Atomik Kuvvet Mikroskobu Konsol Tabanlı Nanogirinti: Hava ve Sıvıda Nanoölçekte Mekanik Özellik Ölçümleri

Summary

Bir atomik kuvvet mikroskobu (AFM) prob ucu tarafından bir numune yüzeyine uygulanan temas alanının ve kuvvetin ölçülmesi, nano ölçekli mekanik özellik belirlemeyi mümkün kılar. Elastik modülü veya diğer nanomekanik özellikleri ölçmek için yumuşak ve sert numunelerde havada veya sıvıda AFM konsol bazlı nanogirinti uygulamak için en iyi uygulamalar tartışılmaktadır.

Abstract

Bir atomik kuvvet mikroskobu (AFM), nano ölçekli bir AFM prob ucu ile numune yüzeyi arasındaki etkileşimi temel olarak ölçer. Prob ucu ve numune ile temas alanı tarafından uygulanan kuvvet ölçülebilirse, incelenen yüzeyin nano ölçekli mekanik özelliklerini (örneğin, elastik veya Young modülü) belirlemek mümkündür. Kantitatif AFM konsol tabanlı nanogirinti deneylerinin gerçekleştirilmesi için ayrıntılı bir prosedür, kPa'dan GPa'ya kadar çok çeşitli numune tiplerinin elastik modüllerini belirlemek için tekniğin nasıl uygulanabileceğine dair temsili örneklerle birlikte burada verilmiştir. Bunlar arasında canlı mezenkimal kök hücreler (MSC'ler) ve fizyolojik tampondaki çekirdekler, reçineye gömülü kurutulmuş loblolly çam kesitleri ve çeşitli bileşimlerde Bakken şeylleri bulunur.

Ek olarak, AFM konsol bazlı nanogirinti, fosfolipid çift katmanlarının kopma mukavemetini (yani atılım kuvvetini) araştırmak için kullanılır. Tekniğin doğru uygulanmasına yardımcı olmak için metot seçimi ve geliştirme, prob seçimi ve kalibrasyonu, ilgilenilen bölgenin tanımlanması, numune heterojenliği, özellik boyutu ve en boy oranı, uç aşınması, yüzey pürüzlülüğü ve veri analizi ve ölçüm istatistikleri gibi önemli pratik hususlar tartışılmaktadır. Son olarak, AFM türevli nanomekanik haritaların element bileşimi hakkında ek bilgi sağlayan elektron mikroskobu teknikleri ile birlikte lokalizasyonu gösterilmiştir.

Introduction

Malzemelerin mekanik özelliklerini anlamak, mühendislikteki en temel ve temel görevlerden biridir. Dökme malzeme özelliklerinin analizi için, malzeme sistemlerinin mekanik özelliklerini karakterize etmek için çekme testleri¹, sıkıştırma testleri² ve üç veya dört noktalı eğilme (eğilme) testleri³ dahil olmak üzere çok sayıda yöntem mevcuttur. Bu mikro ölçekli testler, dökme malzeme özellikleri hakkında paha biçilmez bilgiler sağlayabilirken, genellikle başarısızlığa uğrar ve bu nedenle yıkıcıdır. Ek olarak, ince filmler, biyolojik malzemeler ve nanokompozitler gibi günümüzde ilgi çekici olan birçok malzeme sisteminin mikro ve nano ölçekli özelliklerini doğru bir şekilde araştırmak için gerekli mekansal çözünürlükten yoksundurlar. Büyük ölçekli mekanik testlerle ilgili bazı problemleri, özellikle de yıkıcı doğasını ele almaya başlamak için, mikrosertlik testleri mineralojiden benimsenmiştir. Sertlik, bir malzemenin belirli koşullar altında plastik deformasyona karşı direncinin bir ölçüsüdür. Genel olarak, mikrosertlik testleri, bir malzemeye girinti yapmak için genellikle sertleştirilmiş çelik veya elmastan yapılmış sert bir prob kullanır. Elde edilen girinti derinliği ve / veya alanı daha sonra sertliği belirlemek için kullanılabilir. Vickers⁴, Knoop⁵ ve Brinell⁶ sertliği dahil olmak üzere çeşitli yöntemler geliştirilmiştir; Her biri mikro ölçekli malzeme sertliğinin bir ölçüsünü sağlar, ancak farklı koşullar ve tanımlar altında ve bu nedenle yalnızca aynı koşullar altında gerçekleştirilen testlerle karşılaştırılabilecek veriler üretir.

Aletli nanogirinti, çeşitli mikrosertlik test yöntemleri ile elde edilen nispi değerleri iyileştirmek, mekanik özelliklerin analizi için mümkün olan uzamsal çözünürlüğü geliştirmek ve ince filmlerin analizini sağlamak için geliştirilmiştir. Önemli olarak, ilk olarak Oliver ve Pharr⁷ tarafından geliştirilen yöntem kullanılarak, bir numune malzemesinin elastik veya Young modülü E, aletli nanogirinti yoluyla belirlenebilir. Ayrıca, bir Berkovich üç taraflı piramidal nanoindenter probu (ideal uç alanı fonksiyonu Vickers dört taraflı piramidal probunkiyle eşleşir)⁸ kullanılarak, nano ölçekli ve daha geleneksel mikro ölçekli sertlik ölçümleri arasında doğrudan karşılaştırma yapılabilir. AFM'nin popülaritesinin artmasıyla birlikte, AFM konsol bazlı nanogirinti, özellikle daha yumuşak malzemelerin mekanik özelliklerini ölçmek için de dikkat çekmeye başladı. Sonuç olarak, Şekil 1'de şematik olarak gösterildiği gibi, nano ölçekli mekanik özellikleri sorgulamak ve ölçmek için günümüzde en yaygın olarak kullanılan iki teknik, bu çalışmanın odak noktası olan aletli nanogirinti (Şekil 1A) ve AFM konsol tabanlı nanogirinti (Şekil 1B)^9'dur.

Şekil 1: Aletli ve AFM konsol bazlı nanogirinti sistemlerinin karşılaştırılması. (A) aletli nanogirinti ve (B) AFM konsol tabanlı nanogirinti iletmek için tipik sistemleri gösteren şematik diyagramlar. Bu rakam Qian ve ^ark.51'den değiştirilmiştir. Kısaltma: AFM = atomik kuvvet mikroskobu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Hem aletli hem de AFM konsol bazlı nanogirinti, ilgilenilen bir numune yüzeyini deforme etmek ve ortaya çıkan kuvveti ve yer değiştirmeyi zamanın bir fonksiyonu olarak izlemek için sert bir prob kullanır. Tipik olarak, istenen yük (yani kuvvet) veya (Z-piezo) yer değiştirme profili, kullanıcı tarafından yazılım arayüzü aracılığıyla belirlenir ve diğer parametre ölçülürken doğrudan cihaz tarafından kontrol edilir. Nanogirinti deneylerinden en sık elde edilen mekanik özellik, basınç birimlerine sahip Young modülü olarak da adlandırılan elastik modüldür (E). Bir malzemenin elastik modülü, bağ sertliği ile ilgili temel bir özelliktir ve plastik deformasyonun başlamasından önce elastik (yani tersinir veya geçici) deformasyon sırasında çekme veya basınç gerilmesinin (σ, birim alan başına uygulanan kuvvet) eksenel gerinime (ε, girinti ekseni boyunca orantılı deformasyon) oranı olarak tanımlanır (denklem [1]):

(1)

Birçok malzemenin (özellikle biyolojik dokuların) aslında viskoelastik olması nedeniyle, gerçekte, (dinamik veya karmaşık) modülün hem elastik (depolama, faz içinde) hem de viskoz (kayıp, faz dışı) bileşenlerden oluştuğu belirtilmelidir. Gerçek uygulamada, bir nanogirinti deneyinde ölçülen şey, denklemde (2) gösterildiği gibi, ilgilenilen gerçek numune modülü E ile ilişkili olan indirgenmiş modül E * 'dir:

(2)

Burada E ucu ve ν _ucu, nanoindenter ucunun sırasıyla elastik modülü ve Poisson oranıdır ve ν, numunenin tahmini Poisson oranıdır. Poisson oranı, enine eksenel gerinimin negatif oranıdır ve bu nedenle, denklemde (3) gösterildiği gibi, eksenel gerinimlere (örneğin, nanogirinti yüklemesi sırasında) maruz kalındığında bir numunenin enine uzama derecesini gösterir:

(3)

İndirgenmiş modülden gerçek modüle dönüşüm gereklidir, çünkü a) girinti ucu tarafından verilen eksenel gerinimin bir kısmı enine gerinime dönüştürülebilir (yani, numune yükleme yönüne dik olarak genleşme veya büzülme yoluyla deforme olabilir) ve b) girinti ucu sonsuz derecede sert değildir ve bu nedenle numuneyi girintileme eylemi, ucun bir miktar (küçük) deformasyonuna neden olur. E _{ucunun E >>} durumunda (yani, girinti ucu numuneden çok daha zordur, ki bu genellikle bir elmas probu kullanıldığında doğrudur), indirgenmiş ve gerçek numune modülü arasındaki ilişkinin E ≈ E * (1 - v²) için büyük ölçüde basitleştirildiğini unutmayın. Aletli nanogirinti, doğru kuvvet karakterizasyonu ve dinamik aralık açısından üstün olsa da, AFM konsol tabanlı nanogirinti daha hızlıdır, büyüklük sıralarında daha fazla kuvvet ve yer değiştirme hassasiyeti sağlar, daha yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve gelişmiş girinti konumlandırma sağlar ve aynı anda nano ölçekli manyetik ve elektriksel özellikleri araştırabilir⁹. Özellikle, AFM konsol bazlı nanogirinti, yumuşak malzemelerin (örneğin, polimerler, jeller, lipit çift katmanları ve hücreler veya diğer biyolojik malzemeler), son derece ince (alt μm) filmlerin (girinti derinliğine bağlı olarak substrat etkilerinin devreye girebileceği) ^nano ölçekte mekanik özelliklerin nicelleştirilmesi için üstündür.10,11 ve grafen gibi asılı iki boyutlu (2D) malzemeler^{12,13,1415,16}, mika¹⁷, altıgen bor nitrür (h-BN)18 veya geçiş metali dikalkojenitler (TMDC'ler; örneğin, MoS₂)¹⁹. Bunun nedeni, ilk temas noktasını doğru bir şekilde belirlemek ve elastik deformasyon bölgesinde kalmak için önemli olan mükemmel kuvvet (sub-nN) ve yer değiştirme (sub-nm) hassasiyetidir.

AFM konsol bazlı nanogirintide, bir AFM probunun numune yüzeyine doğru yer değiştirmesi, kalibre edilmiş bir piezoelektrik eleman (Şekil 1B) tarafından harekete geçirilir ve esnek konsol, numune yüzeyiyle temas ettiğinde yaşanan dirençli kuvvet nedeniyle sonunda bükülür. Konsoldaki bu bükülme veya sapma tipik olarak bir lazeri konsol arkasından ve bir fotodetektöre (konuma duyarlı dedektör [PSD]) yansıtarak izlenir. Konsol sertliği (nN/nm cinsinden) ve sapma hassasiyeti (nm/V cinsinden) bilgisi ile birleştiğinde, ölçülen bu konsol sapmasını (V cinsinden) numuneye uygulanan kuvvete (nN cinsinden) dönüştürmek mümkündür. Temasın ardından, Z-piezo hareketi ile konsol sapması arasındaki fark, numune girinti derinliğini verir. Uç alanı fonksiyonunun bilgisi ile birleştiğinde, bu, uç-numune temas alanının hesaplanmasını sağlar. Elde edilen kuvvet-mesafe veya kuvvet-yer değiştirme (F-D) eğrilerinin temas halindeki kısımlarının eğimi, numunenin nanomekanik özelliklerini belirlemek için uygun bir temas mekaniği modeli (tartışmanın Veri Analizi bölümüne bakınız) kullanılarak sığdırılabilir. AFM konsol bazlı nanogirinti, yukarıda açıklandığı gibi aletli nanogirintiye göre bazı belirgin avantajlara sahip olsa da, burada tartışılacak olan kalibrasyon, uç aşınması ve veri analizi gibi çeşitli pratik uygulama zorlukları da sunmaktadır. AFM konsol tabanlı nanogirintinin bir diğer potansiyel dezavantajı, temas yarıçapı ve girinti derinliklerinin, nano ölçekli AFM probları ve / veya önemli yüzey pürüzlülüğü sergileyen numunelerle çalışırken elde edilmesi zor olabilen indenter yarıçapından çok daha küçük olması gerektiğinden, doğrusal elastikiyet varsayımıdır.

Geleneksel olarak, nanogirinti, istenen bir konumun (yani, ilgi alanı [ROI]) seçildiği ve tek bir kontrollü girinti, bir miktar bekleme süresi ile ayrılmış tek bir konumda birden fazla girinti ve / veya kaba bir girinti ızgarasının Hz sırasına göre bir oranda gerçekleştirildiği bireysel konumlar veya küçük ızgara girinti deneyleri ile sınırlandırılmıştır. Bununla birlikte, AFM'deki son gelişmeler, yüksek hızlı kuvvet eğrisi tabanlı görüntüleme modlarının (sistem üreticisine bağlı olarak çeşitli ticari isimlerle anılır) kullanılmasıyla mekanik özelliklerin ve topografyanın eşzamanlı olarak edinilmesine izin verir; burada kuvvet eğrileri, görüntüleme ayar noktası olarak kullanılan maksimum uç-numune kuvveti ile yük kontrolü altında bir kHz hızında gerçekleştirilir. Bir AFM topografya görüntüsünün elde edilmesine ve ardından görüntü içindeki ilgi çekici noktalarda seçici nanogirintinin ardından nanogirinti konumu üzerinde nano ölçekli mekansal kontrol sağlayan bas ve çek yöntemleri de geliştirilmiştir. Bu çalışmanın birincil odağı olmasa da, hem kuvvet eğrisi tabanlı görüntüleme hem de bas ve çek konsol tabanlı nanogirintinin spesifik seçilmiş uygulama örnekleri temsili sonuçlarda sunulmuştur ve kullanılan belirli AFM platformunda mevcutsa aşağıda özetlenen protokolle birlikte kullanılabilir. Spesifik olarak, bu çalışma, herhangi bir yetenekli AFM sisteminde AFM konsol tabanlı nanogirintinin pratik uygulaması için genelleştirilmiş bir protokolü özetlemektedir ve temsili sonuçlar ve tekniğin başarılı bir şekilde kullanılması için nüansların, zorlukların ve önemli hususların derinlemesine tartışılması da dahil olmak üzere tekniğin dört kullanım örneği (ikisi havada, ikisi sıvıda) sunmaktadır.

Protocol

NOT: Ticari olarak temin edilebilen çok çeşitli AFM'ler ve konsol bazlı nanogirinti için mevcut olan numune tiplerinin ve uygulamalarının çeşitliliği nedeniyle, takip eden protokol, cihaz veya üreticiden bağımsız olarak tüm konsol tabanlı nanogirinti deneyleri için gerekli olan paylaşılan adımlara odaklanarak, doğada nispeten genel olacak şekilde kasıtlı olarak tasarlanmıştır. Bu nedenle, yazarlar okuyucunun konsol bazlı nanogirinti yapmak için seçilen belirli enstrümanı çalıştırma konusunda en azından temel aşinalığa sahip olduğunu varsaymaktadır. Bununla birlikte, aşağıda özetlenen genel protokole ek olarak, AFM'ye ve burada kullanılan yazılıma özgü ayrıntılı bir adım adım standart çalışma prosedürü (SOP) (bkz. Malzeme Tablosu), sıvıdaki numunelerin konsol bazlı nanogirintisine odaklanmış, Ek Malzeme olarak dahil edilmiştir.

1. Numune hazırlama ve cihaz kurulumu

1. Numuneyi, ilgilenilen alanın (alanların) mekanik özelliklerini değiştirmeden hem yüzey pürüzlülüğünü (ideal olarak nanometre ölçeğinde, amaçlanan girinti derinliğinden ~ 10 kat daha az) hem de kontaminasyonu en aza indirecek şekilde hazırlayın.
2. Ortama (yani hava veya sıvı), beklenen modüle, numune topografyasına ve ilgili özellik boyutlarına bağlı olarak amaçlanan numunenin nanogirintisi için uygun bir AFM probu seçin (tartışmadaki prob seçimi hususlarına bakın). Probu prob tutucuya takın (bkz. Malzeme Tablosu) ve prob tutucuyu AFM tarama kafasına takın.
3. AFM yazılımında, bireysel rampaların (yani, kuvvet-yer değiştirme eğrileri) kullanıcı kontrolünü sağlayan uygun bir nanogirinti modu seçin.
   NOT: Özel mod, farklı AFM üreticileri ve bireysel cihazlar arasında farklılık gösterecektir (daha fazla ayrıntı ve özel bir örnek için Ek Materyal'de sağlanan SÇP'ye bakın).
4. Lazeri prob konsolunun arkasına, prob ucunun bulunduğu yerin karşısına ve PSD'ye hizalayın.
   NOT: Lazeri hizalarken ve sıvıda nanogirinti yaparken, özellikle de ışını dağıtabilecek veya kırabilecek yüzen döküntülerden ve / veya hava kabarcıklarından kaçınırken önemli hususlarla ilgili daha fazla ayrıntı için mezenkimal kök hücre uygulama örneğine bakın. AFM optiklerinin, sıvının kırılma indeksini telafi etmek ve yüzeye girerken probun çökmesini önlemek için de ayarlanması gerekebilir.
   1. Toplam voltajı en üst düzeye çıkararak lazer ışını noktasını konsol arkasında ortalayın (Şekil 2A).
   2. X ve Y (yani yatay ve dikey) sapma sinyallerini mümkün olduğunca sıfıra yakın olacak şekilde ayarlayarak (Şekil 2A) yansıtılan lazer ışını noktasını PSD üzerinde ortalayın, böylece konsol sapmasıyla orantılı bir çıkış voltajı üretmek için maksimum algılanabilir sapma aralığı sağlayın.
5. Numune topografyasından, yüzey pürüzlülüğünden ve/veya yüzey yoğunluğundan (pul veya parçacıklar söz konusu olduğunda) emin değilseniz, adım 1.1'de ve tartışmanın numune hazırlama bölümünde açıklandığı gibi, numune uygunluğunu doğrulamak için herhangi bir nanogirinti deneyinden önce bir AFM topografya araştırması taraması gerçekleştirin.

