Summary
Diese Arbeit zielt darauf ab, das Artemia salina lethality Bioassay-Verfahren, das auch als Solegarnelen-Letalitätstest bezeichnet wird, zu bewerten und zu überprüfen. Diese einfache und kostengünstige Methode gibt Aufschluss über die allgemeine Toxizität (die als vorläufige Toxizitätsbewertung betrachtet wird) von Proben, nämlich Naturstoffen.
Abstract
Naturprodukte werden seit der Antike zur Herstellung von Medikamenten verwendet. Heutzutage gibt es viele Chemotherapeutika, die aus natürlichen Quellen gewonnen und gegen eine Vielzahl von Krankheiten eingesetzt werden. Leider zeigen die meisten dieser Verbindungen oft systemische Toxizität und Nebenwirkungen. Um die Verträglichkeit ausgewählter potentiell bioaktiver Proben besser beurteilen zu können, werden in der Regel Salzgarnelen (Artemia salina) als Modell in Letalitätsstudien verwendet. Der A. salina-Test basiert auf der Fähigkeit der untersuchten bioaktiven Verbindungen, die Mikrokrebstiere in ihrem Larvenstadium (Nauplien) abzutöten. Diese Methode stellt einen geeigneten Ausgangspunkt für Zytotoxizitätsstudien sowie für das allgemeine Toxizitätsscreening von synthetischen, halbsynthetischen und natürlichen Produkten dar. Es kann als einfacher, schneller und kostengünstiger Assay angesehen werden, verglichen mit vielen anderen Assays (In-vitro-Zellen oder Hefestämme, Zebrafische, Nagetiere), die im Allgemeinen für die oben genannten Zwecke geeignet sind. Darüber hinaus kann es auch ohne spezielle Schulung problemlos durchgeführt werden. Insgesamt stellt der A. salina-Assay ein nützliches Werkzeug für die vorläufige Toxizitätsbewertung ausgewählter Verbindungen und die biogesteuerte Fraktionierung von Naturstoffextrakten dar.
Introduction
Naturstoffe aus Pflanzen, Tieren oder Mikroorganismen sind im Laufe der Jahre aufgrund ihres vielfältigen biologischen und pharmakologischen Wirkungsspektrums ein wachsendes Interesse an der Entwicklung neuer bioaktiver Moleküle 1. Die damit verbundenen Nebenwirkungen, die Arzneimittelresistenz oder die unzureichende Spezifität der Wirkstoffe, insbesondere wenn sie als Krebsmedikamente eingesetzt werden, stellen jedoch die Hauptfaktoren dar, die zu einer unwirksamen Behandlung führen können 1,2.
In den letzten Jahrzehnten wurden mehrere pflanzliche Zytostatika entdeckt, von denen einige als Krebsmittel eingesetzt werden 1,2,3. In diesem Zusammenhang wird Paclitaxel als eines der bekanntesten und wirksamsten Chemotherapeutika natürlichen Ursprungs bezeichnet 3,4. Derzeit wird geschätzt, dass mehr als 35 % aller Arzneimittel auf dem Markt aus Naturprodukten stammen oder von diesen inspiriert sind5. Die potentiell hohe Toxizität dieser Verbindungen muss in allen Untersuchungsphasen berücksichtigt werden, da verschiedene Arten von Schadstoffen oder sogar Stoffwechselbestandteile der Pflanze selbst toxische Wirkungen hervorrufen können. Aus diesem Grund sollten in der Vorphase pharmakologische und toxikologische Profile erstellt werden, um die biologische Aktivität und Sicherheit neuer potenzieller pflanzlicher Behandlungen zu bewerten. Um die Toxizität neuer bioaktiver Proben zu bewerten, können wirbellose Tiere als die besten Modelle für die Untersuchung angesehen werden. Sie fordern ethische Mindestanforderungen und erlauben vorläufige In-vitro-Assays, um die vielversprechendsten Produkte für die nächste Testrunde an Wirbeltieren zu priorisieren 1,6.
A. salina ist ein kleines halophiles wirbelloses Tier aus der Gattung Artemia (Familie Artemiidae, Ordnung Anostraca, Unterstamm Crustacea; Abbildung 1). In marinen und aquatischen Salzökosystemen spielen Salzgarnelen eine wichtige ernährungsphysiologische Rolle, da sie sich von Mikroalgen ernähren und Bestandteile des Zooplanktons sind, das zur Fütterung von Fischen verwendet wird. Darüber hinaus werden ihre Larven (bekannt als Nauplien) häufig bei der Beurteilung der allgemeinen Toxizität in Vorstudienverwendet 1,3,7.
Artemia spp. werden häufig in Letalitätsstudien verwendet und sind auch ein geeigneter Ausgangspunkt für Toxizitätsbewertungen, indem sie die Toxizität potenziell bioaktiver Verbindungen basierend auf ihrer Fähigkeit, im Labor gezüchtete Nauplien abzutöten, verfolgen 1,8. Aus diesem Grund hat die Verwendung von A. salina in allgemeinen Toxizitätsstudien an Attraktivität gewonnen, da es sich im Vergleich zu anderen Tests an Tiermodellen um eine sehr effiziente und einfach anzuwendende Methode handelt9.
Aufgrund ihrer einfachen Anatomie, ihrer winzigen Größe und ihres kurzen Lebenszyklus kann eine große Anzahl von wirbellosen Tieren in einem einzigen Experiment untersucht werden. Als solche kombinieren sie genetische Zugänglichkeit und kostengünstige Kompatibilität mit groß angelegten Screenings1. In diesem Zusammenhang zeigt die Verwendung von Salzgarnelen in einem allgemeinen Toxizitätstest mehrere Vorteile, wie z.B. schnelles Wachstum (28-72 h ist vom Schlüpfen bis zu den ersten Ergebnissen erforderlich), Kosteneffizienz und lange Haltbarkeit von kommerziellen Eiern, die das ganze Jahr über verwendet werden können 3,10. Auf der anderen Seite, da wirbellose Tiere ein primitives Organsystem haben und kein adaptives Immunsystem haben, stellen sie kein perfektes und zuverlässiges Modell für menschliche Zellendar 1.
Es bietet jedoch eine vorläufige Bewertungsmethode für die allgemeine Toxizität ausgewählter Proben. Da es häufig als Letalitätstest verwendet wird, kann es vorläufige Hinweise auf die toxischen Wirkungen potenzieller Krebsmittel geben. Es wird oft auch verwendet, um Rückmeldungen über die allgemeine Toxizität von Verbindungen zu erhalten, die mit anderen biologischen Aktivitäten ausgestattet sind, für die es unerlässlich ist, eine möglichst niedrige Sterblichkeitsrate bei den Artemia-Garnelen zu zeigen.
In einer laufenden Studie unserer Gruppe zeigten verschiedene Extrakte aus Plectranthus-Arten antioxidative und antimikrobielle Aktivitäten (unveröffentlichte Ergebnisse). Parallel dazu wurden durch Aufreinigung der Extrakte isolierte Verbindungen erhalten und anschließend chemisch modifiziert. Die Extrakte, reinen Verbindungen und halbsynthetischen Derivate wurden dann auf ihre allgemeine Toxizität getestet. In diesem Zusammenhang zielt die vorliegende Arbeit darauf ab, einen Überblick über die Verwendung des Artemia lethality Bioassays zur Bewertung der allgemeinen Toxizität und potenziellen zytotoxischen Aktivität von bioaktiven Extrakten und isolierten Verbindungen aus verschiedenen Pflanzen der Gattung Plectranthus11 zu geben.
Abbildung 1: Artemia salina unter dem Mikroskop. Frisch geschlüpfte Nauplien von A. salina unter dem Mikroskop (12-fache Vergrößerung). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Protocol
1. Vorbereitung der Ausrüstung
- Erwerben Sie handelsübliche Schlupfausrüstung. Wählen Sie einen geeigneten Ort für die Aufstellung der Schraffurausrüstung aus (Abbildung 2A). Legen Sie den trichterförmigen Behälter in die schwarze Halterung (im Set enthalten) und drehen Sie den Trichter in eine geeignete Richtung, um die Füllstandsmarkierung und den Wasserhahn zu sehen.
- Um handgefertigte Migrationsausrüstung herzustellen, schneiden Sie den Deckel von zwei 0,5-Liter-Plastikflaschen (5,8 cm Durchmesser) ab, um eine Endhöhe von 12 cm zu erhalten. Schaffen Sie ein Loch von 1,5 cm Durchmesser auf einer Seite in 7 cm Entfernung vom Boden in jeder Flasche und führen Sie einen 13 cm langen Gummischlauch (1,3 cm Außen- und 0,9 cm Innendurchmesser) zwischen die beiden Öffnungen ein. Die Öffnungen werden mit Heißkleber verschlossen (Abbildung 2B) und 15 min trocknen gelassen. Stellen Sie die Flaschen auf eine ebene Fläche und füllen Sie sie mit Wasser, um sicherzustellen, dass sie nicht auslaufen.
2. Herstellung von künstlicher Salzlösung
- In einem Becherglas wird eine künstliche Salzlösung (Salzlake Garnelensalz) in einer Konzentration von 35 g/l hergestellt. Fügen Sie dazu 28 g Salz zu 800 ml Leitungswasser gemäß den Anweisungen des Herstellers hinzu. Mischen Sie es mit einem Rührstab, bis sich das gesamte Salz vollständig aufgelöst hat.
HINWEIS: Passen Sie das Volumen der vorbereiteten Kochsalzlösung entsprechend der Größe der verfügbaren Behälter an.
3. Probenvorbereitung
- Alle Proben werden in einem Mikrozentrifugenröhrchen vorbereitet, indem eine geeignete Menge an Extrakten (Plectranthus-Extrakte , Pa- P. ambigerus; Pb- P. barbatus; Pc- P. cylindraceus ; und Pe- P. ecklonii) oder Verbindungen 1-5 (zwei natürliche Verbindungen [1 und 2] erhalten aus Plectranthus spp. und drei halbsynthetischen Derivaten [3, 4, 5]; Abbildung 3) in Dimethylsulfoxid (DMSO)12, um eine Endkonzentration von 10 mg/ml zu erhalten (wenn die Probe wasserlöslich ist, ist die Verwendung von DMSO nicht erforderlich).
- Verdünnen Sie 10 μl jeder Probe (und DMSO für die Negativkontrolle) in einem neuen Mikrozentrifugenröhrchen mit 990 μl künstlicher Kochsalzlösung, die in Schritt 2.1 hergestellt wurde, um eine Endkonzentration von 0,1 mg/ml zu erhalten.
- Unter einem Abzug wird in einem Erlenmeyerkolben eine Lösung von Kaliumdichromat (K2Cr2O7)in destilliertem Wasser in einer Konzentration von 1 mg/ml13,14,15 hergestellt.
4. Bioassay zur Letalität von Salzgarnelen
ANMERKUNG: Dieser Assay wurde aus den Arbeiten mehrerer Autoren mit den Modifikationen 1,16,17,18,19 entwickelt.
- Das Schlupfgefäß wird mit dem in Schritt 2.1 vorbereiteten Medium bis zur Füllstandsmarkierung (500 ml) gefüllt (Abbildung 2C).
- Legen Sie einen Löffel (ca. 0,75 g) Salzgarnelenzysten in die Salzlösung und schließen Sie dann den Behälter. Stellen Sie eine Lampe (Tischlampe, 40 W, 230 V, 50 Hz, mit einer LED-Glühbirne von 8 W, 4.000 K, 830 lm) direkt auf das Gerät (Abbildung 2A) auf und schalten Sie sie ein.
- Schließen Sie das Luftversorgungssystem (3 W Leistung, 50 Hz, 230 V) an den Anschluss an, der sich auf der Oberseite des Geräts befindet, und schalten Sie die Pumpe ein.
- Halten Sie die Raumtemperatur bei 25 ± 3 °C. Solegarnelenzysten schlüpfen in der künstlichen Salzlösung unter kräftiger Belüftung, kontinuierlicher Beleuchtung und stabiler Temperatur nach 24 h bis 48 h.
HINWEIS: Alternativ kann ein vertikaler Inkubator verwendet werden. - Sobald die Eier geschlüpft sind, schalten Sie die Luftpumpe aus und warten Sie, bis die Nauplien (die sich zum Boden des Trichters bewegen) von den leeren Eiergehäusen getrennt sind (oben schwimmend).
- Um die ungeschlüpften Eier von den lebenden Nauplien zu trennen, öffnen Sie den Auslasshahn am Boden und entleeren Sie den Inhalt des Trichters in einen der Behälter des handgefertigten Behälters für Migrationsausrüstung (beschrieben in Schritt 1.2). Stellen Sie sicher, dass die Lösung, die die Nauplien und die restlichen nicht geschlüpften Eier enthält, unter dem Niveau des Röhrchens liegt. Im zweiten Behälter die Restsalzlösung aus Schritt 2.1 über der Höhe des Röhrchens hinzufügen.
- Decken Sie den Behälter mit den Nauplien und den restlichen ungeschlüpften Eiern mit Alufolie ab. Stellen Sie die Lampe nur mit der Salzlösung auf den zweiten Behälter. Die Salzgarnelen werden vom Licht angezogen und wandern von einem Behälter zum anderen (Erntebehälter), was zu einer effizienten Trennung zwischen Eiern (langsam auf den Boden sedimentiert) und lebender Artemia führt.
- Stellen Sie dann das Gerät unter den gleichen Bedingungen wie in Schritt 4.4 für 4 h in den Inkubator (Abbildung 2E). Sammeln Sie aus dem Erntebehälter 900 μL Kochsalzlösung mit 10 bis 15 Nauplien. Legen Sie die Kochsalzlösung mit Nauplien in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte (Abbildung 2F); Alle Proben werden in vierfacher Ausführung getestet.
- Jeweils 100 μL der Negativkontrolle (DMSO), der Positivkontrolle (K2Cr2O7, Kaliumdichromat), der künstlichen Salzlösung und jeder der Proben in die jeweilige Vertiefung geben (Abbildung 2F)13,14.
HINWEIS: Die Proben in jedem Bohrloch weisen eine Konzentration von 0,01 mg/ml auf. Die Endkonzentration der Positivkontrolle in Salzlösung beträgt 0,1 mg / ml, um sicherzustellen, dass alle Nauplien in der Vertiefung der toxischen Wirkung von Kaliumdichromat ausgesetzt sind und absterben. Die künstliche Salzlösung wirkt als Blindling. - Inkubieren Sie die Platte bei 25 ± 3 °C unter Beleuchtung für 24 h (Abbildung 2G). Nach 24 h registrieren Sie die Anzahl der toten Larven (nicht mobile Nauplien für 5 s) in jeder Vertiefung unter einem binokularen Mikroskop (12x)20 (Abbildung 2H). Alternativ können Sie eine Handlinse verwenden.
- Fügen Sie 100 μL Kaliumdichromatlösung hinzu, um den Tod der verbleibenden lebenden Larven zu induzieren, und warten Sie 6 h. Zählen Sie die Gesamtzahl der toten Larven in jeder Vertiefung unter einem Mikroskop. Bestimmen Sie die Sterblichkeitsrate gemäß der folgenden Gleichung.
- Führen Sie alle Tests in dreifacher Ausfertigung durch. Berechnen Sie Standardabweichungen (SD) und drücken Sie die Ergebnisse als Mittelwert von drei unabhängigen Experimenten aus, jedes mit internen Vierfachen (n = 12), ± SD. Wie von Meyer et al. erwähnt, betrachten rohe Extrakte und reine Verbindungen mit LC50< 1.000 μg / ml als toxisch; Es ist auch zu berücksichtigen, dass die Sterblichkeitsrate von Salzgarnelen proportional zur Konzentration der untersuchten Probenist 21.
Abbildung 2: Artemia salina letale Bioassay-Methode. a) handelsübliche Ausrüstung, die zum Schlüpfen von Salzgarnelenzysten verwendet wird; b) handgefertigte Migrationsausrüstung; c) Schlupfgefäß, das mit Kochsalzlösung gefüllt ist; d) Entnahme von ungeschlüpften Eiern und Nauplien; (E) Handgefertigte Geräte im Inkubator während des Migrationsschritts. Der Behälter weit von der Lampe entfernt sollte mit Aluminiumfolie abgedeckt werden; Für eine bessere Ansicht der Set-Installation hier wurde es jedoch entfernt; (F) Ernte von Artemia in Bohrlöchern vor der Durchführung des Assays. Die Verbindungen sollten wie folgt platziert werden: - bezieht sich auf die Negativkontrolle (DMSO), + auf die Positivkontrolle (K2Cr2O7), Salz auf die künstliche Salzlösung und 1 bis 3 auf die zu testenden Proben (in diesem Fall Verbindungen 1-3); g) Inkubation der 24-Well-Platte, die Artemia enthält, und der ausgewählten Proben; (H) Artemia-Zählung unter dem binokularen Mikroskop. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Strukturen ausgewählter Verbindungen. Struktur der Verbindungen 1-2, extrahiert aus Plectranthus-Spezies , und Verbindungen 3-5, erhalten durch Halbsynthese. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Representative Results
Die allgemeine Toxizität einiger Naturstoffe, die kürzlich von unserer Gruppe untersucht wurden, wurde durch den Sole-Garnelen-Letalitäts-Bioassay bewertet. Vier Auszüge (Pa- P. ambigerus; Pb- P. barbatus; Pc- P. cylindraceus; und Pe- P. ecklonii) aus der Gattung Plectranthus , die für ihre antioxidative Wirkung bekannt sind (unveröffentlichte Ergebnisse), wurden getestet. Zusätzlich werden zwei natürliche Verbindungen (1 und 2), die aus Plectranthus spp. gewonnen werden, und drei halbsynthetische Derivate (3, 4, 5; Abbildung 3), die alle in einer anderen Arbeit3 beschrieben wurden, wurden ebenfalls untersucht. Hierin wird ihre vorläufige Bewertung in Bezug auf eine mögliche zytotoxische Aktivität berichtet.
Alle getesteten Extrakte zeigten sehr ermutigende Ergebnisse mit sehr niedrigen Mortalitätsraten, vergleichbar mit denen, die für die Blindprobe (Salzlösung) und die Negativkontrolle (DMSO; Abbildung 4). Umgekehrt zeigte unter den reinen Verbindungen 1-5 nur Derivat 5 eine niedrige Mortalitätsrate (2,30% bei einer Konzentration von 100 ppm) ohne allgemeine Toxizität (Abbildung 5).
Abbildung 4: Letalität von Extrakten auf Artemia salina. Mortalitätsrate von A. salina (%) nach 24 h Exposition bei vier methanolischen Extrakten von Plectranthus spp., bei 0,1 mg/ml (Pa- P. ambigerus; Pb- P. barbatus; Pc- P. cylindraceus; Pe- P. ecklonii). Alle Extrakte waren in Bezug auf die allgemeine Toxizität mit diesem Assay akzeptabel. Salz entspricht der Salzlösung (leer); Als Positivkontrolle wurdeK2Cr2O7und DMSO als Negativkontrolle verwendet. Die Ergebnisse wurden als Mittelwert von drei unabhängigen Experimenten mit jeweils internen Vierfachexperimenten (n = 12) ± SD ausgedrückt. Vergleiche wurden innerhalb von Gruppen durch die Varianzanalyse unter Verwendung der Einweg-ANOVA mit Dunnetts Post-Test durchgeführt. Signifikante Unterschiede zwischen Kontroll- und Versuchsgruppen wurden mit einer kommerziellen statistischen Analysesoftware bewertet. Ein Wahrscheinlichkeitsniveau p < 0,01 wurde als statistischer Signifikanz angesehen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Letalität von Verbindungen auf Artemia salina. Mortalitätsrate von A. salina (%) nach 24-stündiger Exposition gegenüber fünf reinen Verbindungen bei 0,1 mg/ml (1 und 2 sind Naturstoffe und 3-5 sind Derivate, die aus 1 und 2 hergestellt wurden). Es ist offensichtlich, dass nur 5 mit diesem Test eine sehr begrenzte Toxizität zeigen. Salz entspricht der Salzlösung (Blindwert); Als Positivkontrolle wurdeK2Cr2O7und als Negativkontrolle DMSO verwendet. Die Ergebnisse wurden als Mittelwert von drei unabhängigen Experimenten mit jeweils internen Vierfachexperimenten (n = 12) ± SD ausgedrückt. Vergleiche wurden innerhalb von Gruppen durch die Varianzanalyse unter Verwendung der Einweg-ANOVA mit Dunnetts Post-Test durchgeführt. Signifikante Unterschiede zwischen Kontroll- und Versuchsgruppen wurden mit einer kommerziellen statistischen Analysesoftware bewertet. Ein Wahrscheinlichkeitsniveau p < 0,01 wurde als Hinweis auf eine statistische Signifikanz angesehen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Die Naturstoffe 1 und 2 wiesen eine mäßige Letalität auf (36,68 % bzw. 30,95 % bei 100 ppm), während die halbsynthetischen Derivate 3 und 4, die aus 1 bzw. 2 gewonnen wurden, toxischer waren als das ursprüngliche Gerüst (64,02 % bzw. 36,64 % bei 100 ppm; Abbildung 5).
Die Gesamtdaten deuten darauf hin, dass alle getesteten Extrakte, die für ihre antioxidative Wirkung bekannt sind und keine allgemeine Toxizität aufweisen, als Kandidaten für weitere In-vitro-Aktivitäts- und Toxizitätsstudien an ausgewählten Zelllinien angesehen werden können. Wenn die Abwesenheit von Toxizität auch in Hautmodellen nachgewiesen wird, kann die Entwicklung neuer bioaktiver Produkte für die kutane Anwendung durchgeführt werden. Auf der anderen Seite könnten die toxischen Wirkungen, die für die Verbindungen 1-4 beobachtet wurden, sie zu geeigneten Kandidaten für zusätzliche Bewertungen als Antikrebsmittel machen.
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Discussion
In den letzten Jahren hat die wissenschaftliche Gemeinschaft ihre Aufmerksamkeit auf alternative Modelle für Toxizitätsscreenings gelenkt21. Neben dem Bioassay A. salina lethality werden in der Regel andere Methoden zur Bewertung der Probenverträglichkeit durchgeführt und umfassen Wirbeltier-Bioassays (z. B. Nagetiere), Wirbellose (wie Zebrafische), In-vitro-Methoden mit Hefestämmen oder -zellen und In-silico-Methoden 22,23,24,25 . Alle diese Methoden haben klare Vor- und Nachteile, unter Berücksichtigung des Geld- und Zeitaufwands, der Reproduzierbarkeit der Ergebnisse und der Art der zu analysierenden Probe. Zum Beispiel stellen die In-silico-Ansätze eine standardisierte kostengünstige Methodik dar, die nur minimale Ausrüstung erfordert. Wenn sich solche Studien jedoch auf ein einziges Ziel konzentrieren, werden Ergebnisse von schlechter Qualität erzielt, so dass diese Alternative nicht mehr für vorläufige Screenings geeignet ist, wie wir in dieser Studie25,26 vorstellen. Wenn es um Mikroorganismen geht, gilt Saccharomyces cerevisiae als eines der am häufigsten verwendeten Modelle für die Bewertung toxischer Verbindungen23. In der Tat ist die Verwendung von In-vitro-Hefe im Allgemeinen schnell und einfach durchzuführen; Es kann jedoch teuer sein, da es spezifische chemische Produkte und Geräte erfordert und eine geringe Empfindlichkeit gegenüber minimalen Dosen zytotoxischer Verbindungen aufweist27. In einem alternativen Ansatz können menschliche Zellen schnell, einfach und kostengünstig eingesetzt werden. Dennoch können diese nicht einen ganzen Organismus repräsentieren; Daher werden Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Zelltypen und systemische Störungen, die unter physiologischen Bedingungen stattfinden, nicht angemessen berücksichtigt25,26. Auf der anderen Seite haben In-vivo-Assays den großen Vorteil, den gesamten Organismus zu berücksichtigen, aber Tiermodelle (wie Nagetiere) benötigen mehr Zeit für die Assay-Ausführung, sind teurer und implizieren komplexe ethische Überlegungen25. Umgekehrt sind In-vivo-Tests, bei denen Wasserorganismen für das Toxizitätsscreening verwendet werden, im Allgemeinen gut akzeptiert, wenn man auch berücksichtigt, dass die Verwendung von wirbellosen Meerestieren weniger ethischen Bedenken unterliegt und die Methodik einfach, schnell und kostengünstig ist21,24. In diesem Zusammenhang stellt die Verwendung von Zebrafischen zur Untersuchung der allgemeinen Toxizität oft die erste Wahl in der Praxis dar. Im Vergleich zu anderen Tierversuchen kann es als kostengünstige Option angesehen werden, da sich Zebrafische schnell entwickeln und das frühe Larvenstadium etwa 72 h bis 13 Tage nach der Befruchtung erreichen21,28. Die Wartung eines Zebrafisches erfordert jedoch gut ausgebildete Bediener und spezifische Bedingungen, wie z. B. ein Aquarium mit einem zirkulierenden System, das in der Lage ist, das Systemwasser zu belüften und zu filtern, um die Gesamtqualität zu erhalten. Darüber hinaus sind mehrere Deckel und Abflussabdeckungen notwendig, da Zebrafische springen können, sowie spezifische Lichtverhältnisse (14 h hell, 10 h dunkel) und der pH-Wert täglich kontrolliert werden muss, unter anderem29,30. Alles in allem machen diese Überlegungen Zebrafischmodelle zeitaufwendiger und teurer als das hier vorgestellte Artemia-Modell, da diese Mikrokrebstiere einfacher zu handhaben und für die Kultivierung in großen Populationen mit Labormethoden geeignet sind. Dies macht A. salina zweifellos zu einem der am häufigsten verwendeten Screening-Instrumente, das hauptsächlich zum Testen der allgemeinen Toxizität verschiedener Proben, wie z. B. Arzneimitteln und Heilpflanzenextrakten, verwendet wird1.
Im Protokoll wurden A. salina-Nauplien aufgezogen, gesammelt und mit geeigneten Proben für 24 Stunden inkubiert, um die durch jede Probe induzierte Naupliensterblichkeitsrate abzuschätzen . Im ersten Schritt erfolgt das Ausbrüten der Eier in einem handelsüblichen trichterförmigen Brutgefäß, in das kräftiges Blubbern eingebracht wurde (Abbildung 2A). Diese erzwungene Belüftung ist notwendig, da sie das Schlüpfen der Salzgarnelen so erfolgreich wie möglich ermöglicht. Das Schlüpfen erfolgt nach etwa 24 h bei 25 ± 3 °C, während bei niedrigeren Temperaturen bis zu 48 h erforderlich sein können. Sobald die Eier geschlüpft sind, wird die Pumpe ausgeschaltet, damit die leeren Eierbehälter oben schwimmen können, während Nauplien und nicht geschlüpfte Eier leicht durch Öffnen des Trichterhahns unten gesammelt werden können. Während unserer Experimente wurde nie ein vollständiges Schlüpfen der Eier erreicht, was das Vorhandensein von Nauplien und nicht reifen Eiern in der gesammelten Lösung zur Folge hatte. Aus diesem Grund wird zur effizienten Trennung der beiden Artemia-Formen eine handgefertigte Ausrüstung für die Migration der Salzgarnelen vorbereitet (Schritt 1.2). Ein Behälter wird mit den geernteten Organismen gefüllt und dann mit Aluminiumfolie bedeckt, während der andere Empfänger dem direkten Licht einer Lampe ausgesetzt wird. Unter diesen Bedingungen neigen die ungeschlüpften Eier dazu, sich niederzulassen, während die lebenden Nauplien durch das Licht, das auf den benachbarten Behälter trifft, angezogen werden, was die Wanderung von einer Seite zur anderen durch die Brückenverbindung begünstigt. Nach 4 h sind fast alle lebenden Nauplien im Inneren des Behälters dem Licht ausgesetzt und bereit, für die Durchführung des Tests gesammelt zu werden. In diesem Stadium werden Teile der Salzwasserlösung, die zehn bis fünfzehn Nauplien enthalten, entfernt und mit jeder der zu testenden Proben inkubiert.
