة مسطحة وآمنة. قم بتغيير الوسط في البئر باستخدام 0.4 مل من المخزن المؤقت للتصوير GLOX-BME المصنوع حديثا.
  4. اضبط خط الليزر الصحيح ومجموعات المرشحات. قلل طاقة الليزر إلى ~ 1 ميغاواط لتحديد خلية HeLa ذات الأهمية. اضبط المستوى البؤري وزاوية شعاع الليزر أثناء إضاءة العينة بكثافة ليزر منخفضة تبلغ 647 نانومتر (في هذه الحالة ، يقترح زاوية مائلة بشدة [HILO] ، لأن HILO يرفع الإشارة إلى الخلفية [SBR]). اضبط زاوية إضاءة HILO.
    ملاحظة: في هذا البروتوكول ، تم الحصول على تصوير فائق الدقة ل SseJ في قناة Alexa Fluor 647 باستخدام مجهر مقلوب ومتألق (انظر جدول المواد) ، ومجهز بهدف TIRF (هدف غمر زيت 100x Apo TIRF ، NA 1.49). تم الكشف عن مضان مع كاميرا EMCCD ، والتي تم التحكم فيها من خلال μManager.
  5. اضبط كسب المضخم الأولي على 3 وقم بتنشيط نقل الإطار في μManager. اضبط EM-gain على 200 للحصول على حساسية أعلى في قياسات dSTORM ، كما هو موضح في تقرير سابق35.
  6. قبل تصوير dSTORM ، التقط صورة مرجعية محدودة الحيود للهيكل المستهدف. قم بتبديل الفلوروفورات إلى الحالة المظلمة عن طريق تشغيل الليزر إلى أقصى طاقته.
    ملاحظة: لوحظت جزيئات فردية وامضة بسرعة من فلوروفورات JF646 عندما تم تحويل فلوروفورات JF646 إلى حالة مظلمة في الغالب عن طريق الإضاءة المستمرة لضوء الإثارة 647 نانومتر ، كما هو موضح سابقا36.
  7. اضبط قوة الليزر على مستوى مناسب حيث يتم فصل الأحداث الوامضة في المكان والزمان ، واضبط وقت التعرض على 30 مللي ثانية ، وابدأ عملية الاستحواذ. احصل على 10000-30000 إطار.
    ملاحظة: يجب إجراء تغييرات في قوة الليزر لتحسين الوميض. ضع في اعتبارك زيادة شدة الليزر إذا تم اكتشاف الكثير من الأحداث (الجسيمات الوامضة المتداخلة). يعتمد الطول المثالي على جودة العينة ، ولكن يجب أن تظهر ~ 10000 إطار ميزات ملحوظة.

8. إعادة بناء صورة dSTORM

  1. استخدم البرامج المناسبة لتحليل الصور.
    ملاحظة: ThunderSTORM ، أحد برامج إعادة بناء الصور مفتوحة المصدر العديدة المتاحة ، موصوفة بإيجاز أدناه.
  2. افتح ImageJ واستورد البيانات الأولية. افتح المكون الإضافي ThunderSTORM وقم بتكوين إعداد الكاميرا المقابل للجهاز.
  3. انتقل إلى تشغيل التحليل واضبط الإعدادات المناسبة ، مثل تصفية الصور (اختلاف متوسط المرشحات) ، وطرق الترجمة (الحد الأقصى المحلي) ، وتوطين البكسل الفرعي للجزيئات (Gaussian PSF المدمج). انقر فوق موافق لبدء إعادة بناء الصورة.
    ملاحظة: إذا لزم الأمر ، تم بالفعل وصف تعليمات مفصلة لإعداد المعلمات في ThunderSTORM37.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تصف ورقة البروتوكول هذه طريقة قائمة على GCE لوضع العلامات الفلورية الخاصة بالموقع وتصور مستجيبات السالمونيلا المفرزة ، كما هو موضح في الشكل 1. يظهر التركيب الكيميائي للمجموعة المتعامدة الحيوية عبر السيكلوكتين (TCO) الحاملة ncAA وصبغة الفلورسنت في الشكل 1A. تم تحقيق وضع العلامات SseJ عن طريق الدمج الجيني ل ncAAs المتعامدة بيولوجيا في كودون توقف كهرماني (انظر الشكل 1 ب) باستخدام أزواج أمينواسيل-الحمض النووي الريبي المتعامد / الحمض النووي الريبي عبر تقنية GCE. قدمت معالجة المستجيبات الموسومة ب TCO مع التترازين المحتوي على الفلوروفور (JF646-Tz أو BDP-Tz) استراتيجية بديلة لوضع العلامات على البروتين مكنت من مراقبة المستجيبات المفرزة المنقولة بالسالمونيلا بعد ساعات عديدة من إصابة المضيف (الشكل 1B ، C). بدأنا بتحديد بقايا الأحماض الأمينية المحتملة واختيار الموضع 10 من SseJ لإدراج ncAA بناء على إمكانية الوصول إلى السطح والمعرفة الحالية بالمخلفات الوظيفية ل SseJ. يمكن أن تساعد البيانات الهيكلية السابقة وتوقعات التعرض السطحي في اختيار مواقع محددة.