Resim 2: Konuma duyarlı dedektör monitörü. (A) Numune yüzeyine girmeden önce prob konsolunun arkasından ve PSD'nin merkezine (büyük toplam voltaj ve dikey veya yatay sapma eksikliği ile kanıtlandığı gibi) yansıyan düzgün hizalanmış bir lazeri gösteren PSD ekranı (yani, probun numune ile temas etmemesi). (B) Dikey sapma voltajı, konsol saptırıldığında artar (örneğin, prob numune ile temas ettiğinde). Kısaltmalar: PSD = konuma duyarlı dedektör; VERT = dikey; HORIZ = yatay; AMPL = genlik; n/a = uygulanamaz. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

2. Prob kalibrasyonu

NOT: Konsol tabanlı nanogirinti sırasında toplanan F-D eğrisi verilerini kullanarak bir numunenin mekanik özelliklerini ölçmek için üç değer gereklidir: konsol / PSD sisteminin sapma hassasiyeti (DS) ( nm / V veya V / nm), konsol yayı sabiti (nN / nm) ve prob temas alanı, genellikle küresel bir prob durumunda prob yarıçapından daha az belirli bir girinti derinliğinde etkili prob ucu yarıçapı (nm) cinsinden ifade edilir bahşiş.

1. Prob/AFM sisteminin DS'sini son derece sert bir malzemeye (örneğin, safir, E = 345 GPa) yükselterek kalibre edin, böylece numunenin deformasyonu en aza indirilir ve böylece uç-numune temasının başlatılmasından sonra piezo'nun ölçülen Z hareketi yalnızca konsol sapmasına dönüştürülür.
   NOT: DS kalibrasyonu, deneyler sırasında sistemin DS'sini doğru bir şekilde yansıtmak için planlanan nanogirinti deneyleriyle (yani sıcaklık, ortam vb.) aynı koşullar altında gerçekleştirilmelidir. Termal dengeye ulaşılması ve kararlı lazer çıkış gücü ve işaret kararlılığının kurulması için zamana izin vermek üzere maksimum doğruluk için uzun (30 dakika) bir lazer ısınma periyodu gerekli olabilir. DS, lazer yoğunluğuna ve konsol üzerindeki konumuna, ayrıca probdan yansımanın kalitesine (yani, probun arka yan kaplamasının bozulması DS'yi etkileyecektir) ve PSD^20'nin hassasiyetine bağlı olduğundan, lazer her yeniden hizalandığında DS yeniden ölçülmelidir.
   1. Planlanan numune girintileriyle yaklaşık olarak aynı prob sapmasını (V veya nm cinsinden) elde etmek için safir üzerinde DS kalibrasyon girintilerini ayarlayın ve gerçekleştirin, çünkü ölçülen yer değiştirme, uç sapma açısının bir fonksiyonudur ve büyük sapmalar için doğrusal olmayan hale gelir.
   2. DS'yi (nm/V cinsinden) veya alternatif olarak, ters optik kol hassasiyetini (V/nm cinsinden), Şekil 3A'da gösterildiği gibi, ortaya çıkan F-D eğrisindeki ilk temas noktasından sonra temas halinde rejimin doğrusal kısmının eğiminden belirleyin.
   3. Her DS değerini kaydederek rampayı en az 5 kez tekrarlayın. Maksimum doğruluk için değerlerin ortalamasını kullanın. Ölçümlerin göreceli standart sapması (RSD) ~% 1'i aşarsa, DS'yi yeniden ölçün, çünkü bazen ilk birkaç F-D eğrisi, yapışkan kuvvetlerin ilk kez uygulanması nedeniyle ideal değildir.
   4. Prob konsolunun yay sabiti (k) fabrikada kalibre edilmemişse (örneğin, lazer Doppler vibrometri [LDV] ile), yay sabitini kalibre edin.
      NOT: Termal ayar yöntemi, k < 10 N/m'lik nispeten yumuşak konsollar için idealdir (özellikle k > 10 N/m'lik sert konsollar için alternatif yöntemlerin bir listesi ve açıklaması için tartışmanın yay sabiti bölümüne bakınız). Şekil 3B, C'de gösterildiği gibi, termal ayar tipik olarak AFM kontrol yazılımına entegre edilmiştir.
2. Prob fabrikada kalibre edilmiş bir uç yarıçapı ölçümü ile gelmiyorsa (örneğin, taramalı elektron mikroskobu [SEM] görüntüleme yoluyla ), etkili uç yarıçapını, R'yi ölçün.
   NOT: Uç yarıçapını ölçmek için iki yaygın yöntem vardır (ilgili tartışma bölümüne bakın), ancak nanometre ölçekli prob uçları için en yaygın olanı, numuneyi görüntüleyen uçtan ziyade ucu etkili bir şekilde görüntülemeye yarayan çok sayıda son derece keskin (sub-nm) özellik içeren bir pürüzlülük standardı ( Malzeme Tablosuna bakınız) kullanan kör uç rekonstrüksiyonu (BTR) yöntemidir.
   1. BTR yöntemini kullanıyorsanız, çok keskin özelliklerin izlenmesini optimize etmeye yardımcı olmak için yavaş bir tarama hızı (<0,5 Hz) ve yüksek geri bildirim kazanımları kullanarak pürüzlülük (uç karakterizasyonu) numunesini görüntüleyin. Beklenen uç yarıçapına göre bir görüntü boyutu ve piksel yoğunluğu (çözünürlük) seçin (örneğin, 3 μm x 3 μm alanın 1024 x 1024 piksel görüntüsü ~3 nm yanal çözünürlüğe sahip olacaktır).
   2. Prob ucunu modellemek ve Şekil 3D-F'de gösterildiği gibi beklenen numune girinti derinliğinde uç yarıçapını ve etkili uç çapını tahmin etmek için AFM görüntü analiz yazılımını kullanın (bkz.
3. Prob kalibrasyonunu tamamladıktan sonra, Şekil 4A'da gösterildiği gibi DS, k ve R değerlerini cihaz yazılımına girin.
   1. Ölçülen indirgenmiş modülün gerçek numune modülü^9'a dönüştürülmesini sağlamak için numunenin Poisson oranının (ν) bir tahminini girin. Uç şekline ve girinti derinliğine göre konik veya konisferik bir temas mekaniği modeli kullanılıyorsa, uç yarım açısının da girilmesi gerekmektedir (Şekil 4C).
      NOT: Modül, tahmini Poisson oranındaki küçük hatalara veya belirsizliklere karşı nispeten duyarsızdır. ν = 0.2-0.3 tahmini, birçok malzeme²¹ için iyi bir başlangıç noktasıdır.

Şekil 3: Prob kalibrasyonu. (A) Sapma hassasiyeti tayini. Yansıtıcı bir arka taraf alüminyum kaplamalı standart bir kılavuz çekme modu probu (nominal k = 42 N / m; bkz. Malzeme Tablosu) için safir bir substrat (E = 345 GPa) üzerinde gerçekleştirilen temsili bir sapma hassasiyeti ölçümünün sonucu. Ölçülen yaklaşım (mavi iz) ve geri çekme veya geri çekme (kırmızı iz) eğrileri gösterilmektedir. 59.16 nm/V'luk ölçülen sapma hassasiyeti, dikey noktalı kırmızı çizgiler arasındaki bölge tarafından gösterildiği gibi, yaklaşma eğrisinin temas halinde ve dönüş noktaları arasına yerleştirilmesiyle belirlendi. Yüzeyden çekilmeden önce geri çekme/geri çekme eğrisinde belirgin olan negatif yönlü sapma bölgesi, uç-numune yapışmasının göstergesidir. (B,C) Termal ayar. İki farklı prob için karşılık gelen uyumlarla (kırmızı izler) temsili konsol termal gürültü spektrumları (mavi izler). (B) İlk tahmin olarak kullanılan nominal yay sabiti k = 0,4 N/m olan standart kuvvet eğrisi tabanlı AFM görüntüleme probu için termal ayar kurulumu ve uyum parametreleri (bkz. Konsol termal gürültü spektrumunun uyumu, f 0 = 79.8 kHz'lik temel bir rezonans frekansı verir, bu da f₀ = 70 kHz nominal değeri ile oldukça iyi bir uyum içindedir. Ölçülen Q faktörü 58.1'dir. Uyumun iyiliği (R² = 0.99), uyumun iki dikey kesikli kırmızı çizgi arasındaki verilerle anlaşmasına dayanır. Doğru sonuçlar için hem ortam sıcaklığını hem de sapma hassasiyetini bilmek ve girmek önemlidir. (C) Canlı hücreler ve izole çekirdekler üzerinde nanomekanik ölçümler yapmak için kullanılan son derece yumuşak bir konsol için konsol termal gürültü spektrumu ve buna karşılık gelen uyum (yani, termal ayar). ~ 2-3 kHz'lik önemli ölçüde daha düşük doğal rezonans frekansına dikkat edin. (D-F) Kör uç rekonstrüksiyonu. Bir elmas uç probu için temsili kör uç rekonstrüksiyon iş akışı (nominal R = 40 nm; bkz. (D) AFM prob ucunu görüntülemeye yarayan bir dizi son derece keskin (nm altı) titanyum çividen oluşan bir uç karakterizasyon örneğinin 5 μm x 5 μm görüntüsü. (E) Prob ucunun sonuçta yeniden yapılandırılmış modeli (ters yükseklik görüntüsü). (F) Uç tepesinden kullanıcı tarafından seçilen 8 nm yükseklikte (yani, girinti derinliği << R) tahmini R = 29 nm bitiş yarıçapı ve 40 nm etkin uç çapı dahil olmak üzere, bu yükseklikteki uç-numune temas alanının dairesel bir profil varsayılarak etkili bir çapa dönüştürülmesiyle hesaplanan kör uç rekonstrüksiyon uydurma sonuçları (yani, A = πr 2 = π(d/2)²) küresel temas mekaniği modelleriyle kullanım için. Kısaltmalar: AFM = atomik kuvvet mikroskobu; ETD = etkili uç çapı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Yazılım arayüzü girişleri. (A) Prob kalibrasyon sabitleri. Kantitatif nanomekanik ölçümleri etkinleştirmek için ölçülen sapma hassasiyetini, yay sabitini ve uç yarıçapını girmek için yazılım kullanıcı arayüzü ( Malzeme Tablosuna bakınız). Hem probun hem de numunenin Poisson oranı, konsol bazlı nanogirinti kuvveti eğrilerinden numunenin elastik veya Young modülünü hesaplamak için gereklidir. (B) Rampa kontrol penceresi. Rampanın kendisini tanımlayan parametreler (yani girinti profili), cihaz tetikleme (örneğin, kuvvet ve yer değiştirme kontrolü), sonraki kuvvet analizi ve hareket limitleri (A / D dönüştürücüsünün Z-piezo'yu kontrol etmede ve PSD sapmasını okumada çalışması gereken aralığı daraltarak ölçüm hassasiyetini artırmak için) konsol tabanlı nanogirinti deneylerini ayarlamak için yazılım kullanıcı arayüzü ( Malzeme Tablosuna bakınız). (C) Uç yarım açısı (prob geometrisine veya doğrudan ölçüme dayanarak), konik, piramidal veya konisferik temas mekaniği modeli (örneğin, Sneddon) kullanılıyorsa önemlidir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

3. Kuvvet-yer değiştirme (F-D) verilerini toplayın

NOT: Burada sunulan parametre değerleri (bkz. Şekil 4B), belirli bir numune için kuvvet ve girinti aralığına bağlı olarak değişebilir.

1. AFM başlığının altındaki örnekte gezinin ve istediğiniz ilgi alanına girin.
   1. Dikey sapma sinyalini izleyin (Şekil 2B) veya uç ile numunenin temas halinde olduğunu doğrulamak için küçük (~50-200 nm) bir başlangıç rampası (Şekil 4B) gerçekleştirin (bkz. Şekil 5A).
   2. AFM kafa pozisyonunu hafifçe yukarı doğru ayarlayın (tam rampa boyutunun ~% 50'sine karşılık gelen adımlarla) ve tekrar rampa yapın. Neredeyse düz bir rampa (Şekil 5B) ve konsolların minimum dikey sapması (Şekil 2A) ile kanıtlandığı gibi, uç ve numune temas halinde olana kadar tekrarlayın.
   3. Belirgin bir uç-numune etkileşimi olmadığında ( Şekil 2A ve Şekil 2B'yi karşılaştırın), AFM kafasını manuel olarak hareket ettirirken prob ucunun numuneye çarpmamasını sağlamak için AFM kafasını rampa boyutunun ~% 50 -% 100'üne karşılık gelen bir miktarda indirin. İyi bir eğri (Şekil 5D) veya Şekil 5C'ye benzer bir eğri gözlenene kadar tekrarlayarak tekrar rampa. İkinci durumda, iyi temas ve Şekil 5D'de gösterilene benzer bir kuvvet eğrisi elde etmek için rampa boyutunun ~% 20 -% 50'sine eşit ek bir küçük AFM kafa indirme ayarı yapın.
2. Rampa parametrelerini ayarlayın (aşağıda açıklandığı ve aşağıda gösterildiği gibi) Şekil 4B) cihaz, prob ve numune için optimize etmek ve aşağıda gösterilene benzer rampalar elde etmek için Şekil 5D.
   1. Numuneye (ör. kalınlık, beklenen modül, yüzey pürüzlülüğü) ve istenen girinti derinliğine bağlı olarak uygun bir rampa boyutu (yani, bir rampa döngüsü boyunca toplam Z-piezo hareketi) seçin.
      NOT: Daha sert numuneler için, daha az numune deformasyonu (ve dolayısıyla belirli bir Z-piezo hareketi için daha fazla prob sapması) meydana gelmesi muhtemeldir, bu nedenle rampa boyutu genellikle daha yumuşak numunelerden daha küçük olabilir. Sert numuneler ve konsollar için tipik rampa boyutları onlarca nm olabilirken, yumuşak numuneler ve konsollar için rampalar yüzlerce nm ila birkaç μm boyutunda olabilir; Seçilen belirli uygulama örnekleri temsili sonuçlar bölümünde sunulmuştur. Mümkün olan minimum ve maksimum rampa boyutlarının cihaza bağlı olduğunu unutmayın.
   2. Uygun bir rampa hızı seçin (1 Hz çoğu numune için iyi bir başlangıç noktasıdır).
      NOT: Rampa hızı, kontrol ve/veya algılama elektronik hızları/bant genişlikleri ile sınırlandırılabilir. Rampa boyutu ile birlikte, rampa hızı uç hızını belirler. Uç hızı, viskoelastik etkilerin histerezis artefaktlarına neden olabileceği yumuşak malzemeleri girintilendirirken özellikle dikkate alınması önemlidir ^9,22.
   3. Tetiklenmiş (yük kontrollü) veya tetiklenmemiş (yer değiştirme kontrollü) bir rampa kullanıp kullanmayacağınızı seçin.
      NOT: Tetiklenen bir rampada, sistem, istenen tetikleme eşiği (yani, ayar noktası kuvveti veya konsol sapması) tespit edilene kadar kullanıcı tanımlı adımlarla (rampa boyutuna ve çözünürlüğüne veya veri noktası sayısına bağlı olarak) numuneye yaklaşır, bu noktada sistem orijinal konumuna geri çekilir ve F-D eğrisini görüntüler. Tetiklenmemiş bir rampada, sistem Z-piezo'yu kullanıcı tanımlı rampa boyutu tarafından belirtilen mesafeye kadar uzatır ve ölçülen F-D eğrisini görüntüler. Tetiklenen rampalar çoğu kullanım durumu için tercih edilir, ancak tetiklenmemiş rampalar keskin, kolayca tanımlanabilir bir temas noktası göstermeyen yumuşak malzemeleri araştırırken yararlı olabilir.
      1. Tetiklenmiş bir rampa seçilirse, numunede istenen girintiyle sonuçlanması için tetikleme eşiğini (kullanıcı tanımlı izin verilen maksimum kuvvet veya rampanın sapması) ayarlayın.
         NOT: Bir tetikleme eşiğinin kullanılması, bir rampanın belirtilen tam rampa boyutuna (Z-piezo uzantısı) ulaşmadan önce sona erebileceği (yani, probun geri çekilmeye başlayabileceği) anlamına gelir. Değerler, uç numune sistemine bağlı olarak birkaç nN ile birkaç μN arasında değişebilir.
      2. Z-piezo'nun maksimum aralığının rampayı yürütmek için kullanılacak kısmını belirlemek için rampa konumunu ayarlayın. Rampa boyutunun toplam aralığının maksimum Z-piezo aralığının dışında başlamadığından veya bitmediğinden emin olun ( Şekil 6'daki temsili örneklere bakın), aksi takdirde F-D eğrisinin bir kısmı herhangi bir fiziksel ölçümü temsil etmeyecektir (yani, Z-piezo hareket ettirilmeyecek, tamamen uzatılacak veya geri çekilecektir).
   4. Ölçümün istenen çözünürlüğünü (yani, F-D eğrisinin nokta yoğunluğu) elde etmek için numune / rampa sayısını (örneğin, 512 numune / rampa ) ayarlayın.
      NOT: Maksimum numune/rampa, yazılım (dosya boyutu) veya donanım kısıtlamaları (ör. rampa hızına bağlı olarak analogdan dijitale [A/D] dönüştürme hızı) ile sınırlandırılabilir. Sistemin A/D dönüştürücüsünün etkin çözünürlüğünü artırmak için izin verilen Z-piezo veya sapma aralığını sınırlamak da mümkündür ( Şekil 4B'deki sınır parametrelerine bakın).
   5. Probu X yönünde (konsola paralel) hafifçe hareket ettirirken Z yönünde (konsola dikey) girinti yaparak numune ve uç üzerindeki kesme kuvvetlerini azaltmak için X-rotasyonunu ayarlayın. X-döndürme için, prob tutucunun normal yüzeye göre ofset açısına eşit bir değer kullanın (12° tipiktir).
      NOT: X-döndürme gereklidir, çünkü konsol, gelen lazer ışınının PSD'ye yansımasına izin vermek için prob tutucuya yüzeye göre küçük bir açıyla monte edilmiştir. Ek olarak, prob ucunun ön ve arka açıları birbirinden farklı olabilir (yani, prob ucu asimetrik olabilir). Bireysel prob ve AFM üreticilerinden daha spesifik bilgiler elde edilebilir.

