Atomic Force Microscopy Cantilever-Based Nanoindentation: Mechanische eigenschapsmetingen op nanoschaal in lucht en vloeistof

Summary

Het kwantificeren van het contactoppervlak en de kracht die door een atoomkrachtmicroscoop (AFM) sondepunt op een monsteroppervlak wordt uitgeoefend, maakt mechanische eigenschapsbepaling op nanoschaal mogelijk. Best practices voor het implementeren van AFM cantilever-gebaseerde nano-indentatie in lucht of vloeistof op zachte en harde monsters om elastische modulus of andere nanomechanische eigenschappen te meten, worden besproken.

Abstract

Een atoomkrachtmicroscoop (AFM) meet fundamenteel de interactie tussen een AFM-sondepunt op nanoschaal en het monsteroppervlak. Als de kracht die door de sondepunt wordt uitgeoefend en het contactgebied met het monster kunnen worden gekwantificeerd, is het mogelijk om de mechanische eigenschappen op nanoschaal (bijvoorbeeld elastiek of de modulus van Young) van het te onderzoeken oppervlak te bepalen. Een gedetailleerde procedure voor het uitvoeren van kwantitatieve AFM cantilever-gebaseerde nano-indentatie-experimenten wordt hier gegeven, met representatieve voorbeelden van hoe de techniek kan worden toegepast om de elastische moduli van een breed scala aan monstertypen te bepalen, variërend van kPa tot GPa. Deze omvatten levende mesenchymale stamcellen (MSC's) en kernen in fysiologische buffer, hars-ingebedde gedehydrateerde loblolly pine doorsneden en Bakken leisteen van verschillende samenstelling.

Daarnaast wordt AFM cantilever-gebaseerde nano-indentatie gebruikt om de breuksterkte (d.w.z. doorbraakkracht) van fosfolipide bilayers te onderzoeken. Belangrijke praktische overwegingen zoals methodekeuze en -ontwikkeling, sondeselectie en kalibratie, identificatie van interessegebieden, heterogeniteit van monsters, functiegrootte en beeldverhouding, tipslijtage, oppervlakteruwheid en gegevensanalyse en meetstatistieken worden besproken om een goede implementatie van de techniek te bevorderen. Ten slotte wordt co-lokalisatie van AFM-afgeleide nanomechanische kaarten met elektronenmicroscopietechnieken aangetoond die aanvullende informatie geven over de elementaire samenstelling.

Introduction

Het begrijpen van de mechanische eigenschappen van materialen is een van de meest fundamentele en essentiële taken in engineering. Voor de analyse van de eigenschappen van bulkmateriaal zijn er tal van methoden beschikbaar om de mechanische eigenschappen van materiaalsystemen te karakteriseren, waaronder trekproeven¹, compressietests² en drie- of vierpuntsbuigproeven (buigproeven)³. Hoewel deze tests op microschaal waardevolle informatie kunnen opleveren over de eigenschappen van bulkmateriaal, worden ze over het algemeen uitgevoerd om te falen en zijn ze daarom destructief. Bovendien missen ze de ruimtelijke resolutie die nodig is om de micro- en nanoschaaleigenschappen van veel materiaalsystemen die vandaag de dag van belang zijn, zoals dunne films, biologische materialen en nanocomposieten, nauwkeurig te onderzoeken. Om te beginnen met het aanpakken van enkele van de problemen met grootschalige mechanische tests, voornamelijk de destructieve aard ervan, werden microhardheidstests overgenomen van mineralogie. Hardheid is een maat voor de weerstand van een materiaal tegen plastische vervorming onder specifieke omstandigheden. Over het algemeen gebruiken microhardheidstests een stijve sonde, meestal gemaakt van gehard staal of diamant, om in een materiaal te springen. De resulterende inkepingsdiepte en/of -oppervlakte kan vervolgens worden gebruikt om de hardheid te bepalen. Er zijn verschillende methoden ontwikkeld, waaronder Vickers⁴, Knoop⁵ en Brinell⁶ hardheid; Elk biedt een maat voor de materiaalhardheid op microschaal, maar onder verschillende omstandigheden en definities, en produceert als zodanig alleen gegevens die kunnen worden vergeleken met tests die onder dezelfde omstandigheden worden uitgevoerd.

Geïnstrumenteerde nano-indentatie werd ontwikkeld om de relatieve waarden verkregen via de verschillende microhardheidstestmethoden te verbeteren, de ruimtelijke resolutie te verbeteren die mogelijk is voor de analyse van mechanische eigenschappen en de analyse van dunne films mogelijk te maken. Belangrijk is dat door gebruik te maken van de methode die voor het eerst is ontwikkeld door Oliver en Pharr⁷, het elastische of Young's modulus, E, van een monstermateriaal kan worden bepaald via geïnstrumenteerde nano-indentatie. Bovendien kan, door gebruik te maken van een Berkovich driezijdige piramidale nanoindenter-sonde (waarvan de ideale tipgebiedfunctie overeenkomt met die van de Vickers vierzijdige piramidale sonde)⁸, een directe vergelijking tussen nanoschaal en meer traditionele microschaalhardheidsmetingen worden gemaakt. Met de groeiende populariteit van de AFM begon ook AFM cantilever-gebaseerde nano-indentatie aandacht te krijgen, met name voor het meten van de mechanische eigenschappen van zachtere materialen. Als gevolg hiervan, zoals schematisch weergegeven in figuur 1, zijn de twee meest gebruikte technieken om mechanische eigenschappen op nanoschaal te ondervragen en te kwantificeren geïnstrumenteerde nano-indentatie (figuur 1A) en AFM cantilever-gebaseerde nano-indentatie (figuur 1B)⁹, waarvan de laatste de focus van dit werk is.

Figuur 1: Vergelijking van geïnstrumenteerde en AFM cantilever-gebaseerde nano-indentatiesystemen. Schematische diagrammen met typische systemen voor het uitvoeren van (A) geïnstrumenteerde nano-indentatie en (B) AFM cantilever-gebaseerde nano-indentatie. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Qian et ^al.51. Afkorting: AFM = atoomkrachtmicroscopie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Zowel geïnstrumenteerde als AFM cantilever-gebaseerde nano-indentatie maken gebruik van een stijve sonde om een monsteroppervlak van belang te vervormen en de resulterende kracht en verplaatsing te bewaken als een functie van de tijd. Doorgaans wordt het gewenste belastings- (d.w.z. kracht) of (Z-piëzo) verplaatsingsprofiel door de gebruiker gespecificeerd via de software-interface en rechtstreeks door het instrument geregeld, terwijl de andere parameter wordt gemeten. De mechanische eigenschap die het vaakst wordt verkregen uit nano-indentatie-experimenten is de elastische modulus (E), ook wel de Young-modulus genoemd, die drukeenheden heeft. De elastische modulus van een materiaal is een fundamentele eigenschap met betrekking tot de bindingsstijfheid en wordt gedefinieerd als de verhouding tussen trek- of drukspanning (σ, de uitgeoefende kracht per oppervlakte-eenheid) tot axiale spanning (ε, de proportionele vervorming langs de inkepingsas) tijdens elastische (d.w.z. omkeerbare of tijdelijke) vervorming voorafgaand aan het begin van plastische vervorming (vergelijking [1]):

(1)

Opgemerkt moet worden dat, omdat veel materialen (vooral biologische weefsels) in feite visco-elastisch zijn, de (dynamische of complexe) modulus in werkelijkheid bestaat uit zowel elastische (opslag, in fase) als viskeuze (verlies, uit fase) componenten. In de praktijk wordt in een nano-indentatie-experiment de gereduceerde modulus, E *, gemeten, die gerelateerd is aan de werkelijke monstermodulus van belang, E, zoals weergegeven in vergelijking (2):

(2)

Waarbij E-tip en _ν-tip respectievelijk de elastische modulus en Poisson-verhouding van de nano-indenterpunt zijn, en ν de geschatte Poisson-verhouding van het monster. De Poisson-verhouding is de negatieve verhouding van de transversale tot axiale spanning en geeft dus de mate van transversale verlenging van een monster aan bij blootstelling aan axiale spanning (bijvoorbeeld tijdens nano-indentatiebelasting), zoals weergegeven in vergelijking (3):

(3)

De omzetting van gereduceerde naar werkelijke modulus is noodzakelijk omdat a) een deel van de axiale spanning die door de indrukkerijpunt wordt gegeven, kan worden omgezet in dwarsspanning (d.w.z. het monster kan vervormen door uitzetting of samentrekking loodrecht op de belastingsrichting), en b) de indrukkerijpunt niet oneindig hard is, en dus resulteert de handeling van het inspringen van het monster in een (kleine) hoeveelheid vervorming van de punt. Merk op dat in het geval dat E-tip >> E (d.w.z. de indrukpunt is veel harder dan het monster, wat vaak het geval is bij het gebruik van een diamantsonde), de relatie tussen de gereduceerde en werkelijke monstermodulus aanzienlijk vereenvoudigt tot E ