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Biology

आनुवंशिक कोड विस्तार का उपयोग करके बैक्टीरियल स्रावित प्रोटीन की सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/64382
Automatic Translation
1, 1
1Biochemistry & Molecular Biology, University of Texas Medical Branch

Summary

यह लेख आनुवंशिक कोड विस्तार (जीसीई) साइट का उपयोग करके साल्मोनेला स्रावित प्रभावकों को लेबल करने के लिए एक सीधा और स्पष्ट प्रोटोकॉल प्रदान करता है- विशेष रूप से और प्रत्यक्ष स्टोकेस्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (डीएसटीओआरएम) का उपयोग करके हेला कोशिकाओं में स्रावित प्रोटीन के उपकोशिकीय स्थानीयकरण की छवि बनाता है।

Abstract

टाइप थ्री स्राव प्रणाली (टी 3 एसएस) ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया को यूकेरियोटिक मेजबान कोशिकाओं के साइटोसोल में सीधे प्रभावक प्रोटीन की एक बैटरी इंजेक्ट करने में सक्षम बनाती है। प्रवेश पर, इंजेक्शन प्रभावक प्रोटीन सहकारी रूप से यूकेरियोटिक सिग्नलिंग मार्गों को संशोधित करते हैं और सेलुलर कार्यों को पुन: प्रोग्राम करते हैं, जिससे जीवाणु प्रवेश और अस्तित्व को सक्षम किया जा सकता है। संक्रमण के संदर्भ में इन स्रावित प्रभावक प्रोटीनों की निगरानी और स्थानीयकरण मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन के गतिशील इंटरफ़ेस को परिभाषित करने के लिए एक पदचिह्न प्रदान करता है। हालांकि, मेजबान कोशिकाओं में उनकी संरचना / कार्य को बाधित किए बिना बैक्टीरिया प्रोटीन को लेबल करना और इमेजिंग करना तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है।

फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन का निर्माण इस समस्या को हल नहीं करता है, क्योंकि संलयन प्रोटीन स्रावी तंत्र को जाम करते हैं और इस प्रकार स्रावित नहीं होते हैं। इन बाधाओं को दूर करने के लिए, हमने हाल ही में आनुवंशिक कोड विस्तार (जीसीई) का उपयोग करके बैक्टीरिया स्रावित प्रभावकों के साथ-साथ अन्य कठिन-से-लेबल प्रोटीन के साइट-विशिष्ट फ्लोरोसेंट लेबलिंग के लिए एक विधि नियोजित की। यह पेपर विशेष रूप से जीसीई साइट का उपयोग करके साल्मोनेला स्रावित प्रभावकों को लेबल करने के लिए एक पूर्ण चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रदान करता है, इसके बाद प्रत्यक्ष स्टोकेस्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (डीएसटीओआरएम) का उपयोग करके हेला कोशिकाओं में स्रावित प्रोटीन के उपकोशिकीय स्थानीयकरण की इमेजिंग के लिए निर्देश दिए जाते हैं।

हाल के निष्कर्ष बताते हैं कि जीसीई के माध्यम से गैर-कैननिकल अमीनो एसिड (एनसीएए) का समावेश, इसके बाद टेट्राज़िन युक्त रंगों के साथ बायो-ऑर्थोगोनल लेबलिंग, बैक्टीरिया स्रावित प्रोटीन के चयनात्मक लेबलिंग और विज़ुअलाइज़ेशन और मेजबान में बाद में छवि विश्लेषण के लिए एक व्यवहार्य तकनीक है। इस लेख का लक्ष्य एक सीधा और स्पष्ट प्रोटोकॉल प्रदान करना है जिसे बैक्टीरिया और वायरस में विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं के साथ-साथ मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए जीसीई का उपयोग करके सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग करने में रुचि रखने वाले जांचकर्ताओं द्वारा नियोजित किया जा सकता है।

Introduction

बैक्टीरियल संक्रमण को लंबे समय से मानव स्वास्थ्य के लिए एक गंभीर खतरा माना जाता है। रोगजनक मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं से बचने और संक्रमण 1,2 स्थापित करने के लिए अत्यधिक विकसित, अत्यंत शक्तिशाली और जटिल रक्षा प्रणालियों के साथ-साथ विभिन्न प्रकार के जीवाणु विषाणु कारकों (प्रभावक प्रोटीन के रूप में संदर्भित) का उपयोग करते हैं। हालांकि, इन प्रणालियों के अंतर्निहित आणविक तंत्र और व्यक्तिगत प्रभावक प्रोटीन की भूमिका अभी भी काफी हद तक अज्ञात है क्योंकि रोगजनन के दौरान मेजबान कोशिकाओं में महत्वपूर्ण प्रोटीन घटकों और प्रभावकों का सीधे पालन करने के लिए उपयुक्त दृष्टिकोण की कमी है।

एक विशिष्ट उदाहरण साल्मोनेला एंटरिका सेरोवर टाइफिमुरियम है, जो तीव्र गैस्ट्रोएंटेराइटिस का कारण बनता है। साल्मोनेला टाइफीम्यूरियम मेजबान कोशिकाओं में सीधे विभिन्न प्रकार के प्रभावक प्रोटीन इंजेक्ट करने के लिए टाइप तीन स्राव प्रणालियों (टी 3 एसएस) का उपयोग करता है। जैसे ही साल्मोनेला मेजबान कोशिका में प्रवेश करता है, यह एक अम्लीय झिल्ली-बाध्य डिब्बे में रहता है, जिसे साल्मोनेला युक्त रिक्तिका (एससीवी) 3,4 कहा जाता है। एससीवी का एसिड पीएच साल्मोनेला रोगजनकता द्वीप 2 (एसपीआई -2) -एन्कोडेड टी 3 एसएस को सक्रिय करता है और मेजबान साइटोसोल 5,6,7,8 में वैक्यूलर झिल्ली में 20 या अधिक प्रभावकारक प्रोटीन की एक श्रृंखला को स्थानांतरित करता है। मेजबान के अंदर, प्रभावक प्रोटीन के ये जटिल कॉकटेल समन्वय रूप से मेजबान सेल सिग्नलिंग मार्गों में हेरफेर करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप सूक्ष्मनलिकाएं के साथ एससीवी से विस्तारित अत्यधिक गतिशील, जटिल ट्यूबलर झिल्ली संरचनाओं का निर्माण होता है, जिसे साल्मोनेला-प्रेरित फिलामेंट्स (एसआईएफ) कहा जाता है, जो साल्मोनेला को मेजबान कोशिकाओं 9,10,11 के भीतर जीवित रहने और दोहराने में सक्षम बनाता है।

बैक्टीरियल प्रभावक स्थानीयकरण की कल्पना, ट्रैक और निगरानी करने के तरीके, और मेजबान कोशिकाओं के अंदर उनकी तस्करी और बातचीत की जांच करते हैं, जीवाणु रोगजनन को रेखांकित करने वाले तंत्र में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं। मेजबान कोशिकाओं के अंदर साल्मोनेला स्रावित टी 3 एसएस प्रभावक प्रोटीन का लेबलिंग और स्थानीयकरण एक तकनीकी चुनौती साबित हुआ है12,13; बहरहाल, आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोसेंट प्रोटीन के विकास ने जीवित प्रणालियों के भीतर प्रोटीन का अध्ययन और कल्पना करने की हमारी क्षमता को बदल दिया है। हालांकि, फ्लोरोसेंट प्रोटीन (~ 25-30 केडीए) 15 का आकार अक्सर रुचि के प्रोटीन (पीओआई; उदाहरण के लिए, एसएसएपी के लिए 13.65 केडीए, एसआईएफए के लिए 37.4 केडीए) के बराबर या उससे भी अधिक होता है। वास्तव में, प्रभावकों के फ्लोरोसेंट प्रोटीन लेबलिंग अक्सर लेबल किए गए प्रभावक के स्राव को अवरुद्ध करते हैं और टी 3 एसएस14 को जाम करते हैं।

इसके अलावा, फ्लोरोसेंट प्रोटीन कम स्थिर होते हैं और फोटोब्लीचिंग से पहले कम संख्या में फोटॉन का उत्सर्जन करते हैं, जिससे सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपिकतकनीकों 16,17,18 में उनका उपयोग सीमित हो जाता है, विशेष रूप से फोटोएक्टिवेशन लोकलाइजेशन माइक्रोस्कोपी (पाम), स्टॉर्म और उत्तेजित उत्सर्जन कमी (एसटीईडी) माइक्रोस्कोपी में। जबकि कार्बनिक फ्लोरोसेंट रंगों के फोटोफिजिकल गुण फ्लोरोसेंट प्रोटीन से बेहतर होते हैं, CLIP / SNAP19,20, स्प्लिट-GFP 21, ReAsH / FLASH22,23, और HA-Tags 24,25 जैसे तरीकों / तकनीकों के लिए एक अतिरिक्त प्रोटीन या पेप्टाइड उपांग की आवश्यकता होती है जो पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन या तस्करी में हस्तक्षेप करके रुचि के प्रभावक प्रोटीन की संरचना-कार्य को खराब कर सकता है। एक वैकल्पिक विधि जो आवश्यक प्रोटीन संशोधन को कम करती है, उसमें जीसीई के माध्यम से अनुवाद के दौरान पीओआई में एनसीएए को शामिल करना शामिल है। एनसीएए या तो फ्लोरोसेंट हैं या क्लिक रसायन विज्ञान 12,13,26,27,28 के माध्यम से फ्लोरोसेंट बनाया जा सकता है।

जीसीई का उपयोग करके, छोटे, कार्यात्मक, जैव-ऑर्थोगोनल समूहों (जैसे एज़ाइड, साइक्लोप्रोपेन, या साइक्लोक्टाइन समूह) के साथ एनसीएए को लक्ष्य प्रोटीन में लगभग किसी भी स्थान पर पेश किया जा सकता है। इस रणनीति में, एक देशी कोडन को पीओआई के जीन में एक निर्दिष्ट स्थिति में एक एम्बर (टीएजी) स्टॉप कोडन जैसे दुर्लभ कोडन के साथ स्वैप किया जाता है। संशोधित प्रोटीन को बाद में एक ऑर्थोगोनल एमिनोसिल-टीआरएनए सिंथेटेस / टीआरएनए जोड़ी के साथ कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है। टीआरएनए सिंथेटेस सक्रिय साइट को केवल एक विशेष एनसीएए प्राप्त करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, जो तब टीआरएनए के 3'-अंत से सहसंयोजक रूप से जुड़ा होता है जो एम्बर कोडन को पहचानता है। एनसीएए को बस विकास माध्यम में पेश किया जाता है, लेकिन इसे सेल द्वारा लिया जाना चाहिए और साइटोसोल तक पहुंचना चाहिए जहां एमिनोसिल-टीआरएनए सिंथेटेस (एएआरएस) इसे ऑर्थोगोनल टीआरएनए से जोड़ सकता है; फिर इसे निर्दिष्ट स्थान पर पीओआई में शामिल किया जाता है (चित्र 1)12 देखें)। इस प्रकार, जीसीई बायो-ऑर्थोगोनल प्रतिक्रियाशील समूहों जैसे कि कीटोन, एज़ाइड, एल्केन, साइक्लोक्टाइन, ट्रांससाइक्लोक्लॉक्टिन, टेट्राज़िन, नॉरबोनेन, α, β-असंतृप्त एमाइड, और बाइसाइक्लो [6.1.0]-नॉनाइन को पीओआई में शामिल करने में सक्षम बनाता है, जो संभावित रूप से पारंपरिक प्रोटीन लेबलिंग विधियों12,26,27,28 की सीमाओं पर काबू पा लेता है।

सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग तकनीकों में हाल के उभरते रुझानों ने आणविक स्तर पर जैविक संरचनाओं की जांच करने के लिए नए रास्ते खोल दिए हैं। विशेष रूप से, स्टॉर्म, एक एकल-अणु, स्थानीयकरण-आधारित, सुपर-रिज़ॉल्यूशन तकनीक, ~ 20-30 एनएम तक सेलुलर संरचनाओं की कल्पना करने के लिए एक अमूल्य उपकरण बन गया है और एक समय में एक अणु की जैविक प्रक्रियाओं की जांच करने में सक्षम है, जिससे इंट्रासेल्युलर अणुओं की भूमिकाओं की खोज होती है जो पारंपरिक पहनावा-औसतअध्ययनों में अभी तक अज्ञात हैं। . एकल-अणु और सुपर-रिज़ॉल्यूशन तकनीकों को सर्वोत्तम रिज़ॉल्यूशन के लिए उज्ज्वल, फोटोटेबल कार्बनिक फ्लोरोफोरेस के साथ एक छोटे टैग की आवश्यकता होती है। हमने हाल ही में प्रदर्शित किया कि जीसीई का उपयोग सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग12 के लिए उपयुक्त जांच को शामिल करने के लिए किया जा सकता है।

कोशिकाओं में प्रोटीन लेबलिंग के लिए दो सबसे अच्छे विकल्प बाइसाइक्लो [6.1.0] नॉनयनेलिसिन (बीसीएन) और ट्रांस-साइक्लोएक्टिन-लाइसिन (टीसीओ; चित्रा 1 में दिखाए गए) हैं, जिन्हें आनुवंशिक रूप से टीआरएनए / सिंथेटेस जोड़ी के एक संस्करण का उपयोग करके एन्कोड किया जा सकता है (जिसे यहां टीआरएनएपाइल / पाइलआरएसएएफ कहा जाता है), जहां पाइल पाइरोलिसिन का प्रतिनिधित्व करता है, और एएफ एक तर्कसंगत रूप से डिज़ाइन किए गए डबल म्यूटेंट (वाई 306 ए, वाई 384 एफ) का प्रतिनिधित्व करता है जो स्वाभाविक रूप से मेथानोसिन से प्राप्त होता है। 29,30,31. तनाव-प्रचारित व्युत्क्रम इलेक्ट्रॉन-मांग डाइल्स-एल्डर साइक्लोडिशन (एसपीआईईडीएसी) प्रतिक्रिया के माध्यम से, ये अमीनो एसिड टेट्राज़िन संयुग्म (चित्रा 1) 12,30,31 के साथ केमोसेलेक्टिव रूप से प्रतिक्रिया करते हैं। इस तरह की साइक्लोडिशन प्रतिक्रियाएं असाधारण रूप से तेज और जीवित कोशिकाओं के साथ संगत हैं; वे फ्लोरोजेनिक भी हो सकते हैं, अगर एक उपयुक्त फ्लोरोफोरे को टेट्राज़िन मोइटी12,26,32 के साथ कार्यात्मक किया जाता है। यह पेपर जीसीई का उपयोग करके मेजबान कोशिकाओं में वितरित जीवाणु प्रभावकों की गतिशीलता की निगरानी के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है, इसके बाद डीएसटीआरएम का उपयोग करके हेला कोशिकाओं में स्रावित प्रोटीन का उपकोशिकीय स्थानीयकरण होता है। परिणामों से संकेत मिलता है कि जीसीई के माध्यम से एक एनसीएए का समावेश, इसके बाद फ्लोरोजेनिक टेट्राज़िन-असर रंगों के साथ एक क्लिक प्रतिक्रिया, चयनात्मक लेबलिंग, स्रावित प्रोटीन के विज़ुअलाइज़ेशन और बाद में मेजबान में उप-सेलुलर स्थानीयकरण के लिए एक बहुमुखी विधि का प्रतिनिधित्व करती है। हालांकि, यहां विस्तृत सभी घटकों और प्रक्रियाओं को समायोजित या प्रतिस्थापित किया जा सकता है ताकि जीसीई प्रणाली को अन्य जैविक प्रश्नों की जांच के लिए अनुकूलित किया जा सके।

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Protocol

1. प्लास्मिड निर्माण

  1. पीओआई को व्यक्त करने वाले जीन को एक अभिव्यक्ति प्लास्मिड (जैसे, पीईटी 28 ए-एसएसईजे10टीएजी) में क्लोन करें जो ई कोलाई बीएल 21 (डीई 3) में पीओआई को व्यक्त करता है। यह कदम यह निर्धारित करने में सुविधा प्रदान करता है कि उत्परिवर्ती कार्यात्मक हैं।
  2. मेजबान कोशिकाओं में साल्मोनेला स्रावित प्रभावकों के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए, एक अभिव्यक्ति प्लास्मिड (pWSK29-sseJ-HA) का निर्माण करें जो अपने मूल प्रमोटर के नियंत्रण में लक्ष्य POI SSEJ को व्यक्त करता है, जैसा कि पिछली रिपोर्ट 7,12,24 में वर्णित है। साइट-निर्देशित म्यूटेनेसिस का उपयोग करके, फेनिलएलनिन -10 के कोडन को एसएसईजे (पीडब्ल्यूएसके 29-एसएसईजे 10टीएजी-एचए) में एम्बर कोडन(टीएजी) के साथ बदलें, एएटी-टैग-एसीटी मोटिफ 33,34 सुनिश्चित करें।
  3. उपरोक्त प्लास्मिड के अलावा, पीओआई में ट्रांस-साइक्लोक्ट-2-एन-एल-लाइसिन (टीसीओ * ए) के आनुवंशिक समावेश के लिए, एक और अभिव्यक्ति प्लास्मिड (पीईवीओएल-पाइलआरएस-एएफ) 31 का उपयोग करें जिसमें प्लास्मिड पीईवीओएल में एन्कोड किए गए विकसित टीआरएनए / सिंथेटेस जोड़ी (टीआरएनएपाइल / पाइलआरएसएएफ ) जीन शामिल हैं।
    नोट: प्लास्मिड और क्लोनिंग प्रोटोकॉल का विस्तृत विवरण पिछली रिपोर्ट30,31 में वर्णित है।
  4. उच्च गुणवत्ता वाले प्लास्मिड डीएनए प्राप्त करने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्लास्मिड तैयारी किट का उपयोग करें। शुद्ध डीएनए के लिए, इष्टतम 260/280 अनुपात ~ 1.8 है। यदि आवश्यक हो, तो 1% अगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करके डीएनए शुद्धता की जांच करें।

2. बैक्टीरियल कल्चर की तैयारी

  1. ई कोलाई में उत्परिवर्ती कार्यात्मक है, यह परीक्षण करने के लिए डबल ट्रांसफॉर्मेंट्स प्राप्त करना
    1. बीएल 21 सक्षम कोशिकाओं को -80 डिग्री सेल्सियस से बाहर निकालें और लगभग 20-30 मिनट के लिए बर्फ पर पिघलें।
    2. प्रत्येक प्लास्मिड के 1-5 μL (~ 50 ng pEVOL-PylRS-AF और pET28a-sseJ 10TAG) को रासायनिक रूप से सक्षम BL21 कोशिकाओं के 200 μL के साथ 1.5 mL माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में मिलाएं। सक्षम कोशिकाओं और प्लास्मिड मिश्रण को धीरे से मिलाएं; बर्फ पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    3. 45 सेकंड के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब को गर्मी-झटका दें। ट्यूबों को 2 मिनट के लिए बर्फ पर वापस रखें।
    4. माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 1 एमएल गर्म एलबी माध्यम जोड़ें और मिश्रण को जल्दी से 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 250 आरपीएम पर एक शेकर में इनक्यूबेट करें। उचित एंटीबायोटिक दवाओं वाले एलबी एगर प्लेटों पर कुछ हिस्से या सभी रूपांतरित कोशिकाओं को प्लेट करें। प्लेटों को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: इस प्रोटोकॉल में, क्रमशः pEVOL-PylRS-AF और pET28a-sseJ 10TAG का चयन करने के लिए 35 μg / mL क्लोरैम्फेनिकॉल और 50 μg / mL kanamycin काउपयोग किया गया था। परिवर्तन चरण में, नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रणों का उपयोग करके सफल परिवर्तन का मूल्यांकन करें।
  2. मेजबान कोशिकाओं में साल्मोनेला स्रावित प्रभावकों के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए उत्परिवर्ती को साल्मोनेला में स्थानांतरित करें:
    1. एक ठंडे माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में इलेक्ट्रोकॉम्पिटेंट साल्मोनेला टाइफिमुरियम स्ट्रेन 14028 के 40-60 μL में PEVOL-PylRS-AF और pWSK29-sseJ 10TAG के प्रत्येक 2-3 μL जोड़ें। मिश्रण को पिपेट के साथ धीरे से मिलाएं।
    2. इलेक्ट्रोपोरेशन मिश्रण को एक ठंडा (0.2 सेमी इलेक्ट्रोड गैप) क्यूवेट में स्थानांतरित करें; इलेक्ट्रोपोरेशन सेटिंग्स को 2.5 केवी, 200 Ω, 25 μF पर सेट करें। क्यूवेट को इलेक्ट्रोपोरेशन कक्ष के अंदर रखें। सुनिश्चित करें कि चैंबर इलेक्ट्रोड माइक्रो पल्सर क्यूवेट के साथ दृढ़ संपर्क बनाता है।
    3. पल्स बटन को दबाकर रखें जब तक कि यह बीप न हो जाए।
    4. तुरंत क्यूवेट में 1 एमएल गर्म एलबी माध्यम जोड़ें। पूरी सामग्री को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। कोशिकाओं को 1 घंटे के लिए 250 आरपीएम पर झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    5. एलबी एगर प्लेट पर साल्मोनेला के इलेक्ट्रोपोरेशन मिश्रण के कुछ हिस्से या सभी को उचित एंटीबायोटिक्स युक्त प्लेट करें। प्लेटों को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: इस प्रोटोकॉल में, क्रमशः pEVOL-PylRS-AF और pWSK29-sseJ 10TAG के चयन के लिए 35μg / mL chloramphenicol और 100 μg / mL एम्पीसिलीन काउपयोग किया गया था।
  3. संस्कृति की तैयारी
    1. एलबी माध्यम के 5 एमएल में साल्मोनेला या ई कोलाई की एक एकल कॉलोनी को उपयुक्त एंटीबायोटिक्स युक्त टीका लगाएं। रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ें, 250 आरपीएम पर हिलें।

3. एनसीएए-असर प्रोटीन की अभिव्यक्ति और फ्लोरोसेंट लेबलिंग

  1. ई कोलाई में एनसीएए-असर प्रोटीन की अभिव्यक्ति
    1. प्राथमिक संस्कृति के 100 μL को 5 mL LB माध्यम (1:50 तनुकरण) में स्थानांतरित करें जिसमें 35 μg/mL chloramphenicol और 50 μg/mL kanamycin होता है, इसके बाद 37 °C पर इनक्यूबेशन होता है और 250 आरपीएम पर हिलता है जब तक किOD 600 0.4-0.6 तक नहीं पहुंच जाता।
    2. 1 mM TCO * एक स्टॉक समाधान (10 एमएल) तैयार करें; तालिका 1)।
    3. जब संस्कृतियांOD 600 = 0.4–0.6 तक पहुंच जाती हैं, तो एलबी मीडिया को ताजा एलबी के साथ बदलें जिसमें 1 mM TCO * A, 35 μg / mL chloramphenicol, और 50 μg / mL kanamycin हो।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, टीसीओ * एक स्टॉक समाधान तैयार किया जा सकता है जैसा कि चरण 5.4.2 में वर्णित है।
    4. 1 एमएम आईपीटीजी, 0.2% अरबिनोज की उपस्थिति में प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करें और 34 डिग्री सेल्सियस, 250 आरपीएम पर रात भर शेक करें। 11,000 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा जीवाणु कोशिकाओं को काटें। सतह पर तैरने वाले को हटा दें और आगे के उपयोग तक गोली को -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें।
    5. एक नियंत्रण प्रयोग के लिए, एक ही प्रयोग दोहराएं लेकिन एनसीएए की अनुपस्थिति में एनसीएए-असर प्रोटीन को व्यक्त करें। ई कोलाई में एनसीएए-असर प्रोटीन के इन विट्रो फ्लोरोसेंट लेबलिंग के लिए, चरण 3.3 में वर्णित विस्तृत प्रक्रिया का पालन करें।
  2. साल्मोनेला में एनसीएए-असर प्रोटीन की अभिव्यक्ति
    1. प्राथमिक संस्कृति के 100 μL को 5 mL LB माध्यम (1:50 तनुकरण) में स्थानांतरित करें जिसमें 35 μg/mL chloramphenicol और 100 μg/mL एम्पीसिलीन होता है, इसके बाद 37 °C पर इनक्यूबेशन होता है और 250 आरपीएम पर हिलता है जब तकOD 600 0.6 तक नहीं पहुंच जाता है।
    2. तालिका 1 में वर्णित संशोधित एन-न्यूनतम माध्यम (MgM, pH 5.6) तैयार करें।
    3. एलबी माध्यम को संशोधित एन-न्यूनतम माध्यम (एमजीएम) के साथ बदलें जो 1 एमएम टीसीओ * ए (तालिका 1) के साथ पूरक है। 30 मिनट के लिए बैक्टीरिया को 34 डिग्री सेल्सियस पर उगाएं। फिर, 0.2% अरबिनोज, 25 मिलीग्राम / एमएल क्लोरैम्फेनिकॉल, और 100 मिलीग्राम / एमएल एम्पीसिलीन जोड़ें, और कोशिकाओं को 6 घंटे के लिए बढ़ाएं, 250 आरपीएम पर हिलें।
    4. 6 घंटे के बाद, बैक्टीरिया को 30 मिनट के अंतराल पर 4 गुना धो लें, ताजा एमजीएम (पीएच 5.6) मीडिया (तालिका 1) के साथ एनसीएए के बिना। धोने के चरणों में, कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 972 × ग्राम का उपयोग करें।
    5. बैक्टीरिया को सेंट्रीफ्यूज करें, 1x PBS बफर में पुन: निलंबित करें, और अतिरिक्त ncAAs को हटाने के लिए अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। 1 घंटे के बाद, बैक्टीरिया को 3,000 × ग्राम, 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें और आगे के उपयोग के लिए स्टोर करें।
    6. एक नियंत्रण प्रयोग के लिए, एनसीएए की अनुपस्थिति में एनसीएए-असर प्रोटीन व्यक्त करके एक ही प्रयोग को दोहराएं।
  3. साल्मोनेला टाइफिमुरियम में एनसीएए-असर प्रोटीन की इन विट्रो फ्लोरेसेंस लेबलिंग
    1. 1x PBS में TCO* A (चरण 3.2 से) की अनुपस्थिति या उपस्थिति में SSEJ-F10TCO-HA को व्यक्त करने वाली साल्मोनेला कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। पीबीएस मेंOD 600 से 4 समायोजित करें। कोशिकाओं को अंधेरे में 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 μM जेनेलिया फ्लोर 646-टेट्राज़िन (JF646-Tz) या 20 μM BDP-Fl-टेट्राज़िन (DMSO में 5 mM स्टॉक समाधान) के साथ इनक्यूबेट करें और 250 आरपीएम पर 1-2 घंटे के लिए हिलाएं।
    2. कोशिकाओं को छर्रों पर 3-4x को 5% DMSO और 0.2% Pluronic F-127 युक्त PBS के साथ धोएं, 5% DMSO युक्त PBS में पुन: निलंबित करें, और अंधेरे में 4 °C पर रात भर इनक्यूबेट करें। 2x को फिर से 1x PBS से धो लें। धोने के चरणों में, कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 972 × ग्राम का उपयोग करें।
    3. एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कोशिकाओं को तुरंत चित्रित करें या अंधेरे में कमरे के तापमान पर 30-45 मिनट के लिए पीबीएस में 1.5% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के साथ उन्हें ठीक करें।
    4. पीबीएस के साथ निश्चित कोशिकाओं को 2x और अंत में पीबीएस में 50 mM NH4 Clमें 15 मिनट के लिए धोएं ताकि अतिरिक्त पीएफए को हटाया जा सके। पीबीएस में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और 3-4 दिनों से अधिक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। खंड 6 में वर्णित के रूप में कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके बैक्टीरिया की छवि बनाएं।

4. एनसीएए-असर प्रोटीन का जैव रासायनिक लक्षण वर्णन

  1. सेल लाइसिस
    1. लाइसिस बफर (तालिका 1) में खंड 3.1 से कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें और 30 मिनट से अधिक समय तक कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। मिश्रण को बर्फ पर 15 मिनट के लिए ठंडा करें।
      नोट: लाइसिस बफर का अनुपात सेल वजन के लिए 1: 10 तक रखें।
    2. बर्फ पर रहते हुए पुन: निलंबित कोशिकाओं को सोनिकेट करें। सोनिकेटर का उपयोग करके 1 मिनट अंतराल के साथ 7 को कम से कम 6x सेट करने पर 30 सेकंड के लिए पल्स (सामग्री की तालिका देखें)।
    3. सेल लाइसेट को 20,500 × ग्राम, 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर घुमाएं (4 डिग्री सेल्सियस बनाए रखना महत्वपूर्ण है)। सुपरनैटेंट को एक ताजा ट्यूब में स्थानांतरित करें और गोली को छोड़ दें।
  2. एसडीएस-पेज विश्लेषण
    1. 5x SDS लोडिंग डाई तैयार करें (तालिका 1)। सेल लाइसेट के 13 μL में एसडीएस जेल लोडिंग बफर का 5 μL जोड़ें। सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) नमूना बफर के साथ प्रोटीन को 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर 2 एमएल ट्यूब में डिनेचर करें, मिश्रण को 50 सेकंड के लिए 2,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें, और 12% एसडीएस पॉलीक्रिलामाइड जेल पर लोड करें।
    2. जेल कैसेट को इकट्ठा करें, इसे जेल वैद्युतकणसंचलन तंत्र में रखें, और वैद्युतकणसंचलन तंत्र को विद्युत शक्ति आपूर्ति से कनेक्ट करें। रनिंग बफर डालें, आणविक भार मार्करों और प्रोटीन नमूनों को लोड करें, और जेल को 100 वी पर चलाएं, जब तक कि ब्रोमोफेनोल समाधान जेल के तल तक न पहुंच जाए।
      नोट: विश्लेषण तुरंत शुरू करें, क्योंकि -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत लाइसेट प्रत्येक फ्रीज-पिघलना चक्र के बाद गुणवत्ता खो देते हैं।
    3. जेल को कूमासी ब्लू प्रोटीन दाग के साथ दाग दें।

5. हेला कोशिकाओं में साल्मोनेला स्रावित प्रभावक एसएसईजे-एफ 10टीसीओ-एचए के बायो-ऑर्थोगोनल लेबलिंग

  1. उच्च ग्लूकोज (4.5 ग्राम /एल) डलबेको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) में 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2, और 95% आर्द्रता पर हेला कोशिकाओं को कल्चर और बनाए रखें, जो पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (1x) के अलावा 10% (वी / वी) एफबीएस के साथ पूरक है।
  2. संक्रमण से 1 दिन पहले कल्चर बैक्टीरिया। साल्मोनेला 14028 की एक कॉलोनी को एंटीबायोटिक युक्त मानक एलबी शोरबा के 5 एमएल में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर 250 आरपीएम पर हिलाते हुए टीका लगाएं।
  3. संक्रमण से 1 दिन पहले बीज हेला कोशिकाएं। सेल घनत्व की सूक्ष्म परीक्षा द्वारा निर्धारित एक ऊतक संवर्धन फ्लास्क (टी -75) लें जिसमें ~ 80% कंफ्लुएंसी पर हेला कोशिकाएं होती हैं। गर्म पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोएं। कोशिकाओं को 3 एमएल गर्म 0.25% ट्रिप्सिन / ईडीटीए के साथ 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर अलग करें।
    1. डीएमईएम (+ 10% एफबीएस) के 2 एमएल का उपयोग करके ट्रिप्सिन को बुझाएं। कोशिकाओं को पुन: निलंबित करने के बाद फ्लास्क की पूरी सामग्री को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए 1,000 × ग्राम पर घुमाएं। सुपरनैटेंट को ट्यूब से बाहर निकालें। पूर्व-विकास माध्यम में हेला सेल गोली को पुन: निलंबित करें।
    2. निलंबन की जांच करने और मौजूद कोशिकाओं की गणना करने के लिए हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करें। 1 से 105 कोशिकाओं / एमएल पर एक पतला सेल स्टॉक तैयार ×। बीज 0.5 × 105 हेला कोशिकाएं प्रति कुएं डीएमईएम के 500 μL + 10% FBS विकास माध्यम में आठ-वेल चैंबर स्लाइड में। एक इनक्यूबेटर में कक्ष स्लाइड को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2, 95% आर्द्रता पर 24 घंटे के लिए रखें।
  4. बैक्टीरियल संक्रमण
    1. उपसंस्कृति साल्मोनेला 14028 में पीईवीओएल-पाइलआरएस-एएफ और पीडब्ल्यूएसके29-एसएसईजे 10टीएजी को 100 डिग्री सेल्सियस (चरण 5.2 से) एलबी माध्यम (1:30 कमजोर पड़ने) में पतला करके 35 μg/mL क्लोरैम्फेनिकॉल और 100 μg/mL एम्पीसिलीन होता है, इसके बाद 37 डिग्री सेल्सियस पर 5-7 घंटे के लिए 250 डिग्री सेल्सियस पर झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन होता है।
      नोट: इस चरण के दौरान, संस्कृतियां देर से घातीय चरण तक पहुंचती हैं, और बैक्टीरिया अत्यधिक आक्रामक होते हैं।
    2. 100 mM TCO * एक स्टॉक समाधान और पूर्ण मीडिया तैयार करें (तालिका 1)।
    3. हेला सेल संक्रमण शुरू करने के लिए, इनक्यूबेटर से हेला कोशिकाओं को बाहर निकालें और प्रत्येक कुएं में ताजा डीएमईएम (+10% एफबीएस) के 500 μL जोड़ने से पहले कोशिकाओं को पूर्वनिर्मित DPBS के साथ धो लें। संक्रमण शुरू होने तक कक्ष स्लाइड को सीओ2 इनक्यूबेटर में वापस रखें।
    4. इनक्यूबेशन के 5-7 घंटे के बाद, डीएमईएम विकास माध्यम (~ 3 ×10 8 सीएफयू / एमएल) के 1 एमएल में साल्मोनेला संस्कृति को ओडी 600 = 0.2 तक पतला करें। चैंबर स्लाइड के प्रत्येक कुएं में साल्मोनेला इनोकुलम की आवश्यक मात्रा जोड़ें ताकि संक्रमण की बहुलता (एमओआई) 100 हो।
    5. संक्रमित कोशिकाओं को 30 मिनट के लिए सीओ2 इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें। बाह्य साल्मोनेला को हटाने के लिए कोशिकाओं को 3x को पूर्वनिर्मित DPBS के साथ धोएं। संक्रमण के बाद इस समय बिंदु को 0 घंटे पर सेट करें। 1 घंटे के लिए पूर्ण माध्यम (तालिका 1) का 500 μL जोड़ें जिसमें 100 μg/mL gentamicin हो। 1 घंटे के बाद, कोशिकाओं को डीपीबीएस के साथ 3x धो लें। पूर्ण माध्यम का 500 μL जोड़ें (चरण 5.4.2 से; तालिका 1) कक्ष स्लाइड के प्रत्येक कुएं में 0.2% अरबिनोज, 10 μg / mL gentamicin के साथ पूरक।
    6. एक नियंत्रण प्रयोग में, टीसीओ * ए के बिना हेला कोशिकाओं के समान संक्रमण करें।
    7. सीओ2 इनक्यूबेटर में 10 घंटे के लिए चैंबर स्लाइड को इनक्यूबेट करें।
  5. लाइव कोशिकाओं में रसायन विज्ञान-आधारित लेबलिंग पर क्लिक करें
    1. बैक्टीरिया संक्रमित कोशिकाओं को लेबल करने के लिए आगे बढ़ें। टीसीओ * ए के बिना पूर्ण माध्यम को पूर्ववत करें (तालिका 1)।
    2. संक्रमण के 10 घंटे बाद, टीसीओ * ए के बिना पूरे माध्यम को ताजा पूर्ण माध्यम से बदलें और हेला कोशिकाओं को 30 मिनट के अंतराल पर 4 गुना पहले से डीपीबीएस के साथ धोएं, इसके बाद ताजा पूर्ण माध्यम (टीसीओ * ए के बिना)।
    3. डीएमएसओ में 0.5 एमएम डाई-टेट्राज़िन स्टॉक समाधान तैयार करें।
      नोट: मेजबान कोशिकाओं में साल्मोनेला स्रावित प्रभावकों को लेबल करने के लिए, दो प्रोटोकॉल प्रस्तुत किए जाते हैं। प्रोटोकॉल 1 के लिए, गोजातीय दूध से 1% कैसिइन सोडियम नमक युक्त 1x PBS में JF646-TZ स्टॉक को पतला करके डाई मिश्रण तैयार करें ताकि अंतिम कार्यशील समाधान 2 μM हो। प्रोटोकॉल 2 के लिए, गर्म पूर्ण माध्यम (एफबीएस और टीसीओ * ए के बिना) तैयार करें और 2 μM JF646-Tz जोड़ें। प्रत्येक लेबलिंग सत्र के लिए इस डाई मिश्रण को ताजा बनाएं। यदि संभव हो तो अंधेरे में काम करें (हुड और / या कमरे में रोशनी को मंद करें)।
    4. संक्रमण के 12 घंटे बाद, कोशिकाओं से माध्यम को हटा दें। सेल को प्रीवार्ड डीपीबीएस 2x या 3x से धो लें। कुओं के एक समूह में, प्रोटोकॉल 1 में वर्णित डाई समाधान मिश्रण का 500 μL जोड़ें, और उसी कक्ष स्लाइड के कुओं के दूसरे समूह में, चरण 5.5.3 में उल्लिखित प्रोटोकॉल 2 में वर्णित डाई समाधान मिश्रण का 500 μL जोड़ें और उसके बाद नोट जोड़ें। कक्ष स्लाइड को 1.5-2 घंटे के लिए सीओ2 इनक्यूबेटर में वापस रखें।
    5. संक्रमण के बाद 13.5-14 घंटे के बाद, हेला कोशिकाओं को 2x को पूर्वनिर्मित डीपीबीएस के साथ धो लें। ताजा डीएमईएम (एफबीएस के साथ पूरक) के 500 μL जोड़ें। कक्ष स्लाइड को 30 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में वापस रखें। कोशिकाओं को प्रीवार्ड डीपीबीएस के साथ धोएं और उसके बाद 30 मिनट के अंतराल पर ताजा डीएमईएम 4 एक्स लें।
    6. संक्रमण के बाद 16 घंटे पर, प्रत्येक कुएं में 4% पीएफए के 200 μL जोड़कर और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करके पीएफए के साथ हेला कोशिकाओं को ठीक करें। पीएफए से एस्पिरेट करें, पीबीएस के साथ 3 एक्स कुल्ला करें, और पीबीएस में कोशिकाओं को अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: पीएफए एक अत्यधिक विषाक्त रसायन है। साँस लेने से बचें, साथ ही त्वचा और आंखों के संपर्क से बचें। हैंडलिंग करते समय सुरक्षात्मक उपकरण पहनें। लेबल किए गए नमूने को प्रकाश के संपर्क में आने से बचने के लिए, सेल कल्चर हुड में प्रकाश बंद कर दें।
  6. एचए-टैग किए गए प्रोटीन का इम्यूनोस्टेनिंग
    1. पीबीएस को बंद करें और घोल को अवरुद्ध करने में एक बार कुल्ला करें (तालिका 1)।
    2. अंधेरे में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए पीबीएस-आधारित प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान (तालिका 1) के साथ निश्चित हेला कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। स्रावित एसएसईजे (1: 500 कमजोर पड़ने) को दागने के लिए खरगोश विरोधी एचए प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करें।
    3. 1 घंटे के बाद, धीरे से कोशिकाओं को 2x को 0.1% ट्वीन -20/1x PBS के 0.5 mL के साथ धोएं। पीबीएस समाधान के साथ धोने के दौरान, कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए 0.1% ट्वीन 20/1x पीबीएस के 0.5 एमएल के साथ 3x इनक्यूबेट करें।
    4. द्वितीयक एंटीबॉडी गधे विरोधी खरगोश 555 1:500 को द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान में पतला करें और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    5. 1 घंटे के बाद, धीरे से कोशिकाओं को 2x को 0.1% ट्वीन -20/1x PBS के 0.5 mL के साथ धोएं और 5 मिनट के लिए 0.1% Tween20/1x PBS के 0.5 एमएल के साथ 2x को इनक्यूबेट करें।
    6. कोशिकाओं को 1x PBS के 0.5 mL के साथ 3x धोएं और उन्हें अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: निश्चित कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में कुछ हफ्तों के लिए संग्रहीत किया जा सकता है। इम्यूनोस्टेनिंग अंतिम मिनट में किया जाना चाहिए।

6. कॉन्फोकल इमेजिंग

  1. कंफोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करें, जैसे कि स्पिनिंग डिस्क (एसडी) या एसटीईडी माइक्रोस्कोप।
    1. छवि अधिग्रहण सेटिंग्स समायोजित करें, जैसे स्कैन मोड (XYZ), स्कैनिंग गति (400 हर्ट्ज), रिज़ॉल्यूशन (512 x 512), आवर्धन (100x), और Z-स्टैकिंग।
    2. DAPI, BDP-TZ, और JF646 टेट्राज़िन के लिए सही उत्तेजना / उत्सर्जन फ़िल्टर का उपयोग करें।
      नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए, कॉन्फोकल इमेजिंग को स्पंदित सफेद प्रकाश लेजर से लैस एक एसटीईडी माइक्रोस्कोप सिस्टम पर किया गया था, जिससे 470-670 एनएम की सीमा में उत्तेजना का चयन और 405 एनएम, 488 एनएम और 647 एनएम पर उत्तेजना के लिए यूवी 405 एनएम डायोड लेजर का चयन किया जा सकता है। कॉन्फोकल सिस्टम के प्रिज्म-आधारित ट्यूनेबल मल्टीबैंड स्पेक्ट्रल डिटेक्शन के संयोजन में अंतर्निहित एकोस्टो-ऑप्टिकल बीम स्प्लिटर का उपयोग करके उपयुक्त उत्सर्जन रेंज स्थापित की गई थी।
    3. 100×/1.4 तेल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग करके छवियों को प्राप्त करें।

7. सुपर-रिज़ॉल्यूशन (डीएसटीओआरएम) इमेजिंग

  1. थर्मल संतुलन की अनुमति देने के लिए इमेजिंग से 3 घंटे पहले माइक्रोस्कोप चालू करें (यदि इससे पहले इमेजिंग शुरू होती है तो बहाव होने की अधिक संभावना है)। कैमरे को -70 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें।
  2. इस बीच, ताजा ग्लॉक्स-बीएमई इमेजिंग बफर तैयार करें (तालिका 1)।
  3. कोशिकाओं को माइक्रोस्कोप में लाएं। नमूना धारक में माइक्रोस्कोप चरण पर इमेजिंग कक्ष रखें। धारक में, सुनिश्चित करें कि नमूना सपाट और सुरक्षित है। ताजा बनाए गए ग्लोक्स-बीएमई इमेजिंग बफर के 0.4 एमएल के साथ कुएं में माध्यम बदलें।
  4. सही लेजर लाइन और फ़िल्टर सेट सेट करें। रुचि के हेला सेल की पहचान करने के लिए लेजर शक्ति को ~ 1 मेगावाट तक कम करें। कम 647 एनएम लेजर घनत्व के साथ नमूने को रोशन करते समय फोकल प्लेन और लेजर बीम कोण को समायोजित करें (इस मामले में, एक तेजी से झुकाव वाले कोण [HILO] का सुझाव दिया जाता है, क्योंकि HILO सिग्नल-टू-बैकग्राउंड [SBR] को बढ़ाता है)। HILO रोशनी कोण समायोजित करें।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में, एसएसईजे की सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग को एलेक्सा फ्लूर 647 चैनल में एक उल्टे, एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके अधिग्रहित किया गया था, जो टीआईआरएफ उद्देश्य (100x एपो टीआईआरएफ तेल विसर्जन उद्देश्य, एनए 1.49) से लैस था। प्रतिदीप्ति का पता एक ईएमसीसीडी कैमरे के साथ लगाया गया था, जिसे μManager के माध्यम से नियंत्रित किया गया था।
  5. प्रीएम्पलीफायर लाभ को 3 पर सेट करें और फ्रेम ट्रांसफर को 3मैनेजर में सक्रिय करें। डीस्टॉर्म माप में उच्च संवेदनशीलता के लिए ईएम-लाभ को 200 पर सेट करें, जैसा कि पिछली रिपोर्ट35 में वर्णित है।
  6. डीएसटीओआरएम इमेजिंग से पहले, लक्ष्य संरचना की एक संदर्भ विवर्तन-सीमित छवि को कैप्चर करें। लेजर को उसकी अधिकतम शक्ति पर चालू करके फ्लोरोफोरेस को अंधेरे अवस्था में स्विच करें।
    नोट: जेएफ 646 फ्लोरोफोरे के व्यक्तिगत, तेजी से पलक झपकते अणुओं को देखा गया था जब जेएफ 646 फ्लोरोफोरे को 647 एनएम उत्तेजना प्रकाश की निरंतर रोशनी द्वारा मुख्य रूप से अंधेरे अवस्था में बदल दिया गया था, जैसा कि पहलेवर्णित है।
  7. लेजर की ताकत को एक उपयुक्त स्तर पर समायोजित करें जहां ब्लिंकिंग घटनाओं को अंतरिक्ष और समय में अलग किया जाता है, एक्सपोज़र समय को 30 एमएस पर सेट करें, और अधिग्रहण शुरू करें। 10,000-30,000 फ्रेम प्राप्त करें।
    नोट: ब्लिंकिंग को अनुकूलित करने के लिए लेजर शक्ति में परिवर्तन किया जाना चाहिए। लेजर तीव्रता बढ़ाने पर विचार करें यदि बहुत अधिक घटनाएं (पलक झपकने वाले कण जो ओवरलैप होते हैं) का पता लगाया जाता है। आदर्श लंबाई नमूने की गुणवत्ता पर निर्भर करती है, लेकिन ~ 10,000 फ्रेम को स्पष्ट विशेषताएं दिखानी चाहिए।

8. डीएसटीओआरएम का छवि पुनर्निर्माण

  1. छवि विश्लेषण के लिए उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।
    नोट: थंडरस्टॉर्म, उपलब्ध कई ओपन-सोर्स छवि पुनर्निर्माण कार्यक्रमों में से एक, संक्षेप में नीचे वर्णित है।
  2. ImageJ खोलें और कच्चे डेटा आयात करें। ThunderSTORM प्लगइन खोलें और डिवाइस के अनुरूप कैमरा सेटिंग कॉन्फ़िगर करें।
  3. रन विश्लेषण पर जाएं और उपयुक्त सेटिंग्स सेट करें, जैसे कि छवि फ़िल्टरिंग (औसत फ़िल्टर का अंतर), स्थानीयकरण विधियां (स्थानीय अधिकतम), और अणुओं का उप-पिक्सेल स्थानीयकरण (एकीकृत गॉसियन पीएसएफ)। छवि पुनर्निर्माण प्रारंभ करने के लिए ठीक क्लिक करें.
    नोट: यदि आवश्यक हो, तो थंडरस्टॉर्म में पैरामीटर स्थापित करने के लिए विस्तृत निर्देश पहलेही वर्णित किए जा चुके हैं।

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Representative Results

यह प्रोटोकॉल पेपर साइट-विशिष्ट फ्लोरोसेंट लेबलिंग और साल्मोनेला स्रावित प्रभावकों के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए एक जीसीई-आधारित विधि का वर्णन करता है, जैसा कि चित्र 1 में दर्शाया गया है। ट्रांस-साइक्लोऑर्थोगोनल समूह (टीसीओ) और फ्लोरोसेंट डाई को प्रभावित करने वाले एनसीएए की रासायनिक संरचना को चित्रा 1 ए में दिखाया गया है। एसएसईजे लेबलिंग को जीसीई तकनीक के माध्यम से ऑर्थोगोनल एमिनोसिल-टीआरएनए सिंथेटेस / टीआरएनए जोड़े का उपयोग करके एम्बर स्टॉप कोडन ( चित्रा 1 बी देखें) में बायोऑर्थोगोनल एनसीएएएस के आनुवंशिक समावेश द्वारा हासिल किया गया था। फ्लोरोफोरे (जेएफ 646-टीजेड या बीडीपी-टीजेड) युक्त टेट्राज़िन के साथ टीसीओ-लेबल प्रभावकों के उपचार ने एक वैकल्पिक प्रोटीन लेबलिंग रणनीति प्रदान की जिसने मेजबान के संक्रमण के कई घंटों बाद स्थानांतरित साल्मोनेला स्रावित प्रभावकों के अवलोकन को सक्षम किया (चित्रा 1 बी, सी)। हमने संभावित अमीनो एसिड अवशेषों की पहचान करके शुरू किया और सतह पहुंच और एसएसईजे कार्यात्मक अवशेषों के मौजूदा ज्ञान के आधार पर एनसीएए समावेश के लिए एसएसईजे की स्थिति 10 का चयन किया। पूर्व संरचनात्मक डेटा और सतह जोखिम अनुमान विशिष्ट स्थानों के चयन में सहायता कर सकते हैं।

पीओआई एन्कोडिंग जीन के भीतर एम्बर कोडन का प्लेसमेंट टीसीओ निगमन की प्रभावकारिता को प्रभावित करता है। नतीजतन, पीओआई के जीन के विभिन्न पदों में एम्बर कोडन के साथ उत्परिवर्ती की एक श्रृंखला बनाई जानी चाहिए और इष्टतम एकीकरण दक्षता के लिए विश्लेषण किया जाना चाहिए। एम्बर कोडन स्थिति का चयन अनुभवजन्य है। सामान्य तौर पर, परिवर्तित अवशेष पीओआई फ़ंक्शन के लिए गैर-आवश्यक होने चाहिए, पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों से रहित, और फ्लोरोसेंट जांच के लिए सुलभ होना चाहिए। अभिव्यक्ति प्लास्मिड एक कम कॉपी नंबर होना चाहिए ताकि यह पीओआई की मूल प्रतिलिपि संख्या की नकल करे। कोडन संदर्भ प्रभावित करता है कि एक एनसीएए को ऑर्थोगोनल टीआरएनए / एमिनोसिल-टीआरएनए सिंथेटेस सिस्टम द्वारा कितने प्रभावी ढंग से शामिल किया जाता है। जबकि एएटी-टीएजी-एसीटी ऑर्थोगोनल टीआरएनए का पसंदीदा संदर्भ है, एसएसईजे के फेनिलएलनिन -10 की स्थिति को टीएजी में बदल दिया गया था, जिससे एनसीएए के सबसे प्रभावी समावेश को सक्षम करने के लिए एएटी-टीएजी-एसीटी संदर्भ सुनिश्चित हुआ। सबसे पहले, हमने परीक्षण किया कि क्या उत्परिवर्ती एसईजे को व्यक्त करने के लिए एक उच्च प्रतिलिपि संख्या प्लास्मिड का उपयोग करके ई कोलाई में कार्यात्मक थे। जैसा कि एसडीएस-पेज द्वारा प्रमाणित किया गया है, एसएसईजे-एफ 10टीसीओ-एचए उत्परिवर्ती अभिव्यक्ति टीसीओ * ए की उपस्थिति और संबंधित इष्टतम टीआरएनए / एएआरएस (चित्रा 2 ए) पर निर्भर थी। एसएसईजे-एफ 10 एफसीओ-एचए को ई कोलाई में एसपीआईईडीएसी क्लिक रसायन विज्ञान का उपयोग करके जेएफ 646-टीजेड के साथ लेबल किया गया था। इन विट्रो में ई कोलाई में एसएसईजे-एफ 10टीसीओ-एचए के चयनात्मक फ्लोरोसेंट लेबलिंग की पुष्टि फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी विश्लेषण (चित्रा 2 बी) द्वारा की गई थी। जीसीई का उपयोग करते हुए, टीसीओ * ए को इस प्रकार साइट-विशेष रूप से एसएसईजे में एक एम्बर कोडन में शामिल किया गया था। टीआरएनएपाइल / पाइलआरएसएएफ प्रणाली का उपयोग करके एनसीएएएस के जीनोमिक ऑफ-टारगेट निगमन की सीधे पहचान करने के प्रयासों ने उनके अस्तित्व का कोई सबूत नहीं दिया। हालांकि, हम इन-जेल फ्लोरेसेंस, वेस्टर्न ब्लॉट, फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन, इन विट्रो फ्लोरेसेंस लेबलिंग, और पीईवीओएल प्लास्मिड की दक्षता, विशिष्टता, ऑफ-टारगेट निगमन की डिग्री और विषाक्तता का आकलन करने के लिए अन्य तरीकों का उपयोग करने की सलाह देते हैं, जैसा कि यहां उद्धृत पहले रिपोर्ट किए गए पत्रों में प्रलेखित किया गया है।

एक बार जब हमने स्थापित किया कि एसएसईजे में दबा हुआ टीएजी कार्यात्मक था, तो हमने एसएसईजे-एफ 10टीसीओ-एचए को इसके मूल प्रमोटर के साथ कम कॉपी नंबर प्लास्मिड पीडब्ल्यूएसके 29 में क्लोन किया, जिससे फ्लोरोसेंट लेबलिंग और विज़ुअलाइज़ेशन के लिए एएटी-टैग-एसीटी आकृति सुनिश्चित हुई। साल्मोनेला कोशिकाओं में एसएसईजे-एफ 10टीसीओ-एचए के इन विट्रो चयनात्मक लेबलिंग की पुष्टि फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी (चित्रा 3) का उपयोग करके की गई थी। फिर हमने टीसीओ * ए की अनुपस्थिति या उपस्थिति में जंगली प्रकार के साल्मोनेला स्ट्रेन के साथ हेला कोशिकाओं को संक्रमित किया, जो पीएसएसईजे-एचए या पी एसएसईजे10टीएजी-एचए के साथ पूरक था, यह निर्धारित करने के लिए कि क्या टीसीओ-निगमित एसएसईजे को मेजबान कोशिकाओं में स्थानांतरित किया जा सकता है। संक्रमित हेला कोशिकाओं को पीएफए के साथ तय किया गया था और एसएसईजे द्वारा सजाए गए एसआईएफ को उजागर करने के लिए एंटी-एचए एंटीबॉडी 16 एच पोस्ट संक्रमण के साथ इम्यूनोस्टेन्ड किया गया था। जैसा कि चित्रा 4 सी में दिखाया गया है, एसएसईजे-एफ 10टीसीओ-एचए स्पष्ट रूप से स्रावित किया गया था, एसएसईजे-निर्भर एसआईएफ का गठन किया गया था, और वे जंगली प्रकार की संक्रमित कोशिकाओं (चित्रा 4 ए) में देखे गए समान दिखते थे। हालांकि, टीसीओ * ए (चित्रा 4 बी) की अनुपस्थिति में एसएसईजे-निर्भर एसआईएफ नहीं देखा गया था। इन अवलोकनों से पता चला कि जीसीई का उपयोग करके एसएसईजे-एफ 10टीसीओ-एचए की अभिव्यक्ति ने एसएसईजे-निर्भर एसआईएफ को बचाया। इसके अतिरिक्त, परिणामों ने यह भी संकेत दिया कि एसएसईजे-एफ 10टीसीओ-एचए साल्मोनेला के लिए एक पूरी तरह कार्यात्मक विषाणु कारक था।

यह पुष्टि करने के बाद कि जीसीई-लेबल एसएसईजे कार्यात्मक और स्रावित था, हमने हेला कोशिकाओं में जेएफ 646-टीजेड के साथ एसएसईजे-एफ 10टीसीओ-एचए को लेबल करने के लिए एसपीआईईडीएसी प्रतिक्रिया का उपयोग किया। ऐसा करने के लिए, हमने टीसीओ * ए की उपस्थिति में जंगली प्रकार के साल्मोनेला के साथ हेला कोशिकाओं को संक्रमित किया। प्रोटोकॉल अनुभाग 5 में वर्णित दो वैकल्पिक प्रोटोकॉल का उपयोग करके जेएफ 646-टीजेड के साथ लेबलिंग के बाद, कोशिकाओं को अतिरिक्त डाई को हटाने के लिए बड़े पैमाने पर धोया गया, पीएफए के साथ तय किया गया, और स्रावित एसएसईजे-एफ 10टीसीओ-एचए की कल्पना करने के लिए एंटी-एचए एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोस्टेन किया गया। हेला कोशिकाओं के साइटोप्लाज्म में स्रावित एसएसईजे-एफ 10टीसीओ-एचए को जेएफ 646-टीजेड (चित्रा 5 ए, बी, लाल) के साथ लेबल किया गया था और स्पष्ट रूप से एचए-टैग (हरे) के साथ सह-स्थानीयकृत किया गया था। यह अवलोकन कि दो लेबल एक दूसरे के साथ अतिव्यापी हैं (एक फ्लोरोसेंट डाई, दूसरा इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा लेबल किया गया), आगे जीसीई लेबलिंग की विशिष्टता पर जोर देता है।

यह सुनिश्चित करने के लिए कि उन हेला कोशिकाओं में देखा गया प्रतिदीप्ति संकेत केवल स्रावित प्रभावक एसएसईजे के लिए विशिष्ट था, हमने टीसीओ * ए और पीईवीओएल-पाइलआरएस-एएफ की उपस्थिति में जंगली प्रकार के साल्मोनेला (पीएसएसईजे-एचए ले जाने वाले) के साथ कोशिकाओं को संक्रमित किया। एक क्लिक डाई का उपयोग यह देखने के लिए किया गया था कि हेला कोशिकाओं में कोई पृष्ठभूमि लेबलिंग थी या नहीं। एसएसईजे को मेजबान सेल के साइटोप्लाज्म में जारी किया गया था, जिसमें कोई इंट्रासेल्युलर या गैर-विशिष्ट फ्लोरोसेंट सिग्नल (चित्रा 5 सी) नहीं था, यह दर्शाता है कि फ्लोरेसेंस सिग्नल एसएसईजे के लिए विशिष्ट था। यह निर्धारित करने के बाद कि एनसीएए को विशेष रूप से एम्बर कोडन में शामिल किया गया था, और यह स्रावित एसएसईजे को क्लिक प्रतिक्रिया के माध्यम से मेजबान सेल में देखा जा सकता है, अगला लक्ष्य हेला कोशिकाओं में स्रावित एसएसईजे की एक सुपर-रिज़ॉल्यूशन छवि बनाना था (चित्रा 6)। चित्रा 6 में, हम जीसीई की शक्ति और हेला कोशिकाओं में साल्मोनेला स्रावित प्रभावक एसएसईजे की साइट-विशिष्ट सुपर-रिज़ॉल्यूशन छवियों को उत्पन्न करने के लिए जेएफ 646 डाई के उपयोग का प्रदर्शन करते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: एसपीआई -2 प्रभावकों के साइट-विशिष्ट फ्लोरोसेंट लेबलिंग के लिए योजना। (ए) टीसीओ * ए और जेएफ -646-टेट्राज़िन। (बी) योजनाबद्ध एसपीआई -2 प्रभावक में एनसीएए के समावेश को दर्शाता है। बैक्टीरियल सेल में, एक प्लाज्मिड जिसमें एक प्रभावक पीओआई (बैंगनी) और एक ऑर्थोगोनल सप्रेसर टीआरएनए (लाल)/एमिनोसिल सिंथेटेस (हरा) जोड़ी के लिए जीन होता है। एक देशी कोडन को अनुमेय स्थान पर प्रभावक जीन अनुक्रम में एक एम्बर (टीएजी, लाल) स्टॉप कोडन के साथ स्वैप किया जाता है। एनसीएए (गहरा लाल सर्कल) बस विकास माध्यम में पेश किया जाता है। फिर इसे सेल द्वारा उठाया जाता है और साइटोसोल तक पहुंच जाता है, जहां इसे एमिनोसिल-टीआरएनएसिंथेटेस (एएआरएस) द्वारा ऑर्थोगोनल टीआरएनए से जोड़ा जाता है। एक सीयूए एंटीकोडन के साथ एनसीएए-एसाइलेटेड टीआरएनए प्रभावक एमआरएनए (बैंगनी) पर पूरक एम्बर कोडन के परिणामस्वरूप राइबोसोमल मशीनरी में प्रवेश करता है, जिसमें संलग्न एनसीएए को प्रभावक में शामिल किया जाता है। एनसीएए को प्रभावक साइट की पूर्ण लंबाई वाली पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला द्वारा ले जाया जाता है, जो तब एक कार्यात्मक प्रभावक प्रोटीन में फोल्ड और इकट्ठा होता है। नए उत्पादित प्रभावक को टी 3 एसएस के माध्यम से मेजबान सेल में स्थानांतरित किया जाता है। एक बाहरी रूप से आपूर्ति किए गए फ्लोरोफोरे का उपयोग एनसीएए के साथ एकीकृत एक स्रावित एसपीआई -2 प्रभावक को लेबल करने के लिए किया जा सकता है। (सी) फ्लोरोजेनिक टेट्राज़िन डाई के साथ कॉपर-फ्री क्लिक रिएक्शन स्कीम। एसपीआईईडीएसी क्लिक प्रतिक्रिया के माध्यम से, पीओआई (एसएसईजे) में शामिल तनावपूर्ण एल्केन समूह के साथ एक एनसीएए टेट्राज़िन-युग्मित डाई (जेएफ 646-टीजेड) के साथ प्रतिक्रिया करता है। फ्लोरोजेनिक, टेट्राज़िन-युग्मित डाई JF646-TZ सफल लेबलिंग के बाद ही फ्लोरोसेंट (लाल) बन जाता है। संक्षेप: टीसीओ * ए = ट्रांस-साइक्लोक-2-एन-एल-लाइसिन; एनसीएए = गैर-कैननिकल अमीनो एसिड; टी 3 एसएस = टाइप तीन स्राव प्रणाली; एसपीआई -2 = साल्मोनेला रोगजनकता द्वीप 2; पीओआई = रुचि का प्रोटीन; एसपीआईईडीएसी = तनाव-प्रचारित व्युत्क्रम इलेक्ट्रॉन-मांग डाइल्स-एल्डर साइक्लोडेशन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: टीसीओ * ए साइट-विशेष रूप से ई कोलाई में व्यक्त एसएसईजे-एफ 10 टीसीओ-एचए में शामिल किया गया है। (क) कूमासी-सना हुआ एसडीएस-पेज टीसीओ*ए को एसएसईजे-एफ10टीसीओ-एचए (लाल तीर द्वारा इंगित) औरई कोलाई में चुनिंदा रूप से शामिल किए जाने की पुष्टि करता है। (बी) ई कोलाई में एसएसईजे-एफ 10टीसीओ-एचए की अभिव्यक्ति का विश्लेषण 1 एमएम टीसीओ * ए की अनुपस्थिति (ऊपर) या उपस्थिति (नीचे) में फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा किया जाता है। एसएसईजे फ्लोरेसेंस (हरा) केवल शामिल टीसीओ * ए लेबल की उपस्थिति में देखा जाता है; शीर्ष पैनल में पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति की अनुपस्थिति पर ध्यान दें। स्केल बार = 2 μm. संक्षेप: टीसीओ * ए = ट्रांस-साइक्लोक-2-एन-एल-लाइसिन; बीएफ = ब्राइटफील्ड; एचए = हाइलूरोनिक एसिड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: टीसीओ * ए साइट-विशेष रूप से एसएसईजे-एफ 10टीसीओ-एचए में शामिल है जो साल्मोनेला में व्यक्त किया गया है। फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग 1 mM TCO* A की अनुपस्थिति (ऊपर) या उपस्थिति (नीचे) में साल्मोनेला में SSEJ-F10TCO-HA की अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए किया जाता है। SSEJ F10TCO-HA को व्यक्त करने वाले साल्मोनेला को JF646-TZ के साथ इलाज किया जाता है और TCO * A की उपस्थिति या अनुपस्थिति में JF646 फ्लोरेसेंस (Magenta) के लिए चित्रित किया जाता है। SSEJ (Magenta) की प्रतिदीप्ति का पता केवल तभी लगाया जाता है जब TCO * A मौजूद होता है। स्केल बार = 2 μm. संक्षेप: टीसीओ * ए = ट्रांस-साइक्लोक-2-एन-एल-लाइसिन; बीएफ = ब्राइटफील्ड; एचए = हाइलूरोनिक एसिड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4: स्रावित SSEJ-J10TCO-HA कार्यात्मक है। (A) हेला कोशिकाएं 16 घंटे के लिए p sseJ-HA से संक्रमित होती हैं, स्थिर होती हैं, और एंटी-HA एंटीबॉडी (लाल), LPS (हरा), और DAPI (नीला) के साथ इम्यूनोस्टेन्ड होती हैं। जैसा कि अपेक्षित था, संक्रमित कोशिकाओं में एसएसईजे-निर्भर एसआईएफ का गठन देखा जाता है। (बी) टीसीओ * ए की अनुपस्थिति में, एम्बर कोडन को दबाया नहीं जाता है, और संक्रमित हेला कोशिकाओं में एसएसईजे-निर्भर एसआईएफ अनुपस्थित होते हैं। हेला कोशिकाएं साल्मोनेला से संक्रमित होती हैं जो 16 घंटे के लिए टीसीओ * ए की अनुपस्थिति में एसएसईजे-एफ 10टीसीओ-एचए को व्यक्त करती हैं, स्थिर होती हैं, और एंटी-एचए एंटीबॉडी (लाल), एलपीएस (हरा), और डीएपीआई (नीला) के साथ इम्यूनोस्टेन्ड होती हैं। (ग) एसएसईजे-निर्भर एसआईएफ टीसीओ*ए की उपस्थिति में एसएसईजे-एफ10टीसीओ-एचए व्यक्त करने वाले साल्मोनेला से संक्रमित हेला कोशिकाओं को स्थिर किया जाता है और एंटी-एचए एंटीबॉडी एसएसईजे (लाल), एलपीएस (हरा) और डीएपीआई (नीला) के साथ इम्यूनोस्टेन्ड किया जाता है। एसएसईजे-निर्भर एसआईएफ को बाएं पैनल में देखा जाता है, जो स्पष्ट रूप से दर्शाता है कि एसएसईजे को जीसीई का उपयोग करके एसएसईजे-एफ 10टीसीओ-एचए की अभिव्यक्ति से बचाया गया था। स्केल बार = 10 μm. संक्षेप: एचए = हाइलूरोनिक एसिड; एलपीएस = लिपोपॉलेसेकेराइड; DAPI = 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलइंडोल; टीसीओ * ए = ट्रांस-साइक्लोक्ट-2-एन-एल-लाइसिन; एसआईएफ = साल्मोनेला-प्रेरित फिलामेंट्स; जीसीई = आनुवंशिक कोड विस्तार। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: जेएफ 646-टीजेड डाई के साथ एसएसईजे की लेबलिंग विशिष्टता। (A) हेला कोशिकाएं 400 μM TCO* A की उपस्थिति में SSEJ-F10TCO-HA को व्यक्त करने वाले साल्मोनेला से संक्रमित होती हैं। TCO-टैग किए गए स्रावित SSEJ-F10TCO-HA को 1x PBS में 2 μM JF646-TZ के साथ लेबल किया जाता है जिसमें गोजातीय दूध से 1% कैसिइन सोडियम नमक होता है, जो बड़े पैमाने पर धोया जाता है, स्थिर होता है, और स्रावित SSEJ (हरे रंग) की कल्पना करने के लिए एंटी-एचए एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोस्टेन्ड होता है। SSEJ-F10TCO-HA को JF646-TZ डाई (लाल, बाएं पैनल) के साथ स्रावित और लेबल किया जाता है। जीसीई (लाल) और एचए (हरा) के माध्यम से लेबल किए गए एसएसईजे स्पष्ट रूप से सह-स्थानीयकृत (दाएं पैनल) हैं। (बी) थोड़ा अलग लेबलिंग प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, टीसीओ-टैग किए गए स्रावित एसएसईजे-एफ 10 टीसीओ-एचए को पूर्ण माध्यम डीएमईएम (एफबीएस के बिना) में 2 μM JF646-TZ के साथ भी लेबल किया जाता है, बड़े पैमाने पर धोया जाता है, और तय किया जाता है, और एंटी-एचए इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधलापन के अधीन किया जाता है। स्रावित SSEJ-F10TCO-HA को JF646-TZ डाई (लाल, बाएं पैनल) के साथ लेबल किया जाता है और HA (हरे) के साथ सह-स्थानीयकृत किया जाता है। (ग) आगे यह स्थापित करने के लिए कि प्रतिदीप्ति संकेत एसएसईजे के लिए अद्वितीय है और अन्य एसपीआई-2 जारी प्रोटीनों का उत्पाद नहीं है, हेला कोशिकाएं एनसीएए (टीसीओ*ए) की उपस्थिति में जंगली प्रकार के साल्मोनेला से संक्रमित होती हैं, जिसमें पीएसएसईजे-एचए और पीईवीओएल-पाइलआरएस-एएफ होता है। संक्रमण के बाद 16 घंटे में, संक्रमित हेला कोशिकाओं को पूर्ण माध्यम (एफबीएस और टीसीओ * ए के बिना) में 2 μM JF646-Tz के साथ इलाज किया जाता है, और अतिरिक्त डाई को नए विकास माध्यम का उपयोग करके पूरी तरह से हटा दिया जाता है। हेला कोशिकाओं को पीएफए तय किया जाता है और एसएसईजे (हरे) के लिए इम्यूनोस्टेन्ड होने से पहले पीबीएस के साथ अच्छी तरह से धोया जाता है। बाएं पैनल (जेएफ 646-टीजेड) में दृश्यमान पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति संकेत की कमी इंगित करती है कि मेजबान कोशिकाओं के भीतर लगभग कोई ऑफ-टारगेट लेबलिंग नहीं हुई। स्केल बार = 10 μm. संक्षेप: एचए = हाइलूरोनिक एसिड; पीबीएस = फॉस्फेट-बफर्ड खारा; एफबीएस = भ्रूण गोजातीय सीरम; DAPI = 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलइंडोल; टीसीओ * ए = ट्रांस-साइक्लोक्ट-2-एन-एल-लाइसिन; एसआईएफ = साल्मोनेला-प्रेरित फिलामेंट्स; जीसीई = आनुवंशिक कोड विस्तार; एसपीआई -2 = साल्मोनेला रोगजनकता द्वीप 2; बीएफ = ब्राइटफील्ड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: हेला कोशिकाओं में जीसीई-लेबल एसएसईजे की सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग। हेला कोशिकाएं 400 μM TCO* A की उपस्थिति में SSEJ-F10TCO-HA को व्यक्त करने वाले साल्मोनेला से संक्रमित होती हैं। TCO-टैग किए गए स्रावित SSEJ-F10TCO-HA को प्रोटोकॉल में वर्णित शारीरिक परिस्थितियों में 2 μM JF646-TZ के साथ लेबल किया जाता है, फिर बड़े पैमाने पर धोया जाता है। छवियों को Nikon N-Storm का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है। (ए) निगरानी के तहत एक हेला सेल की ब्राइटफील्ड छवि। स्केल बार = 10 μm. (B) TCO* A और JF-646 के साथ लेबल किए गए स्रावित SSEJ की विवर्तन-सीमित, विस्तृत छवि। स्केल बार = 10 μm. (C) SSEJ-सजाए गए SIFs की संबंधित dSTORM छवि। स्केल बार = 10 μm. C(i) इनसेट बॉक्स किए गए क्षेत्र में सुपर-रिज़ॉल्यूशन SSEJ का एक आवर्धित दृश्य दिखाता है। स्केल बार = 1 μm. संक्षेप: एचए = हाइलूरोनिक एसिड; टीसीओ * ए = ट्रांस-साइक्लोक्ट-2-एन-एल-लाइसिन; एसआईएफ = साल्मोनेला-प्रेरित फिलामेंट्स; जीसीई = आनुवंशिक कोड विस्तार; डब्ल्यूएफ = वाइडफील्ड; बीएफ = ब्राइटफील्ड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 1. समाधान। कृपया इस तालिका का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यहां वर्णित दृष्टिकोण का उपयोग संक्रमण के बाद बैक्टीरियल टी 3 एसएस द्वारा मेजबान सेल में इंजेक्ट किए गए प्रभावक प्रोटीन के सटीक स्थान को ट्रैक करने के लिए किया गया था। टी 3 एसएस को इंट्रासेल्युलर रोगजनकों जैसे साल्मोनेला, शिगेला और येर्सिनिया द्वारा मेजबान में विषाणु घटकों को परिवहन करने के लिए नियोजित किया जाता है। सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग प्रौद्योगिकियों के विकास ने पहले अकल्पनीय रिज़ॉल्यूशन12,13,24 पर विषाणु कारकों की कल्पना करना संभव बना दिया है। हालांकि, कुछ लेबलिंग बाधाओं ने अधिक गहराई से जांच को रोक दिया, क्योंकि फोटोएक्टिवेटेबल प्रोटीन संलयन टी 3 एसएस छिद्र को अवरुद्ध करते हैं और स्रावित नहीं होते हैं। इसके अलावा, क्लस्टरिंग कलाकृतियों और गलत विश्लेषण के परिणामस्वरूप कुछ संलयन प्रोटीन की क्लस्टर या एग्रीगेट की अंतर्निहित प्रवृत्ति हो सकती है।

कुछ उदाहरणों में, संलयन प्रोटीन भी क्लीवर है, जैसा कि हमने पहले PAmCherry-SsaP12,13 के साथ देखा था। इन सभी बाधाओं को जीसीई द्वारा दूर किया जाता है, जो पीओआई के साइट-विशिष्ट फ्लोरोसेंट लेबलिंग की अनुमति देता है। यह प्रोटीन के विज़ुअलाइज़ेशन की भी अनुमति देता है जो भरपूरमात्रा में 12,13 नहीं हैं। जबकि कई कारक हैं जो ऑर्थोगोनल टीआरएनए / एमिनोसिल-टीआरएनए सिंथेटेस सिस्टम का उपयोग करके एनसीएए निगमन की दक्षता को प्रभावित कर सकते हैं, ऐसा लगता है कि कोडन संदर्भ सबसे महत्वपूर्ण है। ऑर्थोगोनल टीआरएनए एक एनसीएए को सबसे कुशलता से शामिल करता है जब पसंदीदा कोडन संदर्भ एटीटीएजीएसीटी33 होता है। चित्रा 5 में, हम एचए-टैग के इम्यूनोस्टेनिंग की तुलना में जीसीई और साइट-विशिष्ट फ्लोरोफोरे (साथ ही पृष्ठभूमि की अनुपस्थिति) से उत्पन्न क्रिस्प लेबलिंग की तुलना कर सकते हैं।

नतीजतन, शोधकर्ता यहां उल्लिखित विधि का उपयोग करके रोगजनकों, कॉमेंसल बैक्टीरिया और यूकेरियोटिक मेजबानों में पीओआई की कल्पना करने में सक्षम होंगे। संक्षेप में, आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड एनसीएए पारंपरिक तरीकों के विफल होने पर प्रभावक प्रोटीन लेबलिंग के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण प्रदान करते हैं। हालांकि, इस विधि की एक प्रमुख सीमा फ्लोरोफोरे के अंतर्निहित रासायनिक गुण हैं, जैसे झिल्ली पारगम्यता, वितरण और प्रतिधारण, जो फ्लोरोसेंट लेबलिंग की दक्षता को प्रभावित कर सकते हैं। फ्लोरोसेंट एनसीएएएस क्लिक प्रतिक्रियाओं से बचने के लिए एक वैकल्पिक विकल्प है12, हालांकि इन्हें केवल दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके देखा जा सकता है। पाठकों को यहांउद्धृत कोशिका-झिल्ली-पारगम्य / अभेद्य रंगों की एक सूची के लिए संदर्भित किया जाता है जो यहां 12,38,39,40,41 में उद्धृत किए गए हैं।

अंत में, हमने साइट-विशेष रूप से लेबल किया और इसकी कल्पना की कि साल्मोनेला ने अपने जैविक कार्य को बाधित किए बिना फ्लोरोजेनिक फ्लोरोफोरे के साथ संयोजन में आनुवंशिक रूप से एनसीएएएस को एन्कोडिंग करके प्रभावकारक एसएसईजे का स्राव किया। जेएफ 646-टीजेड के साथ एसएसईजे की लेबलिंग अत्यधिक विशिष्ट थी, और सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग को मेजबान कोशिकाओं के अंदर स्रावित प्रभावकों की कल्पना करने के लिए नियोजित किया जा सकता है। इस प्रकार, डीएसटीओआरएम-संगत रंगों और आनुवंशिक कोड विस्तार का उपयोग करके बैक्टीरियल प्रभावकों के फ्लोरोसेंट लेबलिंग ने विवर्तन सीमा से नीचे एक संकल्प पर मेजबान कोशिकाओं में जीवाणु स्रावित प्रभावकों के उपकोशिकीय स्थानिक स्थानीयकरण की अनुमति दी। चूंकि यह लेबलिंग प्लेटफॉर्म लाइव-सेल इमेजिंग एकल कण ट्रैकिंग के साथ संगत है, इसलिए हमारी विधि अस्थायी और स्थानिक संकल्प के अभूतपूर्व स्तर के साथ टी 3 एसएस प्रणाली के प्रभावक प्रोटीन का विश्लेषण करना संभव बना देगी, जो जीवाणु रोगजनन की हमारी आणविक समझ को बढ़ाएगी।

जबकि कुछ सीमाएं हैं, जैसे कि खराब एनसीएए निगमन दक्षता और कार्बनिक फ्लोरोफोरे की फोटोफिजिकल बाधाएं, हमने दिखाया है कि यह दृष्टिकोण शोधकर्ताओं को मेजबान कोशिकाओं के अंदर एक स्रावित प्रभावक का निरीक्षण और स्थानीयकरण करने में मदद कर सकता है, भले ही यह दुर्लभहो। हम उम्मीद करते हैं कि प्रौद्योगिकी का अनुकूलन संक्रमण के दौरान बैक्टीरिया द्वारा उत्पादित अन्य प्रभावक प्रोटीन पर इमेजिंग और अनुसंधान के लिए नए और रोमांचक अवसर खोलेगा। विधि को वायरस के लेबलिंग के लिए भी आसानी से अनुकूलित किया जाता है, जो इसकी व्यापक उपयोगिता का प्रदर्शन करता है।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं हैं।

Acknowledgments

इस काम को टेक्सास मेडिकल शाखा, गैलवेस्टन, टेक्सास विश्वविद्यालय से स्टार्ट-अप फंड और एलजेके को टेक्सास स्टार पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया था। एडवर्ड लेमके (यूरोपीय आणविक जीवविज्ञान प्रयोगशाला, हीडलबर्ग, जर्मनी) को प्लास्मिड पीईवीओएल-पाइलआरएस-एएफ के लिए धन्यवाद देते हैं। चित्रा 1 में छवियां बायोरेंडर का उपयोग करके बनाई गई थीं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Tris/Glycine SDS running buffer BIO-RAD 1610732
Ammonium chloride Fischer Scientific A661-500
Ammonium sulphate Fischer Scientific BP212R-1
Ampicillin Sodium Sigma-Aldrich A0166 5 g
Antibiotic-Antimycotic (100x) ThermiFischer Scientific 15240096
Arabinose Sigma-Aldrich A3256 500 g
Avanti J-26XP (High-Performance Centrifuge) Beckman Coulter
Bacto-Agar BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA 214010
BDP-FL-tetrazine Lumiprobe (USA) 2.14E+02
β-mercaptoethanol Millipore 444203 250 mL
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B8026
BSA Sigma-Aldrich A4503 500 g
Casein Sigma-Aldrich C8654
Catalase Sigma-Aldrich C9322
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C1919
Click Amino Acid / trans-Cyclooct-2-en – L - Lysine (TCO*A) SiChem GmbH SC-8008 Size: 500 mg
DAPI (Hoechst33342) Invitrogen H3570
DeNovix DS-11+ Spectrophotometer DeNovix
DMEM* Corning 10-013-CV * Used for maintaining HeLa Cell
DMEM** Gibco 11965-092 **Used for bacterial infection in presence of ncAA, see section 5.4.
DMSO Sigma-Aldrich D8418 250 g
Donkey anti-rabbit Alexa fluoro555 secondary antibody Invitrogen A-31572
DPBS, 1x Corning 21-031-CV
E. coli strain BL21 (DE3) Novagen (Madison, WI)
EMCCD Camera Andor iXon Ultra 897-BV
Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 mL (PCR clean) Eppendorf, Hamburg, Germany 30123.328
Fetal Bovine Serum (FBS) Fischer 10082147
Fisherbrand Syringe Filters - Sterile (PVDF 0.22 µm) Fischer Scientific 97203 Pack of 100
Gene Pulser Xcell Electroporator BIO-RAD 1652660
Gentamycin Sigma-Aldrich G1272 10 mL
Gibco L-Glutamine (200 mM), 100x Fischer Scientific 25-030-081
Glucose oxidase Sigma-Aldrich G7141-50KU
Glycerol Fischer Scientific BF229-4
HeLa cells ATTC CCL-2
HEPES Buffer Corning 25-060-C1 100 mL
Hydrocloric acid Fischer Scientific A144-212
ImageJ Image processing and analysis:  http://rsbweb.nih.gov/ij
IntantBlue Expedeon ISB1L Coomassie-based stain
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma-Aldrich I5502
Janelia Fluoro 646-tetrazine Tocris Bioscience 7279
Kanamycin Sigma-Aldrich 60615 5 g
LB Broth BD Difco 244620 500 g
Lysozyme Sigma-Aldrich L6876
μManager (v. 1.4.2) https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release
MES Sigma-Aldrich M3671 250 g
Micro pulser cuvette BIO-RAD 165-2086 0.2 cm electrode gap, pkg. of 50
Nikon N-STORM Nikon Instruments Inc. https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/super-resolution-microscopes/n-storm-super-resolution
Nunc EasYFlask Cell Culture Flasks ThermiFischer Scientific 156499
Omnipur Casamino Acid Calbiochem 2240 500 g
Paraformaldehhyde (PFA) Electron Microscopy Sciences  15710
PBS (10x) Roche 11666789001
Penicillin-Streptomycin Solution (100x) GenDEPOT  CA005-010 100 mL
pEVOL-PylRS-AF For plasmid construction and map see following references
1. Angew Chem Int Ed Engl. 2011, 50(17), 3878-81.
2. Angew Chem Int Ed Engl., 2012, 51, 4166-70.
Plasmid Mini-prep Kit Qiagen 27106
plasmid pWSK29-sseJ10TAG-HA Ref.: elife. 2021, 10, e67789.
plasmid pWSK29-sseJ-HA Ref.: elife. 2021, 10, e67789.                                                                   Vector map of PWSK29: https://www.addgene.org/172972/
Pluronic F-127 Millipore 540025 Protein grade, 10% Solution
Potassium phosphate monobasic Fischer Scientific P285-500
Potassium sulphate Acros Organic 424220250
Protease Inhibitor Cocktail Set I - Calbiochem Sigma-Aldrich 539131 100x Solution
Rabbit anti-HA primary antibody Sigma-Aldrich H6908
S. enterica. serovar Typhimurium 14028s Ref.: PLoS Biol. 2015, 13, e1002116.
Saponin Sigma-Aldrich 47036-50G-F
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich L3771
Sodium hydroxide Fischer Scientific SS255-1
Sodium Pyruvate (100 mM), 100x Corning 25-060-C1 100 mL
Sonic Dismembrator Model 100 Fischer Scientific 24932
STED microsocpe (Leica TCS SP8 STED 3X system) Leica Microsystems, Wetzlar, Germany https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/
ThunderSTORM https://zitmen.github.io/thunderstorm/
Trizma Base Sigma-Aldrich T1503
Trypsin-EDTA (1x), 0.25%   GenDEPOT  CA014-010
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416 100 mL
X-well tissue culture chamber slides SARSTEDT 94.6190.802

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References

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Singh, M. K., Kenney, L. J. Super-Resolution Imaging of Bacterial Secreted Proteins Using Genetic Code Expansion. J. Vis. Exp. (192), e64382, doi:10.3791/64382 (2023).

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