Summary
Bu çalışma, tuzlu su karides öldürücülük testi olarak da tanımlanan Artemia salina öldürücülük biyotahlil prosedürünü değerlendirmeyi ve gözden geçirmeyi amaçlamaktadır. Bu basit ve ucuz yöntem, numunelerin, yani doğal ürünlerin genel toksisitesi (ön toksisite değerlendirmesi olarak kabul edilir) hakkında bilgi verir.
Abstract
Doğal ürünler antik çağlardan beri ilaç üretmek için kullanılmıştır. Günümüzde, doğal kaynaklardan elde edilen ve çok sayıda hastalığa karşı kullanılan birçok kemoterapötik ilaç bulunmaktadır. Ne yazık ki, bu bileşiklerin çoğu sıklıkla sistemik toksisite ve yan etkiler gösterir. Seçilmiş potansiyel biyoaktif örneklerin tolere edilebilirliğini daha iyi değerlendirmek için, tuzlu su karidesi (Artemia salina) genellikle öldürücülük çalışmalarında bir model olarak kullanılır. A. salina testi, çalışılan biyoaktif bileşiklerin larva evrelerinde (nauplii) mikrokabukluları öldürme yeteneğine dayanmaktadır. Bu yöntem, sitotoksisite çalışmaları ve sentetik, yarı sentetik ve doğal ürünlerin genel toksisite taraması için uygun bir başlangıç noktasını temsil eder. Yukarıda belirtilen amaçlar için genellikle uygun olan diğer birçok tahlille (in vitro hücreler veya maya suşları, zebra balığı, kemirgenler) karşılaştırıldığında basit, hızlı ve düşük maliyetli bir tahlil olarak kabul edilebilir; dahası, herhangi bir özel eğitim olmadan bile kolayca gerçekleştirilebilir. Genel olarak, A. salina testi, seçilen bileşiklerin ön toksisite değerlendirmesi ve doğal ürün ekstraktlarının biyo-rehberli fraksiyonasyonu için yararlı bir araçtır.
Introduction
Bitkilerden, hayvanlardan veya mikroorganizmalardan elde edilen doğal ürünler, çeşitli biyolojik ve farmakolojik aktiviteleri nedeniyle yeni biyoaktif moleküllerin geliştirilmesinde yıllar içinde artan bir ilgi alanı olmuştur1. Bununla birlikte, ilişkili yan etkiler, ilaç direnci veya ajanların yetersiz özgüllüğü, özellikle antikanser ilaçları olarak kullanıldığında, etkisiz tedaviye yol açabilecek başlıca faktörleri temsil etmektedir 1,2.
Son birkaç on yılda, bazıları antikanser ajanları olarak kullanılan birkaç bitki kaynaklı sitotoksik ajan keşfedilmiştir 1,2,3. Bu bağlamda paklitaksel, doğal kökenli en iyi bilinen ve en aktif kemoterapötik ilaçlardan biri olarak bildirilmektedir 3,4. Şu anda, piyasadaki tüm ilaçların% 35'inden fazlasının doğal ürünlerden türetildiği veya bunlardan ilham aldığı tahmin edilmektedir5. Bu bileşiklerin potansiyel yüksek toksisitesi, tüm çalışma aşamalarında dikkate alınmasını gerektirir, çünkü farklı kirletici maddeler ve hatta bitkinin metabolik bileşenleri toksik etkilere neden olabilir. Bu nedenle, yeni potansiyel bitki bazlı tedavilerin biyolojik aktivitesini ve güvenliğini değerlendirmek için ön aşamada farmakolojik ve toksikolojik profiller yapılmalıdır. Yeni biyoaktif örneklerin toksisitesini değerlendirmek için, omurgasız hayvanlar incelenecek en iyi modeller olarak düşünülebilir. Minimum etik gereklilikler talep ederler ve omurgalılarda bir sonraki test turu için en umut verici ürünlere öncelik vermek için ön in vitro testlere izin verirler 1,6.
Genellikle tuzlu su karidesi olarak bilinen A. salina, Artemia cinsine ait küçük bir halofilik omurgasızdır (Artemiidae familyası, Anostraca, subphylum Crustacea; Şekil 1). Deniz ve sucul tuzlu su ekosistemlerinde, tuzlu su karidesleri mikroalglerle beslendikleri ve balıkları beslemek için kullanılan zooplanktonun bileşenleri oldukları için önemli bir besinsel rol oynarlar. Ayrıca, larvaları (nauplii olarak bilinir), ön çalışmalarsırasında genel toksisitenin değerlendirilmesinde yaygın olarak kullanılmaktadır 1,3,7.
Artemia spp. öldürücülük çalışmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır ve aynı zamanda laboratuvarda yetiştirilen nauplii'yi öldürme yeteneklerine dayanarak potansiyel olarak biyoaktif bileşiklerin toksisitesini izleyerek toksisite değerlendirmeleri için uygun bir başlangıç noktasıdır 1,8. Bu nedenle, A. salina kullanımı genel toksisite çalışmalarında cazibe kazanmıştır, çünkü hayvan modelleri9 üzerindeki diğer testlere kıyasla çok verimli ve kullanımı kolay bir yöntemdir.
Basit anatomileri, küçük boyutları ve kısa yaşam döngüleri sayesinde, çok sayıda omurgasız tek bir deneyde incelenebilir. Bu nedenle, genetik uygunluğu ve düşük maliyetli uyumluluğu büyük ölçekli taramalarla birleştirirler1. Bu bağlamda, genel bir toksisite tahlilinde tuzlu su karidesinin kullanılması, hızlı büyüme (kuluçkadan ilk sonuçlara kadar 28-72 saat gereklidir), maliyet etkinliği ve ticari yumurtaların uzun raf ömrü gibi tüm yıl boyunca kullanılabilen 3,10 gibi çeşitli avantajlar göstermektedir. Öte yandan, omurgasızlar ilkel bir organ sistemine sahip olduklarından ve adaptif bir bağışıklık sisteminden yoksun olduklarından, insan hücreleri için mükemmel ve güvenilir bir model temsil etmezler1.
Bununla birlikte, seçilen numunelerin genel toksisitesi için bir ön değerlendirme yöntemi sağlar. Ölümcül bir tahlil olarak yaygın olarak kullanıldığından, potansiyel antikanser ajanlarının toksik etkileri hakkında geçici endikasyonlar sağlayabilir. Genellikle Artemia karidesleri arasında mümkün olan en düşük ölüm oranını göstermenin gerekli olduğu diğer biyolojik aktivitelerle donatılmış bileşiklerin genel toksisitesi hakkında geri bildirim almak için de kullanılır.
Grubumuzdan devam eden bir çalışmada, Plectranthus türlerinden elde edilen farklı ekstraktlar antioksidan ve antimikrobiyal aktiviteler göstermiştir (yayınlanmamış sonuçlar). Paralel olarak, ekstraktların saflaştırılmasıyla izole edilmiş bileşikler elde edildi ve daha sonra kimyasal olarak modifiye edildi. Ekstraktlar, saf bileşikler ve yarı sentetik türevler daha sonra genel toksisite açısından test edildi. Bu bağlamda, bu çalışma, Plectranthus11 cinsinin farklı bitkilerinden biyoaktif ekstraktların ve izole edilmiş bileşiklerin genel toksisitesi ve potansiyel sitotoksik aktivitesinin değerlendirilmesi için Artemia öldürücülük biyotestinin kullanımına genel bir bakış sunmayı amaçlamaktadır.
Resim 1: Mikroskop altında Artemia salina . Mikroskop altında görüldüğü gibi A. salina'nın yeni yumurtadan çıkmış nauplii (büyütme 12x). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ekipman hazırlığı
- Ticari olarak temin edilebilen kuluçka ekipmanlarını satın alın. Kuluçka ekipmanını kurmak için uygun bir yer seçin (Şekil 2A). Huni şeklindeki kabı siyah desteğe (sete dahil) yerleştirin ve seviye işaretini ve musluğu görmek için huniyi uygun bir yöne çevirin.
- El yapımı migrasyon ekipmanı yapmak için, 12 cm'lik bir son yükseklik elde etmek için iki adet 0,5 L (5,8 cm çapında) plastik şişenin üstünü kesin. Her şişede alttan 7 cm uzakta bir tarafta 1,5 cm çapında bir delik oluşturun ve iki açıklık arasına 13 cm'lik bir lastik tüp (1,3 cm dış ve 0,9 cm iç çap) yerleştirin. Açıklıkları sıcak tutkalla kapatın (Şekil 2B) ve 15 dakika kurumaya bırakın; şişeleri düz bir yüzeye koyun ve sızıntı olmadığını doğrulamak için suyla doldurun.
2. Yapay tuz çözeltisinin hazırlanması
- Bir cam beherde, 35 g / L konsantrasyonda yapay bir tuz çözeltisi (tuzlu su karides tuzu) hazırlayın. Bunu yapmak için, üreticinin talimatlarına göre 800mL musluk suyuna 28 g tuz ekleyin. Tüm tuz iyice çözülene kadar bir karıştırma çubuğuyla karıştırın.
NOT: Hazırlanan tuzlu su çözeltisinin hacmini, mevcut kapların boyutuna göre ayarlayın.
3. Numune hazırlama
- Uygun miktarda ekstraktı çözerek tüm numuneleri bir mikrosantrifüj tüpünde hazırlayın (Plectranthus extracts, Pa- P. ambigerus; Pb- P. barbatus; Pc- P. cylindraceus ; ve Pe- P. ecklonii) veya bileşikler 1-5 ( Plectranthus spp. ve üç yarı sentetik türev [3, 4, 5]'den elde edilen iki doğal bileşik [1 ve 2]; Şekil 3) dimetil sülfoksit (DMSO)12'de, 10 mg / mL'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için (numune suda çözünürse, DMSO kullanımı gerekli değildir).
- Her numunenin 10 μL'sini (ve negatif kontrol için DMSO'yu), 0.1 mg / mL'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için adım 2.1'de hazırlanan 990 μL yapay salin çözeltisi kullanarak yeni bir mikrosantrifüj tüpünde seyreltin.
- Bir duman başlığı altında, bir Erlenmeyer şişesinde, damıtılmış suda 1 mg/ mL 13,14,15 konsantrasyonunda bir potasyum dikromat çözeltisi (K 2 Cr 2O7) hazırlayın.
4. Salamura karides öldürücülük biyotahlili
NOT: Bu tahlil,1,16,17,18,19 modifikasyonları ile birkaç yazarın çalışmalarından geliştirilmiştir.
- Kuluçkalık kabı, seviye işaretine (500 mL) kadar adım 2.1'de hazırlanan ortamla doldurun (Şekil 2C).
- Tuz çözeltisine bir kaşık (yaklaşık 0.75 g) tuzlu su karides kistleri yerleştirin ve ardından kabı kapatın. Doğrudan ekipmana doğru işaret eden bir lamba (masa lambası, 40 W, 230 V, 50 Hz, 8 W, 4.000 K, 830 lm LED ampullü) yerleştirin (Şekil 2A) ve açın.
- Hava tedarikçi sistemini (3 W çıkış, 50 Hz, 230 V) ekipmanın üstüne yerleştirilen konektöre takın ve pompayı açın.
- Oda sıcaklığını 25 ± 3 °C'de tutun. Salamura karides kistleri, yapay tuz çözeltisinde, kuvvetli havalandırma, sürekli aydınlatma ve sabit sıcaklık altında, 24 saat ila 48 saat sonra yumurtadan çıkar.
NOT: Alternatif olarak, dikey bir inkübatör kullanılabilir. - Yumurtalar yumurtadan çıktıktan sonra, hava pompasını kapatın ve nauplii (huninin dibine doğru hareket eden) boş yumurta kutularından (üstte yüzen) ayrılana kadar bekleyin.
- Yumurtadan çıkmamış yumurtaları canlı nauplii'den ayırmak için, alttaki çıkış musluğunu açın ve huninin içeriğini el yapımı göç ekipmanı kabının kaplarından birine boşaltın (adım 1.2'de açıklanmıştır). Nauplii ve artık yumurtadan çıkmamış yumurtaları içeren çözeltinin tüp seviyesinin altında olduğundan emin olun. İkinci kapta, artık tuz çözeltisini tüpün yüksekliğinin üzerindeki adım 2.1'den ekleyin.
- Kabı nauplii ve alüminyum folyo kullanarak artık yumurtadan çıkmamış yumurtalarla örtün. Lambayı sadece tuz çözeltisi ile ikinci kaba yerleştirin. Salamura karidesi ışıktan etkilenecek ve bir kaptan diğerine (hasat kabı) göç edecek ve yumurtalar (yavaşça dibe çökelmiş) ile canlı Artemia arasında verimli bir ayrıma yol açacaktır.
- Ardından, ekipmanı inkübatöre 4.4 adımında 4 saat boyunca kullanılan aynı koşullar altında yerleştirin (Şekil 2E). Hasat kabından, 10 ila 15 nauplii içeren 900 μL tuzlu su çözeltisi toplayın. Tuzlu su çözeltisini nauplii ile 24 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna yerleştirin (Şekil 2F); tüm numuneler quadruplicates halinde test edilir.
- Negatif kontrolün (DMSO), pozitif kontrolün (K 2 Cr2O7, potasyum dikromat), yapay tuz çözeltisinin ve numunelerin her birinin her birini ilgili kuyuya 100 μL ekleyin (Şekil 2F)13,14.
NOT: Her bir kuyucuktaki numuneler 0.01 mg/mL konsantrasyonda olacaktır. Tuz çözeltisindeki pozitif kontrolün son konsantrasyonu, kuyudaki tüm naupliilerin potasyum dikromatın toksik etkisine maruz kaldığından ve öldüğünden emin olmak için 0.1 mg / mL olacaktır. Yapay tuz çözeltisi boş gibi davranacaktır. - Plakayı 25 ± 3 °C'de 24 saat boyunca aydınlatma altında inkübe edin (Şekil 2G). 24 saat sonra, her bir kuyucuktaki ölü larva sayısını (5 s için mobil olmayan nauplii) bir dürbün mikroskobu (12x) 20 altında kaydedin (Şekil 2H). Alternatif olarak, bir el lensi kullanın.
- Kalan canlı larvaların ölümüne neden olmak için 100 μL potasyum dikromat çözeltisi ekleyin ve 6 saat bekleyin. Her kuyucuktaki toplam ölü larvaları mikroskop altında sayın. Ölüm oranını aşağıdaki denkleme göre belirleyin.
- Tüm tahlilleri üçlü olarak yapın. Standart sapmaları (SD) hesaplayın ve sonuçları, her biri dahili dörtgenlere (n = 12) sahip üç bağımsız deneyin ortalaması olarak ifade edin ± SD. Meyer ve ark. tarafından belirtildiği gibi, ham ekstraktları ve LC50< 1.000 μg / mL ile saf bileşikleri toksik olarak düşünün; Ayrıca, tuzlu su karidesinin ölüm oranının, test edilen numunelerin konsantrasyonu ile orantılı olduğunu dikkate alın21.