يؤثر وضع كودون الكهرمان داخل الجين الذي يشفر POI على فعالية دمج التكلفة الإجمالية للملكية. نتيجة لذلك ، يجب إنشاء سلسلة من الطفرات مع كودونات العنبر في مواضع مختلفة من جين POI وتحليلها لتحقيق كفاءة التكامل المثلى. اختيار موضع كودون الكهرمان هو اختيار تجريبي. بشكل عام ، يجب أن تكون المخلفات المعدلة غير ضرورية لوظيفة POI ، وخالية من التعديلات اللاحقة للترجمة ، ويمكن الوصول إليها من قبل مجسات الفلورسنت. يجب أن يكون التعبير plasmid رقم نسخة منخفض بحيث يحاكي رقم النسخة الأصلية ل POI. يؤثر سياق الكودون على مدى فعالية دمج NCAA بواسطة نظام تخليق tRNA / aminoacyl-tRNA المتعامد. في حين أن AAT-TAG-ACT هو السياق المفضل للحمض النووي الريبي المتعامد ، فقد تم تغيير موضع Phenylalanine-10 من sseJ إلى TAG ، مما يضمن سياق AAT-TAG-ACT لتمكين الدمج الأكثر فعالية ل NCAA. أولا ، اختبرنا ما إذا كانت الطفرات تعمل في الإشريكية القولونية باستخدام بلازميد عالي العدد للتعبير عن sseJ. كما يتضح من SDS-PAGE ، كان التعبير الطافر SseJ-F10TCO-HA يعتمد على وجود TCO * A و tRNA / aaRS الأمثل المقابل (الشكل 2A). تم تصنيف SseJ-F10FCO-HA مع JF646-Tz باستخدام كيمياء النقر SPIEDAC في الإشريكية القولونية. تم تأكيد وضع العلامات الفلورية الانتقائية ل SseJ-F10TCO-HA في الإشريكية القولونية في المختبر عن طريق التحليل المجهري الفلوري (الشكل 2 ب). باستخدام GCE ، تم دمج TCO * A على وجه التحديد في كودون كهرماني في sseJ. لم تسفر محاولات التعرف المباشر على الدمج الجينومي خارج الهدف ل ncAAs باستخدام نظام tRNAPyl / PylRS AF عن أي دليل على وجودها. ومع ذلك ، نوصي باستخدام مضان في الهلام ، وللطخة الغربية ، وبروتين الانصهار الفلوري ، ووضع العلامات الفلورية في المختبر ، وطرق أخرى لتقييم الكفاءة والنوعية ودرجة الدمج خارج الهدف وسمية بلازميد pEVOL ، كما هو موثق في الأوراق المبلغ عنها سابقا المذكورة هنا12،29.

بمجرد أن أثبتنا أن TAG المكبوت في sseJ كان وظيفيا ، قمنا باستنساخ sseJ-F10TCO-HA جنبا إلى جنب مع مروجها الأصلي في رقم النسخة المنخفض plasmid pWSK29 ، مما يضمن فكرة AAT-TAG-ACT لوضع العلامات والتصور الفلوري. تم تأكيد وضع العلامات الانتقائية في المختبر ل SseJ-F10TCO-HA في خلايا السالمونيلا باستخدام الفحص المجهري الفلوري (الشكل 3). ثم قمنا بإصابة خلايا هيلا بسلالة السالمونيلا من النوع البري المكملة ب p sseJ-HA أو p sseJ 10TAG-HA ، في غياب أو وجود TCO * A لتحديد ما إذا كان يمكن نقلSseJ المدمج في TCO إلى الخلايا المضيفة. تم إصلاح خلايا HeLa المصابة باستخدام PFA وملطخة بالجسم المضاد ل HA بعد 16 ساعة من الإصابة لتسليط الضوء على SIFs التي زينتها SseJ. كما هو موضح في الشكل 4C ، من الواضح أن SseJ-F10TCO-HA كان يفرز ، وتم تشكيل SIFs المعتمدة على SseJ ، وبدت مشابهة لتلك التي لوحظت في الخلايا المصابة من النوع البري (الشكل 4A). ومع ذلك ، لم يتم ملاحظة SIFs المعتمدة على SseJ في غياب TCO * A (الشكل 4B). أظهرت هذه الملاحظات أن التعبير عن sseJ-F10TCO-HA باستخدام GCE أنقذ SIFs المعتمدة على SseJ. بالإضافة إلى ذلك ، أشارت النتائج أيضا إلى أن SseJ-F10TCO-HA كان عامل ضراوة يعمل بكامل طاقته للسالمونيلا.

بعد التأكد من أن SseJ المسمى GCE كان وظيفيا ومفترضا ، استخدمنا تفاعل SPIEDAC لتسمية SseJ-F10TCO-HA ب JF646-Tz في خلايا HeLa. للقيام بذلك ، قمنا بإصابة خلايا HeLa بالسالمونيلا من النوع البري مع p sseJ-F10TCO-HA ، في وجود TCO * A. بعد وضع العلامات باستخدام JF646-Tz باستخدام بروتوكولين بديلين موصوفين في قسم البروتوكول 5 ، تم غسل الخلايا على نطاق واسع لإزالة الصبغة الزائدة ، وتثبيتها باستخدام PFA ، وملطخة بالمناعة بجسم مضاد ل HA لتصور SseJ-F10TCO-HA المفرز. تم تمييز SseJ-F10TCO-HA المفرز في سيتوبلازم خلايا HeLa ب JF646-Tz (الشكل 5A ، B ، أحمر) وتم توطينه بوضوح مع علامة HA (أخضر). إن ملاحظة أن التسميتين تتداخلان مع بعضهما البعض (أحدهما صبغة فلورية ، والآخر موسوم بالتلطيخ المناعي) ، تؤكد كذلك على خصوصية وضع العلامات على الحملة العالمية للتعليم.

للتأكد من أن الإشارة الفلورية التي لوحظت في خلايا HeLa كانت خاصة فقط بالمستجيب المفرز SseJ ، قمنا بإصابة الخلايا بالسالمونيلا من النوع البري (تحمل psseJ-HA) في وجود TCO * A و pEVOL-PylRS-AF. تم استخدام صبغة نقرة لمراقبة ما إذا كان هناك أي تسمية خلفية في خلايا هيلا. تم إطلاق SseJ في السيتوبلازم للخلية المضيفة ، مع عدم وجود إشارات فلورية داخل الخلايا أو غير محددة (الشكل 5C) ، مما يدل على أن إشارة التألق كانت خاصة ب SseJ. بعد تحديد أن ncAAs تم دمجها على وجه التحديد في كودون كهرماني ، وأنه يمكن تصور SseJ المفرز في الخلية المضيفة عبر تفاعل النقر ، كان الهدف التالي هو إنشاء صورة فائقة الدقة ل SseJ المفرز في خلايا HeLa (الشكل 6). في الشكل 6 ، نوضح قوة GCE واستخدام صبغة JF646 لتوليد صور فائقة الدقة خاصة بالموقع لمستجيب السالمونيلا المفرز SseJ في خلايا HeLa.

Figure 1
الشكل 1: مخطط لوضع العلامات الفلورية الخاصة بالموقع على مستجيبات SPI-2. (أ) التكلفة الإجمالية للملكية (TCO*A) وJF-646-تترازين. (ب) يصور المخطط دمج NCAA في مستجيب SPI-2. في الخلية البكتيرية ، يتم إدخال بلازميد يحتوي على جين مستجيب POI (أرجواني) وزوج مثبط متعامد tRNA (أحمر) / أمينواسيل سينثيتاز (أخضر). يتم تبديل الكودون الأصلي بكودون توقف كهرماني (TAG ، أحمر) في تتابع جين المستجيب في موقع متساهل. يتم إدخال ncAA (الدائرة الحمراء الداكنة) ببساطة في وسط النمو. ثم تلتقطه الخلية وتصل إلى العصارة الخلوية ، حيث يتم ربطها بالحمض النووي الريبي المتعامد بواسطة aminoacyl-tRNAsynthetase (aaRS). يدخل الحمض النووي الريبي tRNA المصنوع من ncAA مع مضاد CUA إلى آلية الريبوسوم نتيجة لكودون الكهرمان التكميلي على mRNA المستجيب (أرجواني) ، مما يدمج ncAA المرفق في المستجيب. يحمل NCAA سلسلة عديد الببتيد كاملة الطول لموقع المستجيب، والتي تطوى بعد ذلك وتتجمع في بروتين مستجيب وظيفي. يتم نقل المستجيب المنتج حديثا إلى الخلية المضيفة من خلال T3SS. يمكن استخدام الفلوروفور المزود خارجيا لتسمية مستجيب SPI-2 مفرز مدمج مع ncAA. (ج) مخطط تفاعل النقر الخالي من النحاس مع صبغة التترازين الفلورية. من خلال تفاعل النقر SPIEDAC ، يتفاعل ncAA مع مجموعة ألكين متوترة مدمجة في POI (SseJ) مع صبغة مقترنة بالتترازين (JF646-Tz). تصبح الصبغة الفلورية المقترنة بالتترازين JF646-Tz فلورية (حمراء) فقط بعد وضع العلامات بنجاح. الاختصارات: TCO * A = trans-cyclooct-2-en-L-Lysine ؛ ncAA = حمض أميني غير قانوني ؛ T3SS = نظام إفراز من النوع الثالث ؛ SPI-2 = جزيرة إمراضية السالمونيلا 2 ؛ POI = بروتين الفائدة ؛ SPIEDAC = إضافة ديلز-ألدر ذات الطلب العكسي على الإلكترون المعزز بالإجهاد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تم دمج TCO * A على وجه التحديد في الموقع في SseJ-F10TCO-HA معبرا عنه في الإشريكية القولونية. (A) تؤكد SDS-PAGE الملطخة ب Coomassie الدمج الانتقائي ل TCO * A في SseJ-F10TCO-HA (المشار إليه بالسهم الأحمر) in E. coli. (ب) التعبير عن SseJ-F10TCO-HA في الإشريكية القولونية التي تم تحليلها بواسطة المجهر الفلوري في غياب (أعلى) أو وجود (أسفل) 1 mM TCO * A. E. يتم تحضين خلايا الإشريكية القولونية التي تعبر عن SseJ-F10TCO-HA في غياب أو وجود TCO * A باستخدام BDP-Fl-tetrazine ويتم تصويرها لمضان BDP (أخضر). يتم ملاحظة مضان SseJ (الأخضر) فقط في وجود ملصق TCO * A المدمج ؛ لاحظ عدم وجود مضان الخلفية في اللوحة العلوية. شريط المقياس = 2 ميكرومتر. الاختصارات: TCO * A = trans-cyclooct-2-en-L-Lysine ؛ BF = برايتفيلد ؛ HA = حمض الهيالورونيك. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تم دمج TCO * A على وجه التحديد في الموقع في SseJ-F10TCO-HA معبرا عنه في السالمونيلا. يستخدم الفحص المجهري الفلوري لفحص تعبير SseJ-F10TCO-HA في السالمونيلا في غياب (أعلى) أو وجود (أسفل) 1 مللي متر TCO * A. يتم التعامل مع السالمونيلا التي تعبر عن SseJ F10TCO-HA باستخدام JF646-Tz ويتم تصويرها لمضان JF646 (أرجواني) ، في وجود أو عدم وجود TCO * A. يتم اكتشاف مضان SseJ (أرجواني) فقط عند وجود TCO * A. شريط المقياس = 2 ميكرومتر. الاختصارات: TCO * A = trans-cyclooct-2-en-L-Lysine ؛ BF = برايتفيلد ؛ HA = حمض الهيالورونيك. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: إفراز SseJ-J10TCO-HA وظيفي. (أ) تصاب خلايا هيلا بالسالمونيلا التي تؤوي psseJ-HA لمدة 16 ساعة ، وهي ثابتة وملطخة بالمناعة بالأجسام المضادة ل HA (الأحمر) و LPS (الأخضر) و DAPI (الأزرق). كما هو متوقع ، لوحظ تكوين SIFs المعتمدة على SseJ في الخلايا المصابة. (ب) في حالة عدم وجود TCO * A ، لا يتم قمع كودون الكهرمان ، وتكون SIFs المعتمدة على SseJ غائبة في خلايا HeLa المصابة. تصاب خلايا هيلا بالسالمونيلا التي تعبر عن SseJ-F10TCO-HA في غياب TCO * A لمدة 16 ساعة ، ثابتة ، وملطخة بالمناعة مع الأجسام المضادة المضادة ل HA (الأحمر) ، LPS (الأخضر) ، و DAPI (الأزرق). (C) لوحظت SIFs المعتمدة على SseJ في وجود TCO * A. خلايا HeLa المصابة بالسالمونيلا التي تعبر عن SseJ-F10TCO-HA في وجود 400 ميكرومتر TCO * A ثابتة وملطخة بالمناعة مع الجسم المضاد ل HA SseJ (أحمر) ، LPS (أخضر) ، و DAPI (أزرق). لوحظت SIFs المعتمدة على SseJ في اللوحة اليسرى ، مما يشير بوضوح إلى أنه تم إنقاذ SseJ من خلال التعبير عن sseJ-F10TCO-HA باستخدام GCE. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. الاختصارات: HA = حمض الهيالورونيك. LPS = عديد السكاريد الدهني. DAPI = 4 '، 6-دياميدينو -2-فينيليندول ؛ TCO * A = ترانس-سيكلوكت-2-أون-إل-ليسين ؛ SIFs = خيوط السالمونيلا التي يسببها السالمونيلا ؛ GCE = توسيع الشفرة الوراثية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: خصوصية وضع العلامات على SseJ بصبغة JF646-Tz. (أ) تصاب خلايا هيلا بالسالمونيلا التي تعبر عن SseJ-F10TCO-HA في وجود 400 ميكرومتر TCO * A. يتم تمييز SseJ-F10TCO-HA المفرز الموسوم ب 2 ميكرومتر JF646-Tz في 1x PBS يحتوي على 1٪ ملح صوديوم الكازين من حليب البقر ، مغسول على نطاق واسع ، ثابت ، ومناعي بجسم مضاد ل HA لتصور SseJ المفرز (الأخضر). يتم إفراز SseJ-F10TCO-HA وتمييزه بصبغة JF646-Tz (أحمر ، اللوحة اليسرى). من الواضح أن SseJ المسمى عبر GCE (أحمر) و HA (أخضر) مترجمان بشكل مشترك (اللوحة اليمنى). (ب) باستخدام بروتوكول وضع علامات مختلف قليلا ، يتم أيضا تمييز SseJ-F10TCO-HA المفرز الموسوم ب 2 ميكرومتر JF646-Tz في وسط كامل DMEM (بدون FBS) ، ويتم غسله على نطاق واسع ، وتثبيته ، وتعريضه لتلطيخ مضاد للتألق المناعي HA. يتم تمييز SseJ-F10TCO-HA المفرز بصبغة