Summary
Questo articolo fornisce un protocollo semplice e chiaro per marcare gli effettori secreti da Salmonella utilizzando l'espansione del codice genetico (GCE) in modo specifico per il sito e visualizzare la localizzazione subcellulare delle proteine secrete nelle cellule HeLa utilizzando la microscopia a ricostruzione ottica stocastica diretta (dSTORM)
Abstract
I sistemi di secrezione di tipo tre (T3SS) consentono ai batteri gram-negativi di iniettare una batteria di proteine effettrici direttamente nel citosol delle cellule ospiti eucariotiche. All'ingresso, le proteine effettrici iniettate modulano in modo cooperativo le vie di segnalazione eucariotiche e riprogrammano le funzioni cellulari, consentendo l'ingresso e la sopravvivenza dei batteri. Il monitoraggio e la localizzazione di queste proteine effettrici secrete nel contesto delle infezioni fornisce un'impronta per definire l'interfaccia dinamica delle interazioni ospite-patogeno. Tuttavia, l'etichettatura e l'imaging delle proteine batteriche nelle cellule ospiti senza interrompere la loro struttura / funzione è tecnicamente impegnativo.
La costruzione di proteine di fusione fluorescenti non risolve questo problema, perché le proteine di fusione bloccano l'apparato secretorio e quindi non vengono secrete. Per superare questi ostacoli, abbiamo recentemente impiegato un metodo per la marcatura fluorescente sito-specifica di effettori secreti batterici, così come altre proteine difficili da etichettare, utilizzando l'espansione del codice genetico (GCE). Questo documento fornisce un protocollo passo-passo completo per marcare gli effettori secreti da Salmonella utilizzando GCE site-specific, seguito da istruzioni per l'imaging della localizzazione subcellulare delle proteine secrete nelle cellule HeLa utilizzando la microscopia a ricostruzione ottica stocastica diretta (dSTORM)
Recenti scoperte suggeriscono che l'incorporazione di aminoacidi non canonici (ncAA) tramite GCE, seguita da marcatura bio-ortogonale con coloranti contenenti tetrazina, è una tecnica praticabile per la marcatura selettiva e la visualizzazione delle proteine secrete batteriche e la successiva analisi delle immagini nell'ospite. L'obiettivo di questo articolo è quello di fornire un protocollo semplice e chiaro che possa essere impiegato dai ricercatori interessati a condurre immagini a super-risoluzione utilizzando GCE per studiare vari processi biologici in batteri e virus, nonché le interazioni ospite-patogeno.
Introduction
Le infezioni batteriche sono state a lungo considerate un grave pericolo per la salute umana. I patogeni utilizzano sistemi di difesa altamente evoluti, estremamente potenti e intricati, nonché una varietà di fattori di virulenza batterica (indicati come proteine effettrici) per eludere le risposte immunitarie dell'ospite e stabilire infezioni 1,2. Tuttavia, i meccanismi molecolari alla base di questi sistemi e il ruolo delle singole proteine effettrici sono ancora in gran parte sconosciuti a causa della mancanza di approcci adeguati per seguire direttamente i componenti proteici cruciali e gli effettori nelle cellule ospiti durante la patogenesi.
Un esempio tipico è Salmonella enterica sierotipo Typhimurium, che causa gastroenterite acuta. Salmonella Typhimurium utilizza sistemi di secrezione di tipo tre (T3SS) per iniettare una varietà di proteine effettrici direttamente nelle cellule ospiti. Non appena la Salmonella entra nella cellula ospite, risiede in un compartimento legato alla membrana acida, chiamato vacuolo contenente Salmonella (SCV)3,4. Il pH acido dell'SCV attiva il T3SS codificato per l'isola di patogenicità della Salmonella 2 (SPI-2) e trasloca una raffica di 20 o più proteine effettrici attraverso la membrana vacuolare nel citosol ospite 5,6,7,8. All'interno dell'ospite, questi complessi cocktail di proteine effettrici manipolano coordinatamente le vie di segnalazione delle cellule ospiti, con conseguente formazione di strutture di membrana tubulari altamente dinamiche e complesse estese dall'SCV lungo i microtubuli, chiamati filamenti indotti da Salmonella (SIF), che consentono alla Salmonella di sopravvivere e replicarsi all'interno delle cellule ospiti 9,10,11.
I metodi per visualizzare, tracciare e monitorare le localizzazioni degli effettori batterici ed esaminare il loro traffico e le interazioni all'interno delle cellule ospiti, forniscono informazioni critiche sui meccanismi alla base della patogenesi batterica. La marcatura e la localizzazione delle proteine effettrici T3SS secrete da Salmonella all'interno delle cellule ospiti si è dimostrata una sfida tecnologica12,13; Tuttavia, lo sviluppo di proteine fluorescenti codificate geneticamente ha trasformato la nostra capacità di studiare e visualizzare le proteine all'interno dei sistemi viventi. Tuttavia, la dimensione delle proteine fluorescenti (~25-30 kDa)15 è spesso paragonabile o addirittura superiore a quella della proteina di interesse (POI; ad esempio, 13,65 kDa per SsaP, 37,4 kDa per SifA). Infatti, la marcatura fluorescente delle proteine degli effettori spesso blocca la secrezione dell'effettore marcato e blocca il T3SS14.
Inoltre, le proteine fluorescenti sono meno stabili ed emettono un basso numero di fotoni prima del fotosbiancamento, limitando il loro uso nelle tecniche microscopiche a super-risoluzione16,17,18, in particolare nella microscopia di localizzazione della fotoattivazione (PALM), STORM e microscopia STED (stimolation emission depletion). Mentre le proprietà fotofisiche dei coloranti fluorescenti organici sono superiori a quelle delle proteine fluorescenti, metodi / tecniche come CLIP / SNAP19,20, Split-GFP 21, ReAsH / FlAsH 22,23 e HA-Tags 24,25 richiedono un'appendice proteica o peptidica aggiuntiva che può compromettere la struttura-funzione della proteina effettrice di interesse interferendo con la modifica o il traffico post-traduzionale. Un metodo alternativo che riduce al minimo la necessaria modificazione proteica comporta l'incorporazione di ncAA in un POI durante la traduzione attraverso GCE. Gli ncAA sono fluorescenti o possono essere resi fluorescenti tramite chimica a scatto 12,13,26,27,28.
Utilizzando la GCE, le ncAA con gruppi piccoli, funzionali, bio-ortogonali (come un gruppo azide, ciclopropene o cicloottino) possono essere introdotte in quasi tutte le posizioni in una proteina bersaglio. In questa strategia, un codone nativo viene scambiato con un codone raro come un codone di arresto ambrato (TAG) in una posizione specifica nel gene del POI. La proteina modificata viene successivamente espressa nelle cellule insieme a una coppia ortogonale amminoacil-tRNA sintetasi/tRNA. Il sito attivo della tRNA sintetasi è progettato per ricevere solo un particolare ncAA, che viene quindi attaccato covalentemente all'estremità 3' del tRNA che riconosce il codone ambrato. L'ncAA viene semplicemente introdotto nel mezzo di crescita, ma deve essere assorbito dalla cellula e raggiungere il citosol dove l'amminoacil-tRNA sintetasi (aaRS) può collegarlo al tRNA ortogonale; viene quindi incorporato nel PDI nella posizione specificata (vedere Figura 1)12. Pertanto, GCE consente l'incorporazione sito-specifica di una pletora di gruppi reattivi bio-ortogonali come chetone, azide, alchino, cicloottino, transciclooctene, tetrazina, norbonene, α, ammide β-insatura e biciclo [6.1.0]-nonyne in un POI, superando potenzialmente i limiti dei metodi convenzionali di etichettatura delle proteine 12,26,27,28.
Le recenti tendenze emergenti nelle tecniche di imaging a super-risoluzione hanno aperto nuove strade per studiare le strutture biologiche a livello molecolare. In particolare, STORM, una tecnica a super-risoluzione basata sulla localizzazione, è diventata uno strumento inestimabile per visualizzare strutture cellulari fino a ~ 20-30 nm ed è in grado di studiare i processi biologici una molecola alla volta, scoprendo così i ruoli delle molecole intracellulari che sono ancora sconosciuti negli studi tradizionali con media di ensemble13 . Le tecniche a singola molecola e super-risoluzione richiedono un piccolo tag con fluorofori organici luminosi e fotostabili per la migliore risoluzione. Abbiamo recentemente dimostrato che GCE può essere utilizzato per incorporare sonde adatte per l'imaging a super-risoluzione12.
Due delle migliori scelte per la marcatura delle proteine nelle cellule sono biciclo [6.1.0] noninilisina (BCN) e trans-ciclooctene-lisina (TCO; mostrato in Figura 1), che può essere geneticamente codificato usando una variante della coppia tRNA/sintetasi (qui chiamata tRNAPyl/PylRS AF), dove Pyl rappresenta la pirrolisina, e AF rappresenta un doppio mutante razionalmente progettato (Y306A, Y384F) derivato da Methanosarcina mazei che codifica naturalmente la pirrolisina12, 29,30,31. Attraverso la reazione di cicloaddizione di Diels-Alder (SPIEDAC) promossa dalla tensione inversa, questi amminoacidi reagiscono chesomelettivamente con i coniugati tetrazina (Figura 1)12,30,31. Tali reazioni di cicloaddizione sono eccezionalmente veloci e compatibili con le cellule viventi; Possono anche essere fluorogenici, se un fluoroforo appropriato è funzionalizzato con la porzione di tetrazina12,26,32. Questo articolo presenta un protocollo ottimizzato per il monitoraggio della dinamica degli effettori batterici consegnati nelle cellule ospiti utilizzando GCE, seguito dalla localizzazione subcellulare delle proteine secrete nelle cellule HeLa utilizzando dSTORM. I risultati indicano che l'incorporazione di un ncAA tramite GCE, seguita da una reazione a clic con coloranti fluorogenici contenenti tetrazina, rappresenta un metodo versatile per la marcatura selettiva, la visualizzazione delle proteine secrete e la successiva localizzazione subcellulare nell'ospite. Tutti i componenti e le procedure qui descritti possono tuttavia essere adattati o sostituiti in modo che il sistema GCE possa essere adattato per indagare su altre questioni biologiche.
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Protocol
1. Costruzione plasmidica
- Clonare il gene che esprime il POI in un plasmide di espressione (ad esempio, pET28a-sseJ 10TAG) che esprime il POI in E. coli BL21 (DE3). Questo passaggio facilita nel determinare che i mutanti sono funzionali.
- Per la visualizzazione degli effettori secreti da Salmonella nelle cellule ospiti, costruire un plasmide di espressione (pWSK29-sseJ-HA) che esprima il POI bersaglio SseJ sotto il controllo del suo promotore nativo, come descritto nei precedenti rapporti 7,12,24. Utilizzando la mutagenesi sito-diretta, sostituire il codone di fenilalanina-10 con un codone ambrato (TAG) in SseJ (pWSK29-sseJ 10TAG-HA), assicurando il motivo AAT-TAG-ACT33,34.
- Oltre ai plasmidi di cui sopra, per l'incorporazione genetica della trans-ciclooct-2-en-L-lisina (TCO*A) in un POI, utilizzare un altro plasmide di espressione (pEVOL-PylRS-AF)31 che contiene la coppia evoluta tRNA/sintetasi (tRNAPyl/PylRS AF ) geni codificati nel plasmide pEVOL.
NOTA: Le descrizioni dettagliate del plasmide e dei protocolli di clonazione sono descritte nella relazione precedente30,31. - Utilizzare kit di preparazione del plasmide disponibili in commercio per ottenere DNA plasmidico di alta qualità. Per il DNA purificato, il rapporto ottimale 260/280 è ~ 1,8. Controllare la purezza del DNA utilizzando l'elettroforesi su gel di agarosio all'1%, se necessario.
2. Preparazione della coltura batterica
- Ottenere doppi trasformanti per verificare che il mutante sia funzionale in E. coli
- Prelevare le cellule competenti BL21 da -80 °C e scongelarle sul ghiaccio per circa 20-30 minuti.
- Mescolare 1-5 μL di ciascun plasmide (~50 ng di pEVOL-PylRS-AF e pET28a-sseJ 10TAG) con 200 μL di cellule BL21 chimicamente competenti in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. Mescolare delicatamente le cellule competenti e la miscela di plasmidi; Incubare per 30 minuti su ghiaccio.
- Shock termico della provetta della microcentrifuga a bagnomaria a 42 °C per 45 secondi. Rimettere i tubi sul ghiaccio per 2 minuti.
- Aggiungere 1 mL di mezzo LB caldo al tubo della microcentrifuga e trasferire rapidamente la miscela in un tubo conico da 15 ml. Incubare le cellule a 37 °C in uno shaker a 250 rpm per 1 h. Placcare una parte o tutte le cellule trasformate su piastre di agar LB contenenti antibiotici appropriati. Incubare le piastre per una notte a 37 °C.
NOTA: In questo protocollo, sono stati utilizzati 35 μg/mL di cloramfenicolo e 50 μg/mL di kanamicina per selezionare rispettivamente pEVOL-PylRS-AF e pET28a-sseJ 10TAG. Nella fase di trasformazione, valutare la trasformazione riuscita utilizzando controlli negativi e positivi.
- Trasferire il mutante in Salmonella per la visualizzazione degli effettori secreti da Salmonella nelle cellule ospiti:
- Aggiungere 2–3 μL ciascuno di pEVOL-PylRS-AF e pWSK29-sseJ 10TAG a 40–60 μL di Salmonella Typhimurium ceppo 14028s elettrocompetente in una provetta di microcentrifuga refrigerata. Mescolare delicatamente la miscela con una pipetta.
- Trasferire la miscela di elettroporazione in una cuvetta refrigerata (spazio tra gli elettrodi di 0,2 cm); impostare le impostazioni di elettroporazione su 2,5 kV, 200 Ω, 25 μF. Posizionare la cuvetta all'interno della camera di elettroporazione. Assicurarsi che l'elettrodo della camera sia saldamente in contatto con la cuvetta del micro pulser.
- Tieni premuto il pulsante dell'impulso finché non emette un segnale acustico.
- Aggiungere immediatamente 1 mL di mezzo LB caldo nella cuvetta. Trasferire l'intero contenuto in un tubo conico da 15 ml. Incubare le cellule a 37 °C agitando a 250 giri/min per 1 ora.
- Placcare una parte o tutta la miscela elettroporazionale di Salmonella su una piastra di agar LB contenente antibiotici appropriati. Incubare le piastre per una notte a 37 °C.
NOTA: In questo protocollo, 35μg/mL di cloramfenicolo e 100 μg/mL di ampicillina sono stati utilizzati per la selezione di pEVOL-PylRS-AF e pWSK29-sseJ 10TAG, rispettivamente.
- Preparazione della cultura
- Inoculare una singola colonia di Salmonella o E. coli in 5 ml di terreno LB contenente antibiotici appropriati. Crescere per una notte a 37 °C, agitando a 250 giri/min.
3. Espressione ed etichettatura fluorescente di proteine portatrici di ncAA
- Espressione di proteine portatrici di ncAA in E. coli
- Trasferire 100 μL di coltura primaria in 5 mL di terreno LB (diluizione 1:50) contenente 35 μg/mL di cloramfenicolo e 50 μg/mL di kanamicina, seguito da incubazione a 37 °C con agitazione a 250 giri/min fino a quando OD600 raggiunge 0,4-0,6.
- Preparare 1 mM di TCO*A di soluzione madre (10 mL; Tabella 1).
- Quando le colture raggiungono OD600 = 0,4-0,6, sostituire il mezzo LB con LB fresco contenente 1 mM TCO*A, 35 μg/mL di cloramfenicolo e 50 μg/mL di kanamicina.
NOTA: In alternativa, è possibile preparare TCO*Una soluzione madre come descritto al punto 5.4.2. - Indurre l'espressione proteica in presenza di 1 mM IPTG, 0,2% arabinosio e agitare per una notte a 34 °C, 250 rpm. Raccogliere le cellule batteriche mediante centrifugazione per 5 minuti a 11.000 × g. Rimuovere il surnatante e congelare il pellet a -20 °C fino a un ulteriore utilizzo.
- Per un esperimento di controllo, ripetere lo stesso esperimento ma esprimere le proteine portatrici di ncAA in assenza di ncAA. Per la marcatura fluorescente in vitro di proteine contenenti ncAA in E. coli, seguire la procedura dettagliata descritta al punto 3.3.
- Espressione di proteine contenenti ncAA in Salmonella
- Trasferire 100 μL di coltura primaria in 5 mL di terreno LB (diluizione 1:50) contenente 35 μg/mL di cloramfenicolo e 100 μg/mL di ampicillina, seguito da incubazione a 37 °C con agitazione a 250 giri/min fino a quando OD600 raggiunge 0,6.
- Preparare il terreno N-minimo modificato (MgM, pH 5,6) come descritto nella Tabella 1.
