Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Superoppløsningsavbildning av bakterielle utskillede proteiner ved hjelp av genetisk kodeutvidelse

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/64382
Automatic Translation
1, 1
1Biochemistry & Molecular Biology, University of Texas Medical Branch

Summary

Denne artikkelen gir en enkel og klar protokoll for å merke Salmonella-utskilte effektorer ved hjelp av genetisk kodeutvidelse (GCE) stedsspesifikt og avbilde subcellulær lokalisering av utskilte proteiner i HeLa-celler ved hjelp av direkte stokastisk optisk rekonstruksjonsmikroskopi (dSTORM)

Abstract

Type tre sekresjonssystemer (T3SS) gjør det mulig for gramnegative bakterier å injisere et batteri av effektorproteiner direkte inn i cytosolen til eukaryote vertsceller. Ved innreise modulerer de injiserte effektorproteinene eukaryote signalveier og omprogrammerer cellulære funksjoner, noe som muliggjør bakteriell oppføring og overlevelse. Overvåking og lokalisering av disse utskilte effektorproteinene i sammenheng med infeksjoner gir et fotavtrykk for å definere det dynamiske grensesnittet for vertspatogeninteraksjoner. Imidlertid er merking og avbildning av bakterielle proteiner i vertsceller uten å forstyrre deres struktur / funksjon teknisk utfordrende.

Konstruksjon av fluorescerende fusjonsproteiner løser ikke dette problemet, fordi fusjonsproteinene jammer sekretoriske apparater og dermed ikke utskilles. For å overvinne disse hindringene brukte vi nylig en metode for stedsspesifikk fluorescerende merking av bakterielle utskillede effektorer, så vel som andre vanskelig å merke proteiner, ved bruk av genetisk kodeutvidelse (GCE). Dette papiret gir en komplett trinnvis protokoll for å merke Salmonella-utskilte effektorer ved hjelp av GCE-spesifikt, etterfulgt av instruksjoner for avbildning av subcellulær lokalisering av utskilte proteiner i HeLa-celler ved bruk av direkte stokastisk optisk rekonstruksjonsmikroskopi (dSTORM)

Nylige funn tyder på at inkorporering av ikke-kanoniske aminosyrer (ncAAs) via GCE, etterfulgt av bio-ortogonal merking med tetrazinholdige fargestoffer, er en levedyktig teknikk for selektiv merking og visualisering av bakterielle utskillede proteiner og påfølgende bildeanalyse i verten. Målet med denne artikkelen er å gi en enkel og klar protokoll som kan brukes av etterforskere som er interessert i å gjennomføre superoppløsningsavbildning ved hjelp av GCE for å studere ulike biologiske prosesser i bakterier og virus, samt vertspatogeninteraksjoner.

Introduction

Bakterielle infeksjoner har lenge vært ansett som en alvorlig fare for menneskers helse. Patogener bruker høyt utviklede, ekstremt kraftige og intrikate forsvarssystemer, samt en rekke bakterielle virulensfaktorer (referert til som effektorproteiner) for å unngå vertsimmunresponser og etablere infeksjoner 1,2. Imidlertid er de molekylære mekanismene som ligger til grunn for disse systemene og rollen til individuelle effektorproteiner fortsatt stort sett ukjente på grunn av mangelen på egnede tilnærminger for direkte å følge de avgjørende proteinkomponentene og effektorene i vertsceller under patogenesen.

Et typisk eksempel er Salmonella enterica serovar Typhimurium, som forårsaker akutt gastroenteritt. Salmonella Typhimurium bruker type tre sekresjonssystemer (T3SS) for å injisere en rekke effektorproteiner direkte inn i vertsceller. Så snart Salmonella kommer inn i vertscellen, ligger den i et surt membranbundet rom, kalt Salmonella-inneholdende vakuol (SCV) 3,4. Den sure pH i SCV aktiverer Salmonella patogenisitet øya 2 (SPI-2)-kodet T3SS og translokerer en volley av 20 eller flere effektorproteiner over vakuolar membranen inn i verten cytosol 5,6,7,8. Inne i verten manipulerer disse komplekse cocktailer av effektorproteiner koordinat vertscellesignalveier, noe som resulterer i dannelsen av svært dynamiske, komplekse rørformede membranstrukturer utvidet fra SCV langs mikrotubuli, kalt Salmonella-induserte filamenter (SIF), som gjør det mulig for Salmonella å overleve og replikere i vertscellene9,10,11.

Metoder for å visualisere, spore og overvåke bakterielle effektorlokaliseringer, og undersøke deres handel og interaksjoner i vertsceller, gir kritisk innsikt i mekanismene som ligger til grunn for bakteriell patogenese. Merking og lokalisering av Salmonella-utskilte T3SS-effektorproteiner inne i vertsceller har vist seg å være en teknologisk utfordring12,13; Ikke desto mindre har utviklingen av genetisk kodede fluorescerende proteiner forvandlet vår evne til å studere og visualisere proteiner i levende systemer. Imidlertid er størrelsen på fluorescerende proteiner (~ 25-30 kDa) 15 ofte sammenlignbar med eller enda større enn proteinet av interesse (POI; f.eks. 13,65 kDa for SsaP, 37,4 kDa for SifA). Faktisk blokkerer fluorescerende proteinmerking av effektorer ofte sekresjonen av den merkede effektoren og syltetøy T3SS14.

Videre er fluorescerende proteiner mindre stabile og avgir et lavt antall fotoner før fotobleking, noe som begrenser bruken i superoppløsningsmikroskopiske teknikker16,17,18, spesielt i fotoaktiveringslokaliseringsmikroskopi (PALM), STORM og stimulert utslippsuttømming (STED) mikroskopi. Mens de fotofysiske egenskapene til organiske fluorescerende fargestoffer er bedre enn fluorescerende proteiner, krever metoder/teknikker som CLIP/SNAP19,20, Split-GFP 21, ReAsH/FlAsH 22,23 og HA-Tags 24,25 et ekstra protein- eller peptidvedheng som kan svekke strukturfunksjonen til effektorproteinet av interesse ved å forstyrre posttranslasjonell modifikasjon eller handel. En alternativ metode som minimerer nødvendig proteinmodifisering innebærer inkorporering av ncAAs i et POI under oversettelse gjennom GCE. NCAene er enten fluorescerende eller kan gjøres fluorescerende via klikkkjemi 12,13,26,27,28.

Ved hjelp av GCE kan ncAAs med små, funksjonelle, bio-ortogonale grupper (som en azid-, cyklopropen- eller cyklooktynegruppe) introduseres på nesten hvilket som helst sted i et målprotein. I denne strategien byttes et innfødt kodon med et sjeldent kodon som et gult (TAG) stoppkodon i en spesifisert posisjon i genet til POI. Det modifiserte proteinet uttrykkes deretter i celler sammen med et ortogonalt aminoacyl-tRNA-syntetase / tRNA-par. Det aktive tRNA-syntetase-stedet er designet for å motta bare en bestemt ncAA, som deretter er kovalent festet til 3'-enden av tRNA som gjenkjenner det gule kodonet. ncAA blir ganske enkelt introdusert i vekstmediet, men det må tas opp av cellen og nå cytosolen der aminoacyl-tRNA-syntetasen (aaRS) kan koble den til det ortogonale tRNA; den blir deretter innlemmet i POI på det angitte stedet (se figur 1)12. Dermed muliggjør GCE stedsspesifikk inkorporering av en mengde bio-ortogonale reaktive grupper som keton, azid, alkyn, cyklooktin, transsyklookten, tetrazin, norbonen, α, β-umettet amid og bicyclo [6.1.0]-nonyne i en POI, potensielt overvinne begrensningene i konvensjonelle proteinmerkingsmetoder 12,26,27,28.

Nylige fremvoksende trender i superoppløsningsbildebehandlingsteknikker har åpnet nye veier for å undersøke biologiske strukturer på molekylært nivå. Spesielt har STORM, en enkeltmolekylær, lokaliseringsbasert, superoppløsningsteknikk, blitt et uvurderlig verktøy for å visualisere cellulære strukturer ned til ~ 20-30 nm og er i stand til å undersøke biologiske prosesser ett molekyl om gangen, og dermed oppdage rollene til intracellulære molekyler som ennå er ukjente i tradisjonelle ensemble-gjennomsnittlige studier13 . Enkeltmolekylære og superoppløsningsteknikker krever en liten tag med lyse, fotostabile organiske fluoroforer for best oppløsning. Vi har nylig demonstrert at GCE kan brukes til å inkorporere egnede sonder for superoppløsningsavbildning12.

To av de beste valgene for proteinmerking i celler er bicyclo [6.1.0] nonynelysin (BCN) og trans-cyklookten-lysin (TCO; vist i figur 1), som kan være genetisk kodet ved hjelp av en variant av tRNA / syntetaseparet (her kalt tRNA Pyl/PylRSAF), hvorPyl representerer pyrrolysin, og AF representerer en rasjonelt utformet dobbeltmutant (Y306A, Y384F) avledet fra Methanosarcina mazei som naturlig koder for pyrrolysin12, 29,30,31. Gjennom den belastningsfremmende inverse Diels-Alder-sykloaddisjonsreaksjonen (SPIEDAC) reagerer disse aminosyrene kjemoselektivt med tetrazinkonjugater (figur 1)12,30,31. Slike sykloaddisjonsreaksjoner er eksepsjonelt raske og kompatible med levende celler; De kan også være fluorogene, hvis en passende fluorofor er funksjonalisert med tetrazindelen12,26,32. Denne artikkelen presenterer en optimalisert protokoll for overvåking av dynamikken til bakterielle effektorer levert inn i vertsceller ved hjelp av GCE, etterfulgt av subcellulær lokalisering av utskilte proteiner i HeLa-celler ved bruk av dSTORM. Resultatene indikerer at inkorporering av en ncAA via GCE, etterfulgt av en klikkreaksjon med fluorogene tetrazinbærende fargestoffer, representerer en allsidig metode for selektiv merking, visualisering av utskilte proteiner og påfølgende subcellulær lokalisering i verten. Alle komponentene og prosedyrene som er beskrevet her, kan imidlertid justeres eller erstattes slik at GCE-systemet kan tilpasses for å undersøke andre biologiske spørsmål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Plasmid konstruksjon

  1. Klon genet som uttrykker POI til et uttrykksplasmid (f.eks. pET28a-sseJ 10TAG) som uttrykker POI i E. coli BL21 (DE3). Dette trinnet letter å bestemme at mutantene er funksjonelle.
  2. For visualisering av Salmonella-utskilte effektorer i vertsceller, konstruer et ekspresjonsplasmid (pWSK29-sseJ-HA) som uttrykker målet POI SseJ under kontroll av sin opprinnelige promotor, som beskrevet i tidligere rapporter 7,12,24. Ved hjelp av stedsrettet mutagenese, erstatt kodonet til fenylalanin-10 med et ravkodon (TAG) i SseJ (pWSK29-sseJ 10TAG-HA), og sikre AAT-TAG-ACT-motivet 33,34.
  3. I tillegg til de ovennevnte plasmidene, for genetisk inkorporering av trans-cyklookt-2-en-L-lysin (TCO * A) i et POI, bruk et annet uttrykksplasmid (pEVOL-PylRS-AF) 31 som inneholder det utviklede tRNA / syntetaseparet (tRNAPyl / PylRSAF ) gener kodet i plasmid pEVOL.
    MERK: Detaljerte beskrivelser av plasmidet og kloningsprotokollene er beskrevet i forrige rapport30,31.
  4. Bruk kommersielt tilgjengelige plasmidpreparasjonssett for å oppnå plasmid-DNA av høy kvalitet. For renset DNA er det optimale forholdet 260/280 ~1,8. Kontroller DNA-renheten ved hjelp av 1% agarosegelelektroforese, om nødvendig.

2. Forberedelse av bakteriekultur

  1. Oppnå doble transformanter for å teste at mutanten er funksjonell i E. coli
    1. Ta BL21 kompetente celler ut av -80 °C og tine på is i ca. 20–30 min.
    2. Bland 1–5 μL av hvert plasmid (~50 ng pEVOL-PylRS-AF og pET28a-sseJ 10TAG) med 200 μL kjemisk kompetente BL21-celler i et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Bland de kompetente cellene og plasmidblandingen forsiktig; ruge i 30 min på is.
    3. Varmesjokk mikrosentrifugerøret i et 42 °C vannbad i 45 s. Legg tubene tilbake på is i 2 min.
    4. Tilsett 1 ml varmt LB-medium til mikrosentrifugerøret og overfør blandingen raskt til et 15 ml konisk rør. Inkuber cellene ved 37 °C i en shaker ved 250 o / min i 1 time. Plate noen del eller alle de transformerte cellene på LB-agarplater som inneholder passende antibiotika. Inkuber platene over natten ved 37 °C.
      MERK: I denne protokollen ble 35 μg/ml kloramfenikol og 50 μg/ml kanamycin brukt for valg av henholdsvis pEVOL-PylRS-AF og pET28a-sseJ 10TAG. I transformasjonstrinnet evaluerer du den vellykkede transformasjonen ved hjelp av negative og positive kontroller.
  2. Overfør mutanten til Salmonella for visualisering av Salmonella-utskilte effektorer i vertsceller:
    1. Tilsett 2–3 μL hver av pEVOL-PylRS-AF og pWSK29-sseJ 10TAG til 40–60 μL elektrokompetent Salmonella Typhimurium-stamme 14028s i et kjølt mikrosentrifugerør. Bland blandingen forsiktig med en pipette.
    2. Overfør elektroporasjonsblandingen til en kjølt (0,2 cm elektrodegap) kuvette; sett elektroporeringsinnstillingene til 2,5 kV, 200 Ω, 25 μF. Plasser kyvetten inne i elektroporeringskammeret. Forsikre deg om at kammerelektroden har god kontakt med mikropulserkuvetten.
    3. Trykk og hold pulsknappen til den piper.
    4. Tilsett umiddelbart 1 ml varmt LB-medium i kyvetten. Overfør hele innholdet til et 15 ml konisk rør. Inkuber cellene ved 37 °C med risting ved 250 o / min i 1 time.
    5. Plate noen del eller hele elektroporasjonsblandingen av Salmonella på en LB-agarplate som inneholder passende antibiotika. Inkuber platene over natten ved 37 °C.
      MERK: I denne protokollen ble 35μg / ml kloramfenikol og 100 μg / ml ampicillin brukt til valg av henholdsvis pEVOL-PylRS-AFog pWSK29-sseJ 10TAG.
  3. Kultur forberedelse
    1. Inokuler en enkelt koloni av Salmonella eller E. coli i 5 ml LB-medium som inneholder passende antibiotika. Vokser over natten ved 37 °C, rister ved 250 o / min.

3. Ekspresjon og fluorescerende merking av ncAA-bærende proteiner

  1. Ekspresjon av ncAA-bærende proteiner i E. coli
    1. Overfør 100 μL primærkultur til 5 ml LB-medium (1:50 fortynning) inneholdende 35 μg/ml kloramfenikol og 50 μg/ml kanamycin, etterfulgt av inkubasjon ved 37 °C med risting ved 250 rpm til OD600 når 0,4–0,6.
    2. Klargjøre 1 mM TCO*A stamløsning (10 ml; Tabell 1).
    3. Når kulturene når OD600 = 0,4–0,6, erstatt LB-mediet med fersk LB inneholdende 1 mM TCO*A, 35 μg/ml kloramfenikol og 50 μg/ml kanamycin.
      MERK: Alternativt kan TCO*A lagerløsning utarbeides som beskrevet i trinn 5.4.2.
    4. Indusere proteinuttrykk i nærvær av 1 mM IPTG, 0,2% arabinose og rist over natten ved 34 ° C, 250 rpm. Høst bakteriecellene ved sentrifugering i 5 min ved 11 000 × g. Fjern supernatanten og frys pelleten ved -20 °C inntil videre bruk.
    5. For et kontrolleksperiment, gjenta det samme eksperimentet, men uttrykk de ncAA-bærende proteinene i fravær av ncAA. For in vitro fluorescerende merking av ncAA-bærende proteiner i E. coli, følg den detaljerte prosedyren beskrevet i trinn 3.3.
  2. Ekspresjon av ncAA-bærende proteiner i Salmonella
    1. Overfør 100 mikrol primærkultur til 5 ml LB-medium (1:50 fortynning) inneholdende 35 μg/ml kloramfenikol og 100 mikrog/ml ampicillin, etterfulgt av inkubasjon ved 37 °C med risting ved 250 rpm til OD600 når 0,6.
    2. Klargjør modifisert N-minimalt medium (MgM, pH 5,6) som beskrevet i tabell 1.
    3. LB-mediet erstattes med modifisert N-minimalt medium (MgM) supplert med 1 mM TCO*A (tabell 1). Dyrk bakteriene ved 34 °C i 30 minutter. Deretter tilsettes 0,2% arabinose, 25 mg / ml kloramfenikol og 100 mg / ml ampicillin, og vokser cellene i ytterligere 6 timer, risting ved 250 o / min.
    4. Etter 6 timer, vask bakteriene 4x over et intervall på 30 minutter, med friske MgM (pH 5,6) medier (tabell 1) uten ncAA. I vasketrinnene, bruk 972 × g i 15 min ved romtemperatur.
    5. Sentrifuger bakteriene, resuspender i 1x PBS-buffer og inkuber i 1 time ved 4 °C i mørket for å fjerne overflødige ncAAer. Etter 1 time, sentrifuge bakteriene ved 3000 × g, 4 ° C i 15 minutter og lagre for videre bruk.
    6. For et kontrolleksperiment, gjenta det samme eksperimentet ved å uttrykke ncAA-bærende proteiner i fravær av ncAA.
  3. In vitro fluorescensmerking av ncAA-bærende proteiner i Salmonella Typhimurium
    1. Resuspendere salmonellaceller som uttrykker SseJ-F10TCO-HA i fravær eller tilstedeværelse av TCO*A (fra trinn 3.2) i 1x PBS. Juster OD600 til 4 i PBS. Inkuber cellene med 20 μM Janelia Fluor 646-tetrazin (JF646-Tz) eller 20 μM BDP-Fl-tetrazin (5 mM stamløsninger i DMSO) ved 37 °C i mørket og rist i 1–2 timer ved 250 o / min.
    2. Pellet cellene, vask 3–4x med PBS inneholdende 5 % DMSO og 0,2 % Pluronic F-127, resuspender i PBS inneholdende 5 % DMSO, og inkuber over natten ved 4 °C i mørket. Vask 2x igjen med 1x PBS. I vasketrinnene, bruk 972 × g, i 15 minutter ved romtemperatur.
    3. Avbilde cellene umiddelbart ved hjelp av et konfokalmikroskop eller fest dem med 1,5% paraformaldehyd (PFA) i PBS i 30-45 minutter ved romtemperatur i mørket.
    4. Vask de faste cellene 2x med PBS og til slutt i 50 mM NH4Cl i PBS i 15 minutter for å fjerne overflødig PFA. Resuspender cellene i PBS og oppbevares ved 4 °C i høyst 3–4 dager. Avbilde bakteriene ved hjelp av konfokalmikroskopi som beskrevet i avsnitt 6.

4. Biokjemisk karakterisering av ncAA-bærende proteiner

  1. Cellelyse
    1. Resuspender cellene fra pkt. 3.1 i lysisbuffer (tabell 1) og inkuber ved romtemperatur i mer enn 30 minutter. Avkjøl blandingen på is i 15 minutter.
      MERK: Hold forholdet mellom lysisbuffer og cellevekt brukt til 1:10.
    2. Sonikere de resuspenderte cellene mens de fortsatt er på is. Puls i 30 s ved innstilling 7 minst 6x, med 1 min mellomrom, ved hjelp av en sonikator (se materialfortegnelsen).
    3. Spinn ned cellelysatet ved 20 500 × g, 4 °C i 15 minutter (å opprettholde 4 °C er kritisk). Overfør supernatanten til en ny slange og kast pelleten.
  2. SDS-PAGE analyse
    1. Forbered 5x SDS-lastestoff (tabell 1). Tilsett 5 μL SDS-gellastbuffer til 13 μL cellelysat. Denaturer proteinene med natriumdodecylsulfat (SDS) prøvebuffer i et 2 ml rør ved 95 ° C i 10 minutter, sentrifuge blandingen ved 2000 × g i 50 s, og legg på en 12% SDS polyakrylamidgel.
    2. Monter gelkassetten, plasser den i et gelelektroforeseapparat, og koble elektroforeseapparatet til en strømforsyning. Hell løpebufferen, legg molekylvektmarkørene og proteinprøvene, og kjør gelen ved 100 V, til bromfenolen når bunnen av oppløsningsgelen.
      MERK: Begynn analysen umiddelbart, da lysater lagret ved -20 °C har en tendens til å miste kvalitet etter hver fryse-tine-syklus.
    3. Flekk gelen med Coomassie blå proteinflekk.

5. Bio-ortogonal merking av Salmonella-utskilt effektor SseJ-F10TCO-HA i HeLa-celler

  1. Dyrkning og vedlikehold av HeLa-celler ved 37 °C, 5% CO2 og 95% luftfuktighet i et høyt glukose (4,5 g / L) Dulbeccos modifiserte ørnemedium (DMEM), supplert med 10% (v / v) FBS i tillegg til Penicillin-Streptomycin (1x).
  2. Kultur bakterier 1 dag før infeksjon. Inokulere en enkelt koloni av Salmonella 14028s som har pEVOL-PylRS-AF og pWSK29-sseJ 10TAG i 5 ml antibiotikaholdig standard LB-buljong over natten ved 37 ° C, risting ved 250 o / min.
  3. Frø HeLa-celler 1 dag før infeksjon. Ta en vevskulturkolbe (T-75) som inneholder HeLa-celler ved ~ 80% konfluens, som bestemt ved mikroskopisk undersøkelse av celletettheten. Vask cellene med varm PBS. Løsne cellene med 3 ml varm 0,25% trypsin/EDTA i 5 minutter ved 37 °C, 5% CO2.
    1. Slukk trypsinen med 2 ml DMEM (+ 10% FBS). Overfør hele innholdet i kolben til et 15 ml rør etter resuspendering av cellene. Spinn ned cellene ved 1000 × g i 5 minutter. Ta supernatanten ut av røret. Resuspender HeLa-cellepelleten i forvarmet vekstmedium.
    2. Bruk et hemocytometer for å undersøke suspensjonen og telle cellene som er tilstede. Klargjør en fortynnet cellemasse ved 1 × 105 celler/ml. Frø 0,5 × 105 HeLa-celler per brønn i 500 μL DMEM + 10% FBS vekstmedium i et åtte-brønns kammerlysbilde. Hold kammerets lysbilde i en inkubator ved 37 ° C, 5% CO2, 95% fuktighet i 24 timer.
  4. Bakteriell infeksjon
    1. Subkultur Salmonella 14028s som inneholder pEVOL-PylRS-AF og pWSK29-sseJ 10TAG, ved å fortynne 100 μL bakteriekultur over natten (fra trinn 5.2) til 3 ml LB-medium (1:30 fortynning) inneholdende 35 μg/ml kloramfenikol og 100 μg/ml ampicillin, etterfulgt av inkubasjon ved 37 °C med risting ved 250 rpm i 5–7 timer.
      MERK: I løpet av denne fasen når kulturene den sene eksponentielle fasen, og bakteriene er svært invasive.
    2. Klargjøre 100 mM TCO*A lagerløsning og komplette medier (tabell 1).
    3. For å starte HeLa-celleinfeksjonen, ta ut HeLa-cellene fra inkubatoren og vask cellene med forvarmet DPBS før du tilsetter 500 μL fersk DMEM (+10% FBS) til hver brønn. Plasser kammeret lysbildet tilbake i CO2 -inkubatoren til infeksjonen begynner.
    4. Etter 5-7 timers inkubasjon, fortynn Salmonellakulturen til OD600 = 0,2 i 1 ml DMEM vekstmedium (~ 3 × 108 cfu / ml). Legg til de nødvendige mengdene av Salmonella inoculum i hver brønn i kammerlysbildet slik at infeksjonsmangfoldet (MOI) er 100.
    5. Inkuber de infiserte cellene i en CO2 -inkubator i 30 minutter. Vask cellene 3x med forvarmet DPBS for å fjerne ekstracellulær Salmonella. Sett dette tidspunktet til 0 t etter infeksjon. Tilsett 500 mikrol komplett medium (tabell 1) inneholdende 100 μg/ml gentamicin i 1 time. Etter 1 time, vask cellene 3x med DPBS. Tilsett 500 μL av hele mediet (fra trinn 5.4.2; Tabell 1) supplert med 0,2 % arabinose, 10 μg/ml gentamicin til hver brønn i kammersliden.
    6. I et kontrolleksperiment, utfør lignende infeksjoner av HeLa-celler uten TCO*A.
    7. Inkubere kammeret lysbildet i 10 timer i CO2 -inkubatoren.
  5. Klikk kjemibasert merking i levende celler
    1. Fortsett å merke bakterieinfiserte celler. Forvarm hele mediet uten TCO*A (tabell 1).
    2. Etter 10 timer etter infeksjon, erstatt hele mediet med ferskt komplett medium uten TCO * A og vask HeLa-cellene 4x over et intervall på 30 minutter hver med forvarmet DPBS, etterfulgt av fersk komplett medium (uten TCO * A).
    3. Forbered en 0,5 mM fargestoff-tetrazin stamløsning i DMSO.
      MERK: For merking av Salmonella-utskilte effektorer i vertsceller, presenteres to protokoller. For protokoll 1, klargjør fargestoffblandingen ved å fortynne JF646-Tz-lager i 1x PBS inneholdende 1% kaseinnatriumsalt fra storfemelk, slik at den endelige arbeidsløsningen er 2 μM. For protokoll 2, tilbered varmt komplett medium (uten FBS og TCO * A) og tilsett 2 μM JF646-Tz. Gjør denne fargestoffblandingen frisk for hver merkingsøkt. Arbeid om mulig i mørket (demp lysene i panseret og/eller rommet).
    4. Etter 12 timer etter infeksjon, aspirer av mediet fra cellene. Vask cellen med forvarmet DPBS 2x eller 3x. I en gruppe brønner, tilsett 500 μL av fargestoffoppløsningsblandingen beskrevet i protokoll 1, og i en annen gruppe brønner i samme kammerlysbilde, tilsett 500 μL av fargestoffoppløsningsblandingen beskrevet i protokoll 2 nevnt i trinn 5.5.3 og notatet etter. Plasser kammeret glir tilbake i CO 2 -inkubatoren i 1,5-2 timer.
    5. Etter 13,5–14 timer etter infeksjon, skyll HeLa-cellene 2x med forvarmet DPBS. Tilsett 500 μL fersk DMEM (supplert med FBS). Plasser kammeret lysbildet tilbake i inkubatoren i 30 minutter. Vask cellene med forvarmet DPBS etterfulgt av fersk DMEM 4x over et intervall på 30 minutter.
    6. Ved 16 timer etter infeksjon, fikser HeLa-cellene med PFA ved å tilsette 200 μL 4% PFA i hver brønn og inkubere i 10 minutter ved romtemperatur i mørket. Aspirer av PFA, skyll 3x med PBS, og oppbevar cellene i PBS ved 4 °C i mørket.
      MERK: PFA er et svært giftig kjemikalie. Unngå innånding, samt hud- og øyekontakt. Bruk verneutstyr ved håndtering. For å unngå at den merkede prøven blir utsatt for lys, slå av lyset i cellekulturhetten.
  6. Immunfarging av HA-merkede proteiner
    1. Aspirer av PBS og skyll én gang i blokkerende oppløsning (tabell 1).
    2. Inkuber de faste HeLa-cellene med en PBS-basert primær antistoffløsning (tabell 1) i 1 time ved romtemperatur i mørket. Bruk et kaninanti-HA primært antistoff for å flekke utskilt SseJ (1:500 fortynning).
    3. Etter 1 time, vask forsiktig cellene 2x med 0,5 ml 0,1% Tween-20/1x PBS. Under vask med Tween/PBS-oppløsning, inkuber cellene 3x med 0,5 ml 0,1% Tween20/1x PBS i 5 minutter.
    4. Fortynn sekundært antistoff esel anti-kanin 555 1:500 i sekundær antistoffoppløsning og inkuber i 1 time ved romtemperatur i mørket.
    5. Etter 1 time, vask forsiktig cellene 2x med 0,5 ml 0,1% Tween-20/1x PBS og inkuber 2x med 0,5 ml 0,1% Tween20/1x PBS i 5 minutter.
    6. Vask cellene 3x med 0,5 ml 1x PBS og oppbevar dem ved 4 °C i mørket.
      MERK: Faste celler kan lagres i et par uker i PBS ved 4 °C. Immunofarging bør utføres i siste øyeblikk.

6. Konfokal bildebehandling

  1. Bruk et konfokalmikroskop, for eksempel spinning disc (SD) eller STED mikroskop.
    1. Juster innstillingene for bildeopptak, for eksempel skannemodus (XYZ), skannehastighet (400 Hz), oppløsning (512 x 512), forstørrelse (100x) og Z-stabling.
    2. Bruk riktige eksitasjons-/utslippsfiltre for DAPI, BDP-Tz og JF646 tetrazin.
      MERK: For denne protokollen ble konfokal avbildning utført på et STED-mikroskopsystem utstyrt med en pulserende hvit lyslaser, noe som muliggjorde valg av eksitasjon i området 470-670 nm og en UV 405 nm diodelaser for eksitasjon ved 405 nm, 488 nm og 647 nm. De riktige utslippsområdene ble satt opp ved hjelp av den innebygde akusto-optiske strålesplitteren i kombinasjon med en prismebasert justerbar multibånds spektral deteksjon av konfokalsystemet.
    3. Skaff bildene ved hjelp av et 100×/1,4 oljenedsenkingsmål.

7. Superoppløsning (dSTORM) avbildning

  1. Slå på mikroskopet 3 timer før avbildning for å tillate termisk likevekt (drift er mer sannsynlig å oppstå hvis avbildning begynner før dette). Avkjøl kameraet til -70 °C.
  2. I mellomtiden forbereder du fersk GLOX-BME-bildebuffer (tabell 1).
  3. Ta med cellene til mikroskopet. Plasser bildekammeret på mikroskoptrinnet i prøveholderen. I holderen må du kontrollere at prøven er flat og sikker. Bytt medium i brønnen med 0,4 ml av den nylagde GLOX-BME-avbildningsbufferen.
  4. Still inn riktig laserlinje og filtersett. Reduser lasereffekten til ~1 mW for å identifisere en HeLa-celle av interesse. Juster fokalplanet og laserstrålevinkelen mens du belyser prøven med lave 647 nm lasertettheter (i dette tilfellet foreslås en bratt skrånende vinkel [HILO], siden HILO øker signal-til-bakgrunnen [SBR]). Juster HILO-belysningsvinkelen.
    MERK: I denne protokollen ble superoppløsningsavbildning av SseJ anskaffet i Alexa Fluor 647-kanalen ved hjelp av et invertert epifluorescensmikroskop (se materialfortegnelsen), utstyrt med et TIRF-mål (100x Apo TIRF oljenedsenkingsmål, NA 1.49). Fluorescens ble påvist med et EMCCD-kamera, som ble styrt gjennom μManager.
  5. Sett forforsterkerforsterkningen til 3 og aktiver rammeoverføringen i μManager. Sett EM-gain til 200 for høyere følsomhet i dSTORM-målinger, som beskrevet i en tidligere rapport35.
  6. Før dSTORM-avbildning må du ta et referansediffraksjonsbegrenset bilde av målstrukturen. Bytt fluoroforene til mørk tilstand ved å slå på laseren til maksimal effekt.
    MERK: Individuelle, raskt blinkende molekyler av JF646-fluoroforer ble observert når JF646-fluoroforer ble transformert til en overveiende mørk tilstand ved kontinuerlig belysning av 647 nm eksitasjonslys, som beskrevet tidligere36.
  7. Juster laserstyrken til et passende nivå der blinkende hendelser er atskilt i rom og tid, sett eksponeringstiden til 30 ms og begynn innsamlingen. Skaff deg 10 000–30 000 rammer.
    MERK: Endringer i laserstyrken bør gjøres for å optimalisere blinkingen. Vurder å øke laserintensiteten hvis det oppdages for mange hendelser (blinkende partikler som overlapper). Den ideelle lengden avhenger av kvaliteten på prøven, men ~ 10.000 bilder skal vise merkbare funksjoner.

8. Rekonstruksjon av bilder av dSTORM

  1. Bruk egnet programvare for bildeanalyse.
    MERK: ThunderSTORM, et av mange open source-bilderekonstruksjonsprogrammer tilgjengelig, er kort beskrevet nedenfor.
  2. Åpne ImageJ og importer rådataene. Åpne ThunderSTORM-plugin og konfigurer kamerainnstillingen som tilsvarer enheten.
  3. Gå til Kjør analyse og angi de riktige innstillingene, for eksempel bildefiltrering (forskjell på gjennomsnittsfiltre), lokaliseringsmetoder (lokalt maksimum) og subpiksellokalisering av molekyler (integrert Gaussian PSF). Klikk OK for å starte rekonstruksjon av bilder.
    MERK: Om nødvendig er detaljerte instruksjoner for å sette opp parametrene i ThunderSTORM allerede beskrevet37.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dette protokollpapiret beskriver en GCE-basert metode for stedsspesifikk fluorescerende merking og visualisering av Salmonella-utskilte effektorer, som vist i figur 1. Kjemisk struktur av ncAA-bærende transsyklookten bioortogonal gruppe (TCO) og fluorescerende fargestoff er vist i figur 1A. SseJ-merking ble oppnådd ved genetisk inkorporering av bioortogonale ncAAs ved et gult stoppkodon (se figur 1B) ved bruk av et ortogonalt aminoacyl-tRNA-syntetase/tRNA-par via GCE-teknologi. Behandling av TCO-merkede effektorer med tetrazin inneholdende en fluorofor (JF646-Tz eller BDP-Tz) ga en alternativ proteinmerkingsstrategi som muliggjorde observasjon av translokerte Salmonella-utskilte effektorer mange timer etter infeksjon av verten (figur 1B, C). Vi begynte med å identifisere mulige aminosyrerester og valgte posisjon 10 i SseJ for ncAA-inkludering basert på overflatetilgjengelighet og eksisterende kunnskap om SseJ funksjonelle rester. Tidligere strukturelle data og overflateeksponeringsprojeksjoner kan hjelpe til med valg av bestemte steder.

Plasseringen av det gule kodonet i genet som koder for POI påvirker effekten av TCO-inkorporering. Som et resultat bør en serie mutanter med ravkodoner i forskjellige posisjoner av genet til POI opprettes og analyseres for optimal integrasjonseffektivitet. Valg av gult kodonposisjon er empirisk. Generelt bør de endrede restene være ikke-essensielle for POI-funksjon, uten posttranslasjonelle modifikasjoner og tilgjengelige for fluorescerende prober. Uttrykket plasmid bør være et lavt kopinummer slik at det etterligner det opprinnelige kopinummeret til POI. Kodonkonteksten påvirker hvor effektivt en ncAA er inkorporert av et ortogonalt tRNA / aminoacyl-tRNA-syntetasesystem. Mens AAT-TAG-ACT er den foretrukne konteksten til det ortogonale tRNA, ble posisjonen til fenylalanin-10 av sseJ endret til TAG, noe som sikrer AAT-TAG-ACT-konteksten for å muliggjøre den mest effektive innlemmelsen av ncAA. Først testet vi om mutantene var funksjonelle i E. coli ved hjelp av et høyt kopinummerplasmid for å uttrykke sseJ. Som vist av SDS-PAGE var SseJ-F10TCO-HA mutert uttrykk avhengig av tilstedeværelsen av TCO*A og den tilsvarende optimale tRNA/aaRS (figur 2A). SseJ-F10FCO-HA ble merket med JF646-Tz ved hjelp av SPIEDAC klikkkjemi i E. coli. Den selektive fluorescerende merkingen av SseJ-F10TCO-HA i E. coli in vitro ble bekreftet ved fluorescensmikroskopianalyse (figur 2B). Ved hjelp av GCE ble TCO*A dermed stedsspesifikt innlemmet i et ravkodon i sseJ. Forsøk på direkte å identifisere genomisk off-target inkorporering av ncAAs ved hjelp av tRNAPyl/PylRSAF-system produserte ingen bevis for deres eksistens. Vi anbefaler imidlertid å bruke in-gel fluorescens, Western blot, fluorescerende fusjonsprotein, in vitro fluorescensmerking og andre metoder for å vurdere effektiviteten, spesifisiteten, graden av off-target inkorporering og toksisitet av pEVOL-plasmidet, som dokumentert i tidligere rapporterte artikler sitert her12,29.

Når vi fastslo at den undertrykte TAG i sseJ var funksjonell, klonet vi sseJ-F10TCO-HA sammen med dens opprinnelige promotor til det lave kopinummeret plasmid pWSK29, og sikret et AAT-TAG-ACT-motiv for fluorescerende merking og visualisering. In vitro selektiv merking av SseJ-F10TCO-HA i salmonellaceller ble bekreftet med fluorescensmikroskopi (figur 3). Vi infiserte deretter HeLa-celler med villtype Salmonella-stammen komplementert med p sseJ-HA eller p sseJ 10TAG-HA, i fravær eller tilstedeværelse av TCO * A for å avgjøre om TCO-inkorporertSseJ kunne overføres til vertsceller. Infiserte HeLa-celler ble fiksert med PFA og immunfarget med anti-HA antistoff 16 timer etter infeksjon for å markere SIFs dekorert av SseJ. Som vist i figur 4C ble SseJ-F10TCO-HA åpenbart utskilt, SseJ-avhengige SIF-er ble dannet, og de lignet de som ble observert i villtypeinfiserte celler (figur 4A). SseJ-avhengige SIF-er ble imidlertid ikke observert i fravær av TCO*A (figur 4B). Disse observasjonene viste at uttrykket av sseJ-F10TCO-HA ved bruk av GCE reddet SseJ-avhengige SIF-er. I tillegg indikerte resultatene også at SseJ-F10TCO-HA var en fullt funksjonell virulensfaktor for Salmonella.

Etter å ha bekreftet at GCE-merket SseJ var funksjonell og utskilt, brukte vi SPIEDAC-reaksjonen til å merke SseJ-F10TCO-HA med JF646-Tz i HeLa-celler. For å gjøre det, infiserte vi HeLa-celler med villtype Salmonella komplementert med p sseJ-F10TCO-HA, i nærvær av TCO*A. Etter merking med JF646-Tz ved bruk av to alternative protokoller beskrevet i protokollseksjon 5, ble celler vasket omfattende for å fjerne overflødig fargestoff, fiksert med PFA, og immunfarget med et anti-HA-antistoff for å visualisere den utskilte SseJ-F10TCO-HA. SseJ-F10TCO-HA utskilt i cytoplasma av HeLa-celler ble merket med JF646-Tz (figur 5A, B, rød) og tydelig samlokalisert med HA-tag (grønn). Observasjonen at de to etikettene overlappet hverandre (den ene et fluorescerende fargestoff, den andre merket ved immunfarging), understreker ytterligere spesifisiteten til GCE-merking.

For å sikre at fluorescenssignalet observert i disse HeLa-cellene bare var spesifikt for den utskilte effektoren SseJ, infiserte vi celler med villtype Salmonella (bærer psseJ-HA) i nærvær av TCO * A og pEVOL-PylRS-AF. Et klikkfargestoff ble brukt for å observere om det var bakgrunnsmerking i HeLa-cellene. SseJ ble frigjort til vertscellens cytoplasma, uten intracellulære eller uspesifikke fluorescerende signaler (figur 5C), noe som viste at fluorescenssignalet var spesifikt for SseJ. Etter å ha fastslått at ncAA ble inkorporert spesifikt i et gult kodon, og at utskilt SseJ kunne visualiseres i vertscellen via klikkreaksjonen, var neste mål å lage et superoppløsningsbilde av utskilt SseJ i HeLa-celler (figur 6). I figur 6 demonstrerer vi kraften til GCE og bruken av JF646-fargestoffet for å generere stedsspesifikke superoppløsningsbilder av Salmonella-utskilt effektor SseJ i HeLa-celler.

Figure 1
Figur 1: Skjema for stedsspesifikk fluorescerende merking av SPI-2-effektorer. (A) TCO*A og JF-646-tetrazin. (B) Skjemaet viser inkorporering av en ncAA i en SPI-2 effektor. I bakteriecellen introduseres et plasmid som inneholder genet for en effektor POI (lilla) og et ortogonalt suppressor tRNA (rødt) / aminoacylsyntetase (grønt) par. Et naturlig kodon byttes ut med et gult (TAG, rødt) stoppkodon i effektorgensekvensen på et tillatt sted. ncAA (mørk rød sirkel) blir ganske enkelt introdusert i vekstmediet. Det blir deretter plukket opp av cellen og når cytosolen, hvor det er knyttet til det ortogonale tRNA av aminoacyl-tRNAsyntetase (aaRS). Det ncAA-acylerte tRNA med et CUA-antikodon kommer inn i det ribosomale maskineriet som et resultat av det komplementære ravkodonet på effektoren mRNA (lilla), som inkorporerer det vedlagte ncAA i effektoren. ncAA bæres av polypeptidkjeden i full lengde av effektorstedet, som deretter brettes og monteres til et funksjonelt effektorprotein. Den nylig produserte effektoren omplasseres til vertscellen gjennom T3SS. En eksternt forsynt fluorofor kan brukes til å merke en utskilt SPI-2-effektor integrert med ncAA. (C) Kobberfritt klikkreaksjonsskjema med fluorogent tetrazinfargestoff. Gjennom SPIEDAC-klikkreaksjonen reagerer en ncAA med en anstrengt alkengruppe innlemmet i et POI (SseJ) med et tetrazinkoblet fargestoff (JF646-Tz). Det fluorogene, tetrazinkoblede fargestoffet JF646-Tz blir fluorescerende (rødt) først etter vellykket merking. Forkortelser: TCO*A = trans-cyclooct-2-en-L-Lysine; ncAA = ikke-kanonisk aminosyre; T3SS = type tre sekresjonssystem; SPI-2 = Salmonella patogenisitet øy 2; POI = protein av interesse; SPIEDAC = belastningsfremmet invers elektron-etterspørsel Diels-Alder sykloaddisjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2:TCO*A er stedsspesifikt innlemmet i SseJ-F10TCO-HA uttrykt i E. coli. (A) Coomassie-farget SDS-PAGE bekrefter den selektive innlemmelsen av TCO*A i SseJ-F10TCO-HA (indikert med rød pil) in E. coli. (B) Ekspresjon av SseJ-F10TCO-HA i E. coli analysert ved fluorescensmikroskopi i fravær (øverst) eller tilstedeværelse (nederst) av 1 mM TCO*A. E. coli-celler som uttrykker SseJ-F10TCO-HA i fravær eller tilstedeværelse av TCO*A, inkuberes med BDP-Fl-tetrazin og avbildes for BDP-fluorescens (grønn). SseJ-fluorescens (grønn) observeres kun i nærvær av den inkorporerte TCO*A-etiketten; Legg merke til fraværet av bakgrunnsfluorescens i topppanelet. Skala bar = 2 μm. Forkortelser: TCO*A = trans-cyclooct-2-en-L-Lysine; BF = brightfield; HA = hyaluronsyre. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: TCO*A er stedsspesifikt inkorporert i SseJ-F10TCO-HA uttrykt i Salmonella. Fluorescensmikroskopi brukes til å undersøke uttrykket av SseJ-F10TCO-HA i Salmonella i fravær (øverst) eller tilstedeværelse (nederst) av 1 mM TCO*A. Salmonella som uttrykker SseJ F10TCO-HA behandles med JF646-Tz og avbildes for JF646 fluorescens (magenta), i nærvær eller fravær av TCO*A. Fluorescens av SseJ (magenta) påvises kun når TCO*A er til stede. Skala bar = 2 μm. Forkortelser: TCO*A = trans-cyclooct-2-en-L-Lysine; BF = brightfield; HA = hyaluronsyre. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Utskilt SseJ-J10TCO-HA er funksjonell. (A) HeLa-celler er infisert med Salmonella som har psseJ-HA i 16 timer, fast og immunfarget med anti-HA-antistoff (rød), LPS (grønn) og DAPI (blå). Som forventet observeres dannelsen av SseJ-avhengige SIFs i infiserte celler. (B) I fravær av TCO*A undertrykkes ikke gult kodon, og SseJ-avhengige SIF-er er fraværende i infiserte HeLa-celler. HeLa-celler er infisert med Salmonella som uttrykker SseJ-F10TCO-HA i fravær av TCO*A i 16 timer, fiksert og immunfarget med anti-HA-antistoff (rød), LPS (grønn) og DAPI (blå). (C) SseJ-avhengige SIFer observeres i nærvær av TCO*A. Infiserte HeLa-celler med Salmonella som uttrykker SseJ-F10TCO-HA i nærvær av 400 μM TCO*A er fiksert og immunfarget med anti-HA antistoff SseJ (rød), LPS (grønn) og DAPI (blå). SseJ-avhengige SIF-er er observert i venstre panel, noe som tydelig indikerer at SseJ ble reddet av uttrykket av sseJ-F10TCO-HA ved bruk av GCE. Skala bar = 10 μm. Forkortelser: HA = hyaluronsyre; LPS = lipopolysakkarid; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; TCO * A = trans-cyklookt-2-en-L-lysin; SIFs = Salmonella-induserte filamenter; GCE = genetisk kodeutvidelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Merking spesifisitet av SseJ med JF646-Tz fargestoff. (A) HeLa-celler er infisert med Salmonella som uttrykker SseJ-F10TCO-HA i nærvær av 400 μM TCO * A. TCO-merket utskilt SseJ-F10TCO-HA er merket med 2 μM JF646-Tz i 1x PBS som inneholder 1% kaseinnatriumsalt fra storfemelk, grundig vasket, fiksert og immunfarget med anti-HA-antistoff for å visualisere den utskilte SseJ (grønn). SseJ-F10TCO-HA skilles ut og merkes med JF646-Tz fargestoff (rødt, venstre panel). SseJ merket via GCE (rød) og HA (grønn) er tydelig samlokalisert (høyre panel). (B) Ved hjelp av en litt annen merkingsprotokoll er TCO-merket utskilt SseJ-F10TCO-HA også merket med 2 μM JF646-Tz i komplett medium DMEM (uten FBS), grundig vasket og fiksert, og utsatt for anti-HA immunfluorescensfarging. Utskilt SseJ-F10TCO-HA er merket med JF646-Tz fargestoff (rødt, venstre panel) og samlokalisert med HA (grønn). (C) For ytterligere å fastslå at fluorescenssignalet er unikt for SseJ og ikke et produkt av andre SPI-2-frigjorte proteiner, er HeLa-celler infisert med villtype Salmonella som bærer psseJ-HA og pEVOL-PylRS-AF, i nærvær av ncAA (TCO * A). 16 timer etter infeksjon behandles infiserte HeLa-celler med 2 μM JF646-Tz i komplett medium (uten FBS og TCO*A), og overflødig fargestoff fjernes grundig ved hjelp av nytt vekstmedium. HeLa-celler er PFA-fiksert og grundig vasket med PBS før de blir immunfarget for SseJ (grønn). Mangelen på synlig bakgrunnsfluorescenssignal i venstre panel (JF646-Tz) indikerer at nesten ingen off-target merking skjedde i vertscellene. Skala bar = 10 μm. Forkortelser: HA = hyaluronsyre; PBS = fosfatbufret saltvann; FBS = føtalt bovint serum; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; TCO * A = trans-cyklookt-2-en-L-lysin; SIFs = Salmonella-induserte filamenter; GCE = genetisk kodeutvidelse; SPI-2 = Salmonella patogenisitet øy 2; BF = brightfield. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Superoppløsningsavbildning av GCE-merket SseJ i HeLa-celler. HeLa-celler er infisert med Salmonella som uttrykker SseJ-F10TCO-HA i nærvær av 400 μM TCO * A. TCO-merket utskilt SseJ-F10TCO-HA er merket med 2 μM JF646-Tz under fysiologiske forhold som beskrevet i protokollen, og deretter grundig vasket. Bildene er tatt med Nikon N-STORM. (A) Brightfield-bilde av en HeLa-celle under observasjon. Skalastang = 10 μm. (B) Diffraksjonsbegrenset vidvinkelbilde av utskilt SseJ merket med TCO*A og JF-646. Skalastang = 10 μm. (C) Tilsvarende dSTORM-bilde av de SseJ-dekorerte SIF-ene. Skalalinje = 10 μm. C(i)-innfelling viser en forstørret visning av superoppløst SseJ i det boksede området. Skala bar = 1 μm. Forkortelser: HA = hyaluronsyre; TCO * A = trans-cyklookt-2-en-L-lysin; SIFs = Salmonella-induserte filamenter; GCE = genetisk kodeutvidelse; WF = bredfelt; BF = brightfield. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1. Løsninger. Klikk her for å se en større versjon av denne tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tilnærmingen beskrevet her ble brukt til å spore den nøyaktige plasseringen av effektorproteiner injisert i vertscellen av bakterien T3SS etter infeksjon. T3SS er ansatt av intracellulære patogener som Salmonella, Shigella og Yersinia for å transportere virulenskomponenter inn i verten. Utviklingen av superoppløsningsteknologier har gjort det mulig å visualisere virulensfaktorer ved en tidligere utenkelig oppløsning12,13,24. Imidlertid utelukket visse merkingsbegrensninger mer grundig undersøkelse, da fotoaktiverbare proteinfusjoner blokkerer T3SS-porene og ikke utskilles. I tillegg kan klyngeartefakter og feilaktig analyse skyldes noe fusjonsproteins iboende tilbøyelighet til å klynge eller aggregere.

I noen tilfeller spaltes fusjonsproteinet også, som vi tidligere observerte med PAmCherry-SsaP12,13. Alle disse begrensningene overvinnes av GCE, som muliggjør stedsspesifikk fluorescerende merking av interessepunkter. Det tillater også visualisering av proteiner som ikke er rikelig12,13. Selv om det er en rekke faktorer som kan påvirke effektiviteten av ncAA-inkorporering ved bruk av et ortogonalt tRNA / aminoacyl-tRNA-syntetasesystem, ser det ut til at kodonkonteksten er den mest avgjørende. Det ortogonale tRNA inkorporerer en ncAA mest effektivt når den foretrukne kodonkonteksten er AATTAGACT33. I figur 5 kan vi sammenligne den skarpe merkingen som følge av GCE og en stedsspesifikk fluorofor (samt fravær av bakgrunn) sammenlignet med immunfarging av en HA-tag.

Som et resultat vil forskere kunne visualisere POI i patogener, kommensale bakterier og eukaryote verter ved hjelp av metoden som er skissert her. Kort sagt, genetisk kodede ncAA gir en alternativ tilnærming til effektorproteinmerking når konvensjonelle metoder mislykkes. Imidlertid er en stor begrensning av denne metoden de iboende kjemiske egenskapene til fluoroforen, for eksempel membranpermeabilitet, distribusjon og retensjon, noe som kan påvirke effektiviteten av fluorescerende merking. Fluorescerende ncAA er et alternativ for å unngå klikkreaksjoner12, men disse kan bare visualiseres ved hjelp av to-foton mikroskopi. Leserne henvises til en liste over cellemembran-permeable / ugjennomtrengelige fargestoffer sitert her 12,38,39,40,41.

Avslutningsvis merket og visualiserte vi Salmonella-utskilt effektor SseJ ved å genetisk kode ncAAs i kombinasjon med en fluorogen fluorofor uten å svekke dens biologiske funksjon. Merking av SseJ med JF646-Tz var svært spesifikk, og superoppløsningsavbildning kan videre brukes til å visualisere utskilte effektorer inne i vertsceller. Dermed tillot fluorescerende merking av bakterielle effektorer ved bruk av dSTORM-kompatible fargestoffer og genetisk kodeutvidelse den subcellulære romlige lokaliseringen av bakterielle utskillede effektorer i vertsceller, med en oppløsning under diffraksjonsgrensen. Siden denne merkeplattformen er kompatibel med sporing av enkeltpartikler med levende celler, vil metoden vår gjøre det mulig å analysere effektorproteiner i T3SS-systemet med enestående nivåer av tidsmessig og romlig oppløsning, noe som vil forbedre vår molekylære forståelse av bakteriell patogenese.

Selv om det er visse begrensninger, for eksempel dårlig ncAA-inkorporeringseffektivitet og de fotofysiske begrensningene til den organiske fluoroforen, har vi vist at denne tilnærmingen kan hjelpe forskere til å observere og lokalisere en utskilt effektor inne i vertsceller, selv når det er knappe12,13. Vi forventer at tilpasning av teknologien vil åpne for nye og spennende muligheter for avbildning og forskning på andre effektorproteiner produsert av bakterier under infeksjon. Metoden er også lett tilpasset for merking av virus, og demonstrerer sin brede nytteverdi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av oppstartsmidler fra University of Texas Medical branch, Galveston, TX, og en Texas STAR-pris til LJK Vi takker professor Edward Lemke (European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg, Tyskland) for plasmid pEVOL-PylRS-AF. Bildene i figur 1 ble laget ved hjelp av BioRender.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Tris/Glycine SDS running buffer BIO-RAD 1610732
Ammonium chloride Fischer Scientific A661-500
Ammonium sulphate Fischer Scientific BP212R-1
Ampicillin Sodium Sigma-Aldrich A0166 5 g
Antibiotic-Antimycotic (100x) ThermiFischer Scientific 15240096
Arabinose Sigma-Aldrich A3256 500 g
Avanti J-26XP (High-Performance Centrifuge) Beckman Coulter
Bacto-Agar BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA 214010
BDP-FL-tetrazine Lumiprobe (USA) 2.14E+02
β-mercaptoethanol Millipore 444203 250 mL
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B8026
BSA Sigma-Aldrich A4503 500 g
Casein Sigma-Aldrich C8654
Catalase Sigma-Aldrich C9322
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C1919
Click Amino Acid / trans-Cyclooct-2-en – L - Lysine (TCO*A) SiChem GmbH SC-8008 Size: 500 mg
DAPI (Hoechst33342) Invitrogen H3570
DeNovix DS-11+ Spectrophotometer DeNovix
DMEM* Corning 10-013-CV * Used for maintaining HeLa Cell
DMEM** Gibco 11965-092 **Used for bacterial infection in presence of ncAA, see section 5.4.
DMSO Sigma-Aldrich D8418 250 g
Donkey anti-rabbit Alexa fluoro555 secondary antibody Invitrogen A-31572
DPBS, 1x Corning 21-031-CV
E. coli strain BL21 (DE3) Novagen (Madison, WI)
EMCCD Camera Andor iXon Ultra 897-BV
Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 mL (PCR clean) Eppendorf, Hamburg, Germany 30123.328
Fetal Bovine Serum (FBS) Fischer 10082147
Fisherbrand Syringe Filters - Sterile (PVDF 0.22 µm) Fischer Scientific 97203 Pack of 100
Gene Pulser Xcell Electroporator BIO-RAD 1652660
Gentamycin Sigma-Aldrich G1272 10 mL
Gibco L-Glutamine (200 mM), 100x Fischer Scientific 25-030-081
Glucose oxidase Sigma-Aldrich G7141-50KU
Glycerol Fischer Scientific BF229-4
HeLa cells ATTC CCL-2
HEPES Buffer Corning 25-060-C1 100 mL
Hydrocloric acid Fischer Scientific A144-212
ImageJ Image processing and analysis:  http://rsbweb.nih.gov/ij
IntantBlue Expedeon ISB1L Coomassie-based stain
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma-Aldrich I5502
Janelia Fluoro 646-tetrazine Tocris Bioscience 7279
Kanamycin Sigma-Aldrich 60615 5 g
LB Broth BD Difco 244620 500 g
Lysozyme Sigma-Aldrich L6876
μManager (v. 1.4.2) https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release
MES Sigma-Aldrich M3671 250 g
Micro pulser cuvette BIO-RAD 165-2086 0.2 cm electrode gap, pkg. of 50
Nikon N-STORM Nikon Instruments Inc. https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/super-resolution-microscopes/n-storm-super-resolution
Nunc EasYFlask Cell Culture Flasks ThermiFischer Scientific 156499
Omnipur Casamino Acid Calbiochem 2240 500 g
Paraformaldehhyde (PFA) Electron Microscopy Sciences  15710
PBS (10x) Roche 11666789001
Penicillin-Streptomycin Solution (100x) GenDEPOT  CA005-010 100 mL
pEVOL-PylRS-AF For plasmid construction and map see following references
1. Angew Chem Int Ed Engl. 2011, 50(17), 3878-81.
2. Angew Chem Int Ed Engl., 2012, 51, 4166-70.
Plasmid Mini-prep Kit Qiagen 27106
plasmid pWSK29-sseJ10TAG-HA Ref.: elife. 2021, 10, e67789.
plasmid pWSK29-sseJ-HA Ref.: elife. 2021, 10, e67789.                                                                   Vector map of PWSK29: https://www.addgene.org/172972/
Pluronic F-127 Millipore 540025 Protein grade, 10% Solution
Potassium phosphate monobasic Fischer Scientific P285-500
Potassium sulphate Acros Organic 424220250
Protease Inhibitor Cocktail Set I - Calbiochem Sigma-Aldrich 539131 100x Solution
Rabbit anti-HA primary antibody Sigma-Aldrich H6908
S. enterica. serovar Typhimurium 14028s Ref.: PLoS Biol. 2015, 13, e1002116.
Saponin Sigma-Aldrich 47036-50G-F
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich L3771
Sodium hydroxide Fischer Scientific SS255-1
Sodium Pyruvate (100 mM), 100x Corning 25-060-C1 100 mL
Sonic Dismembrator Model 100 Fischer Scientific 24932
STED microsocpe (Leica TCS SP8 STED 3X system) Leica Microsystems, Wetzlar, Germany https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/
ThunderSTORM https://zitmen.github.io/thunderstorm/
Trizma Base Sigma-Aldrich T1503
Trypsin-EDTA (1x), 0.25%   GenDEPOT  CA014-010
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416 100 mL
X-well tissue culture chamber slides SARSTEDT 94.6190.802