JF646-Tz (أحمر ، اللوحة اليسرى) ويتم توطينه بشكل مشترك مع HA (أخضر). (C) لإثبات أن إشارة التألق فريدة من نوعها ل SseJ وليست نتاجا للبروتينات الأخرى التي تم إطلاقها SPI-2 ، تصاب خلايا HeLa بالسالمونيلا من النوع البري التي تحمل psseJ-HA و pEVOL-PylRS-AF ، في وجود NCAA (TCO * A). في 16 ساعة بعد الإصابة، تعالج خلايا هيلا المصابة ب 2 ميكرومتر JF646-Tz في وسط كامل (بدون FBS و TCO * A)، ويتم إزالة الصبغة الزائدة تماما باستخدام وسط نمو جديد. يتم تثبيت خلايا HeLa PFA وغسلها جيدا باستخدام PBS قبل تلوينها المناعية ل SseJ (الأخضر). يشير عدم وجود إشارة مضان خلفية مرئية في اللوحة اليسرى (JF646-Tz) إلى أنه لم يحدث أي وضع علامات خارج الهدف تقريبا داخل الخلايا المضيفة. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. الاختصارات: HA = حمض الهيالورونيك. PBS = محلول ملحي مخزن بالفوسفات ؛ FBS = مصل الجنين البقري ؛ DAPI = 4 '، 6-دياميدينو -2-فينيليندول ؛ TCO * A = ترانس-سيكلوكت-2-أون-إل-ليسين ؛ SIFs = خيوط السالمونيلا التي يسببها السالمونيلا ؛ GCE = توسيع الشفرة الوراثية ؛ SPI-2 = جزيرة إمراضية السالمونيلا 2 ؛ BF = برايتفيلد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: تصوير فائق الدقة ل SseJ المسمى GCE في خلايا HeLa. تصاب خلايا هيلا بالسالمونيلا التي تعبر عن SseJ-F10TCO-HA في وجود 400 ميكرومتر TCO * A. يتم تمييز SseJ-F10TCO-HA المفرز الموسوم ب 2 ميكرومتر JF646-Tz في ظل الظروف الفسيولوجية كما هو موضح في البروتوكول ، ثم يتم غسلها على نطاق واسع. يتم الحصول على الصور باستخدام نيكون N-STORM. (أ) صورة برايتفيلد لخلية هيلا تحت الملاحظة. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. (B) صورة محدودة الحيود وواسعة المجال ل SseJ المفرز المسمى TCO * A و JF-646. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. (C) صورة dSTORM المقابلة ل SIFs المزينة ب SseJ. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. يعرض الجزء الداخلي C (i) عرضا مكبرا ل SseJ فائق الدقة في المنطقة المحاصرة. شريط المقياس = 1 ميكرومتر. الاختصارات: HA = حمض الهيالورونيك. TCO * A = ترانس-سيكلوكت-2-أون-إل-ليسين ؛ SIFs = خيوط السالمونيلا التي يسببها السالمونيلا ؛ GCE = توسيع الشفرة الوراثية ؛ WF = حقل واسع ؛ BF = برايتفيلد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1. محاليل. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الجدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تم استخدام النهج الموصوف هنا لتتبع الموقع الدقيق للبروتينات المستجيبة التي يتم حقنها في الخلية المضيفة بواسطة T3SS البكتيرية بعد الإصابة. يتم استخدام T3SSs بواسطة مسببات الأمراض داخل الخلايا مثل السالمونيلا والشيغيلة واليرسينيا لنقل مكونات الفوعة إلى المضيف. أتاح تطوير تقنيات التصوير فائقة الدقة تصور عوامل الفوعة بدقة لم يكن من الممكن تصورها سابقا12،13،24. ومع ذلك ، فإن بعض قيود وضع العلامات حالت دون إجراء مزيد من التحقيق المتعمق ، حيث أن اندماج البروتين القابل للتنشيط الضوئي يسد مسام T3SS ولا يتم إفرازه. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن ينتج تجميع القطع الأثرية والتحليل الخاطئ عن الميل المتأصل لبعض بروتين الاندماج إلى التجمع أو التجميع.