Şekil 5: İyi kuvvet eğrileri elde etmek için devreye girdikten sonra uç-numune ayrımını optimize etme. 5 μm yarıçaplı yarım küre şeklinde sonlanan kalibre edilmiş yumuşak silikon nitrür konsollu (nominal k = 0.04 N/m) canlı bir mezenkimal kök hücre çekirdeği üzerinde sıvı (fosfat tamponlu salin) içinde girinti yaparken elde edilen temsili kuvvet-yer değiştirme eğrilerinin sıralı örnekleri (bkz. Hücre yüzeyini meşgul etme ve girinti parametrelerini optimize etme sürecinde, prob yaklaşımı mavi renkte gösterilerek ve kırmızı renkte geri çekilme / geri çekilme ile eğriler elde edildi. (A) Uç, rampaya başlamadan önce numuneyle zaten devrededir ve temas halindedir, bu da düz bir ön temas tabanı olmaksızın büyük konsol sapmasına ve kuvvetlerine yol açar. (B) Ucu numuneden yeterince uzağa manuel olarak hareket ettirdikten sonra, tetiklenmemiş 2 μm'lik bir rampa, neredeyse düz olan bir F-D eğrisi ile sonuçlanır (yani, kuvvette neredeyse hiç değişiklik olmaz). Ortam koşullarında, eğri daha düz olacaktır, ancak akışkanda, ortamın viskozitesi, yüzey teması olmasa bile, burada görüldüğü gibi bir rampa sırasında prob konsolunun hafif sapmalarına neden olabilir. (C) Rampaya başlamadan önce yüzeye biraz daha yaklaştıktan sonra, yaklaşma ve geri çekilme eğrileri, rampanın dönüş noktasına yakın bir kuvvet artışı (artan eğim) gösterir (yani, yaklaşımdan geri çekilmeye geçiş). Aranması gereken anlatım işareti, yaklaşım (mavi) ve geri çekilme (kırmızı) eğrilerinin, yüzeyle fiziksel bir etkileşimin göstergesi olan üst üste binmeye (siyah daire ile gösterilen bölge) başlamasıdır. (D) Rampa parametrelerinin optimizasyonundan sonra elde edilen ve hücre yüzeyine C'den biraz daha yakın (~ 1 μm) yaklaşan ideal bir F-D eğrisi, böylece prob, rampanın yaklaşık yarısını hücre ile temas halinde geçirir ve yaklaşım eğrisinin temas kısmına uyacak ve elastik modülü belirlemek için yeterli deformasyonu sağlar. Nispeten uzun, düz, düşük gürültülü taban çizgisi, uygulama algoritmasının temas noktasını belirlemesini kolaylaştırır. Kısaltma: F-D = kuvvet-yer değiştirme. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Rampa boyutu ve konumu. Mevcut toplam Z-piezo hareket aralığına (yeşil çubuk) göre rampanın (mavi çubuk) derecesini gösteren Z-piezo monitör. (A) Z-piezo konumu, hem mavi çubuğun kabaca yeşil çubuğun ortasında yer alması hem de mevcut Z-piezo voltajının (-78,0 V) kabaca tamamen geri çekilmiş (-212,2 V) ve genişletilmiş (+102,2 V) değerleri arasında olmasıyla gösterildiği gibi, hareket aralığının ortasına yakındır. (B) Z-piezo, sapma voltajı uygulanmadan A'ya göre uzatılır. (C) Z-piezo, A ve B'ye göre geri çekilir. (D) Z-piezo pozisyonu -156.0 V'de C'deki ile aynıdır, ancak Z-piezo'nun tüm hareket aralığından daha fazla yararlanmak için rampa boyutu A-C'ye göre artırılmıştır. € Rampa boyutu mevcut rampa konumu için çok büyük, bu da Z-piezo'nun aralığının sonuna kadar uzatılmasına neden oluyor. Bu, sistem Z-piezo'yu daha fazla uzatamadığından F-D eğrisinin düz çizgiye çıkmasına neden olacaktır. Kısaltma: F-D = kuvvet-yer değiştirme. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

4. F-D eğrisi analizi

1. Uygun bir veri analizi yazılım paketi seçin. Analiz edilecek verileri seçin ve yükleyin.
   NOT: Birçok AFM üreticisi ve AFM görüntü işleme yazılımı programı, F-D eğrisi analizi için yerleşik desteğe sahiptir. Alternatif olarak, açık kaynaklı AtomicJ yazılım paketi gibi özel bir F-D eğri analizi paketinin artan esnekliği ve özellikleri, özellikle büyük veri kümelerinin toplu işlenmesi ve istatistiksel analizi veya karmaşık temas mekaniği modellerinin uygulanması için yararlı olabilir²³.
2. Yay sabiti, DS ve prob ucu yarıçapı için kalibre edilmiş değerlerin yanı sıra Young modülü ve prob ucu için Poisson oranı (malzeme bileşimine göre) ve numunenin Poisson oranı ile ilgili tahminleri girin.
   NOT: Elmas uçlu bir girinti kullanılıyorsa, E_ucu = 1140 GPa ve ν_uç = 0,07 değerleri 21,24,25,26 kullanılabilir. Standart bir silikon prob için, E ucu = 170 GPa ve ν _ucu = 0.27 tipik olarak kullanılabilir, ancak Young'ın silikon modülü kristalografik yönelime bağlı olarak değişir²⁷.
3. Uç ve numune için uygun bir nanogirinti temas mekaniği modeli seçin.
   NOT: Birçok yaygın küresel uç modeli için (örneğin, Hertz, Maugis, DMT, JKR), numunedeki girinti derinliğinin uç yarıçapından daha az olması zorunludur; aksi takdirde prob ucunun küresel geometrisi yerini konik veya piramidal bir şekle bırakır (Şekil 4C). Konik (örneğin, Sneddon²⁸) ve piramidal modeller için, uç yarım açısı (yani, ucun yan duvarı ile uç ucuna dik bir biseksiyon çizgisi arasındaki açı; Şekil 4C) bilinmelidir ve genellikle prob üreticisinden temin edilebilir. Temas mekaniği modelleri hakkında daha fazla bilgi için lütfen thedDiscussion'ın Veri Analizi bölümüne bakın.
4. Uydurma algoritmasını çalıştırın. F-D eğrilerinin doğru şekilde takılıp takılmadığını kontrol edin; birliğe yakın ortalama bir R 2'ye karşılık gelen düşük bir artık hata (örneğin, R² > 0,9) tipik olarak seçilen model 29,30'a iyi bir uyumun göstergesidir. İsterseniz eğriyi, model uyumunu ve hesaplanan temas noktalarını görsel olarak incelemek için tek tek eğrileri yerinde kontrol edin (örneğin, Şekil 7'ye ve tartışmanın Veri Analizi bölümüne bakın).

Representative Results

Kuvvet-yer değiştirme eğrileri
Şekil 7, reçineye gömülü loblolly çam örnekleri (Şekil 7A) ve mezenkimal kök hücre (MSC) çekirdekleri üzerindeki sıvıda (fosfat tamponlu salin [PBS]) havada yapılan nanogirinti deneylerinden elde edilen temsili, ideale yakın F-D eğrilerini göstermektedir (Şekil 7B). Herhangi bir temas mekaniği modelinin kullanılması, ilk uç-numune temas noktasının doğru ve güvenilir bir şekilde belirlenmesine dayanır. Bu nedenle, ilk temas noktasından önceki nispeten düz, düşük gürültülü taban çizgisi ve Şekil 7'de gösterilen F-D eğrilerinin temas kısmının düzgün eğimi, yaklaşım eğrileri (mavi izler) ile insets'teki karşılık gelen uyumlar (yeşil izler) arasındaki mükemmel uyumun kanıtladığı gibi, mekanik özellikleri çıkarmak için analiz için idealdir.

Tersine, bir kullanıcının konsol tabanlı nanogirinti yaparken karşılaşabileceği ve ideal olmayan F-D eğrilerine yol açacak birkaç yaygın sorun vardır. En yaygın sorunlardan biri, özellikle devreye girdikten hemen sonra, bir rampanın başlatılmasından önce numune ile temas halinde olan prob ucudur (Şekil 5A), bu da ilk temas noktasını belirlemek için gerekli temas dışı taban çizgisinin elde edilmesini önler. Bu aynı zamanda tetiklenmemiş (yani kontrollü yer değiştirme) rampalar durumunda aşırı büyük kuvvetlere yol açabilir. Bu, sert bir konsol ile büyük bir rampa gerçekleştirirken özellikle önemlidir, çünkü ortaya çıkan kuvvetler konsolları kırabilir ve / veya numuneye veya uca zarar verebilir. Bunu önlemek için, ilk devreye alma sırasında ve sonrasında dikey sapma voltajını izleyin. Ölçülen dikey sapma voltajı Şekil 2B'de gösterildiği gibi pozitifse (uygun başlangıç hizalaması varsayılarak), konsol saptırılır ve uç numune ile temas halindedir. Daha büyük pozitif voltajlar daha büyük konsol sapmalarına karşılık gelir, ancak sapmanın büyüklüğünden bağımsız olarak, kullanıcı AFM kafasını manuel olarak (örneğin, bir step motor kullanarak) numuneden uzağa kaldırmalıdır. Dikey sapma voltajı yavaşça düşmelidir ve hatta güçlü uç-numune yapışkan kuvvetleri durumunda geçici olarak sıfırın altına düşebilir, ancak uç artık numune ile temas etmediğinde sonunda 0 V'a (veya 0 V'a yakın) ulaşacaktır (Şekil 2A). Bu noktadan sonra, kullanıcı rampa parametrelerini optimize etmeye ve girintiler gerçekleştirmeye devam edebilir.

Diğer bir yaygın sorun (özellikle tetiklenmemiş rampalar için), daha önce Şekil 5B'de gösterildiği gibi, tüm F-D eğrisinin neredeyse düz görünmesi, uç-örneklem etkileşiminin belirgin bir işareti olmamasıdır. Cihazda mevcutsa, bunun çözümü, SPM kafasını rampa boyutundan ~% 10 daha az manuel olarak alçaltmak (prob ucunun çökmesini önlemek için) ve diğer rampa parametrelerini optimize etmeye devam etmeden önce uç-numune etkileşimi nedeniyle kuvvette belirgin bir artış gözlenene kadar tekrarlayarak tekrar rampa yapmaktır (Şekil 5C, D).

Uç aşınması
Şekil 8, deneysel bir ortamda uç aşınmasına bir örnek sunmaktadır. Hızlı (kHz hızı) kuvvet eğrisi tabanlı bir görüntüleme yöntemi kullanarak bir Bakken şeyl numunesinin birkaç geniş alanını görüntülemek için tek, sert, silikon kılavuz çekme modu AFM probu (bkz. Malzeme Tablosuna bakınız) kullanıldı ve BTR yöntemi, uç geometrisini modellemek ve üç ardışık görüntünün her birinden önce ve sonra uç uç yarıçapını tahmin etmek için kullanıldı. İncelenen şeyl örnekleri, (>E ~ 5 GPa) boyunca dağılmış çok daha sert inorganik mineral kapanımları olan bir kil ve organik malzeme matrisinden (E ~ 5 GPa) oluşuyordu. Numune, görüntülenen geniş tarama alanlarında (85 μm x 85 μm) yüzey topografyasında (±2 μm) önemli farklılıklar içerdiğinden, tarama hızı kullanılan cihazda izin verilen minimum değere, 0,1 Hz'ye ayarlanmıştır. 2 kHz'lik bir kuvvet eğrisi alma hızı ve 0,1 Hz'lik bir tarama hızıyla, tek bir 1024 x 1024 piksel görüntü boyunca 20 milyondan fazla uç örneği etkileşimi vardı. Sonuç olarak, prob ucu, numunenin görüntülenmesi sırasında bozulmamış durumuna (Şekil 8A) göre önemli bir aşınma yaşadı ve üç görüntünün sonunda ~11 nm'lik etkili bir uç yarıçapından ~129 nm'ye kadar bir büyüklük sırasına göre arttı (Şekil 8D). İlk görüntüde uç kırılmış gibi görünmektedir, bu da Şekil 8B'de görülen büyük morfolojik değişikliğe neden olmaktadır. Sonraki her görüntüde, uç giderek daha yuvarlak hale gelir, bu da kademeli aşınmanın daha yaygın fenomeninin mükemmel bir örneğidir (tartışmaya bakınız). BTR modellerinden tahmini uç yarıçapları Şekil 8'de yer almaktadır.

Buna karşılık, Şekil 8E, F, 6 ay arayla elde edilen bir elmas uç probunun BTR modellerini (Malzeme Tablosuna bakınız), binlerce nanogirinti ve aralarında meydana gelen yüz milyonlarca kuvvet eğrisi görüntüleme tabanlı uç-numune etkileşimi ile sunmaktadır. 29 nm (Şekil 8E) ve 28 nm (Şekil 8F) tahmini uç yarıçaplarından görülebileceği gibi, prob ucu yarıçapı BTR yönteminin sınırları içinde değişmedi ve elmasın aşırı aşınma direncini vurguladı. Bununla birlikte, elmas uç problarının (tüm AFM probları gibi), uç alanı fonksiyonunu ve etkili sertliği etkileyebilecek gevşek yapışmış döküntülerden kaynaklanan kirlenmeye duyarlı olduğu unutulmamalıdır. Buna göre, numune temizliği, ucun korunması ve doğru nanomekanik ölçümler için hayati önem taşımaktadır.

Uygulama örnekleri
Prob malzemesi bileşimi, konsol yay sabiti ve uç geometrisi ve yarıçapının akıllıca seçilmesiyle, konsol bazlı nanogirinti, hem akışkanda hem de ortam koşullarında kPa'dan GPa'ya kadar değişen elastik modüllü malzemelerin nano ölçekli mekanik özelliklerini ölçmek için kullanılabilir. Konsol tabanlı nanogirinti için mümkün olan çok çeşitli kullanım durumlarından birkaçını vurgulamak için seçilen uygulama örnekleri aşağıdadır.

Biyoyakıt uygulamaları için loblolly çamı mekanik özelliklerinin araştırılması
Loblolly çam ağaçları (Pinus taeda), Güney Amerika Birleşik Devletleri'nde oldukça bol bulunan ve 13 milyon hektardan fazla yer kaplayan hızlı büyüyen bir yumuşak ağaç türüdür³¹. Bollukları nedeniyle, loblolly çam ağaçları, güney ABD'de hem kereste hem de kağıt hamuru ağacı için yaygın olarak kullanılan kritik bir ticari üründür. Ek olarak, ikinci nesil selülozik biyoyakıt üretimi için önemli bir kaynaktırlar³². Daha da önemlisi, 2007 Enerji Bağımsızlığı ve Güvenliği Yasası (EISA) nedeniyle selülozik biyoyakıt hammaddesine olan talep, 2022 yılına kadar ABD ulaştırma endüstrisindeki toplam yenilenebilir yakıt kullanımının 36 milyar galon olması ve 16 milyar galonun selülozik biyokütleden elde edilmesini zorunlu kılmaktadır. Buna göre, loblolly çamının hızlı büyüme hızı ve tarımsal ormancılık projelerine elverişliliği nedeniyle, son yıllarda büyük ilgi gören bir biyoyakıt hammaddesi haline gelmiştir³³. Tek tek ağaçlar, anatomik fraksiyonlar (örneğin, beyaz ağaç, ağaç kabuğu, iğneler) ve hücre alanları (örneğin, iç mekana karşı hücre duvarı) arasındaki değişkenlik de dahil olmak üzere loblolly çamının mekanik özellikleri hakkında bilgi, mekanik işleme ve termokimyasal dönüşümü optimize etmek için biyokütle akışlarının hedeflenen şekilde ayrılmasına izin verebilir³⁴.

