מיקרוסקופ כוח אטומי ננו-הזחה מבוססת Cantilever: מדידות תכונות מכניות בקנה מידה ננומטרי באוויר ובנוזל

Summary

כימות שטח המגע והכוח המופעל על ידי קצה גשושית כוח אטומי (AFM) על משטח הדגימה מאפשר קביעת תכונות מכניות ננומטריות. נדונות שיטות עבודה מומלצות ליישום ננו-הזחה מבוססת AFM באוויר או בנוזל על דגימות רכות וקשות למדידת מודולוס אלסטי או תכונות ננו-מכניות אחרות.

Abstract

מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) מודד באופן יסודי את האינטראקציה בין קצה גשושית AFM ננומטרי לבין משטח הדגימה. אם ניתן לכמת את הכוח המופעל על ידי קצה הגשושית ואת אזור המגע שלו עם הדגימה, ניתן לקבוע את התכונות המכניות הננומטריות (למשל, אלסטי או מודולוס יאנג) של המשטח הנבדק. כאן מובא הליך מפורט לביצוע ניסויי ננו-הזחה כמותיים מבוססי AFM cantilever, עם דוגמאות מייצגות לאופן שבו ניתן ליישם את הטכניקה כדי לקבוע את המודולים האלסטיים של מגוון רחב של סוגי דגימות, החל מ-kPa ועד GPa. אלה כוללים תאי גזע מזנכימליים חיים (MSCs) וגרעינים בחיץ פיזיולוגי, חתכי אורן לובולי מיובשים משובצים בשרף, ופצלי Bakken בהרכב משתנה.

בנוסף, ננו-הזחה מבוססת AFM משמשת לבדיקת חוזק הקרע (כלומר, כוח פריצת דרך) של דו-שכבות פוספוליפידים. שיקולים מעשיים חשובים כגון בחירת שיטה ופיתוח, בחירה וכיול של גשושיות, זיהוי אזור עניין, הטרוגניות מדגם, גודל תכונה ויחס גובה-רוחב, שחיקת קצוות, חספוס פני השטח וסטטיסטיקות ניתוח נתונים ומדידה נדונים כדי לסייע ביישום נכון של הטכניקה. לבסוף, מודגמת לוקליזציה משותפת של מפות ננומכניות שמקורן ב-AFM עם טכניקות של מיקרוסקופ אלקטרונים המספקות מידע נוסף לגבי הרכב היסודות.

Introduction

הבנת התכונות המכניות של חומרים היא אחת המשימות הבסיסיות והחיוניות ביותר בהנדסה. לניתוח תכונות חומר בתפזורת, קיימות שיטות רבות לאפיון התכונות המכניות של מערכות חומרים, כולל בדיקות מתיחה¹, בדיקות דחיסה² ובדיקות כיפוף שלוש או ארבע נקודות (גמישות)³. בעוד בדיקות מיקרוסקליות אלה יכולות לספק מידע רב ערך לגבי תכונות חומר בתפזורת, הן נערכות בדרך כלל לכישלון, ולכן הן הרסניות. בנוסף, הם חסרים את הרזולוציה המרחבית הדרושה כדי לחקור במדויק את התכונות המיקרו והננומטריות של מערכות חומרים רבות המעניינות כיום, כגון שכבות דקות, חומרים ביולוגיים וננו-מרוכבים. כדי להתחיל לטפל בחלק מהבעיות בבדיקות מכניות בקנה מידה גדול, בעיקר בטבעו ההרסני, אומצו בדיקות מיקרו-קשיות ממינרלוגיה. קשיות היא מדד לעמידות של חומר לעיוות פלסטי בתנאים מסוימים. באופן כללי, בדיקות מיקרו-קשיות משתמשות בבדיקה קשיחה, העשויה בדרך כלל מפלדה קשוחה או יהלום, כדי להיכנס לחומר. לאחר מכן ניתן להשתמש בעומק הכניסה ו/או באזור המתקבל כדי לקבוע את הקשיות. פותחו מספר שיטות, ביניהן ויקרס⁴, קנופ⁵ וקשיות ברינל⁶ ; כל אחד מהם מספק מדד לקשיות החומר המיקרוסקולרי, אך בתנאים שונים ובהגדרות שונות, וככזה מייצר רק נתונים שניתן להשוות לבדיקות המבוצעות באותם תנאים.

ננו-הזחה מכשורית פותחה כדי לשפר את הערכים היחסיים המתקבלים בשיטות בדיקת המיקרו-קשיות השונות, לשפר את הרזולוציה המרחבית האפשרית לניתוח תכונות מכניות, ולאפשר ניתוח של שכבות דקות. חשוב לציין, על ידי שימוש בשיטה שפותחה לראשונה על ידי אוליבר ופאר⁷, ניתן לקבוע את המודולוס האלסטי או של יאנג, E, של חומר לדוגמה באמצעות ננו-הזחה מכשורית. יתר על כן, על ידי שימוש בגשושית ננו-אינדנטרית פירמידלית תלת-צדדית של ברקוביץ' (שפונקציית שטח החוד האידיאלית שלה תואמת לזו של הגשושית הפירמידלית הארבע-צדדית של ויקרס)⁸, ניתן לבצע השוואה ישירה בין מדידות קשיות ננומטריות למדידות מיקרוסקליות מסורתיות יותר. עם הגידול בפופולריות של AFM, ננו-הזחה מבוססת AFM החלה לקבל תשומת לב גם כן, במיוחד למדידת התכונות המכניות של חומרים רכים יותר. כתוצאה מכך, כפי שמתואר באופן סכמטי באיור 1, שתי השיטות הנפוצות ביותר כיום כדי לחקור ולכמת תכונות מכניות ננומטריות הן ננו-הזחה מכשירית (איור 1A) וננו-הזחה מבוססת AFM (איור 1B)⁹, שהאחרונה שבהן היא מוקד העבודה הזו.

איור 1: השוואה בין מערכות ננו-הזחה מבוססות מכשור ו-AFM. דיאגרמות סכמטיות המתארות מערכות אופייניות לביצוע (A) ננו-הזחה מכשורית ו-(B) ננו-הזחה מבוססת AFM. נתון זה שונה מ Qian et ^al.51. קיצור: AFM = מיקרוסקופ כוח אטומי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

הן ננו-הזחה מכשורית והן ננו-הזחה מבוססת AFM משתמשות בגשושית נוקשה כדי לעוות משטח דגימה מעניין ולנטר את הכוח והתזוזה המתקבלים כתוצאה מכך כפונקציה של זמן. בדרך כלל, פרופיל התזוזה הרצוי (כלומר, כוח) או (Z-piezo) מוגדר על ידי המשתמש באמצעות ממשק התוכנה ונשלט ישירות על ידי המכשיר, בעוד הפרמטר השני נמדד. התכונה המכנית המתקבלת לרוב מניסויי ננו-הזחה היא המודולוס האלסטי (E), המכונה גם מודולוס יאנג, שיש לו יחידות לחץ. המודולוס האלסטי של חומר הוא תכונה בסיסית הקשורה לנוקשות הקשר והוא מוגדר כיחס בין מתח מתיחה או דחיסה (σ, הכוח המופעל ליחידת שטח) למאמץ צירי (ε, העיוות היחסי לאורך ציר ההזחה) במהלך עיוות אלסטי (כלומר, הפיך או זמני) לפני תחילת העיוות הפלסטי (משוואה [1]):

(1)

יש לציין כי מכיוון שחומרים רבים (בעיקר רקמות ביולוגיות) הם למעשה ויסקו-אלסטיים, במציאות, המודולוס (הדינמי או המורכב) מורכב הן מרכיבים אלסטיים (אחסון, בפאזה) והן צמיגים (אובדן, מחוץ לפאזה). בפועל, מה שנמדד בניסוי ננו-הזחה הוא המודולוס המופחת, E *, הקשור למודולוס המדגם האמיתי של עניין, E, כפי שמוצג במשוואה (2):

(2)

כאשר קצה E _וקצה ν הם המודולוס האלסטי והיחס של פואסון, בהתאמה, של _קצה הננו-אינדנטר, ו-ν הוא היחס המשוער של פואסון לדגימה. יחס פואסון הוא היחס השלילי בין המתח הרוחבי למתח הצירי, ולכן מציין את מידת ההתארכות הרוחבית של דגימה כאשר היא נתונה למאמץ צירית (למשל, במהלך העמסת ננו-הזחה), כפי שמוצג במשוואה (3):

(3)

ההמרה ממודולוס מופחת למודולוס ממשי נחוצה מכיוון ש-א) חלק מהמתח הצירי המוקנה על ידי קצה האינדנטר עשוי להיות מומר לזן רוחבי (כלומר, הדגימה עלולה להתעוות באמצעות התרחבות או כיווץ בניצב לכיוון ההעמסה), וב) קצה האינדנדר אינו קשה עד אינסוף, ולכן פעולת הזחת הדגימה גורמת לעיוות מסוים (קטן) של הקצה. שימו לב שבמקרה שבו קצה E >> E (כלומר, _קצה האינדנטר קשה הרבה יותר מהדגימה, מה שנכון לעתים קרובות בעת שימוש בבדיקת יהלום), הקשר בין מודולוס הדגימה המוקטן לבין מודולוס הדגימה בפועל מפשט מאוד ל- E ≈ E*(1 - v²). בעוד שננו-הזחה מכשורית עדיפה במונחים של אפיון כוח מדויק וטווח דינמי, ננו-הזחה מבוססת AFM מהירה יותר, מספקת בסדרי גודל כוח ורגישות תזוזה גדולים יותר, מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה יותר ואיתור כניסה משופר, ויכולה לחקור בו זמנית תכונות מגנטיות וחשמליות ננומטריות⁹. בפרט, ננו-הזחה מבוססת AFM עדיפה לכימות תכונות מכניות בקנה מידה ננומטרי של חומרים רכים (למשל, פולימרים, ג'לים, דו-שכבות ליפידים ותאים או חומרים ביולוגיים אחרים), שכבות דקות במיוחד (תת-מיקרומטר) (שבהן אפקטים של המצע יכולים להיכנס לפעולה בהתאם לעומק הכניסה)^10,11, וחומרים דו-ממדיים מרחפים (דו-ממדיים) 12,13,14 כגון גרפן ^15,16, נציץ¹⁷, בורון ניטריד משושה (H-BN)18, או דיכלקוגנידים של מתכת מעבר (TMDCs; למשל, MoS₂)¹⁹. זאת בשל רגישות הכוח המעולה (sub-nN) והתזוזה (sub-nm), החשובה לקביעה מדויקת של נקודת המגע הראשונית ולהישאר בתוך אזור העיוות האלסטי.

בננו-הזחה מבוססת AFM, תזוזה של גשושית AFM לכיוון משטח הדגימה מופעלת על-ידי אלמנט פיאזואלקטרי מכויל (איור 1B), כאשר הכנף הגמיש מתכופף בסופו של דבר בשל כוח ההתנגדות הנחווה במגע עם משטח הדגימה. כיפוף או סטייה זו של המגן מנוטרת בדרך כלל על ידי החזרת לייזר מהחלק האחורי של הפתח לתוך פוטו-גלאי (גלאי רגיש מיקום [PSD]). יחד עם הידע על קשיחות הקנטיליבר (ב-nN/nm) ורגישות הסטייה (ב-nm/V), ניתן להמיר את הסטייה הנמדדת הזו (ב-V) לכוח (ב-nN) המופעל על הדגימה. לאחר מגע, ההבדל בין תנועת Z-piezo לבין הטיית הקנטליבר מניב את עומק הזחת הדגימה. בשילוב עם הידע של פונקציית אזור הקצה, זה מאפשר חישוב של אזור המגע של קצה הדגימה. לאחר מכן ניתן להתאים את השיפוע של חלקי המגע של עקומות מרחק הכוח או תזוזת הכוח (F-D) המתקבלות באמצעות מודל מכניקת מגע מתאים (ראה פרק ניתוח הנתונים בדיון) כדי לקבוע את התכונות הננו-מכניות של הדגימה. בעוד שלננו-הזחה מבוססת AFM יש כמה יתרונות ברורים על פני ננו-הזחה מכשורית כמתואר לעיל, היא גם מציגה מספר אתגרי יישום מעשיים, כגון כיול, שחיקת קצה וניתוח נתונים, שיידונו כאן. חיסרון פוטנציאלי נוסף של ננו-הזחה מבוססת AFM הוא ההנחה של גמישות ליניארית, מכיוון שרדיוס המגע ועומק ההזחה צריכים להיות קטנים בהרבה מרדיוס הכניסה, דבר שיכול להיות קשה להשגה בעבודה עם גשושיות AFM ננומטריות ו / או דגימות המציגות חספוס פני שטח משמעותי.

באופן מסורתי, ננו-הזחה הוגבלה למיקומים בודדים או לניסויי הזחת רשת קטנים, שבהם נבחר מיקום רצוי (כלומר, אזור עניין [ROI]) וכניסה מבוקרת יחידה, כניסות מרובות במיקום יחיד המופרדות על ידי זמן המתנה מסוים, ו/או רשת גסה של כניסות מבוצעות בקצב בסדר גודל של הרץ. עם זאת, ההתקדמות האחרונה ב- AFM מאפשרת רכישה בו זמנית של תכונות מכניות וטופוגרפיה באמצעות שימוש במצבי הדמיה מבוססי עקומת כוח במהירות גבוהה (המכונים בשמות מסחריים שונים בהתאם ליצרן המערכת), שבהם עקומות הכוח מתבצעות בקצב kHz תחת בקרת עומס, כאשר כוח הדגימה המרבי מנוצל כנקודת ההדמיה. פותחו גם שיטות point-and-shoot, המאפשרות רכישה של תמונת טופוגרפיה AFM ואחריה ננו-הזחה סלקטיבית בנקודות עניין בתוך התמונה, מה שמאפשר שליטה מרחבית ננומטרית על מיקום ננו-הזחה. למרות שזה לא המוקד העיקרי של עבודה זו, דוגמאות ספציפיות שנבחרו ליישומים הן של הדמיה מבוססת עקומת כוח והן של ננו-הזחה מבוססת קנטיליבר של point-and-shoot מוצגות בתוצאות המייצגות, וניתן להשתמש בהן בשילוב עם הפרוטוקול המתואר להלן אם זמין בפלטפורמת AFM הספציפית שבה נעשה שימוש. באופן ספציפי, עבודה זו מתווה פרוטוקול כללי ליישום מעשי של ננו-הזחה מבוססת AFM על כל מערכת AFM בעלת יכולת ומספקת ארבע דוגמאות מקרה שימוש (שתיים באוויר, שתיים בנוזל) של הטכניקה, כולל תוצאות מייצגות ודיון מעמיק בניואנסים, באתגרים ובשיקולים החשובים ליישום מוצלח של הטכניקה.

Protocol

הערה: בשל המגוון הרחב של AFM הזמינים מסחרית ומגוון סוגי הדגימות והיישומים הקיימים עבור ננו-הזחה מבוססת קנטילבר, הפרוטוקול הבא מתוכנן במכוון להיות כללי יחסית באופיו, תוך התמקדות בצעדים המשותפים הדרושים לכל ניסויי ננו-הזחה מבוססי קנטילבר ללא קשר למכשיר או ליצרן. מסיבה זו, המחברים מניחים שלקורא יש לפחות היכרות בסיסית עם הפעלת המכשיר הספציפי שנבחר לביצוע ננו-הזחה מבוססת קנטיליבר. עם זאת, בנוסף לפרוטוקול הכללי המתואר להלן, נכלל כחומר משלים נוהל הפעלה סטנדרטי מפורט שלב אחר שלב (SOP) ספציפי ל-AFM ולתוכנה המשמשת כאן (ראה טבלת חומרים), המתמקדת בננו-הזחה מבוססת קנטיליבר של דגימות בנוזל.

1. הכנת דוגמאות והגדרת המכשיר

1. הכן את הדגימה באופן שממזער הן את חספוס פני השטח (באופן אידיאלי בקנה מידה ננומטרי, ~ פי 10 פחות מעומק הכניסה המיועד) והן את הזיהום מבלי לשנות את התכונות המכניות של האזור (ים) המעניין.
2. בחר גשושית AFM מתאימה לננו-הזחה של הדגימה המיועדת בהתבסס על התווך (כלומר, אוויר או נוזל), מודולוס צפוי, טופוגרפיית הדגימה וגדלי התכונות הרלוונטיים (ראה את שיקולי בחירת הגשושית בדיון). טען את הגשושית על מחזיק הבדיקה (ראה טבלת חומרים) וחבר את מחזיק הבדיקה לראש סריקת AFM.
3. בחר מצב ננו-הזחה מתאים בתוכנת AFM המעניק למשתמש שליטה ברמפות בודדות (כלומר, עקומות תזוזת כוח).
   הערה: המצב הספציפי יהיה שונה בין יצרני AFM שונים ומכשירים נפרדים (ראה SOP המסופק בחומר המשלים לקבלת פרטים נוספים ודוגמה ספציפית).
4. יישרו את הלייזר על גב הגשושית, מול המיקום של קצה הגשושית ולתוך ה-PSD.
   הערה: עיין בדוגמה ליישום תאי גזע מזנכימליים לקבלת פרטים נוספים לגבי שיקולים חשובים בעת יישור הלייזר וביצוע ננו-שקע בנוזל, בפרט, הימנעות מפסולת צפה ו / או בועות אוויר, שיכולות לפזר או לשבור את הקרן. ייתכן שיהיה צורך להתאים את אופטיקת AFM כדי לפצות על מדד השבירה של הנוזל וכדי למנוע קריסה של הגשושית בעת מגע עם המשטח.
   1. מרכז את נקודת קרן הלייזר בחלק האחורי של הפתח על-ידי מקסום מתח הסכום (איור 2A).
   2. מרכז את נקודת קרן הלייזר המוחזרת ב-PSD על-ידי התאמת אותות הסטייה X ו-Y (כלומר, אופקיים ואנכיים) כך שיהיו קרובים ככל האפשר לאפס (איור 2A), ובכך לספק את טווח הסטייה המרבי הניתן לגילוי ליצירת מתח יציאה פרופורציונלי להטיית הקנטיליבר.
5. אם אינך בטוח לגבי טופוגרפיית הדגימה, חספוס פני השטח ו / או צפיפות פני השטח (במקרה של פתיתים או חלקיקים), בצע סריקת סקר טופוגרפיה AFM לפני כל ניסוי ננו-הזחה כדי לאשר את התאמת הדגימה, כמתואר בשלב 1.1 ובחלק הכנת הדגימה של הדיון.