In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die Methode effizient, wirtschaftlich und einfach durchzuführen ist. Bei der Durchführung dieses Assays sollten jedoch einige kritische Punkte berücksichtigt werden.
Der Test wird normalerweise mit Leitungswasser durchgeführt. Abhängig von geographischen und physikalisch-chemischen Faktoren weist Leitungswasser eine unterschiedliche Härteverteilung auf, die die Reproduzierbarkeit des Assays und insbesondere den Schlupfschritt der Eier beeinflusst. Aus dem gleichen Grund könnte die Verwendung von Meerwasser die Reproduzierbarkeit des Tests beeinflussen. Die schwankende Salzkonzentration, das Vorhandensein von Verunreinigungen, Mikroplastik und anderen Blutkörperchen würde den Bediener zwingen, sich weiteren Schritten wie Filtrationen und anderen Reinigungsarten zu unterziehen, die das Experiment komplexer und weniger einfach zu handhaben machen würden. Alles in allem sollten optimale Bedingungen auf der Grundlage der Eigenschaften und der Verfügbarkeit von Leitungswasser festgelegt werden, insbesondere durch eine sorgfältige Regulierung der Menge an künstlichem Salz, das eine geeignete Umgebung schafft und auch als Nahrung für die Nauplien dient.
Große Temperaturschwankungen können zu niedrigeren Schlupfraten führen. Infolgedessen konnte eine geringe Anzahl lebender Artemia beobachtet werden, gemischt mit einer hohen Anzahl von nicht geschlüpften Eiern. Natürlich sind solche Bedingungen nicht für die Entwicklung zuverlässiger Assays geeignet, daher sollte eine kontrollierte Klimatisierung des Raumes oder die Verwendung geeigneter vertikaler Inkubatoren in Betracht gezogen werden.
Eine kräftige Belüftung der Lösung innerhalb des Schlupfgefäßes ist erforderlich. Das Vorhandensein von kontinuierlichem Blubbern begünstigt den Kontakt zwischen den Eiern und beschleunigt den Schlupfprozess.
Das Sammeln von ungeschlüpften Eiern und Nauplien während der Ernte kann die Zuverlässigkeit des Tests stark beeinflussen. Dies ist auf die Möglichkeit des Schlüpfens während der Inkubation mit den Proben zurückzuführen. In diesem Fall wurden nicht alle Nauplien für die gleiche Zeit exponiert, was zu fehlerhaften Sterblichkeitsraten führte. Da Eier und Nauplien zu klein sind, um effizient getrennt zu werden, sind höhere Inkubationszeiten in der Brutausrüstung oder der Einsatz der handgefertigten Migrationsausrüstung erforderlich.
Jede Vertiefung sollte 10-15 Nauplien für den Inkubationsschritt enthalten, die sorgfältig mit einem Binokularmikroskop (12-fache Vergrößerung) gezählt werden. Das Vorhandensein von zu vielen Nauplien in derselben Vertiefung kann die endgültige Zählung aufgrund von Überschneidungen erschweren oder sogar fehlerhaft machen. Auf der anderen Seite würden kleine Mengen von Garnelen zu Ergebnissen führen, die keine statistische Signifikanz haben.
Wie offensichtlich ist, hängen die meisten Probleme dieser Methode mit den Schlupf- und Wachstumsphasen zusammen, in denen mehr Aufmerksamkeit erforderlich ist, um Zuverlässigkeitsprobleme zu vermeiden. Dennoch kann die Methode Modifikationen tolerieren, insbesondere in Bezug auf die kritischsten Punkte, die oben beschrieben wurden. Wenn einer dieser Parameter geändert wird, kann es natürlich notwendig sein, mehrere Versuche durchzuführen, um die ursprüngliche Methode zu optimieren. Zum Beispiel kann die Änderung der Temperatur helfen, die Gesamtzeit des Assays zu kontrollieren: Eine Erhöhung der Temperatur auf 28-29 ° C erhöht auch die Schlupfrate und beschleunigt den gesamten Prozess.
Einige Einschränkungen des A. salina-Bioassays hängen auch mit der Stabilität der Proben gegenüber den Testbedingungen und der Testzeit zusammen . Der Assay kann nur mit Proben durchgeführt werden, die bei Raumtemperatur und unter sichtbarem Licht stabil sind. Darüber hinaus muss berücksichtigt werden, dass das gesamte Verfahren mindestens 4 Tage dauert, und wenn die Schlupfrate niedrig ist, kann der Assay einen zusätzlichen Tag für den Schlupfschritt benötigen.
Insgesamt heben wir in dieser Studie zwei Beispiele für die Anwendung der allgemeinen Toxizitätsbewertung durch die A. salina-Methode hervor. Für alle untersuchten Proben wurde eine allgemeine Toxizität festgestellt. Extrakte aus Plectranthus-Pflanzen und Verbindung 5 zeigten keine allgemeine Toxizität, während sich die Verbindungen 1-4 auf Salzgarnelen als mäßig oder sogar hochgiftig erwiesen. Insbesondere die negative Wirkung der Verbindungen 1 und 2 auf Artemia wurde zuvor von Sitarek und Matias durch MTT- bzw. SRB/MTT-Assaysnachgewiesen 31,32. Gleichzeitig weisen die benzoylierten Analoga, die Verbindungen 3 und 4, höhere Toxizitätswerte auf als ihre Vorläufer 1 und 2, was unterstreicht, dass die Esterfunktionalisierung eine wichtige Rolle in Bezug auf die Zytotoxizität spielen könnte, wie Garcia et al. für Verbindung 4 in der humanen NSCLC-MDR-Krebszelllinie bestätigt haben.33. Es sind jedoch andere Tests erforderlich, um zu bestätigen, dass eine solche zytotoxische Aktivität in der Krebstherapie ausgenutzt werden könnte. Auf der anderen Seite zeigte Derivat 5 zusammen mit allen untersuchten Extrakten keine Toxizität und erscheint als die vielversprechendste reine Verbindung der Serie. Es sind jedoch weitere Studien erforderlich, um die potenzielle biologische Aktivität für die kutane Anwendung zu bewerten.
Hier haben wir gezeigt, wie die Verwendung der Artemia Salina-basierten Methode als Screening-Tool im Vergleich zu anderen bekannten Methoden Zeit und Geld sparen kann. Es stellt eine effiziente und vorteilhafte Möglichkeit dar, in vorläufigen Toxizitätskontexten genutzt zu werden. Es kann in Gegenwart verschiedener und komplexer Proben, synthetischer und halbsynthetischer Drogen sowie zur biogesteuerten Fraktionierung von Naturstoffextrakten und -proben verwendet werden.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte, weder finanziell noch anderweitig.
Acknowledgments
In Erinnerung an Professor Amilcar Roberto.
Diese Arbeit wurde von der Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, Portugal) im Rahmen der Projekte UIDB/04567/2020 und UIDP/04567/2020 finanziell unterstützt, die CBIOS und dem Promotionsstipendium SFRH/BD/137671/2018 (Vera Isca) zugeschrieben wurden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Thermo Fisher Scientific, Denmark | 174899 | Thermo Scientific Nunc Up Cell 24 multidish |
| Aluminium foil | Albal | - | Can be purchased in supermarket |
| Artemio Set | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 61066000 | Can be purchased in pet shops |
| Binocular microscope | Ceti, Belgium | 1700.0000 | Flexum-24AED, 220-240 V, 50 Hz |
| Bottles | - | - | 0.5 L Diameter: 5.8 cm; Height: 12 cm |
| Brine shrimp cysts | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 3090700 | Can be purchased in pet shops |
| Brine shrimp salt | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 3090600 | Can be purchased in pet shops |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | VWR chemicals | CAS: 67-68-5 | 99% purity |
| Discartable tips | Diamond | F171500 | Volume range: 100 - 1000 µL |
| Eppendorf microtubes | BRAND | 7,80,546 | Microtubes, PP, 2 mL, BIO-CERT PCR QUALITY |
| Erlenmeyer flask | VWR chemicals | 4,47,109 | volume: 100 mL |
| Glass beaker | Normax | 3.2111654N | Volume: 1000 mL |
| Gloves | Guantes Luna | GLSP3 | - |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, San Diego, CA, USA | - | GraphPad Prism version 5.00 for Windows, www.graphpad.com, accessed on 5 February 2021; commercial statistical analysis software |
| Home-made A. salina Grower | - | - | Home made: two plastic bottles connected by a hose |
| Hot glue | Parkside | PHP500E3 | 230 V, 50 Hz, 25 W |
| Incubator | Heidolph Instruments, Denmark | - | One Heidolph Unimax 1010 equipment and one Heidolph Inkubator 1006 |
| Light | Roblan | SKYC3008FE14 | LED light bulb |
| Micropipettes | VWR chemicals | 613-5265 | Volume range: 100 - 1000 µL |
| Potassium dichromate (K2Cr2O7) | VWR chemicals | CAS: 7778-50-9 | 99% purity |
| Pump ProAir a50 | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | - | Included in the Artemio Set+1 kit |
| Rubber tube | - | - | 1.3 cm outer and 0.9 cm inner diameter |
| Stirring rod | VWR chemicals | 441-0147 |  6 mm, 250 mm |
| Termometer | VWR chemicals | 620-0821 | 0 - 100 °C |
References
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