في بعض الحالات ، يتم أيضا شق بروتين الاندماج ، كما لاحظنا سابقا مع PAmCherry-SsaP12,13. يتم التغلب على كل هذه القيود من خلال الحملة العالمية للتعليم ، والتي تسمح بوضع العلامات الفلورية الخاصة بالموقع لنقاط الاهتمام. كما يسمح بتصور البروتينات التي ليست وفيرة12,13. في حين أن هناك عددا من العوامل التي يمكن أن تؤثر على كفاءة دمج ncAA باستخدام نظام توليف tRNA / aminoacyl-tRNA المتعامد ، يبدو أن سياق الكودون هو الأكثر أهمية. يشتمل الحمض النووي الريبوزي الريبوزي المتعامد على NCAA بشكل أكثر كفاءة عندما يكون سياق الكودون المفضل هو AATTAGACT33. في الشكل 5 ، يمكننا مقارنة الملصقات الواضحة الناتجة عن GCE والفلوروفور الخاص بالموقع (بالإضافة إلى عدم وجود خلفية) مقارنة بالتلوين المناعي لعلامة HA.

نتيجة لذلك ، سيتمكن الباحثون من تصور POIs في مسببات الأمراض والبكتيريا المتعايشة والمضيفات حقيقية النواة باستخدام الطريقة الموضحة هنا. باختصار ، توفر ncAAs المشفرة وراثيا نهجا بديلا لوضع العلامات على البروتين المستجيب عندما تفشل الطرق التقليدية. ومع ذلك ، فإن أحد القيود الرئيسية لهذه الطريقة هو الخصائص الكيميائية المتأصلة في الفلوروفور ، مثل نفاذية الغشاء وتوزيعه والاحتفاظ به ، والتي يمكن أن تؤثر على كفاءة وضع العلامات الفلورية. تعد NCAAs الفلورية خيارا بديلا لتجنب تفاعلات النقر12 ، ولكن لا يمكن تصورها إلا باستخدام المجهر ثنائي الفوتون. تتم إحالة القراء إلى قائمة الأصباغ المنفذة لغشاء الخلية / غير المنفذة المذكورة هنا12،38،39،40،41.