Şekil 9, temsili bir AFM topografyası (yükseklik sensörü) görüntüsü (Şekil 9A) ve paslanmaz çelik bir konsol üzerine monte edilmiş ~ 30 nm yarıçaplı eğrilik elmas ucu probu ile 23 yıllık bir loblolly çamı üzerindeki bir daldan elde edilen bir enine kesit beyaz ağaç örneğinin (Şekil 9B) karşılık gelen elastik modül haritasını (Şekil 9B) sunmaktadır (k = 256 N/m). Topografya ve modül haritaları, hızlı kHz hız kuvveti eğrisi tabanlı AFM görüntüleme kullanılarak eşzamanlı olarak oluşturuldu; modül haritası, prob kalibrasyon sabitleri (yani, yay sabiti, sapma hassasiyeti ve uç yarıçapı) için nominal değerlere dayanan yarı nicel sonuçlar sundu ve kuvvet eğrilerini DMT (Derjaguin, Muller ve Toporov) temas mekaniği model^35'e gerçek zamanlı olarak uydurdu. Her üç boyutta da (uzunluk x genişlik x yükseklik) <3 mm olacak şekilde kesilmiş kesitli numuneler, reçine ile sızmadan (bkz. Malzeme Tablosu) ve gece boyunca 60 ° C'de polimerize edilmeden önce, artan konsantrasyonlarda etanol (% 33,% 55,% 70,% 90 ve% 100)³⁶ kullanılarak seri dehidrasyon ile görüntüleme için hazırlanmıştır. Tamamen kürlenmiş reçineye gömülü numuneler önce öğütüldü, daha sonra AFM görüntülemeye uygun düz bir yüzey üretmek için dilim başına 1 μm'den 50-70 nm'ye düşen bir besleme kalınlığı ile ~ 1 mm / s kesme hızında çalışan bir elmas bıçakla ultramikrotomlandı. Bununla birlikte, Şekil 9A'daki renk skalası çubuğundan görülebileceği gibi, bu durumda ortaya çıkan yüzey, belki de numune yüzeyinde ve / veya ultramikrotom bıçağında artık kalıntıların varlığından dolayı, kesitleme sırasında bıçak "gevezeliğine" yol açan, diğer örnekler ise çok daha pürüzsüz yüzey topografyası sergileyen nispeten pürüzlüdür.

Şekil 9C, AFM topografya görüntüsünü Şekil 9A'dan yeniden üretir, ancak ROI içinde seçilen hücre duvarları boyunca gerçekleştirilecek 50 nanogirintiden oluşan sekiz dizinin yerlerini gösteren beyaz artı işaretleri ile, söz konusu projenin amacı, loblolly çamının nanomekanik özelliklerinin çeşitli doku tipleri ve ağaç yaşı arasında nasıl farklılık gösterdiğini anlamaktı. Rampalar için tipik olarak 1 μN'lik bir tetikleme eşiği kullanılmıştır (1 Hz rampa hızında yürütülen 60 nm nominal rampa boyutu), hücre duvarları boyunca ~ 10 nm'lik bir girinti derinliğine (incelenen tüm örneklerde 8 ± 2 nm) veya hücre iç kısımlarında biraz daha derin (14 ± 4 nm) hücre duvarlarından biraz daha yumuşaktır. Her satırdaki girintiler, iyi ayrıldıklarından emin olmak için ≥100 nm aralıklarla yerleştirildi ve iyi karakterize edilmiş yaklaşım ve geri çekilme eğrileri üretmek için rampa başına 1.024 veri noktası toplandı. Hızlı kuvvet eğrisi tabanlı görüntülemeyi bas ve çek konsol tabanlı nanogirinti ile birleştirerek, istatistik üretmek ve hücre yapıları arasındaki modül farklılıklarını belirlemek mümkün oldu. Örneğin, Tablo 1'de gösterildiği gibi, hücre iç kısmının ortalama elastik modülünün, farklı yaşlardaki ağaçların birden fazla dalından türetilen beyaz ağaç örnekleri boyunca hücre duvarının yaklaşık yarısı olduğu bulunmuştur.

Örnek	Yer	E* (GPa)	E (GPa)	Deformasyon (nm)	Sayı (n)
1	İç	1,5 ± 0,4	1.4 ± 0.4	14 ± 2	199
	Duvar	4.7 ± 1.3	4.3 ± 1.3	7 ± 2	202
2	İç	1.3 ± 0.3	1.2 ± 0.3	16 ± 3	198
	Duvar	3.2 ± 0.9	2.9 ± 0.9	9 ± 2	199
3	İç	1.9 ± 0.6	1.7 ± 0.6	12 ± 3	198
	Duvar	5.7 ± 1.2	5.2 ± 1.2	6 ± 1	199
4	İç	2.4 ± 0.8	2.2 ± 0.8	11 ± 3	202
	Duvar	4.2 ± 2.1	3.8 ± 2.1	9 ± 4	193
5	İç	2.6 ± 0.8	2.3 ± 0.8	10 ± 2	198
	Duvar	4.3 ± 1.6	3.9 ± 1.6	7 ± 2	199
Ortalama	İç	1.9 ± 0.6	1.8 ± 0.6	13 ± 3
	Duvar	4.4 ± 1.4	4.0 ± 1.4	8 ± 2

Tablo 1: Loblolly çam elastik modül istatistikleri: hücre duvarlarına karşı hücre içi. Farklı yaşlardaki iki ağaçtan toplanan beş loblolly çam beyazağaç dalı örneği için hücre duvarlarının hücre iç kısımlarına karşı ölçülen elastik modül. Tüm modül değerleri, kuvvet yer değiştirme eğrisinin yaklaşım kısmının DMT modeline sığdırılması ve numune için 0.3'lük bir Poisson oranı varsayılarak hesaplanmıştır. Moduli, her bir numune konumu için ortalama ± standart sapma olarak rapor edilir ve bildirilen sonucu üretmek için analiz edilen kuvvet eğrilerinin sayısı (sayım, n) ile birlikte rapor edilir. Ölçülen indirgenmiş modül (E*), kullanılan elmas ucu indenter için bir Young modülünün 1.140 GPa ve Poisson'un oranının 0.07 olduğu varsayılarak gerçek numune modülüne (E) dönüştürüldü. Ayrıca, 1 μN'lik uygulanan yük için ortalama numune deformasyonu da gösterilmiştir.

Bakken şeylleri üzerinde korelasyonlu nanomekanik ve elektron mikrospektroskopisi
Bakken şeyl yatakları, Amerika Birleşik Devletleri'ndeki Montana ve Kuzey Dakota'daki Williston Havzası'nda ve Kanada'daki Saskatchewan'ın bazı bölgelerinde bulunur. Amerika Birleşik Devletleri'ndeki en büyük ikinci hidrokarbon rezervuarıdır, ancak yatakların incelenmesi hala emekleme aşamasındadır³⁷. Bakken şeylinin bileşim ve termal olgunluğun bir fonksiyonu olarak nanomekanik özelliklerinin araştırılması, Şekil 10'da gösterildiği gibi, AFM konsol bazlı nanogirintinin taramalı elektron mikroskobu (SEM) görüntüleme ve enerji dağıtıcı spektroskopi (EDS) element bileşimi karakterizasyonu ile birlikte lokalize edilmesiyle gerçekleştirilmiştir. Spesifik olarak, element dağılımını karakterize etmek için SEM-EDS haritalaması kullanıldı (Şekil 10C), böylece şeyl matrisi içindeki çeşitli mineral kapanımlarının varlığını ve yerini belirledi. Hızlı (kHz hızı) kuvvet eğrisi tabanlı AFM görüntüleme (Şekil 10B), ikincil elektron (SE) SEM görüntüsünde (Şekil 10A) optik olarak tanımlanabilir bir köken tanımlayarak ve hem AFM hem de SEM^38'in sahne hareketini izleyerek SEM-EDS haritaları ile birlikte lokalize edildi. Yine sert bir paslanmaz çelik konsol üzerine monte edilmiş bir elmas uç probu kullanılarak, ilgilenilen inklüzyonları içeren büyük bölgeler (85 μm x 85 μm) için elastik modüldeki varyasyonların haritalanması mümkün olmuştur (Şekil 10D). Şekil 10D'de sunulan modül haritasının, görüntüleme ve veri toplamadan önce yazılıma uygun prob kalibrasyon sabitleri girilmediğinden, doğası gereği niceliksel olmaktan ziyade nitel olduğunu unutmayın.

Şekil 10B ve Şekil 10D'deki AFM görüntüleri, kullanılan elmas uç probunun dezavantajlarından birini, yani küp köşe ucu geometrisi nedeniyle yüksek en boy oranı özelliklerini (Şekil 10B'deki siyah oval bölgeye bakınız) doğru bir şekilde izleyememesini de vurgulamaktadır. Azaltılmış çözünürlük ve dik özelliklerin doğru bir şekilde izlenememesi, bir Bakken şeyl numunesinin aynı genel alanının küp köşe elmas ucu (Şekil 11A) ve önemli ölçüde daha keskin, daha yüksek en boy oranına sahip sert kılavuz çekme modu silikon AFM probu (Şekil 11B) tarafından görüntülendiği Şekil 11'de daha net bir şekilde görülebilir. Daha spesifik olarak, Şekil 11B'de gösterilen görüntü, Şekil 8A-D'de karakterize edilen prob ile, Şekil 8A'daki BTR modelleri arasında (R = 11 nm) ve Şekil 8B'de (R = 43 nm) elde edilmiştir. Doğrudan karşılaştırma için, Şekil 11C,D görüntü çiftleri, Şekil 11E,F ile birlikte, sırasıyla elmas uç ve silikon prob ile elde edilen aynı örnek yüzey özelliklerinin yakınlaştırılmış görüntülerini sunarak, uç geometrisinin ve yarıçapının görüntü çözünürlüğü ve doğruluğu üzerindeki etkisini gösterir. Şekil 11G, keskin, yüksek ençülü silikon prob (Şekil 8A,B) ile elde edilen yüzey topografyasını ve üst üste bindirilmiş renkli cilt olarak kodlanmış elmas uç probu (Şekil 8E,F) ile elde edilen modül değerlerini birleştiren kompozit bir 3D görüntü sunmaktadır.

Şekil 10 ve Şekil 11'de gösterilen büyük görüntülere ek olarak, tamamen kalibre edilmiş elmas uç probu kullanılarak daha küçük (10 μm x 10 μm) hızlı kuvvet eğrisi tabanlı görüntüler elde edilmiştir. Bu görüntüler, çevredeki organik matrisin özelliklerini daha ayrıntılı olarak araştırmak için optik olarak görünür inorganik mineral kapanımları olmayan alanlara odaklandı. 512 x 512 piksel çözünürlüğü (yani, ~ 20 nm x 20 nm örnekleme pikselleri) kullanılarak, her 10 μm x 10 μm görüntüyle >262.000 ayrı F-D eğrisi yakalandı ve kaydedildi, böylece mükemmel istatistikler elde edildi. F-D verileri, Derjaguin-Muller-Toporov (DMT)³⁵ kontak mekaniği modelini uygulamak için AtomicJ yazılım paketi²³ kullanılarak toplu olarak işlendi ve analiz edildi. Uydurmayı takiben, veriler, hesaplanan bir elastik modül <0 (fiziksel olmayan) veya >30 GPa (çalışma şeylin mineral olmayan kısmına odaklandığından, E << 30 GPa) ile sonuçlanan eğrileri çıkarmak için temizlendi. diğer çalışmalara benzer^39,40 ve ayrıca bir model uyumu olan veriler R² < 0.7. R² kesimi biraz keyfi olsa da, yalnızca modelin açıkça tam olarak sığdıramadığı verileri kaldırmak için seçildi. Görüntüleme alanına büyük bir mineral dahil eden bir aykırı değer hariç, çıkarılan eğriler her görüntü için toplam verilerin% 0,5'inden azını oluşturuyordu. İstatistiksel sonuçların bir özeti Tablo 2'de bulunabilir. Hesaplanan elastik modül, benzer çalışmaların da^39,40 bulduğu aralıkta 3.5 ila 6.1 ^GPa arasında değişmektedir.

Örnek	E (GPa)	Veri Temizleme Sonrası Verim	Sayı (n)
1	6.1 ± 3.8	93.70%	7,36,874
2	5.1 ± 2.6	99.70%	7,84,267
3	3.5 ± 1.9	99.60%	7,83,427

Tablo 2: Bakken şeyllerinin elastik modül istatistikleri. Farklı bileşim ve termal olgunluğa sahip üç Bakken şeyl örneğinde organik matrislerin elastik modülleri ölçüldü. Numune 1 bir kontroldür, numune 2 ve 3 ise termal olgunlaşmayı yapay olarak simüle etmek için sırasıyla 12 saat ve 48 saat boyunca tavlanmıştır. Elastik modüller, her numune konumu için ortalama ± standart sapma olarak raporlanır ve belirtilen metinde açıklanan veri temizleme prosedürü uygulandıktan sonra analize dahil edilen kuvvet eğrilerinin sayısı (sayım, n) bulunur. Hesaplanan ortalama modül (3.5-6.1 GPa), 2.9-11.8 GPa'lık bir modül aralığı bulan Li ve ^ark.40 gibi diğer benzer çalışmalarda bildirilen aralıkta yer almaktadır.

Mezenkimal kök hücre nükleer sertliği dış uyaranlara bağlı olarak değişir
Mezenkimal kök hücreler (MSC'ler), kondrositler, adipositler, osteoblastlar ve miyositler haline gelebilen progenitör hücrelerdir⁴¹. MSC'nin bu çeşitli doku tiplerine farklılaşması, dış hücre zarını fiziksel olarak nükleer membran^41'e bağlayan Hücre İskeleti ve Nükleoiskelet (LINC) kompleksinin Bağlayıcısı aracılığıyla hücre üzerindeki dış mekanik uyaranlardan etkilenir. LINC kompleksi, hücre üzerindeki fiziksel kuvvetleri tespit etmek ve farklılaşma sürecini başlatmak için mekanosensitif faktörlerin β-katenin ve YAP'ın nükleer ithalatını kolaylaştırmak için hücre hücre iskeleti ile etkileşime giren SUN ve Nesprin proteinlerinden oluşur^42,43,44. Hücrelerin mekanostimülasyonundan sonra β-katenin ve YAP'ın nükleer ithalatının yanı sıra, hücre iskeleti de çekirdeğin etrafında F-aktin filamentlerinin oluşumu ve aktin^{44,45,46'nın} nükleer translokasyonu da dahil olmak üzere yeniden düzenlemeye tabi tutulur. Mekanostimülasyon, hücre hücre iskeletinde ve aktinin nükleer girişinde değişiklikler başlattığından, hücrelerin ve çekirdeklerin genel sertliği (modül) etkilenir ve AFM konsol bazlı nanogirinti ile ölçülebilir. Önceki çalışmalar, LINC kompleksinin bozulmasından sonra hücre ve nükleer modülde bir azalma ve MSC'lerin mekanostimülasyonundan sonra hücre ve nükleer modülde ters bir artış tespit ederek bunu doğrulamıştır⁴⁷. Mevcut araştırmalar hala çekirdeğe aktin ithalatı için mekanizmaları ve aktin polimerizasyonunun mekanostimülasyondan sonra hücre ve nükleer modülü nasıl etkilediğini araştırmaktadır.