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Marlovits, T. C., et al. Structural insights into the assembly of the type III secretion needle complex. Science. 306 (5698), 1040-1042 (2004).
  2. Kubori, T., et al. Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretion system. Science. 280 (5363), 602-605 (1998).
  3. LaRock, D. L., Chaudhary, A., Miller, S. I. Salmonellae interactions with host processes. Nature Reviews Microbiology. 13 (4), 191-205 (2015).
  4. Galan, J. E., Waksman, G. Protein-injection machines in bacteria. Cell. 172 (6), 1306-1318 (2018).
  5. Feng, X., Oropeza, R., Kenney, L. J. Dual regulation by phospho-OmpR of ssrA/B gene expression in Salmonella pathogenicity island 2. Molecular Microbiology. 48 (4), 1131-1143 (2003).
  6. Walthers, D., et al. Salmonella enterica response regulator SsrB relieves H-NS silencing by displacing H-NS bound in polymerization mode and directly activates transcription. Journal of Biological Chemistry. 286 (3), 1895-1902 (2011).
  7. Chakraborty, S., Mizusaki, H., Kenney, L. J. A FRET-based DNA biosensor tracks OmpR-dependent acidification of Salmonella during macrophage infection. PLoS Biology. 13 (4), e1002116 (2015).
  8. Liew, A. T. F., et al. Single cell, super-resolution imaging reveals an acid pH-dependent conformational switch in SsrB regulates SPI-2. eLife. 8, e45311 (2019).
  9. Knuff, K., Finlay, B. B. What the SIF is happening-the role of intracellular Salmonella-induced filaments. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 335 (2017).
  10. Drecktrah, D., et al. Dynamic behavior of Salmonella-induced membrane tubules in epithelial cells. Traffic. 9 (12), 2117-2129 (2008).
  11. Garcia del-Portillo, F., Zwick, M. B., Leung, K. Y., Finlay, B. B. Salmonella induces the formation of filamentous structures containing lysosomal membrane glycoproteins in epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (22), 10544-10548 (1993).
  12. Singh, M. K., Zangoui, P., Yamanaka, Y., Kenney, L. J. Genetic code expansion enables visualization of Salmonella type three secretion system components and secreted effectors. elife. 10, e67789 (2021).
  13. Singh, M. K., Kenney, L. J. Super-resolution imaging of bacterial pathogens and visualization of their secreted effectors. FEMS Microbiology Reviews. 45 (2), fuaa050 (2020).
  14. Akeda, Y., Galan, J. E. Chaperone release and unfolding of substrates in type III secretion. Nature. 437 (7060), 911-915 (2005).
  15. Su, W. W. Fluorescent proteins as tools to aid protein production. Microbial Cell Factories. 4 (1), 12 (2005).
  16. Wang, S., Moffitt, J. R., Dempsey, G. T., Xie, X. S., Zhuang, X. Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8452-8457 (2014).
  17. Ghodke, H., Caldas, V. E. A., Punter, C. M., van Oijen, A. M., Robinson, A. Single-molecule specific mislocalization of red fluorescent proteins in live Escherichia coli. Biophysical Journal. 111 (1), 25-27 (2016).
  18. Gahlmann, A., Moerner, W. E. Exploring bacterial cell biology with single-molecule tracking and super-resolution imaging. Nature Reviews Microbiology. 12 (1), 9-22 (2014).
  19. Keppler, A., et al. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).
  20. Gautier, A., et al. An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells. Chemical Biology. 15 (2), 128-136 (2008).
  21. Young, A. M., Minson, M., McQuate, S. E., Palmer, A. E. Optimized fluorescence complementation platform for visualizing Salmonella effector proteins reveals distinctly different intracellular niches in different cell types. ACS Infectious Diseases. 3 (8), 575-584 (2017).
  22. Martin, B. R., Giepmans, B. N., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Mammalian cell-based optimization of the biarsenical-binding tetracysteine motif for improved fluorescence and affinity. Nature Biotechnology. 23 (10), 1308-1314 (2005).
  23. Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications. Journal of the American Chemical Society. 124 (21), 6063-6076 (2002).
  24. Gao, Y., Spahn, C., Heilemann, M., Kenney, L. J. The pearling transition provides evidence of force-driven endosomal tubulation during Salmonella infection. mBio. 9 (3), e01083-e01018 (2018).
  25. Brumell, J. H., Goosney, D. L., Finlay, B. B. SifA, a type III secreted effector of Salmonella typhimurium, directs Salmonella-induced filament (Sif) formation along microtubules. Traffic. 3 (6), 407-415 (2002).
  26. Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
  27. Davis, L., Chin, J. W. Designer proteins: applications of genetic code expansion in cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 168-182 (2012).
  28. Chin, J. W., et al. Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).
  29. Kipper, K., et al. Application of noncanonical amino acids for protein labeling in a genomically recoded Escherichia coli. ACS Synthetic Biology. 6 (2), 233-255 (2017).
  30. Uttamapinant, C., et al. Genetic code expansion enables live-cell and super-resolution imaging of site-specifically labeled cellular proteins. Journal of American Chemical Society. 137 (14), 4602-4605 (2015).
  31. Plass, T., et al. Amino acids for Diels-Alder reactions in living cells. Angewandte Chemie International Edition. 51 (17), 4166-4170 (2012).
  32. Lang, K., et al. Genetic encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions. Journal of the American Chemical Society. 134 (25), 10317-10320 (2012).
  33. Xu, H., et al. Re-exploration of the codon context effect on amber codon-guided incorporation of noncanonical amino acids in Escherichia coli by the blue-white screening assay. ChemBioChem. 17 (13), 1250-1256 (2016).
  34. Nakamura, Y., Gojobori, T., Ikemura, T. Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000. Nucleic Acids Research. 28 (1), 292 (2000).
  35. Spahn, C., et al. Sequential super-resolution imaging of bacterial regulatory proteins: the nucleoid and the cell membrane in single, fixed E. coli cells. Methods in Molecular Biology. 1624, 269-289 (2017).
  36. Grimm, J., English, B., Chen, J., et al. A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy. Nature Methods. 12 (3), 244-250 (2015).
  37. Xu, J., Ma, H., Liu, Y. Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM). Current Protocols in Cytometry. 81 (1), 12-46 (2017).
  38. Meineke, B., Heimgärtner, J., Eirich, J., Landreh, M., Elsässer, S. J. Site-specific incorporation of two ncAAs for two-color bioorthogonal labeling and crosslinking of proteins on live mammalian cells. Cell Reports. 31 (12), 107811 (2020).
  39. Bessa-Neto, D., et al. Bioorthogonal labeling of transmembrane proteins with non-canonical amino acids unveils masked epitopes in live neurons. Nature Communications. 12 (1), 6715 (2021).
  40. Beliu, G., et al. Bioorthogonal labeling with tetrazine-dyes for super-resolution microscopy. Communication Biology. 2, 261 (2019).
  41. Arsić, A., Hagemann, C., Stajković, N., Schubert, T., Nikić-Spiegel, I. Minimal genetically encoded tags for fluorescent protein labeling in living neurons. Nature Communications. 13 (1), 314 (2022).

Tags

Biologi utgave 192 Salmonella ikke-kanoniske aminosyrer genetisk kodeutvidelse SseJ superoppløsning dSTORM
Superoppløsningsavbildning av bakterielle utskillede proteiner ved hjelp av genetisk kodeutvidelse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Singh, M. K., Kenney, L. J.… More

Singh, M. K., Kenney, L. J. Super-Resolution Imaging of Bacterial Secreted Proteins Using Genetic Code Expansion. J. Vis. Exp. (192), e64382, doi:10.3791/64382 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter