Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Superopløsningsbilleddannelse af bakterielle udskillede proteiner ved hjælp af genetisk kodeudvidelse

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/64382
Automatic Translation
1, 1
1Biochemistry & Molecular Biology, University of Texas Medical Branch

Summary

Denne artikel giver en ligetil og klar protokol til mærkning af salmonellaudskillede effektorer ved hjælp af genetisk kodeudvidelse (GCE) stedspecifikt og billede af subcellulær lokalisering af udskillede proteiner i HeLa-celler ved hjælp af direkte stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (dSTORM)

Abstract

Type tre sekretionssystemer (T3SS'er) gør det muligt for gramnegative bakterier at injicere et batteri af effektorproteiner direkte i cytosolen i eukaryote værtsceller. Ved indgangen modulerer de injicerede effektorproteiner kooperativt eukaryote signalveje og omprogrammerer cellulære funktioner, hvilket muliggør bakteriel indgang og overlevelse. Overvågning og lokalisering af disse udskillede effektorproteiner i forbindelse med infektioner giver et fodaftryk til at definere den dynamiske grænseflade mellem værtspatogeninteraktioner. Imidlertid er mærkning og billeddannelse af bakterielle proteiner i værtsceller uden at forstyrre deres struktur / funktion teknisk udfordrende.

Konstruktion af fluorescerende fusionsproteiner løser ikke dette problem, fordi fusionsproteinerne sidder fast i sekretorisk apparat og dermed ikke udskilles. For at overvinde disse forhindringer anvendte vi for nylig en metode til stedspecifik fluorescerende mærkning af bakterielle udskillede effektorer samt andre proteiner, der er vanskelige at mærke, ved hjælp af genetisk kodeudvidelse (GCE). Dette papir giver en komplet trin-for-trin protokol til mærkning af salmonellaudskillede effektorer ved hjælp af GCE stedspecifikt, efterfulgt af anvisninger til billeddannelse af subcellulær lokalisering af udskillede proteiner i HeLa-celler ved hjælp af direkte stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (dSTORM)

Nylige resultater tyder på, at inkorporering af ikke-kanoniske aminosyrer (ncAA'er) via GCE, efterfulgt af bio-ortogonal mærkning med tetrazinholdige farvestoffer, er en levedygtig teknik til selektiv mærkning og visualisering af bakterielle udskillede proteiner og efterfølgende billedanalyse i værten. Målet med denne artikel er at give en ligetil og klar protokol, der kan anvendes af efterforskere, der er interesserede i at udføre superopløsningsbilleddannelse ved hjælp af GCE til at studere forskellige biologiske processer i bakterier og vira samt værtspatogeninteraktioner.

Introduction

Bakterielle infektioner har længe været betragtet som en alvorlig fare for menneskers sundhed. Patogener bruger højt udviklede, ekstremt kraftfulde og indviklede forsvarssystemer samt en række bakterielle virulensfaktorer (kaldet effektorproteiner) for at undgå værtsimmunresponser og etablere infektioner 1,2. Imidlertid er de molekylære mekanismer, der ligger til grund for disse systemer, og rollen som individuelle effektorproteiner stadig stort set ukendte på grund af manglen på egnede tilgange til direkte at følge de afgørende proteinkomponenter og effektorer i værtsceller under patogenese.

Et typisk eksempel er Salmonella enterica serovar Typhimurium, som forårsager akut gastroenteritis. Salmonella Typhimurium bruger type tre sekretionssystemer (T3SS) til at injicere en række effektorproteiner direkte i værtsceller. Så snart salmonella kommer ind i værtscellen, befinder den sig i et surt membranbundet rum, kaldet den salmonellaholdige vakuol (SCV)3,4. SCV's sure pH aktiverer Salmonella patogenicitetsø 2 (SPI-2)-kodet T3SS og translokerer en volley af 20 eller flere effektorproteiner over den vakuolære membran ind i værtscytosolen 5,6,7,8. Inde i værten manipulerer disse komplekse cocktails af effektorproteiner værtscellesignalveje koordineret, hvilket resulterer i dannelsen af meget dynamiske, komplekse rørformede membranstrukturer udvidet fra SCV langs mikrotubuli, kaldet Salmonella-inducerede filamenter (SIF'er), der gør det muligt for Salmonella at overleve og replikere i værtscellerne9,10,11.

Metoder til at visualisere, spore og overvåge bakterielle effektorlokaliseringer og undersøge deres handel og interaktioner inde i værtsceller giver kritisk indsigt i de mekanismer, der understøtter bakteriel patogenese. Mærkning og lokalisering af salmonellaudskillede T3SS-effektorproteiner inde i værtsceller har vist sig at være en teknologisk udfordring12,13; Ikke desto mindre har udviklingen af genetisk kodede fluorescerende proteiner ændret vores evne til at studere og visualisere proteiner i levende systemer. Imidlertid er størrelsen af fluorescerende proteiner (~ 25-30 kDa)15 ofte sammenlignelig med eller endda større end størrelsen af det pågældende protein (POI; f.eks. 13,65 kDa for SsaP, 37,4 kDa for SifA). Faktisk blokerer fluorescerende proteinmærkning af effektorer ofte udskillelsen af den mærkede effektor og syltetøj T3SS14.

Desuden er fluorescerende proteiner mindre stabile og udsender et lavt antal fotoner før fotoblegning, hvilket begrænser deres anvendelse i superopløsningsmikroskopiske teknikker16,17,18, især i fotoaktiveringslokaliseringsmikroskopi (PALM), STORM og stimuleret emissionsudtømning (STED) mikroskopi. Mens de fotofysiske egenskaber ved organiske fluorescerende farvestoffer er bedre end fluorescerende proteiner, kræver metoder / teknikker som CLIP / SNAP19,20, Split-GFP 21, ReAsH / FlAsH 22,23 og HA-Tags 24,25 et yderligere protein- eller peptidvedhæng, der kan forringe strukturfunktionen af effektorproteinet af interesse ved at forstyrre posttranslationel modifikation eller handel. En alternativ metode, der minimerer nødvendig proteinmodifikation, involverer inkorporering af ncAA'er i et POI under oversættelse gennem GCE. NCA'erne er enten fluorescerende eller kan gøres fluorescerende via klikkemi 12,13,26,27,28.

Ved hjælp af GCE kan ncAA'er med små, funktionelle, bioortogonale grupper (såsom et azid-, cyclopropen- eller cyclooctyne-gruppe) introduceres næsten ethvert sted i et målprotein. I denne strategi byttes et naturligt codon ud med et sjældent kodon, såsom et gult (TAG) stopcodon på en bestemt position i POI'ets gen. Det modificerede protein udtrykkes efterfølgende i celler sammen med et ortogonalt aminoacyl-tRNA-syntetase/tRNA-par. Det tRNA-syntetaseaktive sted er designet til kun at modtage en bestemt ncAA, som derefter er kovalent bundet til 3'-enden af tRNA'et, der genkender det gule kodon. ncAA indføres simpelthen i vækstmediet, men det skal optages af cellen og nå cytosolen, hvor aminoacyl-tRNA-syntetasen (aaRS) kan forbinde den med det ortogonale tRNA; Det inkorporeres derefter i IP'et på det angivne sted (se figur 1)12. GCE muliggør således stedspecifik inkorporering af en overflod af bio-ortogonale reaktive grupper såsom keton, azid, alkyn, cyclooctyn, transcycloocten, tetrazin, norbonen, α, β-umættet amid og bicyclo [6.1.0]-nonyne i et POI, hvilket potentielt overvinder begrænsningerne ved konventionelle proteinmærkningsmetoder 12,26,27,28.

De seneste nye tendenser inden for billeddannelsesteknikker med superopløsning har åbnet nye veje til at undersøge biologiske strukturer på molekylært niveau. Især STORM, en lokaliseringsbaseret superopløsningsteknik med et enkelt molekyle, er blevet et uvurderligt værktøj til at visualisere cellulære strukturer ned til ~ 20-30 nm og er i stand til at undersøge biologiske processer et molekyle ad gangen og derved opdage rollerne af intracellulære molekyler, der endnu er ukendte i traditionelle ensemble-gennemsnitlige undersøgelser13 . Enkeltmolekyle- og superopløsningsteknikker kræver et lille mærke med lyse, fototable organiske fluoroforer for den bedste opløsning. Vi demonstrerede for nylig, at GCE kan bruges til at inkorporere egnede sonder til superopløsningsbilleddannelse12.

To af de bedste valg til proteinmærkning i celler er bicyclo [6.1.0] nonynelysin (BCN) og transcycloocten-lysin (TCO; vist i figur 1), som kan genetisk kodes ved hjælp af en variant af tRNA / syntetaseparret (her kaldet tRNA Pyl / PylRS AF), hvorPyl repræsenterer pyrrolysin, ogAF repræsenterer en rationelt designet dobbeltmutant (Y306A, Y384F) afledt af Methanosarcina-labyrint, der naturligt koder for pyrrolysin12, 29,30,31. Gennem den stamme-fremmet inverse elektron-efterspørgsel Diels-Alder cycloaddition (SPIEDAC) reaktion, reagerer disse aminosyrer kemoselektivt med tetrazin konjugater (figur 1)12,30,31. Sådanne cycloadditionsreaktioner er usædvanligt hurtige og kompatible med levende celler; De kan også være fluorogene, hvis en passende fluorofor er funktionaliseret med tetrazindelen12,26,32. Dette papir præsenterer en optimeret protokol til overvågning af dynamikken i bakterielle effektorer leveret til værtsceller ved hjælp af GCE, efterfulgt af subcellulær lokalisering af udskillede proteiner i HeLa-celler ved hjælp af dSTORM. Resultaterne indikerer, at inkorporering af en ncAA via GCE, efterfulgt af en klikreaktion med fluorogene tetrazinbærende farvestoffer, repræsenterer en alsidig metode til selektiv mærkning, visualisering af udskillede proteiner og efterfølgende subcellulær lokalisering i værten. Alle de komponenter og procedurer, der er beskrevet her, kan dog justeres eller erstattes, så GCE-systemet kan tilpasses til at undersøge andre biologiske spørgsmål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Plasmid konstruktion

  1. Klon genet, der udtrykker POI'et, til et ekspressionsplasmid (f.eks. pET28a-sseJ 10TAG), der udtrykker POI i E. coli BL21 (DE3). Dette trin gør det lettere at bestemme, at mutanterne er funktionelle.
  2. Til visualisering af salmonellaudskillede effektorer i værtsceller konstrueres et ekspressionsplasmid (pWSK29-sseJ-HA), der udtrykker mål-POI SseJ under kontrol af dets oprindelige promotor, som beskrevet i tidligere rapporter 7,12,24. Ved hjælp af stedrettet mutagenese erstattes kodonet af phenylalanin-10 med et ravfarvet codon (TAG) i SseJ (pWSK29-sseJ 10TAG-HA), hvilket sikrer AAT-TAG-ACT-motivet 33,34.
  3. Ud over de ovennævnte plasmider skal du til genetisk inkorporering af transcyclooct-2-en-L-lysin (TCO*A) i et POI bruge et andet ekspressionsplasmid (pEVOL-PylRS-AF)31 , der indeholder de udviklede tRNA/syntetasepar (tRNAPyl/PylRSAF ) gener kodet i plasmidet pEVOL.
    BEMÆRK: Detaljerede beskrivelser af plasmidet og kloningsprotokollerne er beskrevet i den foregående rapport30,31.
  4. Brug kommercielt tilgængelige plasmidpræparationssæt til at opnå plasmid-DNA af høj kvalitet. For renset DNA er det optimale forhold på 260/280 ~ 1,8. Kontroller DNA-renheden ved hjælp af 1% agarosegelelektroforese, hvis det er nødvendigt.

2. Bakteriel kultur forberedelse

  1. Opnåelse af dobbelttransformanter for at teste, at mutanten er funktionel i E. coli
    1. Tag BL21 kompetente celler ud af -80 °C og tø op på is i ca. 20-30 minutter.
    2. Bland 1–5 μL af hvert plasmid (~50 ng pEVOL-PylRS-AF og pET28a-sseJ 10TAG) med 200 μL kemisk kompetente BL21-celler i et 1,5 ml mikrocentrifugeglas. Bland de kompetente celler og plasmidblandingen forsigtigt; Inkuber i 30 min på is.
    3. Mikrocentrifugerøret varmechokkes i et 42 °C vandbad i 45 sekunder. Sæt rørene tilbage på is i 2 min.
    4. Tilsæt 1 ml varmt LB-medium til mikrocentrifugerøret og overfør hurtigt blandingen til et 15 ml konisk rør. Cellerne inkuberes ved 37 °C i en ryster ved 250 o/min i 1 time. Plade en del eller alle de transformerede celler på LB-agarplader, der indeholder passende antibiotika. Pladerne inkuberes natten over ved 37 °C.
      BEMÆRK: I denne protokol blev 35 μg/ml chloramphenicol og 50 μg/ml kanamycin anvendt til valg af henholdsvis pEVOL-PylRS-AF og pET28a-sseJ 10TAG. I transformationstrinnet skal du evaluere den vellykkede transformation ved hjælp af negative og positive kontroller.
  2. Overfør mutanten til Salmonella til visualisering af Salmonella-udskillede effektorer i værtsceller:
    1. Der tilsættes 2–3 μL hver af pEVOL-PylRS-AF og pWSK29-sseJ 10TAG til 40–60 μL elektrokompetent Salmonella Typhimurium stamme 14028 i et kølet mikrocentrifugerør. Bland blandingen forsigtigt med en pipette.
    2. Overfør elektroporationsblandingen til en kølet (0,2 cm elektrodegab) kuvette; Indstil elektroporationsindstillingerne til 2,5 kV, 200 Ω, 25 μF. Placer kuvetten inde i elektroporationskammeret. Sørg for, at kammerelektroden kommer i sikker kontakt med mikropulserkuvetten.
    3. Tryk på pulsknappen , og hold den nede, indtil den bipper.
    4. Tilsæt straks 1 ml varmt LB-medium i kuvetten. Overfør hele indholdet til et 15 ml konisk rør. Cellerne inkuberes ved 37 °C under omrystning ved 250 o/min i 1 time.
    5. En del af eller hele elektroporationsblandingen af salmonella anbringes på en LB-agarplade, der indeholder passende antibiotika. Pladerne inkuberes natten over ved 37 °C.
      BEMÆRK: I denne protokol blev 35μg/ml chloramphenicol og 100 μg/ml ampicillin anvendt til udvælgelse af henholdsvis pEVOL-PylRS-AFog pWSK29-sseJ 10TAG.
  3. Kultur forberedelse
    1. Pod en enkelt koloni af Salmonella eller E. coli i 5 ml LB-medium indeholdende passende antibiotika. Voks natten over ved 37 °C, ryst ved 250 o / min.

