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Biology

Imagerie à super-résolution de protéines sécrétées par des bactéries à l’aide de l’expansion du code génétique

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/64382
Automatic Translation
1, 1
1Biochemistry & Molecular Biology, University of Texas Medical Branch

Summary

Cet article fournit un protocole simple et clair pour marquer les effecteurs sécrétés par Salmonella en utilisant le site d’expansion du code génétique (ECG) et imager la localisation subcellulaire des protéines sécrétées dans les cellules HeLa à l’aide de la microscopie de reconstruction optique stochastique directe (dSTORM)

Abstract

Les systèmes de sécrétion de type trois (T3SS) permettent aux bactéries à Gram négatif d’injecter une batterie de protéines effectrices directement dans le cytosol des cellules hôtes eucaryotes. À l’entrée, les protéines effectrices injectées modulent de manière coopérative les voies de signalisation eucaryotes et reprogramment les fonctions cellulaires, permettant l’entrée et la survie des bactéries. La surveillance et la localisation de ces protéines effectrices sécrétées dans le contexte des infections fournissent une empreinte pour définir l’interface dynamique des interactions hôte-pathogène. Cependant, le marquage et l’imagerie des protéines bactériennes dans les cellules hôtes sans perturber leur structure / fonction est techniquement difficile.

La construction de protéines de fusion fluorescentes ne résout pas ce problème, car les protéines de fusion bloquent l’appareil sécrétoire et ne sont donc pas sécrétées. Pour surmonter ces obstacles, nous avons récemment utilisé une méthode de marquage fluorescent spécifique au site des effecteurs sécrétés bactériens, ainsi que d’autres protéines difficiles à étiqueter, en utilisant l’expansion du code génétique (ECG). Cet article fournit un protocole complet étape par étape pour marquer les effecteurs sécrétés par Salmonella à l’aide du site GCE, suivi de directives pour l’imagerie de la localisation subcellulaire des protéines sécrétées dans les cellules HeLa à l’aide de la microscopie de reconstruction optique stochastique directe (dSTORM)

Des découvertes récentes suggèrent que l’incorporation d’acides aminés non canoniques (ncAA) via GCE, suivie d’un marquage bio-orthogonal avec des colorants contenant de la tétrazine, est une technique viable pour le marquage sélectif et la visualisation des protéines sécrétées bactériennes et l’analyse ultérieure de l’image chez l’hôte. L’objectif de cet article est de fournir un protocole simple et clair qui peut être utilisé par les chercheurs intéressés à effectuer une imagerie à super-résolution en utilisant GCE pour étudier divers processus biologiques dans les bactéries et les virus, ainsi que les interactions hôte-pathogène.

Introduction

Les infections bactériennes ont longtemps été considérées comme un danger grave pour la santé humaine. Les agents pathogènes utilisent des systèmes de défense très évolués, extrêmement puissants et complexes, ainsi qu’une variété de facteurs de virulence bactérienne (appelés protéines effectrices) pour échapper aux réponses immunitaires de l’hôte et établir des infections 1,2. Cependant, les mécanismes moléculaires sous-jacents à ces systèmes et le rôle des protéines effectrices individuelles sont encore largement inconnus en raison du manque d’approches appropriées pour suivre directement les composants protéiques cruciaux et les effecteurs dans les cellules hôtes pendant la pathogenèse.

Un exemple typique est Salmonella enterica sérovar Typhimurium, qui provoque une gastro-entérite aiguë. Salmonelle Typhimurium utilise des systèmes de sécrétion de type trois (T3SS) pour injecter une variété de protéines effectrices directement dans les cellules hôtes. Dès que Salmonella pénètre dans la cellule hôte, elle réside dans un compartiment membranaire acide, appelé vacuole contenant Salmonella (SCV)3,4. Le pH acide du SCV active le T3SS codé par l’îlot de pathogénicité 2 de Salmonella (SPI-2) et transloque une volée de 20 protéines effectrices ou plus à travers la membrane vacuolaire dans le cytosolhôte 5,6,7,8. À l’intérieur de l’hôte, ces cocktails complexes de protéines effectrices manipulent de manière coordonnée les voies de signalisation de la cellule hôte, ce qui entraîne la formation de structures membranaires tubulaires complexes et hautement dynamiques étendues à partir du SCV le long de microtubules, appelées filaments induits par Salmonella (SIF), qui permettent à Salmonella de survivre et de se répliquer dans les cellules hôtes9,10,11.

Les méthodes permettant de visualiser, de suivre et de surveiller les localisations des effecteurs bactériens, et d’examiner leur trafic et leurs interactions à l’intérieur des cellules hôtes, fournissent un aperçu essentiel des mécanismes qui sous-tendent la pathogenèse bactérienne. Le marquage et la localisation des protéines effectrices T3SS sécrétées par Salmonella à l’intérieur des cellules hôtes se sont avérés être un défi technologique12,13; Néanmoins, le développement de protéines fluorescentes codées génétiquement a transformé notre capacité à étudier et à visualiser les protéines dans les systèmes vivants. Cependant, la taille des protéines fluorescentes (~25-30 kDa)15 est souvent comparable ou même supérieure à celle de la protéine d’intérêt (POI; par exemple, 13,65 kDa pour SsaP, 37,4 kDa pour SifA). En fait, le marquage des protéines fluorescentes des effecteurs bloque souvent la sécrétion de l’effecteur marqué et bloque le T3SS14.

De plus, les protéines fluorescentes sont moins stables et émettent un faible nombre de photons avant photoblanchiment, ce qui limite leur utilisation dans les techniques microscopiques à super-résolution16,17,18, en particulier en microscopie de localisation par photoactivation (PALM), STORM et en microscopie à déplétion par émission stimulée (STED). Bien que les propriétés photophysiques des colorants fluorescents organiques soient supérieures à celles des protéines fluorescentes, des méthodes et techniques telles que CLIP/SNAP19,20, Split-GFP 21, ReAsH/FlAsH 22,23 et HA-Tags 24,25 nécessitent un appendice protéique ou peptidique supplémentaire qui peut altérer la structure-fonction de la protéine effectrice d’intérêt en interférant avec la modification ou le trafic post-traductionnel. Une méthode alternative qui minimise la modification nécessaire des protéines implique l’incorporation de ncAA dans un POI pendant la traduction par GCE. Les ncAA sont fluorescents ou peuvent être rendus fluorescents via la chimie de clic 12,13,26,27,28.

En utilisant l’ECG, les ncAA avec de minuscules groupes bio-orthogonaux fonctionnels (tels qu’un groupe azoture, cyclopropène ou cyclooctyne) peuvent être introduits à presque n’importe quel endroit d’une protéine cible. Dans cette stratégie, un codon natif est échangé avec un codon rare tel qu’un codon stop ambre (TAG) à une position spécifiée dans le gène du POI. La protéine modifiée est ensuite exprimée dans les cellules aux côtés d’une paire orthogonale aminoacyl-ARNt synthétase/ARNt. Le site actif de l’ARNt synthétase est conçu pour recevoir un seul ncAA particulier, qui est ensuite attaché de manière covalente à l’extrémité 3' de l’ARNt qui reconnaît le codon ambre. Le ncAA est simplement introduit dans le milieu de croissance, mais il doit être absorbé par la cellule et atteindre le cytosol où l’aminoacyl-ARNt synthétase (aaRS) peut le lier à l’ARNt orthogonal; il est ensuite incorporé dans la POI à l’emplacement spécifié (voir la figure 1)12. Ainsi, la CME permet l’incorporation spécifique au site d’une pléthore de groupes réactifs bio-orthogonaux tels que la cétone, l’azoye, l’alcyne, le cyclooctyne, le transcyclooctène, la tétrazine, le norbonène, le α, l’amide β-insaturé et le bicyclo [6.1.0]-nonyne dans un POI, surmontant potentiellement les limites des méthodes conventionnelles de marquage des protéines 12,26,27,28.

