Summary
Dette arbejde har til formål at evaluere og gennemgå Artemia salina lethality bioassay procedure, også identificeret som saltlage rejer dødelighed assay. Denne enkle og billige metode giver oplysninger om den generelle toksicitet (betragtes som en foreløbig toksicitetsvurdering) af prøver, nemlig naturlige produkter.
Abstract
Naturprodukter er blevet brugt siden oldtiden til fremstilling af medicin. I dag er der masser af kemoterapeutiske lægemidler opnået fra naturlige kilder og brugt mod en overflod af sygdomme. Desværre viser de fleste af disse forbindelser ofte systemisk toksicitet og bivirkninger. For bedre at kunne vurdere tolerabiliteten af udvalgte potentielt bioaktive prøver anvendes artemia (Artemia salina) generelt som model i dødelighedsundersøgelser. A. salina-testen er baseret på de undersøgte bioaktive forbindelsers evne til at dræbe mikrokrebsdyrene i deres larvestadie (nauplii). Denne metode repræsenterer et praktisk udgangspunkt for cytotoksicitetsundersøgelser såvel som for generel toksicitetsscreening af syntetiske, semisyntetiske og naturlige produkter. Det kan betragtes som et simpelt, hurtigt og billigt assay sammenlignet med mange andre assays (in vitro-celler eller gærstammer, zebrafisk, gnavere), der generelt er egnede til ovennævnte formål; Desuden kan det let udføres selv uden nogen specifik træning. Samlet set repræsenterer A. salina-analysen et nyttigt værktøj til foreløbig toksicitetsevaluering af udvalgte forbindelser og biostyret fraktionering af naturlige produktekstrakter.
Introduction
Naturprodukter fra planter, dyr eller mikroorganismer har været et voksende interesseområde gennem årene i udviklingen af nye bioaktive molekyler på grund af deres varierede udvalg af biologiske og farmakologiske aktiviteter1. Imidlertid repræsenterer de tilknyttede bivirkninger, lægemiddelresistens eller utilstrækkelig specificitet af midlerne, især når de anvendes som kræftlægemidler, de vigtigste faktorer, der kan føre til ineffektiv behandling 1,2.
I løbet af de sidste par årtier er flere planteafledte cytotoksiske midler blevet opdaget, nogle af dem anvendes som kræftmidler 1,2,3. I denne sammenhæng rapporteres paclitaxel som et af de mest kendte og mest aktive kemoterapeutiske lægemidler af naturlig oprindelse 3,4. I øjeblikket anslås det, at mere end 35 % af alle lægemidler på markedet er afledt af eller inspireret af naturlige produkter5. Den potentielle høje toksicitet af disse forbindelser kræver overvejelse under alle undersøgelsesfaserne, da forskellige typer forurenende stoffer eller endda metaboliske komponenter i selve planten kan forårsage toksiske virkninger. Derfor bør der i den indledende fase foretages farmakologiske og toksikologiske profiler for at vurdere den biologiske aktivitet og sikkerheden ved nye potentielle plantebaserede behandlinger. For at evaluere toksiciteten af nye bioaktive prøver kan hvirvelløse dyr betragtes som de bedste modeller at studere. De kræver minimale etiske krav og tillader foreløbige in vitro-assays for at prioritere de mest lovende produkter til den næste testrunde i hvirveldyr 1,6.
Almindeligvis kendt som artemia, A. salina er et lille halofilt hvirvelløse dyr, der tilhører slægten Artemia (familie Artemiidae, orden Anostraca, subphylum Crustacea; Figur 1). I marine og akvatiske saltvandsøkosystemer spiller artemia en vigtig ernæringsmæssig rolle, da de lever af mikroalger og er bestanddele af zooplanktonet, der bruges til at fodre fisk. Desuden anvendes deres larver (kendt som nauplii) i vid udstrækning til vurdering af generel toksicitet under indledende undersøgelser 1,3,7.
Artemia spp. anvendes i vid udstrækning i dødelighedsundersøgelser og er også et bekvemt udgangspunkt for toksicitetsvurderinger ved at spore toksiciteten af potentielt bioaktive forbindelser baseret på deres evne til at dræbe nauplii dyrket i laboratoriet 1,8. Af denne grund blev brugen af A. salina tiltrukket i generelle toksicitetsundersøgelser, fordi det er en meget effektiv og brugervenlig metode sammenlignet med andre forsøg på dyremodeller9.
På grund af deres enkle anatomi, lille størrelse og korte livscyklus kan et stort antal hvirvelløse dyr studeres i et enkelt eksperiment. Som sådan kombinerer de genetisk modtagelighed og billig kompatibilitet med storstilede screeninger1. I denne sammenhæng viser brugen af artemia i en generel toksicitetsanalyse flere fordele, såsom hurtig vækst (28-72 timer er nødvendig fra udklækning til de første resultater), omkostningseffektivitet og lang holdbarhed af kommercielle æg, der kan bruges hele året rundt 3,10. På den anden side, da hvirvelløse dyr har et primitivt organsystem og mangler et adaptivt immunsystem, repræsenterer de ikke en perfekt og pålidelig model for humane celler1.
Den indeholder imidlertid en foreløbig evalueringsmetode for udvalgte prøvers generelle toksicitet. Da det er almindeligt anvendt som en dødelighed assay, det kan give foreløbige indikationer om de toksiske virkninger af potentielle anticancer agenter. Det bruges ofte også til at få feedback om den generelle toksicitet af forbindelser, der er udstyret med andre biologiske aktiviteter, for hvilke det er vigtigt at vise den lavest mulige dødelighed blandt Artemia-rejer .
I en igangværende undersøgelse fra vores gruppe viste forskellige ekstrakter fra Plectranthus arter antioxidant og antimikrobielle aktiviteter (upublicerede resultater). Parallelt blev isolerede forbindelser opnået ved oprensning af ekstrakterne og blev derefter kemisk modificeret. Ekstrakterne, rene forbindelser og semisyntetiske derivater blev derefter testet med hensyn til generel toksicitet. I denne sammenhæng har dette arbejde til formål at give et overblik over anvendelsen af Artemia lethality bioassay til evaluering af generel toksicitet og potentiel cytotoksisk aktivitet af bioaktive ekstrakter og isolerede forbindelser fra forskellige planter af slægten Plectranthus11.
Figur 1: Artemia salina under mikroskop. Nyklækket nauplii af A. salina set under mikroskop (forstørrelse 12x). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse af udstyr
- Anskaf kommercielt tilgængeligt rugeudstyr. Vælg et passende sted at opsætte rugeudstyret (figur 2A). Placer den tragtformede beholder i den sorte understøtning (inkluderet i sættet), og drej tragten i en passende retning for at se niveaumærket og hanen.
- For at fremstille håndlavet migrationsudstyr skal du skære toppen af to 0,5 L (5,8 cm diameter) plastflasker for at opnå en endelig højde på 12 cm. Opret et hul på 1,5 cm diameter på den ene side 7 cm fra bunden i hver flaske, og indsæt et 13 cm gummirør (1,3 cm ydre og 0,9 cm indvendig diameter) mellem de to åbninger. Forsegl åbningerne med varm lim (figur 2B) og lad dem tørre i 15 minutter; Sæt flaskerne på en plan overflade og fyld dem med vand for at kontrollere, at der ikke er lækage.
2. Fremstilling af kunstig saltopløsning
- I et glasbægerglas fremstilles en kunstig saltopløsning (saltlagesalt) i en koncentration på 35 g/l. For at gøre dette tilsættes 28 g salt til 800 ml ledningsvand i henhold til producentens anvisninger. Bland det med en omrøringsstang, indtil alt saltet er grundigt opløst.
BEMÆRK: Juster volumenet af den tilberedte saltopløsning i henhold til størrelsen på de tilgængelige beholdere.
3. Forberedelse af prøver
- Alle prøverne fremstilles i et mikrocentrifugerør ved at opløse en passende mængde ekstrakter (Plectranthus-ekstrakter , Pa- P. ambigerus; Pb - P. barbatus; Pc-P. cylindraceus ; og Pe-P. ecklonii) eller forbindelser 1-5 (to naturlige forbindelser [1 og 2] opnået fra Plectranthus spp. og tre halvsyntetiske derivater [3, 4, 5]; Figur 3) i dimethylsulfoxid (DMSO)12 for at opnå en slutkoncentration på 10 mg/ml (hvis prøven er vandopløselig, er det ikke nødvendigt at anvende DMSO).
- 10 μL af hver prøve (og DMSO til negativ kontrol) fortyndes i et nyt mikrocentrifugeglas med 990 μL kunstig saltopløsning fremstillet i trin 2.1 for at opnå en slutkoncentration på 0,1 mg/ml.
- Under en damphætte fremstilles der i en Erlenmeyerkolbe en opløsning af kaliumdichromat (K2Cr2O7) idestilleret vand i en koncentration på 1 mg/ml13,14,15.
4. Saltlage rejer dødelighed bioassay
BEMÆRK: Dette assay er udviklet fra værker af flere forfattere med modifikationer 1,16,17,18,19.
- Ruklebeholderen fyldes med substratet fremstillet i trin 2.1 op til niveaumærket (500 ml) (figur 2C).
- Anbring en ske (ca. 0,75 g) artemiascyster i saltopløsningen, og luk derefter beholderen. Placer en lampe (bordlampe, 40 W, 230 V, 50 Hz, med en LED-pære på 8 W, 4.000 K, 830 lm), der peger direkte mod udstyret (figur 2A), og tænd den.
- Fastgør luftleverandørsystemet (3 W udgang, 50 Hz, 230 V) til stikket placeret oven på udstyret, og tænd pumpen.
- Holdbarheden holdes ved 25 ± 3 °C. Brine rejer cyster klækkes i den kunstige saltopløsning, under kraftig beluftning, kontinuerlig belysning og stabil temperatur, efter 24 timer til 48 timer.
BEMÆRK: Alternativt kan en lodret inkubator anvendes. - Når æggene er klækket, skal du slukke for luftpumpen og vente, indtil nauplii (bevæger sig mod bunden af tragten) er adskilt fra de tomme ægkasser (flydende øverst).
- For at adskille de uudklækkede æg fra levende nauplii skal du åbne udløbshanen i bunden og tømme tragtens indhold i en af beholderne i den håndlavede migrationsudstyrsbeholder (beskrevet i trin 1.2). Sørg for, at opløsningen indeholdende nauplii og de resterende uudkraverede æg er under rørniveauet. I den anden beholder tilsættes den resterende saltopløsning fra trin 2.1 over rørets højde.
- Dæk beholderen med nauplii og de resterende uudklækkede æg ved hjælp af aluminiumsfolie. Placer lampen på den anden beholder med kun saltopløsningen. Saltlage rejer vil blive tiltrukket af lyset og migrere fra den ene beholder til den anden (høstbeholder), hvilket fører til effektiv adskillelse mellem æg (langsomt sedimenteret til bunden) og levende Artemia.
- Anbring derefter udstyret i inkubatoren under de samme betingelser, der anvendes i trin 4.4 i 4 timer (figur 2E). Fra høstbeholderen opsamles 900 μL saltopløsning indeholdende 10 til 15 nauplii. Saltopløsningen anbringes med nauplii i hvert hul i en plade med 24 brønde (figur 2F). Alle prøverne testes i fire eksemplarer.
- Der tilsættes 100 μL hver af de negative kontroller (DMSO), den positive kontrol (K2Cr2O7, kaliumdichromat), den kunstige saltopløsning og hver af prøverne til henholdsvis hul (figur 2F)13,14.
BEMÆRK: Prøverne i hver brønd vil være i en koncentration på 0,01 mg / ml. Den endelige koncentration af den positive kontrol i saltopløsning vil være 0,1 mg / ml for at være sikker på, at alle nauplii i brønden udsættes for den toksiske virkning af kaliumdichromat og dør. Den kunstige saltopløsning fungerer som blank. - Pladen inkuberes ved 25 ± 3 °C under belysning i 24 timer (figur 2G). Efter 24 timer registreres antallet af døde larver (ikke-mobile nauplii i 5 s) i hver brønd under et kikkertmikroskop (12x)20 (figur 2H). Alternativt kan du bruge en håndlinse.
- Tilsæt 100 μL kaliumdichromatopløsning for at fremkalde de resterende levende larvers død, og vent i 6 timer. Tæl de samlede døde larver i hver brønd under et mikroskop. Bestem dødeligheden i henhold til følgende ligning.
- Udfør al analysen i tre eksemplarer. Standardafvigelser (SD) beregnes, og resultaterne udtrykkes som gennemsnittet af tre uafhængige eksperimenter, hver med interne quadruplikater (n = 12), ± SD. Som nævnt af Meyer et al., betragt råekstrakter og rene forbindelser med LC50< 1.000 μg / ml som giftige; Der skal også tages hensyn til, at dødeligheden af artemia er proportional med koncentrationen af de testede prøver21.
Figur 2: Artemia salina lethality bioassay metode. A) Kommercielt tilgængeligt udstyr, der anvendes til udklækning af cyster med artemia; B) håndlavet migrationsudstyr C) Rugebeholder fyldt med saltopløsning; D) indsamling af uudklækkede æg og nauplii (E) Håndlavet udstyr i inkubatoren under migrationstrinnet. Beholderen langt fra lampen skal være dækket af aluminiumsfolie; Men for et bedre overblik over den indstillede installation her blev den fjernet; (F) Høst af Artemia i brønde inden udførelse af analysen. Forbindelserne anbringes som vist: - henviser til den negative kontrol (DMSO), + til den positive kontrol (K2Cr2O7), salt til den kunstige saltopløsning og 1 til 3 til prøverne til test (i dette tilfælde forbindelse 1-3); G) Inkubation af pladen med 24 brønde indeholdende Artemia og de udvalgte prøver (H) Artemia tæller under kikkertmikroskopet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Strukturer af udvalgte forbindelser. Struktur af forbindelser 1-2, ekstraheret fra Plectranthus-arter , og forbindelser 3-5, opnået ved semisyntese. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den generelle toksicitet af nogle naturlige produkter, der for nylig blev undersøgt af vores gruppe, blev evalueret gennem bioassay med saltlagemia. Fire uddrag (Pa- P. ambigerus; Pb- P. barbatus; Pc- P. cylindraceus; og Pe-P. ecklonii) fra Plectranthus slægten, kendt for deres antioxidant aktivitet (upublicerede resultater), blev testet. Derudover to naturlige forbindelser (1 og 2) opnået fra Plectranthus spp. og tre halvsyntetiske derivater (3, 4, 5; Figur 3), alle beskrevet i et andet værk3, blev også undersøgt. Heri rapporteres deres foreløbige vurdering med hensyn til potentiel cytotoksisk aktivitet.
Alle de testede ekstrakter viste meget opmuntrende resultater med meget lave dødelighedsrater, der kan sammenlignes med dem, der er registreret for blindprøven (saltopløsning) og den negative kontrol (DMSO; Figur 4). Omvendt viste kun derivat 5 blandt de rene forbindelser 1-5 en lav dødelighed (2,30% ved en koncentration på 100 ppm) uden generel toksicitet (figur 5).
Figur 4: Dødelighed af ekstrakter på Artemia salina. Dødelighed af A. salina (%) efter 24 timers eksponering for fire methanolekstrakter af Plectranthus spp., ved 0,1 mg/ml (Pa- P. ambigerus; Pb- P. barbatus; Pc- P. cylindraceus; Pe- P. ecklonii). Alle ekstrakterne var acceptable med hensyn til generel toksicitet ved anvendelse af denne analyse. Salt svarer til saltopløsningen (blank); K2 Cr2O7 blev anvendt som positiv kontrol og DMSO som negativ kontrol. Resultaterne blev udtrykt som gennemsnittet af tre uafhængige eksperimenter, hver med interne quadruplikater (n = 12) ± SD. Sammenligninger blev udført inden for grupper ved variansanalyse ved hjælp af envejs ANOVA med Dunnetts post-test. Signifikante forskelle mellem kontrol- og eksperimentelle grupper blev vurderet ved hjælp af en kommerciel statistisk analysesoftware. Et sandsynlighedsniveau p < 0,01 blev anset for at indikere statistisk signifikans. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Lethalitet af forbindelser på Artemia salina. Dødelighed af A. salina (%) efter 24 timers eksponering for fem rene forbindelser ved 0,1 mg / ml (1 og 2 er naturlige produkter og 3-5 er derivater fremstillet fra 1 og 2). Det er tydeligt, at kun 5 viser meget begrænset toksicitet ved anvendelse af dette assay. Salt svarer til saltopløsningen (blank); K2 Cr2O7 blev anvendt som positiv kontrol og DMSO som negativ kontrol. Resultaterne blev udtrykt som gennemsnittet af tre uafhængige eksperimenter, hver med interne quadruplikater (n = 12) ± SD. Sammenligninger blev udført inden for grupper ved variansanalyse ved hjælp af envejs ANOVA med Dunnetts post-test. Signifikante forskelle mellem kontrol- og eksperimentelle grupper blev vurderet ved hjælp af en kommerciel statistisk analysesoftware. Et sandsynlighedsniveau p < 0,01 blev anset for at indikere statistisk signifikans. Klik her for at se en større version af denne figur.
Naturprodukter 1 og 2 viste moderat dødelighed (henholdsvis 36,68% og 30,95% ved 100 ppm), mens semisyntetiske derivater 3 og 4, opnået fra henholdsvis 1 og 2, var mere giftige end det oprindelige stillads (henholdsvis 64,02% og 36,64% ved 100 ppm; Figur 5).
Samlede data tydede på, at alle de testede ekstrakter, der er kendt for deres antioxidantaktivitet og ikke viser nogen generel toksicitet, kan betragtes som kandidater til yderligere in vitro-aktivitets - og toksicitetsundersøgelser på udvalgte cellelinjer. Hvis fraværet af toksicitet også påvises i kutane modeller, kan udviklingen af nye bioaktive produkter til kutan anvendelse udføres. På den anden side kan de toksiske virkninger, der observeres for forbindelse 1-4, gøre dem egnede kandidater til yderligere evalueringer som kræftmidler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I løbet af de seneste år har det videnskabelige samfund øget sin opmærksomhed mod alternative modeller for toksicitetsscreeninger21. Ved siden af A. salina lethality bioassay udføres normalt andre metoder til evaluering af prøvetolerabilitet og inkluderer bioassays af hvirveldyr (såsom gnavere), hvirvelløse dyr (såsom zebrafisk), in vitro-metoder ved anvendelse af gærstammer eller celler og in silico-metoder 22,23,24,25 . Alle disse metoder har klare fordele og ulemper i betragtning af brugte penge og tid, reproducerbarhed af resultaterne og den type prøve, der skal analyseres. For eksempel repræsenterer in silico-tilgangene en standardiseret billig metode, der kræver minimalt udstyr. Ikke desto mindre, når sådanne undersøgelser er fokuseret på et enkelt mål, opnås resultater af dårlig kvalitet, hvilket gør dette alternativ uden for rammerne af foreløbige screeninger, som vi præsenterer i denne undersøgelse25,26. Når det kommer til mikroorganismer, betragtes Saccharomyces cerevisiae som en af de mest anvendte modeller til evaluering af toksiske forbindelser23. Faktisk er brugen af in vitro-gær generelt hurtig og nem at udføre; Det kan dog være dyrt, da det kræver specifikke kemiske produkter og udstyr og viser lav følsomhed over for minimale doser af cytotoksiske forbindelser27. I en alternativ tilgang kan humane celler anvendes på en hurtig, enkel og billig måde. Alligevel kan disse ikke repræsentere en hel organisme; Således tages interaktioner mellem forskellige celletyper og systemiske forstyrrelser, der finder sted under fysiologiske forhold, ikke passende i betragtning25,26. På den anden side har in vivo-assays den store fordel, at de tager hensyn til hele organismen, men dyremodeller (såsom gnavere) kræver mere tid til analyseudførelsen, er dyrere og indebærer komplekse etiske overvejelser25. Omvendt er in vivo-assays, der anvender akvatiske organismer til toksicitetsscreening, generelt velaccepterede, også i betragtning af at brugen af marine hvirvelløse dyr gennemgår mindre etiske bekymringer, og metoden er let at udføre, hurtig og billig21,24. I denne sammenhæng repræsenterer brugen af zebrafisk til undersøgelse af generel toksicitet ofte det første valg på området. Faktisk kan det sammenlignet med andre dyreforsøg betragtes som en billig løsning, da zebrafisk udvikler sig hurtigt og når det tidlige larvestadie omkring 72 timer til 13 dage efter befrugtning21,28. Ikke desto mindre kræver vedligeholdelse af en zebrafisk veluddannede operatører og specifikke forhold, såsom et akvarium med et cirkulationssystem, der er i stand til at lufte og filtrere systemets vand, for at opretholde den overordnede kvalitet; desuden er flere låg og afløbsdæksler nødvendige, da zebrafisk kan hoppe, samt specifikke lysforhold (14 timers lys, 10 timers mørke), og pH-niveauer skal kontrolleres dagligt, blandt andet29,30. Alt i alt gør disse overvejelser zebrafiskmodeller mere tidskrævende og dyre end Artemia-modellen, der er rapporteret her, da disse mikrokrebsdyr er lettere at håndtere og levedygtige til dyrkning i store populationer ved hjælp af laboratoriemetoder. Dette gør A. salina utvivlsomt til et af de mest anvendte screeningsværktøjer, der hovedsageligt bruges til at teste den generelle toksicitet af forskellige prøver, såsom lægemidler og medicinske planteekstrakter1.
I protokollen er A. salina nauplii blevet opdrættet, indsamlet og inkuberet med passende prøver i 24 timer for at estimere nauplii-dødeligheden induceret af hver prøve. I det første trin udføres ægklækken i et kommercielt tilgængeligt tragtformet avlsfartøj, hvor kraftig boblende blev introduceret (figur 2A). Denne tvungne beluftning er nødvendig, da det gør det muligt for rejer af saltlage at forekomme så vellykket som muligt. Udklækningen sker ved ca. 24 timer ved 25 ± 3 °C, mens op til 48 timer kan være nødvendig ved lavere temperaturer. Når æggene klækkes, slukkes pumpen, så de tomme ægkasser kan flyde på toppen, mens nauplii og uudklækkede æg let opsamles ved at åbne tragthanen i bunden. Under vores eksperimenter blev fuldstændig ægudklækning aldrig opnået med den deraf følgende tilstedeværelse af nauplii og ikke-modne æg i den indsamlede opløsning. For effektivt at adskille de to former for Artemia fremstilles derfor et håndlavet udstyr til migration af artemia af artemia (trin 1.2). Den ene beholder fyldes op med de høstede organismer og dækkes derefter med aluminiumsfolie, mens den anden modtager udsættes for det direkte lys fra en lampe. Under disse forhold har de ikke-udklækkede æg en tendens til at slå sig ned, mens de levende nauplii tiltrækkes af lyset, der rammer den tilstødende beholder, hvilket favoriserer migrationen fra den ene side til den anden gennem broforbindelsen. Efter 4 timer er næsten alle levende nauplii inde i beholderen udsat for lyset og klar til at blive opsamlet til udførelse af analysen. På dette stadium fjernes dele af saltvandsopløsningen, der indeholder ti til femten nauplii, og inkuberes med hver af de prøver, der skal testes.
I dette arbejde har det vist sig, hvordan metoden er effektiv, økonomisk og let at udføre. Der er dog nogle kritiske punkter, der bør anerkendes, når denne analyse udføres.
Analysen udføres normalt med ledningsvand. Afhængigt af geografiske og fysisk-kemiske faktorer udviser ledningsvand forskellig hårdhedsfordeling, hvilket påvirker reproducerbarheden af analysen og især ægklækningstrinnet. Af samme grund kan brugen af havvand påvirke testens reproducerbarhed. Den varierende saltkoncentration, tilstedeværelsen af forurenende stoffer, mikroplast og andre blodlegemer ville tvinge operatøren til at gennemgå yderligere trin, såsom filtreringer og andre former for rensning, hvilket ville gøre eksperimentet mere komplekst og mindre let at håndtere. Alt taget i betragtning bør optimale forhold afregnes baseret på egenskaberne og tilgængeligheden af ledningsvand, især ved en omhyggelig regulering af mængden af tilsat kunstigt salt, der skaber et passende miljø og også fungerer som næring for nauplii.
Store variationer i temperaturer kan resultere i lavere skraveringshastigheder. Som følge heraf kunne lave niveauer af levende Artemia observeres blandet med et stort antal uudklækkede æg. Det er klart, at sådanne betingelser ikke er egnede til udvikling af pålidelige assays, så en kontrolleret klimatisering af rummet eller brugen af passende vertikale inkubatorer bør overvejes.
Kraftig beluftning af opløsningen i rugebeholderen er påkrævet. Tilstedeværelsen af kontinuerlig bobling favoriserer kontakten mellem æg og fremskynder rugeprocessen.
Indsamling af både uudklækkede æg og nauplii under høsten kan stærkt påvirke analysens pålidelighed. Dette skyldes muligheden for udklækning under inkubationen med prøverne. I dette tilfælde vil ikke alle nauplii have været udsat i samme tid med deraf følgende fejlagtige dødelighedsrater. Da æg og nauplii er for små til at blive effektivt adskilt, er der behov for højere inkubationstider i rugeudstyret eller brug af det håndlavede migrationsudstyr.
Hver brønd skal indeholde 10-15 nauplii til inkubationstrinnet, omhyggeligt talt ved brug af et kikkertmikroskop (12x forstørrelse). Tilstedeværelsen af for mange nauplii i samme brønd kan gøre den endelige optælling vanskelig eller endog fejlagtig på grund af overlapning. På den anden side ville små mængder rejer føre til resultater uden statistisk signifikans.
Som det er tydeligt, er de fleste af problemerne med denne metode relateret til ruge- og vækststadierne, hvor der kræves mere opmærksomhed for at undgå pålidelighedsproblemer. Alligevel kan metoden tolerere ændringer, især i forhold til de mest kritiske punkter beskrevet ovenfor. Når en af disse parametre ændres, kan det naturligvis være nødvendigt at udføre flere forsøg på at optimere den oprindelige metode. For eksempel kan ændring af temperaturen hjælpe med at kontrollere den samlede tid for analysen: at øge temperaturen op til 28-29 ° C vil også øge lugehastigheden og fremskynde hele processen.
Nogle begrænsninger af A. salina bioassay er også relateret til stabiliteten af prøverne til testbetingelserne og tiden. Analysen kan kun udføres ved hjælp af prøver, der er stabile ved stuetemperatur og under synligt lys. Desuden skal det tages i betragtning, at hele proceduren varer mindst 4 dage, og hvis lugehastigheden er lav, kan analysen have brug for en ekstra dag til rugetrinnet.
Samlet set fremhæver vi i denne undersøgelse to eksempler på anvendelsen af den generelle toksicitetsvurdering gennem A. salina-metoden. Der er fastslået generel toksicitet for alle de undersøgte prøver. Ekstrakter fra Plectranthus planter og forbindelse 5 viste ingen generel toksicitet, mens forbindelser 1-4 viste sig at være moderat eller endda meget giftige på artemia. Især blev den negative virkning af forbindelse 1 og 2 på Artemia tidligere påvist af Sitarek og Matias ved MTT- og SRB/MTT-assays, henholdsvis31,32. Samtidig viser benzoylerede analoger, forbindelser 3 og 4, højere toksicitetsværdier end deres forstadier 1 og 2, hvilket fremhæver, at esterfunktionaliseringen kunne have en vigtig rolle med hensyn til cytotoksicitet, som bekræftet for forbindelse 4 i human NSCLC MDR-kræftcellelinje af Garcia et al.33. Imidlertid er andre assays nødvendige for at bekræfte, at en sådan cytotoksisk aktivitet kunne udnyttes i kræftbehandling. På den anden side viste derivat 5 sammen med alle de analyserede ekstrakter ingen toksicitet og fremstår som den mest lovende rene forbindelse i serien. Der er dog behov for yderligere undersøgelser for at evaluere den potentielle biologiske aktivitet til kutan anvendelse.
Her demonstrerede vi, hvordan brugen af Artemia salina-baseret metode som screeningsværktøj kunne give mulighed for at spare tid og penge sammenlignet med andre kendte metoder. Det repræsenterer en effektiv og fordelagtig måde at blive udnyttet i foreløbige toksicitetssammenhænge. Det kan bruges i nærværelse af forskellige og komplekse prøver, syntetiske og halvsyntetiske stoffer samt til biostyret fraktionering af naturlige produktekstrakter og prøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter, økonomiske eller på anden måde.
Acknowledgments
Til minde om professor Amilcar Roberto.
Dette arbejde blev støttet økonomisk af Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, Portugal) under projekterne UIDB/04567/2020 og UIDP/04567/2020 tildelt CBIOS og ph.d.-stipendium SFRH/BD/137671/2018 (Vera Isca).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Thermo Fisher Scientific, Denmark | 174899 | Thermo Scientific Nunc Up Cell 24 multidish |
| Aluminium foil | Albal | - | Can be purchased in supermarket |
| Artemio Set | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 61066000 | Can be purchased in pet shops |
| Binocular microscope | Ceti, Belgium | 1700.0000 | Flexum-24AED, 220-240 V, 50 Hz |
| Bottles | - | - | 0.5 L Diameter: 5.8 cm; Height: 12 cm |
| Brine shrimp cysts | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 3090700 | Can be purchased in pet shops |
| Brine shrimp salt | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 3090600 | Can be purchased in pet shops |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | VWR chemicals | CAS: 67-68-5 | 99% purity |
| Discartable tips | Diamond | F171500 | Volume range: 100 - 1000 µL |
| Eppendorf microtubes | BRAND | 7,80,546 | Microtubes, PP, 2 mL, BIO-CERT PCR QUALITY |
| Erlenmeyer flask | VWR chemicals | 4,47,109 | volume: 100 mL |
| Glass beaker | Normax | 3.2111654N | Volume: 1000 mL |
| Gloves | Guantes Luna | GLSP3 | - |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, San Diego, CA, USA | - | GraphPad Prism version 5.00 for Windows, www.graphpad.com, accessed on 5 February 2021; commercial statistical analysis software |
| Home-made A. salina Grower | - | - | Home made: two plastic bottles connected by a hose |
| Hot glue | Parkside | PHP500E3 | 230 V, 50 Hz, 25 W |
| Incubator | Heidolph Instruments, Denmark | - | One Heidolph Unimax 1010 equipment and one Heidolph Inkubator 1006 |
| Light | Roblan | SKYC3008FE14 | LED light bulb |
| Micropipettes | VWR chemicals | 613-5265 | Volume range: 100 - 1000 µL |
| Potassium dichromate (K2Cr2O7) | VWR chemicals | CAS: 7778-50-9 | 99% purity |
| Pump ProAir a50 | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | - | Included in the Artemio Set+1 kit |
| Rubber tube | - | - | 1.3 cm outer and 0.9 cm inner diameter |
| Stirring rod | VWR chemicals | 441-0147 |  6 mm, 250 mm |
| Termometer | VWR chemicals | 620-0821 | 0 - 100 °C |
References
- Ntungwe, N. E., et al. Artemia species: An important tool to screen general toxicity samples. Current Pharmaceutical Design. 26 (24), 2892-2908 (2020).
- Cragg, G. M., Newman, D. J. Natural products: A continuing source of novel drug leads. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1830 (6), 3670-3695 (2013).
- Ntungwe, E., et al. General toxicity screening of Royleanone derivatives using an artemia salina model. Journal Biomedical and Biopharmaceutical Research. 18 (1), 114 (2021).
- Seca, A., Plant Pinto, D. secondary metabolites as anticancer agents: Successes in clinical trials and therapeutic application. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 263 (2018).
- Calixto, J. B. The role of natural products in modern drug discovery. Anais da Academia Brasileira de Ciências. 91 (3), 1-7 (2019).
- Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).
- Zhang, Y., Mu, J., Han, J., Gu, X. An improved brine shrimp larvae lethality microwell test method. Toxicology Mechanisms and Methods. 22 (1), 23-30 (2012).