3. Ekspression og fluorescerende mærkning af ncAA-bærende proteiner

  1. Ekspression af ncAA-bærende proteiner i E. coli
    1. Der overføres 100 μl primærkultur til 5 ml LB-substrat (1:50 fortynding) indeholdende 35 μg/ml chloramphenicol og 50 μg/ml kanamycin, efterfulgt af inkubation ved 37 °C med omrystning ved 250 rpm, indtil OD600 når 0,4-0,6.
    2. Forbered 1 mM TCO*A stamopløsning (10 ml; Tabel 1).
    3. Når kulturerne når OD600 = 0,4-0,6, erstattes LB-mediet med frisk LB indeholdende 1 mM TCO*A, 35 μg/ml chloramphenicol og 50 μg/ml kanamycin.
      BEMÆRK: Alternativt kan TCO*A-stamopløsning fremstilles som beskrevet i trin 5.4.2.
    4. Inducer proteinekspression i nærvær af 1 mM IPTG, 0,2% arabinose og ryst natten over ved 34 °C, 250 rpm. Høst bakteriecellerne ved centrifugering i 5 min ved 11.000 × g. Supernatanten fjernes og pellets fryses ved -20 °C, indtil den anvendes igen.
    5. For et kontroleksperiment gentages det samme eksperiment, men de ncAA-bærende proteiner udtrykkes i fravær af ncAA. For in vitro fluorescerende mærkning af ncAA-bærende proteiner i E. coli, følg den detaljerede procedure beskrevet i trin 3.3.
  2. Ekspression af ncAA-bærende proteiner i salmonella
    1. Der overføres 100 μl primærkultur til 5 ml LB-substrat (1:50 fortynding) indeholdende 35 μg/ml chloramphenicol og 100 μg/ml ampicillin, efterfulgt af inkubation ved 37 °C med omrystning ved 250 rpm, indtil OD600 når 0,6.
    2. Der fremstilles modificeret N-minimalt substrat (MgM, pH 5,6) som beskrevet i tabel 1.
    3. LB-substratet erstattes med modificeret N-minimalt medium (MgM) suppleret med 1 mM TCO*A (tabel 1). Dyrk bakterierne ved 34 °C i 30 min. Derefter tilsættes 0,2% arabinose, 25 mg / ml chloramphenicol og 100 mg / ml ampicillin, og dyrk cellerne i yderligere 6 timer, ryst ved 250 o / min.
    4. Efter 6 timer vaskes bakterierne 4x over et interval på 30 minutter med friske MgM-medier (pH 5,6) (tabel 1) uden ncAA. I vasketrinnene skal du bruge 972 × g i 15 minutter ved stuetemperatur.
    5. Centrifuger bakterierne, resuspender i 1x PBS-buffer og inkuber i 1 time ved 4 °C i mørke for at fjerne overskydende ncAA'er. Efter 1 time centrifugeres bakterierne ved 3.000 × g, 4 °C i 15 minutter og opbevares til videre brug.
    6. For et kontroleksperiment gentages det samme eksperiment ved at udtrykke ncAA-bærende proteiner i fravær af ncAA.
  3. In vitro fluorescens mærkning af ncAA-bærende proteiner i Salmonella Typhimurium
    1. Salmonellaceller, der udtrykker SseJ-F10TCO-HA, resuspenderes ved fravær eller tilstedeværelse af TCO*A (fra trin 3.2) i 1x PBS. Juster OD600 til 4 i PBS. Cellerne inkuberes med 20 μM Janeliafluor 646-tetrazin (JF646-Tz) eller 20 μM BDP-Fl-tetrazin (5 mM stamopløsninger i DMSO) ved 37 °C i mørke og rystes i 1-2 timer ved 250 omdr./min.
    2. Pillecellerne, vask 3-4x med PBS indeholdende 5% DMSO og 0,2% Pluronic F-127, resuspender i PBS indeholdende 5% DMSO, og inkuber natten over ved 4 °C i mørke. Vask 2x igen med 1x PBS. I vasketrinnene skal du bruge 972 × g i 15 minutter ved stuetemperatur.
    3. Tag straks billeder af cellerne ved hjælp af et konfokalmikroskop eller fastgør dem med 1,5% paraformaldehyd (PFA) i PBS i 30-45 minutter ved stuetemperatur i mørke.
    4. De fikserede celler vaskes 2x med PBS og til sidst i 50 mM NH4Cl i PBS i 15 min for at fjerne overskydende PFA. Resuspender cellerne i PBS og opbevar dem ved 4 °C i højst 3-4 dage. Afbild bakterierne ved hjælp af konfokal mikroskopi som beskrevet i punkt 6.

4. Biokemisk karakterisering af ncAA-bærende proteiner

  1. Cellelyse
    1. Cellerne resuspenderes fra pkt. 3.1 i lysisbuffer (tabel 1) og inkuberes ved stuetemperatur i mere end 30 min. Afkøl blandingen på is i 15 min.
      BEMÆRK: Hold forholdet mellem lysisbuffer og cellevægt brugt til 1:10.
    2. Sonikere de resuspenderede celler, mens de stadig er på is. Puls i 30 s ved indstilling 7 mindst 6x, med 1 min mellemrum, ved hjælp af en sonikator (se materialetabellen).
    3. Drej cellelysatet ned ved 20.500 × g, 4 °C i 15 minutter (opretholdelse af 4 °C er kritisk). Supernatanten overføres til et frisk rør, og pelletsen kasseres.
  2. SDS-PAGE analyse
    1. Forbered 5x SDS-påfyldningsfarvestof (tabel 1). Tilsæt 5 μL SDS-gelbelastningsbuffer til 13 μL cellelysat. Proteinerne denatureres med natriumdodecylsulfatprøvebuffer (SDS) i et 2 ml rør ved 95 °C i 10 minutter, blandingen centrifugeres ved 2.000 × g i 50 s, og fyldes på en 12% SDS-polyacrylamidgel.
    2. Saml gelkassetten, læg den i et gelelektroforeseapparat, og tilslut elektroforeseapparatet til en elektrisk strømforsyning. Hæld løbebufferen, ilæg molekylvægtsmarkørerne og proteinprøverne, og kør gelen ved 100 V, indtil bromphenolen når bunden af opløsningsgelen.
      BEMÆRK: Start analysen med det samme, da lysater, der opbevares ved -20 °C, har tendens til at miste kvalitet efter hver fryse-optøningscyklus.
    3. Plet gelen med Coomassie blå proteinplet.