- Sostituire il mezzo LB con un mezzo N-minimo modificato (MgM) integrato con 1 mM TCO*A (Tabella 1). Far crescere i batteri a 34 °C per 30 minuti. Quindi, aggiungere 0,2% arabinosio, 25 mg / ml di cloramfenicolo e 100 mg / ml di ampicillina e far crescere le cellule per altre 6 ore, agitando a 250 giri / min.
- Dopo 6 ore, lavare i batteri 4 volte per un intervallo di 30 minuti, con mezzi freschi di MgM (pH 5,6) (Tabella 1) senza ncAA. Nelle fasi di lavaggio, utilizzare 972 × g per 15 minuti a temperatura ambiente.
- Centrifugare i batteri, risospendere in 1x tampone PBS e incubare per 1 ora a 4 °C al buio per rimuovere gli ncAA in eccesso. Dopo 1 ora, centrifugare i batteri a 3.000 × g, 4 °C per 15 minuti e conservare per un ulteriore utilizzo.
- Per un esperimento di controllo, ripetere lo stesso esperimento esprimendo proteine portatrici di ncAA in assenza di ncAA.
- Marcatura in vitro con fluorescenza di proteine contenenti ncAA in Salmonella Typhimurium
- Risospendere le cellule di Salmonella che esprimono SseJ-F10TCO-HA in assenza o presenza di TCO*A (dalla fase 3.2) in 1x PBS. Regolare l'OD600 su 4 in PBS. Incubare le cellule con 20 μM di Janelia Fluor 646-tetrazina (JF646-Tz) o 20 μM di BDP-Fl-tetrazina (5 mM di soluzioni madre in DMSO) a 37 °C al buio e agitare per 1-2 ore a 250 giri/min.
- Pellettare le cellule, lavare 3-4 volte con PBS contenente il 5% di DMSO e lo 0,2% di Pluronic F-127, risospendere in PBS contenente il 5% di DMSO e incubare per una notte a 4 °C al buio. Lavare nuovamente 2 volte con 1x PBS. Nelle fasi di lavaggio, utilizzare 972 × g, per 15 minuti a temperatura ambiente.
- Immagina immediatamente le cellule usando un microscopio confocale o fissale con paraformaldeide (PFA) all'1,5% in PBS per 30-45 minuti a temperatura ambiente al buio.
- Lavare le celle fisse 2x con PBS e infine in 50 mM NH4Cl in PBS per 15 minuti per rimuovere l'eccesso di PFA. Risospendere le cellule in PBS e conservare a 4 °C per non più di 3-4 giorni. Immagini dei batteri utilizzando la microscopia confocale come descritto nel paragrafo 6.
4. Caratterizzazione biochimica di proteine contenenti ncAA
- Lisi cellulare
- Risospendere le cellule dalla sezione 3.1 nel tampone di lisi (Tabella 1) e incubare a temperatura ambiente per più di 30 minuti. Raffreddare la miscela sul ghiaccio per 15 minuti.
NOTA: mantenere il rapporto tra tampone di lisi e peso della cella utilizzato a 1:10. - Sonica le cellule risospese mentre sei ancora sul ghiaccio. Pulsare per 30 s all'impostazione 7 almeno 6x, con intervalli di 1 minuto, utilizzando un sonicatore (vedere la tabella dei materiali).
- Ruotare il lisato cellulare a 20.500 × g, 4 °C per 15 minuti (mantenere 4 °C è fondamentale). Trasferire il surnatante in un tubo fresco e scartare il pellet.
- Risospendere le cellule dalla sezione 3.1 nel tampone di lisi (Tabella 1) e incubare a temperatura ambiente per più di 30 minuti. Raffreddare la miscela sul ghiaccio per 15 minuti.
- Analisi SDS-PAGE
- Preparare il colorante di caricamento SDS 5x (Tabella 1). Aggiungere 5 μL di tampone di carico gel SDS a 13 μL di lisato cellulare. Denaturare le proteine con tampone campione di sodio dodecilsolfato (SDS) in una provetta da 2 mL a 95 °C per 10 minuti, centrifugare la miscela a 2.000 × g per 50 s e caricare su un gel di poliacrilammide SDS al 12%.
- Assemblare la cassetta di gel, posizionarla in un apparecchio di elettroforesi su gel e collegare l'apparecchio di elettroforesi a un alimentatore elettrico. Versare il tampone corrente, caricare i marcatori di peso molecolare e i campioni proteici e far scorrere il gel a 100 V, fino a quando il bromofenolo raggiunge il fondo del gel risolvente.
NOTA: Iniziare immediatamente l'analisi, poiché i lisati conservati a -20 °C tendono a perdere qualità dopo ogni ciclo di congelamento-scongelamento. - Colorare il gel con la colorazione proteica blu Coomassie.
5. Marcatura bio-ortogonale dell'effettore secreto di Salmonella SseJ-F10TCO-HA nelle cellule HeLa
- Coltivare e mantenere le cellule HeLa a 37 °C, 5% CO2 e 95% di umidità in un mezzo di aquila modificato (DMEM) ad alto contenuto di glucosio (4,5 g / L) di Dulbecco, integrato con FBS al 10% (v / v) in aggiunta a penicillina-streptomicina (1x).
- Batteri di coltura 1 giorno prima dell'infezione. Inoculare una singola colonia di Salmonella 14028 che ospita pEVOL-PylRS-AF e pWSK29-sseJ 10TAG in 5 mL di brodo LB standard contenente antibiotici per una notte a 37 °C, agitando a 250 giri/min.
- Cellule HeLa seme 1 giorno prima dell'infezione. Prendere un pallone di coltura tissutale (T-75) contenente cellule HeLa a ~ 80% di confluenza, come determinato dall'esame microscopico della densità cellulare. Lavare le celle con PBS caldo. Staccare le cellule con 3 ml di tripsina/EDTA caldo allo 0,25% per 5 minuti a 37 °C, 5% CO2.
- Spegnere la tripsina utilizzando 2 ml di DMEM (+ 10% FBS). Trasferire l'intero contenuto del matraccio in una provetta da 15 mL dopo aver risospeso le cellule. Ruotare le cellule a 1.000 × g per 5 minuti. Togliere il surnatante dal tubo. Risospendere il pellet di cellule HeLa in substrato di crescita preriscaldato.
- Utilizzare un emocitometro per esaminare la sospensione e contare le cellule presenti. Preparare uno stock di cellule diluito a 1 × 105 celle/ml. Seme 0,5 × 105 cellule HeLa per pozzetto in 500 μL di DMEM + 10% di terreno di crescita FBS in un vetrino a otto pozzetti. Tenere la slitta della camera in un'incubatrice a 37 °C, 5% CO2, 95% di umidità per 24 ore.
- Infezione batterica
- Sottocoltura Salmonella 14028s contenente pEVOL-PylRS-AF e pWSK29-sseJ 10TAG, diluendo 100 μL di coltura batterica notturna (dalla fase 5.2) in 3 mL di terreno LB (diluizione 1:30) contenente 35 μg/mL di cloramfenicolo e 100 μg/mL di ampicillina, seguita da incubazione a 37 °C con agitazione a 250 giri/min per 5-7 ore.
NOTA: Durante questa fase, le colture raggiungono la fase esponenziale tardiva e i batteri sono altamente invasivi. - Preparare una soluzione madre TCO*A da 100 mM e un mezzo completo (Tabella 1).
- Per iniziare l'infezione delle cellule HeLa, estrarre le cellule HeLa dall'incubatore e lavare le cellule con DPBS preriscaldato prima di aggiungere 500 μL di DMEM fresco (+10% FBS) a ciascun pozzetto. Posizionare il vetrino della camera nell'incubatore di CO2 fino all'inizio dell'infezione.
- Dopo 5-7 ore di incubazione, diluire la coltura di Salmonella a OD600 = 0,2 in 1 mL di terreno di crescita DMEM (~3 × 108 ufc/mL). Aggiungere le quantità necessarie di inoculo di Salmonella in ciascun pozzetto del vetrino della camera in modo che la molteplicità di infezione (MOI) sia 100.
- Incubare le cellule infette in un incubatore di CO2 per 30 minuti. Lavare le cellule 3 volte con DPBS preriscaldato per rimuovere la Salmonella extracellulare. Impostare questo punto temporale su 0 h dopo l'infezione. Aggiungere 500 μL di terreno completo (Tabella 1) contenente 100 μg/mL di gentamicina per 1 ora. Dopo 1 ora, lavare le celle 3 volte con DPBS. Aggiungere 500 μL del mezzo completo (dal punto 5.4.2; Tabella 1) integrato con 0,2% arabinosio, 10 μg/mL di gentamicina per ciascun pozzetto del vetrino della camera.
- In un esperimento di controllo, eseguire infezioni simili di cellule HeLa senza TCO * A.
- Incubare il vetrino da camera per 10 ore nell'incubatore CO2 .
- Sottocoltura Salmonella 14028s contenente pEVOL-PylRS-AF e pWSK29-sseJ 10TAG, diluendo 100 μL di coltura batterica notturna (dalla fase 5.2) in 3 mL di terreno LB (diluizione 1:30) contenente 35 μg/mL di cloramfenicolo e 100 μg/mL di ampicillina, seguita da incubazione a 37 °C con agitazione a 250 giri/min per 5-7 ore.
- Fare clic sull'etichettatura basata sulla chimica nelle celle vive
- Procedere all'etichettatura delle cellule infette da batteri. Preriscaldare il mezzo completo senza TCO*A (Tabella 1).
- Dopo 10 ore dall'infezione, sostituire il mezzo completo con un mezzo completo fresco senza TCO * A e lavare le celle HeLa 4 volte in un intervallo di 30 minuti ciascuna con DPBS preriscaldato, seguito da terreno completo fresco (senza TCO * A).
- Preparare una soluzione madre di colorante-tetrazina da 0,5 mM in DMSO.
NOTA: Per l'etichettatura degli effettori secreti da Salmonella nelle cellule ospiti, vengono presentati due protocolli. Per il protocollo 1, preparare la miscela di colorante diluendo il brodo JF646-Tz in 1x PBS contenente l'1% di caseina sodica di sale di latte bovino in modo che la soluzione di lavoro finale sia di 2 μM. Per il protocollo 2, preparare un mezzo completo caldo (senza FBS e TCO*A) e aggiungere 2 μM JF646-Tz. Rendi fresca questa miscela di coloranti per ogni sessione di etichettatura. Lavorare al buio, se possibile (abbassare le luci nella cappa e/o nella stanza). - Dopo 12 ore dopo l'infezione, aspirare il mezzo dalle cellule. Lavare la cella con DPBS preriscaldato 2x o 3x. In un gruppo di pozzetti, aggiungere 500 μL della miscela di soluzione colorante descritta nel protocollo 1 e, in un altro gruppo di pozzetti dello stesso vetrino della camera, aggiungere 500 μL della miscela di soluzione colorante descritta nel protocollo 2 menzionato al punto 5.5.3 e nella nota successiva. Posizionare nuovamente i vetrini della camera nell'incubatore di CO 2 per 1,5-2 ore.
- Dopo 13,5-14 ore dopo l'infezione, sciacquare le cellule HeLa 2x con DPBS preriscaldato. Aggiungere 500 μL di DMEM fresco (integrato con FBS). Posizionare il vetrino della camera nell'incubatore per 30 minuti. Lavare le celle con DPBS preriscaldato seguito da DMEM fresco 4x per un intervallo di 30 minuti.
- A 16 ore dopo l'infezione, fissare le cellule HeLa con PFA aggiungendo 200 μL di PFA al 4% in ciascun pozzetto e incubando per 10 minuti a temperatura ambiente al buio. Aspirare il PFA, sciacquare 3 volte con PBS e conservare le cellule in PBS a 4 °C al buio.
NOTA: PFA è una sostanza chimica altamente tossica. Evitare l'inalazione, così come il contatto con la pelle e gli occhi. Indossare dispositivi di protezione durante la manipolazione. Per evitare che il campione etichettato venga esposto alla luce, spegnere la luce nella cappa di coltura cellulare.
- Immunocolorazione di proteine marcate con HA
- Aspirare il PBS e risciacquare una volta in soluzione bloccante (Tabella 1).
- Incubare le cellule HeLa fisse con una soluzione di anticorpi primari a base di PBS (Tabella 1) per 1 ora a temperatura ambiente al buio. Utilizzare un anticorpo primario anti-HA di coniglio per colorare SseJ secreto (diluizione 1:500).
- Dopo 1 ora, lavare delicatamente le celle 2x con 0,5 ml di 0,1% Tween-20/1x PBS. Durante i lavaggi con soluzione Tween/PBS, incubare le cellule 3x con 0,5 mL di Tween20/1x PBS allo 0,1% per 5 minuti.
- Diluire l'anticorpo secondario dell'asino anti-coniglio 555 1:500 in soluzione anticorpale secondaria e incubare per 1 ora a temperatura ambiente al buio.
- Dopo 1 ora, lavare delicatamente le cellule 2x con 0,5 mL di 0,1% Tween-20/1x PBS e incubare 2x con 0,5 mL di 0,1% Tween20/1x PBS per 5 min.
- Lavare le celle 3 volte con 0,5 ml di 1x PBS e conservarle a 4 °C al buio.
NOTA: Le celle fisse possono essere conservate per un paio di settimane in PBS a 4 °C. L'immunocolorazione deve essere eseguita all'ultimo minuto.
6. Imaging confocale
- Utilizzare un microscopio confocale, come il disco rotante (SD) o il microscopio STED.
- Regolare le impostazioni di acquisizione delle immagini, ad esempio la modalità di scansione (XYZ), la velocità di scansione (400 Hz), la risoluzione (512 x 512), l'ingrandimento (100x) e lo stacking Z.
- Utilizzare i filtri di eccitazione/emissione corretti per DAPI, BDP-Tz e JF646 tetrazina.
NOTA: Per questo protocollo, l'imaging confocale è stato eseguito su un sistema di microscopio STED dotato di un laser a luce bianca pulsata, che consente la selezione dell'eccitazione nell'intervallo 470-670 nm e un laser a diodi UV da 405 nm per l'eccitazione a 405 nm, 488 nm e 647 nm. Gli intervalli di emissione appropriati sono stati impostati utilizzando il beam splitter acusto-ottico incorporato in combinazione con un rilevamento spettrale multibanda sintonizzabile basato su prismi del sistema confocale. - Acquisisci le immagini utilizzando un obiettivo di immersione in olio 100×/1.4.
7. Imaging a super-risoluzione (dSTORM)
- Accendere il microscopio 3 ore prima dell'imaging per consentire l'equilibrio termico (è più probabile che si verifichi una deriva se l'imaging inizia prima di questo). Raffreddare la fotocamera a -70 °C.
- Nel frattempo, preparare un nuovo tampone di imaging GLOX-BME (Tabella 1).
- Porta le cellule al microscopio. Posizionare la camera di imaging sul palco del microscopio nel supporto del campione. Nel supporto, assicurarsi che il campione sia piatto e sicuro. Cambiare il mezzo nel pozzetto con 0,4 mL del tampone di imaging GLOX-BME appena fatto.
- Impostare la linea laser e i set di filtri corretti. Diminuire la potenza del laser a ~ 1 mW per identificare una cella HeLa di interesse. Regolare il piano focale e l'angolo del fascio laser illuminando il campione con basse densità laser di 647 nm (in questo caso, si suggerisce un angolo fortemente inclinato [HILO], poiché HILO aumenta il segnale-sfondo [SBR]). Regolare l'angolo di illuminazione HILO.
NOTA: In questo protocollo, l'imaging a super-risoluzione di SseJ è stato acquisito nel canale Alexa Fluor 647 utilizzando un microscopio a epifluorescenza invertito (vedere la Tabella dei materiali), dotato di un obiettivo TIRF (obiettivo ad immersione in olio Apo TIRF 100x, NA 1.49). La fluorescenza è stata rilevata con una telecamera EMCCD, controllata tramite μManager. - Impostare il guadagno del preamplificatore su 3 e attivare il trasferimento del frame in μManager. Impostare EM-gain su 200 per una maggiore sensibilità nelle misurazioni dSTORM, come descritto in un precedente rapporto35.
- Prima dell'imaging dSTORM, acquisire un'immagine limitata dalla diffrazione di riferimento della struttura target. Passa i fluorofori allo stato scuro accendendo il laser alla sua massima potenza.
NOTA: Singole molecole lampeggianti di fluorofori JF646 sono state osservate quando i fluorofori JF646 sono stati trasformati in uno stato prevalentemente scuro mediante illuminazione continua della luce di eccitazione a 647 nm, come descritto in precedenza36. - Regolare la potenza del laser a un livello adeguato in cui gli eventi lampeggianti sono separati nello spazio e nel tempo, impostare il tempo di esposizione a 30 ms e iniziare l'acquisizione. Acquisisci 10.000-30.000 fotogrammi.
NOTA: è necessario apportare modifiche alla forza del laser per ottimizzare il lampeggio. Prendi in considerazione l'aumento dell'intensità del laser se vengono rilevati troppi eventi (particelle lampeggianti che si sovrappongono). La lunghezza ideale dipende dalla qualità del campione, ma ~ 10.000 fotogrammi dovrebbero mostrare caratteristiche distinguibili.
8. Ricostruzione dell'immagine di dSTORM
- Utilizzare un software appropriato per l'analisi delle immagini.
NOTA: ThunderSTORM, uno dei tanti programmi di ricostruzione di immagini open source disponibili, è brevemente descritto di seguito. - Aprire ImageJ e importare i dati non elaborati. Apri il plug-in ThunderSTORM e configura l'impostazione della fotocamera corrispondente al dispositivo.
- Vai a Esegui analisi e imposta le impostazioni appropriate, come il filtraggio delle immagini (differenza dei filtri medi), i metodi di localizzazione (massimo locale) e la localizzazione sub-pixel delle molecole (PSF gaussiana integrata). Fare clic su OK per avviare la ricostruzione dell'immagine.
NOTA: Se necessario, sono già state descritte istruzioni dettagliate per l'impostazione dei parametri in ThunderSTORM37.
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Representative Results
Questo documento protocollare descrive un metodo basato su GCE per l'etichettatura fluorescente sito-specifica e la visualizzazione degli effettori secreti da Salmonella , come illustrato nella Figura 1. La struttura chimica del gruppo bioortogonale (TCO) transciclooctene contenente ncAA e del colorante fluorescente sono mostrati nella Figura 1A. La marcatura di SseJ è stata ottenuta mediante incorporazione genetica di ncAA bioortogonali in un codone ambrato (vedi Figura 1B) utilizzando una coppia ortogonale amminoacil-tRNA sintetasi/tRNA tramite tecnologia GCE. Il trattamento degli effettori marcati con TCO con la tetrazina contenente un fluoroforo (JF646-Tz o BDP-Tz) ha fornito una strategia di etichettatura proteica alternativa che ha permesso l'osservazione degli effettori traslocati secreti da Salmonella molte ore dopo l'infezione dell'ospite (Figura 1B, C). Abbiamo iniziato identificando possibili residui di amminoacidi e selezionato la posizione 10 di SseJ per l'inclusione di ncAA in base all'accessibilità superficiale e alle conoscenze esistenti sui residui funzionali di SseJ. I dati strutturali precedenti e le proiezioni dell'esposizione superficiale possono aiutare nella selezione di posizioni specifiche.
Il posizionamento del codone ambrato all'interno del gene che codifica il POI influenza l'efficacia dell'incorporazione del TCO. Di conseguenza, una serie di mutanti con codoni ambrati in varie posizioni del gene del POI dovrebbe essere creata e analizzata per un'efficienza di integrazione ottimale. La selezione della posizione del codone ambrato è empirica. In generale, i residui alterati dovrebbero essere non essenziali per il funzionamento del PDI, privi di modifiche post-traduzionali e accessibili per le sonde fluorescenti. L'espressione plasmide dovrebbe essere un numero di copie basso in modo da imitare il numero di copia nativo del POI. Il contesto del codone influenza l'efficacia con cui un ncAA è incorporato da un sistema ortogonale tRNA/amminoacil-tRNA sintetasi. Mentre AAT-TAG-ACT è il contesto preferito del tRNA ortogonale, la posizione della fenilalanina-10 di sseJ è stata cambiata in TAG, garantendo il contesto AAT-TAG-ACT per consentire l'incorporazione più efficace del ncAA. In primo luogo, abbiamo testato se i mutanti erano funzionali in E. coli usando un plasmide ad alto numero di copie per esprimere sseJ. Come evidenziato da SDS-PAGE, l'espressione mutante di SseJ-F10TCO-HA dipendeva dalla presenza di TCO*A e dal corrispondente tRNA/aaRS ottimale (Figura 2A). SseJ-F10FCO-HA è stato etichettato con JF646-Tz utilizzando la chimica a scatto SPIEDAC in E. coli. La marcatura fluorescente selettiva di SseJ-F10TCO-HA in E. coli in vitro è stata confermata dall'analisi al microscopio a fluorescenza (Figura 2B). Utilizzando la GCE, il TCO*A è stato quindi incorporato specificamente in un codone ambrato in sseJ. I tentativi di identificare direttamente l'incorporazione genomica off-target di ncAA utilizzando il sistema tRNAPyl/PylRSAF non hanno prodotto alcuna prova della loro esistenza. Tuttavia, raccomandiamo di utilizzare fluorescenza in gel, Western blot, proteina di fusione fluorescente, etichettatura a fluorescenza in vitro e altri metodi per valutare l'efficienza, la specificità, il grado di incorporazione off-target e la tossicità del plasmide pEVOL, come documentato in articoli precedentemente riportati citati qui12,29.
Una volta stabilito che il TAG soppresso in sseJ era funzionale, abbiamo clonato sseJ-F10TCO-HA insieme al suo promotore nativo nel plasmide a basso numero di copie pWSK29, garantendo un motivo AAT-TAG-ACT per l'etichettatura e la visualizzazione fluorescente. La marcatura selettiva in vitro di SseJ-F10TCO-HA nelle cellule di Salmonella è stata confermata utilizzando la microscopia a fluorescenza (Figura 3). Abbiamo quindi infettato le cellule HeLa con il ceppo di Salmonella wild-type integrato con p sseJ-HA o psseJ 10TAG-HA, in assenza o presenza di TCO * A per determinare se ilSseJincorporato in TCO potesse essere traslocato in cellule ospiti. Le cellule HeLa infette sono state fissate con PFA e immunocolorate con anticorpi anti-HA 16 ore dopo l'infezione per evidenziare i SIF decorati da SseJ. Come mostrato in Figura 4C, SseJ-F10TCO-HA era ovviamente secreto, si formavano SIF SseJ-dipendenti e sembravano simili a quelli osservati nelle cellule infette wild-type (Figura 4A). Tuttavia, i SIF SseJ-dipendenti non sono stati osservati in assenza di TCO*A (Figura 4B). Queste osservazioni hanno dimostrato che l'espressione di sseJ-F10TCO-HA utilizzando GCE ha salvato SIF dipendenti da SseJ. Inoltre, i risultati hanno anche indicato che SseJ-F10TCO-HA era un fattore di virulenza completamente funzionale per la Salmonella.
Dopo aver confermato che il SseJ marcato con GCE era funzionale e secreto, abbiamo usato la reazione SPIEDAC per marcare SseJ-F10TCO-HA con JF646-Tz nelle cellule HeLa. Per fare ciò, abbiamo infettato le cellule HeLa con Salmonella wild-type integrata con p sseJ-F10TCO-HA, in presenza di TCO * A. Dopo l'etichettatura con JF646-Tz utilizzando due protocolli alternativi descritti nella sezione 5 del protocollo, le cellule sono state ampiamente lavate per rimuovere il colorante in eccesso, fissate con PFA e immunocolorate con un anticorpo anti-HA per visualizzare il SseJ-F10TCO-HA secreto. Il SseJ-F10TCO-HA secreto nel citoplasma delle cellule HeLa è stato marcato con JF646-Tz (Figura 5A, B, rosso) e chiaramente co-localizzato con il tag HA (verde). L'osservazione che le due etichette si sovrapponevano l'una con l'altra (una colorante fluorescente, l'altra marcata mediante immunocolorazione), sottolinea ulteriormente la specificità dell'etichettatura GCE.
Per garantire che il segnale di fluorescenza osservato in quelle cellule HeLa fosse specifico solo per l'effettore secreto SseJ, abbiamo infettato cellule con Salmonella wild-type (portatrice di psseJ-HA) in presenza di TCO * A e pEVOL-PylRS-AF. Un click dye è stato utilizzato per osservare se c'era un'etichettatura di sfondo nelle celle HeLa. SseJ è stato rilasciato nel citoplasma della cellula ospite, senza segnali fluorescenti intracellulari o non specifici (Figura 5C), dimostrando che il segnale di fluorescenza era specifico per SseJ. Dopo aver determinato che gli ncAA erano incorporati specificamente in un codone ambrato e che SseJ secreto poteva essere visualizzato nella cellula ospite tramite la reazione del clic, l'obiettivo successivo era quello di creare un'immagine a super-risoluzione di SseJ secreto nelle cellule HeLa (Figura 6). Nella Figura 6, dimostriamo la potenza della GCE e l'uso del colorante JF646 per generare immagini a super-risoluzione specifiche del sito dell'effettore secreto da Salmonella SseJ nelle cellule HeLa.
Figura 1: Schema per l'etichettatura fluorescente sito-specifica degli effettori SPI-2. (A) TCO*A e JF-646-tetrazina. (B) Lo schema illustra l'incorporazione di un ncAA in un effettore SPI-2. Nella cellula batterica vengono introdotti un plasmide contenente il gene per un POI effettore (viola) e una coppia tRNA (rosso)/amminoacilsintetasi (verde) soppressore ortogonale. Un codone nativo viene scambiato con un codone di stop ambrato (TAG, rosso) nella sequenza genica effettrice in una posizione permissiva. L'ncAA (cerchio rosso scuro) viene semplicemente introdotto nel mezzo di crescita. Viene quindi raccolto dalla cellula e raggiunge il citosol, dove è collegato al tRNA ortogonale dall'amminoacil-tRNAsintetasi (aaRS). Il tRNA ncAA-acilato con un anticodone CUA entra nel macchinario ribosomiale come risultato del codone ambrato complementare sull'mRNA effettore (viola), incorporando l'ncAA attaccato nell'effettore. L'ncAA è trasportato dalla catena polipeptidica a tutta lunghezza del sito effettore, che poi si piega e si assembla in una proteina effettrice funzionale. L'effettore appena prodotto viene traslocato nella cellula ospite attraverso il T3SS. Un fluoroforo fornito esternamente può essere utilizzato per marcare un effettore SPI-2 secreto integrato con ncAA. (C) Schema di reazione a scatto senza rame con un colorante fluorogenico tetrazina. Attraverso la reazione di clic SPIEDAC, un ncAA con un gruppo alchene teso incorporato in un POI (SseJ) reagisce con un colorante accoppiato a tetrazina (JF646-Tz). Il colorante fluorogenico accoppiato alla tetrazina JF646-Tz diventa fluorescente (rosso) solo dopo aver etichettato con successo. Abbreviazioni: TCO*A = trans-cyclooct-2-en-L-Lisina; ncAA = amminoacido non canonico; T3SS = sistema di secrezione di tipo tre; SPI-2 = Isola di patogenicità della Salmonella 2; POI = proteina di interesse; SPIEDAC = cicloaddizione di Diels-Alder a domanda inversa di elettroni promossa dalla deformazione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2:TCO*A è specificamente incorporato in SseJ-F10TCO-HA espresso in E. coli. (A) SDS-PAGE colorato con Coomassie conferma l'incorporazione selettiva di TCO*A in SseJ-F10TCO-HA (indicato da una freccia rossa) in E. coli. (B) Espressione di SseJ-F10TCO-HA in E. coli analizzato al microscopio a fluorescenza in assenza (in alto) o presenza (in basso) di 1 mM TCO*A. E. le cellule di coli che esprimono SseJ-F10TCO-HA in assenza o presenza di TCO*A sono incubate con BDP-Fl-tetrazina e visualizzate per la fluorescenza BDP (verde). La fluorescenza SseJ (verde) si osserva solo in presenza dell'etichetta TCO*A incorporata; Si noti l'assenza di fluorescenza di fondo nel pannello superiore. Barra della scala = 2 μm. Abbreviazioni: TCO*A = trans-cyclooct-2-en-L-Lisina; BF = campo luminoso; HA = acido ialuronico. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Il TCO*A è incorporato in modo sito-specifico in SseJ-F10TCO-HA espresso in Salmonella. La microscopia a fluorescenza viene utilizzata per esaminare l'espressione di SseJ-F10TCO-HA in Salmonella in assenza (in alto) o in presenza (in basso) di 1 mM TCO*A. Le Salmonelle che esprimono SseJ F10TCO-HA sono trattate con JF646-Tz e visualizzate per la fluorescenza JF646 (magenta), in presenza o assenza di TCO*A. La fluorescenza di SseJ (magenta) viene rilevata solo quando è presente TCO*A. Barra della scala = 2 μm. Abbreviazioni: TCO*A = trans-cyclooct-2-en-L-Lisina; BF = campo luminoso; HA = acido ialuronico. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Secreted SseJ-J10TCO-HA è funzionale. (A) Le cellule HeLa sono infettate da Salmonella che ospita psseJ-HA per 16 ore, fisse e immunocolorate con anticorpi anti-HA (rosso), LPS (verde) e DAPI (blu). Come previsto, la formazione di SIF SseJ-dipendenti è osservata nelle cellule infette. (B) In assenza di TCO*A, il codone ambrato non viene soppresso e i SIF SseJ-dipendenti sono assenti nelle cellule HeLa infette. Le cellule HeLa sono infettate da Salmonella che esprime SseJ-F10TCO-HA in assenza di TCO*A per 16 ore, fisse e immunocolorate con anticorpi anti-HA (rosso), LPS (verde) e DAPI (blu). (C) SIF SseJ-dipendenti sono osservati in presenza di TCO*A. Le cellule HeLa infette con Salmonella che esprimono SseJ-F10TCO-HA in presenza di 400 μM di TCO*A sono fissate e immunocolorate con anticorpi anti-HA SseJ (rosso), LPS (verde) e DAPI (blu). I SIF SseJ-dipendenti sono osservati nel pannello di sinistra, indicando chiaramente che SseJ è stato salvato dall'espressione di sseJ-F10TCO-HA usando GCE. Barra della scala = 10 μm. Abbreviazioni: HA = acido ialuronico; LPS = lipopolisaccaride; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo; TCO*A = trans-cicloott-2-en-L-lisina; SIF = filamenti indotti da Salmonella; GCE = espansione del codice genetico. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Specificità di etichettatura di SseJ con colorante JF646-Z. (A) Le cellule HeLa sono infette da Salmonella che esprime SseJ-F10TCO-HA in presenza di 400 μM TCO*A. TCO-marcato con TGO secreto SseJ-F10TCO-HA è marcato con 2 μM JF646-Tz in 1x PBS contenente l'1% di sale sodico di caseina da latte bovino, ampiamente lavato, fissato e immunocolorato con anticorpi anti-HA per visualizzare il SseJ secreto (verde). SseJ-F10TCO-HA è secreto ed etichettato con colorante JF646-Tz (rosso, pannello sinistro). SseJ etichettati tramite GCE (rosso) e HA (verde) sono chiaramente co-localizzati (pannello di destra). (B) Utilizzando un protocollo di etichettatura leggermente diverso, SseJ-F10TCO-HA secreto con TCO è anche etichettato con 2 μM JF646-Tz in DMEM completo (senza FBS), ampiamente lavato e fissato e sottoposto a colorazione anti-HA immunofluorescenza. Secreted SseJ-F10TCO-HA è etichettato con colorante JF646-Tz (rosso, pannello sinistro) e co-localizzato con HA (verde). (C) Per stabilire ulteriormente che il segnale di fluorescenza è unico per SseJ e non un prodotto di altre proteine rilasciate da SPI-2, le cellule HeLa sono infettate da Salmonella wild-type che trasporta psseJ-HA e pEVOL-PylRS-AF, in presenza di ncAA (TCO*A). A 16 ore dopo l'infezione, le cellule HeLa infette vengono trattate con 2 μM JF646-Tz in mezzo completo (senza FBS e TCO * A) e il colorante in eccesso viene completamente rimosso utilizzando un nuovo terreno di crescita. Le cellule HeLa sono fissate con PFA e accuratamente lavate con PBS prima di essere immunocolorate per SseJ (verde). La mancanza di segnale di fluorescenza di fondo visibile nel pannello di sinistra (JF646-Tz) indica che quasi nessuna marcatura fuori bersaglio si è verificata all'interno delle cellule ospiti. Barra della scala = 10 μm. Abbreviazioni: HA = acido ialuronico; PBS = soluzione salina tamponata fosfato; FBS = siero fetale bovino; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo; TCO*A = trans-cicloott-2-en-L-lisina; SIF = filamenti indotti da Salmonella; GCE = espansione del codice genetico; SPI-2 = Isola di patogenicità della Salmonella 2; BF = campo luminoso. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Imaging ad altissima risoluzione di SseJ marcato con GCE nelle cellule HeLa. Le cellule HeLa sono infettate da Salmonella che esprime SseJ-F10TCO-HA in presenza di 400 μM TCO*A. TCO-taggato secreto SseJ-F10TCO-HA è marcato con 2 μM JF646-Tz in condizioni fisiologiche come descritto nel protocollo, quindi ampiamente lavato. Le immagini vengono acquisite utilizzando Nikon N-STORM. (A) Immagine in campo chiaro di una cellula HeLa sotto osservazione. Barra di scala = 10 μm. (B) Immagine a largo campo limitata alla diffrazione di SseJ secreto marcato con TCO*A e JF-646. Barra della scala = 10 μm. (C) Immagine dSTORM corrispondente dei SIF decorati con SseJ. Barra di scala = 10 μm. C(i) L'inserto mostra una vista ingrandita di SseJ super-risolto nella regione riquadro. Barra della scala = 1 μm. Abbreviazioni: HA = acido ialuronico; TCO*A = trans-cicloott-2-en-L-lisina; SIF = filamenti indotti da Salmonella; GCE = espansione del codice genetico; WF = campo largo; BF = campo luminoso. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Tabella 1. Soluzioni. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa tabella.
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Discussion
L'approccio qui descritto è stato utilizzato per tracciare la posizione precisa delle proteine effettrici iniettate nella cellula ospite dal batterico T3SS dopo l'infezione. I T3SS sono impiegati da patogeni intracellulari come Salmonella, Shigella e Yersinia per trasportare componenti di virulenza nell'ospite. Lo sviluppo di tecnologie di imaging a super-risoluzione ha permesso di visualizzare fattori di virulenza con una risoluzione precedentemente inimmaginabile12,13,24. Tuttavia, alcuni vincoli di etichettatura hanno precluso indagini più approfondite, poiché le fusioni proteiche fotoattivabili bloccano il poro T3SS e non vengono secrete. Inoltre, gli artefatti di clustering e l'analisi errata possono derivare dalla propensione intrinseca di alcune proteine di fusione a raggrupparsi o aggregarsi.
In alcuni casi, la proteina di fusione è anche scissa, come abbiamo osservato in precedenza con PAmCherry-SsaP12,13. Tutti questi vincoli sono superati da GCE, che consente l'etichettatura fluorescente specifica del sito dei POI. Permette anche la visualizzazione di proteine che non sono abbondanti12,13. Mentre ci sono una serie di fattori che possono influenzare l'efficienza dell'incorporazione di ncAA utilizzando un sistema ortogonale tRNA / amminoacil-tRNA sintetasi, sembra che il contesto del codone sia il più cruciale. Il tRNA ortogonale incorpora un ncAA in modo più efficiente quando il contesto del codone preferito è AATTAGACT33. Nella Figura 5, possiamo confrontare l'etichettatura nitida risultante dalla GCE e un fluoroforo sito-specifico (così come l'assenza di sfondo) rispetto all'immunocolorazione di un tag HA.
Di conseguenza, i ricercatori saranno in grado di visualizzare i POI in agenti patogeni, batteri commensali e ospiti eucariotici utilizzando il metodo descritto qui. In breve, le ncAA geneticamente codificate forniscono un approccio alternativo all'etichettatura delle proteine effettrici quando i metodi convenzionali falliscono. Tuttavia, una delle principali limitazioni di questo metodo sono le proprietà chimiche intrinseche del fluoroforo, come la permeabilità, la distribuzione e la ritenzione della membrana, che possono influire sull'efficienza dell'etichettatura fluorescente. Gli ncAA fluorescenti sono un'opzione alternativa per evitare reazioni di clic12, tuttavia questi possono essere visualizzati solo utilizzando la microscopia a due fotoni. Si rimanda i lettori ad un elenco di coloranti permeabili/impermeabili alla membrana cellulare citati qui 12,38,39,40,41.
In conclusione, abbiamo etichettato e visualizzato specificamente l'effettore secreto da Salmonella SseJ codificando geneticamente ncAA in combinazione con un fluoroforo fluorogenico senza compromettere la sua funzione biologica. L'etichettatura di SseJ con JF646-Tz è stata altamente specifica e l'imaging a super-risoluzione può essere ulteriormente impiegato per visualizzare gli effettori secreti all'interno delle cellule ospiti. Pertanto, la marcatura fluorescente degli effettori batterici utilizzando coloranti compatibili con dSTORM e l'espansione del codice genetico hanno permesso la localizzazione spaziale subcellulare degli effettori secreti batterici nelle cellule ospiti, ad una risoluzione inferiore al limite di diffrazione. Poiché questa piattaforma di etichettatura è compatibile con il tracciamento di singole particelle di imaging di cellule vive, il nostro metodo consentirà di analizzare le proteine effettrici del sistema T3SS con livelli senza precedenti di risoluzione temporale e spaziale, che miglioreranno la nostra comprensione molecolare della patogenesi batterica.
Mentre ci sono alcune limitazioni, come la scarsa efficienza di incorporazione di ncAA e i vincoli fotofisici del fluoroforo organico, abbiamo dimostrato che questo approccio può aiutare i ricercatori a osservare e localizzare un effettore secreto all'interno delle cellule ospiti, anche quando è scarso12,13. Prevediamo che l'adattamento della tecnologia aprirà nuove ed entusiasmanti opportunità per l'imaging e la ricerca su altre proteine effettrici prodotte dai batteri durante l'infezione. Il metodo è anche facilmente adattabile per l'etichettatura dei virus, dimostrando la sua ampia utilità.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da fondi di start-up della University of Texas Medical branch, Galveston, TX, e un premio Texas STAR a L.J.K. Ringraziamo il Prof. Edward Lemke (European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg, Germania) per il plasmide pEVOL-PylRS-AF. Le immagini nella Figura 1 sono state create utilizzando BioRender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Tris/Glycine SDS running buffer | BIO-RAD | 1610732 | |
| Ammonium chloride | Fischer Scientific | A661-500 | |
| Ammonium sulphate | Fischer Scientific | BP212R-1 | |
| Ampicillin Sodium | Sigma-Aldrich | A0166 | 5 g |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermiFischer Scientific | 15240096 | |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | 500 g |
| Avanti J-26XP (High-Performance Centrifuge) | Beckman Coulter | ||
| Bacto-Agar | BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA | 214010 | |
| BDP-FL-tetrazine | Lumiprobe (USA) | 2.14E+02 | |
| β-mercaptoethanol | Millipore | 444203 | 250 mL |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B8026 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A4503 | 500 g |
| Casein | Sigma-Aldrich | C8654 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| Click Amino Acid / trans-Cyclooct-2-en – L - Lysine (TCO*A) | SiChem GmbH | SC-8008 | Size: 500 mg |
| DAPI (Hoechst33342) | Invitrogen | H3570 | |
| DeNovix DS-11+ Spectrophotometer | DeNovix | ||
| DMEM* | Corning | 10-013-CV | * Used for maintaining HeLa Cell |
| DMEM** | Gibco | 11965-092 | **Used for bacterial infection in presence of ncAA, see section 5.4. |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | 250 g |
| Donkey anti-rabbit Alexa fluoro555 secondary antibody | Invitrogen | A-31572 | |
| DPBS, 1x | Corning | 21-031-CV | |
| E. coli strain BL21 (DE3) | Novagen (Madison, WI) | ||
| EMCCD Camera | Andor | iXon Ultra 897-BV | |
| Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 mL (PCR clean) | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30123.328 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fischer | 10082147 | |
| Fisherbrand Syringe Filters - Sterile (PVDF 0.22 µm) | Fischer Scientific | 97203 | Pack of 100 |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | BIO-RAD | 1652660 | |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G1272 | 10 mL |
| Gibco L-Glutamine (200 mM), 100x | Fischer Scientific | 25-030-081 | |
| Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G7141-50KU | |
| Glycerol | Fischer Scientific | BF229-4 | |
| HeLa cells | ATTC | CCL-2 | |
| HEPES Buffer | Corning | 25-060-C1 | 100 mL |
| Hydrocloric acid | Fischer Scientific | A144-212 | |
| ImageJ | Image processing and analysis: http://rsbweb.nih.gov/ij | ||
| IntantBlue | Expedeon | ISB1L | Coomassie-based stain |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma-Aldrich | I5502 | |
| Janelia Fluoro 646-tetrazine | Tocris Bioscience | 7279 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | 60615 | 5 g |
| LB Broth | BD Difco | 244620 | 500 g |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| μManager (v. 1.4.2) | https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release | ||
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | 250 g |
| Micro pulser cuvette | BIO-RAD | 165-2086 | 0.2 cm electrode gap, pkg. of 50 |
| Nikon N-STORM | Nikon Instruments Inc. | https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/super-resolution-microscopes/n-storm-super-resolution | |
| Nunc EasYFlask Cell Culture Flasks | ThermiFischer Scientific | 156499 | |
| Omnipur Casamino Acid | Calbiochem | 2240 | 500 g |
| Paraformaldehhyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| PBS (10x) | Roche | 11666789001 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution (100x) | GenDEPOT | CA005-010 | 100 mL |
| pEVOL-PylRS-AF | For plasmid construction and map see following references 1. Angew Chem Int Ed Engl. 2011, 50(17), 3878-81. 2. Angew Chem Int Ed Engl., 2012, 51, 4166-70. |
||
| Plasmid Mini-prep Kit | Qiagen | 27106 | |
| plasmid pWSK29-sseJ10TAG-HA | Ref.: elife. 2021, 10, e67789. | ||
| plasmid pWSK29-sseJ-HA | Ref.: elife. 2021, 10, e67789. Vector map of PWSK29: https://www.addgene.org/172972/ | ||
| Pluronic F-127 | Millipore | 540025 | Protein grade, 10% Solution |
| Potassium phosphate monobasic | Fischer Scientific | P285-500 | |
| Potassium sulphate | Acros Organic | 424220250 | |
| Protease Inhibitor Cocktail Set I - Calbiochem | Sigma-Aldrich | 539131 | 100x Solution |
| Rabbit anti-HA primary antibody | Sigma-Aldrich | H6908 | |
| S. enterica. serovar Typhimurium 14028s | Ref.: PLoS Biol. 2015, 13, e1002116. | ||
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036-50G-F | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Sodium hydroxide | Fischer Scientific | SS255-1 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM), 100x | Corning | 25-060-C1 | 100 mL |
| Sonic Dismembrator Model 100 | Fischer Scientific | 24932 | |
| STED microsocpe (Leica TCS SP8 STED 3X system) | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/ | |
| ThunderSTORM | https://zitmen.github.io/thunderstorm/ | ||
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Trypsin-EDTA (1x), 0.25% | GenDEPOT | CA014-010 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | 100 mL |
| X-well tissue culture chamber slides | SARSTEDT | 94.6190.802 |
References
- Marlovits, T. C., et al. Structural insights into the assembly of the type III secretion needle complex. Science. 306 (5698), 1040-1042 (2004).
- Kubori, T., et al. Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretion system. Science. 280 (5363), 602-605 (1998).
- LaRock, D. L., Chaudhary, A., Miller, S. I. Salmonellae interactions with host processes. Nature Reviews Microbiology. 13 (4), 191-205 (2015).
- Galan, J. E., Waksman, G.
- Feng, X., Oropeza, R., Kenney, L. J. Dual regulation by phospho-OmpR of ssrA/B gene expression in Salmonella pathogenicity island 2. Molecular Microbiology. 48 (4), 1131-1143 (2003).
- Walthers, D., et al. Salmonella enterica response regulator SsrB relieves H-NS silencing by displacing H-NS bound in polymerization mode and directly activates transcription. Journal of Biological Chemistry. 286 (3), 1895-1902 (2011).
- Chakraborty, S., Mizusaki, H., Kenney, L. J. A FRET-based DNA biosensor tracks OmpR-dependent acidification of Salmonella during macrophage infection. PLoS Biology. 13 (4), e1002116 (2015).
- Liew, A. T. F., et al. Single cell, super-resolution imaging reveals an acid pH-dependent conformational switch in SsrB regulates SPI-2. eLife. 8, e45311 (2019).
- Knuff, K., Finlay, B. B. What the SIF is happening-the role of intracellular Salmonella-induced filaments. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 335 (2017).
- Drecktrah, D., et al. Dynamic behavior of Salmonella-induced membrane tubules in epithelial cells. Traffic. 9 (12), 2117-2129 (2008).
- Garcia del-Portillo, F., Zwick, M. B., Leung, K. Y., Finlay, B. B. Salmonella induces the formation of filamentous structures containing lysosomal membrane glycoproteins in epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (22), 10544-10548 (1993).
- Singh, M. K., Zangoui, P., Yamanaka, Y., Kenney, L. J. Genetic code expansion enables visualization of Salmonella type three secretion system components and secreted effectors. elife. 10, e67789 (2021).
- Singh, M. K., Kenney, L. J. Super-resolution imaging of bacterial pathogens and visualization of their secreted effectors. FEMS Microbiology Reviews. 45 (2), fuaa050 (2020).
- Akeda, Y., Galan, J. E. Chaperone release and unfolding of substrates in type III secretion. Nature. 437 (7060), 911-915 (2005).
- Su, W. W. Fluorescent proteins as tools to aid protein production. Microbial Cell Factories. 4 (1), 12 (2005).
- Wang, S., Moffitt, J. R., Dempsey, G. T., Xie, X. S., Zhuang, X. Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8452-8457 (2014).
- Ghodke, H., Caldas, V. E. A., Punter, C. M., van Oijen, A. M., Robinson, A. Single-molecule specific mislocalization of red fluorescent proteins in live Escherichia coli. Biophysical Journal. 111 (1), 25-27 (2016).
- Gahlmann, A., Moerner, W. E. Exploring bacterial cell biology with single-molecule tracking and super-resolution imaging. Nature Reviews Microbiology. 12 (1), 9-22 (2014).
- Keppler, A., et al. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).
- Gautier, A., et al. An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells. Chemical Biology. 15 (2), 128-136 (2008).
- Young, A. M., Minson, M., McQuate, S. E., Palmer, A. E. Optimized fluorescence complementation platform for visualizing Salmonella effector proteins reveals distinctly different intracellular niches in different cell types. ACS Infectious Diseases. 3 (8), 575-584 (2017).
- Martin, B. R., Giepmans, B. N., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Mammalian cell-based optimization of the biarsenical-binding tetracysteine motif for improved fluorescence and affinity. Nature Biotechnology. 23 (10), 1308-1314 (2005).
- Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications. Journal of the American Chemical Society. 124 (21), 6063-6076 (2002).
- Gao, Y., Spahn, C., Heilemann, M., Kenney, L. J. The pearling transition provides evidence of force-driven endosomal tubulation during Salmonella infection. mBio. 9 (3), e01083-e01018 (2018).
- Brumell, J. H., Goosney, D. L., Finlay, B. B. SifA, a type III secreted effector of Salmonella typhimurium, directs Salmonella-induced filament (Sif) formation along microtubules. Traffic. 3 (6), 407-415 (2002).
- Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
- Davis, L., Chin, J. W. Designer proteins: applications of genetic code expansion in cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 168-182 (2012).
- Chin, J. W., et al. Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).
- Kipper, K., et al. Application of noncanonical amino acids for protein labeling in a genomically recoded Escherichia coli. ACS Synthetic Biology. 6 (2), 233-255 (2017).
- Uttamapinant, C., et al. Genetic code expansion enables live-cell and super-resolution imaging of site-specifically labeled cellular proteins. Journal of American Chemical Society. 137 (14), 4602-4605 (2015).
- Plass, T., et al. Amino acids for Diels-Alder reactions in living cells. Angewandte Chemie International Edition. 51 (17), 4166-4170 (2012).
- Lang, K., et al. Genetic encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions. Journal of the American Chemical Society. 134 (25), 10317-10320 (2012).
- Xu, H., et al. Re-exploration of the codon context effect on amber codon-guided incorporation of noncanonical amino acids in Escherichia coli by the blue-white screening assay. ChemBioChem. 17 (13), 1250-1256 (2016).
- Nakamura, Y., Gojobori, T., Ikemura, T. Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000. Nucleic Acids Research. 28 (1), 292 (2000).
- Spahn, C., et al. Sequential super-resolution imaging of bacterial regulatory proteins: the nucleoid and the cell membrane in single, fixed E. coli cells. Methods in Molecular Biology. 1624, 269-289 (2017).
- Grimm, J., English, B., Chen, J., et al. A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy. Nature Methods. 12 (3), 244-250 (2015).
- Xu, J., Ma, H., Liu, Y. Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM). Current Protocols in Cytometry. 81 (1), 12-46 (2017).
- Meineke, B., Heimgärtner, J., Eirich, J., Landreh, M., Elsässer, S. J. Site-specific incorporation of two ncAAs for two-color bioorthogonal labeling and crosslinking of proteins on live mammalian cells. Cell Reports. 31 (12), 107811 (2020).
- Bessa-Neto, D., et al. Bioorthogonal labeling of transmembrane proteins with non-canonical amino acids unveils masked epitopes in live neurons. Nature Communications. 12 (1), 6715 (2021).
- Beliu, G., et al. Bioorthogonal labeling with tetrazine-dyes for super-resolution microscopy. Communication Biology. 2, 261 (2019).
- Arsić, A., Hagemann, C., Stajković, N., Schubert, T., Nikić-Spiegel, I. Minimal genetically encoded tags for fluorescent protein labeling in living neurons. Nature Communications. 13 (1), 314 (2022).