- Domínguez-Villegas, V., et al. antioxidant and cytotoxicity activities of methanolic extract and prenylated flavanones isolated from leaves of eysehardtia platycarpa. Natural Product Communications. 8 (2), 177-180 (2013).
- Hamidi, M. R., Jovanova, B., Panovska, T. K. Toxicological evaluation of the plant products using Brine Shrimp (Artemia salina L.) model. Macedonian Pharmaceutical Bulletin. 60 (01), 9-18 (2014).
- Libralato, G., Prato, E., Migliore, L., Cicero, A. M., Manfra, L. A review of toxicity testing protocols and endpoints with Artemia spp. Ecological Indicators. 69, 35-49 (2016).
- Mendes Hacke, A. C., et al. Cytotoxicity of cymbopogon citratus (DC) Stapf fractions, essential oil, citral, and geraniol in human leukocytes and erythrocytes. Journal of Ethnopharmacology. 291, 115147 (2022).
- Thangapandi, V., Pushpanathan, T. Comparison of the Artemia salina and Artemia fransiscana bioassays for toxicity of Indian medicinal plants. Journal of Coastal Life Medicine. 2 (6), 453-457 (2014).
- Syahmi, A. R. M., et al. Acute oral toxicity and brine shrimp lethality of Elaeis guineensis Jacq., (Oil Palm Leaf) methanol extract. Molecules. 15 (11), 8111-8121 (2010).
- Sasidharan, S., et al. Acute toxicity impacts of Euphorbia hirta L extract on behavior, organs body weight index and histopathology of organs of the mice and Artemia salina. Pharmacognosy Research. 4 (3), 170 (2012).
- Libralato, G. The case of Artemia spp. in nanoecotoxicology. Marine Environmental Research. 101, 38-43 (2014).
- Okumu, M. O., et al. Artemia salina as an animal model for the preliminary evaluation of snake venom-induced toxicity. Toxicon: X. 12, 100082 (2021).
- Rajabi, S., Ramazani, A., Hamidi, M., Naji, T. Artemia salina as a model organism in toxicity assessment of nanoparticles. DARU Journal of Pharmaceutical Sciences. 23 (1), 20 (2015).
- Svensson, B. -M., Mathiasson, L., Mårtensson, L., Bergström, S. Artemia salina as test organism for assessment of acute toxicity of leachate water from landfills. Environmental Monitoring and Assessment. 102 (1), 309-321 (2005).
- Banti, C., Hadjikakou, S. Evaluation of toxicity with brine shrimp assay. Bio-Protocol. 11 (2), 3895 (2021).
- Pecoraro, R., et al. Artemia salina: A microcrustacean to assess engineered nanoparticles toxicity. Microscopy Research and Technique. 84 (3), 531-536 (2021).
- Lillicrap, A., et al. Alternative approaches to vertebrate ecotoxicity tests in the 21st century: A review of developments over the last 2 decades and current status. Environmental Toxicology and Chemistry. 35 (11), 2637-2646 (2016).
- Ribeiro, I. C., et al. Yeasts as a model for assessing the toxicity of the fungicides Penconazol, Cymoxanil and Dichlofulanid. Chemosphere. (10), 1637-1642 (2000).
- Armour, C. D., Lum, P. Y. From drug to protein: using yeast genetics for high-throughput target discovery. Current Opinion in Chemical Biology. 9 (1), 20-24 (2005).
- Modarresi Chahardehi, A., Arsad, H., Lim, V. Zebrafish as a successful animal model for screening toxicity of medicinal plants. Plants. 9 (10), 1345 (2020).
- Fischer, I., Milton, C., Wallace, H.
- de Araújo, G. L., et al. Alternative methods in toxicity testing: the current approach. Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences. 50 (1), 55-62 (2014).
- Toussaint, M., et al. A high-throughput method to measure the sensitivity of yeast cells to genotoxic agents in liquid cultures. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 606 (1), 92-105 (2006).
- Horzmann, K. A., Freeman, J. L. Making waves: New developments in toxicology with the zebrafish. Toxicological Sciences. 163 (1), 5-12 (2018).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Cunliffe, V. T. Zebrafish: A Practical Approach. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. (2002).
- Sitarek, P., et al. Insight the biological activities of selected Abietane Diterpenes isolated from Plectranthus spp. Biomolecules. 10 (2), 194 (2020).
- Matias, D., et al. Cytotoxic activity of Royleanone Diterpenes from Plectranthus madagascariensis Benth. ACS Omega. 4 (5), 8094-8103 (2019).
- Garcia, C., et al. Royleanone derivatives from Plectranthus spp. as a novel class of P-glycoprotein inhibitors. Frontiers in Pharmacology. 11, (2020).