في الختام ، قمنا على وجه التحديد بتسمية وتصور المستجيب المفرز للسالمونيلا SseJ عن طريق ترميز NCAAs وراثيا بالاشتراك مع فلوروفور فلوروجيني دون إضعاف وظيفته البيولوجية. كان وضع العلامات على SseJ باستخدام JF646-Tz محددا للغاية ، ويمكن استخدام التصوير فائق الدقة لتصور المستجيبات المفرزة داخل الخلايا المضيفة. وهكذا ، سمح وضع العلامات الفلورية للمستجيبات البكتيرية باستخدام الأصباغ المتوافقة مع dSTORM وتوسيع الشفرة الوراثية بالتوطين المكاني دون الخلوي للمستجيبات المفرزة البكتيرية في الخلايا المضيفة ، بدقة أقل من حد الحيود. نظرا لأن منصة وضع العلامات هذه متوافقة مع تتبع الجسيمات المفردة للتصوير بالخلايا الحية ، فإن طريقتنا ستجعل من الممكن تحليل البروتينات المستجيبة لنظام T3SS بمستويات غير مسبوقة من الدقة الزمنية والمكانية ، مما سيعزز فهمنا الجزيئي للتسبب في الأمراض البكتيرية.

في حين أن هناك بعض القيود ، مثل ضعف كفاءة دمج ncAA والقيود الفيزيائية الضوئية للفلوروفور العضوي ، فقد أثبتنا أن هذا النهج يمكن أن يساعد الباحثين على مراقبة وتوطين المستجيب المفرز داخل الخلايا المضيفة ، حتى عندما يكون نادرا12,13. نتوقع أن يفتح تكييف التكنولوجيا فرصا جديدة ومثيرة للتصوير والبحث عن البروتينات المستجيبة الأخرى التي تنتجها البكتيريا أثناء العدوى. كما يتم تكييف الطريقة بسهولة لوضع العلامات على الفيروسات ، مما يدل على فائدتها الواسعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لهما مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من خلال أموال بدء التشغيل من الفرع الطبي بجامعة تكساس ، جالفستون ، تكساس ، وجائزة Texas STAR إلى LJ K. نشكر البروفيسور إدوارد ليمكي (مختبر البيولوجيا الجزيئية الأوروبي ، هايدلبرغ ، ألمانيا) على البلازميد pEVOL-PylRS-AF. تم إنشاء الصور في الشكل 1 باستخدام BioRender.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Tris/Glycine SDS running buffer BIO-RAD 1610732
Ammonium chloride Fischer Scientific A661-500
Ammonium sulphate Fischer Scientific BP212R-1
Ampicillin Sodium Sigma-Aldrich A0166 5 g
Antibiotic-Antimycotic (100x) ThermiFischer Scientific 15240096
Arabinose Sigma-Aldrich A3256 500 g
Avanti J-26XP (High-Performance Centrifuge) Beckman Coulter
Bacto-Agar BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA 214010
BDP-FL-tetrazine Lumiprobe (USA) 2.14E+02
β-mercaptoethanol Millipore 444203 250 mL
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B8026
BSA Sigma-Aldrich A4503 500 g
Casein Sigma-Aldrich C8654
Catalase Sigma-Aldrich C9322
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C1919
Click Amino Acid / trans-Cyclooct-2-en – L - Lysine (TCO*A) SiChem GmbH SC-8008 Size: 500 mg
DAPI (Hoechst33342) Invitrogen H3570
DeNovix DS-11+ Spectrophotometer DeNovix
DMEM* Corning 10-013-CV * Used for maintaining HeLa Cell
DMEM** Gibco 11965-092 **Used for bacterial infection in presence of ncAA, see section 5.4.
DMSO Sigma-Aldrich D8418 250 g
Donkey anti-rabbit Alexa fluoro555 secondary antibody Invitrogen A-31572
DPBS, 1x Corning 21-031-CV
E. coli strain BL21 (DE3) Novagen (Madison, WI)
EMCCD Camera Andor iXon Ultra 897-BV
Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 mL (PCR clean) Eppendorf, Hamburg, Germany 30123.328
Fetal Bovine Serum (FBS) Fischer 10082147
Fisherbrand Syringe Filters - Sterile (PVDF 0.22 µm) Fischer Scientific 97203 Pack of 100
Gene Pulser Xcell Electroporator BIO-RAD 1652660
Gentamycin Sigma-Aldrich G1272 10 mL
Gibco L-Glutamine (200 mM), 100x Fischer Scientific 25-030-081
Glucose oxidase Sigma-Aldrich G7141-50KU
Glycerol Fischer Scientific BF229-4
HeLa cells ATTC CCL-2
HEPES Buffer Corning 25-060-C1 100 mL
Hydrocloric acid Fischer Scientific A144-212
ImageJ Image processing and analysis:  http://rsbweb.nih.gov/ij
IntantBlue Expedeon ISB1L Coomassie-based stain
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma-Aldrich I5502
Janelia Fluoro 646-tetrazine Tocris Bioscience 7279
Kanamycin Sigma-Aldrich 60615 5 g
LB Broth BD Difco 244620 500 g
Lysozyme Sigma-Aldrich L6876
μManager (v. 1.4.2) https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release
MES Sigma-Aldrich M3671 250 g
Micro pulser cuvette BIO-RAD 165-2086 0.2 cm electrode gap, pkg. of 50
Nikon N-STORM Nikon Instruments Inc. https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/super-resolution-microscopes/n-storm-super-resolution
Nunc EasYFlask Cell Culture Flasks ThermiFischer Scientific 156499
Omnipur Casamino Acid Calbiochem 2240 500 g
Paraformaldehhyde (PFA) Electron Microscopy Sciences  15710
PBS (10x) Roche 11666789001
Penicillin-Streptomycin Solution (100x) GenDEPOT  CA005-010 100 mL
pEVOL-PylRS-AF For plasmid construction and map see following references
1. Angew Chem Int Ed Engl. 2011, 50(17), 3878-81.
2. Angew Chem Int Ed Engl., 2012, 51, 4166-70.
Plasmid Mini-prep Kit Qiagen 27106
plasmid pWSK29-sseJ10TAG-HA Ref.: elife. 2021, 10, e67789.
plasmid pWSK29-sseJ-HA Ref.: elife. 2021, 10, e67789.                                                                   Vector map of PWSK29: https://www.addgene.org/172972/
Pluronic F-127 Millipore 540025 Protein grade, 10% Solution
Potassium phosphate monobasic Fischer Scientific P285-500
Potassium sulphate Acros Organic 424220250
Protease Inhibitor Cocktail Set I - Calbiochem Sigma-Aldrich 539131 100x Solution
Rabbit anti-HA primary antibody Sigma-Aldrich H6908
S. enterica. serovar Typhimurium 14028s Ref.: PLoS Biol. 2015, 13, e1002116.
Saponin Sigma-Aldrich 47036-50G-F
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich L3771
Sodium hydroxide Fischer Scientific SS255-1
Sodium Pyruvate (100 mM), 100x Corning 25-060-C1 100 mL
Sonic Dismembrator Model 100 Fischer Scientific 24932
STED microsocpe (Leica TCS SP8 STED 3X system) Leica Microsystems, Wetzlar, Germany https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/
ThunderSTORM https://zitmen.github.io/thunderstorm/
Trizma Base Sigma-Aldrich T1503
Trypsin-EDTA (1x), 0.25%   GenDEPOT  CA014-010
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416 100 mL
X-well tissue culture chamber slides SARSTEDT 94.6190.802

