Summary
Questo lavoro mira a valutare e rivedere la procedura di saggio biologico di letalità dell'Artemia salina , identificata anche come saggio di letalità dei gamberetti di salamoia. Questo metodo semplice ed economico fornisce informazioni sulla tossicità generale (considerata come una valutazione preliminare della tossicità) dei campioni, vale a dire i prodotti naturali.
Abstract
I prodotti naturali sono stati utilizzati fin dall'antichità per produrre medicinali. Al giorno d'oggi, ci sono molti farmaci chemioterapici ottenuti da fonti naturali e utilizzati contro una pletora di malattie. Sfortunatamente, la maggior parte di questi composti spesso mostrano tossicità sistemica ed effetti avversi. Al fine di valutare meglio la tollerabilità di campioni selezionati potenzialmente bioattivi, il gambero salamoia (Artemia salina) viene generalmente utilizzato come modello negli studi di letalità. Il test di A. salina si basa sulla capacità dei composti bioattivi studiati di uccidere i microcrostacei nel loro stadio larvale (naupli). Questo metodo rappresenta un comodo punto di partenza per gli studi di citotossicità, nonché per lo screening della tossicità generale di prodotti sintetici, semisintetici e naturali. Può essere considerato un test semplice, rapido e a basso costo, rispetto a molti altri saggi (cellule in vitro o ceppi di lievito, zebrafish, roditori) generalmente adatti agli scopi sopra indicati; Inoltre, può essere facilmente eseguito anche senza alcuna formazione specifica. Nel complesso, il saggio di A. salina rappresenta uno strumento utile per la valutazione preliminare della tossicità di composti selezionati e il frazionamento bioguidato di estratti di prodotti naturali.
Introduction
I prodotti naturali di piante, animali o microrganismi sono stati una crescente area di interesse nel corso degli anni nello sviluppo di nuove molecole bioattive a causa della loro variegata gamma di attività biologiche e farmacologiche1. Tuttavia, gli effetti collaterali associati, la resistenza ai farmaci o l'inadeguata specificità degli agenti, specialmente se usati come farmaci antitumorali, rappresentano i principali fattori che possono portare a un trattamento inefficace 1,2.
Negli ultimi decenni sono stati scoperti diversi agenti citotossici di origine vegetale, alcuni dei quali utilizzati come agenti antitumorali 1,2,3. In questo contesto, il paclitaxel è segnalato come uno dei farmaci chemioterapici più noti e attivi di origine naturale 3,4. Attualmente, si stima che oltre il 35% di tutti i farmaci sul mercato derivino o siano ispirati a prodotti naturali5. La potenziale elevata tossicità di questi composti richiede considerazione durante tutte le fasi di studio, poiché diversi tipi di contaminanti o anche componenti metabolici della pianta stessa possono causare effetti tossici. Per questo motivo, i profili farmacologici e tossicologici dovrebbero essere intrapresi nella fase preliminare, per valutare l'attività biologica e la sicurezza di nuovi potenziali trattamenti a base vegetale. Per valutare la tossicità di nuovi campioni bioattivi, gli animali invertebrati possono essere considerati i migliori modelli da studiare. Richiedono requisiti etici minimi e consentono test preliminari in vitro, per dare priorità ai prodotti più promettenti per il prossimo ciclo di test sui vertebrati 1,6.
Comunemente noto come gambero salamoia, A. salina è un piccolo invertebrato alofilo appartenente al genere Artemia (famiglia Artemiidae, ordine Anostraca, subphylum Crustacea; Figura 1). Negli ecosistemi salini marini e acquatici, i gamberetti di salamoia svolgono un importante ruolo nutrizionale in quanto si nutrono di microalghe e sono costituenti dello zooplancton utilizzato per nutrire i pesci. Inoltre, le loro larve (note come naupli) sono ampiamente utilizzate nella valutazione della tossicità generale durante gli studi preliminari 1,3,7.
Le Artemia spp. sono ampiamente utilizzate negli studi di letalità e sono anche un comodo punto di partenza per le valutazioni di tossicità, monitorando la tossicità di composti potenzialmente bioattivi in base alla loro capacità di uccidere i naupli coltivati in laboratorio 1,8. Per questo motivo, l'uso di A. salina ha guadagnato attrazione negli studi di tossicità generale, perché è un metodo molto efficiente e facile da usare, rispetto ad altri test su modelli animali9.
Grazie alla loro anatomia semplice, alle piccole dimensioni e al breve ciclo di vita, un vasto numero di invertebrati può essere studiato in un singolo esperimento. In quanto tali, combinano l'amenabilità genetica e la compatibilità a basso costo con screening su larga scala1. In questo contesto, l'uso di gamberetti di salamoia in un saggio di tossicità generale mostra diversi vantaggi, come la crescita rapida (28-72 ore sono necessarie dalla schiusa ai primi risultati), l'economicità e la lunga durata di conservazione delle uova commerciali, che possono essere utilizzate tutto l'anno 3,10. D'altra parte, poiché gli invertebrati hanno un sistema di organi primitivo e mancano di un sistema immunitario adattativo, non rappresentano un modello perfetto e affidabile per le cellule umane1.
Tuttavia, fornisce un metodo di valutazione preliminare per la tossicità generale di campioni selezionati. Poiché è ampiamente usato come test di letalità, può fornire indicazioni provvisorie sugli effetti tossici di potenziali agenti antitumorali. Viene spesso utilizzato anche per ottenere feedback sulla tossicità generale di composti dotati di qualsiasi altra attività biologica per la quale è essenziale mostrare il più basso tasso di mortalità possibile tra i gamberetti di Artemia .
In uno studio in corso dal nostro gruppo, diversi estratti di specie Plectranthus hanno mostrato attività antiossidanti e antimicrobiche (risultati non pubblicati). Parallelamente, composti isolati sono stati ottenuti mediante purificazione degli estratti e sono stati poi modificati chimicamente. Gli estratti, i composti puri e i derivati semisintetici sono stati quindi testati in termini di tossicità generale. In questo contesto, il presente lavoro si propone di fornire una panoramica dell'uso del saggio biologico di letalità dell'Artemia per la valutazione della tossicità generale e della potenziale attività citotossica di estratti bioattivi e composti isolati da diverse piante del genere Plectranthus11.
Figura 1: Artemia salina al microscopio. Naupli appena schiusi di A. salina visti al microscopio (ingrandimento 12x). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Protocol
1. Preparazione dell'attrezzatura
- Acquisire attrezzature di schiusa disponibili in commercio. Selezionare un luogo adatto per installare l'attrezzatura di schiusa (Figura 2A). Posizionare il contenitore a forma di imbuto nel supporto nero (incluso nel set) e ruotare l'imbuto in una direzione adatta per vedere il segno di livello e il rubinetto.
- Per realizzare attrezzature di migrazione fatte a mano, tagliare la parte superiore di due bottiglie di plastica da 0,5 L (5,8 cm di diametro) per ottenere un'altezza finale di 12 cm. Creare un foro di 1,5 cm di diametro su un lato a 7 cm dal fondo in ogni bottiglia e inserire un tubo di gomma di 13 cm (1,3 cm di diametro esterno e 0,9 cm interno) tra le due aperture. Sigillare le aperture con colla a caldo (Figura 2B) e lasciare asciugare per 15 minuti; Metti le bottiglie su una superficie piana e riempile d'acqua per verificare che non ci siano perdite.
2. Preparazione della soluzione salina artificiale
- In un becher di vetro, preparare una soluzione salina artificiale (sale di gamberetti di salamoia) ad una concentrazione di 35 g/L. Per fare questo, aggiungere 28 g di sale a 800 ml di acqua del rubinetto, secondo le istruzioni del produttore. Mescolare con una bacchetta di agitazione fino a quando tutto il sale è completamente sciolto.
NOTA: Regolare il volume della soluzione salina preparata in base alle dimensioni dei contenitori disponibili.
3. Preparazione del campione
- Preparare tutti i campioni in una provetta da microcentrifuga sciogliendo una quantità adeguata di estratti (estratti di Plectranthus , Pa- P. ambigerus; Pb- P. barbatus; Pc- P. cylindraceus ; e Pe- P. ecklonii) o composti 1-5 (due composti naturali [1 e 2] ottenuti da Plectranthus spp. e tre derivati semisintetici [3, 4, 5]; Figura 3) nel dimetilsolfossido (DMSO)12, in modo da ottenere una concentrazione finale di 10 mg/ml (se il campione è solubile in acqua, non è necessario l'uso di DMSO).
- Diluire 10 μL di ciascun campione (e DMSO per il controllo negativo) in una nuova provetta da microcentrifuga utilizzando 990 μL di soluzione salina artificiale preparata nella fase 2.1, per ottenere una concentrazione finale di 0,1 mg/ml.
- Sotto una cappa aspirante, in un matraccio di Erlenmeyer, preparare una soluzione di dicromato di potassio(K 2 Cr2O7) in acqua distillata ad una concentrazione di 1 mg/mL13,14,15.
4. Saggio biologico sulla letalità dei gamberetti di salamoia
NOTA: Questo saggio è sviluppato dalle opere di diversi autori con modifiche 1,16,17,18,19.
- Riempire il recipiente da cova con il mezzo preparato al punto 2.1 fino al livello (500 ml) (figura 2C).
- Mettere un cucchiaio (circa 0,75 g) di cisti di gamberetti di salamoia nella soluzione salina, quindi chiudere il contenitore. Posizionare una lampada (lampada da tavolo, 40 W, 230 V, 50 Hz, con una lampadina a LED da 8 W, 4.000 K, 830 lm) rivolta direttamente verso l'apparecchiatura (Figura 2A) e accenderla.
- Collegare il sistema di alimentazione dell'aria (uscita 3 W, 50 Hz, 230 V) al connettore posto sulla parte superiore dell'apparecchiatura e accendere la pompa.
- Mantenere la temperatura ambiente a 25 ± 3 °C. Le cisti di salamoia si schiudono nella soluzione salina artificiale, sotto aerazione vigorosa, illuminazione continua e temperatura stabile, dopo 24 ore a 48 ore.
NOTA: In alternativa, è possibile utilizzare un incubatore verticale. - Una volta che le uova si sono schiuse, spegnere la pompa dell'aria e attendere che i naupli (spostandosi verso il fondo dell'imbuto) siano separati dalle casse delle uova vuote (galleggianti nella parte superiore).
- Per separare le uova non schiuse dai naupli vivi, aprire il rubinetto di uscita in basso e scaricare il contenuto dell'imbuto in uno dei contenitori del contenitore dell'attrezzatura di migrazione fatto a mano (descritto al punto 1.2). Assicurarsi che la soluzione contenente i naupli e le uova residue non schiuse sia al di sotto del livello del tubo. Nel secondo contenitore, aggiungere la soluzione salina residua dal punto 2.1 sopra l'altezza del tubo.
- Coprire il contenitore con i naupli e le uova residue non schiuse usando un foglio di alluminio. Posizionare la lampada sul secondo contenitore con solo la soluzione salina. I gamberetti di salamoia saranno attratti dalla luce e migreranno da un contenitore all'altro (contenitore di raccolta), portando a un'efficiente separazione tra uova (lentamente sedimentate sul fondo) e Artemia viva.
- Quindi, posizionare l'apparecchiatura nell'incubatore nelle stesse condizioni utilizzate al punto 4.4 per 4 ore (Figura 2E). Dal contenitore di raccolta, raccogliere 900 μL di soluzione salina contenente da 10 a 15 naupli. Porre la soluzione salina con naupli in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti (Figura 2F); Tutti i campioni sono testati in quadruplicati.
- Aggiungere 100 μL ciascuno del controllo negativo (DMSO), del controllo positivo (K 2 Cr2O7,dicromato di potassio), della soluzione salina artificiale e di ciascuno dei campioni al rispettivo pozzetto (Figura 2F)13,14.