Les tendances émergentes récentes dans les techniques d’imagerie à super-résolution ont ouvert de nouvelles voies pour étudier les structures biologiques au niveau moléculaire. En particulier, STORM, une technique de super-résolution basée sur la localisation et basée sur la localisation, est devenue un outil inestimable pour visualiser les structures cellulaires jusqu’à ~20-30 nm et est capable d’étudier les processus biologiques une molécule à la fois, découvrant ainsi les rôles de molécules intracellulaires qui sont encore inconnus dans les études traditionnelles de moyenne d’ensemble13 . Les techniques monomoléculaires et de super-résolution nécessitent une petite étiquette avec des fluorophores organiques brillants et photostables pour la meilleure résolution. Nous avons récemment démontré que GCE peut être utilisé pour incorporer des sondes appropriées pour l’imagerie à super-résolution12.

Deux des meilleurs choix pour le marquage des protéines dans les cellules sont la bicyclo [6.1.0] nonynelysine (BCN) et la transcyclooctène-lysine (TCO; illustrée à la figure 1), qui peuvent être génétiquement codées en utilisant une variante de la paire ARNt / synthétase (ici appelée ARNt Pyl / PylRS AF), oùPyl représente la pyrrolysine, et AF représente un double mutant rationnellement conçu (Y306A, Y384F) dérivé de Methanosarcina mazei qui code naturellement pour la pyrrolysine12, 29,30,31. Grâce à la réaction de cycloaddition Diels-Alder (Siels-Alder) à demande inverse d’électrons favorisée par la déformation, ces acides aminés réagissent chimiosélectivement avec les conjugués de tétrazine (Figure 1)12,30,31. De telles réactions de cycloaddition sont exceptionnellement rapides et compatibles avec les cellules vivantes; Ils peuvent également être fluorogéniques, si un fluorophore approprié est fonctionnalisé avec la fraction tétrazine12,26,32. Cet article présente un protocole optimisé pour surveiller la dynamique des effecteurs bactériens délivrés dans les cellules hôtes à l’aide de la CME, suivi de la localisation subcellulaire des protéines sécrétées dans les cellules HeLa à l’aide de dSTORM. Les résultats indiquent que l’incorporation d’un ncAA via GCE, suivie d’une réaction de clic avec des colorants fluorogéniques contenant de la tétrazine, représente une méthode polyvalente pour le marquage sélectif, la visualisation des protéines sécrétées et la localisation sous-cellulaire ultérieure dans l’hôte. Cependant, tous les composants et procédures détaillés ici peuvent être ajustés ou remplacés afin que le système GCE puisse être adapté pour étudier d’autres questions biologiques.

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Protocol

1. Construction plasmidique

  1. Cloner le gène exprimant le POI dans un plasmide d’expression (p. ex. pET28a-sseJ 10TAG) qui exprime le POI dans E. coli BL21 (DE3). Cette étape facilite la détermination que les mutants sont fonctionnels.
  2. Pour la visualisation des effecteurs sécrétés par Salmonella dans les cellules hôtes, construire un plasmide d’expression (pWSK29-sseJ-HA) qui exprime le POI cible SseJ sous le contrôle de son promoteur natif, comme décrit dans les rapports précédents 7,12,24. En utilisant la mutagénèse dirigée sur site, remplacer le codon de phénylalanine-10 par un codon ambre (TAG) dans SseJ (pWSK29-sseJ 10TAG-HA), en assurant le motif AAT-TAG-ACT 33,34.
  3. En plus des plasmides ci-dessus, pour l’incorporation génétique de trans-cyclooct-2-en-L-lysine (TCO*A) dans un POI, utiliser un autre plasmide d’expression (pEVOL-PylRS-AF)31 qui contient la paire ARNt/synthétase évoluée (ARNtPyl/PylRSAF ) gènes codés dans le plasmide pEVOL.
    NOTE: Des descriptions détaillées du plasmide et des protocoles de clonage sont décrites dans le rapport précédent30,31.
  4. Utilisez des kits de préparation plasmidique disponibles dans le commerce pour obtenir de l’ADN plasmidique de haute qualité. Pour l’ADN purifié, le rapport optimal 260/280 est ~1,8. Vérifiez la pureté de l’ADN en utilisant une électrophorèse sur gel d’agarose à 1%, si nécessaire.

2. Préparation de la culture bactérienne

  1. Obtention de doubles transformants pour tester que le mutant est fonctionnel chez E. coli
    1. Prélever les cellules compétentes BL21 à -80 °C et les décongeler sur la glace pendant environ 20 à 30 minutes.
    2. Mélanger 1 à 5 μL de chaque plasmide (~50 ng de pEVOL-PylRS-AF et pET28a-sseJ 10TAG) avec 200 μL de cellules BL21 chimiquement compétentes dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL. Mélanger délicatement les cellules compétentes et le mélange plasmidique; Incuber pendant 30 min sur la glace.
    3. Choc thermique du tube microcentrifuge dans un bain-marie à 42 °C pendant 45 s. Remettez les tubes sur la glace pendant 2 min.
    4. Ajouter 1 mL de milieu LB chaud dans le tube microcentrifuge et transférer rapidement le mélange dans un tube conique de 15 mL. Incuber les cellules à 37 °C dans un agitateur à 250 rpm pendant 1 h. Plaquer une partie ou la totalité des cellules transformées sur des plaques de gélose LB contenant les antibiotiques appropriés. Incuber les plaques pendant la nuit à 37 °C.
      REMARQUE : Dans ce protocole, 35 μg/mL de chloramphénicol et 50 μg/mL de kanamycine ont été utilisés pour sélectionner pEVOL-PylRS-AF et pET28a-sseJ 10TAG, respectivement. À l’étape de la transformation, évaluez la transformation réussie à l’aide de contrôles négatifs et positifs.
  2. Transférer le mutant à Salmonella pour la visualisation des effecteurs sécrétés par Salmonella dans les cellules hôtes:
    1. Ajouter 2 à 3 μL de pEVOL-PylRS-AF et de pWSK29-sseJ 10TAG à 40 à 60 μL de souches électrocompétentes de Salmonella Typhimurium 14028s dans un tube à microcentrifuger réfrigéré. Mélanger doucement le mélange à l’aide d’une pipette.
    2. Transférer le mélange d’électroporation dans une cuvette refroidie (espace électrode de 0,2 cm); réglez les réglages d’électroporation sur 2,5 kV, 200 Ω, 25 μF. Placez la cuvette à l’intérieur de la chambre d’électroporation. Assurez-vous que l’électrode de la chambre entre fermement en contact avec la cuvette du micro-impulseur.
    3. Appuyez sur le bouton d’impulsion et maintenez-le enfoncé jusqu’à ce qu’il émette un bip.
    4. Ajouter immédiatement 1 mL de milieu LB chaud dans la cuvette. Transférer tout le contenu dans un tube conique de 15 mL. Incuber les cellules à 37 °C en agitant à 250 rpm pendant 1 h.
    5. Plaquer une partie ou la totalité du mélange d’électroporation de Salmonella sur une plaque de gélose LB contenant les antibiotiques appropriés. Incuber les plaques pendant la nuit à 37 °C.
      REMARQUE : Dans ce protocole, 35 μg/mL de chloramphénicol et 100 μg/mL d’ampicilline ont été utilisés pour la sélection de pEVOL-PylRS-AF et de pWSK29-sseJ 10TAG, respectivement.
  3. Préparation à la culture
    1. Inoculer une seule colonie de Salmonella ou E. coli dans 5 mL de milieu LB contenant les antibiotiques appropriés. Cultiver pendant la nuit à 37 °C, en agitant à 250 tr/min.

3. Expression et marquage fluorescent des protéines contenant des ncAA

  1. Expression de protéines contenant du ncAA chez E. coli
    1. Transférer 100 μL de culture primaire dans 5 mL de milieu LB (dilution 1:50) contenant 35 μg/mL de chloramphénicol et 50 μg/mL de kanamycine, suivi d’une incubation à 37 °C avec agitation à 250 rpm jusqu’à ce que la DO600 atteigne 0,4–0,6.
    2. Préparer une solution mère de TCO*A de 1 mM (10 mL; Tableau 1).
    3. Lorsque les cultures atteignent la DO600 = 0,4–0,6, remplacer le milieu LB par de la LB fraîche contenant 1 mM DE TCO*A, 35 μg/mL de chloramphénicol et 50 μg/mL de kanamycine.
      REMARQUE : Vous pouvez également préparer une solution mère de TCO*A comme décrit à l’étape 5.4.2.
    4. Induire l’expression des protéines en présence de 1 mM IPTG, 0,2% d’arabinose et agiter pendant une nuit à 34 °C, 250 rpm. Récolter les cellules bactériennes par centrifugation pendant 5 min à 11 000 × g. Retirer le surnageant et congeler la pastille à -20 °C jusqu’à nouvelle utilisation.
    5. Pour une expérience de contrôle, répétez la même expérience, mais exprimez les protéines contenant ncAA en l’absence de la ncAA. Pour le marquage fluorescent in vitro de protéines contenant du ncAA chez E. coli, suivre la procédure détaillée décrite à l’étape 3.3.
  2. Expression de protéines contenant du ncAA dans Salmonella
    1. Transférer 100 μL de culture primaire dans 5 mL de milieu LB (dilution 1:50) contenant 35 μg/mL de chloramphénicol et 100 μg/mL d’ampicilline, suivi d’une incubation à 37 °C avec agitation à 250 rpm jusqu’à ce que la DO600 atteigne 0,6.
    2. Préparer un milieu N-minimal modifié (MgM, pH 5,6) comme décrit dans le tableau 1.
    3. Remplacer le milieu LB par un milieu N-minimal modifié (MgM) complété par 1 mM DE TCO*A (tableau 1). Cultiver les bactéries à 34 °C pendant 30 min. Ensuite, ajoutez 0,2% d’arabinose, 25 mg / mL de chloramphénicol et 100 mg / mL d’ampicilline, et cultivez les cellules pendant encore 6 heures, en agitant à 250 rpm.
    4. Après 6 h, laver les bactéries 4x sur un intervalle de 30 min, avec un milieu frais de MgM (pH 5,6) (tableau 1) sans ncAA. Dans les étapes de lavage, utiliser 972 × g pendant 15 min à température ambiante.
    5. Centrifuger les bactéries, remettre en suspension dans 1x tampon PBS et incuber pendant 1 h à 4 °C dans l’obscurité pour éliminer l’excès de ncAA. Après 1 h, centrifuger les bactéries à 3 000 × g, 4 °C pendant 15 min et conserver pour une utilisation ultérieure.
    6. Pour une expérience de contrôle, répétez la même expérience en exprimant des protéines contenant des ncAA en l’absence de ncAA.
  3. Marquage par fluorescence in vitro de protéines contenant du NCA chez Salmonella Typhimurium
    1. Resuspendre les cellules de Salmonella exprimant SseJ-F10TCO-HA en l’absence ou la présence de TCO*A (à partir de l’étape 3.2) dans 1x PBS. Réglez le diamètre OD600 à 4 dans PBS. Incuber les cellules avec 20 μM de Janelia Fluor 646-tétrazine (JF646-Tz) ou 20 μM de BDP-Fl-tétrazine (solutions mères de 5 mM dans du DMSO) à 37 °C dans l’obscurité et agiter pendant 1 à 2 h à 250 tr/min.
    2. Ensemencer les cellules, laver 3 à 4x avec du PBS contenant 5 % de DMSO et 0,2 % de Pluronic F-127, remettre en suspension dans du PBS contenant 5 % de DMSO et incuber pendant la nuit à 4 °C dans l’obscurité. Lavez 2x à nouveau avec 1x PBS. Dans les étapes de lavage, utiliser 972 × g, pendant 15 min à température ambiante.
    3. Imagez immédiatement les cellules à l’aide d’un microscope confocal ou fixez-les avec 1,5% de paraformaldéhyde (PFA) dans du PBS pendant 30 à 45 minutes à température ambiante dans l’obscurité.
    4. Laver les cellules fixes 2x avec du PBS et enfin dans 50 mMNH4Cldans du PBS pendant 15 min pour éliminer l’excès de PFA. Remettez les cellules en suspension dans du PBS et conservez-les à 4 °C pendant 3 à 4 jours maximum. Imagez les bactéries à l’aide de la microscopie confocale comme décrit à la rubrique 6.

4. Caractérisation biochimique des protéines contenant des ncAA

  1. Lyse cellulaire
    1. Resuspendre les cellules de la section 3.1 dans un tampon de lyse (tableau 1) et incuber à température ambiante pendant plus de 30 min. Refroidir le mélange sur de la glace pendant 15 min.
      REMARQUE: Gardez le rapport entre le tampon de lyse et le poids de la cellule utilisé à 1:10.
    2. Sonicer les cellules en suspension alors qu’elles sont encore sur la glace. Pulser pendant 30 s au réglage 7 au moins 6x, avec des intervalles de 1 min, à l’aide d’un sonicateur (voir le tableau des matériaux).
    3. Faites tourner le lysat cellulaire à 20 500 × g, 4 °C pendant 15 minutes (le maintien de 4 °C est essentiel). Transférer le surnageant dans un tube neuf et jeter la pastille.
  2. Analyse SDS-PAGE
    1. Préparez 5 colorants de chargement FDS (Tableau 1). Ajouter 5 μL de tampon de chargement de gel SDS à 13 μL de lysat cellulaire. Dénaturer les protéines avec un tampon d’échantillon de dodécylsulfate de sodium (SDS) dans un tube de 2 mL à 95 °C pendant 10 min, centrifuger le mélange à 2 000 × g pendant 50 s et charger sur un gel de polyacrylamide SDS à 12%.
    2. Assemblez la cassette de gel, placez-la dans un appareil d’électrophorèse sur gel et connectez l’appareil d’électrophorèse à une alimentation électrique. Verser le tampon courant, charger les marqueurs de poids moléculaire et les échantillons de protéines, et faire fonctionner le gel à 100 V, jusqu’à ce que le bromophénol atteigne le fond du gel de résolution.
      REMARQUE : Commencez l’analyse immédiatement, car les lysats stockés à -20 °C ont tendance à perdre de la qualité après chaque cycle de gel-dégel.
    3. Colorer le gel avec la coloration de protéine bleue de Coomassie.

5. Marquage bio-orthogonal de l’effecteur sécrété par Salmonella SseJ-F10TCO-HA dans les cellules HeLa

  1. Cultiver et maintenir les cellules HeLa à 37 °C, 5 % de CO2 et 95 % d’humidité dans un milieu aigle modifié de Dulbecco à haute teneur en glucose (4,5 g/L), complété par 10 % (v/v) de FBS en plus de la pénicilline-streptomycine (1x).
  2. Culture de bactéries 1 jour avant l’infection. Inoculer une seule colonie de Salmonella 14028 contenant pEVOL-PylRS-AF et pWSK29-sseJ 10TAG dans 5 ml de bouillon LB standard contenant des antibiotiques pendant une nuit à 37 °C, en agitant à 250 tr/min.
  3. Ensemencez les cellules HeLa 1 jour avant l’infection. Prélever un flacon de culture tissulaire (T-75) contenant des cellules HeLa à ~80% de confluence, tel que déterminé par examen microscopique de la densité cellulaire. Lavez les cellules avec du PBS chaud. Détacher les cellules avec 3 mL de trypsine/EDTA chaud à 0,25 % pendant 5 min à 37 °C, 5 % de CO2.
    1. Tremper la trypsine en utilisant 2 mL de DMEM (+ 10% FBS). Transvaser tout le contenu de la fiole dans un tube de 15 mL après remise en suspension des cellules. Faites tourner les cellules à 1 000 × g pendant 5 min. Sortez le surnageant du tube. Remettez en suspension la pastille de cellule HeLa dans un milieu de croissance préchauffé.
    2. Utilisez un hémocytomètre pour examiner la suspension et compter les cellules présentes. Préparer un stock de cellules diluées à 1 × 105 cellules/mL. Semer 0,5 × 10cellules 5 HeLa par puits dans 500 μL de milieu de croissance DMEM + 10% FBS dans une lame de chambre de huit puits. Conserver la glissière de la chambre dans un incubateur à 37 °C, 5% CO2, 95% d’humidité pendant 24 h.
  4. Infection bactérienne
    1. Sous-culture de Salmonella 14028s hébergeant pEVOL-PylRS-AF et pWSK29-sseJ 10TAG, par dilution de 100 μL de culture bactérienne de nuit (à partir de l’étape 5.2) dans 3 mL de milieu LB (dilution 1:30) contenant 35 μg/mL de chloramphénicol et 100 μg/mL d’ampicilline, suivie d’une incubation à 37 °C avec agitation à 250 rpm pendant 5–7 h.
      REMARQUE: Au cours de cette phase, les cultures atteignent la phase exponentielle tardive et les bactéries sont très invasives.
    2. Préparez une solution mère TCO*A de 100 mM et un support complet (Tableau 1).
    3. Pour initier l’infection des cellules HeLa, retirez les cellules HeLa de l’incubateur et lavez les cellules avec du DPBS préchauffé avant d’ajouter 500 μL de DMEM frais (+10% FBS) à chaque puits. Replacez la glissière de chambre dans l’incubateur de CO2 jusqu’à ce que l’infection commence.
    4. Après 5 à 7 heures d’incubation, diluer la culture de Salmonella à600 OD = 0,2 dans 1 mL de milieu de croissance DMEM (~3 × 108 ufc/mL). Ajouter les quantités requises de l’inoculum Salmonella dans chaque puits de la lame de chambre de sorte que la multiplicité de l’infection (MOI) soit de 100.
    5. Incuber les cellules infectées dans un incubateur de CO2 pendant 30 min. Lavez les cellules 3x avec du DPBS préchauffé pour éliminer les salmonelles extracellulaires. Définissez ce point temporel sur 0 h après l’infection. Ajouter 500 μL de milieu complet (tableau 1) contenant 100 μg/mL de gentamicine pendant 1 h. Après 1 h, laver les cellules 3x avec DPBS. Ajouter 500 μL du milieu complet (à partir de l’étape 5.4.2; Tableau 1) supplémenté avec 0,2% d’arabinose, 10 μg/mL de gentamicine à chaque puits de la lame de chambre.
    6. Dans une expérience de contrôle, effectuer des infections similaires de cellules HeLa sans TCO*A.
    7. Incuber la lame de chambre pendant 10 h dans l’incubateur CO2 .
  5. Marquage basé sur la chimie des clics dans les cellules vivantes
    1. Procédez à l’étiquetage des cellules infectées par des bactéries. Préchauffer le milieu complet sans TCO*A (tableau 1).
    2. Après 10 h après l’infection, remplacer le milieu complet par un milieu complet frais sans TCO*A et laver les cellules HeLa 4x sur un intervalle de 30 min chacune avec du DPBS préchauffé, suivi d’un milieu complet frais (sans TCO*A).
    3. Préparer une solution mère de colorant-tétrazine à 0,5 mM dans du DMSO.
      REMARQUE: Pour le marquage des effecteurs sécrétés par Salmonella dans les cellules hôtes, deux protocoles sont présentés. Pour le protocole 1, préparer le mélange de colorants en diluant le bouillon JF646-Tz dans 1x PBS contenant 1% de sel de caséine sodique provenant de lait de vache de sorte que la solution de travail finale soit de 2 μM. Pour le protocole 2, préparer le milieu complet chaud (sans FBS et TCO*A) et ajouter 2 μM JF646-Tz. Préparez ce mélange de colorant frais pour chaque séance d’étiquetage. Travaillez dans l’obscurité si possible (tamisez les lumières dans le capot et/ou la pièce).
    4. Après 12 h après l’infection, aspirer le milieu des cellules. Lavez la cellule avec du DPBS préchauffé 2x ou 3x. Dans un groupe de puits, ajouter 500 μL du mélange de solution de colorant décrit dans le protocole 1, et dans un autre groupe de puits de la même lame de chambre, ajouter 500 μL du mélange de solution colorante décrit dans le protocole 2 mentionné à l’étape 5.5.3 et la note suivante. Replacez la chambre dans l’incubateur de CO 2 pendant 1,5 à2 h.
    5. Après 13,5 à 14 heures après l’infection, rincer les cellules HeLa 2x avec du DPBS préchauffé. Ajouter 500 μL de DMEM frais (complété par FBS). Replacez la glissière de la chambre dans l’incubateur pendant 30 min. Laver les cellules avec du DPBS préchauffé suivi d’un DMEM frais 4x sur un intervalle de 30 min.
    6. À 16 h après l’infection, fixer les cellules HeLa avec du PFA en ajoutant 200 μL de PFA à 4 % dans chaque puits et en incubant pendant 10 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Aspirer le PFA, rincer 3x avec du PBS et stocker les cellules dans du PBS à 4 °C dans l’obscurité.
      REMARQUE: Le PFA est un produit chimique hautement toxique. Évitez l’inhalation, ainsi que le contact avec la peau et les yeux. Portez un équipement de protection lors de la manipulation. Pour éviter que l’échantillon marqué ne soit exposé à la lumière, éteignez la lumière dans le capot de culture cellulaire.
  6. Immunomarquage des protéines marquées par l’HA
    1. Aspirer le PBS et rincer une fois dans une solution de blocage (tableau 1).
    2. Incuber les cellules HeLa fixes avec une solution d’anticorps primaires à base de PBS (tableau 1) pendant 1 h à température ambiante dans l’obscurité. Utiliser un anticorps primaire anti-HA de lapin pour colorer SseJ sécrété (dilution de 1:500).
    3. Après 1 h, laver doucement les cellules 2x avec 0,5 mL de 0,1% Tween-20/1x PBS. Pendant les lavages avec la solution Tween/PBS, incuber les cellules 3x avec 0,5 mL de 0,1% Tween20/1x PBS pendant 5 min.
    4. Diluer l’anticorps secondaire âne anti-lapin 555 1:500 dans une solution d’anticorps secondaire et incuber pendant 1 h à température ambiante dans l’obscurité.
    5. Après 1 h, laver doucement les cellules 2x avec 0,5 mL de 0,1% Tween-20/1x PBS et incuber 2x avec 0,5 mL de 0,1% Tween20/1x PBS pendant 5 min.
    6. Lavez les cellules 3x avec 0,5 mL de 1x PBS et conservez-les à 4 °C dans l’obscurité.
      REMARQUE: Les cellules fixes peuvent être stockées pendant quelques semaines dans PBS à 4 ° C. L’immunomarquage doit être effectué à la dernière minute.

6. Imagerie confocale

  1. Utilisez un microscope confocal, tel qu’un disque rotatif (SD) ou un microscope STED.
    1. Ajustez les paramètres d’acquisition d’image, tels que le mode de numérisation (XYZ), la vitesse de numérisation (400 Hz), la résolution (512 x 512), le grossissement (100x) et l’empilement Z.
    2. Utilisez les filtres d’excitation/d’émission appropriés pour DAPI, BDP-Tz et JF646 tétrazine.
      REMARQUE: Pour ce protocole, l’imagerie confocale a été réalisée sur un système de microscope STED équipé d’un laser à lumière blanche pulsée, permettant la sélection de l’excitation dans la gamme de 470-670 nm et d’un laser à diode UV 405 nm pour l’excitation à 405 nm, 488 nm et 647 nm. Les plages d’émission appropriées ont été configurées à l’aide du séparateur de faisceau acousto-optique intégré en combinaison avec une détection spectrale multibande accordable à prisme du système confocale.
    3. Acquérir les images à l’aide d’un objectif d’immersion dans l’huile 100×/1,4.

7. Imagerie à super-résolution (dSTORM)

  1. Allumez le microscope 3 heures avant l’imagerie pour permettre l’équilibre thermique (la dérive est plus susceptible de se produire si l’imagerie commence avant). Refroidissez l’appareil photo à -70 °C.
  2. Pendant ce temps, préparez un nouveau tampon d’imagerie GLOX-BME (tableau 1).
  3. Amenez les cellules au microscope. Placez la chambre d’imagerie sur la platine du microscope dans le porte-échantillon. Dans le support, assurez-vous que l’échantillon est plat et bien fixé. Changez le milieu dans le puits avec 0,4 mL du tampon d’imagerie GLOX-BME fraîchement préparé.
  4. Réglez la ligne laser et les jeux de filtres appropriés. Diminuez la puissance laser à ~1 mW pour identifier une cellule HeLa d’intérêt. Ajustez le plan focal et l’angle du faisceau laser tout en éclairant l’échantillon avec de faibles densités laser de 647 nm (dans ce cas, un angle fortement incliné [HILO] est suggéré, car HILO augmente le signal à l’arrière-plan [SBR]). Ajustez l’angle d’éclairage HILO.
    REMARQUE: Dans ce protocole, l’imagerie à super-résolution de SseJ a été acquise dans le canal Alexa Fluor 647 à l’aide d’un microscope à épifluorescence inversée (voir le tableau des matériaux), équipé d’un objectif TIRF (objectif d’immersion d’huile Apo TIRF 100x, NA 1.49). La fluorescence a été détectée avec une caméra EMCCD, qui a été contrôlée par μManager.
  5. Réglez le gain du préamplificateur sur 3 et activez le transfert d’images dans μManager. Réglez le gain EM à 200 pour une sensibilité plus élevée dans les mesures dSTORM, comme décrit dans un rapport précédent35.
  6. Avant l’imagerie dSTORM, capturez une image de référence limitée par diffraction de la structure cible. Passez les fluorophores à l’état sombre en allumant le laser à sa puissance maximale.
    NOTE: Des molécules individuelles clignotantes de fluorophores JF646 ont été observées lorsque les fluorophores JF646 ont été transformés en un état principalement sombre par un éclairage continu de lumière d’excitation de 647 nm, comme décrit précédemment36.
  7. Ajustez la force du laser à un niveau approprié où les événements clignotants sont séparés dans l’espace et le temps, réglez le temps d’exposition à 30 ms et commencez l’acquisition. Acquérir 10 000 à 30 000 images.
    REMARQUE: Des changements dans la force du laser doivent être effectués pour optimiser le clignotement. Envisagez d’augmenter l’intensité du laser s’il y a trop d’événements (particules clignotantes qui se chevauchent) détectés. La longueur idéale dépend de la qualité de l’échantillon, mais ~10 000 images doivent présenter des caractéristiques perceptibles.

8. Reconstruction d’images de dSTORM

  1. Utilisez un logiciel approprié pour l’analyse d’images.
    REMARQUE: ThunderSTORM, l’un des nombreux programmes de reconstruction d’images open source disponibles, est brièvement décrit ci-dessous.
  2. Ouvrez ImageJ et importez les données brutes. Ouvrez le plugin ThunderSTORM et configurez le paramètre de caméra correspondant à l’appareil.
  3. Accédez à Exécuter l’analyse et définissez les paramètres appropriés, tels que le filtrage d’image (différence de filtres de moyenne), les méthodes de localisation (maximum local) et la localisation des molécules sous les pixels (PSF gaussien intégré). Cliquez sur OK pour démarrer la reconstruction d’image.
    NOTE: Si nécessaire, des instructions détaillées pour la configuration des paramètres dans ThunderSTORM ont déjà été décrites37.

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Representative Results

Ce document de protocole décrit une méthode basée sur l’ECG pour le marquage fluorescent spécifique au site et la visualisation des effecteurs sécrétés par Salmonella, comme illustré à la figure 1. La structure chimique du groupe bioorthogonal transcyclooctène (TCO) ncAA et du colorant fluorescent est illustrée à la figure 1A. Le marquage SseJ a été réalisé par incorporation génétique de ncAA bioorthogonaux à un codon stop ambre (voir Figure 1B) en utilisant une paire orthogonale aminoacyl-ARNt synthétase/ARNt via la technologie GCE. Le traitement des effecteurs marqués au TCO avec la tétrazine contenant un fluorophore (JF646-Tz ou BDP-Tz) a fourni une autre stratégie de marquage des protéines qui a permis d’observer les effecteurs sécrétés par Salmonella transloqués plusieurs heures après l’infection de l’hôte (Figure 1B,C). Nous avons commencé par identifier les résidus possibles d’acides aminés et sélectionné la position 10 de SseJ pour l’inclusion de ncAA en fonction de l’accessibilité de surface et des connaissances existantes sur les résidus fonctionnels de SseJ. Les données structurelles préalables et les projections d’exposition de surface peuvent aider à choisir des emplacements spécifiques.

Le placement du codon ambre dans le gène codant pour le POI affecte l’efficacité de l’incorporation du TCO. En conséquence, une série de mutants avec des codons ambrés dans diverses positions du gène du POI devrait être créée et analysée pour une efficacité d’intégration optimale. La sélection de la position du codon ambre est empirique. En général, les résidus altérés ne devraient pas être essentiels à la fonction POI, dépourvus de modifications post-traductionnelles et accessibles aux sondes fluorescentes. L’expression plasmide doit être un nombre de copies faible afin qu’il imite le numéro de copie natif du POI. Le contexte du codon affecte l’efficacité avec laquelle un ncAA est incorporé par un système orthogonal d’ARNt / aminoacyl-ARNt synthétase. Alors que AAT-TAG-ACT est le contexte préféré de l’ARNt orthogonal, la position de la phénylalanine-10 de sseJ a été changée en TAG, assurant le contexte AAT-TAG-ACT pour permettre l’incorporation la plus efficace de la NCA. Tout d’abord, nous avons testé si les mutants étaient fonctionnels chez E. coli en utilisant un plasmide à nombre élevé de copies pour exprimer sseJ. Comme en témoigne SDS-PAGE, l’expression du mutant SseJ-F10TCO-HA dépendait de la présence de TCO*A et de l’ARNt/aaRS optimal correspondant (Figure 2A). SseJ-F10FCO-HA a été marqué avec JF646-Tz en utilisant la chimie de clic SPIEDAC dans E. coli. Le marquage fluorescent sélectif de SseJ-F10TCO-HA chez E. coli in vitro a été confirmé par analyse par microscopie à fluorescence (Figure 2B). À l’aide de la GCE, le TCO*A a donc été incorporé spécifiquement au site dans un codon ambré en sseJ. Les tentatives d’identification directe de l’incorporation génomique hors cible des ncAA à l’aide du systèmeARNt Pyl/PylRS AF n’ont produit aucune preuve de leur existence. Cependant, nous recommandons d’utiliser la fluorescence dans le gel, le transfert Western, la protéine de fusion fluorescente, le marquage par fluorescence in vitro et d’autres méthodes pour évaluer l’efficacité, la spécificité, le degré d’incorporation hors cible et la toxicité du plasmide pVOL, comme documenté dans les articles précédemment cités ici12,29.

Une fois que nous avons établi que le TAG supprimé dans sseJ était fonctionnel, nous avons cloné sseJ-F10TCO-HA avec son promoteur natif dans le plasmide à faible nombre de copies pWSK29, assurant un motif AAT-TAG-ACT pour le marquage fluorescent et la visualisation. Le marquage sélectif in vitro de SseJ-F10TCO-HA dans les cellules de Salmonella a été confirmé par microscopie à fluorescence (Figure 3). Nous avons ensuite infecté les cellules HeLa avec la souche Salmonella de type sauvage complétée par p sseJ-HA ou psseJ 10TAG-HA, en l’absence ou en présence de TCO*A pour déterminer si leSseJincorporé au TCO pouvait être transloqué dans les cellules hôtes. Les cellules HeLa infectées ont été fixées avec du PFA et immunocolorées avec des anticorps anti-HA 16 h après l’infection pour mettre en évidence les SIF décorés par SseJ. Comme le montre la figure 4C, SseJ-F10TCO-HA était manifestement sécrété, des SIF dépendants de SseJ se sont formés, et ils ressemblaient à ceux observés dans les cellules infectées de type sauvage (Figure 4A). Cependant, les SIF dépendants de SseJ n’ont pas été observés en l’absence de TCO*A (figure 4B). Ces observations ont démontré que l’expression de sseJ-F10TCO-HA à l’aide de GCE a sauvé des SIF dépendants de SseJ. De plus, les résultats ont également indiqué que SseJ-F10TCO-HA était un facteur de virulence entièrement fonctionnel pour Salmonella.

Après avoir confirmé que le SseJ marqué GCE était fonctionnel et sécrété, nous avons utilisé la réaction SPIEDAC pour marquer SseJ-F10TCO-HA avec JF646-Tz dans les cellules HeLa. Pour ce faire, nous avons infecté les cellules HeLa avec des Salmonella de type sauvage complétées par du p sseJ-F10TCO-HA, en présence de TCO*A. Après marquage avec JF646-Tz à l’aide de deux protocoles alternatifs décrits dans la section 5 du protocole, les cellules ont été lavées abondamment pour éliminer l’excès de colorant, fixées avec PFA et immunocolorées avec un anticorps anti-HA pour visualiser le SseJ-F10TCO-HA sécrété. Le SseJ-F10TCO-HA sécrété dans le cytoplasme des cellules HeLa a été marqué avec JF646-Tz (Figure 5A,B, rouge) et clairement co-localisé avec le marqueur HA (vert). L’observation que les deux étiquettes se chevauchent (l’une un colorant fluorescent, l’autre marquée par immunomarquage), souligne encore la spécificité du marquage CME.

Pour nous assurer que le signal de fluorescence observé dans ces cellules HeLa était spécifique uniquement à l’effecteur sécrété SseJ, nous avons infecté des cellules avec des Salmonella de type sauvage (portant psseJ-HA) en présence de TCO*A et de pEVOL-PylRS-AF. Un colorant à clic a été utilisé pour observer s’il y avait un étiquetage d’arrière-plan dans les cellules HeLa. SseJ a été libéré dans le cytoplasme de la cellule hôte, sans signaux fluorescents intracellulaires ou non spécifiques (Figure 5C), démontrant que le signal de fluorescence était spécifique à SseJ. Après avoir déterminé que les ncAA étaient incorporés spécifiquement à un codon ambre et que le SseJ sécrété pouvait être visualisé dans la cellule hôte via la réaction de clic, l’objectif suivant était de créer une image à super-résolution de SseJ sécrété dans les cellules HeLa (Figure 6). Dans la figure 6, nous démontrons la puissance de GCE et l’utilisation du colorant JF646 pour générer des images super-résolution spécifiques au site de l’effecteur sécrété par Salmonella SseJ dans les cellules HeLa.

Figure 1
Figure 1 : Schéma de marquage fluorescent spécifique au site des effecteurs SPI-2. (A) TCO*A et JF-646-tétrazine. (B) Le schéma représente l’incorporation d’un ncAA dans un effecteur SPI-2. Dans la cellule bactérienne, un plasmide contenant le gène d’un POI effecteur (violet) et une paire ARNt suppresseur orthogonal (rouge)/aminoacyl synthétase (vert) sont introduits. Un codon natif est échangé avec un codon stop ambre (TAG, rouge) dans la séquence du gène effecteur à un endroit permissif. Le ncAA (cercle rouge foncé) est simplement introduit dans le milieu de croissance. Il est ensuite capté par la cellule et atteint le cytosol, où il est lié à l’ARNt orthogonal par l’aminoacyl-ARNt synthétase (aaRS). L’ARNt acylé ncAA avec un anticodon CUA pénètre dans la machinerie ribosomique à la suite du codon ambre complémentaire sur l’ARNm effecteur (violet), incorporant le ncAA attaché dans l’effecteur. Le ncAA est transporté par la chaîne polypeptidique pleine longueur du site effecteur, qui se replie et s’assemble ensuite en une protéine effectrice fonctionnelle. L’effecteur nouvellement produit est transféré dans la cellule hôte par le T3SS. Un fluorophore fourni de l’extérieur peut être utilisé pour marquer un effecteur SPI-2 sécrété intégré à ncAA. (C) Schéma de réaction de clic sans cuivre avec un colorant tétrazine fluorogénique. Grâce à la réaction de clic SPIEDAC, un ncAA avec un groupe alcène contraint incorporé dans un POI (SseJ) réagit avec un colorant couplé à la tétrazine (JF646-Tz). Le colorant fluorogénique couplé à la tétrazine JF646-Tz ne devient fluorescent (rouge) qu’après un marquage réussi. Abréviations : TCO*A = trans-cyclooct-2-en-L-Lysine; ncAA = acide aminé non canonique; T3SS = système de sécrétion de type trois; IPS-2 = Salmonella pathogénicité îlot 2; POI = protéine d’intérêt; SPIEDAC = cycloaddition de Diels-Alder à demande inverse d’électrons promue par déformation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Le TCO*A est incorporé spécifiquement au site dans le SseJ-F10TCO-HA exprimé en E. coli. (A) La FDS-PAGE colorée à Coomassie confirme l’incorporation sélective de TCO*A dans SseJ-F10TCO-HA (indiqué par une flèche rouge) in E. coli. (B) Expression de SseJ-F10TCO-HA chez E. coli analysée par microscopie à fluorescence en l’absence (en haut) ou en présence (en bas) de 1 mM DE TCO*A. Les cellules d’E. coli exprimant SseJ-F10TCO-HA en l’absence ou en présence de TCO*A sont incubées avec BDP-Fl-tétrazine et imagées pour la fluorescence BDP (vert). La fluorescence SseJ (verte) n’est observée qu’en présence du label TCO*A incorporé ; Notez l’absence de fluorescence de fond dans le panneau supérieur. Barre d’échelle = 2 μm. Abréviations : TCO*A = trans-cyclooct-2-en-L-Lysine; BF = fond clair; HA = acide hyaluronique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Le TCO*A est incorporé spécifiquement au site dans le SseJ-F10TCO-HA exprimé dans Salmonella. La microscopie à fluorescence est utilisée pour examiner l’expression de SseJ-F10TCO-HA dans Salmonella en l’absence (en haut) ou en présence (en bas) de 1 mM DE TCO*A. Les salmonelles exprimant SseJ F10TCO-HA sont traitées avec JF646-Tz et imagées pour la fluorescence JF646 (magenta), en présence ou en l’absence de TCO*A. La fluorescence de SseJ (magenta) n’est détectée que lorsque le TCO*A est présent. Barre d’échelle = 2 μm. Abréviations : TCO*A = trans-cyclooct-2-en-L-Lysine; BF = fond clair; HA = acide hyaluronique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Le SseJ-J10TCO-HA sécrété est fonctionnel. (A) Les cellules HeLa sont infectées par Salmonella hébergeant psseJ-HA pendant 16 heures, fixées et immunocolorées avec des anticorps anti-HA (rouge), LPS (vert) et DAPI (bleu). Comme prévu, la formation de SIF dépendants de SseJ est observée dans les cellules infectées. (B) En l’absence de TCO*A, le codon ambre n’est pas supprimé et les SIF dépendants de SseJ sont absents dans les cellules HeLa infectées. Les cellules HeLa sont infectées par Salmonella exprimant SseJ-F10TCO-HA en l’absence de TCO*A pendant 16 heures, fixées et immunocolorées avec des anticorps anti-HA (rouge), LPS (vert) et DAPI (bleu). (C) Des SIF dépendants de SseJ sont observés en présence de TCO*A. Les cellules HeLa infectées avec Salmonella exprimant SseJ-F10TCO-HA en présence de 400 μM TCO*A sont fixées et immunocolorées avec les anticorps anti-HA SseJ (rouge), LPS (vert) et DAPI (bleu). Des SIF dépendants de SseJ sont observés dans le panneau de gauche, indiquant clairement que SseJ a été sauvé par l’expression de sseJ-F10TCO-HA à l’aide de GCE. Barre d’échelle = 10 μm. Abréviations : HA = acide hyaluronique; LPS = lipopolysaccharide; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole; TCO*A = trans-cyclooct-2-en-L-Lysine; SIF = filaments induits par Salmonella; GCE = expansion du code génétique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Spécificité de l’étiquetage du SseJ avec colorant JF646-Tz. (A) Les cellules HeLa sont infectées par Salmonella exprimant SseJ-F10TCO-HA en présence de 400 μM TCO*A. SseJ-F10TCO-HA sécrété par le TCO marqué est marqué avec 2 μM JF646-Tz dans 1x PBS contenant 1% de sel de caséine sodique provenant de lait bovin, largement lavé, fixé et immunocoloré avec un anticorps anti-HA pour visualiser le SseJ sécrété (vert). Le SseJ-F10TCO-HA est sécrété et étiqueté avec un colorant JF646-Tz (rouge, panneau de gauche). Les SseJ étiquetés via GCE (rouge) et HA (vert) sont clairement co-localisés (panneau de droite). (B) En utilisant un protocole d’étiquetage légèrement différent, le SseJ-F10TCO-HA sécrété par marquage TCO est également marqué avec 2 μM JF646-Tz dans un milieu complet DMEM (sans FBS), largement lavé et fixé, et soumis à une coloration par immunofluorescence anti-HA. Le SseJ-F10TCO-HA sécrété est étiqueté avec un colorant JF646-Tz (rouge, panneau de gauche) et co-localisé avec HA (vert). (C) Pour établir en outre que le signal de fluorescence est unique à SseJ et n’est pas un produit d’autres protéines libérées par SPI-2, les cellules HeLa sont infectées par des Salmonella de type sauvage portant psseJ-HA et pEVOL-PylRS-AF, en présence de ncAA (TCO*A). 16 h après l’infection, les cellules HeLa infectées sont traitées avec 2 μM JF646-Tz dans un milieu complet (sans FBS et TCO*A), et l’excès de colorant est soigneusement éliminé à l’aide d’un nouveau milieu de croissance. Les cellules HeLa sont fixées au PFA et soigneusement lavées avec du PBS avant d’être immunocolorées pour SseJ (vert). L’absence de signal de fluorescence de fond visible dans le panneau de gauche (JF646-Tz) indique que presque aucun marquage hors cible ne s’est produit dans les cellules hôtes. Barre d’échelle = 10 μm. Abréviations : HA = acide hyaluronique; PBS = solution saline tamponnée au phosphate; FBS = sérum fœtal bovin; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole; TCO*A = trans-cyclooct-2-en-L-Lysine; SIF = filaments induits par Salmonella; CME = expansion du code génétique; IPS-2 = Salmonella pathogénicité îlot 2; BF = fond clair. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Imagerie à super-résolution de SseJ marqués par la CBE dans des cellules HeLa. Les cellules HeLa sont infectées par Salmonella exprimant SseJ-F10TCO-HA en présence de 400 μM de TCO*a. Le SseJ-F10TCO-HA sécrété par le TCO marqué est marqué avec 2 μM JF646-Tz dans les conditions physiologiques décrites dans le protocole, puis lavé abondamment. Les images sont acquises à l’aide de Nikon N-STORM. (A) Image en fond clair d’une cellule HeLa observée. Barre d’échelle = 10 μm. (B) Image à grand champ limitée par diffraction de SseJ sécrétée étiquetée avec TCO*A et JF-646. Barre d’échelle = 10 μm. (C) Image dSTORM correspondante des SIF décorés par SseJ. Barre d’échelle = 10 μm. C(i) L’encart montre une vue agrandie de SseJ super-résolu dans la région en boîte. Barre d’échelle = 1 μm. Abréviations : HA = acide hyaluronique; TCO*A = trans-cyclooct-2-en-L-Lysine; SIF = filaments induits par Salmonella; CME = expansion du code génétique; WF = grand champ; BF = fond clair. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1. Solutions. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de ce tableau.

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Discussion

L’approche décrite ici a été utilisée pour suivre l’emplacement précis des protéines effectrices injectées dans la cellule hôte par la bactérie T3SS après l’infection. Les T3SS sont utilisés par des agents pathogènes intracellulaires tels que Salmonella, Shigella et Yersinia pour transporter les composants de virulence dans l’hôte. Le développement de technologies d’imagerie à super-résolution a permis de visualiser les facteurs de virulence à une résolution jusque-là inimaginable12,13,24. Cependant, certaines contraintes de marquage ont empêché une enquête plus approfondie, car les fusions de protéines photoactivables bloquent le pore T3SS et ne sont pas sécrétées. En outre, les artefacts de regroupement et les analyses erronées peuvent résulter de la propension inhérente de certaines protéines de fusion à regrouper ou à agréger.

Dans certains cas, la protéine de fusion est également clivée, comme nous l’avons observé précédemment avec PAmCherry-SsaP12,13. Toutes ces contraintes sont surmontées par la CME, qui permet un marquage fluorescent spécifique au site des points d’intérêt. Il permet également la visualisation de protéines qui ne sont pas abondantes12,13. Bien qu’un certain nombre de facteurs puissent affecter l’efficacité de l’incorporation de ncAA à l’aide d’un système orthogonal d’ARNt / aminoacyl-ARNt synthétase, il semble que le contexte du codon soit le plus crucial. L’ARNt orthogonal incorpore un ncAA plus efficacement lorsque le contexte de codon préféré est AATTAGACT33. Dans la figure 5, nous pouvons comparer le marquage net résultant de GCE et d’un fluorophore spécifique au site (ainsi que l’absence de fond) par rapport à l’immunomarquage d’un marquage HA.

En conséquence, les chercheurs seront en mesure de visualiser les points d’intérêt chez les agents pathogènes, les bactéries commensales et les hôtes eucaryotes en utilisant la méthode décrite ici. En bref, les NCA génétiquement codés offrent une approche alternative au marquage des protéines effectrices lorsque les méthodes conventionnelles échouent. Cependant, l’une des principales limites de cette méthode est les propriétés chimiques inhérentes au fluorophore, telles que la perméabilité, la distribution et la rétention de la membrane, qui peuvent avoir un impact sur l’efficacité du marquage fluorescent. Les ncAA fluorescents sont une option alternative pour éviter les réactions de clic12, mais celles-ci ne peuvent être visualisées qu’en utilisant la microscopie à deux photons. Les lecteurs sont invités à consulter une liste de colorants perméables/imperméables à la membrane cellulaire citée dansle présent document 12,38,39,40,41.

En conclusion, nous avons spécifiquement étiqueté et visualisé l’effecteur sécrété par Salmonella SseJ en codant génétiquement pour les ncAA en combinaison avec un fluorophore fluorogénique sans altérer sa fonction biologique. Le marquage de SseJ avec JF646-Tz était très spécifique, et l’imagerie à super-résolution peut également être utilisée pour visualiser les effecteurs sécrétés à l’intérieur des cellules hôtes. Ainsi, le marquage fluorescent des effecteurs bactériens à l’aide de colorants compatibles dSTORM et l’expansion du code génétique ont permis la localisation spatiale subcellulaire des effecteurs sécrétés par les bactéries dans les cellules hôtes, à une résolution inférieure à la limite de diffraction. Comme cette plateforme de marquage est compatible avec le suivi monoparticulaire par imagerie de cellules vivantes, notre méthode permettra d’analyser les protéines effectrices du système T3SS avec des niveaux de résolution temporelle et spatiale sans précédent, ce qui améliorera notre compréhension moléculaire de la pathogenèse bactérienne.

Bien qu’il existe certaines limites, telles qu’une faible efficacité d’incorporation de ncAA et les contraintes photophysiques du fluorophore organique, nous avons démontré que cette approche peut aider les chercheurs à observer et à localiser un effecteur sécrété à l’intérieur des cellules hôtes, même lorsqu’il est rare12,13. Nous prévoyons que l’adaptation de la technologie ouvrira de nouvelles possibilités passionnantes pour l’imagerie et la recherche sur d’autres protéines effectrices produites par les bactéries pendant l’infection. La méthode est également facilement adaptée pour le marquage des virus, ce qui démontre sa grande utilité.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par des fonds de démarrage de la branche médicale de l’Université du Texas, Galveston, TX, et un prix Texas STAR à L.J.K. Nous remercions le Prof. Edward Lemke (European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg, Allemagne) pour le plasmide pEVOL-PylRS-AF. Les images de la figure 1 ont été créées à l’aide de BioRender.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Tris/Glycine SDS running buffer BIO-RAD 1610732
Ammonium chloride Fischer Scientific A661-500
Ammonium sulphate Fischer Scientific BP212R-1
Ampicillin Sodium Sigma-Aldrich A0166 5 g
Antibiotic-Antimycotic (100x) ThermiFischer Scientific 15240096
Arabinose Sigma-Aldrich A3256 500 g
Avanti J-26XP (High-Performance Centrifuge) Beckman Coulter
Bacto-Agar BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA 214010
BDP-FL-tetrazine Lumiprobe (USA) 2.14E+02
β-mercaptoethanol Millipore 444203 250 mL
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B8026
BSA Sigma-Aldrich A4503 500 g
Casein Sigma-Aldrich C8654
Catalase Sigma-Aldrich C9322
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C1919
Click Amino Acid / trans-Cyclooct-2-en – L - Lysine (TCO*A) SiChem GmbH SC-8008 Size: 500 mg
DAPI (Hoechst33342) Invitrogen H3570
DeNovix DS-11+ Spectrophotometer DeNovix
DMEM* Corning 10-013-CV * Used for maintaining HeLa Cell
DMEM** Gibco 11965-092 **Used for bacterial infection in presence of ncAA, see section 5.4.
DMSO Sigma-Aldrich D8418 250 g
Donkey anti-rabbit Alexa fluoro555 secondary antibody Invitrogen A-31572
DPBS, 1x Corning 21-031-CV
E. coli strain BL21 (DE3) Novagen (Madison, WI)
EMCCD Camera Andor iXon Ultra 897-BV
Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 mL (PCR clean) Eppendorf, Hamburg, Germany 30123.328
Fetal Bovine Serum (FBS) Fischer 10082147
Fisherbrand Syringe Filters - Sterile (PVDF 0.22 µm) Fischer Scientific 97203 Pack of 100
Gene Pulser Xcell Electroporator BIO-RAD 1652660
Gentamycin Sigma-Aldrich G1272 10 mL
Gibco L-Glutamine (200 mM), 100x Fischer Scientific 25-030-081
Glucose oxidase Sigma-Aldrich G7141-50KU
Glycerol Fischer Scientific BF229-4
HeLa cells ATTC CCL-2
HEPES Buffer Corning 25-060-C1 100 mL
Hydrocloric acid Fischer Scientific A144-212
ImageJ Image processing and analysis:  http://rsbweb.nih.gov/ij
IntantBlue Expedeon ISB1L Coomassie-based stain
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma-Aldrich I5502
Janelia Fluoro 646-tetrazine Tocris Bioscience 7279
Kanamycin Sigma-Aldrich 60615 5 g
LB Broth BD Difco 244620 500 g
Lysozyme Sigma-Aldrich L6876
μManager (v. 1.4.2) https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release
MES Sigma-Aldrich M3671 250 g
Micro pulser cuvette BIO-RAD 165-2086 0.2 cm electrode gap, pkg. of 50
Nikon N-STORM Nikon Instruments Inc. https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/super-resolution-microscopes/n-storm-super-resolution
Nunc EasYFlask Cell Culture Flasks ThermiFischer Scientific 156499
Omnipur Casamino Acid Calbiochem 2240 500 g
Paraformaldehhyde (PFA) Electron Microscopy Sciences  15710
PBS (10x) Roche 11666789001
Penicillin-Streptomycin Solution (100x) GenDEPOT  CA005-010 100 mL
pEVOL-PylRS-AF For plasmid construction and map see following references
1. Angew Chem Int Ed Engl. 2011, 50(17), 3878-81.
2. Angew Chem Int Ed Engl., 2012, 51, 4166-70.
Plasmid Mini-prep Kit Qiagen 27106
plasmid pWSK29-sseJ10TAG-HA Ref.: elife. 2021, 10, e67789.
plasmid pWSK29-sseJ-HA Ref.: elife. 2021, 10, e67789.                                                                   Vector map of PWSK29: https://www.addgene.org/172972/
Pluronic F-127 Millipore 540025 Protein grade, 10% Solution
Potassium phosphate monobasic Fischer Scientific P285-500
Potassium sulphate Acros Organic 424220250
Protease Inhibitor Cocktail Set I - Calbiochem Sigma-Aldrich 539131 100x Solution
Rabbit anti-HA primary antibody Sigma-Aldrich H6908
S. enterica. serovar Typhimurium 14028s Ref.: PLoS Biol. 2015, 13, e1002116.
Saponin Sigma-Aldrich 47036-50G-F
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich L3771
Sodium hydroxide Fischer Scientific SS255-1
Sodium Pyruvate (100 mM), 100x Corning 25-060-C1 100 mL
Sonic Dismembrator Model 100 Fischer Scientific 24932
STED microsocpe (Leica TCS SP8 STED 3X system) Leica Microsystems, Wetzlar, Germany https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/
ThunderSTORM https://zitmen.github.io/thunderstorm/
Trizma Base Sigma-Aldrich T1503
Trypsin-EDTA (1x), 0.25%   GenDEPOT  CA014-010
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416 100 mL
X-well tissue culture chamber slides SARSTEDT 94.6190.802

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Biologie numéro 192 Salmonella acides aminés non canoniques expansion du code génétique SseJ super-résolution dSTORM
Imagerie à super-résolution de protéines sécrétées par des bactéries à l’aide de l’expansion du code génétique
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Singh, M. K., Kenney, L. J. Super-Resolution Imaging of Bacterial Secreted Proteins Using Genetic Code Expansion. J. Vis. Exp. (192), e64382, doi:10.3791/64382 (2023).

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