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Marlovits, T. C., et al. Structural insights into the assembly of the type III secretion needle complex. Science. 306 (5698), 1040-1042 (2004).
  2. Kubori, T., et al. Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretion system. Science. 280 (5363), 602-605 (1998).
  3. LaRock, D. L., Chaudhary, A., Miller, S. I. Salmonellae interactions with host processes. Nature Reviews Microbiology. 13 (4), 191-205 (2015).
  4. Galan, J. E., Waksman, G. Protein-injection machines in bacteria. Cell. 172 (6), 1306-1318 (2018).
  5. Feng, X., Oropeza, R., Kenney, L. J. Dual regulation by phospho-OmpR of ssrA/B gene expression in Salmonella pathogenicity island 2. Molecular Microbiology. 48 (4), 1131-1143 (2003).
  6. Walthers, D., et al. Salmonella enterica response regulator SsrB relieves H-NS silencing by displacing H-NS bound in polymerization mode and directly activates transcription. Journal of Biological Chemistry. 286 (3), 1895-1902 (2011).
  7. Chakraborty, S., Mizusaki, H., Kenney, L. J. A FRET-based DNA biosensor tracks OmpR-dependent acidification of Salmonella during macrophage infection. PLoS Biology. 13 (4), e1002116 (2015).
  8. Liew, A. T. F., et al. Single cell, super-resolution imaging reveals an acid pH-dependent conformational switch in SsrB regulates SPI-2. eLife. 8, e45311 (2019).
  9. Knuff, K., Finlay, B. B. What the SIF is happening-the role of intracellular Salmonella-induced filaments. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 335 (2017).
  10. Drecktrah, D., et al. Dynamic behavior of Salmonella-induced membrane tubules in epithelial cells. Traffic. 9 (12), 2117-2129 (2008).
  11. Garcia del-Portillo, F., Zwick, M. B., Leung, K. Y., Finlay, B. B. Salmonella induces the formation of filamentous structures containing lysosomal membrane glycoproteins in epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (22), 10544-10548 (1993).
  12. Singh, M. K., Zangoui, P., Yamanaka, Y., Kenney, L. J. Genetic code expansion enables visualization of Salmonella type three secretion system components and secreted effectors. elife. 10, e67789 (2021).
  13. Singh, M. K., Kenney, L. J. Super-resolution imaging of bacterial pathogens and visualization of their secreted effectors. FEMS Microbiology Reviews. 45 (2), fuaa050 (2020).
  14. Akeda, Y., Galan, J. E. Chaperone release and unfolding of substrates in type III secretion. Nature. 437 (7060), 911-915 (2005).
  15. Su, W. W. Fluorescent proteins as tools to aid protein production. Microbial Cell Factories. 4 (1), 12 (2005).
  16. Wang, S., Moffitt, J. R., Dempsey, G. T., Xie, X. S., Zhuang, X. Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8452-8457 (2014).
  17. Ghodke, H., Caldas, V. E. A., Punter, C. M., van Oijen, A. M., Robinson, A. Single-molecule specific mislocalization of red fluorescent proteins in live Escherichia coli. Biophysical Journal. 111 (1), 25-27 (2016).
  18. Gahlmann, A., Moerner, W. E. Exploring bacterial cell biology with single-molecule tracking and super-resolution imaging. Nature Reviews Microbiology. 12 (1), 9-22 (2014).
  19. Keppler, A., et al. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).
  20. Gautier, A., et al. An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells. Chemical Biology. 15 (2), 128-136 (2008).
  21. Young, A. M., Minson, M., McQuate, S. E., Palmer, A. E. Optimized fluorescence complementation platform for visualizing Salmonella effector proteins reveals distinctly different intracellular niches in different cell types. ACS Infectious Diseases. 3 (8), 575-584 (2017).
  22. Martin, B. R., Giepmans, B. N., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Mammalian cell-based optimization of the biarsenical-binding tetracysteine motif for improved fluorescence and affinity. Nature Biotechnology. 23 (10), 1308-1314 (2005).
  23. Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications. Journal of the American Chemical Society. 124 (21), 6063-6076 (2002).
  24. Gao, Y., Spahn, C., Heilemann, M., Kenney, L. J. The pearling transition provides evidence of force-driven endosomal tubulation during Salmonella infection. mBio. 9 (3), e01083-e01018 (2018).
  25. Brumell, J. H., Goosney, D. L., Finlay, B. B. SifA, a type III secreted effector of Salmonella typhimurium, directs Salmonella-induced filament (Sif) formation along microtubules. Traffic. 3 (6), 407-415 (2002).
  26. Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
  27. Davis, L., Chin, J. W. Designer proteins: applications of genetic code expansion in cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 168-182 (2012).
  28. Chin, J. W., et al. Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).
  29. Kipper, K., et al. Application of noncanonical amino acids for protein labeling in a genomically recoded Escherichia coli. ACS Synthetic Biology. 6 (2), 233-255 (2017).
  30. Uttamapinant, C., et al. Genetic code expansion enables live-cell and super-resolution imaging of site-specifically labeled cellular proteins. Journal of American Chemical Society. 137 (14), 4602-4605 (2015).
  31. Plass, T., et al. Amino acids for Diels-Alder reactions in living cells. Angewandte Chemie International Edition. 51 (17), 4166-4170 (2012).
  32. Lang, K., et al. Genetic encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions. Journal of the American Chemical Society. 134 (25), 10317-10320 (2012).
  33. Xu, H., et al. Re-exploration of the codon context effect on amber codon-guided incorporation of noncanonical amino acids in Escherichia coli by the blue-white screening assay. ChemBioChem. 17 (13), 1250-1256 (2016).
  34. Nakamura, Y., Gojobori, T., Ikemura, T. Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000. Nucleic Acids Research. 28 (1), 292 (2000).
  35. Spahn, C., et al. Sequential super-resolution imaging of bacterial regulatory proteins: the nucleoid and the cell membrane in single, fixed E. coli cells. Methods in Molecular Biology. 1624, 269-289 (2017).
  36. Grimm, J., English, B., Chen, J., et al. A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy. Nature Methods. 12 (3), 244-250 (2015).
  37. Xu, J., Ma, H., Liu, Y. Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM). Current Protocols in Cytometry. 81 (1), 12-46 (2017).
  38. Meineke, B., Heimgärtner, J., Eirich, J., Landreh, M., Elsässer, S. J. Site-specific incorporation of two ncAAs for two-color bioorthogonal labeling and crosslinking of proteins on live mammalian cells. Cell Reports. 31 (12), 107811 (2020).
  39. Bessa-Neto, D., et al. Bioorthogonal labeling of transmembrane proteins with non-canonical amino acids unveils masked epitopes in live neurons. Nature Communications. 12 (1), 6715 (2021).
  40. Beliu, G., et al. Bioorthogonal labeling with tetrazine-dyes for super-resolution microscopy. Communication Biology. 2, 261 (2019).
  41. Arsić, A., Hagemann, C., Stajković, N., Schubert, T., Nikić-Spiegel, I. Minimal genetically encoded tags for fluorescent protein labeling in living neurons. Nature Communications. 13 (1), 314 (2022).

Tags

علم الأحياء ، العدد 192 ، السالمونيلا ، الأحماض الأمينية غير المتعارف عليها ، توسيع الشفرة الوراثية ، SseJ ، الدقة الفائقة ، dSTORM
تصوير فائق الدقة للبروتينات المفرزة البكتيرية باستخدام توسيع الشفرة الوراثية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Singh, M. K., Kenney, L. J.… More

Singh, M. K., Kenney, L. J. Super-Resolution Imaging of Bacterial Secreted Proteins Using Genetic Code Expansion. J. Vis. Exp. (192), e64382, doi:10.3791/64382 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter