Summary
Dette arbeidet tar sikte på å evaluere og gjennomgå Artemia salina lethality bioassay prosedyre, også identifisert som saltlake reker dødelighetsanalyse. Denne enkle og billige metoden gir informasjon om den generelle toksisiteten (betraktet som en foreløpig toksisitetsevaluering) av prøver, nemlig naturlige produkter.
Abstract
Naturlige produkter har blitt brukt siden antikken for å produsere medisiner. I dag er det mange kjemoterapeutiske stoffer hentet fra naturlige kilder og brukt mot en mengde sykdommer. Dessverre viser de fleste av disse forbindelsene ofte systemisk toksisitet og bivirkninger. For bedre å evaluere toleransen til utvalgte potensielt bioaktive prøver, brukes saltlake reker (Artemia salina) vanligvis som modell i dødelighetsstudier. A. salina-testen er basert på evnen til de studerte bioaktive forbindelsene til å drepe mikrokrepsdyrene i larvestadiet (nauplii). Denne metoden representerer et praktisk utgangspunkt for cytotoksisitetsstudier, samt for generell toksisitetsscreening av syntetiske, semisyntetiske og naturlige produkter. Det kan betraktes som en enkel, rask og rimelig analyse, sammenlignet med mange andre analyser (in vitro-celler eller gjærstammer, sebrafisk, gnagere) generelt egnet for de nevnte formålene; Videre kan det enkelt utføres selv uten spesifikk trening. Samlet sett representerer A. salina-analysen et nyttig verktøy for foreløpig toksisitetsevaluering av utvalgte forbindelser og biostyrt fraksjonering av naturlige produktekstrakter.
Introduction
Naturlige produkter fra planter, dyr eller mikroorganismer har vært et voksende interesseområde gjennom årene i utviklingen av nye bioaktive molekyler på grunn av deres varierte utvalg av biologiske og farmakologiskeaktiviteter. Imidlertid representerer de tilknyttede bivirkningene, stoffresistensen eller utilstrekkelig spesifisitet av midlene, spesielt når de brukes som kreftmedisiner, de viktigste faktorene som kan føre til ineffektiv behandling 1,2.
I løpet av de siste tiårene har flere planteavledede cytotoksiske midler blitt oppdaget, noen av dem brukt som kreftmidler 1,2,3. I denne sammenheng er paklitaksel rapportert som et av de mest kjente og mest aktive kjemoterapeutiske legemidlene av naturlig opprinnelse 3,4. For tiden er det anslått at mer enn 35% av alle medisiner på markedet er avledet fra eller er inspirert av naturlige produkter5. Den potensielle høye toksisiteten til disse forbindelsene krever vurdering i alle studiefasene, siden forskjellige typer forurensninger eller til og med metabolske komponenter i selve planten kan forårsake toksiske effekter. Av denne grunn bør farmakologiske og toksikologiske profiler utføres i den foreløpige fasen for å vurdere den biologiske aktiviteten og sikkerheten til nye potensielle plantebaserte behandlinger. For å evaluere toksisiteten til nye bioaktive prøver, kan virvelløse dyr betraktes som de beste modellene å studere. De krever minimale etiske krav og tillater foreløpige in vitro-analyser, for å prioritere de mest lovende produktene for neste testrunde hos virveldyr 1,6.
Vanligvis kjent som saltlake reker, er A. salina en liten halofil virvelløse dyr som tilhører slekten Artemia (familie Artemiidae, orden Anostraca, subphylum Crustacea; Figur 1). I marine og akvatiske saltvannsøkosystemer spiller saltlake reker en viktig ernæringsmessig rolle når de spiser på mikroalger og er bestanddeler av dyreplanktonet som brukes til å mate fisk. Videre er larvene deres (kjent som nauplii) mye brukt i vurderingen av generell toksisitet under foreløpige studier 1,3,7.
Artemia spp. er mye brukt i dødelighetsstudier og er også et praktisk utgangspunkt for toksisitetsvurderinger, ved å spore toksisiteten til potensielt bioaktive forbindelser basert på deres evne til å drepe nauplii dyrket i laboratoriet 1,8. Av denne grunn fikk bruken av A. salina tiltrekning i generelle toksisitetsstudier, fordi det er en svært effektiv og brukervennlig metode, sammenlignet med andre tester på dyremodeller9.
På grunn av deres enkle anatomi, lille størrelse og korte livssyklus, kan et stort antall hvirvelløse dyr studeres i et enkelt eksperiment. Som sådan kombinerer de genetisk egnethet og rimelig kompatibilitet med storskala screenings1. I denne sammenheng viser bruk av saltlake reker i en generell toksisitetsanalyse flere fordeler, for eksempel rask vekst (28-72 timer er nødvendig fra klekking til de første resultatene), kostnadseffektivitet og lang holdbarhet for kommersielle egg, som kanbrukes hele året 3,10. På den annen side, siden hvirvelløse dyr har et primitivt organsystem og mangler et adaptivt immunsystem, representerer de ikke en perfekt og pålitelig modell for humane celler1.
Det gir imidlertid en foreløpig evalueringsmetode for generell toksisitet av utvalgte prøver. Siden det er mye brukt som en dødelighetsanalyse, kan den gi foreløpige indikasjoner på de toksiske effektene av potensielle anticancermidler. Det brukes ofte også til å få tilbakemelding om den generelle toksisiteten av forbindelser utstyrt med andre biologiske aktiviteter som det er viktig å vise lavest mulig dødelighet blant Artemia reker.
I en pågående studie fra vår gruppe viste forskjellige ekstrakter fra Plectranthus-arter antioksidanter og antimikrobielle aktiviteter (upubliserte resultater). Parallelt ble isolerte forbindelser oppnådd ved rensing av ekstraktene og ble deretter kjemisk modifisert. Ekstraktene, rene forbindelser og semisyntetiske derivater ble deretter testet med hensyn til generell toksisitet. I denne sammenheng tar dette arbeidet sikte på å gi en oversikt over bruken av Artemia lethality bioassay for evaluering av generell toksisitet og potensiell cytotoksisk aktivitet av bioaktive ekstrakter og isolerte forbindelser fra forskjellige planter av slekten Plectranthus11.
Figur 1: Artemia salina under mikroskopet. Nyklekkede nauplii av A. salina sett under mikroskopet (forstørrelse 12x). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse av utstyr
- Skaff kommersielt tilgjengelig klekkeutstyr. Velg et egnet sted å sette opp klekkeutstyret (figur 2A). Plasser den traktformede beholderen i den svarte støtten (inkludert i settet) og vri trakten i en passende retning for å se nivåmerket og kranen.
- For å lage håndlaget migrasjonsutstyr, kutt toppen av to plastflasker på 0,5 l (5,8 cm diameter) for å oppnå en endelig høyde på 12 cm. Lag et hull på 1,5 cm diameter på den ene siden ved 7 cm fra bunnen i hver flaske og sett inn et 13 cm gummirør (1,3 cm ytre og 0,9 cm indre diameter) mellom de to åpningene. Forsegl åpningene med varmt lim (figur 2B) og la det tørke i 15 minutter; Sett flaskene på en flat overflate og fyll dem med vann for å bekrefte at det ikke er lekkasje.
2. Fremstilling av kunstig saltoppløsning
- I et glassbeger fremstiller du en kunstig saltløsning (saltlakesalt) i en konsentrasjon på 35 g / L. For å gjøre dette, tilsett 28 g av saltet til 800 ml vann fra springen, i henhold til produsentens instruksjoner. Bland den med en omrørestang til alt saltet er grundig oppløst.
MERK: Juster volumet på den tilberedte saltoppløsningen i henhold til størrelsen på de tilgjengelige beholderne.
3. Prøvepreparering
- Forbered alle prøvene i et mikrocentrifugerør ved å oppløse en passende mengde ekstrakter (Plectranthus ekstrakter, Pa- P. ambigerus; Pb- P. barbatus; Pc- P. cylindraceus ; og Pe- P. ecklonii) eller forbindelser 1-5 (to naturlige forbindelser [1 og 2] oppnådd fra Plectranthus spp. og tre halvsyntetiske derivater [3, 4, 5]; Figur 3) i dimetylsulfoksid (DMSO)12, for å oppnå en endelig konsentrasjon på 10 mg/ml (hvis prøven er vannløselig, er bruk av DMSO ikke nødvendig).
- Fortynn 10 μL av hver prøve (og DMSO for negativ kontroll) i et nytt mikrosentrifugerør ved bruk av 990 μL kunstig saltoppløsning fremstilt i trinn 2.1, for å oppnå en endelig konsentrasjon på 0,1 mg / ml.
- Under en avtrekkshette, i en Erlenmeyer-kolbe, lag en løsning av kaliumdikromat (K 2 Cr2O7)i destillert vann i en konsentrasjon på 1 mg / ml13,14,15.
4. Saltlake reker dødelighet bioassay
MERK: Denne analysen er utviklet fra verkene til flere forfattere med modifikasjoner 1,16,17,18,19.
- Fyll klekkebeholderen med mediet klargjort i trinn 2.1 opp til nivåmerket (500 ml) (figur 2C).
- Plasser en skje (ca. 0,75 g) saltlakecyster i saltløsningen, og lukk deretter beholderen. Plasser en lampe (bordlampe, 40 W, 230 V, 50 Hz, med en LED-lyspære på 8 W, 4 000 K, 830 lm) som peker direkte mot utstyret (figur 2A) og slå den på.
- Fest luftleverandørsystemet (3 W effekt, 50 Hz, 230 V) til kontakten som er plassert på toppen av utstyret, og slå på pumpen.
- Hold romtemperaturen på 25 ± 3 °C. Saltlakecyster klekkes i den kunstige saltløsningen, under kraftig lufting, kontinuerlig belysning og stabil temperatur, etter 24 timer til 48 timer.
MERK: Alternativt kan en vertikal inkubator brukes. - Når eggene har klekket, slå av luftpumpen og vent til nauplii (beveger seg mot bunnen av trakten) er skilt fra de tomme eggkassene (flytende øverst).
- For å skille de uklipte eggene fra levende nauplii, åpne utløpskranen i bunnen og slipp innholdet i trakten i en av beholderne i den håndlagde migrasjonsutstyrsbeholderen (beskrevet i trinn 1.2). Forsikre deg om at løsningen som inneholder naupliene og de resterende uklipte eggene er under rørets nivå. I den andre beholderen tilsettes den resterende saltoppløsningen fra trinn 2.1 over rørets høyde.
- Dekk beholderen med nauplii og resterende unhatched egg ved hjelp av aluminiumsfolie. Plasser lampen på den andre beholderen med bare saltløsningen. Saltlakerekene vil bli tiltrukket av lyset og migrere fra den ene beholderen til den andre (høstingsbeholder), noe som fører til effektiv separasjon mellom egg (sakte sedimentert til bunnen) og levende Artemia.
- Plasser deretter utstyret i inkubatoren under de samme forholdene som ble brukt i trinn 4.4 i 4 timer (figur 2E). Fra høstbeholderen samler du 900 μL saltoppløsning som inneholder 10 til 15 nauplii. Plasser saltoppløsningen med nauplii i hver brønn på en 24-brønns plate (figur 2F); Alle prøvene testes i firemannser.
- Tilsett 100 μL hver av de negative kontrollene (DMSO), den positive kontrollen (K2 Cr2O7, kaliumdikromat), den kunstige saltløsningen og hver av prøvene til respektive brønn (figur 2F)13,14.
MERK: Prøvene i hver brønn vil være i en konsentrasjon på 0,01 mg / ml. Den endelige konsentrasjonen av den positive kontrollen i saltoppløsning vil være 0,1 mg / ml, for å være sikker på at alle naupliene i brønnen blir utsatt for den toksiske effekten av kaliumdikromat og dør. Den kunstige saltløsningen vil fungere som blank. - Inkuber platen ved 25 ± 3 °C under belysning i 24 timer (figur 2G). Etter 24 timer registreres antall døde larver (ikke-mobile nauplier i 5 s) i hver brønn under et kikkertmikroskop (12x)20 (figur 2H). Alternativt kan du bruke en håndlinse.
- Tilsett 100 μL kaliumdikromatløsning, for å indusere døden til de gjenværende levende larver, og vent i 6 timer. Tell de totale døde larver i hver brønn under et mikroskop. Bestem dødeligheten i henhold til følgende ligning.
- Utfør all analysen i tre eksemplarer. Beregn standardavvik (SD), og uttrykk resultatene som gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter, hver med interne firedoblinger (n = 12), ± SD. Som nevnt av Meyer et al., vurder råekstrakter og rene forbindelser med LC50< 1,000 μg / ml som giftig; Ta også hensyn til at dødeligheten av saltlake reker er proporsjonal med konsentrasjonen av de testede prøvene21.
Figur 2: Artemia salina dødelighet bioassay metode. (A) Kommersielt tilgjengelig utstyr som brukes til klekking av saltlakecyster; (B) Håndlaget migrasjonsutstyr; (C) Klekkebeholder fylt med saltoppløsning; (D) Innsamling av uklipte egg og nauplii; (E) Håndlaget utstyr i inkubatoren under migrasjonstrinnet. Beholderen langt fra lampen skal dekkes med aluminiumsfolie; For en bedre oversikt over settinstallasjonen her ble den imidlertid fjernet; (F) Høsting av Artemia i brønner før analysen utføres. Forbindelsene skal plasseres som vist: - refererer til den negative kontrollen (DMSO), + til den positive kontrollen (K 2 Cr2O7), salt til den kunstige saltløsningen og 1 til 3 til prøvene som skal testes (i dette tilfellet forbindelser 1-3); (G) Inkubasjon av platen med 24 brønner som inneholder Artemia og de utvalgte prøvene; (H) Artemia teller under kikkertmikroskopet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Strukturer av utvalgte forbindelser. Struktur av forbindelser 1-2, ekstrahert fra Plectranthus-arter , og forbindelser 3-5, oppnådd ved halvsyntese. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den generelle toksisiteten til noen naturlige produkter som nylig ble studert av vår gruppe, ble evaluert gjennom bioassay av saltlakereker. Fire utdrag (Pa- P. ambigerus; Pb- P. barbatus; Pc- P. cylindraceus; og Pe- P. ecklonii) fra slekten Plectranthus , kjent for sin antioksidantaktivitet (upubliserte resultater), ble testet. I tillegg er to naturlige forbindelser (1 og 2) oppnådd fra Plectranthus spp., og tre halvsyntetiske derivater (3, 4, 5; Figur 3), alle beskrevet i et annet verk3, ble også undersøkt. Her rapporteres deres foreløpige evaluering med hensyn til potensiell cytotoksisk aktivitet.
Alle de testede ekstraktene viste svært oppmuntrende resultater, med svært lave dødelighetsrater, sammenlignbare med de som er registrert for blank (saltløsning) og den negative kontrollen (DMSO; Figur 4). Omvendt, blant de rene forbindelsene 1-5, viste bare derivat 5 en lav dødelighet (2,30% ved en konsentrasjon på 100 ppm) uten generell toksisitet (figur 5).
Figur 4: Letalitet av ekstrakter på Artemia salina. Dødelighet av A. salina (%) etter 24 timers eksponering for fire metanolekstrakter av Plectranthus spp., ved 0,1 mg/ml (Pa- P. ambigerus; Pb- P. barbatus; Pc- P. cylindraceus; Pe- P. ecklonii). Alle ekstraktene var akseptable når det gjelder generell toksisitet ved bruk av denne analysen. Salt tilsvarer saltoppløsningen (blank); K2 Cr2O7 ble brukt som positiv kontroll og DMSO som negativ kontroll. Resultatene ble uttrykt som gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter, hver med interne firedoblinger (n = 12) ± SD. Sammenligninger ble utført i grupper ved variansanalysen, ved bruk av enveis ANOVA med Dunnetts posttest. Signifikante forskjeller mellom kontroll- og eksperimentelle grupper ble vurdert ved hjelp av en kommersiell statistisk analyseprogramvare. Et sannsynlighetsnivå p < 0,01 ble vurdert som en indikasjon på statistisk signifikans. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Letalitet av forbindelser på Artemia salina. Dødelighet av A. salina (%) etter 24 timers eksponering for fem rene forbindelser ved 0,1 mg/ml (1 og 2 er naturlige produkter og 3-5 er derivater fremstilt fra 1 og 2). Det er tydelig at bare 5 viser svært begrenset toksisitet ved bruk av denne analysen. Salt tilsvarer saltoppløsningen (blank); K2 Cr2O7 ble brukt som positiv kontroll og DMSO som negativ kontroll. Resultatene ble uttrykt som gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter, hver med interne firedoblinger (n = 12) ± SD. Sammenligninger ble utført i grupper ved variansanalysen, ved bruk av enveis ANOVA med Dunnetts posttest. Signifikante forskjeller mellom kontroll- og eksperimentelle grupper ble vurdert ved hjelp av en kommersiell statistisk analyseprogramvare. Et sannsynlighetsnivå p < 0,01 ble vurdert som en indikasjon på statistisk signifikans. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Naturlige produkter 1 og 2 viste moderat dødelighet (henholdsvis 36,68% og 30,95% ved 100 ppm), mens semisyntetiske derivater 3 og 4, oppnådd fra henholdsvis 1 og 2, var mer giftige enn det opprinnelige stillaset (henholdsvis 64,02% og 36,64% ved 100 ppm; Figur 5).
Samlede data antydet at alle testede ekstrakter, kjent for sin antioksidantaktivitet og ikke viser noen generell toksisitet, kan betraktes som kandidater for videre in vitro-aktivitet og toksisitetsstudier på utvalgte cellelinjer. Hvis fravær av toksisitet også er demonstrert i kutane modeller, kan utviklingen av nye bioaktive produkter for kutan applikasjon utføres. På den annen side kan de toksiske effektene observert for forbindelser 1-4 gjøre dem til egnede kandidater for ytterligere evalueringer som kreftmidler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I løpet av de siste årene har det vitenskapelige samfunnet økt sin oppmerksomhet mot alternative modeller for toksisitetsscreeninger21. Ved siden av A. salina letalitetsbioassay utføres andre metoder vanligvis for evaluering av prøvetoleranse og inkluderer vertebratbioassays (som gnagere), hvirvelløse dyr (som sebrafisk), in vitro-metoder ved bruk av gjærstammer eller celler, og i silico-metoder 22,23,24,25 . Alle disse metodene har klare fordeler og ulemper, med tanke på brukte penger og tid, reproduserbarhet av resultatene og typen prøve som skal analyseres. For eksempel representerer in silico-tilnærmingene en standardisert lavprismetodikk som krever minimalt utstyr. Likevel, når slike studier er fokusert på et enkelt mål, oppnås resultater av dårlig kvalitet, noe som gjør dette alternativet utenfor rammen for foreløpige screeninger, som vi presenterer i denne studien25,26. Når det gjelder mikroorganismer, regnes Saccharomyces cerevisiae som en av de mest brukte modellene for evaluering av giftige forbindelser23. Faktisk er bruken av in vitro gjær generelt rask og enkel å utføre; Det kan imidlertid være dyrt, siden det krever spesifikke kjemiske produkter og utstyr, og viser lav følsomhet for minimale doser cytotoksiske forbindelser27. I en alternativ tilnærming kan menneskelige celler brukes, på en rask, enkel og billig måte. Likevel kan disse ikke representere en hel organisme; Interaksjoner mellom forskjellige celletyper og systemiske forstyrrelser som finner sted under fysiologiske forhold, er derfor ikke hensiktsmessig tatt i betraktning25,26. På den annen side har in vivo-analyser den store fordelen å ta hensyn til hele organismen, men dyremodeller (som gnagere) krever mer tid til analyseutførelsen, er dyrere og innebærer komplekse etiske hensyn25. Omvendt er in vivo-analyser som bruker vannlevende organismer for toksisitetsscreening generelt godt akseptert, med tanke på at bruken av marine hvirvelløse dyr gjennomgår mindre etiske bekymringer, og metoden er enkel å utføre, rask og billig21,24. I denne sammenheng representerer bruk av sebrafisk til studier av generell toksisitet ofte førstevalget i feltet. Faktisk, sammenlignet med andre dyreforsøk, kan det betraktes som et billig alternativ, da sebrafisk utvikler seg raskt og når det tidlige larvestadiet rundt 72 timer til 13 dager etter befruktning21,28. Likevel krever vedlikehold av en sebrafisk godt trente operatører og spesifikke forhold, for eksempel et akvarium med et sirkulasjonssystem, i stand til å lufte og filtrere systemvannet, for å opprettholde den generelle kvaliteten; Videre er det nødvendig med flere lokk og avløpsdeksler, da sebrafisk kan hoppe, samt spesifikke lysforhold (14 timers lys, 10 timer mørkt), og pH-nivåer må kontrolleres daglig, blant annet29,30. Til sammen gjør disse hensynene sebrafiskmodeller mer tidkrevende og dyre enn Artemia-modellen som er rapportert her, siden disse mikrokrepsdyrene er lettere å håndtere og levedyktige for dyrking i store populasjoner ved hjelp av laboratoriemetoder. Dette gjør A. salina utvilsomt til et av de mest brukte screeningsverktøyene, hovedsakelig brukt til å teste den generelle toksisiteten til forskjellige prøver, for eksempel medisiner og medisinske planteekstrakter1.
I protokollen har A. salina nauplii blitt oppdrettet, samlet inn og inkubert med egnede prøver i 24 timer, for å estimere naupli-dødeligheten indusert av hver prøve. I det første trinnet utføres eggklekkingen i et kommersielt tilgjengelig traktformet avlsfartøy, der kraftig boblende ble introdusert (figur 2A). Denne tvungne luftingen er nødvendig siden den gjør at saltlake-rekkingen kan skje så vellykket som mulig. Klekkingen skjer ved rundt 24 timer ved 25 ± 3 °C, mens opptil 48 timer kan være nødvendig ved lavere temperaturer. Når eggene klekkes, slås pumpen av slik at de tomme eggkassene kan flyte på toppen, mens nauplii og uklipte egg enkelt samles opp ved å åpne traktkranen nederst. Under våre eksperimenter ble fullstendig eggklekking aldri oppnådd, med påfølgende tilstedeværelse av nauplii og ikke-modne egg i den innsamlede løsningen. Av denne grunn, for effektivt å skille de to formene for Artemia, utarbeides et håndlaget utstyr for migrering av saltlake reker (trinn 1.2). En beholder fylles opp med de høstede organismer, og deretter dekkes med aluminiumsfolie, mens den andre mottakeren blir utsatt for direkte lys fra en lampe. Under disse forholdene har de uklipte eggene en tendens til å slå seg ned, mens de levende naupliene tiltrekkes av lyset som treffer den tilstøtende beholderen, og favoriserer migrasjonen fra den ene siden til den andre gjennom broforbindelsen. Etter 4 timer er nesten alle levende nauplii inne i beholderen utsatt for lyset og klar til å bli samlet inn for utførelse av analysen. På dette stadiet fjernes deler av saltvannsløsningen, som inneholder ti til femten nauplii, og inkuberes med hver av prøvene som skal testes.
I dette arbeidet har det blitt vist hvordan metoden er effektiv, økonomisk og enkel å utføre. Noen kritiske punkter bør imidlertid anerkjennes når du utfører denne analysen.
Analysen utføres vanligvis med vann fra springen. Avhengig av geografiske og fysisk-kjemiske faktorer, utviser vann fra springen forskjellig hardhetsfordeling, noe som påvirker reproduserbarheten av analysen og spesielt eggklekkingstrinnet. Av samme grunn kan bruk av sjøvann påvirke reproduserbarheten av testen. Den varierende saltkonsentrasjonen, tilstedeværelsen av forurensninger, mikroplastikk og andre legemer vil tvinge operatøren til å gjennomgå ytterligere trinn, for eksempel filtreringer og andre typer rensing, som vil gjøre eksperimentet mer komplekst og mindre lett å håndtere. Alt i betraktning bør optimale forhold avgjøres basert på egenskapene og tilgjengeligheten av vann fra springen, spesielt ved en nøye regulering av mengden kunstig salt tilsatt, som skaper et passende miljø og fungerer som næring for nauplii også.
Store temperaturvariasjoner kan gi lavere lukehastigheter. Som en konsekvens kunne lave nivåer av levende Artemia observeres, blandet med et høyt antall uklipte egg. Det er klart at slike forhold ikke er egnet for utvikling av pålitelige analyser, så en kontrollert klimatisering av rommet eller bruk av passende vertikale inkubatorer bør vurderes.
Kraftig lufting av løsningen i klekkebeholderen er nødvendig. Tilstedeværelsen av kontinuerlig boblende favoriserer kontakten mellom egg og akseler klekkeprosessen.
Innsamling av både uklipte egg og nauplii under høstingen kan sterkt påvirke påliteligheten av analysen. Dette skyldes muligheten for klekking under inkubasjonen med prøvene. I dette tilfellet vil ikke alle naupliene ha vært eksponert i like lang tid, med påfølgende feilaktige dødelighetsrater. Siden egg og nauplier er for små til å skilles effektivt, er det nødvendig med høyere inkubasjonstider i klekkeutstyret eller bruken av det håndlagde migrasjonsutstyret.
Hver brønn skal inneholde 10-15 nauplii for inkubasjonstrinnet, nøye regnet ved bruk av et kikkertmikroskop (12x forstørrelse). Tilstedeværelsen av for mange nauplii i samme brønn kan gjøre den endelige tellingen vanskelig, eller til og med feilaktig, på grunn av overlapping. På den annen side vil små mengder reker føre til resultater uten statistisk signifikans.
Som det er tydelig, er de fleste problemene med denne metoden relatert til klekke- og vekststadiene, der det kreves mer oppmerksomhet for å unngå pålitelighetsproblemer. Likevel kan metoden tolerere modifikasjoner, spesielt i forhold til de mest kritiske punktene beskrevet ovenfor. Selvfølgelig, når en av disse parametrene endres, kan det være nødvendig å gjennomføre flere forsøk på å optimalisere den opprinnelige metoden. For eksempel kan endring av temperaturen bidra til å kontrollere den totale tiden for analysen: å øke temperaturen opp til 28-29 ° C vil også øke lukehastigheten og øke hastigheten på hele prosessen.
Noen begrensninger ved A. salina bioassay er også relatert til prøvenes stabilitet til testforholdene og tiden. Analysen kan bare utføres ved hjelp av prøver som er stabile ved romtemperatur og under synlig lys. Videre må det tas hensyn til at hele prosedyren varer minst 4 dager, og hvis lukehastigheten er lav, kan analysen trenge en ekstra dag for klekketrinnet.
Samlet sett fremhever vi i denne studien to eksempler på anvendelsen av den generelle toksisitetsevalueringen gjennom A. salina-metoden. Generell toksisitet er fastslått for alle prøvene som er testet. Ekstrakter fra Plectranthus planter og forbindelse 5 viste ingen generell toksisitet, mens forbindelser 1-4 viste seg å være moderat eller til og med svært giftige på saltlake reker. Spesielt ble den negative effekten av forbindelsene 1 og 2 på Artemia tidligere demonstrert av Sitarek og Matias ved MTT- og SRB / MTT-analyser, henholdsvis31,32. Samtidig viser de benzoylerte analogene, forbindelsene 3 og 4, høyere toksisitetsverdier enn deres forløpere 1 og 2, og fremhever at esterfunksjonaliseringen kan ha en viktig rolle når det gjelder cytotoksisitet, som bekreftet for forbindelse 4 i human NSCLC MDR kreftcellelinje av Garcia et al.33. Imidlertid er det behov for andre analyser for å bekrefte at en slik cytotoksisk aktivitet kan utnyttes i kreftbehandling. På den annen side viste derivat 5, sammen med alle de analyserte ekstraktene, ingen toksisitet og fremstår som den mest lovende rene forbindelsen i serien. Imidlertid er det behov for ytterligere studier for å evaluere den potensielle biologiske aktiviteten for kutan anvendelse.