NOTA: I campioni in ciascun pozzetto saranno ad una concentrazione di 0,01 mg/ml. La concentrazione finale del controllo positivo in soluzione salina sarà di 0,1 mg/ml, per essere sicuri che tutti i naupli nel pozzetto siano esposti all'effetto tossico del dicromato di potassio e muoiano. La soluzione salina artificiale agirà come bianco. - Incubare la piastra a 25 ± 3 °C sotto illuminazione per 24 ore (Figura 2G). Dopo 24 ore, registrare il numero di larve morte (naupli non mobili per 5 s) in ciascun pozzetto al microscopio binoculare (12x)20 (Figura 2H). In alternativa, utilizzare una lente a mano.
- Aggiungere 100 μL di soluzione di bicromato di potassio, per indurre la morte delle restanti larve viventi, e attendere 6 ore. Conta le larve morte totali in ciascun pozzetto al microscopio. Determinare il tasso di mortalità secondo la seguente equazione.
- Eseguire tutto il test in triplice copia. Calcolare le deviazioni standard (SD) ed esprimere i risultati come media di tre esperimenti indipendenti, ciascuno con quadruplicati interni (n = 12), ± SD. Come menzionato da Meyer et al., considerare gli estratti grezzi e i composti puri con LC50< 1.000 μg / mL come tossici; Inoltre, tenere conto del fatto che il tasso di mortalità dei gamberetti di salamoia è proporzionale alla concentrazione dei campioni testati21.
Figura 2: Metodo di saggio biologico di letalità di Artemia salina. A) attrezzature disponibili in commercio impiegate per la schiusa di cisti di gamberetti di salamoia; b) attrezzature per la migrazione fatte a mano; c) recipiente da cova riempito di soluzione salina; D) raccolta di uova e naupli non schiusi; (E) Attrezzature fabbricate a mano nell'incubatore durante la fase di migrazione. Il contenitore lontano dalla lampada deve essere coperto con un foglio di alluminio; Tuttavia, per una migliore visione dell'installazione del set qui è stato rimosso; (F) Raccolta di Artemia in pozzi prima di eseguire il test. I composti devono essere posizionati come indicato: - si riferisce al controllo negativo (DMSO), + al controllo positivo (K 2Cr2O7), sale alla soluzione salina artificiale e da 1 a 3 ai campioni da testare (in questo caso composti 1-3); (G) Incubazione della piastra a 24 pozzetti contenente Artemia e dei campioni selezionati; (H) Conta dell'artemia al microscopio binoculare. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Strutture di composti selezionati. Struttura dei composti 1-2, estratti dalle specie di Plectranthus , e composti 3-5, ottenuti per semisintesi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Representative Results
La tossicità generale di alcuni prodotti naturali recentemente studiati dal nostro gruppo è stata valutata attraverso il saggio biologico sulla letalità dei gamberetti in salamoia. Quattro estratti (Pa- P. ambigerus; Pb- P. barbatus; Pc- P. cylindraceus; e Pe- P. ecklonii) del genere Plectranthus , noti per la loro attività antiossidante (risultati non pubblicati), sono stati testati. Inoltre, due composti naturali (1 e 2) ottenuti da Plectranthus spp., e tre derivati semi-sintetici (3, 4, 5; Sono stati studiati anche la Figura 3), tutti descritti in un altro lavoro3. Qui viene riportata la loro valutazione preliminare in termini di potenziale attività citotossica.
Tutti gli estratti testati hanno mostrato risultati molto incoraggianti, con tassi di mortalità molto bassi, paragonabili a quelli registrati per il bianco (soluzione salina) e il controllo negativo (DMSO; Figura 4). Al contrario, tra i composti puri 1-5, solo il derivato 5 ha mostrato un basso tasso di mortalità (2,30% ad una concentrazione di 100 ppm) senza tossicità generale (Figura 5).
Figura 4: Letalità degli estratti su Artemia salina. Tasso di mortalità di A. salina (%) dopo 24 ore di esposizione a quattro estratti metanolici di Plectranthus spp., a 0,1 mg/ml (Pa- P. ambigerus; Pb- P. barbatus; Pc- P. cylindraceus; Pe- P. ecklonii). Tutti gli estratti erano accettabili in termini di tossicità generale utilizzando questo test. Il sale corrisponde alla soluzione salina (bianco); K2 Cr2O7 è stato utilizzato come controllo positivo e DMSO come controllo negativo. I risultati sono stati espressi come media di tre esperimenti indipendenti, ciascuno con quadruplicati interni (n = 12) ± SD. I confronti sono stati eseguiti all'interno dei gruppi mediante l'analisi della varianza, utilizzando l'ANOVA unidirezionale con il post-test di Dunnett. Le differenze significative tra gruppi di controllo e gruppi sperimentali sono state valutate utilizzando un software di analisi statistica commerciale. Un livello di probabilità p < 0,01 è stato considerato per indicare la significatività statistica. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Letalità dei composti su Artemia salina. Tasso di mortalità di A. salina (%) dopo 24 ore di esposizione a cinque composti puri a 0,1 mg/ml (1 e 2 sono prodotti naturali e 3-5 sono derivati preparati da 1 e 2). È evidente che solo 5 mostrano una tossicità molto limitata utilizzando questo test. Il sale corrisponde alla soluzione salina (bianco); K2 Cr2O7 è stato utilizzato come controllo positivo e DMSO come controllo negativo. I risultati sono stati espressi come media di tre esperimenti indipendenti, ciascuno con quadruplicati interni (n = 12) ± SD. I confronti sono stati eseguiti all'interno dei gruppi mediante l'analisi della varianza, utilizzando l'ANOVA unidirezionale con il post-test di Dunnett. Le differenze significative tra gruppi di controllo e gruppi sperimentali sono state valutate utilizzando un software di analisi statistica commerciale. Un livello di probabilità p < 0,01 è stato considerato per indicare la significatività statistica. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
I prodotti naturali 1 e 2 hanno mostrato una letalità moderata (36,68% e 30,95% a 100 ppm, rispettivamente), mentre i derivati semisintetici 3 e 4, ottenuti rispettivamente da 1 e 2, erano più tossici dello scaffold originale (64,02% e 36,64% a 100 ppm, rispettivamente; Figura 5).
I dati complessivi hanno suggerito che tutti gli estratti testati, noti per la loro attività antiossidante e che non mostrano alcuna tossicità generale, possono essere considerati candidati per ulteriori studi di attività in vitro e tossicità su linee cellulari selezionate. Se l'assenza di tossicità è dimostrata anche nei modelli cutanei, è possibile effettuare lo sviluppo di nuovi prodotti bioattivi per l'applicazione cutanea. D'altra parte, gli effetti tossici osservati per i composti 1-4 potrebbero renderli candidati idonei per ulteriori valutazioni come agenti antitumorali.
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Discussion
Negli ultimi anni, la comunità scientifica ha aumentato la sua attenzione verso modelli alternativi per gli screening di tossicità21. Oltre al saggio biologico sulla letalità di A. salina, vengono solitamente eseguite altre metodologie per la valutazione della tollerabilità del campione e includono saggi biologici di vertebrati (come roditori), invertebrati (come il pesce zebra), metodi in vitro che utilizzano ceppi o cellule di lievito e metodi in silico 22,23,24,25 . Tutti questi metodi presentano evidenti vantaggi e svantaggi, in considerazione del denaro e del tempo spesi, della riproducibilità dei risultati e del tipo di campione da analizzare. Ad esempio, gli approcci in silico rappresentano una metodologia standardizzata a basso costo, che richiede attrezzature minime. Tuttavia, quando tali studi sono focalizzati su un singolo obiettivo, si ottengono risultati di scarsa qualità, rendendo questa alternativa fuori dall'ambito degli screening preliminari, come presentiamo in questo studio25,26. Quando si tratta di microrganismi, Saccharomyces cerevisiae è considerato uno dei modelli più utilizzati per la valutazione dei composti tossici23. Infatti, l'utilizzo del lievito in vitro è generalmente veloce e facile da effettuare; Tuttavia, può essere costoso, poiché richiede prodotti e attrezzature chimiche specifici e mostra una bassa sensibilità a dosi minime di composti citotossici27. In un approccio alternativo, le cellule umane possono essere impiegate, in modo rapido, semplice ed economico. Anche così, questi non possono rappresentare un intero organismo; Pertanto, le interazioni tra diversi tipi cellulari e le perturbazioni sistemiche che avvengono in condizioni fisiologiche non sono adeguatamente prese in considerazione25,26. D'altra parte, i saggi in vivo hanno il grande vantaggio di prendere in considerazione l'intero organismo, ma i modelli animali (come i roditori) richiedono più tempo per l'esecuzione del test, sono più costosi e implicano considerazioni etiche complesse25. Al contrario, i saggi in vivo che impiegano organismi acquatici per lo screening della tossicità sono generalmente ben accettati, considerando anche che l'uso di invertebrati marini è soggetto a preoccupazioni meno etiche e la metodologia è facile da eseguire, veloce ed economica21,24. In questo contesto, l'utilizzo del pesce zebra per lo studio della tossicità generale rappresenta spesso la prima scelta in campo. Infatti, rispetto ad altri test su animali, può essere considerata un'opzione a basso costo, in quanto i pesci zebra si sviluppano rapidamente e raggiungono lo stadio larvale precoce intorno alle 72-13 giorni dopo la fecondazione21,28. Tuttavia, la manutenzione di un pesce zebra richiede operatori ben addestrati e condizioni specifiche, come un acquario con un sistema di circolazione, in grado di aerare e filtrare l'acqua del sistema, per mantenere la qualità complessiva; inoltre, sono necessari diversi coperchi e coperchi di scarico, poiché il pesce zebra può saltare, nonché condizioni di illuminazione specifiche (14 ore di luce, 10 ore di buio) e i livelli di pH devono essere controllati quotidianamente, tra gli altri29,30. Tutte insieme, queste considerazioni rendono i modelli di zebrafish più dispendiosi in termini di tempo e costosi rispetto al modello di Artemia riportato qui, poiché questi microcrostacei sono più facili da gestire e praticabili per la coltivazione in grandi popolazioni utilizzando metodi di laboratorio. Ciò rende A. salina senza dubbio uno degli strumenti di screening più utilizzati, utilizzato principalmente per testare la tossicità generale di diversi campioni, come farmaci ed estratti di piante medicinali1.
Nel protocollo, i naupli di A. salina sono stati allevati, raccolti e incubati con campioni adatti per 24 ore, per stimare il tasso di mortalità dei naupli indotto da ciascun campione. Nella prima fase, la schiusa delle uova viene condotta in una nave da riproduzione a forma di imbuto disponibile in commercio, in cui è stato introdotto un vigoroso gorgogliamento (Figura 2A). Questa aerazione forzata è necessaria poiché consente alla schiusa dei gamberetti di salamoia di verificarsi nel modo più efficace possibile. La schiusa avviene a circa 24 h a 25 ± 3 °C, mentre fino a 48 h potrebbero essere necessarie a temperature più basse. Una volta che le uova si schiudono, la pompa viene spenta per consentire alle casse vuote di galleggiare sulla parte superiore, mentre i naupli e le uova non schiuse vengono facilmente raccolti aprendo il rubinetto dell'imbuto nella parte inferiore. Durante i nostri esperimenti, la schiusa completa delle uova non è mai stata raggiunta, con la conseguente presenza di naupli e uova non mature nella soluzione raccolta. Per questo motivo, al fine di separare efficacemente le due forme di Artemia, viene preparata un'attrezzatura manuale per la migrazione dei gamberetti in salamoia (fase 1.2). Un contenitore viene riempito con gli organismi raccolti e quindi coperto con un foglio di alluminio, mentre l'altro destinatario viene esposto alla luce diretta di una lampada. In queste condizioni, le uova non schiuse tendono a depositarsi, mentre i naupli vivi sono attratti dalla luce che colpisce il contenitore adiacente, favorendo la migrazione da una parte all'altra attraverso il collegamento a ponte. Dopo 4 ore, quasi tutti i naupli vivi sono all'interno del contenitore esposti alla luce e pronti per essere raccolti per l'esecuzione del test. In questa fase, porzioni della soluzione di acqua salata, contenenti da dieci a quindici naupli, vengono rimosse e incubate con ciascuno dei campioni da testare.
In questo lavoro, è stato dimostrato come il metodo sia efficiente, economico e facile da eseguire. Tuttavia, alcuni punti critici dovrebbero essere riconosciuti quando si esegue questo test.
Il test viene solitamente condotto con acqua di rubinetto. A seconda dei fattori geografici e fisico-chimici, l'acqua del rubinetto presenta una diversa distribuzione della durezza, influenzando la riproducibilità del saggio e, in particolare, la fase di schiusa delle uova. Per lo stesso motivo, l'uso di acqua di mare potrebbe influenzare la riproducibilità del test. La diversa concentrazione salina, la presenza di contaminanti, microplastiche e altri corpuscoli costringerebbero l'operatore a sottoporsi a ulteriori passaggi, come filtrazioni e altri tipi di purificazione, che renderebbero l'esperimento più complesso e meno facile da gestire. Tutto considerato, le condizioni ottimali dovrebbero essere stabilite in base alle caratteristiche e alla disponibilità di acqua del rubinetto, soprattutto attraverso un'attenta regolazione della quantità di sale artificiale aggiunto, che crea un ambiente adatto e funge da nutrimento anche per i naupli.
Ampie variazioni di temperatura possono comportare tassi di tratteggio più bassi. Di conseguenza, si potevano osservare bassi livelli di Artemia vivente, mescolati con un alto numero di uova non schiuse. Chiaramente, tali condizioni non sono adatte per lo sviluppo di saggi affidabili, quindi è necessario prendere in considerazione una climatizzazione controllata della stanza o l'uso di incubatori verticali appropriati.
È necessaria un'aerazione vigorosa della soluzione all'interno della nave da cova. La presenza di gorgogliamenti continui favorisce il contatto tra le uova e accelera il processo di schiusa.
La raccolta di uova non schiuse e naupli durante la raccolta può influenzare fortemente l'affidabilità del test. Ciò è dovuto alla possibilità di schiusa durante l'incubazione con i campioni. In questo caso, non tutti i naupli saranno stati esposti per lo stesso periodo di tempo, con conseguenti tassi di mortalità errati. Poiché le uova e i naupli sono troppo piccoli per essere separati in modo efficiente, sono necessari tempi di incubazione più elevati nell'attrezzatura di schiusa o l'uso delle attrezzature di migrazione fatte a mano.
Ogni pozzetto dovrebbe contenere 10-15 naupli per la fase di incubazione, attentamente contati mediante l'uso di un microscopio binoculare (ingrandimento 12x). La presenza di troppi naupli nello stesso pozzo può rendere difficile, o addirittura errato, il conteggio finale, a causa della sovrapposizione. D'altra parte, piccole quantità di gamberetti porterebbero a risultati senza rilevanza statistica.
Come è evidente, la maggior parte dei problemi di questo metodo sono legati alle fasi di schiusa e crescita, dove è necessaria maggiore attenzione per evitare problemi di affidabilità. Anche così, il metodo può tollerare modifiche, soprattutto in relazione ai punti più critici sopra descritti. Naturalmente, quando uno di questi parametri viene modificato, potrebbe essere necessario condurre diversi tentativi per ottimizzare il metodo originale. Ad esempio, la modifica della temperatura può aiutare a controllare il tempo complessivo del test: aumentare la temperatura fino a 28-29 °C aumenterà anche la velocità di tratteggio e accelererà l'intero processo.
Alcune limitazioni del saggio biologico di A. salina sono anche legate alla stabilità dei campioni alle condizioni e al tempo di prova. Il test può essere eseguito solo utilizzando campioni stabili a temperatura ambiente e sotto luce visibile. Inoltre, si deve tenere conto del fatto che l'intera procedura dura almeno 4 giorni e, se la velocità di tratteggio è bassa, il test potrebbe richiedere un giorno in più per la fase di schiusa.
Nel complesso, in questo studio, evidenziamo due esempi di applicazione della valutazione della tossicità generale attraverso il metodo A. salina. La tossicità generale è stata stabilita per tutti i campioni testati. Gli estratti delle piante di Plectranthus e del composto 5 non hanno mostrato alcuna tossicità generale, mentre i composti 1-4 si sono dimostrati moderatamente o addirittura altamente tossici sui gamberetti di salamoia. In particolare, l'effetto negativo dei composti 1 e 2 sull'Artemia è stato precedentemente dimostrato da Sitarek e Matias mediante saggi MTT e SRB/MTT, rispettivamente31,32. Allo stesso tempo, gli analoghi benzoilati, composti 3 e 4, mostrano valori di tossicità più elevati rispetto ai loro precursori 1 e 2, evidenziando che la funzionalizzazione dell'estere potrebbe avere un ruolo importante in termini di citotossicità, come confermato per il composto 4 nella linea cellulare tumorale MDR del NSCLC umano da Garcia et al.33. Tuttavia, sono necessari altri test per confermare che tale attività citotossica potrebbe essere sfruttata nella terapia del cancro. D'altra parte, il derivato 5, insieme a tutti gli estratti saggiati, non ha mostrato tossicità e appare come il composto puro più promettente della serie. Tuttavia, sono necessari ulteriori studi per valutare la potenziale attività biologica per l'applicazione cutanea.
Qui abbiamo dimostrato come l'uso del metodo a base di Artemia salina come strumento di screening potrebbe consentire un risparmio di tempo e denaro, rispetto ad altre metodologie conosciute. Rappresenta un modo efficiente e vantaggioso da sfruttare in contesti preliminari di tossicità. Può essere utilizzato in presenza di campioni diversi e complessi, farmaci sintetici e semi-sintetici, nonché per il frazionamento bio-guidato di estratti e campioni di prodotti naturali.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse, finanziari o di altro tipo.
Acknowledgments
In memoria del professor Amilcar Roberto.
Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dalla Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, Portogallo) nell'ambito dei progetti UIDB/04567/2020 e UIDP/04567/2020 attribuiti a CBIOS e PhD grant SFRH/BD/137671/2018 (Vera Isca).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Thermo Fisher Scientific, Denmark | 174899 | Thermo Scientific Nunc Up Cell 24 multidish |
| Aluminium foil | Albal | - | Can be purchased in supermarket |
| Artemio Set | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 61066000 | Can be purchased in pet shops |
| Binocular microscope | Ceti, Belgium | 1700.0000 | Flexum-24AED, 220-240 V, 50 Hz |
| Bottles | - | - | 0.5 L Diameter: 5.8 cm; Height: 12 cm |
| Brine shrimp cysts | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 3090700 | Can be purchased in pet shops |
| Brine shrimp salt | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 3090600 | Can be purchased in pet shops |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | VWR chemicals | CAS: 67-68-5 | 99% purity |
| Discartable tips | Diamond | F171500 | Volume range: 100 - 1000 µL |
| Eppendorf microtubes | BRAND | 7,80,546 | Microtubes, PP, 2 mL, BIO-CERT PCR QUALITY |
| Erlenmeyer flask | VWR chemicals | 4,47,109 | volume: 100 mL |
| Glass beaker | Normax | 3.2111654N | Volume: 1000 mL |
| Gloves | Guantes Luna | GLSP3 | - |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, San Diego, CA, USA | - | GraphPad Prism version 5.00 for Windows, www.graphpad.com, accessed on 5 February 2021; commercial statistical analysis software |
| Home-made A. salina Grower | - | - | Home made: two plastic bottles connected by a hose |
| Hot glue | Parkside | PHP500E3 | 230 V, 50 Hz, 25 W |
| Incubator | Heidolph Instruments, Denmark | - | One Heidolph Unimax 1010 equipment and one Heidolph Inkubator 1006 |
| Light | Roblan | SKYC3008FE14 | LED light bulb |
| Micropipettes | VWR chemicals | 613-5265 | Volume range: 100 - 1000 µL |
| Potassium dichromate (K2Cr2O7) | VWR chemicals | CAS: 7778-50-9 | 99% purity |
| Pump ProAir a50 | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | - | Included in the Artemio Set+1 kit |
| Rubber tube | - | - | 1.3 cm outer and 0.9 cm inner diameter |
| Stirring rod | VWR chemicals | 441-0147 |  6 mm, 250 mm |
| Termometer | VWR chemicals | 620-0821 | 0 - 100 °C |
References
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