איור 2: צג גלאי רגיש למיקום. (A) תצוגת PSD המציינת לייזר מיושר כראוי המוחזר מגב הגשושית אל מרכז ה-PSD (כפי שמעידים מתח הסכום הגדול והיעדר סטייה אנכית או אופקית) לפני המגע על משטח הדגימה (כלומר, בדיקה מחוץ למגע עם הדגימה). (B) מתח הסטייה האנכית עולה כאשר המגן מוסט (למשל, כאשר הגשושית באה במגע עם הדגימה). קיצורים: PSD = גלאי רגיש מיקום; VERT = אנכי; HORIZ = אופקי; AMPL = משרעת; n/a = לא ישים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

2. כיול בדיקה

הערה: שלושה ערכים נחוצים כדי לכמת את התכונות המכניות של דגימה באמצעות נתוני עקומת F-D שנאספו במהלך ננו-הזחה מבוססת קנטילבר: רגישות הסטייה (DS) של מערכת cantilever/PSD (nm/V או V/nm), קבוע קפיץ הקנטיליבר (nN/nm) ואזור המגע של הגשושית, המבוטאים לעתים קרובות במונחים של רדיוס קצה הגשושית האפקטיבי (nm) בעומק כניסה נתון הקטן מרדיוס הגשושית במקרה של בדיקה כדורית תשר.

1. כיול ה-DS של מערכת הגשושית/AFM על ידי דריכה על חומר קשה במיוחד (למשל, ספיר, E = 345 GPa) כך שעיוות הדגימה ימוזער וכך תנועת Z הנמדדת של הפיזו לאחר תחילת מגע חוד-דגימה תומר אך ורק לסטיית קנטיליבר.
   הערה: כיול DS חייב להתבצע באותם תנאים כמו ניסויי ננו-הזחה מתוכננים (כלומר, טמפרטורה, תווך וכו ') כדי לשקף במדויק את ה- DS של המערכת במהלך הניסויים. ייתכן שיהיה צורך בתקופת חימום לייזר ארוכה (30 דקות) לדיוק מרבי כדי לאפשר זמן להגיע לשיווי משקל תרמי ולבסס הספק פלט לייזר יציב ויציבות נקודה. יש למדוד מחדש את ה-DS בכל פעם שהלייזר מיושר מחדש, גם אם נעשה שימוש באותה גשוש, שכן ה-DS תלוי בעוצמת הלייזר ומיקומו על הגשושית, כמו גם באיכות ההשתקפות מהגשושית (כלומר, פגיעה בציפוי האחורי של הגשושית תשפיע על ה-DS) וברגישות של ה-PSD²⁰.
   1. הגדר ובצע את כניסות הכיול DS על הספיר כדי להשיג בערך את אותה סטיית בדיקה (ב- V או nm) כמו כניסות הדגימה המתוכננות, מכיוון שהתזוזה הנמדדת היא פונקציה של זווית הטיית הקצה והופכת ללא ליניארית עבור סטיות גדולות.
   2. קבע את ה-DS (בננומטר/V), או לחילופין, את רגישות המנוף האופטי ההופכי (ב-V/nm), מהשיפוע של החלק הליניארי של משטר המגע לאחר נקודת המגע הראשונית בעקומת ה-F-D שנוצרה, כפי שמוצג באיור 3A.
   3. חזור על הרמפה לפחות 5x, ורשום כל ערך DS. השתמש בממוצע הערכים לקבלת דיוק מרבי. אם סטיית התקן היחסית (RSD) של המדידות עולה על ~1%, מדדו מחדש את ה-DS, מכיוון שלפעמים עקומות ה-F-D הראשונות אינן אידיאליות עקב ההקדמה הראשונית של כוחות הדבקה.
   4. אם קבוע הקפיץ של הגשושית, k, אינו מכויל על-ידי היצרן (למשל, באמצעות ויברומטריית דופלר לייזר [LDV]), כייל את קבוע הקפיץ.
      הערה: שיטת הכוונון התרמי היא אופטימלית עבור cantilevers רך יחסית עם k < 10 N/m (עיין בסעיף קבוע הקפיץ של הדיון לקבלת רשימה ותיאור של שיטות חלופיות, במיוחד עבור cantilevers נוקשה עם k > 10 N/m). כפי שניתן לראות באיור 3B, C, כוונון תרמי משולב בדרך כלל בתוכנת הבקרה AFM.
2. אם הגשושית אינה מגיעה עם מדידת רדיוס קצה מכויילת על-ידי היצרן (למשל, באמצעות הדמיית מיקרוסקופ אלקטרונים סורק [SEM]), מדדו את רדיוס החוד האפקטיבי, R.
   הערה: ישנן שתי שיטות נפוצות למדידת רדיוס החוד (ראה פרק דיון מתאים), אך הנפוצה ביותר עבור קצות בדיקה בקנה מידה ננומטרי היא שיטת שחזור קצה עיוור (BTR), המשתמשת בתקן חספוס (ראה טבלת חומרים) המכיל תכונות חדות במיוחד (sub-nm) רבות המשמשות לתמונה יעילה של הקצה, במקום שהקצה מדמה את הדגימה.
   1. אם אתה משתמש בשיטת BTR, צלם את דוגמת החספוס (אפיון החוד) באמצעות קצב סריקה איטי (<0.5 הרץ) ורווחי משוב גבוהים כדי לסייע במיטוב המעקב אחר התכונות החדות מאוד. בחר גודל תמונה וצפיפות פיקסלים (רזולוציה) בהתבסס על רדיוס הקצה הצפוי (לדוגמה, תמונה של 1024 x 1024 פיקסלים של שטח של 3 מיקרומטר x 3 מיקרומטר תהיה בעלת רזולוציה צדדית ~ 3 ננומטר).
   2. השתמשו בתוכנת ניתוח תמונות AFM (ראו טבלת חומרים) כדי למדל את קצה הגשושית ולהעריך את רדיוס הקצה שלה ואת קוטר הקצה האפקטיבי שלה בעומק כניסת הדגימה הצפוי, כפי שמוצג באיור 3D-F.
3. עם השלמת כיול הגשושית, הזן את הערכים DS, k ו-R בתוכנת המכשיר, כפי שמוצג באיור 4A.
   1. הזן אומדן של יחס פואסון של הדגימה, ν, כדי לאפשר המרת המודולוס המופחת הנמדד למודולוס המדגם^{בפועל 9}. אם משתמשים במודל מכניקת מגע חרוטי או קוניספרי המבוסס על צורת הקצה ועומק הכניסה, יש צורך גם להיכנס לחצי זווית הקצה (איור 4C).
      הערה: המודולוס אינו רגיש יחסית לטעויות קטנות או לאי-ודאות ביחס פואסון המשוער. הערכה של ν = 0.2-0.3 היא נקודת התחלה טובה עבור חומרים רבים²¹.

איור 3: כיול גשושית. (A) קביעת רגישות להסטה. תוצאה של מדידת רגישות סטייה מייצגת שבוצעה על מצע ספיר (E = 345 GPa) עבור בדיקה במצב הקשה סטנדרטית (k נומינלי = 42 N/m; ראה טבלת חומרים) עם ציפוי אלומיניום אחורי מחזיר אור. מוצגות עקומות הגישה הנמדדת (עקבה כחולה) ועקומות נסיגה או נסיגה (עקבה אדומה). רגישות הסטייה הנמדדת של 59.16 ננומטר/וולט נקבעה על ידי התאמת עקומת הגישה בין נקודות ההצמדה למגע והפנייה, כפי שמצוין על ידי האזור שבין הקווים האדומים המנוקדים האנכיים. אזור הסטייה השלילית הניכרת בעקומת הנסיגה/נסיגה לפני משיכת המשטח מעיד על הידבקות דגימת חוד. (ב,ג) כוונון תרמי. ספקטרום רעש תרמי מייצג (עקבות כחולים) עם התאמות תואמות (עקבות אדומות) עבור שתי בדיקות שונות. (B) הגדרת כוונון תרמי ופרמטרי התאמה עבור גשושית הדמיה AFM סטנדרטית מבוססת עקומת כוח (ראה טבלת חומרים) עם קבוע הקפיץ הנומינלי שלה k = 0.4 N/m המשמש כניחוש ראשוני. ההתאמה של ספקטרום הרעש התרמי מניבה תדר תהודה בסיסי של f 0 = 79.8 קילוהרץ, אשר תואם במידה סבירה את הערך הנומינלי של f₀ = 70 קילוהרץ. מקדם ה-Q הנמדד הוא 58.1. מידת ההתאמה (R² = 0.99) מבוססת על הסכמה של ההתאמה עם הנתונים בין שני הקווים האדומים המקווקווים האנכיים. שימו לב שחשוב לדעת ולהזין הן את טמפרטורת הסביבה והן את רגישות הסטייה לקבלת תוצאות מדויקות. (C) ספקטרום רעש תרמי קנטיליוור והתאמה מתאימה (כלומר, כוונון תרמי) עם קבוע קפיץ מחושב כתוצאה מכך k = 0.105 N/m עבור מיכל רך במיוחד המשמש לביצוע מדידות ננו-מכניות על תאים חיים וגרעינים מבודדים. שימו לב לתדר התהודה הטבעית הנמוך משמעותית של ~2-3 קילוהרץ. (ד-ו) שחזור קצה עיוור. תהליך עבודה מייצג של שחזור קצה עיוור עבור גשושית קצה יהלום (R נומינלי = 40 ננומטר; ראה טבלת חומרים). (D) תמונה בגודל 5 מיקרומטר x 5 מיקרומטר של דגימת אפיון קצה המורכבת מסדרה של קוצי טיטניום חדים במיוחד (תת-ננומטר) המשמשים להדמיה של קצה הגשושית AFM. (E) מודל משוחזר (תמונת גובה הפוכה) של קצה הבדיקה. (F) תוצאות התאמת שחזור קצה עיוור, כולל רדיוס קצה משוער של R = 29 ננומטר וקוטר קצה אפקטיבי של 40 ננומטר בגובה שנבחר על ידי המשתמש של 8 ננומטר (כלומר, עומק כניסה << R) מקודקוד הקצה, המחושב על ידי המרת אזור המגע של קצה הדגימה באותו גובה לקוטר אפקטיבי בהנחה של פרופיל מעגלי (כלומר, A = πr 2 = π(d/2)²) לשימוש עם מודלים של מכניקת מגע כדורית. קיצורים: AFM = מיקרוסקופ כוח אטומי; ETD = קוטר קצה אפקטיבי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: כניסות ממשק תוכנה. (A) קבועי כיול בדיקה. ממשק משתמש תוכנה (ראה טבלת חומרים) להזנת רגישות סטייה נמדדת, קבוע קפיץ ורדיוס קצה כדי לאפשר מדידות ננומכניות כמותיות. יחס פואסון הן של הגשושית והן של הדגימה הכרחי לחישוב המודולוס האלסטי או יאנג של הדגימה מעקומות כוח הננו-הזחה המבוססות על קנטילבר. (B) חלון בקרת רמפה. ממשק משתמש של תוכנה (ראה טבלת חומרים) להגדרת ניסויי ננו-הזחה מבוססי cantilever, המאורגנים בפרמטרים המתארים את הרמפה עצמה (כלומר, פרופיל הזחה), הפעלת מכשירים (למשל, בקרת כוח לעומת תזוזה), ניתוח כוח עוקב ומגבלות תנועה (לשיפור רגישות המדידה על ידי צמצום הטווח שעליו ממיר ה- A/D צריך לפעול בשליטה על Z-piezo וקריאת סטיית PSD). (C) חצי זווית הקצה (בהתבסס על גאומטריית הגשושית או מדידה ישירה) חשובה אם משתמשים במודל מכניקת מגע חרוטית, פירמידלית או קוניספרית (למשל, סנדון). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

3. איסוף נתוני עקירה בכפייה (F-D)

הערה: ערכי הפרמטרים המוצגים כאן (ראה איור 4B) עשויים להשתנות בהתאם לכוח ולטווח הכניסה של מדגם נתון.

1. נווט את הדגימה תחת ראש AFM ועסוק באזור העניין הרצוי.
   1. נטרו את אות הסטייה האנכית (איור 2B) או בצעו רמפה ראשונית קטנה (~50-200 ננומטר) (איור 4B) כדי לוודא שהקצה והדגימה נמצאים בקשר (ראו איור 5A).
   2. כוונן את מיקום ראש ה-AFM מעט כלפי מעלה (בצעדים המתאימים ל~50% מגודל הרמפה המלאה) וכבש שוב. חזרו על הפעולה עד שהקצה והדגימה פשוט יצאו ממגע, כפי שמעידה רמפה כמעט שטוחה (איור 5B) וסטייה אנכית מינימלית של הקנטיל (איור 2A).
   3. ברגע שאין אינטראקציה ברורה בין קצה לדגימה (השוו בין איור 2A לאיור 2B), הנמיכו את ראש ה-AFM בסכום המתאים ל~50%-100% מגודל הרמפה כדי להבטיח שקצה הגשושית לא יתנגש בדגימה בזמן הזזת ראש ה-AFM באופן ידני. כבשו שוב, חזרו על הפעולה עד שנצפתה עקומה טובה (איור 5D) או עקומה דומה לאיור 5C. במקרה האחרון, בצע כוונון אחד קטן נוסף של הורדת ראש AFM השווה ל~20%-50% מגודל הרמפה כדי להשיג מגע טוב ועקומת כוח דומה לזו המוצגת באיור 5D.
2. התאם פרמטרים של רמפה (כמתואר להלן ומוצג ב איור 4B) כדי למטב את המכשיר, הבדיקה והדגימה, ולקבל רמפות דומות לאלה המוצגות ב איור 5D.
   1. בחר גודל רמפה מתאים (כלומר, תנועת Z-piezo כוללת דרך מחזור רמפה אחד) בהתאם למדגם (למשל, עובי, מודולוס צפוי, חספוס פני השטח) ועומק הכניסה הרצוי.
      הערה: עבור דגימות נוקשות יותר, סביר להניח שיתרחש פחות עיוות דגימה (ולכן יותר סטיית בדיקה עבור תנועת Z-piezo נתונה), כך שגודל הרמפה יכול להיות בדרך כלל קטן יותר מאשר עבור דגימות רכות יותר. גודל רמפה אופייני עבור דגימות קשיחות ו cantilevers עשוי להיות עשרות ננומטר, בעוד עבור דגימות רכות ו cantilevers רמפות עשוי להיות מאות ננומטר עד כמה מיקרומטר בגודל; דוגמאות ספציפיות שנבחרו ליישומים מוצגות בסעיף תוצאות מייצגות. שים לב שגדלי הרמפה המינימליים והמקסימליים האפשריים תלויים במכשיר.
   2. בחר קצב רמפה מתאים (1 הרץ היא נקודת התחלה טובה לרוב הדגימות).
      הערה: קצב הרמפה עשוי להיות מוגבל על ידי שליטה ו/או זיהוי מהירויות/רוחב פס אלקטרוניים. בשילוב עם גודל הרמפה, קצב הרמפה קובע את מהירות הקצה. מהירות החוד חשובה במיוחד כאשר מכניסים פנימה חומרים רכים שבהם השפעות ויסקו-אלסטיות עלולות לגרום להיסטרזיס ^9,22.
   3. בחר אם להשתמש ברמפה מופעלת (מבוקרת עומס) או לא מופעלת (מבוקרת תזוזה).
      הערה: ברמפה מופעלת, המערכת תתקרב לדגימה בשלבים המוגדרים על-ידי המשתמש (בהתבסס על גודל הרמפה והרזולוציה או מספר נקודות הנתונים) עד לזיהוי סף ההדק הרצוי (כלומר, כוח setpoint או הסטת קנטיליבר), ואז המערכת תיסוג למיקומה המקורי ותציג את עקומת F-D. ברמפה שאינה מופעלת, המערכת פשוט מרחיבה את Z-piezo את המרחק שצוין על ידי גודל הרמפה שהוגדר על ידי המשתמש ומציגה את עקומת F-D הנמדדת. רמפות מופעלות מועדפות לרוב מקרי השימוש, אך רמפות שאינן מופעלות יכולות להיות שימושיות בעת חקירת חומרים רכים שאינם מציגים נקודת מגע חדה וקלה לזיהוי.
      1. אם נבחרה רמפה מופעלת , הגדר את סף ההדק (הכוח המרבי המותר או הסטייה המרבית של הרמפה המוגדרת על-ידי המשתמש) כדי לגרום לכניסה הרצויה לדגימה.
         הערה: שימוש בסף הדק פירושו שרמפה עשויה להסתיים (כלומר, הגשושית עשויה להתחיל לסגת) לפני שתגיע לגודל הרמפה המלא (הרחבת Z-piezo) שצוין. הערכים עשויים לנוע בין nN בודדים לכמה μN, בהתאם למערכת הדגימה.
      2. הגדר את מיקום הרמפה כדי לקבוע את החלק בטווח המרבי של Z-piezo שישמש לביצוע הרמפה. ודא שהטווח הכולל של גודל הרמפה אינו מתחיל או מסתיים מחוץ לטווח Z-piezo המרבי (ראה דוגמאות מייצגות באיור 6), אחרת חלק מעקומת F-D לא ייצג מדידה פיזיקלית כלשהי (כלומר, Z-piezo יורחב במלואו או ייסוג ולא יזוז).
   4. הגדר את מספר הדגימות/רמפה (לדוגמה, 512 דגימות/רמפה) כדי להשיג את הרזולוציה הרצויה של המדידה (כלומר, צפיפות נקודות של עקומת F-D).
      הערה: הדגימות/הרמפה המרביות עשויות להיות מוגבלות על-ידי תוכנה (גודל קובץ) או אילוצי חומרה (לדוגמה, מהירות המרה אנלוגית לדיגיטלית [שמע/ד], בהתאם לקצב הרמפה). ניתן גם להגביל את טווח Z-piezo או הסטייה המותר (ראה פרמטרים של מגבלות באיור 4B) כדי להגדיל את הרזולוציה האפקטיבית של ממיר ה- A/D של המערכת.
   5. הגדר את סיבוב X כדי להפחית את כוחות הגזירה על הדגימה והקצה על-ידי הזזת הגשושית בו-זמנית מעט בכיוון X (במקביל לקנטיליבר) תוך הזחה בכיוון Z (בניצב לקנטיליבר). השתמש בערך לסיבוב X השווה לזווית ההסטה של מחזיק הבדיקה יחסית למשטח הרגיל (12° אופייני).
      הערה: סיבוב X הכרחי מכיוון שהמגן מותקן במחזיק הבדיקה בזווית קטנה ביחס לפני השטח כדי לאפשר לקרן הלייזר של האירוע להשתקף לתוך PSD. בנוסף, הזוויות הקדמיות והאחוריות של קצה הבדיקה עשויות להיות שונות זו מזו (כלומר, קצה הבדיקה עשוי להיות לא סימטרי). מידע ספציפי יותר ניתן לקבל מיצרני בדיקה ו- AFM בודדים.