5. Bio-ortogonal mærkning af Salmonella-udskilt effektor SseJ-F10TCO-HA i HeLa-celler

  1. Dyrk og vedligehold HeLa-celler ved 37 ° C, 5% CO2 og 95% fugtighed i et højt glukose (4,5 g / L) Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM), suppleret med 10% (v / v) FBS ud over Penicillin-Streptomycin (1x).
  2. Kulturbakterier 1 dag før infektion. Pod en enkelt koloni af Salmonella 14028'er, der huser pEVOL-PylRS-AF og pWSK29-sseJ 10TAG, i 5 ml antibiotikaholdig standard LB-bouillon natten over ved 37 ° C, omrystning ved 250 o / min.
  3. Frø HeLa-celler 1 dag før infektion. Tag en vævskulturkolbe (T-75) indeholdende HeLa-celler ved ~ 80% sammenløb, bestemt ved mikroskopisk undersøgelse af celletætheden. Vask cellerne med varm PBS. Fjern cellerne med 3 ml varm 0,25% trypsin / EDTA i 5 minutter ved 37 ° C, 5% CO2.
    1. Sluk trypsinet ved hjælp af 2 ml DMEM (+ 10% FBS). Hele kolbens indhold overføres til et 15 ml rør efter resuspendering af cellerne. Drej cellerne ned ved 1.000 × g i 5 min. Supernatanten tages ud af tuben. Resuspender HeLa-cellepelleten i forvarmet vækstmedium.
    2. Brug et hæmocytometer til at undersøge suspensionen og tælle de tilstedeværende celler. Der fremstilles en fortyndet cellestamme ved 1 × 105 celler/ml. Frø 0,5 × 105 HeLa-celler pr. brønd i 500 μL DMEM + 10% FBS-vækstmedium i et kammerglas med otte brønde. Hold kammeret glide i en inkubator ved 37 ° C, 5% CO2, 95% fugtighed i 24 timer.
  4. Bakteriel infektion
    1. Subkultur Salmonella 14028s med pEVOL-PylRS-AF og pWSK29-sseJ 10TAG ved fortynding af 100 μL bakteriekultur natten over (fra trin 5.2) til 3 ml LB-medium (1:30 fortynding) indeholdende 35 μg/ml chloramphenicol og 100 μg/ml ampicillin, efterfulgt af inkubation ved 37 °C med omrystning ved 250 rpm i 5-7 timer.
      BEMÆRK: I denne fase når kulturerne den sene eksponentielle fase, og bakterierne er meget invasive.
    2. Forbered 100 mM TCO*A stamopløsning og komplette medier (tabel 1).
    3. For at starte HeLa-celleinfektionen skal du tage HeLa-cellerne ud af inkubatoren og vaske cellerne med forvarmet DPBS, før du tilføjer 500 μL frisk DMEM (+10% FBS) til hver brønd. Placer kammeret glide tilbage i CO2 -inkubatoren, indtil infektionen begynder.
    4. Efter 5-7 timers inkubation fortyndes salmonellakulturen til OD600 = 0,2 i 1 ml DMEM-vækstmedium (~ 3 × 108 cfu / ml). Tilsæt de nødvendige mængder af salmonellainokulum i hvert hul i kammerglasset, så infektionsmultipliciteten (MOI) er 100.
    5. Inkuber de inficerede celler i en CO2 inkubator i 30 min. Vask cellerne 3x med forvarmet DPBS for at fjerne ekstracellulær salmonella. Indstil dette tidspunkt til 0 timer efter infektion. Der tilsættes 500 μL komplet substrat (tabel 1) indeholdende 100 μg/ml gentamicin i 1 time. Efter 1 time vaskes cellerne 3x med DPBS. Der tilsættes 500 μL af hele substratet (fra trin 5.4.2; Tabel 1) suppleret med 0,2% arabinose, 10 μg/ml gentamicin til hver brønd i kammerglasset.
    6. I et kontroleksperiment udføres lignende infektioner af HeLa-celler uden TCO*A.
    7. Inkuber kammerobjektglasset i 10 timer i CO2 -inkubatoren.
  5. Klik på kemibaseret mærkning i levende celler
    1. Fortsæt med at mærke de bakterieinficerede celler. Forvarm hele mediet uden TCO*A (tabel 1).
    2. Efter 10 timer efter infektion udskiftes det komplette medium med friskt komplet medium uden TCO*A og vaskes HeLa-cellerne 4x over et interval på 30 minutter hver med forvarmet DPBS efterfulgt af frisk komplet medium (uden TCO*A).
    3. Forbered en 0,5 mM farvestof-tetrazinstamopløsning i DMSO.
      BEMÆRK: Til mærkning af salmonellaudskillede effektorer i værtsceller præsenteres to protokoller. For protokol 1 fremstilles farvestofblandingen ved fortynding af JF646-Tz-stammen i 1x PBS indeholdende 1 % kaseinnatriumsalt fra komælk, således at den endelige arbejdsopløsning er 2 μM. Til protokol 2 fremstilles et varmt, komplet medium (uden FBS og TCO*A), og der tilsættes 2 μM JF646-Tz. Gør denne farvestofblanding frisk til hver mærkningssession. Arbejd i mørke, hvis det er muligt (dæmp lyset i emhætten og/eller rummet).
    4. Efter 12 timer efter infektion aspireres mediet fra cellerne. Vask cellen med forvarmet DPBS 2x eller 3x. I en gruppe brønde tilsættes 500 μL af den farveopløsningsblanding, der er beskrevet i protokol 1, og i en anden gruppe brønde med samme kammerobjektglas tilsættes 500 μL af den farvestofopløsningsblanding, der er beskrevet i protokol 2, og som er nævnt i trin 5.5.3 og bemærkningen efter. Placer kammeret glider tilbage i CO 2 -inkubatoren i 1,5-2 timer.
    5. Efter 13,5-14 timer efter infektion skylles HeLa-cellerne 2x med forvarmet DPBS. Tilsæt 500 μL frisk DMEM (suppleret med FBS). Placer kammerglideren tilbage i inkubatoren i 30 min. Vask cellerne med forvarmet DPBS efterfulgt af frisk DMEM 4x over et interval på 30 min.
    6. 16 timer efter infektion fikseres HeLa-cellerne med PFA ved at tilsætte 200 μL 4% PFA i hver brønd og inkubere i 10 minutter ved stuetemperatur i mørke. Opsug PFA'en, skyl 3x med PBS, og opbevar cellerne i PBS ved 4 °C i mørke.
      BEMÆRK: PFA er et meget giftigt kemikalie. Undgå indånding samt hud- og øjenkontakt. Brug beskyttelsesudstyr ved håndtering. For at undgå, at den mærkede prøve udsættes for lys, skal du slukke for lyset i cellekulturhætten.
  6. Immunfarvning af HA-mærkede proteiner
    1. Opsug PBS og skyl én gang i blokerende opløsning (tabel 1).
    2. Inkuber de faste HeLa-celler med en PBS-baseret primær antistofopløsning (tabel 1) i 1 time ved stuetemperatur i mørke. Brug et kaninanti-HA primært antistof til at plette udskilt SseJ (1:500 fortynding).
    3. Efter 1 time vaskes cellerne forsigtigt 2x med 0,5 ml 0,1% Tween-20/1x PBS. Under vaskningen med Tween/PBS-opløsningen inkuberes cellerne 3x med 0,5 ml 0,1% Tween20/1x PBS i 5 min.
    4. Fortynd sekundært antistof æsel anti-kanin 555 1:500 i sekundær antistofopløsning og inkuber i 1 time ved stuetemperatur i mørke.
    5. Efter 1 time vaskes cellerne forsigtigt 2x med 0,5 ml 0,1% Tween-20/1x PBS og inkuberes 2x med 0,5 ml 0,1% Tween20/1x PBS i 5 min.
    6. Cellerne vaskes 3x med 0,5 ml 1x PBS og opbevares ved 4 °C i mørke.
      BEMÆRK: Faste celler kan opbevares i et par uger i PBS ved 4 °C. Immunfarvning skal udføres i sidste øjeblik.

6. Konfokal billeddannelse

  1. Brug et konfokalmikroskop, såsom spindeskive (SD) eller STED-mikroskop.
    1. Juster indstillingerne for billedoptagelse, f.eks. scanningstilstand (XYZ), scanningshastighed (400 Hz), opløsning (512 x 512), forstørrelse (100x) og Z-stabling.
    2. Brug de korrekte excitations-/emissionsfiltre til DAPI, BDP-Tz og JF646 tetrazin.
      BEMÆRK: For denne protokol blev konfokal billeddannelse udført på et STED-mikroskopsystem udstyret med en pulserende hvid lyslaser, hvilket tillod valg af excitation i området 470-670 nm og en UV 405 nm diodelaser til excitation ved 405 nm, 488 nm og 647 nm. De passende emissionsområder blev oprettet ved hjælp af den indbyggede akusto-optiske strålesplitter i kombination med en prismebaseret justerbar multibåndspektraldetektion af det konfokale system.
    3. Hent billederne ved hjælp af et 100×/1,4 olienedsænkningsmål.

7. Billeddannelse i superopløsning (dSTORM)

  1. Tænd mikroskopet 3 timer før billeddannelse for at tillade termisk ligevægt (drift er mere tilbøjelig til at forekomme, hvis billeddannelse begynder før dette). Afkøl kameraet til -70 °C.
  2. I mellemtiden skal du forberede frisk GLOX-BME-billedbuffer (tabel 1).
  3. Bring cellerne til mikroskopet. Billeddannelseskammeret anbringes på mikroskopstadiet i prøveholderen. Sørg for, at prøven er flad og sikker i holderen. Skift mediet i brønden med 0,4 ml af den frisklavede GLOX-BME-billedbuffer.
  4. Indstil de korrekte laserlinje- og filtersæt. Sænk lasereffekten til ~ 1 mW for at identificere en HeLa-celle af interesse. Juster brændplanet og laserstrålevinklen, mens prøven belyses med lave 647 nm lasertætheder (i dette tilfælde foreslås en stejlt skrånende vinkel [HILO], da HILO hæver signal-til-baggrund [SBR]). Juster HILO-belysningsvinklen.
    BEMÆRK: I denne protokol blev superopløsningsbilleddannelse af SseJ erhvervet i Alexa Fluor 647-kanalen ved hjælp af et inverteret epifluorescensmikroskop (se materialetabellen), udstyret med et TIRF-mål (100x Apo TIRF olienedsænkningsmål, NA 1.49). Fluorescens blev detekteret med et EMCCD-kamera, som blev styret gennem μManager.
  5. Indstil forforstærkerforstærkningen til 3 , og aktiver rammeoverførslen i μManager. Indstil EM-forstærkning til 200 for højere følsomhed i dSTORM-målinger, som beskrevet i en tidligere rapport35.
  6. Før dSTORM-billeddannelse skal du tage et referencediffraktionsbegrænset billede af målstrukturen. Skift fluoroforerne til mørk tilstand ved at tænde laseren til sin maksimale effekt.
    BEMÆRK: Individuelle, hurtigt blinkende molekyler af JF646 fluoroforer blev observeret, når JF646 fluoroforer blev transformeret til en overvejende mørk tilstand ved kontinuerlig belysning af 647 nm excitationslys, som beskrevet tidligere36.
  7. Juster laserstyrken til et passende niveau, hvor blinkende hændelser adskilles i rum og tid, indstil eksponeringstiden til 30 ms, og start optagelsen. Anskaf 10.000-30.000 rammer.
    BEMÆRK: Ændringer i laserstyrken skal foretages for at optimere blinkning. Overvej at øge laserintensiteten, hvis der registreres for mange hændelser (blinkende partikler, der overlapper hinanden). Den ideelle længde afhænger af prøvens kvalitet, men ~ 10.000 rammer skal vise mærkbare træk.

8. Billede rekonstruktion af dSTORM

  1. Brug passende software til billedanalyse.
    BEMÆRK: ThunderSTORM, et af mange open source-billedrekonstruktionsprogrammer, der er tilgængelige, beskrives kort nedenfor.
  2. Åbn ImageJ, og importer rådataene. Åbn ThunderSTORM-pluginet, og konfigurer kameraindstillingen, der svarer til enheden.
  3. Gå til Kør analyse , og indstil de relevante indstillinger, såsom billedfiltrering (forskel på gennemsnitsfiltre), lokaliseringsmetoder (lokalt maksimum) og subpixellokalisering af molekyler (integreret Gaussisk PSF). Klik på OK for at starte billedrekonstruktion.
    BEMÆRK: Om nødvendigt er detaljerede instruktioner til opsætning af parametrene i ThunderSTORM allerede beskrevet37.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dette protokolpapir beskriver en GCE-baseret metode til stedspecifik fluorescerende mærkning og visualisering af salmonellaudskillede effektorer, som vist i figur 1. Den kemiske struktur af den ncAA-bærende transcyclooctenbioortogonale gruppe (TCO) og det fluorescerende farvestof er vist i figur 1A. SseJ-mærkning blev opnået ved genetisk inkorporering af bioortogonale ncAA'er ved et gult stopkodon (se figur 1B) ved hjælp af et ortogonalt aminoacyl-tRNA-syntetase/tRNA-par via GCE-teknologi. Behandling af TCO-mærkede effektorer med tetrazinen indeholdende en fluorofor (JF646-Tz eller BDP-Tz) tilvejebragte en alternativ proteinmærkningsstrategi, der muliggjorde observation af translokerede salmonellaudskillede effektorer mange timer efter infektion af værten (figur 1B, C). Vi begyndte med at identificere mulige aminosyrerester og valgte position 10 i SseJ til ncAA-inklusion baseret på overfladetilgængelighed og eksisterende viden om SseJ-funktionelle rester. Tidligere strukturelle data og fremskrivninger af overfladeeksponering kan hjælpe med udvælgelsen af specifikke placeringer.

Placeringen af det gule codon i genet, der koder for POI, påvirker effektiviteten af TCO-inkorporering. Som følge heraf bør en række mutanter med gule kodoner i forskellige positioner af POI-genet oprettes og analyseres for optimal integrationseffektivitet. Udvælgelsen af den gule kodonposition er empirisk. Generelt bør de ændrede restkoncentrationer være ikke-væsentlige for POI-funktionen, uden posttranslationelle modifikationer og tilgængelige for fluorescerende sonder. Ekspressionsplasmidet skal være et lavt kopinummer, så det efterligner IP'ets oprindelige kopinummer. Kodonkonteksten påvirker, hvor effektivt en ncAA inkorporeres af et ortogonalt tRNA/aminoacyl-tRNA-syntetasesystem. Mens AAT-TAG-ACT er den foretrukne kontekst for det ortogonale tRNA, blev positionen af phenylalanin-10 af sseJ ændret til TAG, hvilket sikrer AAT-TAG-ACT-konteksten for at muliggøre den mest effektive inkorporering af ncAA. Først testede vi, om mutanterne var funktionelle i E. coli ved hjælp af et plasmid med højt kopinummer til at udtrykke sseJ. Som det fremgår af SDS-PAGE, var SseJ-F10TCO-HA-mutantekspression afhængig af tilstedeværelsen af TCO*A og den tilsvarende optimale tRNA/aaRS (figur 2A). SseJ-F10FCO-HA blev mærket med JF646-Tz ved hjælp af SPIEDAC klikkemi i E. coli. Den selektive fluorescerende mærkning af SseJ-F10TCO-HA i E. coli in vitro blev bekræftet ved fluorescensmikroskopianalyse (figur 2B). Ved hjælp af GCE blev TCO*A således stedspecifikt inkorporeret i et ravfarvet codon i sseJ. Forsøg på direkte at identificere genomisk inkorporering uden for målet af ncAA'er ved hjælp af tRNAPyl/PylRS AF-system gav ingen beviser for deres eksistens. Vi anbefaler dog at bruge in-gel fluorescens, Western blot, fluorescerende fusionsprotein, in vitro fluorescens mærkning og andre metoder til at vurdere effektiviteten, specificiteten, graden af inkorporering uden for målet og toksiciteten af pEVOL plasmid, som dokumenteret i tidligere rapporterede papirer citeret heri12,29.

Da vi havde konstateret, at den undertrykte TAG i sseJ var funktionel, klonede vi sseJ-F10TCO-HA sammen med dens oprindelige promotor ind i plasmidet pWSK29 med lavt kopinummer, hvilket sikrede et AAT-TAG-ACT-motiv til fluorescerende mærkning og visualisering. In vitro selektiv mærkning af SseJ-F10TCO-HA i salmonellaceller blev bekræftet ved hjælp af fluorescensmikroskopi (figur 3). Vi inficerede derefter HeLa-celler med vildtypen Salmonella-stammen suppleret med p sseJ-HA eller p sseJ 10TAG-HA i fravær eller tilstedeværelse af TCO*A for at afgøre, om den TCO-inkorporeredeSseJ kunne translokeres til værtsceller. Inficerede HeLa-celler blev fikseret med PFA og immunfarvet med anti-HA-antistof 16 timer efter infektion for at fremhæve SIF'erne dekoreret af SseJ. Som vist i figur 4C blev SseJ-F10TCO-HA tydeligvis udskilt, SseJ-afhængige SIF'er blev dannet, og de lignede dem, der blev observeret i vildtypeinficerede celler (figur 4A). SseJ-afhængige SIF'er blev imidlertid ikke observeret i fravær af TCO*A (figur 4B). Disse observationer viste, at ekspressionen af sseJ-F10TCO-HA ved hjælp af GCE reddede SseJ-afhængige SIF'er. Derudover viste resultaterne også, at SseJ-F10TCO-HA var en fuldt funktionel virulensfaktor for salmonella.

Efter at have bekræftet, at den GCE-mærkede SseJ var funktionel og udskilt, brugte vi SPIEDAC-reaktionen til at mærke SseJ-F10TCO-HA med JF646-Tz i HeLa-celler. For at gøre dette inficerede vi HeLa-celler med vildtype Salmonella suppleret med p sseJ-F10TCO-HA i nærværelse af TCO*A. Efter mærkning med JF646-Tz ved hjælp af to alternative protokoller beskrevet i protokolafsnit 5 blev cellerne vasket grundigt for at fjerne overskydende farvestof, fikseret med PFA og immunfarvet med et anti-HA-antistof for at visualisere det udskillede SseJ-F10TCO-HA. SseJ-F10TCO-HA, der blev udskilt i cytoplasmaet i HeLa-celler, blev mærket med JF646-Tz (figur 5A, B, rød) og tydeligt co-lokaliseret med HA-mærket (grøn). Observationen om, at de to etiketter overlappede hinanden (den ene et fluorescerende farvestof, den anden mærket ved immunfarvning), understreger yderligere specificiteten af GCE-mærkning.

For at sikre, at fluorescenssignalet, der blev observeret i disse HeLa-celler, kun var specifikt for den udskillede effektor SseJ, inficerede vi celler med vildtype Salmonella (bærer psseJ-HA) i nærvær af TCO*A og pEVOL-PylRS-AF. Et klikfarvestof blev brugt til at observere, om der var nogen baggrundsmærkning i HeLa-cellerne. SseJ blev frigivet i værtscellens cytoplasma uden intracellulære eller ikke-specifikke fluorescerende signaler (figur 5C), hvilket viste, at fluorescenssignalet var specifikt for SseJ. Efter at have fastslået, at ncAA'er blev inkorporeret specifikt ved et ravkodon, og at udskilt SseJ kunne visualiseres i værtscellen via klikreaktionen, var det næste mål at skabe et superopløsningsbillede af udskilt SseJ i HeLa-celler (figur 6). I figur 6 demonstrerer vi kraften i GCE og brugen af JF646-farvestoffet til at generere stedspecifikke superopløsningsbilleder af den salmonellaudskillede effektor SseJ i HeLa-celler.

Figure 1
Figur 1: Skema til stedspecifik fluorescerende mærkning af SPI-2-effektorer. A) TCO*A og JF-646-tetrazin. (B) Skemaet viser inkorporeringen af en ncAA i en SPI-2-effektor. I bakteriecellen introduceres et plasmid indeholdende genet for en effektor POI (lilla) og et ortogonalt suppressor tRNA (rødt) / aminoacylsyntetase (grønt) par. Et naturligt codon byttes med et gult (TAG, rødt) stopkodon i effektorgensekvensen på et tilladeligt sted. NCAA (mørkerød cirkel) indføres simpelthen i vækstmediet. Det opfanges derefter af cellen og når cytosolen, hvor det er bundet til det ortogonale tRNA af aminoacyl-tRNAsyntetasen (aaRS). Det ncAA-acylerede tRNA med et CUA-anticodon kommer ind i det ribosomale maskineri som et resultat af det komplementære ravkodon på effektorens mRNA (lilla), der inkorporerer det vedhæftede ncAA i effektoren. ncAA bæres af polypeptidkæden i fuld længde på effektorstedet, som derefter foldes og samles til et funktionelt effektorprotein. Den nyproducerede effektor translokeres ind i værtscellen gennem T3SS. En eksternt leveret fluorofor kan bruges til at mærke en udskilt SPI-2-effektor integreret med ncAA. (C) Kobberfrit klikreaktionsskema med et fluorogent tetrazinfarvestof. Gennem SPIEDAC-klikreaktionen reagerer en ncAA med en anstrengt alkengruppe inkorporeret i en POI (SseJ) med et tetrazinkoblet farvestof (JF646-Tz). Det fluorogene, tetrazinkoblede farvestof JF646-Tz bliver fluorescerende (rødt) først efter vellykket mærkning. Forkortelser: TCO*A = trans-cyclooct-2-en-L-lysin; ncAA = ikke-kanonisk aminosyre; T3SS = type tre sekretionssystem; SPI-2 = Salmonella patogenicitet ø 2; POI = protein af interesse; SPIEDAC = stammefremmet invers elektron-efterspørgsel Diels-Alder cycloaddition. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2:TCO*A er stedspecifikt inkorporeret i SseJ-F10TCO-HA udtrykt i E. coli. (A) Coomassie-farvet SDS-PAGE bekræfter den selektive inkorporering af TCO*A i SseJ-F10TCO-HA (angivet med rød pil) in E. coli. (B) Ekspression af SseJ-F10TCO-HA i E. coli analyseret ved fluorescensmikroskopi i fravær (øverst) eller tilstedeværelse (nederst) af 1 mM TCO*A. E. coliceller , der udtrykker SseJ-F10TCO-HA i fravær eller tilstedeværelse af TCO*A, inkuberes med BDP-Fl-tetrazin og afbildes for BDP-fluorescens (grøn). SseJ-fluorescens (grøn) observeres kun i nærværelse af det inkorporerede TCO*A-mærke; Bemærk fraværet af baggrundsfluorescens i toppanelet. Skalabjælke = 2 μm. Forkortelser: TCO*A = trans-cyclooct-2-en-L-lysin; BF = brightfield; HA = hyaluronsyre. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: TCO*A er stedspecifikt indarbejdet i SseJ-F10TCO-HA udtrykt i salmonella. Fluorescensmikroskopi anvendes til at undersøge ekspressionen af SseJ-F10TCO-HA i salmonella ved fravær (øverst) eller tilstedeværelse (nederst) af 1 mM TCO*A. Salmonella , der udtrykker SseJ F10TCO-HA, behandles med JF646-Tz og afbildes for JF646-fluorescens (magenta) i nærvær eller fravær af TCO*A. Fluorescens af SseJ (magenta) detekteres kun, når TCO*A er til stede. Skalabjælke = 2 μm. Forkortelser: TCO*A = trans-cyclooct-2-en-L-lysin; BF = brightfield; HA = hyaluronsyre. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Udskilt SseJ-J10TCO-HA er funktionel. (A) HeLa-celler er inficeret med salmonella, der indeholder psseJ-HA i 16 timer, fast og immunfarvet med anti-HA-antistof (rød), LPS (grøn) og DAPI (blå). Som forventet observeres dannelsen af SseJ-afhængige SIF'er i inficerede celler. (B) I fravær af TCO*A undertrykkes det gule codon ikke, og SseJ-afhængige SIF'er er fraværende i inficerede HeLa-celler. HeLa-celler er inficeret med salmonella, der udtrykker SseJ-F10TCO-HA i fravær af TCO*A i 16 timer, fikseret og immunfarvet med anti-HA-antistof (rød), LPS (grøn) og DAPI (blå). (C) SseJ-afhængige SIF'er observeres ved tilstedeværelse af TCO*A. Inficerede HeLa-celler med salmonella, der udtrykker SseJ-F10TCO-HA i nærværelse af 400 μM TCO*A, fikseres og immunfarves med anti-HA-antistof SseJ (rød), LPS (grøn) og DAPI (blå). SseJ-afhængige SIF'er observeres i venstre panel, hvilket tydeligt indikerer, at SseJ blev reddet af udtrykket sseJ-F10TCO-HA ved hjælp af GCE. Skalabjælke = 10 μm. Forkortelser: HA = hyaluronsyre; LPS = lipopolysaccharid; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol; TCO*A = trans-cyclooct-2-en-L-lysin; SIF'er = salmonella-inducerede filamenter; GCE = genetisk kodeudvidelse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Mærkningsspecificitet af SseJ med JF646-Tz farvestof. (A) HeLa-celler er inficeret med salmonella, der udtrykker SseJ-F10TCO-HA i nærværelse af 400 μM TCO*A. TCO-mærket udskilt SseJ-F10TCO-HA er mærket med 2 μM JF646-Tz i 1x PBS indeholdende 1% kaseinnatriumsalt fra komælk, grundigt vasket, fikseret og immunfarvet med anti-HA-antistof for at visualisere den udskillede SseJ (grøn). SseJ-F10TCO-HA udskilles og mærkes med JF646-Tz farvestof (rødt, venstre panel). SseJ mærket via GCE (rød) og HA (grøn) er tydeligt co-lokaliseret (højre panel). (B) Ved hjælp af en lidt anden mærkningsprotokol mærkes TCO-mærket udskilt SseJ-F10TCO-HA også med 2 μM JF646-Tz i komplet medium DMEM (uden FBS), vaskes grundigt og fastgøres og udsættes for anti-HA-immunofluorescensfarvning. Udskilt SseJ-F10TCO-HA er mærket med JF646-Tz farvestof (rødt, venstre panel) og co-lokaliseret med HA (grøn). (C) For yderligere at fastslå, at fluorescenssignalet er unikt for SseJ og ikke et produkt af andre SPI-2-frigivne proteiner, inficeres HeLa-celler med vildtypesalmonella med psseJ-HA og pEVOL-PylRS-AF, under tilstedeværelse af ncAA (TCO*A). 16 timer efter infektion behandles inficerede HeLa-celler med 2 μM JF646-Tz i komplet medium (uden FBS og TCO*A), og det overskydende farvestof fjernes grundigt ved hjælp af nyt vækstmedium. HeLa-celler er PFA-fikserede og grundigt vasket med PBS, før de immunfarves for SseJ (grøn). Manglen på synligt baggrundsfluorescenssignal i venstre panel (JF646-Tz) indikerer, at næsten ingen off-target mærkning forekom inden for værtscellerne. Skalabjælke = 10 μm. Forkortelser: HA = hyaluronsyre; PBS = fosfatbufret saltvand FBS = føtalt kvægserum; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol; TCO*A = trans-cyclooct-2-en-L-lysin; SIF'er = salmonella-inducerede filamenter; GCE = genetisk kodeudvidelse; SPI-2 = Salmonella patogenicitet ø 2; BF = brightfield. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Superopløsningsbilleddannelse af GCE-mærket SseJ i HeLa-celler. HeLa-celler er inficeret med salmonella, der udtrykker SseJ-F10TCO-HA i nærværelse af 400 μM TCO*A. TCO-mærket udskilt SseJ-F10TCO-HA mærkes med 2 μM JF646-Tz under fysiologiske forhold som beskrevet i protokollen og vaskes derefter grundigt. Billeder erhverves ved hjælp af Nikon N-STORM. (A) Brightfield-billede af en HeLa-celle under observation. Skalabjælke = 10 μm. (B) Diffraktionsbegrænset, widefield billede af udskilt SseJ mærket med TCO*A og JF-646. Skalabjælke = 10 μm. (C) Tilsvarende dSTORM-billede af de SseJ-dekorerede SIF'er. Skalabjælke = 10 μm. C(i) Indsats viser en forstørret visning af superopløst SseJ i det indrammede område. Skalabjælke = 1 μm. Forkortelser: HA = hyaluronsyre; TCO*A = trans-cyclooct-2-en-L-lysin; SIF'er = salmonella-inducerede filamenter; GCE = genetisk kodeudvidelse; WF = bredfelt; BF = brightfield. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1. Løsninger. Klik her for at se en større version af denne tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den fremgangsmåde, der er beskrevet heri, blev brugt til at spore den nøjagtige placering af effektorproteiner, der injiceres i værtscellen af bakterien T3SS efter infektion. T3SS'er anvendes af intracellulære patogener såsom Salmonella, Shigella og Yersinia til at transportere virulenskomponenter ind i værten. Udviklingen af billeddannelsesteknologier med superopløsning har gjort det muligt at visualisere virulensfaktorer ved en tidligere ufattelig opløsning12,13,24. Imidlertid udelukkede visse mærkningsbegrænsninger mere dybtgående undersøgelse, da fotoaktiverbare proteinfusioner blokerer T3SS-poren og ikke udskilles. Derudover kan klyngeartefakter og fejlagtig analyse skyldes nogle fusionsproteins iboende tilbøjelighed til at klynge eller aggregere.

I nogle tilfælde spaltes fusionsproteinet også, som vi tidligere observerede med PAmCherry-SsaP12,13. Alle disse begrænsninger overvindes af GCE, som giver mulighed for stedspecifik fluorescerende mærkning af IP'er. Det tillader også visualisering af proteiner, der ikke er rigelige12,13. Mens der er en række faktorer, der kan påvirke effektiviteten af ncAA-inkorporering ved hjælp af et ortogonalt tRNA / aminoacyl-tRNA-syntetasesystem, ser det ud til, at kodonkonteksten er den mest afgørende. Det ortogonale tRNA inkorporerer en ncAA mest effektivt, når den foretrukne kodonkontekst er AATTAGACT33. I figur 5 kan vi sammenligne den skarpe mærkning som følge af GCE og en stedspecifik fluorofor (samt fraværet af baggrund) sammenlignet med immunfarvning af et HA-tag.

Som et resultat vil forskere være i stand til at visualisere POI'er i patogener, kommensale bakterier og eukaryote værter ved hjælp af den metode, der er skitseret her. Kort sagt giver genetisk kodede ncAA'er en alternativ tilgang til effektorproteinmærkning, når konventionelle metoder fejler. En væsentlig begrænsning af denne metode er imidlertid fluoroforens iboende kemiske egenskaber, såsom membranpermeabilitet, distribution og tilbageholdelse, hvilket kan påvirke effektiviteten af fluorescerende mærkning. Fluorescerende ncAA'er er en alternativ mulighed for at undgå klikreaktioner12, men disse kan kun visualiseres ved hjælp af to-fotonmikroskopi. Læsere henvises til en liste over cellemembrangennemtrængelige/uigennemtrængelige farvestoffer, der er citeret heri 12,38,39,40,41.

Afslutningsvis mærkede og visualiserede vi specifikt Salmonella-udskilt effektor SseJ ved genetisk kodning af ncAA'er i kombination med en fluorogen fluorofor uden at forringe dens biologiske funktion. Mærkning af SseJ med JF646-Tz var meget specifik, og superopløsningsbilleddannelse kan yderligere anvendes til at visualisere udskillede effektorer inde i værtsceller. Således tillod fluorescerende mærkning af bakterielle effektorer ved anvendelse af dSTORM-kompatible farvestoffer og genetisk kodeudvidelse den subcellulære rumlige lokalisering af bakterielle udskillede effektorer i værtsceller ved en opløsning under diffraktionsgrænsen. Da denne mærkningsplatform er kompatibel med live-cellebilleddannelse af enkeltpartikelsporing, vil vores metode gøre det muligt at analysere effektorproteiner i T3SS-systemet med hidtil usete niveauer af tidsmæssig og rumlig opløsning, hvilket vil forbedre vores molekylære forståelse af bakteriel patogenese.

Selvom der er visse begrænsninger, såsom dårlig ncAA-inkorporeringseffektivitet og de fotofysiske begrænsninger af den organiske fluorofor, har vi vist, at denne tilgang kan hjælpe forskere med at observere og lokalisere en udskilt effektor inde i værtsceller, selv når den er knap12,13. Vi forventer, at tilpasningen af teknologien vil åbne nye og spændende muligheder for billeddannelse og forskning i andre effektorproteiner produceret af bakterier under infektion. Metoden er også let tilpasset til mærkning af vira, hvilket viser dens brede anvendelighed.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af opstartsmidler fra University of Texas Medical filial, Galveston, TX, og en Texas STAR-pris til L.J.K. Vi takker professor Edward Lemke (European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg, Tyskland) for plasmidet pEVOL-PylRS-AF. Billeder i figur 1 blev oprettet ved hjælp af BioRender.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Tris/Glycine SDS running buffer BIO-RAD 1610732
Ammonium chloride Fischer Scientific A661-500
Ammonium sulphate Fischer Scientific BP212R-1
Ampicillin Sodium Sigma-Aldrich A0166 5 g
Antibiotic-Antimycotic (100x) ThermiFischer Scientific 15240096
Arabinose Sigma-Aldrich A3256 500 g
Avanti J-26XP (High-Performance Centrifuge) Beckman Coulter
Bacto-Agar BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA 214010
BDP-FL-tetrazine Lumiprobe (USA) 2.14E+02
β-mercaptoethanol Millipore 444203 250 mL
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B8026
BSA Sigma-Aldrich A4503 500 g
Casein Sigma-Aldrich C8654
Catalase Sigma-Aldrich C9322
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C1919
Click Amino Acid / trans-Cyclooct-2-en – L - Lysine (TCO*A) SiChem GmbH SC-8008 Size: 500 mg
DAPI (Hoechst33342) Invitrogen H3570
DeNovix DS-11+ Spectrophotometer DeNovix
DMEM* Corning 10-013-CV * Used for maintaining HeLa Cell
DMEM** Gibco 11965-092 **Used for bacterial infection in presence of ncAA, see section 5.4.
DMSO Sigma-Aldrich D8418 250 g
Donkey anti-rabbit Alexa fluoro555 secondary antibody Invitrogen A-31572
DPBS, 1x Corning 21-031-CV
E. coli strain BL21 (DE3) Novagen (Madison, WI)
EMCCD Camera Andor iXon Ultra 897-BV
Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 mL (PCR clean) Eppendorf, Hamburg, Germany 30123.328
Fetal Bovine Serum (FBS) Fischer 10082147
Fisherbrand Syringe Filters - Sterile (PVDF 0.22 µm) Fischer Scientific 97203 Pack of 100
Gene Pulser Xcell Electroporator BIO-RAD 1652660
Gentamycin Sigma-Aldrich G1272 10 mL
Gibco L-Glutamine (200 mM), 100x Fischer Scientific 25-030-081
Glucose oxidase Sigma-Aldrich G7141-50KU
Glycerol Fischer Scientific BF229-4
HeLa cells ATTC CCL-2
HEPES Buffer Corning 25-060-C1 100 mL
Hydrocloric acid Fischer Scientific A144-212
ImageJ Image processing and analysis:  http://rsbweb.nih.gov/ij
IntantBlue Expedeon ISB1L Coomassie-based stain
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma-Aldrich I5502
Janelia Fluoro 646-tetrazine Tocris Bioscience 7279
Kanamycin Sigma-Aldrich 60615 5 g
LB Broth BD Difco 244620 500 g
Lysozyme Sigma-Aldrich L6876
μManager (v. 1.4.2) https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release
MES Sigma-Aldrich M3671 250 g
Micro pulser cuvette BIO-RAD 165-2086 0.2 cm electrode gap, pkg. of 50
Nikon N-STORM Nikon Instruments Inc. https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/super-resolution-microscopes/n-storm-super-resolution
Nunc EasYFlask Cell Culture Flasks ThermiFischer Scientific 156499
Omnipur Casamino Acid Calbiochem 2240 500 g
Paraformaldehhyde (PFA) Electron Microscopy Sciences  15710
PBS (10x) Roche 11666789001
Penicillin-Streptomycin Solution (100x) GenDEPOT  CA005-010 100 mL
pEVOL-PylRS-AF For plasmid construction and map see following references
1. Angew Chem Int Ed Engl. 2011, 50(17), 3878-81.
2. Angew Chem Int Ed Engl., 2012, 51, 4166-70.
Plasmid Mini-prep Kit Qiagen 27106
plasmid pWSK29-sseJ10TAG-HA Ref.: elife. 2021, 10, e67789.
plasmid pWSK29-sseJ-HA Ref.: elife. 2021, 10, e67789.                                                                   Vector map of PWSK29: https://www.addgene.org/172972/
Pluronic F-127 Millipore 540025 Protein grade, 10% Solution
Potassium phosphate monobasic Fischer Scientific P285-500
Potassium sulphate Acros Organic 424220250
Protease Inhibitor Cocktail Set I - Calbiochem Sigma-Aldrich 539131 100x Solution
Rabbit anti-HA primary antibody Sigma-Aldrich H6908
S. enterica. serovar Typhimurium 14028s Ref.: PLoS Biol. 2015, 13, e1002116.
Saponin Sigma-Aldrich 47036-50G-F
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich L3771
Sodium hydroxide Fischer Scientific SS255-1
Sodium Pyruvate (100 mM), 100x Corning 25-060-C1 100 mL
Sonic Dismembrator Model 100 Fischer Scientific 24932
STED microsocpe (Leica TCS SP8 STED 3X system) Leica Microsystems, Wetzlar, Germany https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/
ThunderSTORM https://zitmen.github.io/thunderstorm/
Trizma Base Sigma-Aldrich T1503
Trypsin-EDTA (1x), 0.25%   GenDEPOT  CA014-010
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416 100 mL
X-well tissue culture chamber slides SARSTEDT 94.6190.802

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Marlovits, T. C., et al. Structural insights into the assembly of the type III secretion needle complex. Science. 306 (5698), 1040-1042 (2004).
  2. Kubori, T., et al. Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretion system. Science. 280 (5363), 602-605 (1998).
  3. LaRock, D. L., Chaudhary, A., Miller, S. I. Salmonellae interactions with host processes. Nature Reviews Microbiology. 13 (4), 191-205 (2015).
  4. Galan, J. E., Waksman, G. Protein-injection machines in bacteria. Cell. 172 (6), 1306-1318 (2018).
  5. Feng, X., Oropeza, R., Kenney, L. J. Dual regulation by phospho-OmpR of ssrA/B gene expression in Salmonella pathogenicity island 2. Molecular Microbiology. 48 (4), 1131-1143 (2003).
  6. Walthers, D., et al. Salmonella enterica response regulator SsrB relieves H-NS silencing by displacing H-NS bound in polymerization mode and directly activates transcription. Journal of Biological Chemistry. 286 (3), 1895-1902 (2011).
  7. Chakraborty, S., Mizusaki, H., Kenney, L. J. A FRET-based DNA biosensor tracks OmpR-dependent acidification of Salmonella during macrophage infection. PLoS Biology. 13 (4), e1002116 (2015).
  8. Liew, A. T. F., et al. Single cell, super-resolution imaging reveals an acid pH-dependent conformational switch in SsrB regulates SPI-2. eLife. 8, e45311 (2019).
  9. Knuff, K., Finlay, B. B. What the SIF is happening-the role of intracellular Salmonella-induced filaments. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 335 (2017).
  10. Drecktrah, D., et al. Dynamic behavior of Salmonella-induced membrane tubules in epithelial cells. Traffic. 9 (12), 2117-2129 (2008).
  11. Garcia del-Portillo, F., Zwick, M. B., Leung, K. Y., Finlay, B. B. Salmonella induces the formation of filamentous structures containing lysosomal membrane glycoproteins in epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (22), 10544-10548 (1993).
  12. Singh, M. K., Zangoui, P., Yamanaka, Y., Kenney, L. J. Genetic code expansion enables visualization of Salmonella type three secretion system components and secreted effectors. elife. 10, e67789 (2021).
  13. Singh, M. K., Kenney, L. J. Super-resolution imaging of bacterial pathogens and visualization of their secreted effectors. FEMS Microbiology Reviews. 45 (2), fuaa050 (2020).
  14. Akeda, Y., Galan, J. E. Chaperone release and unfolding of substrates in type III secretion. Nature. 437 (7060), 911-915 (2005).
  15. Su, W. W. Fluorescent proteins as tools to aid protein production. Microbial Cell Factories. 4 (1), 12 (2005).
  16. Wang, S., Moffitt, J. R., Dempsey, G. T., Xie, X. S., Zhuang, X. Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8452-8457 (2014).
  17. Ghodke, H., Caldas, V. E. A., Punter, C. M., van Oijen, A. M., Robinson, A. Single-molecule specific mislocalization of red fluorescent proteins in live Escherichia coli. Biophysical Journal. 111 (1), 25-27 (2016).
  18. Gahlmann, A., Moerner, W. E. Exploring bacterial cell biology with single-molecule tracking and super-resolution imaging. Nature Reviews Microbiology. 12 (1), 9-22 (2014).
  19. Keppler, A., et al. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).
  20. Gautier, A., et al. An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells. Chemical Biology. 15 (2), 128-136 (2008).
  21. Young, A. M., Minson, M., McQuate, S. E., Palmer, A. E. Optimized fluorescence complementation platform for visualizing Salmonella effector proteins reveals distinctly different intracellular niches in different cell types. ACS Infectious Diseases. 3 (8), 575-584 (2017).
  22. Martin, B. R., Giepmans, B. N., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Mammalian cell-based optimization of the biarsenical-binding tetracysteine motif for improved fluorescence and affinity. Nature Biotechnology. 23 (10), 1308-1314 (2005).
  23. Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications. Journal of the American Chemical Society. 124 (21), 6063-6076 (2002).
  24. Gao, Y., Spahn, C., Heilemann, M., Kenney, L. J. The pearling transition provides evidence of force-driven endosomal tubulation during Salmonella infection. mBio. 9 (3), e01083-e01018 (2018).
  25. Brumell, J. H., Goosney, D. L., Finlay, B. B. SifA, a type III secreted effector of Salmonella typhimurium, directs Salmonella-induced filament (Sif) formation along microtubules. Traffic. 3 (6), 407-415 (2002).
  26. Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
  27. Davis, L., Chin, J. W. Designer proteins: applications of genetic code expansion in cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 168-182 (2012).
  28. Chin, J. W., et al. Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).
  29. Kipper, K., et al. Application of noncanonical amino acids for protein labeling in a genomically recoded Escherichia coli. ACS Synthetic Biology. 6 (2), 233-255 (2017).
  30. Uttamapinant, C., et al. Genetic code expansion enables live-cell and super-resolution imaging of site-specifically labeled cellular proteins. Journal of American Chemical Society. 137 (14), 4602-4605 (2015).
  31. Plass, T., et al. Amino acids for Diels-Alder reactions in living cells. Angewandte Chemie International Edition. 51 (17), 4166-4170 (2012).
  32. Lang, K., et al. Genetic encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions. Journal of the American Chemical Society. 134 (25), 10317-10320 (2012).
  33. Xu, H., et al. Re-exploration of the codon context effect on amber codon-guided incorporation of noncanonical amino acids in Escherichia coli by the blue-white screening assay. ChemBioChem. 17 (13), 1250-1256 (2016).
  34. Nakamura, Y., Gojobori, T., Ikemura, T. Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000. Nucleic Acids Research. 28 (1), 292 (2000).
  35. Spahn, C., et al. Sequential super-resolution imaging of bacterial regulatory proteins: the nucleoid and the cell membrane in single, fixed E. coli cells. Methods in Molecular Biology. 1624, 269-289 (2017).
  36. Grimm, J., English, B., Chen, J., et al. A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy. Nature Methods. 12 (3), 244-250 (2015).
  37. Xu, J., Ma, H., Liu, Y. Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM). Current Protocols in Cytometry. 81 (1), 12-46 (2017).
  38. Meineke, B., Heimgärtner, J., Eirich, J., Landreh, M., Elsässer, S. J. Site-specific incorporation of two ncAAs for two-color bioorthogonal labeling and crosslinking of proteins on live mammalian cells. Cell Reports. 31 (12), 107811 (2020).
  39. Bessa-Neto, D., et al. Bioorthogonal labeling of transmembrane proteins with non-canonical amino acids unveils masked epitopes in live neurons. Nature Communications. 12 (1), 6715 (2021).
  40. Beliu, G., et al. Bioorthogonal labeling with tetrazine-dyes for super-resolution microscopy. Communication Biology. 2, 261 (2019).
  41. Arsić, A., Hagemann, C., Stajković, N., Schubert, T., Nikić-Spiegel, I. Minimal genetically encoded tags for fluorescent protein labeling in living neurons. Nature Communications. 13 (1), 314 (2022).

Tags

Biologi udgave 192 Salmonella ikke-kanoniske aminosyrer genetisk kodeudvidelse SseJ superopløsning dSTORM
Superopløsningsbilleddannelse af bakterielle udskillede proteiner ved hjælp af genetisk kodeudvidelse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Singh, M. K., Kenney, L. J.… More

Singh, M. K., Kenney, L. J. Super-Resolution Imaging of Bacterial Secreted Proteins Using Genetic Code Expansion. J. Vis. Exp. (192), e64382, doi:10.3791/64382 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter