Atomic Force Microscopy Cantilever-Based Nanoindentation: Mekaniske egenskapsmålinger på nanoskala i luft og væske

Summary

Kvantifisering av kontaktområdet og kraften påført av et atomkraftmikroskop (AFM) sondespiss til en prøveoverflate muliggjør bestemmelse av mekaniske egenskaper på nanoskala. Beste praksis for å implementere AFM cantilever-basert nanoindentasjon i luft eller væske på myke og harde prøver for å måle elastisk modul eller andre nanomekaniske egenskaper diskuteres.

Abstract

Et atomkraftmikroskop (AFM) måler fundamentalt samspillet mellom en nanoskala AFM-sondespiss og prøveoverflaten. Hvis kraften påført av sondespissen og dens kontaktområde med prøven kan kvantifiseres, er det mulig å bestemme nanoskala mekaniske egenskaper (f.eks. Elastisk eller Youngs modul) av overflaten som undersøkes. En detaljert prosedyre for å utføre kvantitative AFM-utkragingsbaserte nanoindentasjonseksperimenter er gitt her, med representative eksempler på hvordan teknikken kan brukes til å bestemme elastiske moduler av et bredt utvalg av prøvetyper, alt fra kPa til GPa. Disse inkluderer levende mesenkymale stamceller (MSC) og kjerner i fysiologisk buffer, harpiksinnebygde dehydrerte loblolly furutverrsnitt og Bakken-skifer med varierende sammensetning.

I tillegg brukes AFM cantilever-basert nanoindentasjon til å undersøke bruddstyrken (dvs. gjennombruddskraft) av fosfolipid-dobbeltlag. Viktige praktiske hensyn som metodevalg og utvikling, sondevalg og kalibrering, interesseområdeidentifikasjon, prøveheterogenitet, funksjonsstørrelse og sideforhold, spissslitasje, overflateruhet og dataanalyse og målestatistikk diskuteres for å hjelpe riktig implementering av teknikken. Endelig demonstreres samlokalisering av AFM-avledede nanomekaniske kart med elektronmikroskopiteknikker som gir ytterligere informasjon om elementær sammensetning.

Introduction

Å forstå de mekaniske egenskapene til materialer er en av de mest grunnleggende og essensielle oppgavene innen engineering. For analyse av bulkmaterialegenskaper er det mange metoder tilgjengelig for å karakterisere de mekaniske egenskapene til materialsystemer, inkludert strekktester¹, kompresjonstester² og tre- eller firepunkts bøyetester (bøye)³. Selv om disse mikroskalatestene kan gi uvurderlig informasjon om bulkmaterialegenskaper, utføres de vanligvis til svikt, og er derfor ødeleggende. I tillegg mangler de den romlige oppløsningen som er nødvendig for å nøyaktig undersøke mikro- og nanoskalaegenskapene til mange materielle systemer som er av interesse i dag, for eksempel tynne filmer, biologiske materialer og nanokompositter. For å begynne å løse noen av problemene med storskala mekanisk testing, hovedsakelig dens destruktive natur, ble mikrohardhetstester vedtatt fra mineralogi. Hardhet er et mål på motstanden til et materiale mot plastisk deformasjon under spesifikke forhold. Generelt bruker mikrohardhetstester en stiv sonde, vanligvis laget av herdet stål eller diamant, for å rykke inn i et materiale. Den resulterende fordypningsdybden og / eller området kan deretter brukes til å bestemme hardheten. Flere metoder har blitt utviklet, inkludert Vickers⁴, Knoop⁵ og Brinell⁶ hardhet; Hver gir et mål på materialhardhet i mikroskala, men under forskjellige forhold og definisjoner, og produserer som sådan bare data som kan sammenlignes med tester utført under de samme forholdene.

Instrumentert nanoindentasjon ble utviklet for å forbedre de relative verdiene oppnådd via de ulike mikrohardhetstestmetodene, forbedre den romlige oppløsningen som er mulig for analyse av mekaniske egenskaper, og muliggjøre analyse av tynne filmer. Det er viktig at ved å benytte metoden som først ble utviklet av Oliver og Pharr⁷, kan elastikken eller Youngs modul, E, av et prøvemateriale bestemmes via instrumentert nanoindentasjon. Videre, ved å bruke en Berkovich tresidig pyramidal nanoindenter-sonde (hvis ideelle spissområdefunksjon samsvarer med Vickers firesidige pyramideprobe)⁸, kan direkte sammenligning mellom nanoskala og mer tradisjonelle mikroskala hardhetsmålinger gjøres. Med veksten i populariteten til AFM, begynte AFM cantilever-basert nanoindentation å få oppmerksomhet også, spesielt for å måle de mekaniske egenskapene til mykere materialer. Som et resultat, som vist skjematisk i figur 1, er de to mest brukte teknikkene i dag for å forhøre og kvantifisere nanoskala mekaniske egenskaper instrumentert nanoindentasjon (figur 1A) og AFM utkragingsbasert nanoindentasjon (figur 1B) ⁹, hvorav sistnevnte er fokus for dette arbeidet.

Figur 1: Sammenligning av instrumenterte og AFM utkragebaserte nanoindentasjonssystemer. Skjematiske diagrammer som viser typiske systemer for å gjennomføre (A) instrumentert nanoindentasjon og (B) AFM utkragingsbasert nanoindentasjon. Denne figuren ble modifisert fra Qian et ^al.51. Forkortelse: AFM = atomkraftmikroskopi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Både instrumentert og AFM utkragingsbasert nanoindentasjon benytter en stiv sonde for å deformere en prøveoverflate av interesse og overvåke den resulterende kraften og forskyvningen som en funksjon av tid. Vanligvis spesifiseres enten den ønskede belastningen (dvs. kraft) eller (Z-piezo) forskyvningsprofilen av brukeren via programvaregrensesnittet og styres direkte av instrumentet, mens den andre parameteren måles. Den mekaniske egenskapen som oftest oppnås fra nanoindentasjonseksperimenter er den elastiske modulen (E), også referert til som Youngs modul, som har trykkenheter. Den elastiske modulen til et materiale er en grunnleggende egenskap knyttet til bindingsstivheten og er definert som forholdet mellom strekk- eller trykkspenning (σ, den påførte kraften per arealenhet) til aksial belastning (ε, proporsjonal deformasjon langs innrykksaksen) under elastisk (dvs. reversibel eller midlertidig) deformasjon før utbruddet av plastisk deformasjon (ligning [1]):

(1)

Det skal bemerkes at fordi mange materialer (spesielt biologiske vev) faktisk er viskoelastiske, består den (dynamiske eller komplekse) modulen i virkeligheten av både elastiske (lagring, i fase) og viskøse (tap, ute av fase) komponenter. I praksis er det som måles i et nanoindentasjonseksperiment den reduserte modulen, E *, som er relatert til den sanne prøvemodulen av interesse, E, som vist i ligning (2):

(2)

Hvor _E-spiss og ν-spiss er henholdsvis den elastiske modulen og Poissons forhold mellom nanoindenterspissen, og ν er det estimerte Poisson-forholdet mellom prøven. Poissons forhold er det negative forholdet mellom den tverrgående og aksiale belastningen, og indikerer dermed graden av tverrgående forlengelse av en prøve ved å bli utsatt for aksial belastning (f.eks. under nanoindentasjonsbelastning), som vist i ligning (3):

(3)

Konverteringen fra redusert til faktisk modul er nødvendig fordi a) noe av den aksiale belastningen som formidles av indenterspissen, kan konverteres til tverrgående belastning (dvs. prøven kan deformeres via ekspansjon eller sammentrekning vinkelrett på belastningsretningen), og b) innrykksspissen ikke er uendelig hard, og dermed resulterer innrykk av prøven i en viss (liten) mengde deformasjon av spissen. Merk at i tilfelle hvor E-spissen_>> E ( dvs. indenterspissen er mye hardere enn prøven, noe som ofte er sant når du bruker en diamantsonde), forenkles forholdet mellom den reduserte og faktiske prøvemodulen sterkt til E ≈ E * (1 - v²). Mens instrumentert nanoindentasjon er overlegen når det gjelder nøyaktig kraftkarakterisering og dynamisk område, er AFM utkragingsbasert nanoindentasjon raskere, gir størrelsesordener større kraft og forskyvningsfølsomhet, muliggjør høyere oppløsning avbildning og forbedret innrykk lokalisering, og kan samtidig sonde nanoskala magnetiske og elektriske egenskaper⁹. Spesielt er AFM cantilever-basert nanoindentasjon overlegen for kvantifisering av mekaniske egenskaper ved nanoskala av myke materialer (f.eks. Polymerer, geler, lipid-dobbeltlag og celler eller andre biologiske materialer), ekstremt tynne (sub-μm) filmer (hvor substrateffekter kan spille inn avhengig av innrykksdybde) ^10,11 og suspenderte todimensjonale (2D) materialer^12,13,14 som grafen ^15,16, glimmer 17, sekskantet boritrid (h-BN)18, eller overgangsmetall dichalcogenides (TMDC; f.eks. MoS₂)¹⁹. Dette skyldes dens utsøkte kraft (sub-nN) og forskyvningsfølsomhet (sub-nm), noe som er viktig for nøyaktig å bestemme det første kontaktpunktet og forbli innenfor det elastiske deformasjonsområdet.

I AFM utkragingsbasert nanoindentasjon aktiveres forskyvning av en AFM-sonde mot prøveoverflaten av et kalibrert piezoelektrisk element (figur 1B), med den fleksible utkragingen som til slutt bøyes på grunn av den resistive kraften som oppleves ved kontakt med prøveoverflaten. Denne bøyningen eller avbøyningen av utkragingen overvåkes vanligvis ved å reflektere en laser fra baksiden av utkragingen og inn i en fotodetektor (posisjonsfølsom detektor [PSD]). Sammen med kunnskapen om utkragingsstivhet (i nN/nm) og avbøyningsfølsomhet (i nm/V), er det mulig å konvertere denne målte utkrageavbøyningen (i V) til kraften (i nN) som påføres prøven. Etter kontakt gir forskjellen mellom Z-piezo-bevegelsen og utkragingsavbøyningen prøveinnrykksdybden. Kombinert med kunnskapen om spissområdefunksjonen gjør dette det mulig å beregne kontaktområdet for spissprøven. Hellingen til kontaktdelene av de resulterende kraftavstands- eller kraftforskyvningskurvene (F-D) kan da passe ved hjelp av en passende kontaktmekanikkmodell (se dataanalysedelen av diskusjonen) for å bestemme prøvens nanomekaniske egenskaper. Mens AFM cantilever-basert nanoindentation har noen klare fordeler over instrumentert nanoindentation som beskrevet ovenfor, presenterer det også flere praktiske implementeringsutfordringer, for eksempel kalibrering, spissslitasje og dataanalyse, som vil bli diskutert her. En annen potensiell ulempe med AFM cantilever-basert nanoindentasjon er antagelsen om lineær elastisitet, da kontaktradiusen og innrykksdybdene må være mye mindre enn indenterradiusen, noe som kan være vanskelig å oppnå når man arbeider med nanoskala AFM-sonder og / eller prøver som viser betydelig overflateruhet.

Tradisjonelt har nanoindentasjon vært begrenset til individuelle steder eller små rutenettinnrykkeksperimenter, hvor et ønsket sted (dvs. interesseområde [ROI]) er valgt og et enkelt kontrollert innrykk, flere innrykk på ett sted atskilt med litt ventetid, og / eller et grovt rutenett av innrykk utføres med en hastighet i størrelsesorden Hz. Nylige fremskritt innen AFM tillater imidlertid samtidig oppkjøp av mekaniske egenskaper og topografi gjennom bruk av høyhastighets kraftkurvebaserte bildebehandlingsmoduser (referert til av forskjellige handelsnavn avhengig av systemprodusenten), hvor kraftkurver utføres med en kHz-hastighet under belastningskontroll, med maksimal spissprøvekraft brukt som bildesettpunkt. Point-and-shoot-metoder har også blitt utviklet, noe som gjør det mulig å skaffe seg et AFM-topografibilde etterfulgt av etterfølgende selektiv nanoindentasjon på interessepunkter i bildet, som gir nanoskala romlig kontroll over nanoinnrykkplassering. Selv om det ikke er hovedfokus for dette arbeidet, presenteres spesifikke utvalgte applikasjonseksempler på både kraftkurvebasert avbildning og punkt-og-skyt-utkragingsbasert nanoindentasjon i de representative resultatene, og kan brukes sammen med protokollen som er skissert nedenfor hvis tilgjengelig på den aktuelle AFM-plattformen som brukes. Spesielt skisserer dette arbeidet en generalisert protokoll for den praktiske implementeringen av AFM cantilever-basert nanoindentation på ethvert dyktig AFM-system og gir fire brukseksempler (to i luft, to i væske) av teknikken, inkludert representative resultater og en grundig diskusjon av nyansene, utfordringene og viktige hensyn for å lykkes med å bruke teknikken.

Protocol

MERK: På grunn av det store utvalget av kommersielt tilgjengelige AFM og mangfoldet av prøvetyper og applikasjoner som finnes for utkragingsbasert nanoindentasjon, er protokollen som følger med vilje designet for å være relativt generell i naturen, med fokus på de delte trinnene som er nødvendige for alle cantilever-baserte nanoindentasjonseksperimenter uavhengig av instrument eller produsent. På grunn av dette antar forfatterne at leseren har minst grunnleggende kjennskap til å betjene det spesifikke instrumentet som er valgt for å utføre utkragingsbasert nanoindentasjon. Imidlertid, i tillegg til den generelle protokollen som er skissert nedenfor, er en detaljert trinnvis standard operasjonsprosedyre (SOP) spesifikk for AFM og programvare som brukes her (se materialfortegnelse), fokusert på utkragingsbasert nanoinnrykk av prøver i væske, inkludert som et tilleggsmateriale.

1. Prøvepreparering og instrumentoppsett

1. Forbered prøven på en måte som minimerer både overflateruhet (ideelt nanometerskala, ~ 10x mindre enn den tiltenkte innrykksdybden) og forurensning uten å endre de mekaniske egenskapene til området (e) av interesse.
2. Velg en passende AFM-sonde for nanoindentasjon av den tiltenkte prøven basert på mediet (dvs. luft eller væske), forventet modul, prøvetopografi og relevante funksjonsstørrelser (se sondevalgshensyn i diskusjonen). Legg sonden på sondeholderen (se materialfortegnelse) og fest sondeholderen til AFM-skannehodet.
3. Velg en passende nanoindentasjonsmodus i AFM-programvaren som gir brukeren kontroll over individuelle ramper (dvs. kraftforskyvningskurver).
   MERK: Den spesifikke modusen vil variere på tvers av forskjellige AFM-produsenter og individuelle instrumenter (se SOP gitt i tilleggsmaterialet for mer informasjon og et spesifikt eksempel).
4. Juster laseren på baksiden av sondens utkrager, motsatt plasseringen av sondespissen og inn i PSD-en.
   MERK: Se mesenkymale stamcelleapplikasjonseksemplet for flere detaljer om viktige hensyn når du justerer laseren og utfører nanoindentasjon i væske, spesielt unngå flytende rusk og / eller luftbobler, som kan spre eller bryte strålen. AFM-optikken må kanskje også justeres for å kompensere for brytningsindeksen for væsken og for å unngå å krasje sonden når den griper inn i overflaten.
   1. Sentrer laserstrålepunktet på baksiden av utkrageren ved å maksimere sumspenningen (figur 2A).
   2. Sentrer det reflekterte laserstrålepunktet på PSD ved å justere X- og Y-avbøyningssignalene (dvs. horisontale og vertikale) til å være så nær null som mulig (figur 2A), og gir dermed det maksimale detekterbare avbøyningsområdet for å produsere en utgangsspenning proporsjonal med utkragingsavbøyningen.
5. Hvis du er usikker på prøvetopografien, overflateruheten og / eller overflatetettheten (når det gjelder flak eller partikler), utfør en AFM-topografiundersøkelsesskanning før nanoindentasjonseksperimenter for å bekrefte prøvens egnethet, som beskrevet i trinn 1.1 og prøveprepareringsdelen av diskusjonen.

Figur 2: Posisjonsfølsom detektormonitor . (A) PSD-skjerm som indikerer en riktig justert laser som reflekteres fra baksiden av sondeutkrageren og på midten av PSD (som det fremgår av den store sumspenningen og mangelen på vertikal eller horisontal avbøyning) før den tas i bruk på prøveoverflaten (dvs. sonde som ikke er i kontakt med prøven). (B) Den vertikale avbøyningsspenningen øker når utkragingen avbøyes (f.eks. når sonden kommer i kontakt med prøven). Forkortelser: PSD = posisjonsfølsom detektor; VERT = vertikal; HORIZ = horisontal; AMPL = amplitude; I/T = Ikke aktuelt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

2. Kalibrering av sonde

MERK: Tre verdier er nødvendige for å kvantifisere de mekaniske egenskapene til en prøve ved hjelp av F-D-kurvedataene samlet inn under utkragingsbasert nanoindentasjon: avbøyningsfølsomheten (DS) til utkragingssystemet (nm / V eller V / nm), utkragfjærkonstanten (nN / nm) og sondens kontaktområde, ofte uttrykt i form av den effektive sondespissradiusen (nm) ved en gitt innrykkdybde mindre enn sonderadiusen i tilfelle av en sfærisk sonde tips.

1. Kalibrer sondens DS/AFM-system ved å tråkke på et ekstremt hardt materiale (f.eks. safir, E = 345 GPa) slik at deformasjon av prøven minimeres og dermed konverteres den målte Z-bevegelsen til piezoen etter initiering av spissprøvekontakt utelukkende til utkrageavbøyning.
   MERK: DS-kalibreringen må utføres under de samme forholdene som de planlagte nanoindentasjonseksperimentene (dvs. temperatur, medium osv.) for å gjenspeile systemets DS nøyaktig under eksperimentene. En lang (30 min) laseroppvarmingsperiode kan være nødvendig for maksimal nøyaktighet for å gi tid til termisk likevekt som skal nås og stabil laserutgangseffekt og pekestabilitet skal etableres. DS må måles på nytt hver gang laseren justeres, selv om den samme sonden brukes, da DS avhenger av laserintensiteten og posisjonen på utkrageren, samt kvaliteten på refleksjonen fra sonden (dvs. nedbrytning av sondens baksidebelegg vil påvirke DS) og følsomheten til PSD²⁰.
   1. Sett opp og utfør DS-kalibreringsinnrykk på safiren for å oppnå omtrent samme sondeavbøyning (i V eller nm) som de planlagte prøveinnrykkene, siden den målte forskyvningen er en funksjon av spissavbøyningsvinkelen og blir ikke-lineær for store avbøyninger.
   2. Bestem DS (i nm/V), eller alternativt den inverse optiske spakfølsomheten (i V/nm), fra helningen til den lineære delen av kontaktregimet etter det første kontaktpunktet i den resulterende F-D-kurven, som vist i figur 3A.
   3. Gjenta rampen minst 5x, og registrer hver DS-verdi. Bruk gjennomsnittet av verdiene for maksimal nøyaktighet. Hvis det relative standardavviket (RSD) til målingene overstiger ~ 1%, måler DS, da noen ganger de første F-D-kurvene ikke er ideelle på grunn av den første introduksjonen av klebende krefter.
   4. Hvis sondeutkragerens fjærkonstant, k, ikke er fabrikkalibrert (f.eks. via laserdopplervibrometri [LDV]), kalibrerer du fjærkonstanten.
      MERK: Termiske tunemetoden er optimal for relativt myke utkragere med k < 10 N/m (se vårkonstantdelen av diskusjonen for en liste og beskrivelse av alternative metoder, spesielt for stive utkrager med k > 10 N/m). Som vist i figur 3B, C, er termisk innstilling vanligvis integrert i AFM-kontrollprogramvaren.
2. Hvis sonden ikke leveres med en fabrikkalibrert spissradiusmåling (f.eks. via skanning elektronmikroskop [SEM] avbildning), måler du den effektive spissradiusen, R.
   MERK: Det er to vanlige metoder for å måle spissradiusen (se tilsvarende diskusjonsdel), men den vanligste for nanometerskala sondespisser er blindspissrekonstruksjonsmetoden (BTR), som bruker en grovhetsstandard (se materialfortegnelse) som inneholder mange ekstremt skarpe (sub-nm) funksjoner som tjener til effektivt å avbilde spissen, i stedet for spissavbildningen prøven.
   1. Hvis du bruker BTR-metoden, kan du avbilde grovhetsprøven (spisskarakterisering) ved hjelp av en langsom skannehastighet (<0,5 Hz) og høy tilbakemeldingsgevinst for å optimalisere sporing av de svært skarpe funksjonene. Velg en bildestørrelse og pikseltetthet (oppløsning) basert på forventet spissradius (f.eks. vil et bilde på 1024 x 1024 piksler med et område på 3 μm x 3 μm ha ~3 nm sideoppløsning).
   2. Bruk AFM-bildeanalyseprogramvare (se Materialliste) til å modellere probespissen og estimere enderadiusen og den effektive spissdiameteren ved forventet prøveinnrykksdybde, som vist i figur 3D-F.
3. Når sondekalibreringen er fullført, angir du DS-, k- og R-verdiene i instrumentprogramvaren, som vist i figur 4A.
   1. Angi et estimat av utvalgets Poisson-forhold, ν, for å gjøre det mulig å konvertere den målte reduserte modulen til den faktiske prøvemodulen⁹. Hvis du bruker en konisk eller konisfærisk kontaktmekanikkmodell basert på spissformen og innrykksdybden, er det også nødvendig å angi spisshalvvinkelen (figur 4C).
      MERK: Modulen er relativt ufølsom for små feil eller usikkerhet i det estimerte Poisson-forholdet. Et estimat på ν = 0,2-0,3 er et godt utgangspunkt for mange materialer²¹.

Figur 3: Sondekalibrering. (A) Bestemmelse av avbøyningsfølsomhet. Resultat av en representativ måling av avbøyningsfølsomhet utført på et safirsubstrat (E = 345 GPa) for en standard tappemodussonde (nominell k = 42 N/m; se materialfortegnelse) med reflekterende aluminiumsbelegg på baksiden. Vist er de målte tilnærmingskurvene (blått spor) og tilbaketrekking eller tilbaketrekking (rødt spor). Den målte avbøyningsfølsomheten på 59,16 nm/V ble bestemt ved å tilpasse innflygingskurven mellom snap-to-contact- og turn-around-punktene, som indikert av regionen mellom de vertikale stiplede røde linjene. Området med negativ nedbøyning som er tydelig i tilbaketrekkings-/trekkkurven før du trekker av overflaten, indikerer spissprøveadhesjon. (B,C) Termisk innstilling. Representative utkragede termiske støyspektra (blå spor) med tilhørende pasninger (røde spor) for to forskjellige sonder. (B) Termisk tuneoppsett og tilpasningsparametere for en standard kraftkurvebasert AFM-avbildningssonde (se materialfortegnelse) med dens nominelle fjærkonstant k = 0,4 N/m brukt som en første gjetning. Passformen til det utkragede termiske støyspekteret gir en grunnleggende resonansfrekvens på f 0 = 79,8 kHz, som er i rimelig god overensstemmelse med den nominelle verdien av f₀ = 70 kHz. Den målte Q-faktoren er 58,1. God passform (R² = 0,99) er basert på samsvar mellom passformen og dataene mellom de to vertikale stiplede røde linjene. Merk at det er viktig å kjenne til og angi både omgivelsestemperatur og avbøyningsfølsomhet for nøyaktige resultater. (C) Cantilever termisk støyspektrum og tilsvarende passform (dvs. termisk melodi) med resulterende beregnet fjærkonstant k = 0,105 N / m for en ekstremt myk utkraging som brukes til å utføre nanomekaniske målinger på levende celler og isolerte kjerner. Legg merke til den betydelig lavere naturlige resonansfrekvensen på ~2-3 kHz. (VG Nett) Rekonstruksjon av blindspiss. Representativ arbeidsflyt for rekonstruksjon av blindspisser for en diamantspisssonde (nominell R = 40 nm; se materialfortegnelse). (D) Et 5 μm x 5 μm bilde av en spisskarakteriseringsprøve som består av en serie ekstremt skarpe (sub-nm) titanpigger som tjener til å avbilde AFM-sondespissen. (E) Resulterende rekonstruert modell (omvendt høydebilde) av sondespissen. (F) Resultater av rekonstruksjon av blindspisser, inkludert en estimert enderadius på R = 29 nm og effektiv spissdiameter på 40 nm ved en brukervalgt høyde på 8 nm (dvs. innrykksdybde << R) fra spissspissen, beregnet ved å konvertere kontaktområdet for spissprøven i den høyden til en effektiv diameter under forutsetning av en sirkulær profil (dvs. A = πr 2 = π(d/2)²) for bruk med sfæriske kontaktmekanikkmodeller. Forkortelser: AFM = atomkraftmikroskopi; ETD = effektiv spissdiameter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4: Innganger for programvaregrensesnitt. (A) Probe kalibreringskonstanter. Programvare brukergrensesnitt (se Materialfortegnelse) for å angi målt avbøyningsfølsomhet, fjærkonstant og spissradius for å muliggjøre kvantitative nanomekaniske målinger. Poissons forhold mellom både sonden og prøven er nødvendig for å beregne elastikken eller Youngs modul av prøven fra de utkragingsbaserte nanoindentasjonskraftkurvene. (B) Kontrollvindu for rampe. Programvare brukergrensesnitt (se Materialfortegnelse) for å sette opp utkragingsbaserte nanoindentasjonseksperimenter, organisert i parametrene som beskriver selve rampen (dvs. innrykksprofil), instrumentutløsing (f.eks. Kraft vs forskyvningskontroll), påfølgende kraftanalyse og bevegelsesgrenser (for å forbedre målefølsomheten ved å begrense området over hvilket A / D-omformeren må operere for å kontrollere Z-piezoen og lese PSD-avbøyningen). (C) Spisshalvvinkelen (basert på sondens geometri eller direkte måling) er viktig hvis en konisk, pyramidal eller konisfærisk kontaktmekanikkmodell (f.eks. Sneddon) brukes. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

3. Samle inn data om kraftforskyvning (F-D)

MERK: Parameterverdiene som presenteres her (se figur 4B) kan variere avhengig av kraft og innrykksområde for en gitt prøve.

1. Naviger i prøven under AFM-hodet og engasjer deg i ønsket interesseområde.
   1. Overvåk det vertikale avbøyningssignalet (figur 2B) eller utfør en liten (~50–200 nm) innledende rampe (figur 4B) for å kontrollere at spissen og prøven er i kontakt (se figur 5A).
   2. Juster AFM-hodeposisjonen litt oppover (i trinn som tilsvarer ~50 % av full rampestørrelse) og ramp igjen. Gjenta til spissen og prøven akkurat er ute av kontakt, noe som gjenspeiles av en nesten flat rampe (figur 5B) og minimal vertikal avbøyning av utkragingen (figur 2A).
   3. Når ingen åpenbar spissprøveinteraksjon er tilstede (sammenlign figur 2A og figur 2B), senk AFM-hodet med en mengde som tilsvarer ~ 50% -100% av rampestørrelsen for å sikre at sondespissen ikke krasjer inn i prøven mens du manuelt beveger AFM-hodet. Rampe igjen, gjenta til enten en god kurve (figur 5D) eller en kurve som ligner på figur 5C er observert. I sistnevnte tilfelle, utfør en ekstra liten AFM-hodesenkende justering lik ~ 20% -50% av rampestørrelsen for å oppnå god kontakt og en kraftkurve som ligner den som er vist i figur 5D.
2. Juster rampeparametere (som beskrevet nedenfor og vist i Figur 4B) for å optimalisere for instrumentet, sonden og prøven, og oppnå ramper som ligner på den som er vist i Figur 5D.
   1. Velg en passende rampestørrelse (dvs. total Z-piezobevegelse gjennom en rampesyklus) avhengig av prøven (f.eks. tykkelse, forventet modul, overflateruhet) og ønsket innrykksdybde.
      MERK: For stivere prøver vil det sannsynligvis forekomme mindre prøvedeformasjon (og dermed mer sondebøyning for en gitt Z-piezo-bevegelse), slik at rampestørrelsen generelt kan være mindre enn for mykere prøver. Typiske rampestørrelser for stive prøver og utkrager kan være titalls nm, mens for myke prøver og utkragingsramper kan være hundrevis av nm til noen få μm i størrelse; Spesifikke utvalgte applikasjonseksempler presenteres i delen Representative resultater. Vær oppmerksom på at minimum og maksimum mulig rampestørrelse er instrumentavhengig.
   2. Velg en passende rampefrekvens (1 Hz er et godt utgangspunkt for de fleste prøver).
      MERK: Rampehastigheten kan være begrenset av elektroniske hastigheter/båndbredder for kontroll og/eller deteksjon. I kombinasjon med rampestørrelsen bestemmer rampehastigheten spisshastigheten. Spisshastigheten er spesielt viktig å vurdere ved innrykk av myke materialer der viskoelastiske effekter kan forårsake hystereseartefakter ^9,22.
   3. Velg om du vil bruke en utløser (lastkontrollert) eller uutløst (forskyvningskontrollert) rampe.
      MERK: I en utløst rampe vil systemet nærme seg prøven i brukerdefinerte trinn (basert på rampestørrelse og oppløsning eller antall datapunkter) til den ønskede utløserterskelen (dvs. settpunktkraft eller utkragingsnedbøyning) oppdages, og da vil systemet trekke seg tilbake til sin opprinnelige posisjon og vise F-D-kurven. I en uutløst rampe utvider systemet ganske enkelt Z-piezoen avstanden spesifisert av den brukerdefinerte rampestørrelsen og viser den målte F-D-kurven. Utløste ramper foretrekkes for de fleste brukstilfeller, men uutløste ramper kan være nyttige når du undersøker myke materialer som ikke har et skarpt, lett identifiserbart kontaktpunkt.
      1. Hvis en utløst rampe velges, angir du utløserterskelen (brukerdefinert maksimal tillatt kraft eller avbøyning av rampen) for å resultere i ønsket innrykk i prøven.
         MERK: Bruk av en utløserterskel betyr at en rampe kan avsluttes (dvs. sonden kan begynne å trekke seg tilbake) før den når den fullstendige rampestørrelsen (Z-piezo-utvidelsen) som er angitt. Verdiene kan variere fra noen få nN til noen få μN, avhengig av spissprøvesystemet.
      2. Still inn rampeposisjonen for å bestemme delen av Z-piezoens maksimale rekkevidde som skal brukes til å utføre rampen. Forsikre deg om at det totale området for rampestørrelsen ikke starter eller slutter utenfor det maksimale Z-piezoområdet (se representative eksempler i figur 6), ellers vil en del av F-D-kurven ikke representere noen fysisk måling (dvs. Z-piezoen vil være helt forlenget eller trukket tilbake, ikke bevegelig).
   4. Angi antall prøver/ramper (f.eks. 512 prøver/rampe ) for å oppnå ønsket oppløsning på målingen (dvs. punkttettheten til F-D-kurven).
      MERK: Maksimalt antall prøver/ramper kan være begrenset av programvare (filstørrelse) eller maskinvarebegrensninger (f.eks. konverteringshastighet analog til digital [A/D], avhengig av rampehastigheten). Det er også mulig å begrense det tillatte Z-piezo- eller avbøyningsområdet (se grenseparametere i figur 4B) for å øke den effektive oppløsningen til systemets A/D-omformer.
   5. Still inn X-roteringen for å redusere skjærkreftene på prøven og spissen ved samtidig å bevege sonden litt i X-retningen (parallelt med utkragingen) mens du rykker inn i Z-retningen (vinkelrett på utkragingen). Bruk en verdi for X-rotering som er lik forskyvningsvinkelen til sondeholderen i forhold til overflatenormalen (12° er vanlig).
      MERK: X-roteringen er nødvendig fordi utkragingen er montert i sondeholderen i en liten vinkel i forhold til overflaten for å la den innfallende laserstrålen reflekteres i PSD-en. I tillegg kan front- og bakvinklene på probespissen avvike fra hverandre (dvs. sondespissen kan være asymmetrisk). Mer spesifikk informasjon kan fås fra individuelle sonde- og AFM-produsenter.

Figur 5: Optimalisering av separasjon av spissprøver etter innkobling for å oppnå gode kraftkurver. Sekvensielle eksempler på representative kraftforskyvningskurver oppnådd ved innrykk i væske (fosfatbufret saltvann) på en levende mesenkymal stamcellekjerne med en kalibrert myk silisiumnitridutkrager (nominell k = 0,04 N/m) som avsluttes i en halvkuleformet spiss med 5 μm radius (se materialfortegnelse). Kurver ble oppnådd i prosessen med å engasjere celleoverflaten og optimalisere innrykksparametrene, med sondetilnærming vist i blått og trekke tilbake / trekke tilbake i rødt. (A) Spissen er allerede engasjert og i kontakt med prøven før du begynner rampen, noe som fører til stor utkragingsavbøyning og krefter, uten flat forkontaktbaselinje. (B) Etter å ha flyttet spissen manuelt tilstrekkelig langt bort fra prøven, resulterer en uutløst 2 μm rampe i en F-D-kurve som er nesten flat (dvs. praktisk talt ingen endring i kraft). Under omgivelsesforhold vil kurven være flatere, men i væske kan viskositeten til mediet forårsake små avbøyninger av sondeutkragingen under en rampe som sett her, selv uten overflatekontakt. (C) Etter å ha nærmet seg litt nærmere overflaten før du begynner rampen, viser tilnærmings- og tilbaketrekkingskurvene en liten økning i kraft (økt helling) nær rampens snupunkt (dvs. overgang fra tilnærming til tilbaketrekning). Avslørende tegn å se etter er at tilnærmingen (blå) og trekke tilbake (rød) kurver begynner å overlappe (region indikert av den svarte sirkelen), noe som indikerer en fysisk interaksjon med overflaten. (D) En ideell F-D-kurve oppnådd etter optimalisering av rampeparametrene og nærmer seg litt (~ 1 μm) nærmere celleoverflaten enn i C , slik at sonden tilbringer omtrent halvparten av rampen i kontakt med cellen, noe som muliggjør tilstrekkelig deformasjon for å passe kontaktdelen av tilnærmingskurven og bestemme den elastiske modulen. Den relativt lange, flate, støysvake grunnlinjen gjør det lettere for tilpasningsalgoritmen å bestemme kontaktpunktet. Forkortelse: F-D = kraftforskyvning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 6: Rampestørrelse og -posisjon. Z-piezo-skjerm som viser omfanget av rampen (blå stolpe) i forhold til det totale tilgjengelige Z-piezo-bevegelsesområdet (grønn stolpe). (A) Z-piezo-posisjonen er nær midten av bevegelsesområdet, som indikert både ved at den blå linjen er plassert omtrent midt på den grønne linjen og den nåværende Z-piezospenningen (-78,0 V) er omtrent mellom dens helt tilbaketrukne (-212,2 V) og utvidede (+102,2 V) verdier. (B) Z-piezo forlenges i forhold til A, uten skjevspenning. (C) Z-piezo trekkes tilbake i forhold til A og B. (D) Z-piezo-posisjonen er den samme som i C ved -156,0 V, men rampestørrelsen er økt i forhold til A-C for å dra nytte av mer av Z-piezoens fulle bevegelsesområde. € Rampestørrelsen er for stor for den nåværende rampeposisjonen, noe som resulterer i at Z-piezoen blir utvidet til slutten av serien. Dette vil føre til at F-D-kurven flater ut, da systemet ikke kan forlenge Z-piezoen ytterligere. Forkortelse: F-D = kraftforskyvning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

4. F-D-kurveanalyse

1. Velg en passende programvarepakke for dataanalyse. Velg og last inn dataene som skal analyseres.
   MERK: Mange AFM-produsenter og AFM-bildebehandlingsprogrammer har innebygd støtte for F-D-kurveanalyse. Alternativt kan den økte fleksibiliteten og funksjonene til en dedikert F-D-kurveanalysepakke, for eksempel åpen kildekode-programvarepakken AtomicJ, være fordelaktig²³, spesielt for batchbehandling og statistisk analyse av store datasett eller implementering av komplekse kontaktmekanikkmodeller.
2. Inputkalibrerte verdier for fjærkonstanten, DS- og sondespissradiusen, sammen med estimater av Youngs modul og Poissons forhold for probespissen (basert på materialsammensetningen) og Poissons forhold mellom prøven .
   MERK: Hvis du bruker en diamantspissinnrykk, kan verdiene _E-spiss = 1140 GPa og ν-spiss = 0,07 brukes^21,24,25,26. For en standard silisiumsonde kan _E-spiss = 170 GPa og ν-spiss = 0,27 vanligvis brukes, selv om Youngs silisiummodul varierer avhengig av krystallografisk orientering²⁷.
3. Velg en nanoindentasjonskontaktmekanikkmodell som passer for spissen og prøven.
   MERK: For de mange vanlige sfæriske spissmodellene (f.eks. Hertz, Maugis, DMT, JKR) er det viktig at innrykksdybden i prøven er mindre enn spissradiusen; ellers viker sondespissens sfæriske geometri for en konisk eller pyramideformet form (figur 4C). For koniske (f.eks. Sneddon²⁸) og pyramidemodeller, spisshalvvinkelen (dvs. vinkelen mellom sideveggen på spissen og en todelt linje vinkelrett på spissenden; Figur 4C) må være kjent og er vanligvis tilgjengelig fra sonden produsenten. For mer informasjon om kontaktmekanikkmodeller, se Dataanalyse-delen av thedDiscussion.
4. Kjør tilpasningsalgoritmen. Kontroller riktig montering av F-D-kurvene; en lav restfeil som tilsvarer en gjennomsnittlig R 2 nær enhet (f.eks. R² > 0,9) er vanligvis en indikasjon på en god passform til den valgte modellen^29,30. Stikkprøver individuelle kurver for å visuelt inspisere kurven, modelltilpasningen og beregnede kontaktpunkter om ønskelig (se f.eks. figur 7 og dataanalysedelen av diskusjonen).

Representative Results

Kurver for kraftforskyvning
Figur 7 viser representative, nesten ideelle F-D-kurver oppnådd fra nanoindentasjonseksperimenter utført i luft på harpiksinnebygde loblolly furuprøver (figur 7A) og i væske (fosfatbufret saltvann [PBS]) på mesenkymale stamcellekjerner (MSC) (figur 7B). Bruken av enhver kontaktmekanikkmodell er avhengig av nøyaktig og pålitelig bestemmelse av det første kontaktpunktet for spissprøven. Dermed gjør den relativt flate, støysvake grunnlinjen foran det første kontaktpunktet og den glatte helningen til kontaktdelen av F-D-kurvene vist i figur 7 dem ideelle for analyse for å trekke ut mekaniske egenskaper, noe som gjenspeiles av det utmerkede samsvaret mellom tilnærmingskurvene (blå spor) og tilsvarende tilpasninger (grønne spor) i innsatsene.

Omvendt er det flere vanlige problemer som en bruker kan støte på mens han utfører utkragingsbasert nanoinnrykk som vil føre til ikke-ideelle F-D-kurver. Et av de vanligste problemene, spesielt umiddelbart etter inngrep, er at sondespissen allerede er i kontakt med prøven før oppstart av en rampe (figur 5A), noe som forhindrer oppkjøp av den nødvendige kontaktlinjen for å bestemme det første kontaktpunktet. Dette kan også føre til for store krefter ved uutløste (dvs. kontrollerte forskyvninger) ramper. Dette er spesielt bekymringsfullt når du utfører en stor rampe med en stiv utkrager, da de resulterende kreftene kan ødelegge utkragingen og / eller skade prøven eller spissen. For å unngå dette, overvåk den vertikale avbøyningsspenningen under og etter den første inngrepet. Hvis den målte vertikale avbøyningsspenningen er positiv (forutsatt riktig innledende justering) som vist i figur 2B, blir utkragingen avbøyd og spissen er i kontakt med prøven. Større positive spenninger tilsvarer større utkragingsavbøyninger, men uavhengig av størrelsen på avbøyningen, bør brukeren manuelt heve AFM-hodet (f.eks. ved å bruke en trinnmotor) bort fra prøven. Den vertikale avbøyningsspenningen skal sakte reduseres og kan til og med midlertidig dyppe under null ved sterke klebekrefter fra spissprøven, men vil til slutt nå 0 V (eller nær 0 V) når spissen ikke lenger er i kontakt med prøven (figur 2A). Fra dette tidspunktet kan brukeren gjenoppta optimalisering av rampeparametrene og utføre innrykk.

Et annet vanlig problem (spesielt for uutløste ramper) er at hele F-D-kurven ser nesten flat ut, uten tydelige tegn på stikkprøveinteraksjon, som vist tidligere i figur 5B. Hvis tilgjengelig på instrumentet, er løsningen på dette å manuelt senke SPM-hodet med ~ 10% mindre enn rampestørrelsen (for å unngå å krasje sondespissen) og rampe igjen, gjenta til en åpenbar økning i kraft observeres på grunn av spissprøveinteraksjon (figur 5C, D) før du fortsetter å optimalisere andre rampeparametere.

Slitasje på tuppen
Figur 8 viser et eksempel på slitasje på tuppen i en eksperimentell setting. En enkelt, stiv AFM-sonde med silisiumtappemodus (se materialfortegnelse) ble brukt til å avbilde flere store områder av en Bakken-skiferprøve (se tilsvarende applikasjonseksempel for flere detaljer) ved hjelp av en rask (kHz rate) kraftkurvebasert avbildningsmetode, og BTR-metoden ble brukt til å modellere spissgeometrien og estimere spissens enderadius før og etter hvert av tre påfølgende bilder. Skiferprøvene som ble undersøkt besto av en matrise av leire og organisk materiale (E ~ 5 GPa) med mye hardere uorganiske mineralinneslutninger spredt over hele (E > 30 GPa). Fordi prøven inneholdt betydelige variasjoner i overflatetopografi (±2 μm) over de store skanneområdene (85 μm x 85 μm) som ble avbildet, ble skannehastigheten satt til det minste tillatte instrumentet på instrumentet som ble brukt, 0,1 Hz. Med en kraftkurveinnsamlingshastighet på 2 kHz og en skannefrekvens på 0,1 Hz, var det i løpet av et enkelt bilde på 1024 x 1024 piksler over 20 millioner berøringer med spissprøver. Som et resultat opplevde sondespissen betydelig slitasje i forhold til sin uberørte tilstand (figur 8A) i løpet av avbildningen av prøven, og økte med over en størrelsesorden fra en effektiv enderadius på ~ 11 nm som mottatt til ~ 129 nm ved avslutningen av de tre bildene (figur 8D). Under det første bildet ser spissen ut til å ha blitt brutt, noe som resulterer i den store morfologiske forandringen som er sett i figur 8B. I hvert påfølgende bilde blir spissen gradvis mer avrundet, et utmerket eksempel på det mer vanlige fenomenet gradvis slitasje (se diskusjon). De estimerte spissradiene fra BTR-modellene er inkludert i figur 8.

I kontrast presenterer figur 8E, F BTR-modeller av en diamantspisssonde (se materialtabellen) anskaffet med 6 måneders mellomrom, med tusenvis av nanoindents og hundrevis av millioner av kraftkurvebildebaserte spissprøveinteraksjoner som forekommer i mellom. Som det fremgår av de estimerte spissradiene på 29 nm (figur 8E) og 28 nm (figur 8F), endret sondespissradiusen seg ikke innenfor grensene for BTR-metoden, noe som fremhever diamantens ekstreme slitestyrke. Det skal imidlertid bemerkes at diamantspisssonder (som alle AFM-sonder) er utsatt for forurensning fra løst festet rusk som kan påvirke spissområdets funksjon og effektiv hardhet. Følgelig er prøverenslighet fortsatt avgjørende for spissbevaring og nøyaktige nanomekaniske målinger.

Eksempler på bruksområder
Gjennom det fornuftige valget av sondematerialsammensetning, utkragingsfjærkonstant og spissgeometri og radius, kan utkragingsbasert nanoindentasjon brukes til å kvantifisere nanoskala mekaniske egenskaper av materialer med elastiske moduler som spenner fra kPa til GPa, både i væske og under omgivelsesforhold. Utvalgte applikasjonseksempler følger for å fremheve noen av det brede spekteret av brukstilfeller som er mulig for utkragebasert nanoindentasjon.

Undersøkelse av loblolly furu mekaniske egenskaper for biodrivstoff applikasjoner
Loblolly furutrær (Pinus taeda) er en raskt voksende bartreart som er svært rikelig i det sørlige USA, og okkuperer over 13 millioner hektar³¹. På grunn av deres overflod er loblolly furutrær en kritisk kommersiell avling i det sørlige USA, som vanligvis brukes til både tømmer og massetre. I tillegg er de en viktig ressurs for andregenerasjons produksjon av cellulosebasert biodrivstoff³². Det er viktig at etterspørselen har vokst etter cellulosebasert biodrivstoffråstoff på grunn av Energy Independence and Security Act (EISA) fra 2007, som krever at innen 2022 skal det totale fornybare drivstoffforbruket i den amerikanske transportindustrien være 36 milliarder gallon, med 16 milliarder liter avledet fra cellulosebiomasse. Følgelig, på grunn av loblolly furu er rask vekst og tilgjengelighet til agroforestry prosjekter, har det blitt et biodrivstoff råstoff av stor interesse de siste årene³³. Kunnskap om de mekaniske egenskapene til loblolly furu, inkludert variabilitet på tvers av individuelle trær, anatomiske fraksjoner (f.eks. Hvitved, bark, nåler) og celleområder (f.eks. Cellevegg versus interiør), kan tillate målrettet separasjon av biomassestrømmer for å optimalisere mekanisk bearbeiding og termokjemisk konvertering³⁴.

Figur 9 viser et representativt AFM-topografibilde (høydesensor) (figur 9A) og tilsvarende elastisk modulkart (figur 9B) av en tverrsnittsprøve av hvittre hentet fra en gren på en 23 år gammel loblollyfuru med en ~ 30 nm radius av krumningsdiamantspisssonde montert på en utkragingsgruppe i rustfritt stål (k = 256 N/m). Topografi- og modulkartene ble generert samtidig ved hjelp av rask kHz-hastighetskraftkurvebasert AFM-avbildning, med modulkartet som presenterer semi-kvantitative resultater basert på nominelle verdier for sondekalibreringskonstantene (dvs. fjærkonstant, avbøyningsfølsomhet og spissradius) og montering av kraftkurvene i sanntid til DMT (Derjaguin, Müller og Toporov) kontaktmekanikk modell³⁵. Tverrsnittsprøver trimmet til å være <3 mm i alle tre dimensjoner (lengde x bredde x høyde) ble fremstilt for avbildning ved seriell dehydrering ved bruk av økende konsentrasjoner av etanol (33%, 55%, 70%, 90% og 100%)³⁶, før infiltrering med harpiks (se materialtabell) og polymerisering ved 60 °C over natten. Fullt herdede harpiks-innebygde prøver ble først malt, deretter ultramicrotomed med et diamantblad som opererer med en skjærehastighet på ~ 1 mm / s med en matetykkelse som reduseres fra 1 μm ned til 50-70 nm per skive for å produsere en flat overflate som er egnet til AFM-avbildning. Imidlertid, som det fremgår av fargeskalalinjen i figur 9A, er den resulterende overflaten i dette tilfellet fortsatt relativt grov, kanskje på grunn av tilstedeværelsen av gjenværende rusk på prøveoverflaten og / eller ultramikrotombladet, noe som førte til blad "chatter" under seksjonering, mens andre prøver viste mye jevnere overflatetopografi.

Figur 9C gjengir AFM-topografibildet fra figur 9A, men med hvite trådkors som indikerer plasseringene for åtte arrays på 50 nanoindents hver som skal utføres langs utvalgte cellevegger innenfor avkastningen, da målet med det aktuelle prosjektet var å forstå hvordan de nanomekaniske egenskapene til loblolly furu varierer på tvers av ulike vevstyper og trealder. En utløserterskel på 1 μN ble vanligvis brukt for rampene (60 nm nominell rampestørrelse utført ved en 1 Hz rampehastighet), noe som førte til en innrykksdybde på ~ 10 nm langs celleveggene (8 ± 2 nm over alle prøvene som ble studert) eller litt dypere (14 ± 4 nm) i celleinteriørene, som er noe mykere enn celleveggene. Innrykk innenfor hver linje ble fordelt ≥100 nm fra hverandre for å sikre at de var godt separert, og 1024 datapunkter ble samlet per rampe for å produsere godt karakteriserte tilnærmings- og tilbaketrekkingskurver. Ved å kombinere rask kraftkurvebasert avbildning med pek-og-skyt utkragingsbasert nanoinnrykk, var det mulig å generere statistikk og bestemme forskjeller i moduler på tvers av cellestrukturer. For eksempel, som vist i tabell 1, ble det funnet at den gjennomsnittlige elastiske modulen til celleinteriøret var omtrent halvparten av celleveggen over hvite treprøver avledet fra flere grener av trær av varierende alder.

Eksempel	Plassering	E* (GPa)	E (GPa)	Deformasjon (nm)	Antall (n)
1	Interiør	1,5 ± 0,4	1,4 ± 0,4	14 ± 2	199
	Vegg	4.7 ± 1.3	4.3 ± 1.3	7 ± 2	202
2	Interiør	1,3 ± 0,3	1,2 ± 0,3	16 ± 3	198
	Vegg	3,2 ± 0,9	2,9 ± 0,9	9 ± 2	199
3	Interiør	1,9 ± 0,6	1,7 ± 0,6	12 ± 3	198
	Vegg	5.7 ± 1.2	5.2 ± 1.2	6 ± 1	199
4	Interiør	2,4 ± 0,8	2,2 ± 0,8	11 ± 3	202
	Vegg	4.2 ± 2.1	3.8 ± 2.1	9 ± 4	193
5	Interiør	2,6 ± 0,8	2,3 ± 0,8	10 ± 2	198
	Vegg	4.3 ± 1.6	3.9 ± 1.6	7 ± 2	199
Gjennomsnitt	Interiør	1,9 ± 0,6	1,8 ± 0,6	13 ± 3
	Vegg	4.4 ± 1.4	4.0 ± 1.4	8 ± 2

Tabell 1: Loblolly furu elastisk modulstatistikk: cellevegger versus celleinteriør. Målt elastisk moduli av celleveggene versus celleinteriør for fem loblolly furu whitewood grenprøver samlet fra to trær av ulik alder. Alle modulverdiene ble beregnet ved å tilpasse tilnærmingsdelen av kraftforskyvningskurven til DMT-modellen og anta et Poisson-forhold på 0,3 for utvalget. Moduler rapporteres som gjennomsnittlig ± standardavvik for hver prøvelokasjon, med antall kraftkurver (antall, n) analysert for å gi det rapporterte resultatet angitt. Målt redusert moduli (E *) ble konvertert til faktisk prøvemoduli (E), forutsatt en Youngs modul på 1,140 GPa og Poissons forhold på 0,07 for diamantspissindenter som ble brukt. Også vist er gjennomsnittlig prøvedeformasjon for den påførte belastningen på 1 μN.

Korrelert nanomekanikk og elektronmikrospektroskopi på Bakken-skifer
Skiferavsetninger fra bakken finnes i Willistonbassenget i Montana og Nord-Dakota i USA og deler av Saskatchewan i Canada. De er det nest største hydrokarbonreservoaret i USA, men studier av forekomstene er fortsatt i sin barndom³⁷. En undersøkelse av de nanomekaniske egenskapene til Bakken-skifer som en funksjon av sammensetning og termisk modenhet ble utført ved samlokalisering av AFM utkragingsbasert nanoindentasjon med skanning elektronmikroskop (SEM) avbildning og energidispersiv spektroskopi (EDS) elementær sammensetningskarakterisering, som vist i figur 10. Spesielt ble SEM-EDS-kartlegging brukt til å karakterisere elementfordelingen (figur 10C), og dermed bestemme tilstedeværelsen og plasseringen av forskjellige mineralinneslutninger i skifermatrisen. AFM-avbildning basert på rask (kHz-hastighet) kraftkurve (figur 10B) ble samlokalisert med SEM-EDS-kartene ved å definere en optisk identifiserbar opprinnelse i SEM-bildet av sekundærelektronet (SE) (figur 10A) og spore scenebevegelsen til både AFM og SEM³⁸. Ved igjen å bruke en diamantspisssonde montert på en stiv utkrager i rustfritt stål, var kartlegging av variasjoner i den elastiske modulen mulig for store regioner (85 μm x 85 μm) som inneholdt inneslutninger av interesse (figur 10D). Merk at modulkartet som presenteres i figur 10D, er kvalitativt snarere enn kvantitativt, da de riktige sondekalibreringskonstantene ikke ble lagt inn i programvaren før avbildning og datainnsamling.

AFM-bildene i figur 10B og figur 10D fremhever også en av ulempene med diamantspisssonden som brukes, nemlig dens manglende evne til nøyaktig å spore funksjoner med høyt sideforhold (se den svarte ovale regionen i figur 10B) på grunn av kubehjørnespissens geometri. Den reduserte oppløsningen og manglende evne til nøyaktig sporing av bratte formasjoner kan sees tydeligere i figur 11, der det samme generelle området av en Bakken-skiferprøve er avbildet av kubehjørnets diamantspiss (figur 11A) og en betydelig skarpere, høyere sideforhold stiv tappemodus silisium AFM-sonde (figur 11B). Mer spesifikt ble bildet vist i figur 11B tatt med sonden karakterisert i figur 8A-D, mellom BTR-modellene i figur 8A (R = 11 nm) og figur 8B (R = 43 nm). For direkte sammenligning presenterer bildeparene figur 11C, D, sammen med figur 11E, F, zoomede bilder av de samme prøveoverflatefunksjonene oppnådd med henholdsvis diamantspissen og silisiumsonden, som viser effekten av spissgeometri og radius på bildeoppløsning og gjengivelse. Figur 11G viser et sammensatt 3D-bilde som kombinerer overflatetopografien som er oppnådd med den skarpe, høyaspektiske silisiumsonden (figur 8A, B) og modulverdiene oppnådd med diamantspisssonden (figur 8E, F) kodet som den overlagte fargede huden.

I tillegg til de store bildene vist i figur 10 og figur 11, ble mindre (10 μm x 10 μm) raske kraftkurvebaserte bilder tatt ved hjelp av den fullt kalibrerte diamantspisssonden. Disse bildene fokuserte på områder uten optisk synlige uorganiske mineralinneslutninger for å undersøke egenskapene til den omkringliggende organiske matrisen mer detaljert. Ved å bruke en pikseloppløsning på 512 x 512 (dvs. ~20 nm x 20 nm samplingspiksler), ble >262 000 individuelle F-D-kurver fanget og lagret med hvert 10 μm x 10 μm-bilde, noe som muliggjorde utmerket statistikk. F-D-dataene ble batchbehandlet og analysert ved hjelp av AtomicJ-programvarepakken²³ for å implementere Derjaguin-Müller-Toporov (DMT) ³⁵ kontaktmekanikkmodell. Etter tilpasning ble dataene renset for å fjerne kurver som resulterte i en beregnet elastisk modul <0 (ikke-fysisk) eller >30 GPa (siden studien var fokusert på den ikke-mineralske delen av skiferen, E << 30 GPa) lik andre studier^39,40, samt data med en modell som passer R² < ^0,7. Mens R 2-avskjæringen er noe vilkårlig, ble den valgt å bare fjerne data modellen åpenbart ikke kunne passe nøyaktig. Med unntak av en outlier som inkluderte en stor mineralinkludering i avbildningsområdet, utgjorde kurvene som ble fjernet mindre enn 0,5 % av de totale dataene for hvert bilde. En oppsummering av de statistiske resultatene finnes i tabell 2. De beregnede elastiske modulene varierer fra 3,5 til 6,1 GPa, innenfor rekkevidden av hva lignende studier også har funnet^39,40.

Eksempel	E (GPa)	Utbytte etter datarensing	Antall (n)
1	6.1 ± 3.8	93.70%	7,36,874
2	5.1 ± 2.6	99.70%	7,84,267
3	3.5 ± 1.9	99.60%	7,83,427

Tabell 2: Bakken skifers elastiske modulstatistikk. Målte elastiske moduler av de organiske matrisene i tre Bakken-skiferprøver med ulik sammensetning og termisk modenhet. Prøve 1 er en kontroll, mens prøve 2 og 3 ble glødet i henholdsvis 12 timer og 48 timer for kunstig å simulere termisk modning. Elastiske moduler rapporteres som gjennomsnittlig ± standardavvik for hver prøvelokalitet, med antall kraftkurver (antall, n) inkludert i analysen etter bruk av datarensingsprosedyren beskrevet i den angitte teksten. Den beregnede gjennomsnittlige modulen (3, 5-6, 1 GPa) faller innenfor området rapportert i andre lignende studier som Li et ^al.40, som fant et modulområde på 2, 9-11, 8 GPa.

Mesenkymale stamcellekjernestivhet endres på grunn av ytre stimuli
Mesenkymale stamceller (MSC) er stamceller som kan bli kondrocytter, adipocytter, osteoblaster og myocytter⁴¹. MSC-differensiering i disse forskjellige vevstypene påvirkes av eksterne mekaniske stimuli på cellen via Linker of the Cytoskeleton and Nucleoskeleton (LINC) -komplekset, som fysisk knytter den ytre cellemembranen til kjernemembranen⁴¹. LINC-komplekset består av SUN- og Nesprin-proteiner som interagerer med cellecytoskjelettet for å oppdage fysiske krefter på cellen og lette kjernefysisk import av mekanosensitive faktorer β-catenin og YAP for å starte differensieringsprosessen^42,43,44. Sammen med kjernefysisk import av β-catenin og YAP etter mekanostimulering av celler, gjennomgår cytoskelettet også omorganisering, inkludert dannelsen av F-aktinfilamenter rundt kjernen, samt nukleær translokasjon av aktin^44,45,46. Fordi mekanostimering initierer endringer i cellecytoskjelettet og nukleær oppføring av aktin, påvirkes den totale stivheten (modulen) av celler og kjerner og kan måles ved AFM utkragingsbasert nanoindentasjon. Tidligere studier har bekreftet dette ved å oppdage en reduksjon i celle- og nukleærmodul etter forstyrrelse av LINC-komplekset, og omvendt en økning i celle- og nukleærmodul etter mekanostimering av MSC⁴⁷. Nåværende forskning undersøker fortsatt mekanismene for aktinimport til kjernen og hvordan aktinpolymerisasjon påvirker celle- og nukleærmodul etter mekanostimering.

For å undersøke de mekaniske egenskapene til levende celler, må forsøkene utføres i en bufferløsning, typisk PBS. Gjennomføring av utkragingsbasert nanoindentasjon i væske utgjør unike problemer, spesielt for måling av svært myke prøver som MSC (E≈ 2 kPa). Spesielt krever de lave elastiske modulene til levende celler bruk av en stor sonderadius for å redusere spenningen som formidles på cellestrukturen og unngå punktering av membranen. I tillegg er det nødvendig med svært lave fjærkonstante utkrager (k = 0,04 N / m) for å måle slike lave elastiske moduler, men dette øker sannsynligheten for falsk engasjering på grunn av væskens viskøse luftmotstand, noe som fører til avbøyning av den myke utkragingen under det første raske senketrinnet i AFM-engasjementsprosessen. For å motvirke den høyere tilbøyeligheten til falske inngrep, kan det være nødvendig å bruke et større engasjeringssettpunkt (dvs. avbøyningsspenningsterskel for å avslutte engasjeringsprosessen). Siden mykere utkragere generelt kan deformeres elastisk i større grad enn stive utkrager, er den større bøyningen som oppleves med et høyere engasjeringssettpunkt i væske generelt ikke skadelig for slike myke sonder. I tillegg er det viktig at løsningene som brukes i et væskemiljø er fri for rusk og bobler, da flytende rusk eller bobler forbigående kan forstyrre overføringen av laseren gjennom væsken til PSD eller feste seg til utkrageren og blokkere laseren. Interferens med laserstrålen vil påvirke de resulterende F-D-kurvene negativt og resulterer ofte i falsk kollisjonsdeteksjon eller falsk engasjering. Til slutt krever nanoindentasjon på levende celler også mer brukerinngang enn på hardere, livløse materialer. Spesielt fordi cellene og deres væskemiljø er mye mer dynamiske, kan det være nødvendig å aktivt justere sondens høyde for hver rampe for å sikre at en god F-D-kurve oppnås.