איור 5: אופטימיזציה של הפרדת קצה מדגם לאחר העיסוק כדי להשיג עקומות כוח טובות. דוגמאות רציפות של עקומות תזוזת כוח מייצגות המתקבלות בעת הזחה בנוזל (מלח חוצץ פוספט) על גרעין תאי גזע מזנכימלי חי עם קנטיל סיליקון ניטריד רך מכויל ( k נומינלי = 0.04 N/m) המסתיים בקצה חצי ספרי ברדיוס של 5 מיקרומטר (ראה טבלת חומרים). עקומות התקבלו בתהליך של הפעלת פני התא ואופטימיזציה של פרמטרי הכניסה, כאשר גישת הגשושית מוצגת בכחול ונסוגה/נסוגה באדום. (A) החוד כבר מעורב ובא במגע עם הדגימה לפני תחילת הרמפה, מה שמוביל לסטייה וכוחות גדולים, ללא קו בסיס שטוח לפני מגע. (B) לאחר הזזת הקצה באופן ידני מספיק רחוק מהדגימה, רמפה לא מופעלת של 2 מיקרומטר גורמת לעקומת F-D שהיא כמעט שטוחה (כלומר, כמעט ללא שינוי בכוח). בתנאי סביבה, העקומה תהיה שטוחה יותר, אך בנוזל, צמיגות התווך יכולה לגרום לסטיות קלות של הגשושית במהלך רמפה כפי שניתן לראות כאן, גם ללא מגע עם פני השטח. (C) לאחר התקרבות מעט קרובה יותר לפני השטח לפני תחילת הרמפה, עקומות הגישה והנסיגה מראות עלייה קלה בכוח (שיפוע מוגבר) בסמוך לנקודת המפנה של הרמפה (כלומר, מעבר מהתקרבות לנסיגה). הסימן המסגיר שיש לחפש הוא שעקומות הגישה (כחול) והנסיגה (אדומה) מתחילות לחפוף (האזור המסומן על ידי העיגול השחור), מה שמעיד על אינטראקציה פיזית עם פני השטח. (D) עקומת F-D אידיאלית הנרכשת לאחר אופטימיזציה של פרמטרי הרמפה ומתקרבת מעט (~1 מיקרומטר) לפני השטח של התא מאשר ב-C , כך שהגשושית מבלה כמחצית מהרמפה במגע עם התא, מה שמאפשר עיוות מספיק כדי להתאים לחלק המגע של עקומת הגישה ולקבוע את המודולוס האלסטי. קו הבסיס הארוך יחסית, השטוח ובעל הרעש הנמוך מקל על אלגוריתם ההתאמה לקבוע את נקודת המגע. קיצור: F-D = עקירה בכוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: גודל הרמפה ומיקומה. צג Z-piezo המציג את היקף הרמפה (פס כחול) ביחס לטווח התנועה הכולל הזמין של Z-piezo (פס ירוק). (A) מיקום Z-piezo קרוב לאמצע טווח התנועה שלו, כפי שמצוין הן על ידי כך שהפס הכחול ממוקם בערך באמצע הסרגל הירוק והן על ידי מתח Z-piezo הנוכחי (-78.0 V) שנמצא בערך בין הערכים הנסוגים במלואם (-212.2 V) והמורחבים (+102.2 V). (B) Z-piezo מורחב ביחס ל-A, ללא הפעלת מתח הטיה. (C) Z-piezo נסוג ביחס ל-A ו-B. (D) מיקום Z-piezo זהה לזה של C ב-156.0- V-, אך גודל הרמפה הוגדל ביחס ל-A-C כדי לנצל יותר מטווח התנועה המלא של ה-Z-piezo. € גודל הרמפה גדול מדי עבור מיקום הרמפה הנוכחי, וכתוצאה מכך Z-piezo הוארך עד סוף הטווח שלה. זה יגרום לעקומת F-D להתיישר מכיוון שהמערכת לא יכולה להאריך את Z-piezo עוד יותר. קיצור: F-D = עקירה בכוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

4. ניתוח עקומת F-D

1. בחר חבילת תוכנה מתאימה לניתוח נתונים. בחר וטען את הנתונים לניתוח.
   הערה: יצרני AFM ותוכנות עיבוד תמונה AFM רבים תומכים באופן מובנה בניתוח עקומות F-D. לחלופין, הגמישות והתכונות המוגברות של חבילת ניתוח עקומות F-D ייעודית, כגון חבילת התוכנה AtomicJ בקוד פתוח, עשויות להועיל²³, במיוחד עבור עיבוד אצווה וניתוח סטטיסטי של מערכי נתונים גדולים או יישום מודלים מורכבים של מכניקת מגע.
2. ערכי קלט מכוילים עבור קבוע הקפיץ, DS ורדיוס קצה הגשוש, יחד עם הערכות של מודולוס יאנג ויחס פואסון עבור קצה הגשושית (בהתבסס על הרכב החומר שלו) ויחס פואסון של הדגימה.
   הערה: אם אתה משתמש באינדנטר קצה יהלום, ניתן להשתמש בערכים E tip = 1140 GPa ו_- ν _tip = 0.07 21,24,25,26. עבור גשושית סיליקון סטנדרטית, ניתן להשתמש בדרך כלל _בקצה E = 170 GPa _ובקצה ν = 0.27, אם כי מודולוס הסיליקון של יאנג משתנה בהתאם לכיוון הקריסטלוגרפי²⁷.
3. בחר דגם מכניקת מגע ננו-הזחה המתאים לקצה ולדגימה.
   הערה: עבור דגמי קצה כדוריים נפוצים רבים (למשל, הרץ, מאוגי, DMT, JKR), הכרחי שעומק ההזחה לתוך הדגימה יהיה קטן מרדיוס הקצה; אחרת, הגיאומטריה הכדורית של קצה הגשושית מפנה את מקומה לצורה חרוטית או פירמידלית (איור 4C). עבור דגמים חרוטיים (לדוגמה, Sneddon²⁸) ופירמידליים, חצי זווית הקצה (כלומר, הזווית בין הדופן הצדדית של הקצה לקו חוצה בניצב לקצה הקצה; איור 4C) חייב להיות ידוע והוא זמין בדרך כלל מיצרן הבדיקה. לקבלת מידע נוסף אודות מודלים של מכניקת מגע, עיין בסעיף ניתוח נתונים של thedDiscussion.
4. הפעל את אלגוריתם ההתאמה. בדוק התאמה נכונה של עקומות F-D; שגיאה שיורית נמוכה המתאימה לממוצע R 2 קרוב לאחדות (למשל, R² > 0.9) מעידה בדרך כלל על התאמה טובה לדגם^{הנבחר 29,30}. בדוק נקודתית עקומות בודדות כדי לבדוק חזותית את העקומה, התאמת המודל ונקודות המגע המחושבות במידת הצורך (לדוגמה, ראה איור 7 והחלק ניתוח נתונים בדיון).

Representative Results

עקומות תזוזת כוח
איור 7 מראה עקומות F-D מייצגות, כמעט אידיאליות, שהתקבלו מניסויי ננו-הזחה שבוצעו באוויר על דגימות אורן לובולי משובץ שרף (איור 7A) ובנוזל (מלוחים חוצצי פוספט [PBS]) על גרעיני תאי גזע מזנכימליים (MSC) (איור 7B). השימוש בכל מודל מכניקת מגע מסתמך על קביעה מדויקת ואמינה של נקודת המגע הראשונית של הדגימה. לפיכך, קו הבסיס השטוח יחסית עם הרעש הנמוך שקדם לנקודת המגע הראשונית והשיפוע החלק של חלק המגע של עקומות F-D המוצגות באיור 7 הופכים אותן לאידיאליות לניתוח לחילוץ תכונות מכניות, כפי שמעידה ההסכמה המצוינת בין עקומות הגישה (עקבות כחולות) לבין ההתאמות המקבילות (עקבות ירוקות) בכניסות פנימה.

לעומת זאת, ישנן מספר בעיות נפוצות שמשתמש עלול להיתקל בהן בעת ביצוע ננו-הזחה מבוססת קנטיליבר שתוביל לעקומות F-D לא אידיאליות. אחת הבעיות הנפוצות ביותר, במיוחד מיד לאחר הפעלה, היא שקצה הגשושית כבר נמצא במגע עם הדגימה לפני תחילת הרמפה (איור 5A), מה שמונע את רכישת קו הבסיס ההכרחי מחוץ למגע לקביעת נקודת המגע הראשונית. זה יכול גם להוביל לכוחות גדולים מדי במקרה של רמפות לא מופעלות (כלומר, עקירה מבוקרת). זה מדאיג במיוחד בעת ביצוע רמפה גדולה עם קנטיליבר נוקשה, שכן הכוחות הנובעים מכך עלולים לשבור את המקל ו / או לפגוע בדגימה או בחוד. כדי להימנע מכך, עקוב אחר מתח הסטייה האנכית במהלך ולאחר ההפעלה הראשונית. אם מתח הסטייה האנכית שנמדד הוא חיובי (בהנחה של יישור ראשוני נכון) כפי שמוצג באיור 2B, אז הקנטיל מוסט והקצה נמצא במגע עם הדגימה. מתחים חיוביים גדולים יותר מתאימים לסטיות גדולות יותר, אך ללא קשר לגודל הסטיה, המשתמש צריך להרים ידנית את ראש AFM (למשל, על ידי הפעלת מנוע צעד) הרחק מהדגימה. מתח הסטייה האנכית אמור לרדת לאט ואפילו לרדת באופן זמני מתחת לאפס במקרה של כוחות הדבקה חזקים של דגימת חוד, אבל בסופו של דבר יגיע ל-0 וולט (או קרוב ל-0 וולט) ברגע שהקצה כבר לא יהיה במגע עם הדגימה (איור 2A). מנקודה זו, המשתמש יכול לחדש אופטימיזציה של פרמטרי הרמפה וביצוע כניסות.

בעיה נפוצה נוספת (במיוחד עבור רמפות לא מופעלות) היא שעקומת F-D כולה נראית כמעט שטוחה, ללא סימן ברור לאינטראקציה בין קצה לדגימה, כפי שמוצג קודם לכן באיור 5B. אם קיים במכשיר, הפתרון לכך הוא להוריד ידנית את ראש ה-SPM ב~10% פחות מגודל הרמפה (כדי למנוע קריסה של קצה הבדיקה) ולכבוש שוב, לחזור על הפעולה עד שנצפתה עלייה ברורה בכוח עקב אינטראקציה בין קצה לדגימה (איור 5C,D) לפני שנמשיך למטב פרמטרים אחרים של הרמפה.

ללבוש טיפ
איור 8 מציג דוגמה לשחיקת קצוות בסביבה ניסיונית. גשושית AFM יחידה, קשיחה ובמצב הקשה על סיליקון (ראו טבלת חומרים) שימשה לצילום מספר אזורים גדולים של דגימת פצלי שמן Bakken (ראו דוגמת יישום מתאימה לפרטים נוספים) באמצעות שיטת הדמיה מבוססת עקומת כוח מהירה (קצב קילוהרץ), ושיטת BTR שימשה למדל את גאומטריית הקצה ולהעריך את רדיוס קצה הקצה לפני ואחרי כל אחת משלוש תמונות עוקבות. דגימות פצלי השמן שנחקרו כללו מטריצה של חרסית וחומר אורגני (E ~ 5 GPa) עם תכלילי מינרלים אנאורגניים קשים בהרבה המפוזרים לכל אורכו (E > 30 GPa). מכיוון שהדגימה הכילה שינויים משמעותיים בטופוגרפיית פני השטח (±2 מיקרומטר) על פני שטחי הסריקה הגדולים (85 מיקרומטר x 85 מיקרומטר) שצולמו, קצב הסריקה הוגדר למינימום המותר במכשיר שבו נעשה שימוש, 0.1 הרץ. עם קצב רכישת עקומת כוח של 2 קילו-הרץ וקצב סריקה של 0.1 הרץ, במהלך תמונה אחת של 1024 x 1024 פיקסלים היו יותר מ-20 מיליון אינטראקציות של דגימת טיפ. כתוצאה מכך, קצה הגשושית חווה שחיקה משמעותית ביחס למצבו הקדמוני (איור 8A) במהלך ההדמיה של הדגימה, וגדל ביותר מסדר גודל מרדיוס קצה אפקטיבי של ~11 ננומטר כפי שהתקבל ל~129 ננומטר בסיום שלוש התמונות (איור 8D). בתמונה הראשונה נראה שהקצה נשבר, וכתוצאה מכך נוצר שינוי מורפולוגי גדול שנראה באיור 8B. בכל תמונה עוקבת, הקצה נעשה מעוגל יותר ויותר, דוגמה מצוינת לתופעה הנפוצה יותר של שחיקה הדרגתית (ראו דיון). רדיוסי הקצה המשוערים מדגמי BTR כלולים באיור 8.

לעומת זאת, איור 8E,F מציג מודלים של BTR של גשושית קצה יהלום (ראו טבלת חומרים) שנרכשו בהפרש של 6 חודשים זה מזה, עם אלפי ננו-כניסות ומאות מיליוני אינטראקציות של דגימת קצה המבוססת על עקומת כוח המתרחשות ביניהן. כפי שניתן לראות מרדיוסי החוד המשוערים של 29 ננומטר (איור 8E) ו-28 ננומטר (איור 8F), רדיוס קצה הגשושית לא השתנה בגבולות שיטת BTR, מה שמדגיש את העמידות הקיצונית בפני שחיקה של יהלום. יש לציין, עם זאת, כי גשושיות קצה יהלום (כמו כל גשושיות AFM) רגישות לזיהום מפסולת דבוקה באופן רופף שיכול להשפיע על תפקוד אזור הקצה וקשיות יעילה. בהתאם לכך, ניקיון הדגימות נותר חיוני לשימור החוד ולמדידות ננו-מכניות מדויקות.

דוגמאות ליישומים
באמצעות בחירה מושכלת של הרכב חומרי הגשוש, קבוע קפיץ הקנטיליבר, וגיאומטריית קצה ורדיוס, ניתן להשתמש בננו-הזחה מבוססת קנטילבר כדי לכמת את התכונות המכניות הננומטריות של חומרים עם מודולי אלסטי החל מ-kPa ועד GPa, הן בנוזל והן בתנאי סביבה. להלן דוגמאות יישומים נבחרות כדי להדגיש כמה מהמגוון הרחב של תרחישי שימוש אפשריים עבור ננו-הזחה מבוססת cantilever.