Şekil 2: Artemia salina öldürücülük biyotahlil yöntemi. (A) Salamura karides kistlerinin kuluçkalanması için kullanılan ticari olarak temin edilebilen ekipman; (B) El yapımı göç ekipmanları; (C) Tuzlu su çözeltisi ile doldurulmuş kuluçkalık kap; (D) Yumurtadan çıkmamış yumurta ve naupliilerin toplanması; (E) Migrasyon adımı sırasında inkübatörde bulunan el yapımı ekipman. Lambadan uzaktaki kap alüminyum folyo ile kaplanmalıdır; ancak, buradaki set kurulumunun daha iyi bir görünümü için kaldırıldı; (F) Tahlil yapılmadan önce kuyularda Artemia'nın toplanması. Bileşikler gösterildiği gibi yerleştirilmelidir: - negatif kontrole (DMSO), + pozitif kontrole (K2Cr2O7), yapay tuz çözeltisine tuza ve test edilecek numunelere 1 ila 3'e (bu durumda bileşikler 1-3) atıfta bulunur; (G) Artemia'yı ve seçilen numuneleri içeren 24 delikli plakanın kuluçkalanması; (H) Artemia dürbün mikroskobu altında sayılır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Seçilmiş bileşiklerin yapıları. Plectranthus türlerinden ekstrakte edilen bileşiklerin 1-2 ve yarı sentez ile elde edilen 3-5 numaralı bileşiklerin yapısı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Son zamanlarda grubumuz tarafından incelenen bazı doğal ürünlerin genel toksisitesi, tuzlu su karidesi öldürücülük biyotahlili ile değerlendirilmiştir. Dört ekstrakt (Pa- P. ambigerus; Pb- P. barbatus; Pc- P. cylindraceus; ve antioksidan aktiviteleri ile bilinen Plectranthus cinsinden Pe- P. ecklonii) test edildi (yayınlanmamış sonuçlar). Ek olarak, Plectranthus spp.'den elde edilen iki doğal bileşik (1 ve 2) ve üç yarı sentetik türev (3, 4, 5; Şekil 3), başka bir çalışmada anlatılan3 de araştırılmıştır. Bu yazıda, potansiyel sitotoksik aktivite açısından ön değerlendirmeleri bildirilmiştir.
Test edilen tüm ekstraktlar, boş (tuz çözeltisi) ve negatif kontrol (DMSO; Şekil 4). Tersine, saf bileşikler 1-5 arasında, sadece türev 5, genel toksisitesi olmayan düşük bir mortalite oranı (100 ppm'lik bir konsantrasyonda% 2.30) göstermiştir (Şekil 5).
Şekil 4: Artemia salina üzerindeki ekstraktların öldürücülüğü. Plectranthus spp.'nin dört metanolik ekstraktına 24 saat maruz kaldıktan sonra A. salina (%) mortalite oranı, 0.1 mg/mL'de (Pa- P. ambigerus; Pb- P. barbatus; Pc- P. cylindraceus; Pe- P. ecklonii). Tüm ekstraktlar bu tahlil kullanılarak genel toksisite açısından kabul edilebilirdi. Tuz, tuz çözeltisine karşılık gelir (boş); Pozitif kontrololarak K 2 Cr2O7 ve negatif kontrol olarak DMSO kullanıldı. Sonuçlar, her biri dahili dörtgenlere (n = 12) sahip üç bağımsız deneyin ortalaması olarak ifade edildi ± SD. Karşılaştırmalar, Dunnett'in son testi ile tek yönlü ANOVA kullanılarak, varyans analizi ile gruplar içinde gerçekleştirildi. Kontrol ve deney grupları arasındaki anlamlı farklılıklar ticari istatistiksel analiz yazılımı kullanılarak değerlendirildi. İstatistiksel anlamlılığı göstermek için p < 0.01 olasılık düzeyi dikkate alındı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Artemia salina üzerindeki bileşiklerin öldürücülüğü. A. salina mortalite oranı (%) 0.1 mg/mL'de beş saf bileşiğe 24 saat maruz kaldıktan sonra (1 ve 2 doğal ürünler, 3-5 ise 1 ve 2 den hazırlanan türevlerdir). Bu tahlil kullanılarak sadece 5 tanesinin çok sınırlı toksisite gösterdiği açıktır. Tuz, tuz çözeltisine karşılık gelir (boş); Pozitif kontrololarak K 2 Cr2O7 ve negatif kontrol olarak DMSO kullanıldı. Sonuçlar, her biri dahili dörtgenlere (n = 12) sahip üç bağımsız deneyin ortalaması olarak ifade edildi ± SD. Karşılaştırmalar, Dunnett'in son testi ile tek yönlü ANOVA kullanılarak, varyans analizi ile gruplar içinde gerçekleştirildi. Kontrol ve deney grupları arasındaki anlamlı farklılıklar ticari istatistiksel analiz yazılımı kullanılarak değerlendirildi. İstatistiksel anlamlılığı göstermek için p < 0.01 olasılık düzeyi dikkate alındı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Doğal ürünler 1 ve 2 orta derecede öldürücülük gösterirken (sırasıyla 100 ppm'de %36.68 ve %30.95), 1 ve 2'den elde edilen yarı sentetik türevler 3 ve 4, orijinal iskeleden daha toksiktir (100 ppm'de sırasıyla% 64.02 ve% 36.64; Şekil 5).
Genel veriler, antioksidan aktiviteleri ile bilinen ve genel toksisite göstermeyen test edilen tüm ekstraktların, seçilen hücre hatları üzerinde daha fazla in vitro aktivite ve toksisite çalışması için aday olarak kabul edilebileceğini göstermiştir. Kutanöz modellerde toksisite yokluğu da gösterilirse, kutanöz uygulama için yeni biyoaktif ürünlerin geliştirilmesi gerçekleştirilebilir. Öte yandan, 1-4 numaralı bileşikler için gözlenen toksik etkiler, onları antikanser ajanları olarak ek değerlendirmeler için uygun adaylar haline getirebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Son yıllarda, bilimsel topluluk toksisite taramaları için alternatif modellere olan dikkatini artırmıştır21. A. salina öldürücülük biyotahlilinin yanı sıra, diğer metodolojiler genellikle numune tolere edilebilirliğinin değerlendirilmesi için yapılır ve omurgalı biyotahlilleri (kemirgenler gibi), omurgasızlar (zebra balığı gibi), maya suşları veya hücreleri kullanan in vitro yöntemler ve siliko yöntemler22,23,24,25 . Tüm bu yöntemlerin, harcanan para ve zaman, sonuçların tekrarlanabilirliği ve analiz edilecek numune türü göz önüne alındığında açık avantajları ve dezavantajları vardır. Örneğin, in silico yaklaşımları, minimum ekipman gerektiren standartlaştırılmış düşük maliyetli bir metodolojiyi temsil eder. Bununla birlikte, bu tür çalışmalar tek bir hedefe odaklandığında, düşük kaliteli sonuçlar elde edilmekte ve bu alternatif, bu çalışmada25,26 sunduğumuz gibi, ön taramalar için kapsam dışı kalmaktadır. Mikroorganizmalar söz konusu olduğunda, Saccharomyces cerevisiae, toksik bileşiklerin değerlendirilmesi için en yaygın kullanılan modellerden biri olarak kabul edilir23. Aslında, in vitro maya kullanımı genellikle hızlı ve gerçekleştirilmesi kolaydır; Bununla birlikte, belirli kimyasal ürünler ve ekipmanlar gerektirdiğinden ve minimum dozlarda sitotoksik bileşiklere karşı düşük hassasiyet gösterdiğinden pahalı olabilir27. Alternatif bir yaklaşımda, insan hücreleri hızlı, basit ve ucuz bir şekilde kullanılabilir. Öyle olsa bile, bunlar bütün bir organizmayı temsil edemez; Bu nedenle, farklı hücre tipleri arasındaki etkileşimler ve fizyolojik koşullarda meydana gelen sistemik pertürbasyonlar uygun şekilde dikkate alınmamaktadır25,26. Öte yandan, in vivo tahliller tüm organizmayı dikkate almak için büyük bir avantaja sahiptir, ancak hayvan modelleri (kemirgenler gibi) tahlil uygulaması için daha fazla zaman gerektirir, daha pahalıdır ve karmaşık etik hususları ima eder25. Tersine, toksisite taraması için sucul organizmaları kullanan in vivo analizler genellikle iyi kabul edilmektedir, ayrıca deniz omurgasızlarının kullanımının daha az etik kaygıya maruz kaldığı ve metodolojinin gerçekleştirilmesi kolay, hızlı ve ucuz olduğu göz önüne alındığında21,24. Bu bağlamda, zebra balıklarının genel toksisite çalışması için kullanılması genellikle alandaki ilk tercihi temsil eder. Aslında, diğer hayvan testleriyle karşılaştırıldığında, zebra balığı hızla geliştiği ve döllenmeden yaklaşık 72 saat ila 13 gün sonra erken larva aşamasına ulaştığı için düşük maliyetli bir seçenek olarak kabul edilebilir21,28. Bununla birlikte, bir zebra balığının bakımı, iyi eğitimli operatörler ve genel kaliteyi korumak için sistem suyunu havalandırabilen ve filtreleyebilen bir sirkülasyon sistemine sahip bir balık tankı gibi özel koşullar gerektirir; Ayrıca, zebra balığı zıplayabileceğinden, belirli aydınlatma koşullarının (14 saat ışık, 10 saat karanlık) yanı sıra pH seviyelerinin günlük olarak kontrol edilmesi gerektiğinden,29,30 gibi birkaç kapak ve drenaj kapağı gereklidir. Hep birlikte, bu hususlar zebra balığı modellerini burada bildirilen Artemia modelinden daha fazla zaman alıcı ve pahalı hale getirmektedir, çünkü bu mikro kabukluların laboratuvar yöntemlerini kullanarak büyük popülasyonlarda yetiştirilmesi daha kolay ve uygulanabilirdir. Bu, A. sina'yı şüphesiz en çok kullanılan tarama araçlarından biri yapar, esas olarak ilaçlar ve tıbbi bitki özleri gibi farklı numunelerin genel toksisitesini test etmek için kullanılır1.
Protokolde, A. salina nauplii, her bir numunenin neden olduğu nauplii ölüm oranını tahmin etmek için 24 saat boyunca uygun örneklerle yetiştirilmiş, toplanmış ve inkübe edilmiştir. İlk adımda, yumurta yumurtadan çıkma, güçlü köpürmenin tanıtıldığı ticari olarak temin edilebilen huni şeklindeki bir üreme kabında gerçekleştirilir (Şekil 2A). Bu zorla havalandırma, tuzlu su karidesinin kuluçkalanmasının mümkün olduğunca başarılı bir şekilde gerçekleşmesine izin verdiği için gereklidir. Kuluçka, 25 ± 3 ° C'de yaklaşık 24 saatte gerçekleşirken, daha düşük sıcaklıklarda 48 saate kadar gerekli olabilir. Yumurtalar yumurtadan çıktıktan sonra, boş yumurta kasalarının üstte yüzmesine izin vermek için pompa kapatılırken, nauplii ve yumurtadan çıkmamış yumurtalar, alttaki huni musluğu açılarak kolayca toplanır. Deneylerimiz sırasında, toplanan çözeltide nauplii ve olgunlaşmamış yumurtaların varlığı ile tam yumurta kuluçkası asla elde edilememiştir. Bu nedenle, Artemia'nın iki formunu verimli bir şekilde ayırmak için, tuzlu su karideslerinin göçü için el yapımı bir ekipman hazırlanmıştır (adım 1.2). Bir kap hasat edilen organizmalarla doldurulur ve daha sonra alüminyum folyo ile kaplanırken, diğer alıcı bir lambanın doğrudan ışığına maruz kalır. Bu koşullarda, yumurtadan çıkmamış yumurtalar yerleşme eğilimindedir, oysa canlı nauplii, bitişik kaba çarpan ışıktan etkilenir ve köprü bağlantısından bir taraftan diğerine göçü destekler. 4 saat sonra, neredeyse tüm canlı nauplii, ışığa maruz kalan kabın içindedir ve tahlilin uygulanması için toplanmaya hazırdır. Bu aşamada, on ila on beş nauplii içeren tuzlu su çözeltisinin kısımları, test edilecek numunelerin her biri ile çıkarılır ve inkübe edilir.
Bu çalışmada, yöntemin ne kadar verimli, ekonomik ve gerçekleştirilmesi kolay olduğu gösterilmiştir. Bununla birlikte, bu tahlil yapılırken bazı kritik noktalar kabul edilmelidir.
Tahlil genellikle musluk suyu ile yapılır. Coğrafi ve fiziko-kimyasal faktörlere bağlı olarak, musluk suyu farklı sertlik dağılımı sergiler, bu da tahlilin tekrarlanabilirliğini ve özellikle yumurta kuluçka adımını etkiler. Aynı nedenden dolayı, deniz suyunun kullanımı testin tekrarlanabilirliğini etkileyebilir. Değişen tuz konsantrasyonu, kirleticilerin, mikroplastiklerin ve diğer korpusların varlığı, operatörü deneyi daha karmaşık ve kullanımı daha az kolay hale getirecek filtrelemeler ve diğer saflaştırma türleri gibi daha ileri adımlardan geçmeye zorlayacaktır. Tüm göz önünde bulundurulan, optimal koşullar, musluk suyunun özelliklerine ve mevcudiyetine dayanarak, özellikle de uygun bir ortam yaratan ve nauplii için de besin görevi gören yapay tuz miktarının dikkatli bir şekilde düzenlenmesiyle belirlenmelidir.
Sıcaklıklardaki geniş değişimler daha düşük kapak hızlarına neden olabilir. Sonuç olarak, çok sayıda yumurtadan çıkmamış yumurta ile karıştırılmış düşük canlı Artemia seviyeleri gözlenebilir. Açıkçası, bu koşullar güvenilir tahlillerin geliştirilmesi için uygun değildir, bu nedenle odanın kontrollü bir iklimlendirilmesi veya uygun dikey inkübatörlerin kullanılması düşünülmelidir.
Kuluçkalık kap içindeki çözeltinin kuvvetli bir şekilde havalandırılması gerekir. Sürekli köpürmenin varlığı yumurtalar arasındaki teması destekler ve kuluçka sürecini hızlandırır.
Hasat sırasında hem yumurtadan çıkmamış yumurtaların hem de naupliilerin toplanması, tahlilin güvenilirliğini güçlü bir şekilde etkileyebilir. Bunun nedeni, numunelerle inkübasyon sırasında kuluçka olasılığıdır. Bu durumda, tüm nauplii'ler aynı süre boyunca maruz kalmamış olacak ve bunun sonucunda hatalı ölüm oranları ortaya çıkacaktır. Yumurtalar ve nauplii verimli bir şekilde ayrılamayacak kadar küçük olduğundan, kuluçka ekipmanında daha yüksek kuluçka süreleri veya el yapımı göç ekipmanının kullanılması gerekir.
Her kuyucuk, inkübasyon adımı için 10-15 nauplii içermeli, bir binoküler mikroskop (12x büyütme) kullanılarak dikkatlice sayılmalıdır. Aynı kuyuda çok fazla nauplii'nin varlığı, üst üste binme nedeniyle son sayımı zorlaştırabilir, hatta hatalı hale getirebilir. Öte yandan, az miktarda karides, istatistiksel önemi olmayan sonuçlara yol açacaktır.
Görüldüğü gibi, bu yöntemin sorunlarının çoğu, güvenilirlik sorunlarından kaçınmak için daha fazla dikkat edilmesi gereken kuluçka ve büyüme aşamalarıyla ilgilidir. Buna rağmen, yöntem, özellikle yukarıda açıklanan en kritik noktalarla ilgili olarak değişiklikleri tolere edebilir. Tabii ki, bu parametrelerden biri değiştirildiğinde, orijinal yöntemi optimize etmek için birkaç girişimde bulunmak gerekebilir. Örneğin, sıcaklığın değiştirilmesi tahlilin toplam süresini kontrol etmeye yardımcı olabilir: sıcaklığın 28-29 ° C'ye kadar arttırılması da kapak hızını artıracak ve tüm süreci hızlandıracaktır.
A. salina biyotahlilinin bazı sınırlamaları, numunelerin test koşullarına ve zamanına stabilitesi ile de ilgilidir. Tahlil sadece oda sıcaklığında ve görünür ışık altında stabil olan numuneler kullanılarak gerçekleştirilebilir. Ayrıca, tüm prosedürün en az 4 gün sürdüğü ve kapak hızının düşük olması durumunda, tahlilin kuluçka adımı için fazladan bir güne ihtiyaç duyabileceği dikkate alınmalıdır.
Genel olarak, bu çalışmada, genel toksisite değerlendirmesinin A. salina yöntemi ile uygulanmasının iki örneğini vurguladık. Test edilen tüm numuneler için genel toksisite belirlenmiştir. Plectranthus bitkilerinden ve bileşik 5'ten elde edilen ekstraktlar genel toksisite göstermezken, bileşikler 1-4'ün tuzlu su karideslerinde orta veya hatta oldukça toksik olduğu kanıtlanmıştır. Özellikle, 1 ve 2 numaralı bileşiklerin Artemia üzerindeki olumsuz etkisi daha önce Sitarek ve Matias tarafından MTT ve SRB / MTT tahlilleri ile sırasıyla31,32 olarak gösterilmiştir. Aynı zamanda, benzoylatlanmış analoglar, bileşik 3 ve 4, öncülleri 1 ve 2'den daha yüksek toksisite değerleri göstererek, ester işlevselliğinin, Garcia ve ark.33 tarafından insan NSCLC MDR kanser hücresi hattındaki bileşik 4 için doğrulandığı gibi, sitotoksisite açısından önemli bir role sahip olabileceğini vurgulamaktadır. Bununla birlikte, böyle bir sitotoksik aktivitenin kanser tedavisinde kullanılabileceğini doğrulamak için başka testlere ihtiyaç vardır. Öte yandan, türev 5, test edilen tüm ekstraktlarla birlikte, toksisite göstermedi ve serinin en umut verici saf bileşiği olarak ortaya çıktı. Bununla birlikte, kutanöz uygulama için potansiyel biyolojik aktiviteyi değerlendirmek için daha ileri çalışmalara ihtiyaç vardır.
Burada, Artemia salina bazlı yöntemin bir tarama aracı olarak kullanılmasının, bilinen diğer metodolojilere kıyasla zamandan ve paradan tasarruf etmeyi nasıl sağlayabileceğini gösterdik. Ön toksisite bağlamlarında sömürülmenin etkili ve avantajlı bir yolunu temsil eder. Farklı ve karmaşık numunelerin, sentetik ve yarı sentetik ilaçların varlığında ve ayrıca doğal ürün ekstraktlarının ve numunelerinin biyo-rehberliğinde fraksiyonasyonu için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, finansal veya başka türlü hiçbir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Profesör Amilcar Roberto'nun anısına.
Bu çalışma, CBIOS ve doktora hibesi SFRH / BD / 018'e (Vera Isca) atfedilen UIDB / 04567/2020 ve UIDP / 04567 / 2020 projeleri kapsamında Fundação para a Ciência e a 137671 Tecnologia (FCT, Portekiz) tarafından finansal olarak desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Thermo Fisher Scientific, Denmark | 174899 | Thermo Scientific Nunc Up Cell 24 multidish |
| Aluminium foil | Albal | - | Can be purchased in supermarket |
| Artemio Set | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 61066000 | Can be purchased in pet shops |
| Binocular microscope | Ceti, Belgium | 1700.0000 | Flexum-24AED, 220-240 V, 50 Hz |
| Bottles | - | - | 0.5 L Diameter: 5.8 cm; Height: 12 cm |
| Brine shrimp cysts | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 3090700 | Can be purchased in pet shops |
| Brine shrimp salt | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 3090600 | Can be purchased in pet shops |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | VWR chemicals | CAS: 67-68-5 | 99% purity |
| Discartable tips | Diamond | F171500 | Volume range: 100 - 1000 µL |
| Eppendorf microtubes | BRAND | 7,80,546 | Microtubes, PP, 2 mL, BIO-CERT PCR QUALITY |
| Erlenmeyer flask | VWR chemicals | 4,47,109 | volume: 100 mL |
| Glass beaker | Normax | 3.2111654N | Volume: 1000 mL |
| Gloves | Guantes Luna | GLSP3 | - |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, San Diego, CA, USA | - | GraphPad Prism version 5.00 for Windows, www.graphpad.com, accessed on 5 February 2021; commercial statistical analysis software |
| Home-made A. salina Grower | - | - | Home made: two plastic bottles connected by a hose |
| Hot glue | Parkside | PHP500E3 | 230 V, 50 Hz, 25 W |
| Incubator | Heidolph Instruments, Denmark | - | One Heidolph Unimax 1010 equipment and one Heidolph Inkubator 1006 |
| Light | Roblan | SKYC3008FE14 | LED light bulb |
| Micropipettes | VWR chemicals | 613-5265 | Volume range: 100 - 1000 µL |
| Potassium dichromate (K2Cr2O7) | VWR chemicals | CAS: 7778-50-9 | 99% purity |
| Pump ProAir a50 | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | - | Included in the Artemio Set+1 kit |
| Rubber tube | - | - | 1.3 cm outer and 0.9 cm inner diameter |
| Stirring rod | VWR chemicals | 441-0147 |  6 mm, 250 mm |
| Termometer | VWR chemicals | 620-0821 | 0 - 100 °C |
References
- Ntungwe, N. E., et al. Artemia species: An important tool to screen general toxicity samples. Current Pharmaceutical Design. 26 (24), 2892-2908 (2020).
- Cragg, G. M., Newman, D. J. Natural products: A continuing source of novel drug leads. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1830 (6), 3670-3695 (2013).
- Ntungwe, E., et al. General toxicity screening of Royleanone derivatives using an artemia salina model. Journal Biomedical and Biopharmaceutical Research. 18 (1), 114 (2021).
- Seca, A., Plant Pinto, D. secondary metabolites as anticancer agents: Successes in clinical trials and therapeutic application. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 263 (2018).
- Calixto, J. B. The role of natural products in modern drug discovery. Anais da Academia Brasileira de Ciências. 91 (3), 1-7 (2019).
- Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).
- Zhang, Y., Mu, J., Han, J., Gu, X. An improved brine shrimp larvae lethality microwell test method. Toxicology Mechanisms and Methods. 22 (1), 23-30 (2012).
- Domínguez-Villegas, V., et al. antioxidant and cytotoxicity activities of methanolic extract and prenylated flavanones isolated from leaves of eysehardtia platycarpa. Natural Product Communications. 8 (2), 177-180 (2013).
- Hamidi, M. R., Jovanova, B., Panovska, T. K. Toxicological evaluation of the plant products using Brine Shrimp (Artemia salina L.) model. Macedonian Pharmaceutical Bulletin. 60 (01), 9-18 (2014).
- Libralato, G., Prato, E., Migliore, L., Cicero, A. M., Manfra, L. A review of toxicity testing protocols and endpoints with Artemia spp. Ecological Indicators. 69, 35-49 (2016).
- Mendes Hacke, A. C., et al. Cytotoxicity of cymbopogon citratus (DC) Stapf fractions, essential oil, citral, and geraniol in human leukocytes and erythrocytes. Journal of Ethnopharmacology. 291, 115147 (2022).
- Thangapandi, V., Pushpanathan, T. Comparison of the Artemia salina and Artemia fransiscana bioassays for toxicity of Indian medicinal plants. Journal of Coastal Life Medicine. 2 (6), 453-457 (2014).
- Syahmi, A. R. M., et al. Acute oral toxicity and brine shrimp lethality of Elaeis guineensis Jacq., (Oil Palm Leaf) methanol extract. Molecules. 15 (11), 8111-8121 (2010).
- Sasidharan, S., et al. Acute toxicity impacts of Euphorbia hirta L extract on behavior, organs body weight index and histopathology of organs of the mice and Artemia salina. Pharmacognosy Research. 4 (3), 170 (2012).
- Libralato, G. The case of Artemia spp. in nanoecotoxicology. Marine Environmental Research. 101, 38-43 (2014).
- Okumu, M. O., et al. Artemia salina as an animal model for the preliminary evaluation of snake venom-induced toxicity. Toxicon: X. 12, 100082 (2021).
- Rajabi, S., Ramazani, A., Hamidi, M., Naji, T. Artemia salina as a model organism in toxicity assessment of nanoparticles. DARU Journal of Pharmaceutical Sciences. 23 (1), 20 (2015).
- Svensson, B. -M., Mathiasson, L., Mårtensson, L., Bergström, S. Artemia salina as test organism for assessment of acute toxicity of leachate water from landfills. Environmental Monitoring and Assessment. 102 (1), 309-321 (2005).
- Banti, C., Hadjikakou, S. Evaluation of toxicity with brine shrimp assay. Bio-Protocol. 11 (2), 3895 (2021).
- Pecoraro, R., et al. Artemia salina: A microcrustacean to assess engineered nanoparticles toxicity. Microscopy Research and Technique. 84 (3), 531-536 (2021).
- Lillicrap, A., et al. Alternative approaches to vertebrate ecotoxicity tests in the 21st century: A review of developments over the last 2 decades and current status. Environmental Toxicology and Chemistry. 35 (11), 2637-2646 (2016).
- Ribeiro, I. C., et al. Yeasts as a model for assessing the toxicity of the fungicides Penconazol, Cymoxanil and Dichlofulanid. Chemosphere. (10), 1637-1642 (2000).
- Armour, C. D., Lum, P. Y. From drug to protein: using yeast genetics for high-throughput target discovery. Current Opinion in Chemical Biology. 9 (1), 20-24 (2005).
- Modarresi Chahardehi, A., Arsad, H., Lim, V. Zebrafish as a successful animal model for screening toxicity of medicinal plants. Plants. 9 (10), 1345 (2020).
- Fischer, I., Milton, C., Wallace, H.
- de Araújo, G. L., et al. Alternative methods in toxicity testing: the current approach. Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences. 50 (1), 55-62 (2014).
- Toussaint, M., et al. A high-throughput method to measure the sensitivity of yeast cells to genotoxic agents in liquid cultures. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 606 (1), 92-105 (2006).
- Horzmann, K. A., Freeman, J. L. Making waves: New developments in toxicology with the zebrafish. Toxicological Sciences. 163 (1), 5-12 (2018).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Cunliffe, V. T. Zebrafish: A Practical Approach. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. (2002).
- Sitarek, P., et al. Insight the biological activities of selected Abietane Diterpenes isolated from Plectranthus spp. Biomolecules. 10 (2), 194 (2020).
- Matias, D., et al. Cytotoxic activity of Royleanone Diterpenes from Plectranthus madagascariensis Benth. ACS Omega. 4 (5), 8094-8103 (2019).
- Garcia, C., et al. Royleanone derivatives from Plectranthus spp. as a novel class of P-glycoprotein inhibitors. Frontiers in Pharmacology. 11, (2020).