Her demonstrerte vi hvordan bruk av Artemia salina-basert metode som screeningverktøy kunne spare tid og penger, sammenlignet med andre kjente metoder. Det representerer en effektiv og fordelaktig måte å bli utnyttet i foreløpige toksisitetskontekster. Den kan brukes i nærvær av forskjellige og komplekse prøver, syntetiske og halvsyntetiske stoffer, samt for biostyrt fraksjonering av naturlige produktekstrakter og prøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter, verken økonomiske eller andre.
Acknowledgments
Til minne om professor Amilcar Roberto.
Dette arbeidet ble økonomisk støttet av Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, Portugal) under prosjektene UIDB/04567/2020 og UIDP/04567/2020 tilskrevet CBIOS og PhD-stipend SFRH/BD/137671/2018 (Vera Isca).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Thermo Fisher Scientific, Denmark | 174899 | Thermo Scientific Nunc Up Cell 24 multidish |
| Aluminium foil | Albal | - | Can be purchased in supermarket |
| Artemio Set | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 61066000 | Can be purchased in pet shops |
| Binocular microscope | Ceti, Belgium | 1700.0000 | Flexum-24AED, 220-240 V, 50 Hz |
| Bottles | - | - | 0.5 L Diameter: 5.8 cm; Height: 12 cm |
| Brine shrimp cysts | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 3090700 | Can be purchased in pet shops |
| Brine shrimp salt | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 3090600 | Can be purchased in pet shops |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | VWR chemicals | CAS: 67-68-5 | 99% purity |
| Discartable tips | Diamond | F171500 | Volume range: 100 - 1000 µL |
| Eppendorf microtubes | BRAND | 7,80,546 | Microtubes, PP, 2 mL, BIO-CERT PCR QUALITY |
| Erlenmeyer flask | VWR chemicals | 4,47,109 | volume: 100 mL |
| Glass beaker | Normax | 3.2111654N | Volume: 1000 mL |
| Gloves | Guantes Luna | GLSP3 | - |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, San Diego, CA, USA | - | GraphPad Prism version 5.00 for Windows, www.graphpad.com, accessed on 5 February 2021; commercial statistical analysis software |
| Home-made A. salina Grower | - | - | Home made: two plastic bottles connected by a hose |
| Hot glue | Parkside | PHP500E3 | 230 V, 50 Hz, 25 W |
| Incubator | Heidolph Instruments, Denmark | - | One Heidolph Unimax 1010 equipment and one Heidolph Inkubator 1006 |
| Light | Roblan | SKYC3008FE14 | LED light bulb |
| Micropipettes | VWR chemicals | 613-5265 | Volume range: 100 - 1000 µL |
| Potassium dichromate (K2Cr2O7) | VWR chemicals | CAS: 7778-50-9 | 99% purity |
| Pump ProAir a50 | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | - | Included in the Artemio Set+1 kit |
| Rubber tube | - | - | 1.3 cm outer and 0.9 cm inner diameter |
| Stirring rod | VWR chemicals | 441-0147 |  6 mm, 250 mm |
| Termometer | VWR chemicals | 620-0821 | 0 - 100 °C |
References
- Ntungwe, N. E., et al. Artemia species: An important tool to screen general toxicity samples. Current Pharmaceutical Design. 26 (24), 2892-2908 (2020).
- Cragg, G. M., Newman, D. J. Natural products: A continuing source of novel drug leads. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1830 (6), 3670-3695 (2013).
- Ntungwe, E., et al. General toxicity screening of Royleanone derivatives using an artemia salina model. Journal Biomedical and Biopharmaceutical Research. 18 (1), 114 (2021).
- Seca, A., Plant Pinto, D. secondary metabolites as anticancer agents: Successes in clinical trials and therapeutic application. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 263 (2018).
- Calixto, J. B. The role of natural products in modern drug discovery. Anais da Academia Brasileira de Ciências. 91 (3), 1-7 (2019).
- Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).
- Zhang, Y., Mu, J., Han, J., Gu, X. An improved brine shrimp larvae lethality microwell test method. Toxicology Mechanisms and Methods. 22 (1), 23-30 (2012).
- Domínguez-Villegas, V., et al. antioxidant and cytotoxicity activities of methanolic extract and prenylated flavanones isolated from leaves of eysehardtia platycarpa. Natural Product Communications. 8 (2), 177-180 (2013).
- Hamidi, M. R., Jovanova, B., Panovska, T. K. Toxicological evaluation of the plant products using Brine Shrimp (Artemia salina L.) model. Macedonian Pharmaceutical Bulletin. 60 (01), 9-18 (2014).
- Libralato, G., Prato, E., Migliore, L., Cicero, A. M., Manfra, L. A review of toxicity testing protocols and endpoints with Artemia spp. Ecological Indicators. 69, 35-49 (2016).
- Mendes Hacke, A. C., et al. Cytotoxicity of cymbopogon citratus (DC) Stapf fractions, essential oil, citral, and geraniol in human leukocytes and erythrocytes. Journal of Ethnopharmacology. 291, 115147 (2022).
- Thangapandi, V., Pushpanathan, T. Comparison of the Artemia salina and Artemia fransiscana bioassays for toxicity of Indian medicinal plants. Journal of Coastal Life Medicine. 2 (6), 453-457 (2014).
- Syahmi, A. R. M., et al. Acute oral toxicity and brine shrimp lethality of Elaeis guineensis Jacq., (Oil Palm Leaf) methanol extract. Molecules. 15 (11), 8111-8121 (2010).
- Sasidharan, S., et al. Acute toxicity impacts of Euphorbia hirta L extract on behavior, organs body weight index and histopathology of organs of the mice and Artemia salina. Pharmacognosy Research. 4 (3), 170 (2012).
- Libralato, G. The case of Artemia spp. in nanoecotoxicology. Marine Environmental Research. 101, 38-43 (2014).
- Okumu, M. O., et al. Artemia salina as an animal model for the preliminary evaluation of snake venom-induced toxicity. Toxicon: X. 12, 100082 (2021).
- Rajabi, S., Ramazani, A., Hamidi, M., Naji, T. Artemia salina as a model organism in toxicity assessment of nanoparticles. DARU Journal of Pharmaceutical Sciences. 23 (1), 20 (2015).
- Svensson, B. -M., Mathiasson, L., Mårtensson, L., Bergström, S. Artemia salina as test organism for assessment of acute toxicity of leachate water from landfills. Environmental Monitoring and Assessment. 102 (1), 309-321 (2005).
- Banti, C., Hadjikakou, S. Evaluation of toxicity with brine shrimp assay. Bio-Protocol. 11 (2), 3895 (2021).
- Pecoraro, R., et al. Artemia salina: A microcrustacean to assess engineered nanoparticles toxicity. Microscopy Research and Technique. 84 (3), 531-536 (2021).
- Lillicrap, A., et al. Alternative approaches to vertebrate ecotoxicity tests in the 21st century: A review of developments over the last 2 decades and current status. Environmental Toxicology and Chemistry. 35 (11), 2637-2646 (2016).
- Ribeiro, I. C., et al. Yeasts as a model for assessing the toxicity of the fungicides Penconazol, Cymoxanil and Dichlofulanid. Chemosphere. (10), 1637-1642 (2000).
- Armour, C. D., Lum, P. Y. From drug to protein: using yeast genetics for high-throughput target discovery. Current Opinion in Chemical Biology. 9 (1), 20-24 (2005).
- Modarresi Chahardehi, A., Arsad, H., Lim, V. Zebrafish as a successful animal model for screening toxicity of medicinal plants. Plants. 9 (10), 1345 (2020).
- Fischer, I., Milton, C., Wallace, H.
- de Araújo, G. L., et al. Alternative methods in toxicity testing: the current approach. Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences. 50 (1), 55-62 (2014).
- Toussaint, M., et al. A high-throughput method to measure the sensitivity of yeast cells to genotoxic agents in liquid cultures. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 606 (1), 92-105 (2006).
- Horzmann, K. A., Freeman, J. L. Making waves: New developments in toxicology with the zebrafish. Toxicological Sciences. 163 (1), 5-12 (2018).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Cunliffe, V. T. Zebrafish: A Practical Approach. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. (2002).
- Sitarek, P., et al. Insight the biological activities of selected Abietane Diterpenes isolated from Plectranthus spp. Biomolecules. 10 (2), 194 (2020).
- Matias, D., et al. Cytotoxic activity of Royleanone Diterpenes from Plectranthus madagascariensis Benth. ACS Omega. 4 (5), 8094-8103 (2019).
- Garcia, C., et al. Royleanone derivatives from Plectranthus spp. as a novel class of P-glycoprotein inhibitors. Frontiers in Pharmacology. 11, (2020).