חקירת תכונות מכניות של אורן לובולי ליישומי דלק ביולוגי
עצי אורן לובולי (Pinus taeda) הם מין של עץ רך הגדל במהירות ונפוץ מאוד בדרום ארצות הברית, ותופס מעל 13 מיליון דונם³¹. בגלל השפע שלהם, עצי אורן לובולי הם יבול מסחרי קריטי בדרום ארה"ב, המשמש בדרך כלל הן לעץ והן לעיסת עץ. בנוסף, הם משאב חשוב לייצור דלק ביולוגי צלולוסי דור שני³². חשוב לציין, הביקוש גדל לחומרי הזנה לדלק ביולוגי צלולוסי בשל חוק עצמאות האנרגיה והביטחון (EISA) משנת 2007, הקובע כי עד שנת 2022, סך השימוש בדלק מתחדש בתעשיית התחבורה בארה"ב צריך להיות 36 מיליארד גלונים, כאשר 16 מיליארד גלונים נגזרים מביומסה צלולוסית. בהתאם לכך, בשל קצב הצמיחה המהיר של אורן לובולי וזמינותו לפרויקטים של יערנות חקלאית, הוא הפך בשנים האחרונות לחומר גלם לדלק ביולוגי בעל עניין רב^33. ידע על התכונות המכניות של אורן לובולי, כולל שונות בין עצים בודדים, שברים אנטומיים (למשל, עץ לבן, קליפה, מחטים) ואזורי תאים (למשל, דופן התא לעומת פנים), עשוי לאפשר הפרדה ממוקדת של זרמי ביומסה כדי לייעל עיבוד מכני והמרה תרמוכימית³⁴.

איור 9 מציג תמונה מייצגת של טופוגרפיית AFM (חיישן גובה) (איור 9A) ומפת מודולוס אלסטית תואמת (איור 9B) של דגימת חתך רוחב של עץ לבן שהתקבלה מענף על אורן לובולי בן 23 שנה עם רדיוס ~30 ננומטר של גשושית קצה יהלום עקמומיות המורכבת על מיכל נירוסטה (k = 256 N/m). מפות הטופוגרפיה והמודולוס נוצרו בו זמנית באמצעות הדמיית AFM מבוססת עקומת כוח בקצב מהיר של קילוהרץ, כאשר מפת המודולוס מציגה תוצאות כמותיות למחצה המבוססות על ערכים נומינליים עבור קבועי כיול הגשושית (כלומר, קבוע קפיץ, רגישות סטייה ורדיוס קצה) ומתאימה את עקומות הכוח בזמן אמת למכניקת הקשר DMT (Derjaguin, Müller ו- Toporov) מודל³⁵. דגימות חתך שקוצצו לגודל של <3 מ"מ בכל שלושת הממדים (אורך x רוחב x גובה) הוכנו להדמיה על ידי התייבשות סדרתית באמצעות ריכוזים הולכים וגדלים של אתנול (33%, 55%, 70%, 90% ו-100%)³⁶, לפני שחדרו עם שרף (ראו טבלת חומרים) ופילמריו בטמפרטורה של 60°C למשך הלילה. דגימות משובצות שרף שנרפא במלואו היו תחילה טחון, ולאחר מכן אולטרה-מיקרוטום עם להב יהלום הפועל במהירות חיתוך של ~1 מ"מ לשנייה עם עובי הזנה היורד מ-1 מיקרומטר ל-50-70 ננומטר לפרוסה כדי לייצר משטח שטוח הניתן להדמיית AFM. עם זאת, כפי שניתן לראות בסרגל סקאלת הצבעים באיור 9A, פני השטח המתקבלים במקרה זה עדיין מחוספסים יחסית, אולי בשל נוכחותם של שאריות פסולת על משטח הדגימה ו/או להב האולטרה-מיקרוטום, מה שהוביל ל"פטפוט" להבים במהלך החיתוך, בעוד שדגימות אחרות הציגו טופוגרפיית פני שטח חלקה בהרבה.

איור 9C משחזר את תמונת טופוגרפיית AFM מאיור 9A, אך עם כוונת לבנה המצביעה על מיקומם של שמונה מערכים של 50 ננו-כניסות כל אחד שיבוצעו לאורך דפנות תאים נבחרים בתוך החזר ההשקעה, שכן מטרת הפרויקט המדובר הייתה להבין כיצד התכונות הננו-מכניות של אורן לובולי שונות בין סוגי רקמות שונים וגיל העץ. סף הדק של 1 μN שימש בדרך כלל עבור הרמפות (גודל רמפה נומינלי של 60 ננומטר שנערך בקצב רמפה של 1 הרץ), מה שהוביל לעומק הזחה של ~10 ננומטר לאורך דפנות התא (8 ± 2 ננומטר בכל הדגימות שנחקרו) או מעט עמוק יותר (14 ± 4 ננומטר) בפנים התא, שהם מעט רכים יותר מדפנות התא. כניסות בתוך כל קו היו במרווחים של ≥100 ננומטר זו מזו כדי להבטיח שהן מופרדות היטב, ונאספו 1,024 נקודות נתונים לכל רמפה כדי לייצר עקומות גישה ונסיגה מאופיינות היטב. על ידי שילוב של הדמיה מבוססת עקומת כוח מהירה עם ננו-הזחה מבוססת קנטיליבר של point-and-shoot, ניתן היה להפיק סטטיסטיקה ולקבוע הבדלים במודולים בין מבני תאים. לדוגמה, כפי שניתן לראות בטבלה 1, נמצא כי המודולוס האלסטי הממוצע של פנים התא היה כמחצית מזה של דופן התא על פני דגימות עץ לבן שמקורן בענפים מרובים של עצים בגילאים שונים.

לדוגמה	מקום	E* (GPa)	E (GPa)	דפורמציה (nm)	ספירה (n)
1	פנים	1.5 ± 0.4	2.4 ± 0.4	14 ± 2	199
	קיר	4.7 ± 1.3	4.3 ± 1.3	7 ± 2	202
2	פנים	1.3 ± 0.3	1.2 ± 0.3	16 ± 3	198
	קיר	3.2 ± 0.9	4.6 ± 0.9	9 ± 2	199
3	פנים	3.1 ± 0.6	1.7 ± 0.6	12 ± 3	198
	קיר	5.7 ± 1.2	5.2 ± 1.2	6 ± 1	199
4	פנים	2.4 ± 0.8	2.5 ± 0.8	11 ± 3	202
	קיר	4.8 ± 2.1	3.1 ± 2.1	9 ± 4	193
5	פנים	4.6 ± 0.8	3.3 ± 0.8	10 ± 2	198
	קיר	4.3 ± 1.6	3.9 ± 1.6	7 ± 2	199
ממוצע	פנים	3.1 ± 0.6	1.8 ± 0.6	13 ± 3
	קיר	4.4 ± 1.4	4.0 ± 1.4	8 ± 2

טבלה 1: מודולוס אלסטי אורן לובולי סטטיסטיקה: דפנות תאים לעומת פנים התא. מודולי אלסטיות נמדדו של דפנות התא לעומת פנים התא עבור חמש דגימות ענפי עץ לבן מעץ אורן לובולי שנאספו משני עצים בגילאים שונים. כל ערכי המודולוס חושבו על ידי התאמת חלק הגישה של עקומת תזוזת הכוח למודל DMT והנחת יחס פואסון של 0.3 עבור המדגם. מודולי מדווחים כסטיית תקן ממוצעת ± עבור כל מיקום מדגם, כאשר מספר עקומות הכוח (ספירה, n) מנותחות כדי להפיק את התוצאה המדווחת. מודולים מופחתים שנמדדו (E*) הומרו למודולי דגימה ממשיים (E), בהנחה שמודולוס יאנג של 1,140 GPa ויחס פואסון של 0.07 עבור קצה היהלום שנעשה בו שימוש. כמו כן מוצג עיוות המדגם הממוצע עבור העומס המופעל של 1 μN.

ננומכניקה מתואמת ומיקרוספקטרוסקופיית אלקטרונים על פצלי באקן
מרבצי פצלי באקן נמצאים באגן ויליסטון במונטנה ובדקוטה הצפונית בארצות הברית ובחלקים מססקצ'ואן בקנדה. זהו מאגר הפחמימנים השני בגודלו בארצות הברית, אך המחקר של הפיקדונות עדיין בחיתוליו³⁷. חקירה של התכונות הננו-מכניות של פצלי Bakken כפונקציה של הרכב ובשלות תרמית נערכה על ידי לוקליזציה משותפת של ננו-הזחה מבוססת AFM cantilever עם דימות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) וספקטרוסקופיית פיזור אנרגיה (EDS) אפיון הרכב יסודות, כפי שמוצג באיור 10. באופן ספציפי, נעשה שימוש במיפוי SEM-EDS כדי לאפיין את התפלגות היסוד (איור 10C), ובכך לקבוע את הנוכחות והמיקום של תכלילי מינרלים שונים בתוך מטריצת פצלי השמן. דימות AFM מבוסס עקומת כוח מהירה (קצב kHz) (איור 10B) עבר לוקליזציה משותפת עם מפות SEM-EDS על-ידי הגדרת מקור אופטי שניתן לזיהוי בתמונת SEM של אלקטרונים משניים (SE) (איור 10A) ומעקב אחר תנועת השלב הן של AFM והן של SEM³⁸. על-ידי שימוש חוזר בגשושית קצה יהלום המורכבת על מיכל נירוסטה קשיח, מיפוי של שינויים במודולוס האלסטי היה אפשרי עבור אזורים גדולים (85 מיקרומטר x 85 מיקרומטר) המכילים תכלילים מעניינים (איור 10D). שימו לב שמפת המודולוס המוצגת באיור 10D היא איכותית ולא כמותית במהותה, שכן קבועי כיול הגשושית המתאימים לא הוזנו לתוכנה לפני ההדמיה ואיסוף הנתונים.

תמונות AFM באיור 10B ובאיור 10D מדגישות גם את אחד החסרונות של גשושית קצה היהלום שבה נעשה שימוש, והוא חוסר יכולתה לעקוב במדויק אחר תכונות יחס גובה-רוחב גבוה (ראו את האזור הסגלגל השחור באיור 10B) בשל הגיאומטריה של קצה פינת הקובייה שלה. את הרזולוציה המופחתת וחוסר היכולת לעקוב במדויק אחר מאפיינים תלולים ניתן לראות בבירור רב יותר באיור 11, שם אותו אזור כללי של דגימת פצלי Bakken צולם על-ידי קצה יהלום פינת הקובייה (איור 11A) וגשושית סיליקון AFM במצב הקשה נוקשה בעלת יחס גובה-רוחב גבוה יותר באופן משמעותי (איור 11B). באופן ספציפי יותר, התמונה המוצגת באיור 11B נרכשה באמצעות הגשושית המאופיינת באיור 8A-D, בין מודלי BTR באיור 8A (R = 11 ננומטר) ואיור 8B (R = 43 ננומטר). לצורך השוואה ישירה, זוגות התמונות איור 11C,D, יחד עם איור 11E,F, מציגים תמונות מוגדלות של אותן תכונות משטח מדגם שהתקבלו עם קצה היהלום וגשושית הסיליקון, בהתאמה, ומראים את ההשפעה של גיאומטריית קצה ורדיוס על רזולוציית התמונה ונאמנותה. איור 11G מציג תמונה תלת-ממדית מורכבת המשלבת את טופוגרפיית פני השטח שנרכשה עם גשושית הסיליקון החדה בעלת ההיבט הגבוה (איור 8A,B) ואת ערכי המודולוס שנרכשו עם גשושית קצה היהלום (איור 8E,F) המקודדת כעור צבעוני מכוסה על.

בנוסף לתמונות הגדולות המוצגות באיור 10 ובאיור 11, תמונות קטנות יותר (10 מיקרומטר x 10 מיקרומטר) המבוססות על עקומת כוח מהיר נרכשו באמצעות גשושית קצה יהלום מכויילת במלואה. תמונות אלה התמקדו באזורים ללא תכלילי מינרלים אנאורגניים נראים אופטית כדי לחקור את התכונות של המטריצה האורגנית שמסביב בפירוט רב יותר. על ידי שימוש ברזולוציית פיקסלים של 512 x 512 (כלומר, ~ 20 ננומטר x 20 ננומטר פיקסלים לדגימה של פיקסלים), >262,000 עקומות F-D בודדות נלכדו ונשמרו עם כל תמונה של 10 מיקרומטר x 10 מיקרומטר, מה שמאפשר סטטיסטיקה מצוינת. נתוני ה-F-D עובדו ונותחו באצווה באמצעות חבילת התוכנה^{AtomicJ 23} כדי ליישם את מודל מכניקת הקשר Derjaguin-Muller-Toporov (DMT)³⁵. לאחר ההתאמה, הנתונים נוקו כדי להסיר עקומות שהביאו למודולוס אלסטי מחושב <0 (לא פיזי) או >30 GPa (מכיוון שהמחקר התמקד בחלק הלא מינרלי של פצלי הפצלים, E << 30 GPa) בדומה למחקרים אחרים^39,40, כמו גם נתונים עם התאמת מודל R² < 0.7. בעוד שהחיתוך של R² שרירותי למדי, הוא נבחר כדי להסיר רק נתונים שהמודל כמובן לא יכול היה להתאים במדויק. למעט חריגה אחת שכללה הכללת מינרלים גדולה באזור ההדמיה, העקומות שהוסרו היוו פחות מ-0.5% מכלל הנתונים עבור כל תמונה. סיכום התוצאות הסטטיסטיות ניתן למצוא בטבלה 2. המודולים האלסטיים המחושבים נעים בין 3.5 ל-6.1 GPa, בטווח של מה שמחקרים דומים מצאו גם^39,40.

לדוגמה	E (GPa)	תפוקה לאחר ניקוי נתונים	ספירה (n)
1	6.1 ± 3.8	93.70%	7,36,874
2	5.1 ± 2.6	99.70%	7,84,267
3	3.5 ± 1.9	99.60%	7,83,427

טבלה 2: סטטיסטיקות מודולוס אלסטי של פצלי Bakken. נמדדו מודולים אלסטיים של המטריצות האורגניות בשלוש דגימות פצלי Bakken בעלי הרכב שונה ובשלות תרמית שונה. מדגם 1 הוא בקרה, בעוד שדגימות 2 ו-3 חושלו במשך 12 שעות ו-48 שעות, בהתאמה, כדי לדמות באופן מלאכותי הבשלה תרמית. מודולים אלסטיים מדווחים כסטיית תקן ± ממוצעת עבור כל מיקום מדגם, כאשר מספר עקומות הכוח (ספירה, n) נכלל בניתוח לאחר שימוש בהליך ניקוי הנתונים המתואר בטקסט שצוין. המודולים הממוצעים המחושבים (3.5-6.1 GPa) נמצאים בטווח שדווח במחקרים דומים אחרים, כמו זה של Li et ^al.40, שמצאו טווח מודולוס של 2.9-11.8 GPa.

הנוקשות הגרעינית של תאי גזע מזנכימליים משתנה עקב גירויים חיצוניים
תאי גזע מזנכימליים (MSCs) הם תאי אב שיכולים להפוך לכונדרוציטים, אדיפוציטים, אוסטאובלסטים ומיוציטים⁴¹. התמיינות MSC לסוגי רקמות שונים אלה מושפעת מגירויים מכניים חיצוניים על התא באמצעות המקשר של קומפלקס שלד התא והנוקליאוסקלטון (LINC), המקשר פיזית בין קרום התא החיצוני לקרום הגרעין⁴¹. קומפלקס LINC מורכב מחלבוני SUN ו- Nesprin המקיימים אינטראקציה עם שלד התא כדי לזהות כוחות פיזיקליים על התא ולהקל על ייבוא גרעיני של הגורמים הרגישים למכנו β-catenin ו- YAP כדי להתחיל את תהליך ההתמיינות^42,43,44. יחד עם היבוא הגרעיני של β-catenin ו-YAP לאחר מכניסטימולציה של תאים, השלד הציטו-שלד עובר גם סידור מחדש, כולל היווצרות חוטי F-actin סביב הגרעין, כמו גם טרנסלוקציה גרעינית של אקטין^44,45,46. מכיוון שמכניסטימולציה יוזמת שינויים בשלד התא ובכניסה גרעינית של אקטין (actin), הנוקשות הכוללת (מודולוס) של תאים וגרעינים מושפעת וניתן למדוד אותה על ידי ננו-הזחה מבוססת AFM. מחקרים קודמים אישרו זאת על ידי זיהוי ירידה במודולוס התא והגרעין לאחר שיבוש של קומפלקס LINC, ולהיפך עלייה במודולוס התא והגרעין לאחר המכניסטימולציה של MSCs⁴⁷. המחקר הנוכחי עדיין חוקר את מנגנוני ייבוא האקטין לגרעין וכיצד פילמור אקטין משפיע על מודולוס התא והגרעין לאחר מכניסטימולציה.

כדי לחקור את התכונות המכניות של תאים חיים, הניסויים חייבים להתבצע בתמיסת חיץ, בדרך כלל PBS. ביצוע ננו-הזחה מבוססת קנטיליבר בנוזל מציב בעיות ייחודיות, במיוחד למדידת דגימות רכות מאוד כגון MSCs (E≈ 2 kPa). בפרט, המודולים האלסטיים הנמוכים של תאים חיים מחייבים שימוש ברדיוס בדיקה גדול כדי להפחית את הלחץ המוקנה על מבנה התא ולמנוע ניקוב של הממברנה. בנוסף, יש צורך בקפיצים קבועים נמוכים מאוד (k = 0.04 N/m) כדי למדוד מודולים אלסטיים נמוכים כאלה, אך הדבר מגדיל את ההסתברות למעורבות שגויה עקב הגרר הצמיגי של הנוזל, מה שמוביל להטיה של הקנטיליבר הרך במהלך שלב ההנמכה המהיר הראשוני של תהליך הפעלת AFM. כדי לנטרל את הנטייה הגבוהה יותר לעסקאות שווא, ייתכן שיהיה צורך להשתמש בנקודת הגדרה גדולה יותר של מעורבות (כלומר, סף הדק מתח הסטה כדי לסיים את תהליך ההתקשרות). מכיוון שקנטילברות רכות יותר יכולות בדרך כלל להיות מעוותות באופן אלסטי במידה רבה יותר מאשר קנטילברות נוקשות, הכיפוף הגדול יותר שנחווה עם נקודת מעורבות גבוהה יותר בנוזל בדרך כלל אינו מזיק לבדיקות רכות כאלה. בנוסף, הכרחי כי התמיסות המשמשות בסביבה נוזלית יהיו ללא פסולת ובועות, שכן פסולת צפה או בועות יכולות להפריע באופן זמני להעברת הלייזר דרך הנוזל ל- PSD או להיצמד למיכל ולחסום את הלייזר. הפרעה לקרן הלייזר תשפיע לרעה על עקומות ה-F-D הנובעות מכך ולעתים קרובות תגרום לזיהוי קריסה כוזב או להפעלה כוזבת. לבסוף, ננו-הזחה על תאים חיים דורשת גם יותר קלט משתמש מאשר על חומרים קשים ודוממים יותר. בפרט, מכיוון שהתאים וסביבת הנוזל שלהם הם הרבה יותר דינמיים, ייתכן שיהיה צורך להתאים באופן פעיל את גובה הבדיקה עבור כל רמפה כדי להבטיח עקומת F-D טובה מתקבלת.

בננו-הזחה של תאים חיים, לעתים קרובות נדרש עיוות דגימה גדול בהרבה כדי לגרום לאותה סטייה ביחס לדגימות נוקשות יותר. עיוות גדול יותר זה יכול לגרום לתוצאות ניסוי לסטות מהנחת האלסטיות הליניארית של מודל הרץ, ולכן ייתכן שיהיה צורך ליישם גורם תיקון כדי להסביר את ההתנהגות ההיפר-אלסטית לצורך ניתוח F-D מדויק⁴⁸. נמצא כי יחס הגודל הגיאומטרי , כאשר R ₂ הוא רדיוס האינדנטר ו- R₁ הוא רדיוס התא (ראה איור 12A), יכול לשמש לחיזוי היצמדות הנתונים המתקבלים למכניקה הרציאנית. נמצא כי יחס הגודל הגיאומטרי האידיאלי הוא β = 0.3, כאשר ערכי β <0.3 מובילים להערכת חסר של המודולוס האלסטי וערכי β > 0.3 מה שמוביל להערכת יתר של המודולוס האלסטי כאשר נותח עם תורת הקשר הרץ⁴⁸. אחת הדרכים הנפוצות להימנע מהשפעות לא ליניאריות היא לשמור על עיוותים קטנים. במחקר זה, עומק ההזחה הוגבל ל-500 ננומטר-1 מיקרומטר.

ערכת נתונים מייצגת שמראה תוצאות של קבוצה אחת של ניסויי ננו-הזחה על MSCs וגרעינים מבודדים מוצגת באיור 12B. בנתונים המוצגים באיור 12B, מכוילים מראש (קבוע קפיץ דרך LDV ורדיוס קצה דרך SEM), בדיקות חצי ספריות ברדיוס של 5 מיקרומטר עם קבוע קפיץ נומינלי של k = 0.04 N/m שימשו לחקר הבדלים במודולוס בין MSCs חיים שלמים לבין גרעיני MSC מבודדים, ששימשו כבקרות לבדיקת ההשפעות של זנים סטטיים ודינמיים על תכונות מכניות תאיות וגרעיניות⁴⁶ . בשל הבדלים ואתגרים בעיסוק בתאים ובגרעינים, נתוני המודולוס המופקים נוטים להציג שונות גדולה (כלומר, התפלגות הערכים). בהתאם לכך, מערך הנתונים באיור 12B מציג^אחוזון 75 מהנתונים שנאספו. בשל שונות מולדת זו בין תאים חיים והתפשטות המדידה כתוצאה מכך, מומלץ לבצע ניסויי ננו-הזחה משוכפלים על מספר רב של דגימות עם לפחות שלושה עותקים ביולוגיים על מנת ליצור סטטיסטיקה חזקה לניתוח נתונים ופרשנות³⁰.

תכונות מכניות של דו-שכבות שומנים המכילות כולסטרול
קרומי שומנים נתמכים עם תכולת כולסטרול (Chol) גבוהה מאוד (>50 מול), האופיינית להרכב המצוי בקרומי עדשות העין, הוכנו והודגרו על נציץ מוסקבאי^{טרי שסוע 49}. תמונה טופוגרפית AFM מייצגת של קרום שומנים נתמך כזה (SLM) שהוכנה ביחס ערבוב Chol/POPC (POPC = 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine) של 1 מוצגת באיור 13A, עם פרופיל הגובה לאורך הקו הסגול בתמונה המוצגת מתחת לאיור. ה-SLM באיור 13A כיסה לחלוטין את משטח הנציץ החשוף עם זמן דגירה מספיק (~25 דקות) וריכוז שומנים מספיק (0.3 מ"ג/מ"ל), כפי שמעיד היעדר מאפיינים מובחנים בתמונת הטופוגרפיה. כמו כן, פרופיל הגובה לאורך התמונה מספק פרטים מבניים לגבי חספוס פני השטח של הממברנה, כאשר SLM חלק כצפוי.

איור 13B מציג אוסף של קטעי גישה של עקומות כוח שנלכדו ב-SLM המוצגים באיור 13A. כדי להשיג סטטיסטיקה טובה יותר לגבי התכונות המכניות של SLM, נאספו עקומות כוח בנקודות שוות מרחק במרווחים של לפחות 100 ננומטר זו מזו, וכיסו כמעט את כל רוחב ה-SLM. המרווח בין נקודות (≥פי 10 מעומק הכניסה) נבחר כדי למנוע הזחה קרובה מדי זו לזו. עקומות הכוח מראות אירוע פריצת דרך ברור, כפי שמעידה אי הרציפות או הקפיצה הפתאומית בין מרחקי ההפרדה ~0 ו~5 ננומטר בקטע הגישה של עקומות הכוח שבו הכוח יורד בתלילות מ~10 nN ל~5 nN. כוח פריצת הדרך הממוצע של הממברנה המוצג באיור 13A (יחס ערבוב Chol/POPC של 1) בהתבסס על עקומות הגישה באיור 13B מחושב כ-9.25 ±-0.27 nN.

לעומת זאת, איור 13C מראה תמונה טופוגרפית AFM של ממברנות חלקיות או טלאי ממברנה שנוצרו על-ידי דגירה חוזרת של ממברנות ביחס ערבוב Chol/POPC של 1, אך בריכוז נמוך בהרבה של שומנים (~15 מיקרוגרם/מ"ל) ועם זמן דגירה קצר יותר (~5-6 דקות)⁴⁹. פרופיל הגובה לאורך הקו האדום לרוחב כתם הממברנה במרכז התמונה מוצג מתחת לאיור. המדידה על פני הדו-שכבה החלקית מספקת את עובי ה-SLM, שמוצג על-ידי הקווים המקווקווים השחורים באיור 13C כ~7 ננומטר. עם זאת, עובי נמדד זה כולל גם שכבת מים של 1-2 ננומטר בין הממברנה לבין דיסק הנציץ⁵⁰. יש לציין כי הממברנה החלקית מחוברת לעיתים קרובות רק בצורה חלשה למשטח הנציץ, מה שעלול לגרום להסרת חלקיקי שומנים מקצה מדבקות הקרום החלקי במהלך הסריקה, אך זמן דגירה מעט ארוך יותר או הורדת כוח ההדמיה יכולים לבטל קושי זה.

כיול של גשושית AFM חיוני לכימות מדויק של תכונות מכניות SLM. בפרט, למרות שקבוע קפיץ החוד נשאר עקבי בתווך האוויר או הנוזל, רגישות הסטייה חייבת להיות מכויילת באותו תווך שבו מבוצעים הניסויים. חיוני לכייל את רגישות הסטייה מיד לפני כל קבוצה של רכישות עקומת כוח כדי להבטיח תוצאות ניתנות לשחזור, מכיוון שיישור הלייזר ו / או ההחזרה של ציפוי הצד האחורי יכולים להשתנות עם הזמן, במיוחד בנוזל. גשושיות חדות מאוד אינן מומלצות ללכידת עקומות כוח ממברנה, מכיוון שהן מנקבות בקלות את ה- SLM ועלולות להוביל למדידת כוח פריצה נמוך בטעות או ללא פריצת דרך כלל. עם זאת, שימוש חוזר באותו קצה ללא ניקוי מתאים מגדיל את הסיכוי להצטברות לכלוך על הקצה ובכך להקהות את הקצה או להשפיע על כוחות ההדבקה של הדגימה. היעדר אירועים פורצי דרך הניכרים בעקומות כוח הגישה עשוי להתאים גם לדחיפה רק על נציץ ולא על הממברנה בפועל; לכן, אישור חזותי של היווצרות הממברנה לפני לכידת עקומות כוח הוא הכרחי.

איור 7: עקומות תזוזת כוח מייצגות (F-D) באוויר ובנוזל. עקומות כוח מייצגות המתקבלות על (A) אורן לובולי באוויר עם התאמת מודל DMT נלווה, ו-(B) גרעין MSC חי ב-PBS עם התאמת מודל הרץ נלווה. כניסות בחלוניות A ו - B מציגות זום של אזור המגע של עקומות הגישה המתאימות (עקבות כחולות) עם התאמה נלווית (עקבות ירוקות). בכל לוח, נקודת המגע הראשונית של דגימת קצה (כפי שנקבעה על ידי אלגוריתם ההתאמה) מסומנת על ידי יהלום ירוק, בעוד שנקודת הסיבוב (כלומר, מעבר מהתקרבות לנסיגה או נסיגה) מסומנת על ידי מעגל ציאן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 8: השוואה בין שחיקת קצה גשושית סיליקון לעומת שחיקת קצה גשושית יהלום. (A-D) קצה בדיקה מסיליקון. סדרת דגמים שנוצרו בשיטת שחזור החוד העיוור בעקבות הדמיה של דגימת אפיון חוד, המדגימים את האבולוציה ברדיוס של גשושית קצה סיליקון קשיחה (ראה טבלת חומרים) עקב שחיקת קצה פרוגרסיבית שנחווית במהלך שלוש תמונות עוקבות מבוססות עקומת כוח של 85 מיקרומטר x 85 מיקרומטר (1024 x 1024 פיקסלים) של דגימת פצלי שמן Bakken, נערך בקצב סריקת קו של 0.1 הרץ וקצב דגימת עקומת כוח של 2 קילוהרץ (כלומר, ~20 מיליון אינטראקציות טיפ-דגימה / תמונה). (א) טיפ כפי שהתקבל (מחוץ לקופסה), לפני השימוש. R = 11 ננומטר. (B) טיפ אחרי תמונה אחת (R = 43 ננומטר). (C) טיפ אחרי שתי תמונות (R = 94 ננומטר). (D) טיפ אחרי שלוש תמונות (R = 129 ננומטר). (ה,ו) קצה בדיקה יהלום. דגמי BTR של אותה בדיקת קצה יהלום (ראה טבלת חומרים) שהתקבלו ~ בהפרש של 6 חודשים. בין רכישת תמונות החוד המשמשות ליצירת המודלים המוצגים ב-E וב-F, בוצעו אלפי ננו-כניסות עם הגשושית והתרחשו מאות מיליוני אינטראקציות של דגימת קצה במהלך הדמיה מבוססת עקומת כוח. עם זאת, בשל קשיות היהלום, רדיוס קצה הקצה המשוער של ~30 ננומטר לא השתנה במסגרת גבולות אי הוודאות של טכניקת BTR בין רכישת התמונה הראשונית (E) ותמונת המעקב (F) של הקצה. האספריות שנצפתה במודל הקודם (מסומנת על ידי העיגול השחור בלוח E היא ככל הנראה תוצר של שיטת BTR או בשל נוכחות של מזהם ננומטרי (למשל, חלקיק אבק) בצד הקצה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 9: טופוגרפיה AFM ומפות מודולוס של דגימת אורן לובולי. נתוני AFM מייצגים המתקבלים באוויר על דגימת אורן לובולי חתך המוטמעת בשרף כדי לאפשר מדידות ננו-הזחה מבוססות קנטיליבר על דפנות התא. (A) תמונת טופוגרפיה של AFM המכסה תאים מרובים הנרכשים באמצעות מצב הדמיה מבוסס עקומת כוח מהירה, המוצגת כתיאור פסאודו-תלת-ממדי. (B) מפת מודולוס אלסטית או צעירה שנוצרה בזמן אמת על ידי תוכנת AFM על ידי ניתוח עקומת הכוח המתקבלת בכל פיקסל והתאמת הנתונים למודל DMT, המראה שדפנות התא נוקשות יותר מפנים התא. שים לב שנעשה שימוש בפרמטרי כיול הבדיקה הנומינליים, ולא הנמדדים, ולכן יש להתייחס לערכי המודולוס כאיכותיים או כמותיים למחצה בלבד. (C) סקירה כללית של החזר ההשקעה המציינת את המיקומים (שמונה קווים המורכבים מ-50 כוונת לבנה כל אחד במרווחים של ≥100 ננומטר זה מזה) שבהם 400 ננו-כניסות (גודל רמפה נומינלי של 60 ננומטר, עם סף הדק של 1 מיקרו-N המתאים לעומק כניסה ממוצע של ~10 ננומטר) בוצעו לאורך דפנות תאים נבחרות לאחר רכישת תמונת AFM כדי לאפשר איתור כניסות בדיוק ננומטרי. פסי קנה מידה = 20 מיקרומטר (A,B). קיצורים: AFM = מיקרוסקופ כוח אטומי; DMT = Derjaguin-Muller-Toporov. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 10: AFM ו-SEM/EDS של דגימת פצלי שמן Bakken. (A) תמונת SEM אלקטרונית משנית של חלק מדגימת פצלי Bakken. (B) תמונת טופוגרפיה AFM של האזור המסומנת בתיבה השחורה ב-A. אליפסה שחורה מציינת אזור שבו יחס הגובה-רוחב הנמוך של הגשושית מוביל להדמיה של דופן הצד של הגשושית במקום תכונת טופוגרפיית פני השטח התלולה ובעלת יחס הגובה-רוחב הגבוה. (C) מפת הרכב יסוד EDS שהתקבלה עבור תמונת SEM המוצגת ב-A. (D) מפה אלסטית או מודולוס של יאנג שנוצרה במהלך קבלת תמונת טופוגרפיית AFM ב-B, המראה שהכללת המינרלים במרכז התמונות A-D קשה משמעותית מהמטריצה האורגנית שמסביב. פסי קנה מידה = 50 מיקרומטר. קיצורים: AFM = מיקרוסקופ כוח אטומי; SEM = מיקרוסקופ אלקטרונים סורק; EDS = ספקטרוסקופיית פיזור אנרגיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 11: השפעת רדיוס קצה הבדיקה וצורתו על המראה של תכונות יחס גובה-רוחב גבוה. השוואה של רזולוציית תכונות המתקבלת באמצעות (A) יחס גובה-רוחב נמוך R≈ 30 ננומטר (קצה חצי זווית = 47°) גשושית קצה יהלום (ראה טבלת חומרים) או (B) יחס גובה-רוחב גבוה R≈ 10 ננומטר (קצה חצי זווית ≈ 19°) בדיקת סיליקון קשיח (k נומינלי = 200 N/m; ראה רשימת חומרים) כדי לצלם את אותו מיקום על דגימת פצלי Bakken. (ג-ו) תמונות מוגדלות של האזורים הכחולים (C,D) והכתומים (E,F) בתיבות A ו- B המתקבלות עם הרדיוס הגדול יותר של עקמומיות ביחס גובה-רוחב נמוך של בדיקת קצה יהלום (C,E) או עם הגשושית החדה והגבוהה יותר של יחס גובה-רוחב קשיח (D,F), המדגישות את רזולוציית התכונות המופחתת והצגת לכלוכי דופן צד קצה בתמונת טופוגרפיית AFM המתקבלת עם גשושית קצה היהלום בשל רדיוס הקצה הגדול יותר שלה חצי זווית. האזורים המודגשים ב- C-F מכילים תכונות תלולות ועמוקות דמויות-באר המדגימות את הפשרות במונחים של רזולוציה רוחבית, מעקב מדויק ונאמנות תמונה בין גשושית סיליקון קהה וחדה יותר בתחילה או גשושית קצה יהלום קהה ועמידה בפני שחיקה. (G) תמונה תלת-ממדית מורכבת שנוצרה על ידי שילוב טופוגרפיית AFM המתקבלת עם גשושית סיליקון קשיחה חדה ובעלת יחס גובה-רוחב גבוה יותר עם נתוני מודולוס (עור צבעוני שכבת-על) הנגזרים מהדמיית עקומת כוח מהירה של אותו אזור בדגימה עם גשושית קצה היהלום. התכונות המודגשות על ידי התיבות הכחולות והלבנות ב- A ו- B מסומנות גם ב- G. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 12: ננו-הזחה מבוססת Cantilever על תאים או גרעינים. (A) תא עם רדיוס R ₁ הממוקם על מצע שטוח וקשיח מוזח פנימה לעומק d על ידי אינדנטר כדורי עם רדיוס R₂. נתון זה שוחזר מ-Ding et ^al.48. (B) חלקות ערך אינדיבידואליות של מדידות מודולוס מייצגות שהתקבלו מניסויי ננו-הזחה מבוססי AFM על MSCs עכברים וגרעינים מבודדים שחולצו מ-MSC עכבר. בסך הכל נמדדו 10 תאים ו-10 גרעינים חמש פעמים כל אחד בעומק הזחה של 500-600 ננומטר (שנבחר כדי לאפשר שימוש במודל מכניקת המגע של הרץ). נתוני עקומת F-D גולמיים שהתקבלו עובדו באמצעות Atomic J²³ כדי לחשב את המודולים האלסטיים. בשל השונות המולדת הגדולה של התאים, משורטט^אחוזון 75 של הנתונים. תאים וגרעינים מבודדים לא הראו הבדל סטטיסטי במודולוס אלסטי, עם מודולי ממוצע שנמדד של 0.75 ± 0.22 kPa ו- 0.73 ± 0.22 kPa, בהתאמה. נתונים דומים נאספו ונותחו כדי לקבוע הבדלים בנוקשות גרעינית כתוצאה מגירוי מכני, נוקאאוטים של חלבונים וטיפולים כימיים. קיצורים: MSC = תא גזע מזנכימלי; AFM = מיקרוסקופ כוח אטומי; F-D = עקירה בכוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 13: מורפולוגיה ותכונות ננו-מכניות של דו-שכבות ליפידים . (A) תמונת טופוגרפיה של AFM המציגה את שינוי הגובה המינימלי של קרום שומנים נתמך שלם (SLM) המורכב מ- Chol/POPC ביחס ערבוב של 1 שנוצר על פני כל משטח הנציץ החשוף עם זמן דגירה ארוך (~ 25 דקות) וריכוז שומנים גבוה (0.3 מ"ג / מ"ל). פרופיל הגובה לאורך הקו הסגול באמצע התמונה מוצג מתחת לאיור, ומספק פרטים מבניים של פני הממברנה. כצפוי, SLM הוא חלק מאוד. (B) אוסף קטעי גישה של עקומות כוח שנלכדו ב-SLM המוצג ב-A. עקומות הכוח נאספו בנקודות שוות מרחק ≥100 ננומטר זו מזו, וכיסו כמעט את כל ה-SLM. עקומות הכוח מראות אירוע פריצת דרך ברור, כפי שמעידה אי הרציפות או הקפיצה הפתאומית בקטע הגישה של עקומות הכוח. כוח הפריצה הממוצע הוא 9.25 ±-0.27 ננו"ט. (C) ממברנות חלקיות או מדבקות קרום שנוצרו על ידי דגירה של ממברנות ביחס ערבוב Chol/POPC של 1 עם זמן דגירה קצר יותר (~5-6 דקות) וריכוז שומנים נמוך יותר (~15 מיקרוגרם/מ"ל) ביחס ל-A⁴⁹. פרופיל הגובה לאורך הקו האדום בטלאי מוצג מתחת לתמונה. הדו-שכבה החלקית מאפשרת מדידה של עובי ה-SLM, המוצג על ידי הקווים המקווקווים השחורים בפרופיל הגובה. שימו לב שהעובי הנמדד כולל גם שכבת מים של 1-2 ננומטר בין הממברנה לדיסק הנציץ⁵⁰. נתון זה נלקח מ Khadka et ^al.49 באישור Elsevier. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

הכנת דוגמאות
עבור ננו-הזחה באוויר, שיטות הכנה נפוצות כוללות הקפאה (למשל, דגימות רקמות), השחזה ו/או ליטוש ולאחריהן אולטרה-מיקרוטומינג (למשל, דגימות ביולוגיות משובצות שרף), כרסום יונים או הכנת קרן יונים ממוקדת (למשל, מוליכים למחצה, נקבוביים או דגימות קשיות מעורבות שאינן ניתנות לליטוש), ליטוש מכני או אלקטרוכימי (למשל, סגסוגות מתכת), או שקיעת סרט דק (למשל, שכבה אטומית או שקיעת אדים כימיים, אפיטקסי קרן מולקולרית). המטרה היא ליצור דגימה עם חספוס משטח מינימלי (רצוי בקנה מידה nm, ≤פי 0.1 מעומק הכניסה המיועד). ברבות מהשיטות הקודמות, ייתכן שיהיה צורך לשטוף את הדגימה לאחר מכן ו / או להסוניק אותה בממס מסונן ברמת טוהר גבוהה (למשל, בדרגת HPLC) ולייבש אותה בגז חנקן (N₂) בעל טוהר גבוה במיוחד (99.999%) כדי להסיר פסולת חלקיקים. לחלופין, פתיתים (למשל, חומרים דו-ממדיים) או חלקיקים (למשל, ננו-חלקיקים או מיקרו-כמוסות) יכולים להיות מצופים בספין או נשירה מתוך תמיסות שהוכנו באמצעות ממיסים מסוננים בעלי טוהר גבוה. במקרה זה, המטרה היא להשיג צפיפות פני שטח המניבה מספר פתיתים או חלקיקים שאינם חופפים בתוך שדה הראייה בכל אזור שנבחר באופן אקראי בדגימה. עבור ננו-הזחה בנוזל (המשמש לעתים קרובות עבור דגימות ביולוגיות הדורשות תמיסת חיץ כדי להישאר בת קיימא), יש צורך בשיקוע או הכנה של דגימות על מצע חלק (חספוס פני שטח בקנה מידה ננומטרי) (למשל, מגלשת מיקרוסקופ, צלחת פטרי או נציץ מוסקוביטי טרי שסע) ^46,47,49.

שיקולי בחירת בדיקה
הבחירה בגשושית מתאימה היא בעלת חשיבות עליונה לניתוח כמותי של עקומות F-D, שכן האינטראקציה חוד-דגימה היא התכונה הבסיסית הנמדדת בננו-הזחה מבוססת קנטילבר. השאלות הבאות הן בעלות חשיבות מיוחדת בעת בחירת גשושית לניסוי נתון. מהו חספוס פני השטח (או הנמדד) הצפוי (או הנמדד) של הדגימה וטווח המודולוס האלסטי? דגימות חספוס גבוה יכולות לגרום לשחיקה מואצת בהשוואה לדגימות חלקות יותר בשל הכוחות הרוחביים המוגברים הקיימים בקצה בעת מעקב אחר תכונות תלולות, כמו גם להגדיל את הסבירות לאירועי שבירת קצה⁵³. כמו כן, ככל שהדגימה קשה יותר, כך היא תלבש מהר יותר את קצה הבדיקה. בנוסף, כמה תמונות ו / או ננו-כניסות נחוצות? עם פחות הדמיה והזחה, ניתן לצפות לפחות שחיקת טיפים. כפי שמתואר בפירוט רב יותר להלן, ניתן להפחית את שחיקת החוד על ידי שימוש בציפויי פחמן דמויי יהלום (DLC) או לבטל כמעט לחלוטין על ידי שימוש בבדיקות קצה יהלום (כאשר עלות הרכישה הגבוהה מקוזזת לאורך זמן על ידי חיי הגשושית האינסופיים כמעט).

שיקול נוסף בבחירת בדיקה מתאימה הוא גודל התכונות המעניינות. עבור ננו-הזחה, לעתים קרובות עדיף להשתמש בגודל הקצה הגדול ביותר האפשרי תוך שמירה על הרזולוציה המרחבית הדרושה לדגימה (ים) המדוברת ותכולת המידע הרצויה, מכיוון שקצוות גדולים יותר נוטים פחות לחוות שינויים פתאומיים בגיאומטריית החוד עקב שבר וגם יציגו שיעורי שחיקה נמוכים יותר⁵⁴. חשוב גם לשקול אם קיימות שיטות AFM אחרות ללוקליזציה משותפת עם ננו-הזחה, כגון AFM⁵⁵ מוליך, מיקרוסקופ כוח בדיקה קלווין (KPFM)⁵⁶, או מיקרוסקופ כוח מגנטי (MFM)⁵⁷. אם רוצים להשתמש במטרולוגיה נוספת כגון אלה, ייתכן שקצה הגשושית יצטרך להיות מוליך חשמלית או מגנטי, מה שישפיע על הרכב החומר ומכאן על שורה של תכונות, כולל קשיות, עמידות בפני שחיקה ורדיוס חוד. כמו כן, אם ההזחה תבוצע בנוזל, הרכב הציפוי האחורי הרפלקטיבי של הגשושית (אם קיים) הוא שיקול חשוב נוסף, שכן הוא חייב להיות עמיד בפני קורוזיה (למשל, ציפוי אחורי Au נפוץ עבור בדיקות נוזל). לבסוף, ואולי החשוב מכל, יש להתאים את קבוע הקפיץ של הגשושית לטווח הצפוי של מודולי אלסטי שיש למדוד. אם קבוע הקפיץ אינו מתאים היטב למודולוס המדגם, עלול להתרחש אחד משני מקרים. אם הקנטיבר נוקשה מדי, תימדד סטייה מועטה, אם בכלל, והאפיון יהפוך לבלתי אפשרי; לעומת זאת, אם הקנטיל רך מדי, הוא לא יוכל לעוות את הדגימה מספיק כדי למדוד את תכונותיו המכניות.

ללבוש טיפ
ללבוש ניתן להגדיר בדרכים רבות; לצורך הדיון בשחיקת קצה הגשושית AFM כאן, היא תוגדר ככל שינוי בטופוגרפיה של פני השטח של קצה הגשושית עקב עיוות פלסטי ללא כל אובדן חומר, וכן כל הסרה של חומר מפני השטח עקב אינטראקציות פיזיות⁵⁸. במובן רחב יותר, שחיקה עשויה לכלול גם תגובות כימיות כגון חמצון והידרציה. ביישומי AFM רגילים, הרזולוציה המרחבית הצידית מוגבלת בדרך כלל על ידי רדיוס קצה⁵⁹, ואינטראקציית קצה הדגימה היא התכונה הנמדדת העיקרית. מכיוון שרדיוס החוד הוא פרמטר מפתח במידול מכניקת המגע של מערכת דגימת החוד ולאחר מכן בקביעת התכונות המכניות, שחיקת החוד מדאיגה במיוחד בעת ביצוע ניסויי ננו-הזחה והיא מגבלה מרכזית לפרשנות מדויקת של תוצאות ננו-הזחה⁵³. בשל האופי ההדרגתי בדרך כלל של שחיקת החוד (מלבד אירועי שבירת חוד), לא ניתן לכמת את שחיקת החוד עקב מחזור ננו-הזחה יחיד (כלומר, רמפה). בנוסף, התנועה הניצבת של קצה הגשושית ביחס לדגימה בננו-הזחה (בניכוי הדמיה מבוססת עקומת כוח מהירה) מאפשרת להפחית את קצב השחיקה, שכן המצב העיקרי של שחיקת החוד הוא בדרך כלל כוחות גזירה המתפתחים במהלך מצבי סריקה⁶⁰. ככזה, המקור העיקרי לשחיקת קצה בניסויי ננו-הזחה הוא כל הדמיה המבוצעת לאחר כיול הגשושית הראשונית (בפרט, רגישות סטייה ומדידות רדיוס קצה) אך לפני ננו-הזחה. לכן מומלץ שאם משתמשים בבדיקות סיליקון או סיליקון ניטריד, יש לבדוק את רדיוס החוד לפני ואחרי כל ניסוי כדי לנטר ולקחת בחשבון כל שחיקת קצה באמצעות אחת מהשיטות המתוארות לעיל (למשל, ניתוח SEM או BTR).

חומרי בדיקה
פחמן דמוי יהלום (DLC)
באמצעות שימוש בקצוות בדיקה מצופים DLC או בקצוות יהלום, ניתן להפחית או לשלול לחלוטין את שחיקת הטיפים⁵³ . עמידות השחיקה המשופרת של חומרי קצה חלופיים אלה מפתה מאוד למדידת תכונות מכניות, במיוחד של חומרים קשיחים מאוד. הוכח כי קצוות בדיקה DLC יכולים להראות עלייה של פי 1,600 בהתנגדות ללבוש בהשוואה לקצוות בדיקה רגילים של סיליקון⁵⁴. ניתן לייחס עלייה דרמטית זו בהתנגדות ללבוש למספר גורמים. ראשית, הקשרים הקיימים ב-DLC (C-C ו-C=C) והממשק שלו עם סיליקון (Si-O, Si-C) הם חלק מהקשרים החזקים ביותר מכל זוגות היסודות, וחזקים בהרבה מקשרי Si-Si הקיימים בקצות סיליקון. DLC יש גם את ההשפעה של הפחתת החיכוך, אשר בתורו מוריד את לחצי הגזירה בתוך הקצה, ובכך להפחית את השחיקה. בנוסף, הכימיה של משטח ה-DLC שונה מזו של קצה סיליקון, שכן קצוות סיליקון יכולים לחוות חריטה טריבוכימית בתנאי לחות הסביבה, בעוד שקצוות DLC אינם חווים (או לפחות לא באופן משמעותי בהשוואה למצב השחיקה הראשי)⁵⁴. החיסרון העיקרי של קצוות מצופים DLC (מעבר למחיר המוגבר ביחס לקצוות סיליקון סטנדרטיים לא מצופים) הוא רדיוס החוד המוגדל עקב הציפוי עצמו. רוב רדיוסי קצה הבדיקה של DLC הם ≥30 ננומטר, בעוד שקצוות שאינם מצופים DLC יכולים להגיע באופן אמין ל- 1-2 ננומטר ברדיוס⁶¹. עם זאת, רדיוס קצה גדול יותר יכול לעתים קרובות להיות רצוי עבור ניסויי ננו-הזחה כדי להפחית טעויות במדידות רכוש, שכן פערים ננומטריים בין פונקציית עומק השטח האידיאלי לבין פונקציית עומק השטח בפועל, עקב פגמים או aspers, ישפיעו באופן לא פרופורציונלי על מדידות שבוצעו עם בדיקות רדיוס קטן יותר עקב השגיאה היחסית הגדולה יותר. בנוסף, למרות עמידותו המעולה בפני שחיקה, ציפוי ה-DLC עשוי בסופו של דבר להישחק בכתמים, מה שמוביל לשחיקה דיפרנציאלית בין ליבת הסיליקון החשופה לבין ציפוי ה-DLC הנותר. למרבה הצער, עמידות השחיקה של ציפוי DLC עשויה להיות מוגבלת גם על ידי היצמדות הציפוי לקצה הסיליקון ולא על ידי הקשיות בפועל של הציפוי בלבד.

יהלום
יהלום ידוע כאחד החומרים הקשים והעמידים ביותר בפני שחיקה על פני כדור הארץ. עם זאת, הוכח כי עדיין יכולה להתרחש שחיקה משמעותית בקצות היהלומים בעת שימוש בכוחות גדולים (60 מיקרו-ניוטון) בניסיון מכוון לחקור את שחיקת החוד⁶². לעומת זאת, בתרחישי ננו-הזחה והדמיה רגילים שבהם הכוחות המופעלים על הקצה נמוכים בהרבה, לא נערכו מחקרים קפדניים על שחיקת קצה יהלום. עם זאת, כפי שניתן לראות באיור 8E,F, מידול BTR של אותו קצה בדיקה יהלום בתנאים זהים על אותה דגימת אפיון קצה בהפרש של 6 חודשים יצר מודלים כמעט בלתי ניתנים להבחנה בצורת קצה (כלומר, ללא עדות ניכרת לבלאי). בין תמונת ה-BTR הראשונה לשנייה, הגשושית שימשה לביצוע אלפי ננו-כניסות ועברה מאות מיליוני אינטראקציות של דגימת קצה תוך הדמיה של מגוון חומרים קשיחים (E > 15 GPa), כולל עץ (אורן לובולי), פצלים, גרפיט פירוליטי מסודר מאוד (HOPG) ושכבות דקות שונות של גרפן. באופן משמעותי, רדיוס הקצה המשוער השתנה ב~1 ננומטר בין שתי התמונות באיור 8E,F, וזה הרבה בתוך השגיאה⁶³ של שיטת BTR. אמנם לא מחקר מלא, אך השוואה זו מדגימה את העמידות המצוינת של גשושית יהלום בתנאי ננו-הזחה ניסיוניים רגילים (ואפילו הדמיה). החסרונות העיקריים הקשורים לשימוש בחוטי יהלום (מעבר לעלות מראש יקרה) הם רדיוס החוד המוגדל, ובמובנים מסוימים מדאיגים יותר, יחס הממדים הנמוך של גיאומטריית פינת הקובייה של רוב קצות היהלומים הזמינים מסחרית. איור 11A,B מציג זה לצד זה, תמונות AFM השוואתיות של אותו אזור של דגימת פצלי Bakken שנרכשו עם גשושית סיליקון חדה עם רדיוס קצה נומינלי של 8 ננומטר וחצי זווית ממוצעת של ~19° לעומת גשושית קצה יהלום עם רדיוס קצה נומינלי של 40 ננומטר וזווית צד ממוצעת של 47°. כאשר משווים את האזורים המוגדלים (איור 11C,D ואיור 11E,F), ברור בקלות שגשושית קצה היהלום אינה מסוגלת לפתור ולעקוב במדויק אחר התכונות התלולות יותר (יחס גובה-רוחב גבוה יותר) בתמונה. במקום זאת, כאשר קיימות תכונות תלולות, דופן הצד של הקצה יוצרת מגע עם הקצה העליון ומערכת AFM למעשה עוקבת אחר דופן הצד של הגשושית עד שקצה הקצה יוצר מגע עם המשטח שוב והמעקב הרגיל מתחדש.

התאמת קבוע קפיץ/מודולוס
כפי שהוזכר לעיל, יש להתאים את קבוע הקפיץ של הגשושית לטווח הצפוי של מודולי אלסטי שיש למדוד. כדי לסייע בבחירת בדיקה מתאימה, טבלה 3 מציגה קבועי קפיץ נומינליים משוערים המוצעים המתאימים לטווחים רחבים נבחרים של מודולי דגימה אלסטיים צפויים, החל מכמה MPa ועד 100 GPa במקרה של ~30-40 ננומטר רדיוס בדיקה טיפים המשמשים לעתים קרובות עבור ננו-הזחה⁵². בדיקות קבועות בקפיץ התחתון (k < 0.1 N/m) זמינות עבור חומרים רכים עוד יותר (טווח kPa) כגון תאים.

קבוע קפיץ (N/m)	טווח מודולוס מדגם צפוי
0.25	≤ 15 MPa
5	5 – 500 מגפ"ס
40	200 – 8,000 (0.2 – 8 GPa)
200	1,000 – 50,000 (1 – 50 GPa)
450	10,000 – 100,000 (10 – 100 GPa)

טבלה 3: קבועי קפיץ בדיקה אידיאליים למדידת טווחי מודולוס שונים. קבועי קפיץ בדיקה נומינליים משוערים למדידה אופטימלית של מודולים אלסטיים על פני טווחים משתנים מכמה MPa עד 100 GPa, בהנחה שרדיוס בדיקה טיפוסי של ~30-40 ננומטר⁵².

בנוסף לקבוע הקפיץ, במקרה המיוחד של חומרים ביולוגיים, רדיוס החוד והכוחות המופעלים במהלך הדמיה וננו-הזחה חייבים להישקל בזהירות כדי למנוע נזק. בדוגמה היישום של מדידת התכונות המכניות של דו-שכבות שומנים המכילות כולסטרול, המוצגת בסעיף התוצאות המייצגות, נעשה שימוש בקצה חד יחסית (10 ננומטר) במיוחד לניתוח כוח פריצת הדרך בשכבות ליפידים. לעומת זאת, אם החזר ההשקעה על החומר גדול מספיק (למשל, כמו במקרה של תאים וגרעיני תאים) ויש חשש לגבי פוטנציאל הניקוב, קצוות המיספריים גדולים יותר בקנה מידה מיקרוני, כמו אלה המשמשים במדידות הנוקשות על גרעיני MSC המתוארים באחת מדוגמאות היישום בסעיף התוצאות המייצגות הם אידיאליים ומספקים תוצאות מצוינות לרכות, דגימות שבריריות כגון תאים חיים וגרעינים מבודדים. קיין ועמיתיו מציגים דיון מעמיק כיצד לבחור את השילוב האופטימלי של רדיוס בדיקה וקבוע קפיץ כדי להשיג את רגישות המדידה הגבוהה ביותר האפשרית עבור דגימות כאלה⁶⁴.

כיול בדיקה
רגישות לסטייה
רגישות הסטייה מתייחסת לתנועה של Z-piezo (ולכן סטייה של הקנטיל בעת כניסה על מצע קשיח עד אינסוף, בהנחה של פעולה בגבול של סטיות קטנות) לשינוי מדוד במתח על PSD⁶⁵. רגישות הסטייה (המכונה לעתים גם רגישות המנוף האופטי ההופכי [InvOLS]) עשויה להיות מדווחת ב- nm/V או V/nm. סקירה כללית של שיטות כיול רגישות הסטייה הנפוצות ביותר מסופקת להלן.

מגע משטח קשה
השיטה הקלה והפופולרית ביותר לקביעת רגישות הסטייה של מערכת לייזר להקפצת קרן / בדיקת AFM / PSD היא שיטת "מגע משטח קשה"⁶⁵. הפשטות שלה, קלות השילוב שלה בזרימות עבודה של תוכנת בקרת AFM והטבע באתרו מוסיפים כולם לכוח המשיכה של שיטת מגע המשטח הקשיח ולשימוש הנרחב. כדי ליישם שיטה זו, קצה הגשושית AFM מוצמד לחומר קשיח בהרבה מהקנטיליבר. השיפוע של החלק במגע של עקומת תזוזת הכוח (מוצג כוולט של אות שגיאת סטייה אנכית על PSD כפונקציה של תנועת Z-piezo בננומטר או במתח מופעל) נותן את רגישות הסטייה (איור 3A). השימוש במצע קשיח מבטיח שכל הסטייה הנמדדת נובעת מכיפוף הקנטיל ולא מפיתול של עיוות הדגימה ותזוזת הקנטילבר. במקרה של מיכלים רכים (למשל, k < 10 N/m), סיליקון (E ≈ 170 GPa)²⁷ או נציץ¹⁷ הם חומרים נגישים וקלים לשימוש (או לחילופין זכוכית, E≈ 70 GPa, או פלסטיק קשיח מתאים במקרה של תאים משותקים על מגלשת מיקרוסקופ או צלחת פטרי), ואילו עבור מיכלים קשיחים יותר, כגון אלה המשמשים לניסויים מסוימים בננו-הזחה (למשל, k > 200 N/m; טבלה 3), ספיר (E≈ 345 GPa)^26,66 ייתכן שיהיה צורך להשתמש כדי להבטיח שלא יתרחש עיוות דגימה. מכיוון ששיטה זו תלויה במדידת תזוזת הכוח, Z-piezo של סורק AFM חייב להשתמש בחיישן גובה לולאה סגורה או להיות מכויל היטב (אם הוא פועל במצב לולאה פתוחה) תוך שימוש במגוון תקני גובה. התורם הגדול ביותר לטעות בשיטת המגע עם משטח קשה הוא תזוזה של נקודת הלייזר על הפתח עקב תנודות תרמיות. שינויים בטמפרטורה של המגן נגרמים לרוב על ידי לייזר הגילוי, אם כי חימום ג'אול באלקטרוניקה שמסביב עשוי גם הוא לתרום. דווח על הבדלי טמפרטורה כוללים של 6 מעלות צלזיוס בין האוויר הקדמי לאוויר הסביבה, מה שעלול להוביל לתזוזות נקודתיות לייזר של מספר מיקרון⁶⁷. כדי להתחשב בכל חימום, מומלץ להמתין ≥30 דקות לאחר היישור הראשוני של נקודת הלייזר כדי לאפשר למתקן להגיע לשיווי משקל תרמי עם סביבתו לקבלת התוצאות הטובות והמדויקות ביותר. ממוצע שיפועי הגישה ועקומות המשיכה עבור כל מדידת רגישות יתחשב בכל חיכוך קצה או אפקט הזזה ויש לחוקק אותו במידת האפשר⁶⁸. בנוסף, ממוצע על פני מדידות רגישות מרובות יעזור לאמוד את המהימנות ואת יכולת השחזור של המדידה. מדידות רגישות טובות אמורות לגרום לסטיות של ≤1% ולהתבצע בערך באותה סטייה כמו הננו-כניסות הניסיוניות הצפויות כדי למקסם את יעילות הכיול⁶⁹. החיסרון העיקרי של שיטת המגע עם משטח קשה הוא שהמגע הפיזי הדרוש לכיול עלול לגרום נזק לקצות סיליקון שבירים (למשל, קהות או יצירה של חפצי קצה כגון קצה כפול).

שיטת רעש תרמי
שיטת הרעש התרמי לקביעת רגישות הסטייה דורשת כיול מוקדם של קבוע קפיץ הקפיצים ויכולת למדוד את ספקטרום הרעש התרמי של הקנטיל⁶⁷. שיטת הרעש התרמי משולבת לעיתים קרובות בתוכנת בקרת AFM מודרנית וניתן להשתמש בה במקביל לשיטת Sader (ראה להלן) לניתוח וחישוב מהירים הן של קבוע הקפיץ והן של רגישות הסטיה. עם זאת, ייתכן שיהיה קשה או בלתי אפשרי להשתמש בשיטת הרעש התרמי על משרעת קשיחה יותר (k > 10 N/m) עקב ירידה באמפליטודת הרטט. בנוסף, אי הוודאות היחסית המדווחת של שיטת הרעש התרמי גדולה משמעותית, ~20% בהשוואה לשיטת מגע המשטח הקשה שתוארה לעיל⁷⁰. לא ניתן להשתמש בטכניקה זו אם משתמשים בשיטת הכוונון התרמי לקביעת קבוע הקפיץ המתואר להלן⁶⁷.

קבוע האביב
תקן הזהב למדידת קבועי קפיץ הוא ויברומטריית דופלר לייזר (LDV), וכיום ישנן גשושיות רבות הזמינות מסחרית המגיעות עם מידע כיול קבוע קפיץ הנגזר מ- LDV המסופק על ידי היצרן עבור כל בדיקה בנפרד (ראה טבלת חומרים). עם זאת, בעוד שמדידה מדויקת של קבוע קפיץ הקפיצים היא הכרח מוחלט למדידות ננו-מכניות כמותיות, השיטות המעשיות לעשות זאת במעבדה טיפוסית לגשושיות לא מכוילות הן מגוונות מאוד ויכולות להיות מורכבות במידת מה. לפיכך, רק סקירה קצרה של שתי שיטות הכיול הקבוע הנפוצות ביותר באתר מסופקת כאן, עם רשימה של שיטות נוספות וציטוטים מתאימים בספרות שיש להתייעץ בהם לקבלת מידע נוסף.

שיטת כוונון תרמי
ככל הנראה השיטה הנפוצה ביותר הקיימת ב- AFM המסחרי של ימינו, שיטת הכוונון התרמי לקביעת קבועי קפיץ קפיצים מובנית בתוכנת הבקרה עבור מערכות רבות. למרות ששיטת הכוונון התרמי אינה אידיאלית עבור קנטילברים קשיחים יותר (k > 10 N/m) בשל זיהוי סטיית קנטיליבר מופחת ורוחב פס מוגבל של אלקטרוניקה, שיטת הכוונון התרמי קלה יחסית ליישום ותקפה למגוון רחב של גאומטריות קצה⁷¹. שיטת הכוונון התרמי משתמשת במדידה והתאמה של ספקטרום הרעש התרמי של הקנטילבר, ולאחר מכן יישום של משפט החלוקה השווה כדי לחשב את האנרגיה הפוטנציאלית של הקנטילבר, כאשר הקנטיליבר מעוצב בדרך כלל כמתנד הרמוני פשוט⁷². לשיטת הכוונון התרמי יש שגיאה של ~5%-10% עבור בדיקות רכות והיא ישימה לכל צורת מגן^73,74. לקבלת מידע מפורט יותר, עיין בהפניות המצוטטות בסעיף זה.

שיטת סאדר
שיטת סאדר היא שיטה נוספת המשולבת לעתים קרובות בתוכנת הבקרה של AFMs מודרניים רבים^75,76,77. שיטת סאדר משתמשת בעומס ההידרודינמי שחווה הקנטיליבר כאשר הוא רוטט בתווך נוזלי (בדרך כלל אוויר או מים) יחד עם תוכנית הקנטילבר, מידות התצוגה וגורם האיכות כדי לחשב את קבוע הקפיץ. שיטת סאדר מובילה לשגיאה של ~10%-15% עבור קבוע הקפיץ⁷⁴. מאמרים מקבילים על "השיטה המקורית"^76,78, "השיטה הכללית"⁷⁹, הרחבה של השיטה הכללית^77, ותיעוד ספציפי למכשיר יכולים לספק פרטים נוספים.

שיטות אחרות
ישנן מספר שיטות אחרות שפותחו ויושמו כדי לקבוע את קבוע הקפיץ של מכלי AFM שהם מעבר להיקף של מאמר זה. אף על פי שאף אחת מהשיטות הללו אינה קלה ליישום או נפוצה כמו שיטות כיול Sader או כוונון תרמי, לכל אחת מהן יתרונות וחסרונות ייחודיים; הספרות המצוטטת מספקת פרטים לגבי יישומם ויישומם. בפרט, סיקורה מספק סקירה מצוינת של שיטות כיול קבוע קפיץ רבות והוא משאב מצוין בנושא⁷². רשימה לא ממצה של שיטות אחרות לקביעת קבועי קפיץ כוללת לייזר דופלר ויברומטריה (LDV) 73,74,80, התקנים מבוססי מערכות מיקרו-חשמליות-מכניות (MEMS)⁸¹, כבל ייחוס 82,83, מסה נוספת (הן דינמית ⁷⁵ והן סטטית ⁸⁴), איזון דיוק^85,86, הפעלה אלקטרומגנטית ⁸⁷ וניתוח אלמנטים סופיים (FEA) ^88,89.

רדיוס קצה
שיטות נפוצות לקביעת רדיוס החוד כוללות הן דימות אלקטרונים SEM משני והן שיטת שחזור קצה עיוור (BTR).

ניתוח SEM
דימות אלקטרונים SEM משני יכול לספק רזולוציה של עד 1 ננומטר, ומאפשר השוואה ישירה וקלה בין תמונות מתקדמות של בלאי. החיסרון של הדמיית SEM הוא שמכיוון שרק כלי AFM-SEM משולבים ניסיוניים ביותר קיימים⁹⁰, גשושית AFM חייבת בדרך כלל להיות משוחררת ומועברת ל- SEM לניתוח, מה שיכול לגזול זמן רב ועלול לחשוף את הגשושית לזיהום. חיסרון נוסף של SEM הוא שהתמונה המתקבלת היא מטבעה הקרנה דו-ממדית של הקצה, ללא מידע כמותי תלת-ממדי זמין. יש להקפיד ליישר את הגשושית באותו כיוון בדיוק בכל פעם כדי שתוצאות השוואתיות יהיו משמעותיות, שכן אפילו שינויים קטנים בזווית האירוע של קרן האלקטרונים יכולים לשנות את הגודל והצורה הנראים לעין של קצה הבדיקה. לבסוף, הדמיית SEM יכולה להיות נגועה על ידי השפעות טעינה וזיהום פחמן, אשר עלול לטשטש את התמונה או לגרום לשינויים פיזיים בקצה הבדיקה, בהתאמה.

שחזור קצה עיוור
בניגוד ל- SEM, שיטת BTR היא טכניקה באתרה שבה גיאומטריית קצה תלת ממדית מעוצבת על בסיס הדמיה של דגימה עם תכונות חדות רבות (יחס גובה-רוחב גבוה) קטנות בהרבה מרדיוס הגשושית. שיטה זו פועלת מכיוון שב- AFM, התמונה הנצפית היא תמיד פיתול של צורת קצה הגשושית וצורת תכונת הדגימה, כך שעל ידי מידול תכונות חדות במיוחד כחדות עד אינסוף, ניתן להעריך את צורת החוד. למרבה הצער, בנוסף להנחה של קוצים חדים עד אינסוף (כלומר, תכונות פני השטח קטנות בהרבה מרדיוס הקצה), טכניקת BTR יכולה להיות מושפעת מרעשי הדמיה ופרמטרי סריקה, ולכן יש לקבל תמונות השוואתיות באמצעות פרמטרי הדמיה דומים מאוד. בנוסף, מכיוון ש"תמונות" מרובות של הקצה משמשות לשחזור הגיאומטריה שלו, חישוב הפוך ישיר של אחד לאחד של צורת הקצה אינו אפשרי. בגלל טבעה, שיטת BTR מסוגלת רק באופן מעשי ליידע את המשתמש על הגבול העליון של צורת החוד⁶³, ופעולת ההדמיה של הגשושית ליישום שיטת BTR עלולה להוביל לשחיקת קצה (למשל, קהות או סדיקה של קצה הבדיקה).

כיול יחסי
לעיתים, נכס בדיקה מסוים אינו ניתן למדידה קלה ומדויקת. לדוגמה, קבוע הקפיץ של קפיצים קשיחים יותר קשה או בלתי אפשרי למדידה בשיטת הכוונון התרמי בגלל מגבלות רוחב פס וסטייה⁹¹. כפי שפורט לעיל, קיימות שיטות אחרות לקביעת קבוע הקפיץ, אך מכיוון ששיטת הכוונון התרמי משולבת ב- AFM מודרניים רבים, היא מיושמת לעתים קרובות לשימוש יומיומי פשוט. כמו כן, רגישות הסטייה חייבת תמיד להיות מכויילת לפני ניסויים להמרת תנועת לייזר על PSD לסטייה פיזית של הגשושית. עם זאת, מבחינה מעשית, מדידת רדיוס החוד היא שלב הכיול הגוזל זמן רב ביותר, וזה שסביר ביותר שיפגע בקצה הבדיקה. אם לא ניתן למדוד ישירות את רדיוס החוד באמצעות SEM או BTR, ניתן להשתמש בהליך כיול יחסי כחלופה לקביעת רדיוס החוד האפקטיבי, בתנאי שדגימת ייחוס סטנדרטית עם חספוס משטח מינימלי (שטוח אטומית אידיאלית) ומודולוס ידוע קרוב למודולוס הניסויי הצפוי. דוגמאות לתקני ייחוס אידיאליים כאלה לכיול יחסי כוללות נציץ מוסקוביטי 17,92,93,94,95 ו- HOPG ^96, אך משמשות גם כדי להדגיש את הקושי בזיהוי תקני ייחוס מתאימים לדגימות רכות יותר עם מודולי בטווח kPa ל- MPa. כדי לבצע כיול יחסי, ראשית יש לכייל את רגישות הסטייה כמתואר בפרוטוקול הראשי. שנית, יש להזין את קבוע הקפיץ הנומינלי של הגשושית (בדרך כלל מסופק עם הגשוש) או למדוד באמצעות אחת השיטות שתוארו לעיל. השלב השלישי הוא הזחה על משטח הדגימה הסטנדרטי של הייחוס המודולוס באמצעות פרמטרים מתאימים. לבסוף, יש לנתח את נתוני עקומת ה-F-D שנאספו ולהתאים את פרמטר רדיוס הקצה עד שהמודולוס המופחת שנמדד בניסוי יתאים למודולוס המופחת הצפוי. יש לשים לב לעומק העיוות הממוצע שהושג במדגם הייחוס, שכן עומק זה חייב להישמר בעת הזחה על מדגם הניסוי המעניין כדי שהכיול יהיה רלוונטי. כעת, הזחה על מדגם העניין יכולה להתרחש, התאמת פרמטרי הרמפה כך שיתאימו לעומק העיוות שהושג בחומר הייחוס הסטנדרטי של מודולוס.

אחד היתרונות של שיטת הכיול היחסי הוא שהיא מונעת טעויות מצטברות פוטנציאליות הנגרמות כתוצאה מכיול לא מדויק של רגישות הסטיה, קבוע הקפיץ ורדיוס החוד⁵². בנוסף, זה אולי קצת יותר מהיר ופחות סביר לפגוע בבדיקה מאשר שיטת BTR. החסרונות הגדולים ביותר של שיטת הכיול היחסי הם: 1) הצורך בדגימת ייחוס איכותית עם חספוס פני שטח בקנה מידה nm עד אנגסטרום ותכונות מכניות ידועות הדומות לאלה של המדגם המעניין שניתן לנתח באותה בדיקה כמו מדגם הניסוי, 2) הדרישה להשיג עומק עיוות זהה או דומה מאוד הן בדגימות הייחוס והן בדגימות הניסוי כדי שהכיול יהיה תקף. לפיכך, עדיף למדוד ישירות את רדיוס החוד אם בכלל ניתן.

ניתוח נתונים
שיטת הניתוח המשמשת לקביעת התכונות המכניות של הדגימה מעקומות ה-F-D הנמדדות חשובה לא פחות מאיכות נתוני הננו-הזחה עצמה. ישנן מספר תיאוריות מכניות מגע נפוצות המדגימות יחסי כוח-עקירה בהתבסס על הנחות יסוד שונות (ולכן ישימות בתרחישים שונים). מודלים אלה של מכניקת מגע כוללים את הרץ⁹⁷, סנדון 28, JKR (ג'ונסון, קנדל ורוברטס)⁹⁸, DMT (Derjaguin, מולר וטופורוב)^35,99, MD (Maugis-Dugdale)100, ו-MYD (מולר, יושצ'נקו ודריאגווין)^101,102. ניתוח מעמיק והשוואה של מודלים שונים של מכניקת מגע ויישומם לניתוח הוצג במקום אחר 29,30,103,104. למרות שזה מעבר לטווח של מאמר זה, טבלה 4 מספקת סקירה קצרה של כמה מהמודלים הנפוצים ביותר של מכניקת מגע. יש לציין במיוחד כי מודלים מורכבים יותר כגון JKR, DMT ואחרים משלבים את ההשפעות של הידבקות דגימת קצה 30,35,98,99,100,101,102,103,104^, אשר יכולה להיות משמעותית ולעתים קרובות ניתנת לזיהוי בקלות על ידי הופעת סטייה שלילית בעקומת הכוח (ראה איור 3). בפועל, מודל הניתוח שנבחר משמש כדי להתאים את נתוני F-D שנאספו ולקבוע את התכונות המכניות, כגון מודולוס אלסטי. כדי להתאים כראוי את הנתונים, יש צורך בקו בסיס שטוח כדי לקבוע את נקודת המגע הראשונית או נקודת מגע יעילה המתאימה לחלק של נתוני הניסוי עם המתאם הגדול ביותר למודל.

תיאוריה	הישימות	הנחות	מגבלות
הרץ	פשוט; משמש לעתים קרובות עבור דגימות בנוזל.	אין הדבקה.	לא תקף עבור מערכות שיש להן כוחות דבק.
Derjaguin-Muller-Toporov (DMT)	נוקשה עם עיוותים קטנים.	היצמדות לטווח קצר באזור המגע בתוספת היצמדות לטווח ארוך מחוץ לאזור המגע.	גיאומטריה מוגבלת עלולה לגרום להערכת חסר של אזור המגע.
ג'ונסון-קנדל-רוברטס (JKR)	רך עם עיוותים גדולים.	כוחות הדבקה לטווח קצר באזור המגע בלבד.	יכול לזלזל בעומס עקב הידבקות.
מוגיס – דוגדייל (MD)	פתרון כללי זה מכסה את דגמי הדבק האחרים.	ממשק טיפ-דוגמה מעוצב כסדק.	פתרון אנליטי הכולל משוואות פרמטריות.

טבלה 4: מודלים נפוצים של מכניקת מגע. מודלים נבחרים של מכניקת מגע משותפת עם ישימות, הנחות ומגבלות שצוינו.

היישום המעשי של המודלים שהוזכרו לעיל לניתוח עקומות F-D מחייב שימוש בתוכנת מחשב כדי לאפשר עיבוד אצווה בקנה מידה גדול של אלפי או מיליוני עקומות בזמן קצר ולבצע ניתוח סטטיסטי של התוצאות. קוד כתוב פנימי משמש לעתים קרובות לניתוח נתוני F-D, ויצרני AFM שונים מספקים גם חבילות תוכנה. עם זאת, בשל אופיו בקוד פתוח, קלות השימוש ומידע משלים מפורט, המחברים ממליצים על השימוש ב- AtomicJ²³. התוכנית מאפשרת ניתוח פשוט ומדויק של נתוני F-D באמצעות כל אחת מהתיאוריות שתוארו לעיל, כמו גם כמה אחרים. מכיוון שהקוד הוא קוד פתוח, קל לתפעל ולהתאים אישית עבור מקרי שימוש ספציפיים ללא צורך לבנות קוד מורכב מאפס. עיין ב- Hermanowicz et ^al.23 לקבלת מידע מעמיק על חבילת התוכנה AtomicJ.

לסיכום, באמצעות כיול זהיר של הגשושית, ניתן לכמת את שטח המגע והכוח המופעלים על ידי קצה גשושית AFM על משטח הדגימה כדי לאפשר קביעת תכונות מכניות ננומטריות, במיוחד המודולוס האלסטי. פרוטוקול כללי המדגיש שיטות עבודה מומלצות ליישום מוצלח של ננו-הזחה מבוססת AFM באוויר או בנוזל על דגימות רכות וקשות כאחד, עם מודולי אלסטי החל מ-kPa ועד GPa, הוצג עם דוגמאות מייצגות. נדונו שיקולים חשובים כגון בחירת הגשושית (כולל חספוס משטח הדגימה, גדלי תכונות, יחס גובה-רוחב של הגשושית ושחיקת החוד), כיול הגשושית וניתוח נתונים (כולל מודלים של מכניקת מגע וסטטיסטיקות מדידה). לבסוף, הודגמה לוקליזציה משותפת של מפות ננומכניות שמקורן ב-AFM עם טכניקות אפיון אחרות המספקות מידע קומפוזיציוני כגון SEM/EDS, כמו גם דוגמה למדידה של תכונה ננו-מכנית שאינה מודולוס אלסטי (כלומר, כוח קרע דו-שכבתי שומנים) באמצעות ננו-הזחה מבוססת AFM כדי לספק דוגמאות ליישומים סינרגטיים נוספים של הטכניקה. יחד, הדוגמאות והדיון המובאים כאן צריכים לספק נקודת כניסה לחוקרים המבקשים להשתמש בננו-הזחה מבוססת AFM כדי למדוד את התכונות המכניות של כמעט כל סוג דגימה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Atomic force microscope	Bruker	Dimension Icon	Uses Nanoscope control software, including PeakForce Quantitative Nanomechanical Mapping (PF-QNM), FastForce Volume (FFV), and Point-and-Shoot Ramping experimental workspaces
AtomicJ	American Institute of Physics	https://doi.org/10.1063/1.4881683	Flexible, powerful, free open source Java-based force curve analysis software package. Supports numerous contact mechanic models, such as Hertz, Sneddon DMT, JKR, Maugis, and cone or pyramid (including blunt and truncated). Also includes a variety of initial contact point estimation methods to choose from. Supports batch processing of data and subsequent statistical analysis (e.g., averages, standard deviations, histograms, goodness of fit, etc.). Literature citation is: P. Hermanowicz, M. Sarna, K. Burda, and H. Gabry, “AtomicJ: An open source software for analysis of force curves” Rev. Sci. Instrum. 85: 063703 (2014), https://doi.org/10.1063/1.4881683
Buffer solution (PBS)	Fisher Chemical (NaCl), Sigma Aldrich (KCl), Fisher BioReagents (Na2HPO4 and KH2PO4)	S271 (>99% purity NaCl), P9541 (>99% purity KCl), BP332(>99% purity Na2HPO4), BP362 (>99% purity KH2PO4)	Phosphate buffered saline (PBS) was prepared in the laboratory as an aqueous solution consisting of 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, and 1.8 mM KH2PO4 dissolved in ultrapure water. Reagents were measured out using an analytical balance, and glassware was cleaned with soap and water followed by autoclaving immediately prior to use.
Chloroform
Diamond tip AFM probe	Bruker	PDNISP	Pre-mounted factory-calibrated cube corner diamond (E = 1140 GPa) tip AFM probe (nominal R = 40 nm) with a stainless steel cantilever (nominal k = 225 N/m, f0 = 50 kHz). Spring constant is measured at the factory (k = 256 N/m for the probe, Serial #13435414, used here) and calibration data (including AFM images of indents showing probe geometry) is provided with the probe.
Diamond ultramicrotome blade	Diatome	Ultra 35°	2.1 mm width. Also used a standard glass blade for intial rough cut of sample surface before transitioning to diamond blade for final surface preparation
Epoxy	Gorilla Glue	26853-31-6	Epoxy resin and hardner were mixed in a 1:1 ratio, a small drop was placed on a stainless steel sample puck (Ted Pella), and V1 grade muscovite mica (Ted Pella) was attached to create an atomically flat surface for preparation of phospholipid membranes.
Ethanol
LR white resin, medium grade (catalyzed)	Electron Microscopy Sciences	14381	500 mL bottle, Lot #150629
Mesenchymal stem cells (MSCs)	N/A	N/A	MSCs for nanomechanical studies were primary cells harvested from 8-10 week old male C57BL/6 mice as described in Goelzer, M. et al. "Lamin A/C Is Dispensable to Mechanical Repression of Adipogenesis" Int J Mol Sci 22: 6580 (2021) doi:10.3390/ijms22126580 and Peister, A. et al. "Adult stem cells from bone marrow (MSCs) isolated from different strains of inbred mice vary in surface epitopes, rates of proliferation, and differentiation potential" Blood 103: 1662-1668 (2004), doi:10.1182/blood-2003-09-3070.
Modulus standards	Bruker	PFQNM-SMPKIT-12M	Used HOPG (E = 18 GPa) and PS (E = 2.7 GPa). Also contains 2x PDMS (Tack 0, E = 2.5 MPa; Tack 4, E = 3.5 MPa), PS-LDPE (E = 2.0/0.2 GPa), fused silica (E = 72.9 GPa), sapphire (E - 345 GPa), and tip characterization (titanium roughness) sample. All samples come pre-mounted on a 12 mm diameter steel disc (sample puck).
Muscovite mica	Ted Pella	50-12	12 mm diameter, V1 grade muscovite mica
Nanscope Analysis	Bruker	Version 2.0	Free AFM image processing and analysis software package, but designed for, and proprietary/limited to Bruker AFMs; similar functionality is available from free, platform-independent AFM image processing and analysis software packages such as Gwyddion, WSxM, and others. Has built-in capabilities for force curve analysis, but AtomicJ is more flexible/full featured (e.g., more built-in contact mechanics models to choose from, statistical analysis of force curve fitting results, etc.) for force curve analysis and handles batch processing of force curves.
Phospholipids: POPC, Cholesterol (ovine)	Avanti Polar Lipids	POPC: CAS # 26853-31-6, Cholesterol: CAS # 57-88-5	POPC lipid dissolved in chloroform (25 mg/mL) was obtained from vendor and used without further purification. Cholesterol powder from the same vendor was dissolved in chloroform (20 mg/mL).
Probe holder (fluid, lipid bilayers)	Bruker	MTFML-V2	Specific to the particular AFM used; MTFML-V2 is a glass probe holder for scanning in fluid on a MultiMode AFM.
Probe holder (fluid, MSCs)	Bruker	FastScan Bio Z-scanner	Used with Dimension FastScan head (XY flexure scanners). Serial number MXYPOM5-1B154.
Probe holder (standard, ambient)	Bruker	DAFMCH	Specific to the particular AFM used; DAFMCH is the standard contact and tapping mode probe holder for the Dimension Icon AFM, suitable for nanoindentation (PF-QNM, FFV, and point-and-shoot ramping)
Sample Puck	Ted Pella	16218	Product number is for 15 mm diameter stainless steel sample puck. Also available in 6 mm, 10 mm, 12 mm, and 20 mm diameters at https://www.tedpella.com/AFM_html/AFM.aspx#anchor842459
Sapphire substrate	Bruker	PFQNM-SMPKIT-12M	Extremely hard surface (E = 345 GPa) for measuring deflection sensitivity of probes (want all of the deflection to come from the probe, not the substrate). Part of the PF-QNM/modulus standards kit.
Scanning electron microscope	Hitachi	S-3400N-II	Located at Boise State. Used to perform co-localized SEM/EDS on all samples except additively manufactured (AM) Ti-6Al-4V.
Silicon AFM probes (standard)	NuNano	Scout 350	Standard tapping mode silicon probe with reflective aluminum backside coating; k = 42 N/m (nominal), f0 = 350 kHz. Nominal R = 5 nm. Also available uncoated or with reflective gold backside coating. Probes with similar specifications are available from other manufacturers (e.g., Bruker TESPA-V2).
Silicon AFM probes (stiff)	Bruker	RTESPA-525, RTESPA-525-30	Rotated tip etched silicon probes with reflective aluminum backside coating; k = 200 N/m (nominal), f0 = 525 kHz. Nominal R = 8 nm for RTESPA-525, R = 30 nm for RTESPA-525-30. Spring constant of each RTESPA-525-30 is measured individually at the factory via laser Doppler vibrometry and supplied with the probe.
Silicon carbide grit paper (abrasive discs)	Allied	50-10005	120 grit
Silicon nitride AFM probes (soft, large radius hemispherical tip)	Bruker	MLCT-SPH-5UM, MLCT-SPH-5UM-DC	Also MLCT-SPH-1UM-DC. New product line of factory-calibrated (probe radius and spring constants of all cantilevers) large radius (R = 1 or 5 mm) hemispherical tip (at the end of a 23 mm long cylindrical shaft) probes. DC = drift compensation coating. 6 cantilevers/probe (A-F). Nominal spring constants: A, k = 0.07 N/m; B, k = 0.02 N/m; C, k = 0.01 N/m; D, k = 0.03 N/m; E, k = 0.1 N/m; F, k = 0.6 N/m.
Silicon nitride AFM probes (soft, medium sharp tip)	Bruker	DNP	4 cantilevers/probe (A-d). Nominal spring constants: A, k = 0.35 N/m; B, k = 0.12 N/m; C, k = 0.24 N/m; D, k = 0.06 N/m. Nominal radii of curvature, R = 10 nm.
Silicon nitride AFM probes (soft, sharp tip)	Bruker	ScanAsyst-Air	Nominal values: resonance frequency, f0 = 70 kHz; spring constant, k = 0.4 N/m; radius of curvature, R = 2 nm. Designed for force curve based AFM imaging.
Superglue	Henkel	Loctite 495	Cyanoacrylate based instant adhesive. Lots of roughly equivalent products are readily available.
Syringe pump	New Era Pump Systems	NE1000US	One channel syringe pump system with infusion and withdrawal capacity
Tip characterization standard	Bruker	PFQNM-SMPKIT-12M	Titanium (Ti) roughness standard. Part of the PF-QNM/modulus standards kit.
Ultrahigh purity nitrogen (UHP N2), 99.999%	Norco	SPG TUHPNI - T	T size compressed gas cylinder of ultrahigh purity (99.999%) nitrogen for drying samples
Ultramicrotome	Leica	EM UC6	Equipped with a glass blade (standard, for intial sample preparation) and a diamond blade (for final preparation)
Ultrapure water	Thermo Fisher	Barnstead Nanopure Model 7146	Model has been discontinued, but equivalent products are available. Produces ≥18.2 MΩ*cm ultrapure water with 1-5 ppb TOC (total organic content), per inline UV monitoring. Includes 0.2 µm particulate filter, ion exchange columns, and UV oxidation chamber.
Variable Speed Grinder	Buehler	EcoMet 3000	Used with silicon carbide grit papers during hand polishing.
Vibration isolation table (active)	Herzan	TS-140	Used with Bruker MultiMode AFM. Sits on a TMC 65-531 vibration isolation table. Bruker Dimension Icon AFM utilizes strictly passive vibration isolation (comes from manufacturer with custom acoustic hood, air table, and granite slab).
Vibration isolation table (passive)	TMC	65-531	35" x 30" vibration isolation table with optional air damping (disabled). Used with Bruker MultiMode AFM. Herzan TS-140 "Table Stable" active vibration control table is located on top.