Summary
この記事では、遺伝暗号拡大(GCE)部位特異的にサル モネラ 菌分泌エフェクターを標識し、直接確率的光学再構成顕微鏡(dSTORM)を使用してHeLa細胞内の分泌タンパク質の細胞内局在を画像化するための簡単で明確なプロトコルを提供します。
Abstract
タイプ3分泌システム(T3SS)は、グラム陰性菌が真核生物宿主細胞の細胞質ゾルに直接エフェクタータンパク質のバッテリーを注入することを可能にします。侵入すると、注入されたエフェクタータンパク質は真核生物のシグナル伝達経路を協調的に調節し、細胞機能を再プログラムして、細菌の侵入と生存を可能にします。感染の状況下でこれらの分泌されたエフェクタータンパク質をモニタリングおよび局在化することは、宿主-病原体相互作用の動的インターフェースを定義するためのフットプリントを提供します。しかし、宿主細胞内の細菌タンパク質の構造/機能を破壊することなく標識およびイメージングすることは技術的に困難です。
蛍光融合タンパク質を構築しても、融合タンパク質は分泌装置を詰まらせて分泌されないため、この問題は解決しません。これらの障害を克服するために、我々は最近、遺伝暗号拡張(GCE)を用いて、細菌分泌エフェクターやその他の標識が困難なタンパク質の部位特異的蛍光標識法を採用しました。この論文では、GCE部位特異的にサル モネラ 菌分泌エフェクターを標識するための完全なステップバイステップのプロトコルを提供し、その後、直接確率的光学再構成顕微鏡(dSTORM)を使用してHeLa細胞内の分泌タンパク質の細胞内局在をイメージングするための指示を提供します。
最近の知見は、GCE を介して 非標準アミノ酸(ncAA)を取り込み、続いてテトラジン含有色素による生体直交標識を行うことが、細菌分泌タンパク質の選択的標識と可視化、およびその後の宿主での画像解析のための実行可能な技術であることを示唆しています。この記事の目的は、GCEを使用して超解像イメージングを実施し、細菌やウイルスのさまざまな生物学的プロセス、および宿主と病原体の相互作用を研究することに関心のある研究者が採用できる、簡単で明確なプロトコルを提供することです。
Introduction
細菌感染症は長い間、人間の健康に対する深刻な危険と見なされてきました。病原体は、高度に進化し、非常に強力で複雑な防御システム、およびさまざまな細菌の病原性因子(エフェクタータンパク質と呼ばれる)を使用して、宿主の免疫応答を回避し、感染を確立します1,2。しかし、これらの系の根底にある分子メカニズムと個々のエフェクタータンパク質の役割は、病因発生時に宿主細胞内の重要なタンパク質成分とエフェクターを直接追跡するための適切なアプローチが不足しているため、まだほとんど知られていません。
典型的な例の1つは、急性胃腸炎を引き起こすサルモネラ・エンテリカ・セロバー・チフィムリウムです。サルモネラチフィムリウムは、タイプ3分泌系(T3SS)を使用して、さまざまなエフェクタータンパク質を宿主細胞に直接注入します。サルモネラ菌が宿主細胞に入るとすぐに、サルモネラ菌含有液胞(SCV)3,4と呼ばれる酸性膜結合コンパートメントに存在します。SCVの酸性pHは、サルモネラ病原性アイランド2(SPI-2)にコードされたT3SSを活性化し、液胞膜を横切って20以上のエフェクタータンパク質のボレーを宿主細胞質ゾル5,6,7,8に移動します。宿主内では、これらの複雑なエフェクタータンパク質のカクテルが宿主細胞のシグナル伝達経路を協調的に操作し、その結果、SCVから微小管に沿って伸びた非常にダイナミックで複雑な管状膜構造が形成され、サルモネラ菌誘発フィラメント(SIF)と呼ばれ、サルモネラ菌が宿主細胞内で生存および複製できるようになります9,10,11。
細菌のエフェクター局在を視覚化、追跡、モニタリングし、宿主細胞内での輸送と相互作用を調べる方法は、細菌の病因を支えるメカニズムへの重要な洞察を提供します。宿主細胞内でのサルモネラ菌分泌T3SSエフェクタータンパク質の標識と局在化は、技術的な課題であることが証明されています12,13;それにもかかわらず、遺伝的にコードされた蛍光タンパク質の開発は、生体系内のタンパク質を研究し視覚化する私たちの能力を変えました。しかし、蛍光タンパク質のサイズ(~25-30 kDa)15は、多くの場合、目的のタンパク質のサイズと同等かそれ以上です(POI、例えば、SsaPの場合は13.65 kDa、SifAの場合は37.4 kDa)。実際、エフェクターの蛍光タンパク質標識は、標識されたエフェクターの分泌を遮断し、T3SS14を詰まらせることがよくあります。
さらに、蛍光タンパク質は安定性が低く、光退色前に放出する光子の数が少ないため、超解像顕微鏡技術16、17、18、特に光活性化局在顕微鏡(PALM)、STORM、および誘導放出枯渇(STED)顕微鏡での使用が制限されています。有機蛍光色素の光物性は蛍光タンパク質の光物性よりも優れていますが、CLIP/SNAP19,20、Split-GFP 21、ReAsH/FlAsH 22,23、HA-Tags 24,25などの方法/技術には、翻訳後修飾またはトラフィッキングを妨害することにより、目的のエフェクタータンパク質の構造機能を損なう可能性のある追加のタンパク質またはペプチド付加が必要です。必要なタンパク質修飾を最小限に抑える代替方法として、GCEを介した翻訳中にncAAをPOIに組み込む方法があります。ncAAは蛍光性であるか、またはクリックケミストリー12、13、26、27、28を介して蛍光にすることができる。
GCEを使用すると、微小で機能的な生物学的直交基(アジド、シクロプロペン、シクロオクチン基など)を持つncAAを、標的タンパク質のほぼすべての場所に導入できます。この戦略では、ネイティブコドンは、POIの遺伝子内の指定された位置にあるアンバー(TAG)終止コドンなどのまれなコドンと交換されます。修飾されたタンパク質は、その後、直交アミノアシル-tRNA合成酵素/tRNAペアと一緒に細胞内で発現されます。tRNA合成酵素活性部位は、1つの特定のncAAのみを受け取るように設計されており、その後、アンバーコドンを認識するtRNAの3'末端に共有結合します。ncAAは単に増殖培地に導入されますが、細胞に取り込まれて細胞質ゾルに到達しなければならず、そこでアミノアシルtRNA合成酵素(aaRS)がそれを直交tRNAにリンクすることができます。その後、指定された位置のPOIに組み込まれます(図1を参照)12。したがって、GCEは、ケトン、アジド、アルキン、シクロオクチン、トランスシクロオクテン、テトラジン、ノルボネン、α、β不飽和アミド、ビシクロ[6.1.0]-ノニンなどの多数の生体直交反応性基をPOIに組み込むことを可能にし、従来のタンパク質標識法の制限を克服する可能性があります12,26,27,28。
超解像イメージング技術の最近の新たなトレンドは、分子レベルで生物学的構造を調査するための新しい道を開きました。特に、1分子、局在化ベースの超解像技術であるSTORMは、~20-30 nmまでの細胞構造を可視化するための貴重なツールとなり、一度に1分子ずつ生物学的プロセスを調査することができ、従来のアンサンブル平均研究ではまだ知られていない細胞内分子の役割を発見しました13。.単一分子および超解像技術では、最高の分解能を得るために、明るく光安定性のある有機蛍光色素を含む小さなタグが必要です。我々は最近、GCEが超解像イメージングに適したプローブを組み込むために使用できることを実証しました12。