Canlı hücrelerin mekanik özelliklerini araştırmak için, deneyler tipik olarak PBS olan bir tampon çözeltisinde yapılmalıdır. Sıvıda konsol bazlı nanogirinti iletmek, özellikle MSC'ler (E≈ 2 kPa) gibi çok yumuşak numunelerin ölçümü için benzersiz problemler ortaya çıkarmaktadır. Özellikle, canlı hücrelerin düşük elastik modülü, hücre yapısına verilen stresi azaltmak ve zarın delinmesini önlemek için geniş bir prob yarıçapının kullanılmasını gerektirir. Ek olarak, bu tür düşük elastik modülleri ölçmek için çok düşük yaylı sabit konsollar (k = 0.04 N / m) gereklidir, ancak bu, sıvının viskoz sürüklenmesi nedeniyle yanlış kavrama olasılığını arttırır ve AFM kavrama işleminin ilk hızlı indirme adımı sırasında yumuşak konsolların sapmasına neden olur. Yanlış etkileşimlere yönelik daha yüksek eğilime karşı koymak için, daha büyük bir devreye girme ayar noktası (yani, devreye alma işlemini sonlandırmak için sapma voltajı tetikleme eşiği) kullanmak gerekebilir. Daha yumuşak konsollar genellikle sert konsollardan daha büyük ölçüde elastik olarak deforme olabileceğinden, sıvıda daha yüksek bir kavrama ayar noktası ile yaşanan daha büyük bükülme genellikle bu tür yumuşak problara zarar vermez. Ek olarak, akışkan bir ortamda kullanılan çözeltilerin enkaz ve kabarcıklardan arındırılmış olması zorunludur, çünkü yüzen döküntüler veya kabarcıklar, lazerin sıvı yoluyla PSD'ye iletilmesini geçici olarak engelleyebilir veya konsola yapışabilir ve lazeri bloke edebilir. Lazer ışını ile girişim, ortaya çıkan F-D eğrilerini olumsuz yönde etkiler ve genellikle yanlış çarpışma tespiti veya yanlış müdahale ile sonuçlanır. Son olarak, canlı hücreler üzerindeki nanogirinti, daha sert, cansız malzemelerden daha fazla kullanıcı girdisi gerektirir. Özellikle, hücreler ve akışkan ortamları çok daha dinamik olduğundan, iyi bir F-D eğrisinin elde edilmesini sağlamak için her rampa için probun yüksekliğini aktif olarak ayarlamak gerekebilir.

Canlı hücre nanogirintisinde, daha sert numunelere göre aynı konsol sapmasına neden olmak için genellikle çok daha büyük numune deformasyonuna ihtiyaç vardır. Bu daha büyük deformasyon, Hertz modelinin doğrusal elastikiyet varsayımından sapan deneysel sonuçlara neden olabilir ve bu nedenle doğru F-D analizi⁴⁸ için hiperelastik davranışı hesaba katmak için bir düzeltme faktörünün uygulanması gerekebilir. R _2'nin girincinin yarıçapı ve R_1'in hücrenin yarıçapı olduğu geometrik boyut oranının (bkz. Şekil 12A), elde edilen verilerin Hertz mekaniğine bağlılığını tahmin etmek için kullanılabileceği bulunmuştur. İdeal geometrik boyut oranının β = 0.3 olduğu, β değerlerinin <0.3 olduğu ve elastik modülün hafife alınmasına yol açan β değerlerinin 0.3 > Hertz temas teorisi⁴⁸ ile analiz edildiğinde elastik modülün abartılmasına yol açtığı bulunmuştur. Doğrusal olmayan etkilerden kaçınmanın yaygın bir yolu, deformasyonları küçük tutmaktır. Bu çalışmada girinti derinliği 500 nm-1 μm ile sınırlandırılmıştır.

MSC'ler ve izole çekirdekler üzerinde tek bir nanogirinti deneyi setinin sonuçlarını gösteren temsili bir veri seti Şekil 12B'de gösterilmiştir. Şekil 12B'de sunulan verilerde, önceden kalibre edilmiş (LDV ile yay sabiti ve SEM ile uç yarıçapı), statik ve dinamik suşların hücre ve nükleer mekanik özellikler üzerindeki etkilerini test etmek için kontrol görevi gören bozulmamış canlı MSC'ler ve izole MSC çekirdekleri arasındaki modül farklılıklarını araştırmak için k = 0.04 N / m nominal yay sabitine sahip 5 μm yarıçaplı yarım küre probları kullanılmıştır⁴⁶. Hücreler ve çekirdekler arasındaki farklılıklar ve bunlarla etkileşime girmedeki zorluklar nedeniyle, çıkarılan modül verileri büyük bir varyasyon sergileme eğilimindedir (yani, değerlerin dağılımı). Buna göre, Şekil 12B'deki veri kümesi, toplanan verilerin 75. yüzdelik dilimini sunmaktadır^. Canlı hücreler arasındaki bu doğuştan gelen değişkenlik ve sonuçta ortaya çıkan ölçüm yayılımı nedeniyle, veri analizi ve yorumlama için sağlam istatistikler üretmek amacıyla en az üç biyolojik replikasyona sahip çok sayıda numune üzerinde nanogirinti deneylerinin çoğaltılması önerilir³⁰.

Kolesterol içeren lipit çift katmanlarının mekanik özellikleri
Göz merceği zarlarında bulunan bileşimin tipik bir örneği olan çok yüksek (%>50 mol) kolesterol (Chol) içeriğine sahip desteklenen lipit membranları hazırlandı ve taze parçalanmış muskovit mika⁴⁹ üzerinde inkübe edildi. 1'lik bir Chol/POPC (POPC = 1-palmitoyl-2-oleoyl-glisero-3-fosfokolin) karışım oranında hazırlanan böyle bir desteklenen lipit membranının (SLM) temsili bir AFM topografya görüntüsü Şekil 13A'da, şeklin altında gösterilen görüntüdeki mor çizgi boyunca yükseklik profili ile gösterilmiştir. Şekil 13A'daki SLM, topografya görüntüsünde ayırt edilebilir özelliklerin bulunmamasının kanıtladığı gibi, maruz kalan mika yüzeyini yeterli inkübasyon süresi (~ 25 dakika) ve yeterli bir lipit konsantrasyonu (0.3 mg / mL) ile tamamen kaplamıştır. Benzer şekilde, görüntü boyunca yükseklik profili, membran yüzeyinin pürüzlülüğü ile ilgili yapısal detaylar sağlar ve SLM beklendiği gibi pürüzsüzdür.

Şekil 13B, Şekil 13A'da gösterilen SLM üzerinde yakalanan kuvvet eğrilerinin yaklaşım bölümlerinin bir koleksiyonunu sunmaktadır. SLM'nin mekanik özellikleri ile ilgili daha iyi istatistikler elde etmek için, kuvvet eğrileri, SLM'nin neredeyse tüm genişliğini kapsayan, en az 100 nm aralıklı eşit uzak noktalarda toplandı. Noktalar arasındaki boşluk (girinti derinliğinin ≥10 katı), girintinin birbirine çok yakın olmasını önlemek için seçildi. Kuvvet eğrileri, kuvvetin ~10 nN'den ~5 nN'ye hızla düştüğü kuvvet eğrilerinin yaklaşma bölümündeki ~0 ve ~5 nm ayırma mesafeleri arasındaki süreksizlik veya ani sıçrama ile kanıtlandığı gibi, açık bir atılım olayı gösterir. Şekil 13B'deki yaklaşım eğrilerine dayanarak Şekil 13A'da gösterilen membran için ortalama atılım kuvveti (1'in Chol / POPC karıştırma oranı) 9.25 ± 0.27 nN olarak hesaplanmıştır.

Buna karşılık, Şekil 13C , membranların 1'lik bir Chol / POPC karışım oranında, ancak çok daha düşük bir lipit konsantrasyonunda (~ 15 μg / mL) ve daha kısa bir inkübasyon süresinde (~ 5-6 dakika) ⁴⁹ tekrar inkübe edilmesiyle oluşturulan kısmi membran veya membran yamalarının AFM topografya görüntüsünü göstermektedir. Görüntünün ortasındaki membran yaması boyunca kırmızı çizgi boyunca yükseklik profili şeklin altında gösterilmiştir. Kısmi çift katman boyunca yapılan ölçüm, Şekil 13C'deki siyah kesikli çizgilerle ~ 7 nm olarak gösterilen SLM'nin kalınlığını sağlar. Bununla birlikte, ölçülen bu kalınlık, membran ile mika diski⁵⁰ arasında 1-2 nm'lik bir su tabakası da içerir. Kısmi membranın genellikle mika yüzeyine sadece zayıf bir şekilde tutturulduğu ve bu da tarama sırasında lipit parçacıklarının kısmi membran yamalarının kenarından çıkarılmasına neden olabileceği, ancak biraz daha uzun bir inkübasyon süresi veya görüntüleme kuvvetinin düşürülmesinin bu zorluğu ortadan kaldırabileceği belirtilmelidir.

AFM probunun kalibrasyonu, SLM'nin mekanik özelliklerini doğru bir şekilde ölçmek için çok önemlidir. Özellikle, uç yayı sabiti hava veya sıvı ortamda tutarlı kalmasına rağmen, sapma hassasiyeti, deneylerin yapıldığı aynı ortamda kalibre edilmelidir. Tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için her bir kuvvet eğrisi ediniminden hemen önce sapma hassasiyetini kalibre etmek çok önemlidir, çünkü arka taraf kaplamasının lazer hizalaması ve / veya yansıtıcılığı zaman içinde, özellikle de sıvıda değişebilir. Çok keskin problar, membran kuvveti eğrilerini yakalamak için önerilmez, çünkü SLM'yi kolayca delebilirler ve hatalı bir şekilde düşük bir atılım kuvvetinin ölçülmesine veya hiç kırılmaya neden olmayabilirler. Bununla birlikte, aynı ucun uygun temizlik yapılmadan tekrar tekrar kullanılması, uçta biriken döküntülerin olasılığını artırır ve böylece ucu donuklaştırır veya uç numunesi yapışkan kuvvetlerini etkiler. Yaklaşma kuvveti eğrilerinde belirgin olan atılım olaylarının eksikliği, gerçek membran yerine sadece mika üzerinde itmeye karşılık gelebilir; Bu nedenle, kuvvet eğrilerini yakalamadan önce membran oluşumunun görsel olarak doğrulanması gereklidir.

Şekil 7: Hava ve akışkandaki temsili kuvvet-yer değiştirme (F-D) eğrileri. (A) eşlik eden DMT modeli uyumu ile havada bir loblolly çam ve (B) eşlik eden bir Hertz modeli uyumu ile PBS'de canlı bir MSC çekirdeği üzerinde elde edilen temsili kuvvet eğrileri. A ve B panellerindeki girintiler, karşılık gelen yaklaşım eğrilerinin (mavi izler) temas bölgesinin yakınlaştırılmasını ve buna eşlik eden uyumu (yeşil izler) gösterir. Her panelde, ilk uç-numune temas noktası (montaj algoritması tarafından belirlendiği gibi) yeşil bir elmas ile gösterilirken, dönüş noktası (yani, yaklaşımdan geri çekilmeye veya geri çekilmeye geçiş) bir camgöbeği dairesi ile gösterilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 8: Silikon ile elmas prob ucu aşınmasının karşılaştırılması. (A-D) Silikon prob ucu. Bir uç karakterizasyon numunesinin görüntülenmesini takiben kör uç rekonstrüksiyon yöntemi ile oluşturulan, bir Bakken şeyl numunesinin üç sıralı 85 μm x 85 μm (1024 x 1024 piksel) kuvvet eğrisi tabanlı görüntüleri boyunca yaşanan ilerleyici uç aşınması nedeniyle sert bir konsol silikon uç probunun yarıçapındaki evrimi gösteren bir dizi model (bkz. 0,1 Hz'lik bir çizgi tarama hızında ve 2 kHz'lik kuvvet eğrisi örnekleme hızında (yani, ~ 20 milyon uç-örneklem etkileşimi/görüntü) gerçekleştirilir. (A) Kullanımdan önce alındığı gibi (kutudan çıktığı haliyle) bahşiş. R = 11 nm. (B) Bir görüntüden sonra ipucu (R = 43 nm). (C) İki görüntüden sonra ipucu (R = 94 nm). (D) Üç görüntüden sonra ipucu (R = 129 nm). (E,F) Elmas prob ucu. Aynı elmas uç probunun BTR modelleri (bakınız Malzeme Tablosu) ~ 6 ay arayla elde edilmiştir. E ve F'de gösterilen modelleri üretmek için kullanılan uç görüntülerinin elde edilmesi arasında, prob ile binlerce nanogirinti gerçekleştirildi ve kuvvet eğrisi tabanlı görüntüleme sırasında yüz milyonlarca uç-numune etkileşimi meydana geldi. Bununla birlikte, elmasın sertliği nedeniyle, ~ 30 nm'lik tahmini uç uç yarıçapı, BTR tekniğinin ucun ilk (E) ve takip (F) görüntülerinin elde edilmesi arasındaki belirsizlik sınırları içinde değişmemiştir. Önceki modelde gözlemlenen asperite (panel E'deki siyah daire ile gösterilir) büyük olasılıkla ya BTR yönteminin bir eseridir ya da ucun yanında nano ölçekli bir kirleticinin (örneğin, toz parçacığı) varlığından kaynaklanmaktadır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 9: Bir loblolly çam örneğinin AFM topografyası ve modül haritaları. Hücre duvarlarında konsol bazlı nanogirinti ölçümlerini sağlamak için reçineye gömülü kesitli bir loblolly çam örneği üzerinde havada elde edilen temsili AFM verileri. (A) Hızlı kuvvet eğrisi tabanlı görüntüleme modu ile elde edilen birden fazla hücreyi kapsayan AFM topografi görüntüsü, sahte 3D tasviri olarak sunulur. (B) AFM yazılımı tarafından her pikselde elde edilen kuvvet eğrisini analiz ederek ve verileri DMT modeline uydurarak hücre duvarlarının hücre içlerinden daha sert olduğunu gösteren Elastik veya Young modül haritası. Ölçülen prob kalibrasyon parametrelerinin yerine nominal olarak kullanıldığını, bu nedenle modül değerlerinin kalitatif veya sadece yarı kantitatif olarak ele alınması gerektiğini unutmayın. (C) Girintilerin nano ölçekli hassasiyetle konumlandırılmasını sağlamak için AFM görüntüsünün elde edilmesini takiben seçilen hücre duvarları boyunca 400 nanogirintinin (~ 10 nm ortalama girinti derinliğine karşılık gelen 1 μN tetikleme eşiği ile 60 nm nominal rampa boyutu) gerçekleştirildiği konumları (aralıklı ≥100 nm aralıklı) 50 beyaz artı işaretinden oluşan sekiz satır) gösteren YG'ye genel bakış. Ölçek çubukları = 20 μm (A,B). Kısaltmalar: AFM = atomik kuvvet mikroskobu; DMT = Derjaguin-Muller-Toporov. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 10: Bir Bakken şeyl örneğinin birlikte lokalize AFM ve SEM/EDS'si. (A) Bir Bakken şeyl örneğinin bir kısmının ikincil elektron SEM görüntüsü. (B) A'daki kara kutu ile gösterilen bölgenin AFM topografya görüntüsü. Siyah oval, probun düşük en boy oranının, dik, yüksek en boy oranlı yüzey topografyası özelliğinden ziyade prob yan duvarının görüntülenmesine yol açtığı bir bölgeyi gösterir. (C) A'da gösterilen SEM görüntüsü için elde edilen EDS element kompozisyon haritası. (D) AFM topografya görüntüsünün B'de elde edilmesi sırasında oluşturulan AFM türevi elastik veya Young modül haritası, A-D görüntülerinin merkezine mineral katılımını gösteren, çevredeki organik matristen önemli ölçüde daha zordur. Ölçek çubukları = 50 μm. Kısaltmalar: AFM = atomik kuvvet mikroskobu; SEM = taramalı elektron mikroskobu; EDS = enerji dağıtıcı spektroskopi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 11: Prob ucu yarıçapının ve şeklinin yüksek en-boy oranı özelliklerinin görünümüne etkisi. Bir Bakken şeyl numunesinde aynı konumu görüntülemek için (A) bir R≈ 30 nm düşük en-boy oranı (uç yarım açısı = 47°) elmas uç probu (bkz. Malzeme Tablosu) veya (B) bir R≈ 10 nm yüksek en-boy oranı (uç yarım açısı ≈ 19°) sert silikon prob (nominal k = 200 N/m; bkz. Malzeme Tablosu) kullanılarak elde edilen özellik çözünürlüğünün karşılaştırılması. (C-F) A ve B'deki mavi (C,D) ve turuncu (E,F) kutulu bölgelerin yakınlaştırılmış görüntüleri, eğriliğin daha büyük yarıçapı düşük en-boy oranlı elmas uç probu (C,E) veya daha keskin, daha yüksek en-boy oranlı sert silikon kılavuz çekme modu probu (D,F) ile elde edilen, daha büyük uç yarıçapı nedeniyle elmas uç probu ile elde edilen AFM topografya görüntüsünde uç yanak yapıtlarının ve yarım açı. C-F'de vurgulanan alanlar, daha kolay donuklaşan, başlangıçta keskin bir silikon prob veya körelmiş, aşınmaya dayanıklı bir elmas uç probu arasındaki yanal çözünürlük, doğru izleme ve görüntü doğruluğu açısından dengeleri gösteren dik, derin, iyi benzeri özellikler içerir. (G) Keskin, daha yüksek en-boy oranına sahip sert silikon prob ile elde edilen AFM topografyasının, elmas uç probu ile numunenin aynı alanının hızlı kuvvet eğrisi görüntülemesinden elde edilen modül verileri (üst üste bindirilmiş renkli cilt) ile birleştirilmesiyle oluşturulan kompozit 3D görüntü. A ve B'deki mavi ve beyaz kutularla vurgulanan özellikler G ile de belirtilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 12: Hücreler veya çekirdekler üzerinde konsol bazlı nanogirinti. (A) Düz, sert bir substrat üzerinde bulunan yarıçapı R ₁ olan bir hücre, yarıçapı R2 olan küresel bir girinti tarafından d derinliğine girintilenir. Bu rakam Ding ve ^ark.48'den çoğaltılmıştır. (B) Fare MSC'leri üzerinde AFM konsol tabanlı nanogirinti deneylerinden ve fare MSC'lerinden ekstrakte edilen izole çekirdeklerden elde edilen temsili modül ölçümlerinin bireysel değer grafikleri. Toplam 10 hücre ve 10 çekirdek, her biri 500-600 nm girinti derinliğinde beş kez ölçüldü (Hertz temas mekaniği modelinin kullanımına izin vermek için seçildi). Elde edilen ham F-D eğrisi verileri, elastik modülü hesaplamak için Atomic J²³ kullanılarak işlendi. Hücrelerin doğuştan gelen büyük değişkenliği nedeniyle, verilerin yüzde 75'lik^{bir yüzdesi} çizilir. Hücre ve izole çekirdekler, elastik modülde istatistiksel bir fark göstermedi, ölçülen ortalama modül sırasıyla 0.75 ± 0.22 kPa ve 0.73 ± 0.22 kPa idi. Mekanik stimülasyon, protein nakavtları ve kimyasal işlemler nedeniyle nükleer sertlikteki farklılıkları belirlemek için benzer veriler toplanmış ve analiz edilmiştir. Kısaltmalar: MSC = mezenkimal kök hücre; AFM = atomik kuvvet mikroskobu; F-D = kuvvet-yer değiştirme. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 13: Lipid çift katmanlarının morfolojisi ve nanomekanik özellikleri. (A) Uzun inkübasyon süresi (~25 dakika) ve yüksek lipit konsantrasyonu (0.3 mg/mL) ile maruz kalan mika yüzeyinin tamamında oluşan 1 karıştırma oranında Chol/POPC'den oluşan tam destekli bir lipit membranının (SLM) minimum yükseklik değişimini gösteren AFM topografya görüntüsü. Görüntünün ortasındaki mor çizgi boyunca uzanan yükseklik profili, membran yüzeyinin yapısal ayrıntılarını sağlayan şeklin altında gösterilmiştir. Beklendiği gibi, SLM son derece pürüzsüzdür. (B) A'da gösterilen SLM üzerinde yakalanan kuvvet eğrilerinin yaklaşma bölümlerinin toplanması. Kuvvet eğrileri, neredeyse tüm SLM'yi kapsayan eşit mesafeli noktalarda ≥100 nm aralıklarla toplandı. Kuvvet eğrileri, kuvvet eğrilerinin yaklaşma bölümündeki süreksizlik veya ani sıçrama ile kanıtlandığı gibi, açık bir atılım olayı gösterir. Ortalama atılım kuvveti 9.25 ± 0.27 nN'dir. (C) A ^49'a göre daha kısa inkübasyon süresi (~5-6 dakika) ve daha düşük lipit konsantrasyonu (~15 μg/mL) ile 1 Chol/POPC karıştırma oranında membranların inkübe edilmesiyle oluşan kısmi membran veya membran yamaları. Yamadaki kırmızı çizgi boyunca yükseklik profili resmin altında gösterilmiştir. Kısmi çift katmanlı, yükseklik profilindeki siyah kesikli çizgilerle gösterilen SLM'nin kalınlığının ölçülmesini sağlar. Ölçülen kalınlığın ayrıca membran ile mika diski⁵⁰ arasında 1-2 nm'lik bir su tabakası içerdiğini unutmayın. Bu rakam Elsevier'in izniyle Khadka ve ^ark.49'dan uyarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Numune hazırlama
Havadaki nanogirinti için, yaygın hazırlama yöntemleri arasında kriyoseksiyon (örneğin, doku numuneleri), taşlama ve / veya parlatma ve ardından ultramikrotoming (örneğin, reçineye gömülü biyolojik numuneler), iyon frezeleme veya odaklanmış iyon demeti hazırlama (örneğin, parlatma için uygun olmayan yarı iletken, gözenekli veya karışık sertlik numuneleri), mekanik veya elektrokimyasal parlatma (örneğin, metal alaşımları) veya ince film biriktirme (örneğin, atomik tabaka veya kimyasal buhar birikimi, moleküler ışın epitaksisi). Amaç, minimum yüzey pürüzlülüğüne sahip bir numune oluşturmaktır (ideal olarak nm ölçeğinde, amaçlanan girinti derinliğinin ≤0,1 katı). Önceki yöntemlerin birçoğunda, numunenin daha sonra yüksek saflıkta filtrelenmiş (örneğin, HPLC sınıfı) çözücü ile durulanması ve / veya sonikleştirilmesi ve partikül kalıntılarını gidermek için ultra yüksek saflıkta (% 99.999) azot (_N2) gazı ile kurutulması gerekebilir. Alternatif olarak, pullar (örneğin, 2D malzemeler) veya parçacıklar (örneğin, nanopartiküller veya mikrokapsüller) spin ile kaplanabilir veya yüksek saflıkta filtrelenmiş çözücüler kullanılarak hazırlanan çözeltilerden dökülebilir. Bu durumda amaç, numune üzerinde rastgele seçilen herhangi bir alanda görüş alanı içinde üst üste binmeyen birden fazla pul veya parçacık üreten bir yüzey yoğunluğu elde etmektir. Sıvıda nanogirinti için (genellikle canlı kalmak için tampon çözeltisi gerektiren biyolojik numuneler için kullanılır), numunelerin pürüzsüz (nanometre ölçekli yüzey pürüzlülüğü) substrat (örneğin, mikroskop slaytı, Petri kabı veya taze parçalanmış muskovit mika) üzerinde biriktirilmesi veya hazırlanması gereklidir^46,47,49.