I levende celle nanoindentasjon er det ofte nødvendig med mye større prøvedeformasjon for å resultere i samme utkragingsavbøyning i forhold til stivere prøver. Denne større deformasjonen kan resultere i eksperimentelle resultater som avviker fra Hertz-modellens antagelse om lineær elastisitet, og det kan derfor være nødvendig å anvende en korreksjonsfaktor for å ta hensyn til den hyperelastiske oppførselen for nøyaktig F-D-analyse⁴⁸. Det har blitt funnet at det geometriske størrelsesforholdet, hvor R ₂ er radiusen til innrykket og R₁ er radiusen til cellen (se figur 12A), kan brukes til å forutsi de resulterende dataenes overholdelse av Hertzian mekanikk. Det ideelle geometriske størrelsesforholdet har vist seg å være β = 0,3, med β verdier <0,3 som fører til underestimering av den elastiske modulen og β verdier > 0,3 som fører til overestimering av den elastiske modulen når den analyseres med Hertz kontaktteori⁴⁸. En vanlig måte å unngå ikke-lineære effekter på er å holde deformasjonene små. I denne studien var innrykksdybden begrenset til 500 nm-1 μm.

Et representativt datasett som viser resultater av et enkelt sett med nanoindentasjonseksperimenter på MSC og isolerte kjerner er vist i figur 12B. I dataene presentert i figur 12B, prekalibrert (fjærkonstant via LDV og spissradius via SEM), ble 5 μm radius halvkuleformede sonder med en nominell fjærkonstant på k = 0,04 N/m brukt til å undersøke forskjeller i modul mellom intakte levende MSC-er og isolerte MSC-kjerner, som fungerte som kontroller for å teste effekten av statiske og dynamiske stammer på celle- og nukleærmekaniske egenskaper⁴⁶ . På grunn av forskjeller mellom og utfordringer med å engasjere seg på cellene og kjernene, har de ekstraherte moduldataene en tendens til å vise en stor variasjon (dvs. fordeling av verdier). Følgelig presenterer datasettet i figur 12B en^75-prosentil av de innsamlede dataene. På grunn av denne medfødte variabiliteten blant levende celler og resulterende målespredning, anbefales det å gjennomføre replikere nanoindentasjonseksperimenter på et stort antall prøver med minst tre biologiske replikater for å generere robust statistikk for dataanalyse og tolkning³⁰.

Mekaniske egenskaper av kolesterolholdige lipid-dobbeltlag
Støttede lipidmembraner med svært høyt (>50 mol%) kolesterolinnhold (Chol), typisk for sammensetningen funnet i øyelinsemembraner, ble fremstilt og inkubert på nyspaltet muskovitt^{glimmer 49}. Et representativt AFM-topografibilde av en slik støttet lipidmembran (SLM) fremstilt ved et Chol/POPC (POPC = 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-fosfokolin) blandingsforhold på 1 er vist i figur 13A, med høydeprofilen langs den lilla linjen i bildet vist under figuren. SLM i figur 13A dekket fullstendig den eksponerte glimmeroverflaten med tilstrekkelig inkubasjonstid (~25 min) og en tilstrekkelig lipidkonsentrasjon (0,3 mg/ml), noe som fremgår av mangelen på særtrekk i topografibildet. På samme måte gir høydeprofilen over bildet strukturelle detaljer angående ruheten på membranoverflaten, med SLM glatt som forventet.

Figur 13B viser en samling av innflygingsseksjoner av kraftkurver fanget på SLM vist i figur 13A. For å oppnå bedre statistikk over de mekaniske egenskapene til SLM, ble kraftkurver samlet på like fjerne punkter fordelt minst 100 nm fra hverandre, som dekker nesten hele bredden av SLM. Avstanden mellom punktene (≥10x innrykksdybden) ble valgt for å hindre at innrykk oppstår for tett sammen. Kraftkurvene viser en klar gjennombruddshendelse, som det fremgår av diskontinuiteten eller det plutselige hoppet mellom separasjonsavstandene ~0 og ~5 nm i tilnærmingsdelen av kraftkurvene der kraften faller bratt fra ~10 nN til ~5 nN. Den gjennomsnittlige gjennombruddskraften for membranen vist i figur 13A (Chol/POPC-blandingsforhold på 1) basert på tilnærmingskurvene i figur 13B er beregnet til 9,25 ± 0,27 nN.

I kontrast viser figur 13C et AFM-topografibilde av de delvise membran- eller membranplastrene dannet ved igjen å inkubere membraner ved et Chol/POPC-blandingsforhold på 1, men ved en mye lavere konsentrasjon av lipider (~15 μg/ml) og med kortere inkubasjonstid (~5-6 min)⁴⁹. Høydeprofilen langs den røde linjen over membranlappen i midten av bildet vises under figuren. Målingen over det delvise dobbeltlaget gir tykkelsen på SLM, vist ved de svarte stiplede linjene i figur 13C til å være ~ 7 nm. Imidlertid inneholder denne målte tykkelsen også et vannlag på 1-2 nm mellom membranen og glimmerskiven⁵⁰. Det skal bemerkes at den delvise membranen ofte bare er svakt festet til glimmeroverflaten, noe som kan føre til at lipidpartikler fjernes fra kanten av delmembranplastene under skanning, men en litt lengre inkubasjonstid eller senking av bildekraften kan eliminere denne vanskeligheten.

Kalibrering av AFM-sonden er avgjørende for å kvantifisere SLMs mekaniske egenskaper nøyaktig. Spesielt, selv om spissfjærkonstanten forblir konsistent i luft- eller væskemedium, må avbøyningsfølsomheten kalibreres i samme medium der eksperimenter utføres. Det er avgjørende å kalibrere avbøyningsfølsomheten umiddelbart før hvert sett med kraftkurveopptak for å sikre reproduserbare resultater, da laserjusteringen og/eller reflektiviteten til baksidebelegget kan endres over tid, spesielt i væske. Svært skarpe sonder frarådes for å fange membrankraftkurver, da de lett punkterer SLM og kan føre til måling av en feilaktig lav gjennombruddskraft eller ingen gjennombrudd i det hele tatt. Gjentatt bruk av samme spiss uten skikkelig rengjøring øker imidlertid sjansen for at rusk samler seg på spissen og dermed sløver spissen eller påvirker klebemiddelkreftene i spissprøven. Mangel på gjennombruddshendelser som er tydelige i tilnærmingskraftkurvene, kan også tilsvare å skyve bare på glimmer i stedet for den faktiske membranen; Dermed er visuell bekreftelse av membrandannelse før fangst av kraftkurver nødvendig.

Figur 7: Representative kraftforskyvningskurver (F-D) i luft og væske. Representative kraftkurver oppnådd på (A) en loblolly furu i luft med tilhørende DMT-modellpassform, og (B) en levende MSC-kjerne i PBS med en tilhørende Hertz-modellpassform. Innsatser i panel A og B viser en zoom av kontaktområdet til de tilsvarende innflygingskurvene (blå spor) med tilhørende passform (grønne streker). I hvert panel er det første kontaktpunktet for spissprøven (som bestemt av tilpasningsalgoritmen) indikert med en grønn diamant, mens vendepunktet (dvs. overgang fra tilnærming til tilbaketrekking eller tilbaketrekking) indikeres av en cyansirkel. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 8: Sammenligning av slitasje på silisiumsondespisser versus diamantsonder. (A-D) Silisiumsondespiss. Serier av modeller laget av blindspissrekonstruksjonsmetoden etter avbildning av en spisskarakteriseringsprøve, som demonstrerer utviklingen i radius av en stiv utkraget silisiumspisssonde (se materialfortegnelse) på grunn av progressiv spissslitasje opplevd i løpet av tre sekvensielle 85 μm x 85 μm (1024 x 1024 piksler) kraftkurvebaserte bilder av en Bakken-skiferprøve, utført med en linjeskanningsfrekvens på 0,1 Hz og samplingsfrekvens for kraftkurve på 2 kHz (dvs. ~20 millioner interaksjoner/bilde i spissprøven). (A) Tips som mottatt (ut av esken), før bruk. R = 11 nm. (B) Tips etter ett bilde (R = 43 nm). (C) Tips etter to bilder (R = 94 nm). (D) Tips etter tre bilder (R = 129 nm). (E,F) Diamant sonde spissen. BTR-modeller av samme diamantspisssonde (se materialtabell) fikk ~6 måneders mellomrom. Mellom oppkjøpet av spissbildene som ble brukt til å generere modellene vist i E og F, ble tusenvis av nanoindents utført med sonden og hundrevis av millioner av spissprøveinteraksjoner under kraftkurvebasert avbildning skjedde. Likevel, på grunn av diamantens hardhet, endret ikke den estimerte spissens enderadius på ~ 30 nm innenfor usikkerhetsgrensene for BTR-teknikken mellom oppkjøp av de første (E) og oppfølgingsbildene (F) av spissen. Asperiteten observert i den tidligere modellen (indikert med den svarte sirkelen i panel E er mest sannsynlig enten en artefakt av BTR-metoden eller på grunn av tilstedeværelsen av en nanoskalaforurensning (f.eks. Støvpartikkel) på siden av spissen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 9: AFM-topografi og modulkart over en loblolly furuprøve. Representative AFM-data samlet i luft på en tverrsnittet loblolly furuprøve innebygd i harpiks for å muliggjøre utkragingsbaserte nanoindentasjonsmålinger på cellevegger. (A) AFM-topografibilde som dekker flere celler ervervet via en rask kraftkurvebasert avbildningsmodus, presentert som en pseudo-3D-avbildning. (B) Elastic eller Youngs modulkart generert i sanntid av AFM-programvaren ved å analysere kraftkurven som er oppnådd ved hver piksel og tilpasse dataene til DMT-modellen, noe som viser at celleveggene er stivere enn celleinteriørene. Merk at de nominelle, i stedet for målte, sondekalibreringsparametrene ble brukt, så modulverdiene skal behandles som kvalitative eller bare semikvantitative. (C) Oversikt over avkastningen som indikerer stedene (åtte linjer bestående av 50 hvite trådkors stykket fordelt ≥100 nm fra hverandre) hvor 400 nanoindents (60 nm nominell rampestørrelse, med en 1 μN utløserterskel som tilsvarer en gjennomsnittlig innrykksdybde på ~ 10 nm) ble utført langs utvalgte cellevegger etter oppkjøp av AFM-bildet for å muliggjøre lokalisering av innrykk med nanoskala presisjon. Skalastenger = 20 μm (A,B). Forkortelser: AFM = atomkraftmikroskopi; DMT = Derjaguin-Müller-Toporov. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 10: Samlokalisert AFM og SEM/EDS av en Bakken-skiferprøve. (A) Sekundært elektron SEM-bilde av en del av en Bakken-skiferprøve. (B) AFM-topografibilde av regionen angitt med den svarte boksen i A. Svart oval indikerer et område der sondens lave sideforhold fører til avbildning av sondens sidevegg i stedet for den bratte overflatetopografifunksjonen med høyt sideforhold. (C) EDS elementær komposisjonskart oppnådd for SEM-bildet vist i A. (D) AFM-avledet elastikk eller Youngs modulkart generert i løpet av å oppnå AFM-topografibildet i B, som viser mineralinkluderingen i sentrum av bilder A-D er betydelig vanskeligere enn den omkringliggende organiske matrisen. Skalastenger = 50 μm. Forkortelser: AFM = atomkraftmikroskopi; SEM = skanning elektronmikroskopi; EDS = energidispersiv spektroskopi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 11: Effekt av sondespissradius og -form på utseendet til funksjoner med høyt sideforhold. Sammenligning av funksjonsoppløsning oppnådd ved bruk av enten (A) en R≈ 30 nm lavt sideforhold (spisshalvvinkel = 47°) diamantspisssonde (se materialfortegnelse) eller (B) en R≈ 10 nm høyt sideforhold (spisshalvvinkel ≈ 19°) stiv silisiumsonde (nominell k = 200 N/m; se materialfortegnelse) for å avbilde samme sted på en Bakken-skiferprøve. (VG Nett) Innzoomede bilder av de blå (C,D) og oransje (E,F) boksområdene i A og B tatt med enten større krumningsradius med lavt sideforhold diamantspisssonde (C,E) eller den skarpere stiv tappemodussonden i silikon (D,F) med høyere sideforhold, som fremhever redusert funksjonsoppløsning og innføring av sideveggartefakter på spissen i AFM-topografibildet tatt med diamantspisssonden på grunn av den større spissradiusen og halv vinkel. Områdene som er fremhevet i C-F, inneholder bratte, dype, vellignende funksjoner som demonstrerer avveiningene når det gjelder sideoppløsning, nøyaktig sporing og bildegjengivelse mellom en lettere sløv, i utgangspunktet skarp silisiumsonde eller en sløvere, slitesterk diamantspisssonde. (G) Sammensatt 3D-bilde generert ved å kombinere AFM-topografi oppnådd med den skarpe, høyere sideforholdet stiv silisiumsonde med moduldata (overlagt farget hud) avledet fra rask kraftkurveavbildning av det samme området av prøven med diamantspisssonden. Funksjonene fremhevet av de blå og hvite boksene i A og B er også angitt i G. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 12: Utkragingsbasert nanoindentasjon på celler eller kjerner. (A) En celle med radius R ₁ plassert på et flatt, stivt substrat er innrykket til en dybde d av en sfærisk indenter med radius R₂. Dette tallet er gjengitt fra Ding et ^al.48. (B) Individuelle verdiplott av representative modulmålinger oppnådd fra AFM utkragebaserte nanoindentasjonseksperimenter på mus MSC og isolerte kjerner ekstrahert fra mus MSCs. Totalt 10 celler og 10 kjerner ble målt fem ganger hver ved en innrykksdybde på 500-600 nm (valgt for å tillate bruk av Hertz kontaktmekanikkmodell). De resulterende rå F-D-kurvedataene ble behandlet ved hjelp av Atomic J²³ for å beregne den elastiske modulen. På grunn av den store medfødte variabiliteten til cellene, plottes en 75^{. persentil} av dataene. Cellekjerner og isolerte kjerner viste ingen statistisk forskjell i elastisk modul, med en målt gjennomsnittlig modul på henholdsvis 0,75 ± 0,22 kPa og 0,73 ± 0,22 kPa. Lignende data har blitt samlet inn og analysert for å bestemme forskjeller i kjernefysisk stivhet på grunn av mekanisk stimulering, protein knockouts og kjemiske behandlinger. Forkortelser: MSC = mesenkymal stamcelle; AFM = atomkraftmikroskopi; F-D = kraftforskyvning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 13: Morfologi og nanomekaniske egenskaper av lipid bilayers. (A) AFM-topografibilde som viser minimal høydevariasjon av en komplett støttet lipidmembran (SLM) sammensatt av Chol/POPC i et blandingsforhold på 1 som ble dannet over hele den eksponerte glimmeroverflaten med lang inkubasjonstid (~25 min) og høy lipidkonsentrasjon (0,3 mg/ml). Høydeprofilen langs den lilla linjen over midten av bildet er vist under figuren, og gir strukturelle detaljer av membranoverflaten. Som forventet er SLM ekstremt jevn. (B) Innsamling av innflygingsseksjoner av kraftkurver fanget på SLM vist i A. Kraftkurver ble samlet på like fjerne punkter ≥100 nm fra hverandre som dekker nesten hele SLM. Kraftkurvene viser en klar gjennombruddshendelse, noe som gjenspeiles av diskontinuiteten eller det plutselige hoppet i tilnærmingsdelen av kraftkurvene. Den gjennomsnittlige gjennombruddskraften er 9, 25 ± 0, 27 nN. (C) Partielle membran- eller membranplaster dannet ved inkubering av membraner ved et Chol/POPC-blandingsforhold på 1 med kortere inkubasjonstid (~5-6 min) og lavere lipidkonsentrasjon (~15 μg/ml) i forhold til A⁴⁹. Høydeprofilen langs den røde linjen på plasteret vises under bildet. Det delvise dobbeltlaget gjør det mulig å måle tykkelsen på SLM, vist ved de svarte stiplede linjene i høydeprofilen. Merk at den målte tykkelsen også inneholder et vannlag på 1-2 nm mellom membranen og glimmerskiven⁵⁰. Denne figuren ble tilpasset fra Khadka et ^al.49 med tillatelse fra Elsevier. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Prøve forberedelse
For nanoindentasjon i luft inkluderer vanlige prepareringsmetoder kryoseksjonering (f.eks. Vevsprøver), sliping og / eller polering etterfulgt av ultramikrotoming (f.eks. Harpiksinnebygde biologiske prøver), ionfresing eller fokusert ionstrålepreparasjon (f.eks. Halvleder-, porøse eller blandede hardhetsprøver som ikke kan poleres), mekanisk eller elektrokjemisk polering (f.eks. metalllegeringer) eller tynnfilmavsetning (f.eks. Atomlag eller kjemisk dampavsetning, molekylær stråle epitaksi). Målet er å lage en prøve med minimal overflateruhet (ideelt nm-skala, ≤0,1x den tiltenkte innrykksdybden). Med mange av de foregående metodene kan prøven senere skylles med og / eller sonikeres i høy renhet filtrert (f.eks. HPLC-klasse) løsningsmiddel og tørkes med ultrahøy renhet (99,999%) nitrogen (N₂) gass for å fjerne partikkelformig rusk. Alternativt kan flak (f.eks. 2D-materialer) eller partikler (f.eks. Nanopartikler eller mikrokapsler) spinnes belagt eller slippes ut av løsninger fremstilt ved bruk av filtrerte løsningsmidler med høy renhet. I dette tilfellet er målet å oppnå en overflatetetthet som gir flere ikke-overlappende flak eller partikler i synsfeltet i et tilfeldig valgt område på prøven. For nanoindentasjon i væske (ofte brukt til biologiske prøver som krever bufferløsning for å forbli levedyktig), er avsetning eller forberedelse av prøver på et glatt (nanometerskala overflateruhet) substrat (f.eks. Mikroskoplysbilde, petriskål eller nyspaltet muskovitt glimmer) nødvendig^46,47,49.

Hensyn ved sondevalg
Valget av en passende sonde er av største betydning for kvantitativ analyse av F-D-kurver, da spissprøveinteraksjonen er den grunnleggende egenskapen som måles i utkragingsbasert nanoinnrykk. Følgende spørsmål er spesielt viktige når du velger en sonde for et gitt eksperiment. Hva er prøvens forventede (eller målte) overflateruhet og elastiske modulområde? Prøver med høy ruhet kan forårsake akselerert slitasje sammenlignet med jevnere prøver på grunn av de økte sidekreftene som er tilstede på spissen når du sporer bratte funksjoner, samt øke sannsynligheten for spissbruddhendelser⁵³. På samme måte, jo vanskeligere prøven er, desto raskere vil den bære sondespissen. I tillegg, hvor mange bilder og / eller nanoindents er nødvendig? Med mindre avbildning og innrykk kan man forvente mindre slitasje på tuppene. Som beskrevet mer detaljert nedenfor, kan slitasje på spissen reduseres ved å bruke diamantlignende karbonbelegg (DLC) eller praktisk talt elimineres ved å bruke diamantspissprober (med de høye anskaffelseskostnadene kompensert over tid av den nesten uendelige sondens levetid).

En annen vurdering ved å velge en passende sonde er størrelsen på funksjonene av interesse. For nanoindentasjon er det ofte best å bruke størst mulig spissstørrelse samtidig som du opprettholder den romlige oppløsningen som trengs for prøven (e) i spørsmålet og ønsket informasjonsinnhold, fordi større tips er mindre sannsynlig å oppleve plutselige spissgeometriendringer på grunn av brudd og vil også vise lavere slitasjehastigheter⁵⁴. Det er også viktig å vurdere om det finnes andre AFM-metoder som skal samlokaliseres med nanoindentasjon, for eksempel ledende AFM⁵⁵, Kelvin sondekraftmikroskopi (KPFM) ⁵⁶ eller magnetisk kraftmikroskopi (MFM) ⁵⁷. Hvis flere metrologier som disse skal benyttes, må sondespissen kanskje være elektrisk ledende eller magnetisk, noe som vil påvirke materialsammensetningen og dermed en rekke egenskaper, inkludert hardhet, slitestyrke og spissradius. På samme måte, hvis innrykk vil bli utført i væske, er sammensetningen av sondens reflekterende baksidebelegg (hvis det er til stede) et annet viktig hensyn, da det må være korrosjonsbestandig (f.eks. Et Au-baksidebelegg er vanlig for væskeprober). Til slutt, og kanskje viktigst, må sondeutkragerens fjærkonstant tilpasses det forventede området av elastiske moduler som skal måles. Hvis fjærkonstanten ikke stemmer godt overens med prøvemodulen, kan ett av to tilfeller oppstå. Hvis utkragingen er for stiv, vil liten eller ingen avbøyning måles og karakterisering blir umulig; Omvendt, hvis utkragingen er for myk, vil den ikke kunne deformere prøven nok til å måle dens mekaniske egenskaper.

Slitasje på tuppen
Slitasje kan defineres på mange måter; for diskusjonen av AFM-sondespissslitasje her, vil det bli definert som enhver endring i overflatetopografien til sondespissen på grunn av plastisk deformasjon uten tap av materiale, samt fjerning av materiale fra overflaten på grunn av fysiske interaksjoner⁵⁸. I bredere forstand kan slitasje også innebære kjemiske reaksjoner som oksidasjon og hydrering. I normale AFM-applikasjoner er den laterale romlige oppløsningen vanligvis begrenset av spissradiusen⁵⁹, og spissprøveinteraksjonen er den primære målte egenskapen. Siden spissradiusen er en nøkkelparameter i modellering av kontaktmekanikken til spissprøvesystemet og deretter bestemme de mekaniske egenskapene, er spissslitasje spesielt bekymringsfull når du utfører nanoindentasjonseksperimenter og er en nøkkelbegrensning for nøyaktig tolkning av nanoindentasjonsresultater⁵³. På grunn av den normalt gradvise arten av spissslitasje (bortsett fra spissbrudd), er det ikke mulig å kvantifisere spissslitasje på grunn av en enkelt nanoindentasjonssyklus (dvs. rampe). I tillegg egner den vinkelrette bevegelsen av sondespissen i forhold til prøven i nanoinnrykk (diskontering av rask kraftkurvebasert avbildning) seg til å redusere slitasjehastigheten, da den primære modusen for slitasje på spissen vanligvis er skjærkrefter som utvikler seg under skanningsmodus⁶⁰. Som sådan er den primære kilden til spissslitasje i nanoindentasjonseksperimenter enhver avbildning utført etter den første sondekalibreringen (spesielt avbøyningsfølsomhet og spissradiusmålinger), men før nanoindentasjon. Det anbefales derfor at hvis silisium- eller silisiumnitridprober brukes, bør spissradiusen kontrolleres både før og etter hvert eksperiment for å overvåke og ta hensyn til eventuell slitasje på spissen ved hjelp av en av metodene beskrevet ovenfor (f.eks. SEM-analyse eller BTR).

Sonde materialer
Diamantlignende karbon (DLC)
Gjennom bruk av DLC-belagte sondespisser eller diamantspisser kan spissslitasje reduseres kraftig eller oppheves helt⁵³. Den forbedrede slitestyrken til disse alternative tuppmaterialene er svært fristende for måling av mekaniske egenskaper, spesielt av svært stive materialer. Det har vist seg at DLC-sondespisser kan vise en 1,600 ganger økning i slitestyrke sammenlignet med normale silisiumprobespisser⁵⁴. Denne dramatiske økningen i slitestyrke kan tilskrives flere faktorer. For det første er bindingene som er tilstede i DLC (C-C og C = C) og dets grensesnitt med silisium (Si-O, Si-C) noen av de sterkeste bindingene til noen elementære par, og mye sterkere enn Si-Si-bindingene som er tilstede i silisiumspisser. DLC har også effekten av å redusere friksjon, noe som igjen senker skjærspenningene i spissen, og dermed reduserer slitasje. I tillegg er DLC-overflatekjemien forskjellig fra kjemien til en silisiumspiss, ettersom silisiumspisser kan oppleve tribokjemisk etsing under omgivelsesfuktighetsforhold, mens DLC-spisser ikke gjør det (eller i det minste ikke på noen meningsfull måte sammenlignet med den primære slitasjemodusen)⁵⁴. Den primære ulempen med DLC-belagte spisser (utover økt pris i forhold til standard ubelagte silisiumspisser) er den økte spissradiusen på grunn av selve belegget. De fleste DLC-probespissradier er ≥30 nm, mens ikke-DLC-belagte spisser pålitelig kan nå 1-2 nm i radius⁶¹. Imidlertid kan en større spissradius ofte være ønskelig for nanoindentasjonseksperimenter for å redusere feil i egenskapsmålinger, da nanoskalaavvik mellom den ideelle områdedybdefunksjonen og den faktiske områdedybdefunksjonen, på grunn av sondefeil eller asperiteter, vil uforholdsmessig påvirke målinger gjort med mindre radiusprober på grunn av den større relative feilen. I tillegg, til tross for sin overlegne slitestyrke, kan DLC-belegget til slutt slites gjennom i flekker, noe som fører til forskjellsslitasje mellom den eksponerte silisiumkjernen og det gjenværende DLC-belegget. Dessverre kan slitestyrken til DLC-belegget også begrenses av beleggets vedheft til silisiumspissen i stedet for beleggets faktiske hardhet alene.

Diamant
Diamant er kjent som et av de hardeste og mest slitesterke materialene på jorden. Likevel har det vist seg at betydelig slitasje fortsatt kan forekomme i diamantspisser ved bruk av store (60 μN) krefter i et bevisst forsøk på å utforske spissslitasje⁶². Omvendt, i normale nanoindentasjons- og bildescenarier der kreftene som utøves på spissen er mye mindre, har det ikke vært noen strenge studier av diamantspissslitasje. Imidlertid, som vist i figur 8E, F, genererte BTR-modellering av den samme diamantprobespissen under identiske forhold på samme spisskarakteriseringsprøve med 6 måneders mellomrom praktisk talt uutslettelige spissformmodeller (dvs. ingen merkbare tegn på slitasje). Mellom det første og andre BTR-bildet ble sonden brukt til å utføre tusenvis av nanoindents og gjennomgikk hundrevis av millioner av spissprøveinteraksjoner mens de avbildet en rekke stive materialer (E > 15 GPa), inkludert tre (loblolly furu), skifer, høyt bestilt pyrolytisk grafitt (HOPG) og forskjellige grafen tynne filmer. Signifikant endret den estimerte spissradiusen med ~ 1 nm mellom de to bildene i figur 8E, F, som er godt innenfor BTR-metodens feil⁶³. Selv om det ikke er en fullstendig studie, viser denne sammenligningen den utmerkede holdbarheten til en diamantsonde under normale eksperimentelle nanoindentasjonsforhold (og til og med bildebehandling). De største ulempene forbundet med bruk av diamantspisser (utover dyre forhåndskostnader) er den økte spissradiusen og, på noen måter av mer bekymring, det lave sideforholdet til kubehjørnegeometrien til de fleste kommersielt tilgjengelige diamantspisser. Figur 11A,B presenterer side-ved-side, komparative AFM-bilder av det samme området av en Bakken-skiferprøve tatt med en skarp silisiumsonde med en nominell spissradius på 8 nm og gjennomsnittlig halvvinkel på ~19° versus en diamantspisssonde med en nominell spissradius på 40 nm og gjennomsnittlig sidevinkel på 47°. Når de forstørrede områdene sammenlignes (figur 11C, D og figur 11E, F), er det lett tydelig at diamantspisssonden ikke er i stand til å løse og nøyaktig spore de brattere (høyere størrelsesforhold) funksjonene i bildet. I stedet, der bratte trekk er til stede, kommer spissens sidevegg i kontakt med den øvre kanten, og AFM-systemet sporer i hovedsak sondens sidevegg til spissenden kommer i kontakt med overflaten igjen og normal sporing gjenopptas.

Vårkonstant/modulmatching
Som nevnt ovenfor må sondeutkragerens fjærkonstant tilpasses det forventede området av elastiske moduler som skal måles. For å hjelpe til med å velge en passende sonde, presenterer tabell 3 foreslåtte omtrentlige nominelle utkragefjærkonstanter som passer for utvalgte brede områder av forventede prøveelastiske moduler som spenner fra få MPa til 100 GPa når det gjelder ~ 30-40 nm radius sondespisser som ofte brukes til nanoindentasjon⁵². Nedre fjærkonstantsonder (k < 0,1 N/m) er tilgjengelige for enda mykere materialer (kPa-område) som celler.

Fjærkonstant (N/m)	Forventet prøvemodulområde
0.25	≤ 15 MPa
5	5 - 500 MPa
40	200 – 8,000 (0.2 – 8 GPa)
200	1,000 - 50,000 (1 - 50 GPa)
450	10,000 - 100,000 (10 - 100 GPa)

Tabell 3: Ideelle sondefjærkonstanter for måling av ulike modulområder. Omtrentlige nominelle sondefjærkonstanter for optimal måling av elastiske moduler over varierende områder fra få MPa til 100 GPa, forutsatt en typisk sonderadius på ~ 30-40 nm⁵².

I tillegg til fjærkonstanten, i det spesielle tilfellet av biologiske materialer, må spissradiusen og kreftene som påføres under avbildning og nanoindentasjon vurderes nøye for å unngå skade. I applikasjonseksemplet som involverte måling av de mekaniske egenskapene til kolesterolholdige lipid-dobbeltlag, presentert i den representative resultatdelen, ble en relativt skarp (10 nm) spiss spesielt brukt til analyse av gjennombruddskraften i lipid-dobbeltlag. I kontrast, hvis materialavkastningen er stor nok (f.eks. som tilfellet er for celler og cellekjerner) og det er bekymring angående potensialet for punktering, er større halvkuleformede spisser på mikronskala, som de som brukes i stivhetsmålingene på MSC-kjerner beskrevet i et av applikasjonseksemplene i delen om representative resultater, ideelle og gir gode resultater for myke, skjøre prøver som levende celler og isolerte kjerner. Kain et al. presenterer en grundig diskusjon av hvordan man velger den optimale kombinasjonen av sonderadius og fjærkonstant for å oppnå høyest mulig målefølsomhet for slike prøver⁶⁴.

Kalibrering av sonde
Følsomhet for avbøyning
Avbøyningsfølsomheten relaterer bevegelse av Z-piezoen (og dermed avbøyning av utkragingen ved innrykk på et uendelig stivt substrat, forutsatt drift i grensen for små avbøyninger) til en målt spenningsendring på PSD⁶⁵. Avbøyningsfølsomheten (også referert til som den inverse optiske spakfølsomheten [InvOLS]) kan rapporteres i nm/V eller V/nm. En oversikt over de vanligste kalibreringsmetodene for avbøyningsfølsomhet er gitt nedenfor.

Hard overflatekontakt
Den enkleste og mest populære metoden for å bestemme avbøyningsfølsomheten til strålesprettlaseren / AFM-sonden / PSD-systemet er den passende navnet "hard overflatekontakt"^{-metoden 65}. Dens enkelhet, enkel integrering i AFM kontroll programvare arbeidsflyter, og in situ natur alle legge til hard overflate kontaktmetoden appell og utbredt bruk. For å implementere denne metoden blir AFM-sondespissen rampet mot et materiale som er mye stivere enn utkragingen. Hellingen til kontaktdelen av kraftforskyvningskurven (vist som volt for vertikalt avbøyningsfeilsignal på PSD som en funksjon av Z-piezo-bevegelse i nm eller påført spenning) gir deretter avbøyningsfølsomheten (figur 3A). Bruken av et stivt substrat sikrer at all den målte avbøyningen oppstår fra utkragingsbøyningen i stedet for en konvolusjon av prøvedeformasjon og utkragerens forskyvning. Når det gjelder myke utkrager (f.eks. k < 10 N / m), er silisium (E ≈ 170 GPa) ²⁷ eller glimmer¹⁷ lett tilgjengelige og lett brukte materialer (eller alternativt glass, E≈ 70 GPa, eller passende hard plast når det gjelder celler immobilisert på et mikroskopglass eller petriskål), mens for stivere utkrager, slik som de som brukes til noen nanoindentasjonseksperimenter (f.eks. k > 200 N / m; Tabell 3), kan det være nødvendig å bruke safir (E≈ 345 GPa) ^26,66 for å sikre at ingen prøvedeformasjon oppstår. Fordi denne metoden er avhengig av kraftforskyvningsmålingen, må AFM-skannerens Z-piezo enten bruke en lukket sløyfehøydesensor eller være godt kalibrert (hvis den brukes i åpen sløyfemodus) ved hjelp av en rekke høydestandarder. Den største bidragsyteren til feil i kontaktmetoden for hard overflate er bevegelse av laserpunktet på utkrageren på grunn av termiske svingninger. Endringer i temperaturen på utkrageren er oftest forårsaket av deteksjonslaseren, selv om Joule-oppvarming i den omkringliggende elektronikken også kan bidra. Generelle temperaturforskjeller på 6 °C mellom utkragingsluften og omgivelsesluften er rapportert, noe som kan føre til laserpunktforskyvninger på flere mikron⁶⁷. For å ta hensyn til eventuell oppvarming anbefales det å vente ≥30 minutter etter den første laserpunktjusteringen for å la utkragingen komme i termisk likevekt med omgivelsene for de beste og mest nøyaktige resultatene. Gjennomsnitt av innflygings- og trekkkurvene for hver følsomhetsmåling vil ta hensyn til eventuell spissfriksjon eller glideeffekter og bør om mulig iverksettes⁶⁸. I tillegg vil gjennomsnitt på tvers av flere følsomhetsmålinger bidra til å måle påliteligheten og reproduserbarheten til målingen. Gode følsomhetsmålinger bør resultere i avvik på ≤1% og utføres ved omtrent samme avbøyning som de forventede eksperimentelle nanoindents for å maksimere effektiviteten av kalibreringen⁶⁹. Den største ulempen med kontaktmetoden på den harde overflaten er at den fysiske kontakten som er nødvendig for kalibreringen, potensielt kan forårsake skade på skjøre silisiumspisser (f.eks. sløving eller dannelse av spissartefakter som en dobbeltspiss).

Termisk støymetode
Den termiske støymetoden for å bestemme avbøyningsfølsomheten krever tidligere kalibrering av utkragfjærkonstanten og evnen til å måle det termiske støyspekteret til utkrageren⁶⁷. Den termiske støymetoden er ofte integrert i moderne AFM-styringsprogramvare og kan brukes sammen med Sader-metoden (se nedenfor) for rask analyse og beregning av både fjærkonstanten og avbøyningsfølsomheten. Det kan imidlertid være vanskelig eller umulig å bruke metoden for termisk støy på stivere (k > 10 N/m) utkrager på grunn av redusert vibrasjonsamplitude. I tillegg er den rapporterte relative usikkerheten til termisk støymetoden betydelig større, ~ 20% sammenlignet med kontaktmetoden for hard overflate beskrevet ovenfor⁷⁰. Denne teknikken kan ikke brukes hvis termisk justeringsmetode for å bestemme fjærkonstanten beskrevet nedenfor blir brukt⁶⁷.

Vårkonstant
Gullstandarden for måling av utkragefjærkonstanter er laserdopplervibrometri (LDV), og det er nå mange kommersielt tilgjengelige sonder som kommer med LDV-avledet fjærkonstant kalibreringsinformasjon gitt av produsenten for hver enkelt sonde (se materialfortegnelse). Imidlertid, mens nøyaktig måling av den utkragede fjærkonstanten er en absolutt nødvendighet for kvantitative nanomekaniske målinger, er de praktiske metodene for å gjøre det i det typiske laboratoriet for ikke-kalibrerte sonder svært varierte og kan være noe komplekse. Som sådan er det bare gitt en kort oversikt over de to vanligste fjærkonstantkalibreringsmetodene på stedet her, med en liste over tilleggsmetoder og passende litteraturhenvisninger for å konsultere for mer informasjon.

Termisk justeringsmetode
Sannsynligvis den vanligste metoden som er tilgjengelig i dagens kommersielle AFM-er, er termisk justeringsmetode for å bestemme utkragefjærkonstanter innebygd i kontrollprogramvaren for mange systemer. Selv om den ikke er ideell for stivere utkragere (k > 10 N / m) på grunn av redusert utkrageavbøyningsdeteksjon og begrenset elektronikkbåndbredde, er termisk justeringsmetode relativt enkel å implementere og gjelder for et bredt spekter av spissgeometrier⁷¹. Den termiske tunemetoden benytter måling og montering av utkragerens termiske støyspektrum, etterfulgt av anvendelse av ekvipartisjonsteoremet for å beregne utkragerens potensielle energi, med utkrageren generelt modellert som en enkel harmonisk oscillator⁷². Den termiske tunemetoden har en feil på ~ 5% -10% for myke sonder og gjelder for alle utkragingsformer^73,74. For mer detaljert informasjon, se referansene som er sitert i dette avsnittet.

Sader-metoden
Sader-metoden er en annen metode som ofte er integrert i kontrollprogramvaren til mange moderne AFM-er^75,76,77. Sader-metoden bruker den hydrodynamiske belastningen som oppleves av en utkrager når den vibrerer i et væskemedium (vanligvis luft eller vann) sammen med utkragerens planvisningsdimensjoner og kvalitetsfaktor for å beregne utkragfjærkonstanten. Sader-metoden fører til en feil på ~ 10% -15% for utkragfjærkonstanten⁷⁴. Tilsvarende artikler om den "opprinnelige metoden"^76,78, "generell metode"^79, en utvidelse av den generelle metode ⁷⁷ og instrumentspesifikk dokumentasjon kan gi ytterligere detaljer.

Andre metoder
Det er flere andre metoder som er utviklet og implementert for å bestemme fjærkonstanten til AFM-utkrager som er utenfor omfanget av dette papiret. Selv om ingen av disse metodene er like enkle å implementere eller så utbredt som Sader- eller termisk-tune-kalibreringsmetodene, har de hver unike fordeler og ulemper. Den siterte litteraturen gir detaljer om deres anvendelse og implementering. Spesielt gir Sikora en utmerket gjennomgang av mange vårkonstantkalibreringsmetoder og er en utmerket ressurs om emnet⁷². En ikke-uttømmende liste over andre metoder for å bestemme fjærkonstanter inkluderer laser Doppler vibrometri (LDV) 73,74,80, mikro-elektrisk-mekaniske systemer (MEMS) baserte enheter⁸¹, referanse utkrager 82,83, lagt masse (både dynamisk ⁷⁵ og statisk ⁸⁴), presisjonsbalanse^85,86, elektromagnetisk aktivering ⁸⁷ og endelig elementanalyse (FEA) ^88,89.

Spiss radius
Vanlige metoder for å bestemme spissradiusen inkluderer både sekundær elektron SEM-avbildning og blindspissrekonstruksjonsmetoden (BTR).

SEM-analyse
Sekundær elektron SEM-avbildning kan gi oppløsning ned til 1 nm, slik at progressive bilder av slitasje kan sammenlignes direkte og enkelt. En ulempe med SEM-avbildning er at fordi bare svært eksperimentelle kombinerte AFM-SEM-verktøy eksisterer⁹⁰, må AFM-sonden vanligvis demonteres og transporteres til SEM for analyse, noe som kan være både tidkrevende og potensielt utsette sonden for forurensning. En annen ulempe med SEM er at det resulterende bildet er iboende en 2D-projeksjon av spissen, uten kvantitativ 3D-informasjon tilgjengelig. Det må utvises forsiktighet for å justere sonden i nøyaktig samme retning hver gang for at komparative resultater skal være meningsfulle, da selv små endringer i hendelsesvinkelen til elektronstrålen kan endre den tilsynelatende størrelsen og formen på sondespissen. Endelig kan SEM-avbildning bli plaget av ladeeffekter og karbonforurensning, noe som kan uskarpe bildet eller forårsake fysiske endringer i sondespissen, henholdsvis.

Rekonstruksjon av blindspiss
I motsetning til SEM er BTR-metoden en in situ-teknikk der 3D-spissgeometrien modelleres basert på avbildning av en prøve med mange skarpe (høyt sideforhold) trekk som er mye mindre enn sondens radius. Denne metoden fungerer fordi i AFM er det observerte bildet alltid en konvolusjon av probespissformen og prøvefunksjonsformen, så ved å modellere ekstremt skarpe funksjoner som uendelig skarpe, kan spissformen estimeres. Dessverre, i tillegg til antagelsen om uendelig skarpe pigger (dvs. overflatefunksjoner som er mye mindre enn spissradiusen), kan BTR-teknikken påvirkes av bildestøy og skanningsparametere, så komparative bilder bør oppnås ved hjelp av svært like bildeparametere. I tillegg, fordi flere "bilder" av spissen brukes til å rekonstruere geometrien, er en direkte en-til-en invers beregning av spissformen umulig. På grunn av sin natur er BTR-metoden bare praktisk i stand til å informere brukeren om den øvre grensen til spissformen⁶³, og avbildningen av sonden for å implementere BTR-metoden kan føre til slitasje på spissen (f.eks. sløving eller flising av sondespissen).

Relativ kalibrering
Noen ganger kan en bestemt sondeegenskap ikke måles lett og nøyaktig. For eksempel er fjærkonstanten til stivere utkragere vanskelig eller umulig å måle med termisk justeringsmetode på grunn av båndbredde og avbøyningsbegrensninger⁹¹. Som diskutert ovenfor finnes det andre metoder for å bestemme fjærkonstanten, men fordi termisk tune-metoden er integrert i mange moderne AFM-er, implementeres den ofte for enkel daglig bruk. På samme måte må avbøyningsfølsomheten alltid kalibreres før eksperimentering for konvertering av laserbevegelse på PSD til fysisk avbøyning av sondeutkrageren. Praktisk sett er imidlertid måling av spissradiusen det mest tidkrevende kalibreringstrinnet, og det som mest sannsynlig vil skade probespissen. Hvis det ikke er mulig å måle spissradiusen direkte via SEM eller BTR, kan en relativ kalibreringsprosedyre brukes som et alternativ for å bestemme den effektive spissradiusen, forutsatt at en standard referanseprøve med minimal overflateruhet (ideelt atomisk flat) og en velkjent modul nær den forventede eksperimentelle modulen er tilgjengelig. Eksempler på slike ideelle referansestandarder for relativ kalibrering inkluderer muskovitt glimmer 17,92,93,94,95 og HOPG ^96, men tjener også til å markere vanskeligheten med å identifisere egnede referansestandarder for mykere prøver med moduli i kPa til MPa-området. For å utføre en relativ kalibrering, må først avbøyningsfølsomheten kalibreres som beskrevet i hovedprotokollen. For det andre skal den nominelle fjærkonstanten for sonden legges inn (vanligvis leveres med sonden) eller måles via en av metodene beskrevet ovenfor. Det tredje trinnet er innrykk på modulreferansestandardprøveoverflaten ved bruk av passende parametere. Til slutt skal de innsamlede F-D-kurvedataene analyseres og spissradiusparameteren justeres til den eksperimentelt målte reduserte modulen samsvarer med den forventede reduserte modulen. Det bør tas hensyn til den gjennomsnittlige deformasjonsdybden som er oppnådd på referanseprøven, da denne dybden må opprettholdes ved innrykk på den eksperimentelle prøven av interesse for at kalibreringen skal være relevant. Nå kan innrykk på prøven av interesse forekomme, justere rampeparametrene for å matche deformasjonsdybden oppnådd på modulens standard referansemateriale.

En fordel med den relative kalibreringsmetoden er at den unngår potensielle akkumulerte feil forårsaket av unøyaktig kalibrering av avbøyningsfølsomheten, fjærkonstanten og spissradiusen⁵². I tillegg er det kanskje litt raskere og mindre sannsynlig å skade sonden enn BTR-metoden. De største ulempene med den relative kalibreringsmetoden er: 1) behovet for en referanseprøve av høy kvalitet med nm- til Angstrom-skala overflateruhet og kjente mekaniske egenskaper som ligner på prøven av interesse som kan analyseres med samme sonde som eksperimentprøven, og 2) kravet om å oppnå samme eller svært lik deformasjonsdybde på både referanse- og eksperimentprøvene for at kalibreringen skal være gyldig. Følgelig er det å foretrekke å måle spissradiusen direkte hvis det er mulig.

Analyse av data
Analysemetoden som brukes til å bestemme de mekaniske egenskapene til prøven fra de målte F-D-kurvene, er like viktig som kvaliteten på selve nanoindentasjonsdataene. Det er flere vanlige kontaktmekaniske teorier som modellerer kraftforskyvningsforhold basert på varierende underliggende forutsetninger (og dermed anvendelige i forskjellige scenarier). Disse kontaktmekanikkmodellene inkluderer Hertz 97, Sneddon 28, JKR (Johnson, Kendall og Roberts)⁹⁸, DMT (Derjaguin, Müller og Toporov)^35,99, MD (Maugis-Dugdale)100 og MYD (Muller, Jusjtsjenko og Derjaguin)^101,102. En grundig analyse og sammenligning av ulike kontaktmekanikkmodeller og deres anvendelse for analyse har blitt presentert andre steder 29,30,103,104. Selv om det er utenfor omfanget av denne artikkelen, gir tabell 4 en kort oversikt over noen av de vanligste kontaktmekanikkmodellene. Spesielt bemerkelsesverdig inneholder mer komplekse modeller som JKR, DMT og andre effekten av spissprøveadhesjon 30,35,98,99,100,101,102,103,104^, som kan være signifikant og ofte lett identifiserbar ved utseendet av negativ avbøyning i kraftkurven (se figur 3). I praksis brukes den valgte analysemodellen til å tilpasse de innsamlede F-D-dataene og bestemme de mekaniske egenskapene, for eksempel den elastiske modulen. For å passe til dataene er det nødvendig med en flat grunnlinje for å bestemme det første kontaktpunktet eller et effektivt kontaktpunkt som passer til den delen av eksperimentelle data med størst korrelasjon til modellen.

Teori	Anvendbarhet	Forutsetninger	Begrensninger
Hertz	Enkel; Ofte brukt til prøver i væske.	Ingen vedheft.	Ugyldig for systemer som har klebende krefter til stede.
Derjaguin-Müller-Toporov (DMT)	Stiv med små deformasjoner.	Kortvarig vedheft i kontaktområdet pluss langtrekkende vedheft utenfor kontaktområdet.	Begrenset geometri kan føre til en underestimering av kontaktområdet.
Johnson-Kendall-Roberts (JKR)	Myk med store deformasjoner.	Kortdistanse klebende krefter kun i kontaktområdet.	Kan undervurdere belastningen på grunn av vedheft.
Maugis - Dugdale (MD)	Denne generelle løsningen dekker de andre limmodellene.	Tips-eksempelgrensesnitt modellert som en sprekk.	Analytisk løsning som involverer parametriske ligninger.

Tabell 4: Modeller med felles kontaktmekanikk. Utvalgte felles kontaktmekanikkmodeller med anvendelighet, forutsetninger og begrensninger notert.

Den praktiske anvendelsen av modellene nevnt ovenfor for å analysere F-D-kurver krever bruk av dataprogramvare for å muliggjøre storskala batchbehandling av tusenvis eller millioner av kurver på kort tid og utføre statistisk analyse av resultatene. Intern skriftlig kode brukes ofte i analysen av F-D-data, og ulike AFM-produsenter tilbyr også programvarepakker. På grunn av sin åpen kildekode-natur, brukervennlighet og detaljert tilleggsinformasjon, anbefaler forfatterne imidlertid bruk av AtomicJ²³. Programmet tillater enkel og nøyaktig analyse av F-D-data ved hjelp av noen av teoriene beskrevet ovenfor, samt flere andre. Fordi koden er åpen kildekode, er den enkel å manipulere og tilpasse for spesifikke brukstilfeller uten å måtte bygge kompleks kode fra bunnen av. Se Hermanowicz et ^al.23 for grundig informasjon om AtomicJ-programvarepakken.

For å konkludere, gjennom nøye kalibrering av sonden, kan kontaktområdet og kraften som påføres av en AFM-sondespiss på en prøveoverflate, kvantifiseres for å muliggjøre bestemmelse av nanoskala mekaniske egenskaper, spesielt den elastiske modulen. En generalisert protokoll som fremhever beste praksis for å lykkes med å implementere AFM utkragingsbasert nanoindentasjon i luft eller væske på både myke og harde prøver, med elastiske moduler som spenner fra kPa til GPa, har blitt presentert med representative eksempler gitt. Viktige hensyn som valg av sonde (inkludert prøveoverflateruhet, funksjonsstørrelser, sondesideforhold og spissslitasje), probekalibrering og dataanalyse (inkludert kontaktmekanikkmodeller og målestatistikk) har blitt diskutert. Endelig har samlokalisering av AFM-avledede nanomekaniske kart med andre karakteriseringsteknikker som gir komposisjonsinformasjon som SEM / EDS blitt demonstrert, samt et eksempel på måling av en nanomekanisk egenskap annet enn elastisk modul (dvs. lipid bilayer rupture force) via AFM cantilever-basert nanoindentasjon for å gi eksempler på ytterligere synergistiske anvendelser av teknikken. Samlet sett bør eksemplene og diskusjonen som er gitt her, gi et inngangspunkt for forskere som ønsker å bruke AFM cantilever-basert nanoindentasjon for å måle de mekaniske egenskapene til nesten hvilken som helst prøvetype.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Atomic force microscope	Bruker	Dimension Icon	Uses Nanoscope control software, including PeakForce Quantitative Nanomechanical Mapping (PF-QNM), FastForce Volume (FFV), and Point-and-Shoot Ramping experimental workspaces
AtomicJ	American Institute of Physics	https://doi.org/10.1063/1.4881683	Flexible, powerful, free open source Java-based force curve analysis software package. Supports numerous contact mechanic models, such as Hertz, Sneddon DMT, JKR, Maugis, and cone or pyramid (including blunt and truncated). Also includes a variety of initial contact point estimation methods to choose from. Supports batch processing of data and subsequent statistical analysis (e.g., averages, standard deviations, histograms, goodness of fit, etc.). Literature citation is: P. Hermanowicz, M. Sarna, K. Burda, and H. Gabry, “AtomicJ: An open source software for analysis of force curves” Rev. Sci. Instrum. 85: 063703 (2014), https://doi.org/10.1063/1.4881683
Buffer solution (PBS)	Fisher Chemical (NaCl), Sigma Aldrich (KCl), Fisher BioReagents (Na2HPO4 and KH2PO4)	S271 (>99% purity NaCl), P9541 (>99% purity KCl), BP332(>99% purity Na2HPO4), BP362 (>99% purity KH2PO4)	Phosphate buffered saline (PBS) was prepared in the laboratory as an aqueous solution consisting of 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, and 1.8 mM KH2PO4 dissolved in ultrapure water. Reagents were measured out using an analytical balance, and glassware was cleaned with soap and water followed by autoclaving immediately prior to use.
Chloroform
Diamond tip AFM probe	Bruker	PDNISP	Pre-mounted factory-calibrated cube corner diamond (E = 1140 GPa) tip AFM probe (nominal R = 40 nm) with a stainless steel cantilever (nominal k = 225 N/m, f0 = 50 kHz). Spring constant is measured at the factory (k = 256 N/m for the probe, Serial #13435414, used here) and calibration data (including AFM images of indents showing probe geometry) is provided with the probe.
Diamond ultramicrotome blade	Diatome	Ultra 35°	2.1 mm width. Also used a standard glass blade for intial rough cut of sample surface before transitioning to diamond blade for final surface preparation
Epoxy	Gorilla Glue	26853-31-6	Epoxy resin and hardner were mixed in a 1:1 ratio, a small drop was placed on a stainless steel sample puck (Ted Pella), and V1 grade muscovite mica (Ted Pella) was attached to create an atomically flat surface for preparation of phospholipid membranes.
Ethanol
LR white resin, medium grade (catalyzed)	Electron Microscopy Sciences	14381	500 mL bottle, Lot #150629
Mesenchymal stem cells (MSCs)	N/A	N/A	MSCs for nanomechanical studies were primary cells harvested from 8-10 week old male C57BL/6 mice as described in Goelzer, M. et al. "Lamin A/C Is Dispensable to Mechanical Repression of Adipogenesis" Int J Mol Sci 22: 6580 (2021) doi:10.3390/ijms22126580 and Peister, A. et al. "Adult stem cells from bone marrow (MSCs) isolated from different strains of inbred mice vary in surface epitopes, rates of proliferation, and differentiation potential" Blood 103: 1662-1668 (2004), doi:10.1182/blood-2003-09-3070.
Modulus standards	Bruker	PFQNM-SMPKIT-12M	Used HOPG (E = 18 GPa) and PS (E = 2.7 GPa). Also contains 2x PDMS (Tack 0, E = 2.5 MPa; Tack 4, E = 3.5 MPa), PS-LDPE (E = 2.0/0.2 GPa), fused silica (E = 72.9 GPa), sapphire (E - 345 GPa), and tip characterization (titanium roughness) sample. All samples come pre-mounted on a 12 mm diameter steel disc (sample puck).
Muscovite mica	Ted Pella	50-12	12 mm diameter, V1 grade muscovite mica
Nanscope Analysis	Bruker	Version 2.0	Free AFM image processing and analysis software package, but designed for, and proprietary/limited to Bruker AFMs; similar functionality is available from free, platform-independent AFM image processing and analysis software packages such as Gwyddion, WSxM, and others. Has built-in capabilities for force curve analysis, but AtomicJ is more flexible/full featured (e.g., more built-in contact mechanics models to choose from, statistical analysis of force curve fitting results, etc.) for force curve analysis and handles batch processing of force curves.
Phospholipids: POPC, Cholesterol (ovine)	Avanti Polar Lipids	POPC: CAS # 26853-31-6, Cholesterol: CAS # 57-88-5	POPC lipid dissolved in chloroform (25 mg/mL) was obtained from vendor and used without further purification. Cholesterol powder from the same vendor was dissolved in chloroform (20 mg/mL).
Probe holder (fluid, lipid bilayers)	Bruker	MTFML-V2	Specific to the particular AFM used; MTFML-V2 is a glass probe holder for scanning in fluid on a MultiMode AFM.
Probe holder (fluid, MSCs)	Bruker	FastScan Bio Z-scanner	Used with Dimension FastScan head (XY flexure scanners). Serial number MXYPOM5-1B154.
Probe holder (standard, ambient)	Bruker	DAFMCH	Specific to the particular AFM used; DAFMCH is the standard contact and tapping mode probe holder for the Dimension Icon AFM, suitable for nanoindentation (PF-QNM, FFV, and point-and-shoot ramping)
Sample Puck	Ted Pella	16218	Product number is for 15 mm diameter stainless steel sample puck. Also available in 6 mm, 10 mm, 12 mm, and 20 mm diameters at https://www.tedpella.com/AFM_html/AFM.aspx#anchor842459
Sapphire substrate	Bruker	PFQNM-SMPKIT-12M	Extremely hard surface (E = 345 GPa) for measuring deflection sensitivity of probes (want all of the deflection to come from the probe, not the substrate). Part of the PF-QNM/modulus standards kit.
Scanning electron microscope	Hitachi	S-3400N-II	Located at Boise State. Used to perform co-localized SEM/EDS on all samples except additively manufactured (AM) Ti-6Al-4V.
Silicon AFM probes (standard)	NuNano	Scout 350	Standard tapping mode silicon probe with reflective aluminum backside coating; k = 42 N/m (nominal), f0 = 350 kHz. Nominal R = 5 nm. Also available uncoated or with reflective gold backside coating. Probes with similar specifications are available from other manufacturers (e.g., Bruker TESPA-V2).
Silicon AFM probes (stiff)	Bruker	RTESPA-525, RTESPA-525-30	Rotated tip etched silicon probes with reflective aluminum backside coating; k = 200 N/m (nominal), f0 = 525 kHz. Nominal R = 8 nm for RTESPA-525, R = 30 nm for RTESPA-525-30. Spring constant of each RTESPA-525-30 is measured individually at the factory via laser Doppler vibrometry and supplied with the probe.
Silicon carbide grit paper (abrasive discs)	Allied	50-10005	120 grit
Silicon nitride AFM probes (soft, large radius hemispherical tip)	Bruker	MLCT-SPH-5UM, MLCT-SPH-5UM-DC	Also MLCT-SPH-1UM-DC. New product line of factory-calibrated (probe radius and spring constants of all cantilevers) large radius (R = 1 or 5 mm) hemispherical tip (at the end of a 23 mm long cylindrical shaft) probes. DC = drift compensation coating. 6 cantilevers/probe (A-F). Nominal spring constants: A, k = 0.07 N/m; B, k = 0.02 N/m; C, k = 0.01 N/m; D, k = 0.03 N/m; E, k = 0.1 N/m; F, k = 0.6 N/m.
Silicon nitride AFM probes (soft, medium sharp tip)	Bruker	DNP	4 cantilevers/probe (A-d). Nominal spring constants: A, k = 0.35 N/m; B, k = 0.12 N/m; C, k = 0.24 N/m; D, k = 0.06 N/m. Nominal radii of curvature, R = 10 nm.
Silicon nitride AFM probes (soft, sharp tip)	Bruker	ScanAsyst-Air	Nominal values: resonance frequency, f0 = 70 kHz; spring constant, k = 0.4 N/m; radius of curvature, R = 2 nm. Designed for force curve based AFM imaging.
Superglue	Henkel	Loctite 495	Cyanoacrylate based instant adhesive. Lots of roughly equivalent products are readily available.
Syringe pump	New Era Pump Systems	NE1000US	One channel syringe pump system with infusion and withdrawal capacity
Tip characterization standard	Bruker	PFQNM-SMPKIT-12M	Titanium (Ti) roughness standard. Part of the PF-QNM/modulus standards kit.
Ultrahigh purity nitrogen (UHP N2), 99.999%	Norco	SPG TUHPNI - T	T size compressed gas cylinder of ultrahigh purity (99.999%) nitrogen for drying samples
Ultramicrotome	Leica	EM UC6	Equipped with a glass blade (standard, for intial sample preparation) and a diamond blade (for final preparation)
Ultrapure water	Thermo Fisher	Barnstead Nanopure Model 7146	Model has been discontinued, but equivalent products are available. Produces ≥18.2 MΩ*cm ultrapure water with 1-5 ppb TOC (total organic content), per inline UV monitoring. Includes 0.2 µm particulate filter, ion exchange columns, and UV oxidation chamber.
Variable Speed Grinder	Buehler	EcoMet 3000	Used with silicon carbide grit papers during hand polishing.
Vibration isolation table (active)	Herzan	TS-140	Used with Bruker MultiMode AFM. Sits on a TMC 65-531 vibration isolation table. Bruker Dimension Icon AFM utilizes strictly passive vibration isolation (comes from manufacturer with custom acoustic hood, air table, and granite slab).
Vibration isolation table (passive)	TMC	65-531	35" x 30" vibration isolation table with optional air damping (disabled). Used with Bruker MultiMode AFM. Herzan TS-140 "Table Stable" active vibration control table is located on top.