細胞内のタンパク質標識のための最良の選択肢の2つは、ビシクロ[6.1.0]ノニネリジン(BCN)およびトランスシクロオクテン-リジン(TCO;図1に示す)であり、これらはtRNA/シンテターゼペアの変異体(ここではtRNA Pyl/PylRS AFと呼ばれる)を使用して遺伝的にコードされている可能性があり、ここでPylはピロリジンを表し、AFはピロリジン12を自然にコードするメタノサルシナマゼイに由来する合理的に設計された二重変異体(Y306A、Y384F)を表します。 29,30,31。ひずみ促進逆電子要求ディールス・アルダー環化付加(SPIEDAC)反応により、これらのアミノ酸はテトラジン結合体と化学選択的に反応します(図1)12,30,31。このような環化付加反応は非常に速く、生細胞と互換性があります。それらはまた、適切なフルオロフォアがテトラジン部分12、26、32で官能化されている場合、蛍光性であってもよい。この論文では、GCEを使用して宿主細胞に送達された細菌エフェクターのダイナミクスをモニタリングするための最適化されたプロトコルを提示し、その後、dSTORMを使用してHeLa細胞内の分泌タンパク質の細胞内局在をモニタリングします。この結果は、GCEを介したncAAの取り込みとそれに続く蛍光発生テトラジン含有色素とのクリック反応が、選択的標識、分泌タンパク質の可視化、およびその後の宿主における細胞内局在化のための汎用性の高い方法であることを示しています。ただし、ここで詳述するすべてのコンポーネントと手順は、GCEシステムを他の生物学的問題を調査するように調整または置換することができます。
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Protocol
1. プラスミド構築
- POIを発現する遺伝子を、大腸菌BL21(DE3)でPOIを発現する発現プラスミド(例えば、pET28a-sseJ 10TAG)にクローニングする。この工程は、変異体が機能的であるとの判定を容易にする。
- 宿主細胞におけるサルモネラ菌分泌エフェクターの可視化のために、以前の報告7、12、24に記載されているように、天然プロモーターの制御下で標的POI SseJを発現する発現プラスミド(pWSK29-sseJ-HA)を構築します。部位特異的突然変異誘発法を用いて、フェニルアラニン-10のコドンをSseJ(pWSK29-sseJ 10TAG-HA)のアンバーコドン(TAG)に置換し、AAT-TAG-ACTモチーフを確保します33,34。
- 上記のプラスミドに加えて、トランス-シクロオクト-2-エン-L-リジン(TCO*A)をPOIに遺伝的に組み込むには、プラスミドpEVOLにコードされた進化したtRNA/シンテターゼペア(tRNAPyl/PylRS AF)遺伝子を含む別の発現プラスミド(pEVOL-PylRS-AF)31を使用します。
注:プラスミドおよびクローニングプロトコルの詳細な説明は、以前のレポート30、31に記載されています。 - 市販のプラスミド調製キットを使用して、高品質のプラスミドDNAを入手してください。精製されたDNAの場合、最適な260/280の比率は~1.8です。必要に応じて、1%アガロースゲル電気泳動を使用してDNA純度を確認します。
2.細菌培養の準備
- 変異体が大腸菌で機能していることを試験するための二重形質転換体の入手
- BL21コンピテントセルを-80°Cから取り出し、氷上で約20〜30分間解凍します。
- 1–5 μLの各プラスミド(~50 ngのpEVOL-PylRS-AFおよびpET28a-sseJ 10TAG)を200 μLの化学的に有能なBL21細胞と1.5 mLの微量遠心チューブで混合します。コンピテントセルとプラスミド混合物を穏やかに混合します。氷上で30分間インキュベートします。
- 微小遠心チューブを42°Cの水浴中で45秒間ヒートショックします。チューブを2分間氷上に戻します。
- 1 mLの温かいLB培地を微量遠心チューブに加え、混合物を15 mLのコニカルチューブにすばやく移します。細胞を振とう機で37°C、250 rpmで1時間インキュベートします。形質転換細胞の一部または全部を、適切な抗生物質を含むLB寒天プレート上にプレートする。プレートを37°Cで一晩インキュベートします。
注:このプロトコルでは、35 μg/mLのクロラムフェニコールと50 μg/mLのカナマイシンを使用して、それぞれpEVOL-PylRS-AFとpET28a-sseJ 10TAGを選択しました。変換ステップでは、ネガティブコントロールとポジティブコントロールを使用して成功したトランスフォーメーションを評価します。
- 変異体をサルモネラ菌に移し、宿主細胞中のサルモネラ菌分泌エフェクターを可視化します。
- 冷却したマイクロ遠心チューブ内で、pEVOL-PylRS-AFおよびpWSK29-sseJ 10TAGをそれぞれ2〜3 μLの電気コンピテントサルモネラチフィムリウム14028株40〜60 μLに加えます。混合物をピペットで穏やかに混合する。
- エレクトロポレーション混合物を冷却(0.2cm電極ギャップ)キュベットに移す。エレクトロポレーションの設定を 2.5 kV、200 Ω、25 μFに設定します。キュベットをエレクトロポレーションチャンバー内に置きます。チャンバー電極がマイクロパルサーキュベットとしっかりと接触していることを確認してください。
- ビープ音が鳴るまで パルス ボタンを押し続けます。
- すぐに1mLの温かいLB培地をキュベットに加えます。内容物全体を15mLのコニカルチューブに移します。細胞を37°Cでインキュベートし、250rpmで1時間振とうします。
- サルモネラ菌のエレクトロポレーション混合物の一部または全部を、適切な抗生物質を含むLB寒天プレート上にプレートします。プレートを37°Cで一晩インキュベートします。
注:このプロトコルでは、35μg/mLのクロラムフェニコールと100μg/mLのアンピシリンをそれぞれpEVOL-PylRS-AFおよびpWSK29-sseJ 10TAGの選択に使用しました。
- 培養準備
- サルモネラ菌または大腸菌の単一コロニーを、適切な抗生物質を含む5 mLのLB培地に接種します。37°Cで一晩増殖させ、250rpmで振とうする。
3. ncAA含有タンパク質の発現と蛍光標識
- 大腸菌におけるncAA含有タンパク質の発現
- 100 μLの初代培養液を、35 μg/mLのクロラムフェニコールと50 μg/mLのカナマイシンを含む5 mLのLB培地(1:50希釈)に移し、続いてOD600 が0.4〜0.6に達するまで250 rpmで振とうしながら37°Cでインキュベートします。
- 1 mM TCO*A ストック溶液 (10 mL; 表 1)。
- 培養液がOD600 = 0.4〜0.6に達したら、LB培地を1 mM TCO*A、35 μg/mLクロラムフェニコール、および50 μg/mLカナマイシンを含む新しいLBと交換します。
注:または、ステップ5.4.2の説明に従ってTCO*Aストック溶液を調製することもできます。 - 1 mM IPTG、0.2%アラビノースの存在下でタンパク質発現を誘導し、34°C、250 rpmで一晩振とうします。11,000 × gで5分間遠心分離して菌体を回収します。上清を除去し、さらに使用するまでペレットを-20°Cで凍結させる。
- 対照実験では、同じ実験を繰り返しますが、ncAAの非存在下でncAA含有タンパク質を発現させます。大腸菌におけるncAA保有タンパク質のin vitro蛍光標識については、ステップ3.3に記載されている詳細な手順に従ってください。
- サルモネラ菌におけるncAA含有タンパク質の発現
- 初代培養液100 μLを、クロラムフェニコール35 μg/mLとアンピシリン100 μg/mLを含むLB培地5 mL(1:50希釈)に移し、37°Cでインキュベートし、OD600 が0.6に達するまで250 rpmで振とうします。
- 表1に記載のように修飾N-最小培地(MgM、pH 5.6)を調製する。
- LB培地を、1 mM TCO*Aを添加した修飾N-最小培地(MgM)と交換します(表1)。細菌を34°Cで30分間増殖させます。次に、0.2%アラビノース、25 mg / mLクロラムフェニコール、および100 mg / mLアンピシリンを加え、250 rpmで振とうしながら、さらに6時間細胞を増殖させます。
- 6時間後、ncAAを含まない新鮮なMgM(pH 5.6)培地(表1)で、30分間隔で細菌を4回洗浄します。洗浄ステップでは、室温で15分間972× gを使用します。
- 細菌を遠心分離し、1x PBSバッファーに再懸濁し、暗所で4°Cで1時間インキュベートして、過剰なncAAを除去します。1時間後、細菌を3,000 × g、4°Cで15分間遠心分離し、さらに使用するために保存します。
- 対照実験では、ncAAの非存在下でncAA含有タンパク質を発現させることにより、同じ実験を繰り返します。
- ネズミチフス菌におけるncAA含有タンパク質のin vitro蛍光標識
- SseJ-F10TCO-HAを発現する サルモネラ 細胞をTCO*Aの非存在下または存在下(ステップ3.2から)で1x PBSに再懸濁します。PBSでOD600 を4に調整します。細胞を20 μM Janelia Fluor 646-テトラジン(JF646-Tz)または20 μM BDP-Fl-テトラジン(DMSO中の5 mMストック溶液)とともに暗所で37°Cでインキュベートし、250 rpmで1〜2時間振とうします。
- 細胞をペレット化し、5%DMSOおよび0.2%プルロニックF-127を含むPBSで3〜4倍洗浄し、5%DMSOを含むPBSに再懸濁し、暗所で4°Cで一晩インキュベートします。1x PBSで2回もう一度洗います。洗浄ステップでは、972 × gを使用し、室温で15分間使用します。
- 共焦点顕微鏡を使用して細胞をすぐにイメージングするか、PBS中の1.5%パラホルムアルデヒド(PFA)で室温暗所で30〜45分間固定します。
- 固定した細胞をPBSで2回洗浄し、最後にPBS中の50 mM NH4Clで15分間洗浄して、余分なPFAを除去します。細胞をPBSに再懸濁し、4°Cで3〜4日以内保存します。セクション6で説明されているように、共焦点顕微鏡を使用して細菌を画像化します。
4. ncAA含有タンパク質の生化学的特性評価
- 細胞溶解
- セクション3.1の細胞を溶解バッファー(表1)に再懸濁し、室温で30分以上インキュベートします。混合物を氷上で15分間冷やす。
注: 使用する細胞重量に対する溶解バッファー の比率を 1:10に保ちます。 - まだ氷上で再懸濁した細胞を超音波処理します。超音波処理器を使用して、少なくとも6倍の設定7で30秒間パルスし、1分のギャップがあります(材料の表を参照)。
- 細胞ライセートを20,500 × g、4°Cで15分間スピンダウンします(4°Cを維持することが重要です)。上清を新しいチューブに移し、ペレットを廃棄します。
- セクション3.1の細胞を溶解バッファー(表1)に再懸濁し、室温で30分以上インキュベートします。混合物を氷上で15分間冷やす。
- SDSページ分析
- 5x SDSローディング色素を準備します(表1)。5 μLのSDSゲルローディングバッファーを13 μLの細胞ライセートに加えます。ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)サンプルバッファーを2 mLチューブ中で95°Cで10分間変性させ、混合物を2,000 × g で50秒間遠心分離し、12%SDSポリアクリルアミドゲルにロードします。
- ゲルカセットを組み立て、ゲル電気泳動装置に入れ、電気泳動装置を電源に接続します。ランニングバッファーを注ぎ、分子量マーカーとタンパク質サンプルをロードし、ブロモフェノールが分離ゲルの底に達するまで100 Vでゲルを実行します。
注:-20°Cで保存されたライセートは、凍結融解サイクルのたびに品質が低下する傾向があるため、すぐに分析を開始してください。 - ゲルをクーマシーブループロテイン染色で染色します。
5. HeLa細胞におけるサルモネラ 菌分泌エフェクターSseJ-F10TCO-HAの生体直交標識
- ペニシリン-ストレプトマイシン(1x)に加えて10%(v/v)FBSを添加した高グルコース(4.5 g / L)ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)で、HeLa細胞を37°C、5%CO2、湿度95%で培養および維持します。
- 感染の1日前に細菌を培養する。pEVOL-PylRS-AFおよびpWSK29-sseJ 10TAGを含むサルモネラ菌14028の単一コロニーを、抗生物質含有標準LBブロス5 mLに37°C、250 rpmで一晩振とうします。
- 感染の1日前にHeLa細胞を播種します。HeLa細胞を含む組織培養フラスコ(T-75)を~80%のコンフルエントで取り、細胞密度の顕微鏡検査によって決定します。温かいPBSで細胞を洗います。3 mLの温かい0.25%トリプシン/EDTAで細胞を37°C、5%CO2で5分間剥離します。
- 2 mLのDMEM(+10%FBS)を使用してトリプシンをクエンチします。細胞を再懸濁した後、フラスコの内容物全体を15 mLチューブに移します。セルを1,000 × g で5分間スピンダウンします。上清をチューブから取り出します。HeLa細胞ペレットを予温した増殖培地に再懸濁します。
- 血球計算盤を使用して懸濁液を調べ、存在する細胞を数えます。希釈した細胞ストックを1×105 細胞/mLで調製します。ウェルあたり0.5 ×10 5 HeLa細胞を500 μLのDMEM + 10%FBS増殖培地に8ウェルチャンバースライドで播種します。チャンバースライドをインキュベーター内の37°C、5%CO2、湿度95%で24時間保持します。
- 細菌感染
- pEVOL-PylRS-AFおよびpWSK29-sseJ 10TAGを保有する継代培養サルモネラ菌14028sを、100 μLの一晩細菌培養物(ステップ5.2から)を35 μg/mLクロラムフェニコールおよび100 μg/mLアンピシリンを含む3 mLのLB培地(1:30希釈)に希釈し、続いて37°Cで250 rpmで5〜7時間振とうしてインキュベートします。
注:この段階では、培養物は指数関数的後期に達し、細菌は非常に侵襲的です。 - 100 mM TCO*Aストック溶液と完全な培地を準備します(表1)。
- HeLa細胞感染を開始するには、インキュベーターからHeLa細胞を取り出し、予熱したDPBSで細胞を洗浄してから、500 μLの新鮮なDMEM(+10%FBS)を各ウェルに加えます。感染が始まるまでチャンバースライドをCO2 インキュベーターに戻します。
- 5〜7時間のインキュベーション後、サルモネラ菌培養物を1 mLのDMEM増殖培地(~3 × 108 cfu/mL)でOD600 = 0.2に希釈します。チャンバースライドの各ウェルに必要量のサルモネラ菌種源を追加して、感染多重度(MOI)が100になるようにします。
- 感染細胞をCO2 インキュベーターで30分間インキュベートします。細胞外サル モネラ菌を除去するために、予熱したDPBSで細胞を3回洗浄します。この時点を感染後0時間に設定します。100 μg/mLのゲンタマイシンを含む完全培地(表1)500 μLを1時間加えます。1時間後、細胞をDPBSで3倍洗浄します。500 μLの完全な培地を追加します(ステップ5.4.2; 表1)チャンバースライドの各ウェルに0.2%アラビノース、10 μg/mLのゲンタマイシンを添加しました。
- 対照実験では、TCO*AなしでHeLa細胞の同様の感染を行います。
- チャンバースライドをCO2 インキュベーター内で10時間インキュベートします。
- pEVOL-PylRS-AFおよびpWSK29-sseJ 10TAGを保有する継代培養サルモネラ菌14028sを、100 μLの一晩細菌培養物(ステップ5.2から)を35 μg/mLクロラムフェニコールおよび100 μg/mLアンピシリンを含む3 mLのLB培地(1:30希釈)に希釈し、続いて37°Cで250 rpmで5〜7時間振とうしてインキュベートします。
- 生細胞における化学ベースの標識をクリック
- 細菌感染細胞の標識に進みます。TCO*Aなしで培地全体を予熱します(表1)。
- 感染後10時間後、完全培地をTCO*Aを含まない新鮮な完全培地と交換し、予熱したDPBSでそれぞれ30分間隔でHeLa細胞を4回洗浄し、続いて新しい完全培地(TCO*Aなし)を洗浄します。
- DMSO中の0.5 mM色素テトラジンストック溶液を調製します。
注:宿主細胞中の サルモネラ 菌分泌エフェクターを標識するために、2つのプロトコルが提示されています。プロトコル1では、JF646-Tzストックをウシミルクからの1%カゼインナトリウム塩を含む1x PBSで希釈して色素混合物を調製し、最終的な作業溶液が2 μMになるようにします。プロトコル2では、温かい完全培地(FBSおよびTCO*Aを含まない)を準備し、2 μM JF646-TZを追加します。 この色素混合物をラベリングセッションごとに新鮮にします。可能であれば暗闇の中で作業します(フードや部屋の照明を暗くします)。 - 感染後12時間後、細胞から培地を吸引します。予熱したDPBSでセルを2回または3回洗浄します。あるグループのウェルに、プロトコル1に記載されている色素溶液混合物500 μLを追加し、同じチャンバースライドの別のグループのウェルに、ステップ5.5.3および後の注で述べたプロトコル2に記載されている色素溶液混合物500 μLを追加します。チャンバースライドをCO 2インキュベーターに1.5〜2 時間戻します。
- 感染後13.5〜14時間後、予熱したDPBSでHeLa細胞を2回すすぎます。500 μLの新鮮なDMEM(FBSを補給)を加えます。チャンバースライドをインキュベーターに30分間戻します。予熱したDPBSで細胞を洗浄し、続いて新鮮なDMEMを30分間隔で4回洗浄します。
- 感染後16時間で、各ウェルに200 μLの4%PFAを添加し、暗所で室温で10分間インキュベートすることにより、HeLa細胞をPFAで固定します。PFAを吸引し、PBSで3回すすぎ、細胞を暗所で4°CのPBSに保存します。
注意: PFAは非常に有毒な化学物質です。吸入、皮膚や目の接触を避けてください。取り扱うときは保護具を着用してください。標識されたサンプルが光にさらされないようにするには、細胞培養フードの光を消してください。
- HAタグ付きタンパク質の免疫染色
- PBSを吸引し、ブロッキング溶液で一度すすいでください(表1)。
- 固定したHeLa細胞をPBSベースの一次抗体溶液(表1)とともに、暗所で室温で1時間インキュベートします。ウサギ抗HA一次抗体を使用して、分泌されたSseJを染色します(1:500希釈)。
- 1時間後、0.5 mLの0.1%トゥイーン-20/1x PBSで細胞を2回穏やかに洗浄します。Tween/PBS溶液で洗浄しながら、細胞を0.5 mLの0.1%Tween20/1x PBSで5分間インキュベートします。
- 二次抗体ロバ抗ウサギ555 1:500を二次抗体溶液で希釈し、暗所で室温で1時間インキュベートします。
- 1時間後、細胞を0.5 mLの0.1%トゥイーン-20/1x PBSで2回穏やかに洗浄し、0.5 mLの0.1%トゥイーン20/1x PBSで2回5分間インキュベートします。
- 細胞を0.5 mLの1x PBSで3回洗浄し、暗所で4°Cで保存します。
注:固定細胞は、4°CのPBSに数週間保存できます。 免疫染色は土壇場で行われるべきです。
6. 共焦点イメージング
- スピニングディスク(SD)やSTED顕微鏡などの共焦点顕微鏡を使用してください。
- スキャンモード(XYZ)、スキャン速度(400 Hz)、解像度(512 x 512)、倍率(100x)、Zスタッキングなどの画像取得設定を調整します。
- DAPI、BDP-Tz、およびJF646テトラジン用の正しい励起/発光フィルターを使用してください。
注:このプロトコルでは、パルス白色光レーザーを備えたSTED顕微鏡システムで共焦点イメージングが実行され、470〜670 nmの範囲の励起と、405 nm、488 nm、および647 nmでの励起用のUV405 nmダイオードレーザーを選択できました。適切な発光範囲は、内蔵の音響光学ビームスプリッターと、共焦点システムのプリズムベースの調整可能なマルチバンドスペクトル検出を組み合わせて設定されました。 - 100×/1.4の油浸対物レンズを使用して画像を取得します。
7. 超解像(dSTORM)イメージング
- 撮影の3時間前に顕微鏡の電源を入れて、熱平衡を確保します(これより前にイメージングを開始すると、ドリフトが発生する可能性が高くなります)。カメラを-70°Cに冷却します。
- その間、新鮮なGLOX-BMEイメージングバッファーを準備します(表1)。
- 細胞を顕微鏡に持ってきます。イメージングチャンバーをサンプルホルダーの顕微鏡ステージに置きます。ホルダーで、サンプルが平らで安全であることを確認してください。ウェル内の培地を、新たに作製したGLOX-BMEイメージングバッファー0.4 mLで交換します。
- 正しいレーザーラインとフィルターセットを設定します。レーザー出力を~1 mWに下げて、目的のHeLaセルを特定します。647 nmの低いレーザー密度でサンプルを照らしながら、焦点面とレーザービーム角度を調整します(この場合、HILOは信号対バックグラウンド[SBR]を上げるため、急傾斜角[HILO]が推奨されます)。HILO 照明角度を調整します。
注:このプロトコルでは、Tirf対物レンズ(100x Apo TIRF油浸対物レンズ、NA 1.49)を備えた倒立落射蛍光顕微鏡( 材料の表を参照)を使用して、Alexa Fluor 647チャンネルでSseJの超解像イメージングを取得しました。蛍光は、μManagerを介して制御されたEMCCDカメラで検出されました。 - プリアンプのゲインを3に設定し、μManagerでフレーム転送を有効にします。以前のレポート35で説明したように、dSTORM測定の感度を高めるには、EMゲインを200に設定します。
- dSTORMイメージングの前に、ターゲット構造の基準回折制限画像をキャプチャします。蛍光色素を暗状態に切り替えるには、レーザーを最大出力までオンにします。
注:JF646蛍光色素が647 nm励起光の連続照射によって主に暗い状態に変化したときに、JF646蛍光色素の個々の急速に点滅する分子が観察されました(前述のように36)。 - 点滅イベントが空間と時間で区切られる適切なレベルにレーザー強度を調整し、露光時間を30ミリ秒に設定して、取得を開始します。10,000〜30,000フレームを取得します。
注意: まばたきを最適化するには、レーザー強度を変更する必要があります。検出されたイベント(重なり合う粒子の点滅)が多すぎる場合は、レーザー強度を上げることを検討してください。理想的な長さはサンプルの品質によって異なりますが、~10,000フレームは識別可能な特徴を示す必要があります。
8. dストームの画像再構成
- 画像解析には適切なソフトウェアを使用してください。
注:利用可能な多くのオープンソースの画像再構成プログラムの1つであるThunderSTORMについて、以下で簡単に説明します。 - ImageJを開き、生データをインポートします。ThunderSTORMプラグインを開き、デバイスに対応するカメラ設定を構成します。
- [分析の実行]に移動し、画像フィルタリング(平均化フィルターの差)、局在化方法(極大)、分子のサブピクセル局在(積分ガウスPSF)などの適切な設定を行います。[OK] をクリックして、イメージの再構築を開始します。
注:必要に応じて、ThunderSTORMでパラメータを設定するための詳細な手順はすでに説明されています37。
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Representative Results
このプロトコルペーパーでは、図1に示すように、サルモネラ菌分泌エフェクターの部位特異的蛍光標識と可視化のためのGCEベースの方法について説明します。トランスシクロオクテンバイオ直交基(TCO)を有するncAAと蛍光色素の化学構造を図1Aに示す。SseJ標識は、GCE技術を介した直交アミノアシル-tRNA合成酵素/tRNAペアを使用して、アンバー終止コドンに生物学的直交ncAAを遺伝的に組み込むことによって達成されました(図1Bを参照)。TCO標識エフェクターを蛍光色素を含むテトラジン(JF646-TZまたはBDP-Tz)で処理すると、宿主の感染後数時間で転位したサルモネラ菌分泌エフェクターの観察を可能にする代替タンパク質標識戦略が得られました(図1B、C)。まず、表面アクセシビリティとSseJ機能残基に関する既存の知識に基づいて、ncAA包含のための可能なアミノ酸残基と選択された10位のSseJを特定することから始めました。以前の構造データと表面露出投影は、特定の場所の選択に役立ちます。
POIをコードする遺伝子内のアンバーコドンの配置は、TCO取り込みの有効性に影響を与える。結果として、POIの遺伝子の様々な位置に琥珀色のコドンを有する一連の変異体を作成し、最適な統合効率のために分析すべきである。アンバーコドン位置の選択は経験的である。一般に、改変された残基は、POI機能に必須ではなく、翻訳後修飾がなく、蛍光プローブにアクセス可能である必要があります。発現プラスミドは、POIの天然コピー数を模倣するように、低いコピー数であるべきである。コドンの文脈は、ncAAが直交tRNA/アミノアシルtRNA合成酵素系によってどれだけ効果的に取り込まれるかに影響します。AAT-TAG-ACTは直交tRNAの好ましいコンテキストですが、sseJのフェニルアラニン-10の位置がTAGに変更され、ncAAの最も効果的な取り込みを可能にするためのAAT-TAG-ACTコンテキストが確保されました。まず、sseJを発現する高コピー数プラスミドを用いて、変異体が大腸菌で機能するかどうかを試験した。SDS-PAGEで証明されているように、SseJ-F10TCO-HA変異体の発現は、TCO*Aの存在と対応する最適なtRNA/aaRSに依存していました(図2A)。SseJ-F10FCO-HAは、大腸菌中のSPIEDACクリックケミストリーを用いてJF646-Tzで標識されました。インビトロでの大腸菌におけるSseJ-F10TCO-HAの選択的蛍光標識を蛍光顕微鏡分析により確認した(図2B)。GCEを用いると、TCO*AはsseJのアンバーコドンに部位特異的に組み込まれました。tRNAPyl/PylRS AFシステムを使用してncAAのゲノムオフターゲット取り込みを直接同定する試みでは、それらの存在の証拠は得られませんでした。ただし、インゲル蛍光、ウェスタンブロット、蛍光融合タンパク質、in vitro蛍光標識、およびその他の方法を使用して、pEVOLプラスミドの効率、特異性、オフターゲット取り込みの程度、および毒性を評価することをお勧めします。
sseJの抑制されたTAGが機能していることを確認したら、sseJ-F10TCO-HAとそのネイティブプロモーターを低コピー数プラスミドpWSK29にクローニングし、蛍光標識と可視化のためのAAT-TAG-ACTモチーフを確保しました。 サルモネラ菌細胞におけるSseJ-F10TCO-HAのインビトロ選択的標識は、蛍光顕微鏡を用いて確認した(図3)。次に、tco*Aの非存在下または存在下で、p sseJ-HAまたはp sseJ 10TAG-HAで補完された野生型サルモネラ菌株をHeLa細胞に感染させ、TCOに組み込まれたSseJを宿主細胞に転移できるかどうかを調べました。感染したHeLa細胞をPFAで固定し、感染の16時間後に抗HA抗体で免疫染色して、SseJによって装飾されたSIFを強調しました。図4Cに示すように、SseJ-F10TCO-HAは明らかに分泌され、SseJ依存性SIFが形成され、野生型感染細胞で観察されたものと類似した(図4A)。しかし、TCO*Aが存在しない場合、SseJ依存性SIFは観察されませんでした(図4B)。これらの観察により、GCEを用いたsseJ-F10TCO-HAの発現がSseJ依存性SIFをレスキューすることが実証された。さらに、結果はまた、SseJ-F10TCO-HAがサルモネラ菌の完全に機能する病原性因子であることを示しました。
GCE標識SseJが機能的で分泌されていることを確認した後、SPIEDAC反応を用いて、HeLa細胞でSseJ-F10TCO-HAをJF646-TZで標識しました。そのために、我々は、TCO*Aの存在下で、p sseJ-F10TCO-HAで補完された野生型サルモネラ菌をHeLa細胞に感染させました。プロトコルセクション5に記載の2つの代替プロトコルを用いてJF646-Tzで標識した後、細胞を広範囲に洗浄して余分な色素を除去し、PFAで固定し、抗HA抗体で免疫染色して分泌されたSseJ-F10TCO-HAを可視化した。HeLa細胞の細胞質に分泌されたSseJ-F10TCO-HAは、JF646-Tzで標識され(図5A、B、赤色)、HAタグ(緑色)と明確に共局在していました。2つの標識が互いに重なり合っているという観察(一方は蛍光色素、もう一方は免疫染色によって標識された)は、GCE標識の特異性をさらに強調しています。
これらのHeLa細胞で観察される蛍光シグナルが分泌エフェクターSseJのみに特異的であることを確認するために、TCO*AおよびpEVOL-PylRS-AFの存在下で野生型 サルモネラ 菌(psseJ-HAを有する)を細胞に感染させました。クリック色素を用いて、HeLa細胞にバックグラウンド標識があるかどうかを観察した。SseJは宿主細胞の細胞質に放出され、細胞内または非特異的な蛍光シグナルはなく(図5C)、蛍光シグナルがSseJに特異的であることを示しています。ncAAがアンバーコドンに特異的に取り込まれ、分泌されたSseJがクリック反応 を介して 宿主細胞内で可視化できることを決定した後、次の目標は、HeLa細胞で分泌されたSseJの超解像画像を作成することでした(図6)。 図6では、GCEのパワーとJF646色素を使用して、HeLa細胞内の サルモネラ菌 分泌エフェクターSseJの部位特異的超解像画像を生成することを示しています。
図1:SPI-2エフェクターの部位特異的蛍光標識のスキーム。(A)TCO*AおよびJF-646-テトラジン。(B)回路図は、SPI-2エフェクターにncAAを組み込んだ様子を示しています。細菌細胞には、エフェクターPOI(紫)と直交サプレッサーtRNA(赤)/アミノアシル合成酵素(緑)のペアを含むプラスミドが導入されています。天然コドンは、許容位置でエフェクター遺伝子配列中の琥珀色(TAG、赤)終止コドンと交換される。ncAA(暗赤色の円)は、単に増殖培地に導入される。その後、細胞に拾われて細胞質ゾルに到達し、アミノアシルtRNAシンテターゼ(aaRS)によって直交tRNAに結合します。CUAアンチコドンを有するncAAアシル化tRNAは、エフェクターmRNA(紫色)上の相補的な琥珀色のコドンの結果としてリボソーム機構に入り、付着したncAAをエフェクターに取り込む。ncAAは、エフェクター部位の完全長ポリペプチド鎖によって運ばれ、その後、エフェクター部位が折りたたまれて機能的なエフェクタータンパク質に集合します。新しく生成されたエフェクターは、T3SSを介して宿主細胞に移されます。外部から供給された蛍光色素を使用して、ncAAと一体化した分泌型SPI-2エフェクターを標識することができます。(C)蛍光発生性テトラジン色素を用いた銅フリークリック反応スキーム。SPIEDACクリック反応により、POIに組み込まれた緊張したアルケン基を有するncAA(SseJ)がテトラジン結合色素(JF646-Tz)と反応します。蛍光放射性のテトラジン結合色素JF646-Tzは、標識が成功した後にのみ蛍光(赤色)になります。略語:TCO * A =トランス-シクロオクト-2-エン-L-リジン;ncAA =非標準的なアミノ酸;T3SS =タイプ3分泌システム。SPI-2 = サルモネラ 病原性アイランド2;POI = 目的のタンパク質;SPIEDAC = ひずみ促進逆電子要求ディールス・アルダー環化付加。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:TCO*Aは、大腸菌で発現するSseJ-F10TCO-HAに部位特異的に取り込まれています。(A)クーマシー染色SDS-PAGEは、SseJ-F10TCO-HA(赤矢印で示す)にTCO*Aを選択的に取り込むことを確認した。(B)1 mM TCO*Aの非存在下(上)または存在下(下)で蛍光顕微鏡で分析した大腸菌におけるSseJ-F10TCO-HAの発現。 Tco*Aの非存在下または存在下でSseJ-F10TCO-HAを発現する大腸菌細胞をBDP-Fl-テトラジンとともにインキュベートし、BDP蛍光を画像化(緑色)。SseJ蛍光(緑色)は、組み込まれたTCO*Aラベルの存在下でのみ観察されます。トップパネルにバックグラウンド蛍光がないことに注意してください。スケールバー= 2μm。略語:TCO * A =トランス-シクロオクト-2-エン-L-リジン;BF =明視野;HA =ヒアルロン酸。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:TCO*Aは、サルモネラ菌で発現するSseJ-F10TCO-HAに部位特異的に組み込まれています。蛍光顕微鏡は、1 mM TCO*Aの非存在下(上)または存在下(下)でのサルモネラ菌におけるSseJ-F10TCO-HAの発現を調べるために使用されます。 SseJ F10TCO-HAを発現するサルモネラ菌は、JF646-TZで処理し、TCO*Aの有無にかかわらずJF646蛍光(マゼンタ)を画像化します。 スケールバー= 2μm。略語:TCO * A =トランス-シクロオクト-2-エン-L-リジン;BF =明視野;HA =ヒアルロン酸。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:分泌されたSseJ-J10TCO-HAは機能的である。 (A)HeLa細胞をpsseJ-HAを保有するサルモネラ菌に16時間感染させ、固定し、抗HA抗体(赤)、LPS(緑)、およびDAPI(青)で免疫染色します。予想通り、SseJ依存性SIFの形成は感染細胞で観察される。(B)TCO*Aの非存在下では、琥珀色のコドンは抑制されず、SseJ依存性SIFは感染したHeLa細胞には存在しない。HeLa細胞にSseJ-F10TCO-HAを発現するサルモネラ菌をTCO*Aの非存在下で16時間感染させ、固定し、抗HA抗体(赤)、LPS(緑)、DAPI(青)で免疫染色します。(C)TCO*Aの存在下でSseJ依存性SIFが観察され、400 μM TCO*Aの存在下でSseJ-F10TCO-HAを発現するサルモネラ菌に感染したHeLa細胞を固定し、抗HA抗体SseJ(赤)、LPS(緑)、およびDAPI(青)で免疫染色します。左パネルにはSseJ依存性SIFが認められており、GCEを用いたsseJ-F10TCO-HAの発現によりSseJがレスキューされたことが明確に示されている。スケールバー= 10μm。略語:HA =ヒアルロン酸;LPS =リポ多糖;DAPI = 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール;TCO*A = トランス-シクロオクト-2-エン-L-リジン;SIF =サルモネラ誘発フィラメント;GCE = 遺伝暗号の拡張。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:JF646-Tz色素によるSseJの標識特異性。(A)HeLa細胞は、400 μM TCO*Aの存在下でSseJ-F10TCO-HAを発現するサルモネラ菌に感染します。 TCOタグ付き分泌型SseJ-F10TCO-HAは、ウシ乳由来の1%カゼインナトリウム塩を含む1x PBS中で2 μM JF646-Tzで標識し、広範囲に洗浄、固定し、抗HA抗体で免疫染色して分泌されたSseJ(緑色)を可視化します。SseJ-F10TCO-HAは分泌され、JF646-Tz色素で標識されています(赤、左パネル)。GCE(赤)とHA(緑)でラベル付けされたSseJは、明らかに共局在しています(右パネル)。(B)わずかに異なる標識プロトコルを使用して、TCOタグ付き分泌型SseJ-F10TCO-HAも完全培地DMEM(FBSなし)で2 μM JF646-Tzで標識し、広範囲に洗浄し、固定し、抗HA免疫蛍光染色にかけます。分泌されたSseJ-F10TCO-HAはJF646-Tz色素で標識され(赤、左パネル)、HAと共局在します(緑)。(C)蛍光シグナルがSseJに特異的であり、他のSPI-2放出タンパク質の産物ではないことをさらに確立するために、HeLa細胞は、ncAA(TCO*A)の存在下で、psseJ-HAおよびpEVOL-PylRS-AFを保有する野生型サルモネラ菌に感染します。感染後16時間で、感染したHeLa細胞を完全培地(FBSおよびTCO*Aを含まない)で2 μM JF646-Tzで処理し、新しい増殖培地を使用して余分な色素を完全に除去します。HeLa細胞はPFA固定され、SseJ(緑色)の免疫染色される前にPBSで完全に洗浄されます。左パネル(JF646-Tz)に可視のバックグラウンド蛍光シグナルがないことは、宿主細胞内でオフターゲット標識がほとんど起こらなかったことを示しています。スケールバー= 10μm。略語:HA =ヒアルロン酸;PBS =リン酸緩衝生理食塩水;FBS =ウシ胎児血清;DAPI = 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール;TCO*A = トランス-シクロオクト-2-エン-L-リジン;SIF =サルモネラ誘発フィラメント;GCE =遺伝暗号の拡張;SPI-2 = サルモネラ病原性アイランド2;BF =明視野。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:HeLa細胞におけるGCE標識SseJの超解像イメージング。HeLa細胞は、400 μM TCO*Aの存在下でSseJ-F10TCO-HAを発現する サルモネラ菌 に感染します。 TCOタグ付き分泌型SseJ-F10TCO-HAは、プロトコルに記載されている生理学的条件下で2 μM JF646-TZで標識され、その後広範囲に洗浄されます。画像はニコンN-STORMを使用して取得します。(A)観察中のHeLa細胞の明視野画像。スケールバー = 10 μm。 (B)TCO*AおよびJF-646で標識された分泌型SseJの回折制限広視野画像。スケールバー = 10 μm。 (C) SseJで装飾されたSIFの対応するdSTORM画像。スケールバー = 10 μm。 C(i)挿入図は、ボックス化された領域における超解像SseJの拡大図を示しています。スケールバー= 1μm。略語:HA =ヒアルロン酸;TCO*A = トランス-シクロオクト-2-エン-L-リジン;SIF = サルモネラ誘発フィラメント;GCE =遺伝暗号の拡張;WF = 広視野;BF =明視野。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
表 1.ソリューション。この表の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本明細書に記載のアプローチは、感染後に細菌T3SSによって宿主細胞に注入されたエフェクタータンパク質の正確な位置を追跡するために使用された。T3SSは、サルモネラ菌、赤痢菌、エルシニア菌などの細胞内病原体によって、病原性成分を宿主に輸送するために使用されます。超解像イメージング技術の開発により、これまで想像もできなかった解像度で病原性因子を可視化することが可能になりました12,13,24。しかし、特定の標識制約により、光活性化可能なタンパク質融合がT3SS細孔をブロックし、分泌されないため、より詳細な調査が妨げられました。さらに、クラスタリングアーティファクトや誤った分析は、一部の融合タンパク質のクラスター化または凝集の固有の傾向に起因する可能性があります。
場合によっては、PAmCherry-SsaP12,13で以前に観察したように、融合タンパク質も切断されます。これらの制約はすべてGCEによって克服され、POIの部位特異的蛍光標識が可能になります。また、豊富ではないタンパク質の可視化も可能です12,13。直交tRNA/アミノアシルtRNA合成酵素系を用いたncAAの取り込み効率に影響を与える要因は数多くありますが、コドンの文脈が最も重要であるように思われます。直交tRNAは、好ましいコドンコンテキストがAATTAGACT33である場合に最も効率的にncAAを組み込む。図5では、GCEと部位特異的蛍光色素による鮮明な標識(およびバックグラウンドの不在)を、HAタグの免疫染色と比較することができます。
その結果、研究者は、ここで概説する方法を使用して、病原体、共生細菌、および真核生物宿主のPOIを視覚化できるようになります。要するに、遺伝的にコードされたncAAは、従来の方法が失敗した場合にエフェクタータンパク質標識への代替アプローチを提供します。ただし、この方法の大きな制限の1つは、蛍光標識の効率に影響を与える可能性のある、膜透過性、分布、保持などの蛍光色素の固有の化学的特性です。蛍光ncAAはクリック反応を回避するための代替オプションですが12、これらは2光子顕微鏡を使用してのみ視覚化できます。読者は、本明細書12、38、39、40、41において引用される細胞膜透過性/不透過性色素のリストを参照する。
結論として、サルモネラ菌分泌エフェクターSseJを、蛍光発生蛍光色素と組み合わせて遺伝的にコードすることにより、その生物学的機能を損なうことなく、サル モネラ 菌分泌エフェクターSseJを部位特異的に標識および可視化しました。JF646-TzによるSseJの標識は特異性が高く、超解像イメージングを使用して宿主細胞内の分泌されたエフェクターを可視化することができます。したがって、dSTORM適合性色素および遺伝暗号拡張を用いた細菌エフェクターの蛍光標識により、宿主細胞における細菌分泌エフェクターの細胞内空間局在を回折限界以下の分解能で実現した。本ラベリングプラットフォームは、生細胞イメージング単粒子トラッキングに対応しているため、T3SS系のエフェクタータンパク質をこれまでにない時間分解能・空間分解能で解析することが可能となり、細菌の病態の分子理解が深まります。
ncAAの取り込み効率の悪さや有機蛍光色素の光物理学的制約など、一定の制限はありますが、このアプローチは、分泌されたエフェクターが乏しい場合でも、宿主細胞内で分泌されるエフェクターを観察し、局在化するのに役立つことを実証しました12,13。この技術の適応により、感染時に細菌が産生する他のエフェクタータンパク質のイメージングと研究のための新しくエキサイティングな機会が開かれることを期待しています。この方法は、ウイルスの標識にも容易に適合し、その幅広い有用性を示しています。
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Disclosures
著者は、競合する経済的利益はないと宣言しています。
Acknowledgments
この作業は、テキサス州ガルベストンのテキサス大学医学部からのスタートアップ資金と、L.J.K.へのテキサススター賞によってサポートされました。プラスミドpEVOL-PylRS-AFについて、Edward Lemke教授(欧州分子生物学研究所、ハイデルベルク、ドイツ)に感謝します。 図1 の画像は、BioRenderを使用して作成されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Tris/Glycine SDS running buffer | BIO-RAD | 1610732 | |
| Ammonium chloride | Fischer Scientific | A661-500 | |
| Ammonium sulphate | Fischer Scientific | BP212R-1 | |
| Ampicillin Sodium | Sigma-Aldrich | A0166 | 5 g |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermiFischer Scientific | 15240096 | |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | 500 g |
| Avanti J-26XP (High-Performance Centrifuge) | Beckman Coulter | ||
| Bacto-Agar | BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA | 214010 | |
| BDP-FL-tetrazine | Lumiprobe (USA) | 2.14E+02 | |
| β-mercaptoethanol | Millipore | 444203 | 250 mL |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B8026 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A4503 | 500 g |
| Casein | Sigma-Aldrich | C8654 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| Click Amino Acid / trans-Cyclooct-2-en – L - Lysine (TCO*A) | SiChem GmbH | SC-8008 | Size: 500 mg |
| DAPI (Hoechst33342) | Invitrogen | H3570 | |
| DeNovix DS-11+ Spectrophotometer | DeNovix | ||
| DMEM* | Corning | 10-013-CV | * Used for maintaining HeLa Cell |
| DMEM** | Gibco | 11965-092 | **Used for bacterial infection in presence of ncAA, see section 5.4. |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | 250 g |
| Donkey anti-rabbit Alexa fluoro555 secondary antibody | Invitrogen | A-31572 | |
| DPBS, 1x | Corning | 21-031-CV | |
| E. coli strain BL21 (DE3) | Novagen (Madison, WI) | ||
| EMCCD Camera | Andor | iXon Ultra 897-BV | |
| Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 mL (PCR clean) | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30123.328 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fischer | 10082147 | |
| Fisherbrand Syringe Filters - Sterile (PVDF 0.22 µm) | Fischer Scientific | 97203 | Pack of 100 |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | BIO-RAD | 1652660 | |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G1272 | 10 mL |
| Gibco L-Glutamine (200 mM), 100x | Fischer Scientific | 25-030-081 | |
| Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G7141-50KU | |
| Glycerol | Fischer Scientific | BF229-4 | |
| HeLa cells | ATTC | CCL-2 | |
| HEPES Buffer | Corning | 25-060-C1 | 100 mL |
| Hydrocloric acid | Fischer Scientific | A144-212 | |
| ImageJ | Image processing and analysis: http://rsbweb.nih.gov/ij | ||
| IntantBlue | Expedeon | ISB1L | Coomassie-based stain |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma-Aldrich | I5502 | |
| Janelia Fluoro 646-tetrazine | Tocris Bioscience | 7279 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | 60615 | 5 g |
| LB Broth | BD Difco | 244620 | 500 g |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| μManager (v. 1.4.2) | https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release | ||
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | 250 g |
| Micro pulser cuvette | BIO-RAD | 165-2086 | 0.2 cm electrode gap, pkg. of 50 |
| Nikon N-STORM | Nikon Instruments Inc. | https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/super-resolution-microscopes/n-storm-super-resolution | |
| Nunc EasYFlask Cell Culture Flasks | ThermiFischer Scientific | 156499 | |
| Omnipur Casamino Acid | Calbiochem | 2240 | 500 g |
| Paraformaldehhyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| PBS (10x) | Roche | 11666789001 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution (100x) | GenDEPOT | CA005-010 | 100 mL |
| pEVOL-PylRS-AF | For plasmid construction and map see following references 1. Angew Chem Int Ed Engl. 2011, 50(17), 3878-81. 2. Angew Chem Int Ed Engl., 2012, 51, 4166-70. |
||
| Plasmid Mini-prep Kit | Qiagen | 27106 | |
| plasmid pWSK29-sseJ10TAG-HA | Ref.: elife. 2021, 10, e67789. | ||
| plasmid pWSK29-sseJ-HA | Ref.: elife. 2021, 10, e67789. Vector map of PWSK29: https://www.addgene.org/172972/ | ||
| Pluronic F-127 | Millipore | 540025 | Protein grade, 10% Solution |
| Potassium phosphate monobasic | Fischer Scientific | P285-500 | |
| Potassium sulphate | Acros Organic | 424220250 | |
| Protease Inhibitor Cocktail Set I - Calbiochem | Sigma-Aldrich | 539131 | 100x Solution |
| Rabbit anti-HA primary antibody | Sigma-Aldrich | H6908 | |
| S. enterica. serovar Typhimurium 14028s | Ref.: PLoS Biol. 2015, 13, e1002116. | ||
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036-50G-F | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Sodium hydroxide | Fischer Scientific | SS255-1 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM), 100x | Corning | 25-060-C1 | 100 mL |
| Sonic Dismembrator Model 100 | Fischer Scientific | 24932 | |
| STED microsocpe (Leica TCS SP8 STED 3X system) | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/ | |
| ThunderSTORM | https://zitmen.github.io/thunderstorm/ | ||
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Trypsin-EDTA (1x), 0.25% | GenDEPOT | CA014-010 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | 100 mL |
| X-well tissue culture chamber slides | SARSTEDT | 94.6190.802 |
References
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- LaRock, D. L., Chaudhary, A., Miller, S. I. Salmonellae interactions with host processes. Nature Reviews Microbiology. 13 (4), 191-205 (2015).
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