Prob seçiminde dikkat edilmesi gereken noktalar
Uygun bir probun seçimi, F-D eğrilerinin kantitatif analizi için son derece önemlidir, çünkü uç-numune etkileşimi, konsol bazlı nanogirintide ölçülen temel özelliktir. Belirli bir deney için bir prob seçerken aşağıdaki sorular özellikle önemlidir. Numunenin beklenen (veya ölçülen) yüzey pürüzlülüğü ve elastik modül aralığı nedir? Yüksek pürüzlülüğe sahip numuneler, dik özellikleri izlerken uçta bulunan yanal kuvvetlerin artması nedeniyle daha pürüzsüz numunelere kıyasla daha hızlı aşınmaya neden olabilir ve ayrıca uç kırılma olaylarının olasılığını artırabilir⁵³. Aynı şekilde, numune ne kadar sert olursa, prob ucunu o kadar hızlı takar. Ek olarak, kaç tane görüntü ve / veya nanogirinti gereklidir? Daha az görüntüleme ve girinti ile daha az uç aşınması beklenebilir. Aşağıda daha ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, elmas benzeri karbon (DLC) kaplamalar kullanılarak uç aşınması azaltılabilir veya elmas uç probları kullanılarak neredeyse tamamen ortadan kaldırılabilir (neredeyse sonsuz prob ömrü ile zaman içinde dengelenen yüksek satın alma maliyeti ile).

Uygun bir prob seçiminde dikkat edilmesi gereken bir diğer husus, ilgilenilen özelliklerin boyutudur. Nanogirinti için, söz konusu numune (ler) ve istenen bilgi içeriği için gereken uzamsal çözünürlüğü korurken mümkün olan en büyük uç boyutunu kullanmak genellikle en iyisidir, çünkü daha büyük uçların kırılma nedeniyle ani uç geometrisi değişiklikleri yaşama olasılığı daha düşüktür ve ayrıca daha düşük aşınma oranları sergileyecektir⁵⁴. İletken AFM⁵⁵, Kelvin prob kuvvet mikroskobu (KPFM) 56 veya manyetik kuvvet mikroskobu (MFM) ⁵⁷ gibi nanogirinti ile birlikte lokalize edilecek başka AFM yöntemleri olup olmadığını düşünmek de önemlidir. Bunlar gibi ek metrolojiler kullanılacaksa, prob ucunun elektriksel olarak iletken veya manyetik olması gerekebilir, bu da malzeme bileşimini ve dolayısıyla sertlik, aşınma direnci ve uç yarıçapı dahil olmak üzere bir dizi özelliği etkileyecektir. Benzer şekilde, girinti akışkan olarak yapılacaksa, probun yansıtıcı arka taraf kaplamasının bileşimi (varsa), korozyona dayanıklı olması gerektiğinden (örneğin, sıvı probları için bir Au arka taraf kaplaması yaygındır) bir başka önemli husustur. Son olarak ve belki de en önemlisi, prob konsolunun yay sabiti, ölçülmesi beklenen elastik modül aralığıyla eşleştirilmelidir. Yay sabiti numune modülü ile iyi eşleşmezse, iki durumdan biri oluşabilir. Konsol çok sertse, çok az sapma ölçülür veya hiç sapma ölçülmez ve karakterizasyon imkansız hale gelir; Tersine, konsol çok yumuşaksa, numuneyi mekanik özelliklerini ölçecek kadar deforme edemez.

Uç aşınması
Aşınma çeşitli şekillerde tanımlanabilir; AFM prob ucu aşınmasının burada tartışılması için, herhangi bir malzeme kaybı olmaksızın plastik deformasyon nedeniyle prob ucunun yüzey topografyasında herhangi bir değişiklik ve fiziksel etkileşimler nedeniyle malzemenin yüzeyden herhangi bir şekilde çıkarılması olarak tanımlanacaktır⁵⁸. Daha geniş anlamda, aşınma oksidasyon ve hidrasyon gibi kimyasal reaksiyonları da içerebilir. Normal AFM uygulamalarında, yanal uzamsal çözünürlük genellikle uç yarıçapı⁵⁹ ile sınırlıdır ve uç-numune etkileşimi birincil ölçülen özelliktir. Uç yarıçapı, uç-numune sisteminin temas mekaniğinin modellenmesinde ve daha sonra mekanik özelliklerin belirlenmesinde önemli bir parametre olduğundan, nanogirinti deneyleri yapılırken uç aşınması özellikle önemlidir ve nanogirinti sonuçlarının doğru yorumlanması için önemli bir sınırlamadır⁵³. Uç aşınmasının normalde kademeli doğası nedeniyle (uç kırılma olaylarının yanı sıra), tek bir nanogirinti döngüsü (yani rampa) nedeniyle uç aşınmasını ölçmek mümkün değildir. Ek olarak, prob ucunun nanogirintideki numuneye göre dik hareketi (hızlı kuvvet eğrisi tabanlı görüntülemenin indirgenmesi), uç aşınmasının birincil modu tipik olarak tarama modları⁶⁰ sırasında gelişen kesme kuvvetleri olduğundan, aşınma oranını azaltmaya kendini borçludur. Bu nedenle, nanogirinti deneylerinde uç aşınmasının birincil kaynağı, ilk prob kalibrasyonundan sonra (özellikle sapma hassasiyeti ve uç yarıçapı ölçümleri) ancak nanogirintiden önce yapılan herhangi bir görüntülemedir. Bu nedenle, silikon veya silikon nitrür probları kullanılıyorsa, yukarıda açıklanan yöntemlerden birini (örneğin, SEM analizi veya BTR) kullanarak herhangi bir uç aşınmasını izlemek ve hesaba katmak için uç yarıçapının her deneyden önce ve sonra kontrol edilmesi önerilir.

Prob malzemeleri
Elmas benzeri karbon (DLC)
DLC kaplamalı prob uçları veya elmas uçlar kullanılarak, uç aşınması büyük ölçüde azaltılabilir veya tamamen reddedilebilir⁵³. Bu alternatif uç malzemelerinin gelişmiş aşınma direnci, özellikle çok sert malzemelerin mekanik özelliklerinin ölçümü için çok caziptir. DLC prob uçlarının, normal silikon prob uçlarına kıyasla aşınma direncinde 1.600 kat artış gösterebileceği gösterilmiştir⁵⁴. Aşınma direncindeki bu dramatik artış birkaç faktöre bağlanabilir. İlk olarak, DLC'de (C-C ve C = C) bulunan bağlar ve silikonla olan arayüzü (Si-O, Si-C), herhangi bir element çiftinin en güçlü bağlarından bazılarıdır ve silikon uçlarda bulunan Si-Si bağlarından çok daha güçlüdür. DLC ayrıca sürtünmeyi azaltma etkisine sahiptir, bu da uç içindeki kayma gerilmelerini azaltır ve böylece aşınmayı azaltır. Ek olarak, DLC yüzey kimyası silikon uçtan farklıdır, çünkü silikon uçlar ortam nemi koşullarında tribokimyasal aşındırma yaşayabilirken, DLC uçları bunu yapmaz (veya en azından birincil aşınma moduna kıyasla anlamlı bir şekilde değil)⁵⁴. DLC kaplı uçların birincil dezavantajı (standart kaplamasız silikon uçlara göre artan fiyatın ötesinde), kaplamanın kendisinden dolayı artan uç yarıçapıdır. Çoğu DLC prob ucu yarıçapı ≥30 nm'dir, oysa DLC kaplamalı olmayan uçlar^{yarıçap 61'de} güvenilir bir şekilde 1-2 nm'ye ulaşabilir. Bununla birlikte, nanogirinti deneyleri için özellik ölçümlerindeki hatayı azaltmak için daha büyük bir uç yarıçapı sıklıkla arzu edilebilir, çünkü prob kusurları veya asperiteleri nedeniyle ideal alan derinliği fonksiyonu ile gerçek alan derinliği fonksiyonu arasındaki nano ölçekli tutarsızlıklar, daha büyük göreceli hata nedeniyle daha küçük yarıçap problarıyla yapılan ölçümleri orantısız bir şekilde etkileyecektir. Ek olarak, üstün aşınma direncine rağmen, DLC kaplama sonunda lekelerde aşınabilir ve bu da maruz kalan silikon çekirdek ile kalan DLC kaplama arasında diferansiyel aşınmaya neden olabilir. Ne yazık ki, DLC kaplamanın aşınma direnci, kaplamanın tek başına gerçek sertliğinden ziyade kaplamanın silikon uca yapışmasıyla da sınırlı olabilir.

Elmas
Elmas, dünyadaki en sert ve aşınmaya en dayanıklı malzemelerden biri olarak bilinir. Bununla birlikte, uç aşınmasını araştırmak için kasıtlı bir girişimde büyük (60 μN) kuvvetler kullanıldığında elmas uçlarda hala önemli aşınmaların meydana gelebileceği gösterilmiştir⁶². Tersine, uca uygulanan kuvvetlerin çok daha az olduğu normal nanogirinti ve görüntüleme senaryolarında, elmas uç aşınması ile ilgili titiz çalışmalar yapılmamıştır. Bununla birlikte, Şekil 8E, F'de görüldüğü gibi, aynı elmas prob ucunun BTR modellemesi, 6 ay arayla aynı uç karakterizasyon örneğinde aynı koşullar altında neredeyse ayırt edilemez uç şekli modelleri üretti (yani, fark edilebilir aşınma kanıtı yok). Birinci ve ikinci BTR görüntüleri arasında, prob binlerce nanogirinti gerçekleştirmek için kullanıldı ve ahşap (loblolly çam), şeyl, yüksek sıralı pirolitik grafit (HOPG) ve çeşitli grafen ince filmler dahil olmak üzere çeşitli sert malzemeleri (E > 15 GPa) görüntülerken yüz milyonlarca uç-numune etkileşimine maruz kaldı. Önemli ölçüde, tahmini uç yarıçapı, BTR yönteminin^{hata 63'ü} içinde olan Şekil 8E, F'deki iki görüntü arasında ~ 1 nm değişti. Tam bir çalışma olmasa da, bu karşılaştırma normal deneysel nanogirinti (ve hatta görüntüleme) koşulları altında bir elmas probun mükemmel dayanıklılığını göstermektedir. Elmas uçların kullanımıyla ilişkili en büyük dezavantajlar (pahalı ön maliyetin ötesinde), artan uç yarıçapı ve bazı yönlerden daha fazla endişe verici olarak, ticari olarak temin edilebilen elmas uçların küp köşe geometrisinin düşük en boy oranıdır. Şekil 11A,B, nominal uç yarıçapı 8 nm ve ortalama yarım açısı ~19° olan keskin bir silikon prob ile elde edilen bir Bakken şeyl numunesinin aynı alanının yan yana, karşılaştırmalı AFM görüntülerini, nominal uç yarıçapı 40 nm ve ortalama yan açısı 47° olan bir elmas uç probu ile birlikte sunmaktadır. Büyütülmüş alanlar karşılaştırıldığında (Şekil 11C,D ve Şekil 11E,F), elmas uç probunun görüntüdeki daha dik (daha yüksek en boy oranı) özellikleri çözemediği ve doğru bir şekilde izleyemediği açıkça görülmektedir. Bunun yerine, dik özelliklerin mevcut olduğu yerlerde, uç yanak üst kenarla temas eder ve AFM sistemi, uç ucu yüzeyle tekrar temas edene ve normal izlemeye devam edene kadar probun yan duvarını izler.

Yay sabiti/modül eşleştirme
Yukarıda belirtildiği gibi, prob konsolunun yay sabiti, ölçülmesi beklenen elastik modül aralığıyla eşleştirilmelidir. Uygun bir prob seçimine yardımcı olmak için, Tablo 3 , nanogirinti⁵² için sıklıkla kullanılan ~ 30-40 nm yarıçap prob uçları durumunda, birkaç MPa'dan 100 GPa'ya kadar değişen beklenen numune elastik modüllerinin seçilen geniş aralıkları için uygun önerilen yaklaşık nominal konsol yay sabitlerini sunmaktadır. Alt yaylı sabit problar (k < 0,1 N/m), hücreler gibi daha yumuşak malzemeler (kPa aralığı) için mevcuttur.

Yay Sabiti (N/m)	Beklenen Numune Modülü Aralığı
0.25	≤ 15 MPa
5	5 – 500 MPa
40	200 – 8.000 (0.2 – 8 GPa)
200	1.000 – 50.000 (1 – 50 GPa)
450	10.000 – 100.000 (10 – 100 Genel Not Ortalaması)

Tablo 3: Çeşitli modül aralıklarını ölçmek için ideal prob yayı sabitleri. Birkaç MPa'dan 100 GPa'ya kadar değişen aralıklarda elastik modüllerin optimum ölçümü için yaklaşık nominal prob yayı sabitleri, ~ 30-40 nm^52'lik tipik bir prob yarıçapı varsayarsak.

Yay sabitine ek olarak, biyolojik materyallerin özel durumunda, görüntüleme ve nanogirinti sırasında uygulanan uç yarıçapı ve kuvvetleri, hasarı önlemek için dikkatlice düşünülmelidir. Temsili sonuçlar bölümünde sunulan kolesterol içeren lipit çift katmanlarının mekanik özelliklerinin ölçülmesini içeren uygulama örneğinde , lipit çift katmanlarındaki atılım kuvvetinin analizi için özellikle nispeten keskin (10 nm) bir uç kullanılmıştır. Buna karşılık, malzeme yatırım getirisi yeterince büyükse (örneğin, hücreler ve hücre çekirdekleri için olduğu gibi) ve delinme potansiyeli ile ilgili endişeler varsa, temsili sonuçlar bölümündeki uygulama örneklerinden birinde açıklanan MSC çekirdekleri üzerindeki sertlik ölçümlerinde kullanılanlar gibi daha büyük mikron ölçekli yarım küre uçları idealdir ve yumuşak için mükemmel sonuçlar sağlar, canlı hücreler ve izole çekirdekler gibi kırılgan örnekler. Kain ve ark., bu tür numuneler için mümkün olan en yüksek ölçüm hassasiyetini elde etmek için prob yarıçapı ve yay sabitinin optimum kombinasyonunun nasıl seçileceğine dair derinlemesine bir tartışma sunmaktadır⁶⁴.

Prob kalibrasyonu
Sapma hassasiyeti
Sapma hassasiyeti, Z-piezo'nun hareketini (ve böylece sonsuz sert bir substrat üzerine girinti yaparken, küçük sapmaların sınırında çalışmayı varsayarsak, konsol sapmasını) PSD^65'teki voltajda ölçülen bir değişiklikle ilişkilendirir. Sapma hassasiyeti (bazen ters optik kol hassasiyeti [InvOLS] olarak da adlandırılır) nm / V veya V / nm olarak bildirilebilir. En yaygın sapma hassasiyeti kalibrasyon yöntemlerine genel bir bakış aşağıda verilmiştir.

Sert yüzey teması
Işın sıçramalı lazer / AFM probu / PSD sisteminin sapma hassasiyetini belirlemek için en kolay ve en popüler yöntem, uygun bir şekilde adlandırılan "sert yüzey teması" yöntemi^65'tir. Sadeliği, AFM kontrol yazılımı iş akışlarına entegrasyon kolaylığı ve yerinde doğası, sert yüzey temas yönteminin çekiciliğine ve yaygın kullanımına katkıda bulunur. Bu yöntemi uygulamak için, AFM prob ucu konsoldan çok daha sert bir malzemeye karşı yükseltilir. Kuvvet-yer değiştirme eğrisinin temas halindeki kısmının eğimi (PSD'de nm cinsinden Z-piezo hareketinin bir fonksiyonu olarak dikey sapma hata sinyalinin Volt'u olarak görüntülenir) veya uygulanan voltaj) daha sonra sapma hassasiyetini verir (Şekil 3A). Sert bir substratın kullanılması, ölçülen tüm sapmanın, numune deformasyonunun evrişimi ve konsol yer değiştirmesinden ziyade konsol bükülmesinden kaynaklanmasını sağlar. Yumuşak konsollar söz konusu olduğunda (örneğin, k < 10 N/m), silikon (E ≈ 170 GPa)²⁷ veya mika¹⁷ kolayca erişilebilir ve kolayca kullanılan malzemelerdir (veya alternatif olarak cam, E≈ 70 GPa veya mikroskop sürgüsü veya Petri kabı üzerinde hareketsiz hale getirilmiş hücreler için uygun şekilde sert plastik), daha sert konsollar için, bazı nanogirinti deneyleri için kullanılanlar gibi (örneğin, k > 200 N / m; Tablo 3), safir (E≈ 345 GPa)^26,66 numune deformasyonu oluşmadığından emin olmak için kullanılması gerekebilir. Bu yöntem kuvvet-yer değiştirme ölçümüne bağlı olduğundan, AFM tarayıcısının Z-piezo'su ya kapalı döngü yükseklik sensörü kullanmalı ya da çeşitli yükseklik standartları kullanılarak iyi kalibre edilmelidir (açık döngü modunda çalışıyorsa). Sert yüzey teması yönteminde hataya en büyük katkı, termal dalgalanmalar nedeniyle lazer noktasının konsol üzerindeki hareketidir. Konsol sıcaklığındaki değişiklikler en yaygın olarak algılama lazerinden kaynaklanır, ancak çevredeki elektroniklerde Joule ısıtması da katkıda bulunabilir. Konsol ve ortam havası arasında 6 ° C'lik genel sıcaklık farkları bildirilmiştir, bu da birkaç mikron^67'lik lazer lekesi kaymalarına neden olabilir. Herhangi bir ısıtmayı hesaba katmak için, en iyi ve en doğru sonuçlar için konsolların çevresiyle termal dengeye girmesini sağlamak için ilk lazer leke hizalamasından sonra ≥30 dakika beklemeniz önerilir. Her bir hassasiyet ölçümü için yaklaşımın eğimlerinin ve geri çekilme eğrilerinin ortalamasının alınması, herhangi bir uç sürtünmesi veya kayma etkisini hesaba katacaktır ve mümkünse yürürlüğe girmelidir⁶⁸. Ek olarak, birden fazla hassasiyet ölçümünün ortalamasının alınması, ölçümün güvenilirliğini ve tekrarlanabilirliğini ölçmeye yardımcı olacaktır. İyi hassasiyet ölçümleri% ≤1'lik sapmalara neden olmalı ve kalibrasyonun etkinliğini en üst düzeye çıkarmak için beklenen deneysel nanogirintilerle yaklaşık olarak aynı sapmada yapılmalıdır⁶⁹. Sert yüzeyle temas yönteminin en büyük dezavantajı, kalibrasyon için gerekli fiziksel temasın kırılgan silikon uçlara potansiyel olarak zarar verebilmesidir (örneğin, donuklaşma veya çift uç gibi uç artefaktlarının oluşturulması).

Termal gürültü yöntemi
Sapma hassasiyetini belirlemek için termal gürültü yöntemi, konsol yayı sabitinin önceden kalibrasyonunu ve konsol^67'nin termal gürültü spektrumunu ölçme yeteneğini gerektirir. Termal gürültü yöntemi genellikle modern AFM kontrol yazılımına entegre edilir ve hem yay sabitinin hem de sapma hassasiyetinin hızlı analizi ve hesaplanması için Sader yöntemiyle (aşağıya bakınız) birlikte kullanılabilir. Bununla birlikte, azalan titreşim genliği nedeniyle daha sert (k > 10 N/m) konsollarda termal gürültü yöntemini kullanmak zor veya imkansız olabilir. Ek olarak, termal gürültü yönteminin bildirilen göreceli belirsizliği, yukarıda açıklanan sert yüzey temas yöntemine kıyasla ~%²⁰ oranında önemli ölçüde daha büyüktür. Bu teknik, aşağıda açıklanan yay sabitini belirlemek için termal ayar yöntemi kullanılıyorsa kullanılamaz⁶⁷.

Bahar sabiti
Konsol yay sabitlerini ölçmek için altın standart lazer Doppler vibrometridir (LDV) ve artık her bir prob için üretici tarafından sağlanan LDV türevi yay sabiti kalibrasyon bilgileriyle birlikte gelen ticari olarak temin edilebilen birçok prob bulunmaktadır (bkz. Bununla birlikte, konsol yay sabitinin doğru ölçümü, kantitatif nanomekanik ölçümler için mutlak bir gereklilik olsa da, kalibre edilmemiş problar için tipik laboratuvarda bunu yapmak için pratik yöntemler çok çeşitlidir ve biraz karmaşık olabilir. Bu nedenle, burada en yaygın iki yerinde yay sabit kalibrasyon yöntemine kısa bir genel bakış, ek yöntemlerin bir listesi ve daha fazla bilgi için başvurabileceğiniz uygun literatür alıntıları ile birlikte sunulmaktadır.

Termal ayar yöntemi
Muhtemelen günümüzün ticari AFM'lerinde mevcut olan en yaygın yöntem olan konsol yay sabitlerini belirlemek için termal ayar yöntemi, birçok sistem için kontrol yazılımına yerleştirilmiştir. Düşük konsol sapma algılaması ve sınırlı elektronik bant genişliği nedeniyle daha sert konsollar (k > 10 N/m) için ideal olmasa da, termal ayar yönteminin uygulanması nispeten kolaydır ve çok çeşitli uç geometrileri⁷¹ için geçerlidir. Termal ayar yöntemi, konsol sisteminin termal gürültü spektrumunun ölçümünü ve montajını kullanır, ardından konsol genellikle basit bir harmonik osilatör⁷² olarak modellenen konsol ile konsol potansiyel enerjisini hesaplamak için eşbölümleme teoreminin uygulanmasını izler. Termal ayar yöntemi, yumuşak problar için ~% 5 -% 10'luk bir hataya sahiptir ve herhangi bir konsol şekli^73,74 için geçerlidir. Daha ayrıntılı bilgi için, bu bölümde belirtilen referanslara bakın.

Sader yöntemi
Sader yöntemi, çoğu modern AFM'nin kontrol yazılımına sıklıkla entegre edilen başka bir yöntemdir^75,76,77. Sader yöntemi, konsol yay sabitini hesaplamak için konsol yay sabitini hesaplamak için konsol plan, görünüm boyutları ve kalite faktörü ile birlikte akışkan bir ortamda (genellikle hava veya su) titreşirken bir konsol tarafından deneyimlenen hidrodinamik yükü kullanır. Sader yöntemi, konsol yay sabiti⁷⁴ için ~% 10 -% 15'lik bir hataya yol açar. "Orijinal yöntem"76,78, "genel yöntem"^79, genel yöntem ^77'nin bir uzantısı ve cihaza özgü dokümantasyon ile ilgili ilgili makaleler daha fazla ayrıntı sağlayabilir.

Diğer yöntemler
Bu makalenin kapsamı dışında kalan AFM konsollarının yay sabitini belirlemek için geliştirilmiş ve uygulanmış birkaç yöntem daha vardır. Bu yöntemlerin hiçbirinin uygulanması Sader veya termal ayar kalibrasyon yöntemleri kadar kolay veya yaygın olmasa da, her birinin kendine özgü avantajları ve dezavantajları vardır; atıf yapılan literatür, bunların uygulanması ve uygulanması ile ilgili ayrıntılı bilgi vermektedir. Özellikle, Sikora birçok yay sabit kalibrasyon yönteminin mükemmel bir incelemesini sağlar ve konuyla ilgili mükemmel bir kaynaktır⁷². Yay sabitlerini belirlemek için kullanılan diğer yöntemlerin kapsamlı olmayan bir listesi arasında lazer Doppler vibrometri (LDV)73,74,80, mikro-elektrik-mekanik sistemler (MEMS) tabanlı cihazlar⁸¹, referans konsol 82,83, ilave kütle (hem dinamik ⁷⁵ hem de statik ⁸⁴), hassas denge^85,86, elektromanyetik aktüasyon ⁸⁷ ve sonlu elemanlar analizi (FEA) bulunmaktadır ^88,89.

Uç yarıçapı
Uç yarıçapını belirlemek için yaygın yöntemler hem ikincil elektron SEM görüntülemeyi hem de kör uç rekonstrüksiyon yöntemini (BTR) içerir.

SEM analizi
İkincil elektron SEM görüntüleme, 1 nm'ye kadar çözünürlük sağlayabilir ve aşınmanın ilerici görüntülerinin doğrudan ve kolayca karşılaştırılmasını sağlar. SEM görüntülemenin bir dezavantajı, yalnızca son derece deneysel kombine AFM-SEM araçları⁹⁰ bulunduğundan, AFM probunun tipik olarak sökülmesi ve analiz için SEM'e taşınması gerektiğidir, bu da hem zaman alıcı hem de potansiyel olarak probu kontaminasyona maruz bırakabilir. SEM'in bir diğer dezavantajı, ortaya çıkan görüntünün doğal olarak ucun 2D projeksiyonu olması ve nicel 3D bilgi bulunmamasıdır. Karşılaştırmalı sonuçların anlamlı olması için probu her seferinde aynı yönde hizalamaya özen gösterilmelidir, çünkü elektron ışınının olay açısındaki küçük değişiklikler bile prob ucunun görünür boyutunu ve şeklini değiştirebilir. Son olarak, SEM görüntüleme, görüntüyü bulanıklaştırabilecek veya prob ucunda fiziksel değişikliklere neden olabilecek şarj efektleri ve karbon kontaminasyonu ile uğraşabilir.

Kör uç rekonstrüksiyonu
SEM'in aksine, BTR yöntemi, 3D uç geometrisinin, probun yarıçapından çok daha küçük çok sayıda keskin (yüksek en boy oranı) özelliğe sahip bir numunenin görüntülenmesine dayanarak modellendiği yerinde bir tekniktir. Bu yöntem işe yarar, çünkü AFM'de gözlemlenen görüntü her zaman prob ucu şeklinin ve numune özellik şeklinin bir evrişimidir, bu nedenle son derece keskin özellikleri sonsuz keskinlikte modelleyerek uç şekli tahmin edilebilir. Ne yazık ki, sonsuz keskin sivri uçların (yani, uç yarıçapından çok daha küçük yüzey özellikleri) varsayımına ek olarak, BTR tekniği görüntüleme gürültüsü ve tarama parametrelerinden etkilenebilir, bu nedenle çok benzer görüntüleme parametreleri kullanılarak karşılaştırmalı görüntüler elde edilmelidir. Ek olarak, geometrisini yeniden yapılandırmak için ucun birden fazla "görüntüsü" kullanıldığından, uç şeklinin doğrudan bire bir ters hesaplanması imkansızdır. Doğası gereği, BTR yöntemi kullanıcıyı yalnızca pratik olarak uç şekli^63'ün üst sınırı hakkında bilgilendirebilir ve BTR yöntemini uygulamak için probun görüntülenmesi eylemi uç aşınmasına neden olabilir (örneğin, prob ucunun donuklaşması veya yontulması).

Bağıl kalibrasyon
Bazen, belirli bir prob özelliği kolayca ve doğru bir şekilde ölçülemez. Örneğin, daha sert konsolların yay sabitinin, bant genişliği ve sapma sınırlamaları nedeniyle termal ayar yöntemiyle ölçülmesi zor veya imkansızdır⁹¹. Yukarıda tartışıldığı gibi, yay sabitini belirlemek için başka yöntemler de mevcuttur, ancak termal ayar yöntemi birçok modern AFM'ye entegre edildiğinden, genellikle basit günlük kullanım için uygulanır. Benzer şekilde, PSD üzerindeki lazer hareketinin prob konsolunun fiziksel sapmasına dönüştürülmesi için deneylerden önce sapma hassasiyeti her zaman kalibre edilmelidir. Bununla birlikte, pratik olarak, uç yarıçapının ölçülmesi en çok zaman alan kalibrasyon adımıdır ve prob ucuna zarar verme olasılığı en yüksek olanıdır. Uç yarıçapını SEM veya BTR yoluyla doğrudan ölçmek mümkün değilse, minimum yüzey pürüzlülüğüne (ideal olarak atomik olarak düz) sahip standart bir referans numunesi ve beklenen deneysel modüle yakın iyi bilinen bir modülün mevcut olması koşuluyla, etkili uç yarıçapını belirlemek için alternatif olarak göreceli bir kalibrasyon prosedürü kullanılabilir. Bağıl kalibrasyon için bu tür ideal referans standartlarının örnekleri arasında muskovit mika 17,92,93,94,95 ve HOPG ⁹⁶ bulunur^, ancak aynı zamanda kPa ila MPa aralığında modüllü daha yumuşak numuneler için uygun referans standartlarının belirlenmesindeki zorluğu vurgulamaya da hizmet eder. Bağıl kalibrasyon yapmak için, önce sapma hassasiyeti ana protokolde açıklandığı gibi kalibre edilmelidir. İkincisi, prob için nominal yay sabiti girilmeli (genellikle prob ile birlikte verilmelidir) veya yukarıda açıklanan yöntemlerden biriyle ölçülmelidir. Üçüncü adım, uygun parametreler kullanılarak modül referans standardı numune yüzeyinde girintilendirmedir. Son olarak, toplanan F-D eğrisi verileri analiz edilmeli ve deneysel olarak ölçülen indirgenmiş modül beklenen indirgenmiş modülle eşleşene kadar uç yarıçapı parametresi ayarlanmalıdır. Kalibrasyonun ilgili olması için ilgili deneysel numuneye girinti yapılırken bu derinlik korunduğundan, referans numunede elde edilen ortalama deformasyon derinliğine dikkat edilmelidir. Şimdi, ilgili numune üzerinde girinti oluşabilir ve rampa parametreleri, modül standart referans malzemesinde elde edilen deformasyon derinliğine uyacak şekilde ayarlanabilir.

Bağıl kalibrasyon yönteminin bir avantajı, sapma hassasiyetinin, yay sabitinin ve uç yarıçapı^52'nin yanlış kalibrasyonundan kaynaklanan potansiyel birikmiş hataları önlemesidir. Ek olarak, belki de BTR yönteminden biraz daha hızlı ve proba zarar verme olasılığı daha düşüktür. Bağıl kalibrasyon yönteminin en büyük dezavantajları şunlardır: 1) nm- ila Angstrom ölçekli yüzey pürüzlülüğüne ve deneysel numune ile aynı prob ile analiz edilebilen ilgili numuneninkine benzer iyi bilinen mekanik özelliklere sahip yüksek kaliteli bir referans numuneye duyulan ihtiyaç ve 2) kalibrasyonun geçerli olması için hem referans hem de deneysel numunelerde aynı veya çok benzer deformasyon derinliğinin elde edilmesi gerekliliği. Buna göre, mümkünse uç yarıçapının doğrudan ölçülmesi tercih edilir.

Veri analizi
Ölçülen F-D eğrilerinden numunenin mekanik özelliklerini belirlemek için kullanılan analiz yöntemi, nanogirinti verilerinin kalitesi kadar önemlidir. Kuvvet-yer değiştirme ilişkilerini değişen temel varsayımlara dayanarak modelleyen birkaç ortak temas mekaniği teorisi vardır (ve bu nedenle farklı senaryolarda uygulanabilir). Bu temas mekaniği modelleri arasında Hertz 97, Sneddon 28, JKR (Johnson, Kendall ve Roberts)⁹⁸, DMT (Derjaguin, Muller ve Toporov)^35,99, MD (Maugis-Dugdale)100 ve MYD (Muller, Yushchenko ve Derjaguin)^101,102 bulunmaktadır. Çeşitli temas mekaniği modellerinin derinlemesine bir analizi ve karşılaştırılması ve analiz için uygulamaları başka bir yerde sunulmuştur 29,30,103,104. Bu makalenin kapsamı dışında olsa da, Tablo 4 en yaygın temas mekaniği modellerinden bazılarına kısa bir genel bakış sunmaktadır. Özellikle, JKR, DMT ve diğerleri gibi daha karmaşık modeller, uç-numune yapışmasının etkilerini içerir 30,35,98,99,100,101,102,103,104, önemli olabilir ve genellikle kuvvet eğrisinde negatif sapmanın ortaya çıkmasıyla kolayca tanımlanabilir (bkz. Şekil 3). Uygulamada, seçilen analiz modeli, toplanan F-D verilerine uymak ve elastik modül gibi mekanik özellikleri belirlemek için kullanılır. Verileri düzgün bir şekilde sığdırmak için, ilk temas noktasını veya deneysel verilerin modelle en büyük korelasyona sahip kısmına uyan etkili bir temas noktasını belirlemek için düz bir taban çizgisi gereklidir.

Teori	Uygulanabilirlik	Varsayım	Sınırlama
Hertz	Basit; genellikle sıvıdaki numuneler için kullanılır.	Yapışma yok.	Yapışkan kuvvetlerin bulunduğu sistemler için geçersizdir.
Derjaguin-Muller-Toporov (DMT)	Küçük deformasyonlarla sert.	Temas bölgesinde kısa menzilli yapışma artı temas bölgesi dışında uzun menzilli yapışma.	Kısıtlı geometri, temas alanının hafife alınmasına neden olabilir.
Johnson-Kendall-Roberts (JKR)	Büyük deformasyonlarla yumuşak.	Sadece temas bölgesindeki kısa menzilli yapışkan kuvvetler.	Yapışma nedeniyle yükü hafife alabilir.
Maugis – Dugdale (MD)	Bu genel çözüm diğer yapıştırıcı modellerini kapsar.	Çatlak olarak modellenmiş uç örneği arabirimi.	Parametrik denklemleri içeren analitik çözüm.

Tablo 4: Ortak temas mekaniği modelleri. Uygulanabilirlik, varsayımlar ve sınırlamalar ile seçilmiş ortak temas mekaniği modelleri belirtilmiştir.

F-D eğrilerini analiz etmek için yukarıda belirtilen modellerin pratik uygulaması, kısa sürede binlerce veya milyonlarca eğrinin büyük ölçekli toplu işlenmesini sağlamak ve sonuçlar üzerinde istatistiksel analiz yapmak için bilgisayar yazılımının kullanılmasını gerektirir. Şirket içi yazılı kod genellikle F-D verilerinin analizinde kullanılır ve çeşitli AFM üreticileri de yazılım paketleri sağlar. Bununla birlikte, açık kaynaklı doğası, kullanım kolaylığı ve ayrıntılı ek bilgileri nedeniyle, yazarlar AtomicJ^23'ün kullanılmasını önermektedir. Program, yukarıda açıklanan teorilerden herhangi birini ve diğerlerini kullanarak F-D verilerinin basit ve doğru bir şekilde analiz edilmesini sağlar. Kod açık kaynak olduğundan, sıfırdan karmaşık kod oluşturmaya gerek kalmadan belirli kullanım durumları için işlemek ve özelleştirmek kolaydır. AtomicJ yazılım paketi hakkında ayrıntılı bilgi için Hermanowicz et ^al.23'e bakın.

Sonuç olarak, probun dikkatli bir şekilde kalibre edilmesiyle, bir AFM prob ucu tarafından bir numune yüzeyine uygulanan temas alanı ve kuvvet, nano ölçekli mekanik özelliklerin, özellikle de elastik modülün belirlenmesini sağlamak için ölçülebilir. AFM konsol tabanlı nanogirintiyi hem yumuşak hem de sert numunelerde havada veya sıvıda başarılı bir şekilde uygulamak için en iyi uygulamaları vurgulayan genelleştirilmiş bir protokol, kPa'dan GPa'ya kadar değişen elastik modüllerle, sağlanan temsili örneklerle sunulmuştur. Prob seçimi (numune yüzey pürüzlülüğü, özellik boyutları, prob en boy oranı ve uç aşınması dahil), prob kalibrasyonu ve veri analizi (temas mekaniği modelleri ve ölçüm istatistikleri dahil) gibi önemli hususlar tartışılmıştır. Son olarak, AFM kaynaklı nanomekanik haritaların SEM / EDS gibi bileşimsel bilgi sağlayan diğer karakterizasyon teknikleriyle birlikte lokalizasyonunun yanı sıra, tekniğin ek sinerjik uygulamalarına örnekler sağlamak için AFM konsol tabanlı nanogirinti yoluyla elastik modül (yani, lipit çift katmanlı kopma kuvveti) dışındaki bir nanomekanik özelliğin ölçülmesine bir örnek gösterilmiştir. Birlikte ele alındığında, burada verilen örnekler ve tartışmalar, hemen hemen her örnek tipinin mekanik özelliklerini ölçmek için AFM konsol tabanlı nanogirinti kullanmak isteyen araştırmacılar için bir giriş noktası sağlamalıdır.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Atomic force microscope	Bruker	Dimension Icon	Uses Nanoscope control software, including PeakForce Quantitative Nanomechanical Mapping (PF-QNM), FastForce Volume (FFV), and Point-and-Shoot Ramping experimental workspaces
AtomicJ	American Institute of Physics	https://doi.org/10.1063/1.4881683	Flexible, powerful, free open source Java-based force curve analysis software package. Supports numerous contact mechanic models, such as Hertz, Sneddon DMT, JKR, Maugis, and cone or pyramid (including blunt and truncated). Also includes a variety of initial contact point estimation methods to choose from. Supports batch processing of data and subsequent statistical analysis (e.g., averages, standard deviations, histograms, goodness of fit, etc.). Literature citation is: P. Hermanowicz, M. Sarna, K. Burda, and H. Gabry, “AtomicJ: An open source software for analysis of force curves” Rev. Sci. Instrum. 85: 063703 (2014), https://doi.org/10.1063/1.4881683
Buffer solution (PBS)	Fisher Chemical (NaCl), Sigma Aldrich (KCl), Fisher BioReagents (Na2HPO4 and KH2PO4)	S271 (>99% purity NaCl), P9541 (>99% purity KCl), BP332(>99% purity Na2HPO4), BP362 (>99% purity KH2PO4)	Phosphate buffered saline (PBS) was prepared in the laboratory as an aqueous solution consisting of 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, and 1.8 mM KH2PO4 dissolved in ultrapure water. Reagents were measured out using an analytical balance, and glassware was cleaned with soap and water followed by autoclaving immediately prior to use.
Chloroform
Diamond tip AFM probe	Bruker	PDNISP	Pre-mounted factory-calibrated cube corner diamond (E = 1140 GPa) tip AFM probe (nominal R = 40 nm) with a stainless steel cantilever (nominal k = 225 N/m, f0 = 50 kHz). Spring constant is measured at the factory (k = 256 N/m for the probe, Serial #13435414, used here) and calibration data (including AFM images of indents showing probe geometry) is provided with the probe.
Diamond ultramicrotome blade	Diatome	Ultra 35°	2.1 mm width. Also used a standard glass blade for intial rough cut of sample surface before transitioning to diamond blade for final surface preparation
Epoxy	Gorilla Glue	26853-31-6	Epoxy resin and hardner were mixed in a 1:1 ratio, a small drop was placed on a stainless steel sample puck (Ted Pella), and V1 grade muscovite mica (Ted Pella) was attached to create an atomically flat surface for preparation of phospholipid membranes.
Ethanol
LR white resin, medium grade (catalyzed)	Electron Microscopy Sciences	14381	500 mL bottle, Lot #150629
Mesenchymal stem cells (MSCs)	N/A	N/A	MSCs for nanomechanical studies were primary cells harvested from 8-10 week old male C57BL/6 mice as described in Goelzer, M. et al. "Lamin A/C Is Dispensable to Mechanical Repression of Adipogenesis" Int J Mol Sci 22: 6580 (2021) doi:10.3390/ijms22126580 and Peister, A. et al. "Adult stem cells from bone marrow (MSCs) isolated from different strains of inbred mice vary in surface epitopes, rates of proliferation, and differentiation potential" Blood 103: 1662-1668 (2004), doi:10.1182/blood-2003-09-3070.
Modulus standards	Bruker	PFQNM-SMPKIT-12M	Used HOPG (E = 18 GPa) and PS (E = 2.7 GPa). Also contains 2x PDMS (Tack 0, E = 2.5 MPa; Tack 4, E = 3.5 MPa), PS-LDPE (E = 2.0/0.2 GPa), fused silica (E = 72.9 GPa), sapphire (E - 345 GPa), and tip characterization (titanium roughness) sample. All samples come pre-mounted on a 12 mm diameter steel disc (sample puck).
Muscovite mica	Ted Pella	50-12	12 mm diameter, V1 grade muscovite mica
Nanscope Analysis	Bruker	Version 2.0	Free AFM image processing and analysis software package, but designed for, and proprietary/limited to Bruker AFMs; similar functionality is available from free, platform-independent AFM image processing and analysis software packages such as Gwyddion, WSxM, and others. Has built-in capabilities for force curve analysis, but AtomicJ is more flexible/full featured (e.g., more built-in contact mechanics models to choose from, statistical analysis of force curve fitting results, etc.) for force curve analysis and handles batch processing of force curves.
Phospholipids: POPC, Cholesterol (ovine)	Avanti Polar Lipids	POPC: CAS # 26853-31-6, Cholesterol: CAS # 57-88-5	POPC lipid dissolved in chloroform (25 mg/mL) was obtained from vendor and used without further purification. Cholesterol powder from the same vendor was dissolved in chloroform (20 mg/mL).
Probe holder (fluid, lipid bilayers)	Bruker	MTFML-V2	Specific to the particular AFM used; MTFML-V2 is a glass probe holder for scanning in fluid on a MultiMode AFM.
Probe holder (fluid, MSCs)	Bruker	FastScan Bio Z-scanner	Used with Dimension FastScan head (XY flexure scanners). Serial number MXYPOM5-1B154.
Probe holder (standard, ambient)	Bruker	DAFMCH	Specific to the particular AFM used; DAFMCH is the standard contact and tapping mode probe holder for the Dimension Icon AFM, suitable for nanoindentation (PF-QNM, FFV, and point-and-shoot ramping)
Sample Puck	Ted Pella	16218	Product number is for 15 mm diameter stainless steel sample puck. Also available in 6 mm, 10 mm, 12 mm, and 20 mm diameters at https://www.tedpella.com/AFM_html/AFM.aspx#anchor842459
Sapphire substrate	Bruker	PFQNM-SMPKIT-12M	Extremely hard surface (E = 345 GPa) for measuring deflection sensitivity of probes (want all of the deflection to come from the probe, not the substrate). Part of the PF-QNM/modulus standards kit.
Scanning electron microscope	Hitachi	S-3400N-II	Located at Boise State. Used to perform co-localized SEM/EDS on all samples except additively manufactured (AM) Ti-6Al-4V.
Silicon AFM probes (standard)	NuNano	Scout 350	Standard tapping mode silicon probe with reflective aluminum backside coating; k = 42 N/m (nominal), f0 = 350 kHz. Nominal R = 5 nm. Also available uncoated or with reflective gold backside coating. Probes with similar specifications are available from other manufacturers (e.g., Bruker TESPA-V2).
Silicon AFM probes (stiff)	Bruker	RTESPA-525, RTESPA-525-30	Rotated tip etched silicon probes with reflective aluminum backside coating; k = 200 N/m (nominal), f0 = 525 kHz. Nominal R = 8 nm for RTESPA-525, R = 30 nm for RTESPA-525-30. Spring constant of each RTESPA-525-30 is measured individually at the factory via laser Doppler vibrometry and supplied with the probe.
Silicon carbide grit paper (abrasive discs)	Allied	50-10005	120 grit
Silicon nitride AFM probes (soft, large radius hemispherical tip)	Bruker	MLCT-SPH-5UM, MLCT-SPH-5UM-DC	Also MLCT-SPH-1UM-DC. New product line of factory-calibrated (probe radius and spring constants of all cantilevers) large radius (R = 1 or 5 mm) hemispherical tip (at the end of a 23 mm long cylindrical shaft) probes. DC = drift compensation coating. 6 cantilevers/probe (A-F). Nominal spring constants: A, k = 0.07 N/m; B, k = 0.02 N/m; C, k = 0.01 N/m; D, k = 0.03 N/m; E, k = 0.1 N/m; F, k = 0.6 N/m.
Silicon nitride AFM probes (soft, medium sharp tip)	Bruker	DNP	4 cantilevers/probe (A-d). Nominal spring constants: A, k = 0.35 N/m; B, k = 0.12 N/m; C, k = 0.24 N/m; D, k = 0.06 N/m. Nominal radii of curvature, R = 10 nm.
Silicon nitride AFM probes (soft, sharp tip)	Bruker	ScanAsyst-Air	Nominal values: resonance frequency, f0 = 70 kHz; spring constant, k = 0.4 N/m; radius of curvature, R = 2 nm. Designed for force curve based AFM imaging.
Superglue	Henkel	Loctite 495	Cyanoacrylate based instant adhesive. Lots of roughly equivalent products are readily available.
Syringe pump	New Era Pump Systems	NE1000US	One channel syringe pump system with infusion and withdrawal capacity
Tip characterization standard	Bruker	PFQNM-SMPKIT-12M	Titanium (Ti) roughness standard. Part of the PF-QNM/modulus standards kit.
Ultrahigh purity nitrogen (UHP N2), 99.999%	Norco	SPG TUHPNI - T	T size compressed gas cylinder of ultrahigh purity (99.999%) nitrogen for drying samples
Ultramicrotome	Leica	EM UC6	Equipped with a glass blade (standard, for intial sample preparation) and a diamond blade (for final preparation)
Ultrapure water	Thermo Fisher	Barnstead Nanopure Model 7146	Model has been discontinued, but equivalent products are available. Produces ≥18.2 MΩ*cm ultrapure water with 1-5 ppb TOC (total organic content), per inline UV monitoring. Includes 0.2 µm particulate filter, ion exchange columns, and UV oxidation chamber.
Variable Speed Grinder	Buehler	EcoMet 3000	Used with silicon carbide grit papers during hand polishing.
Vibration isolation table (active)	Herzan	TS-140	Used with Bruker MultiMode AFM. Sits on a TMC 65-531 vibration isolation table. Bruker Dimension Icon AFM utilizes strictly passive vibration isolation (comes from manufacturer with custom acoustic hood, air table, and granite slab).
Vibration isolation table (passive)	TMC	65-531	35" x 30" vibration isolation table with optional air damping (disabled). Used with Bruker MultiMode AFM. Herzan TS-140 "Table Stable" active vibration control table is located on top.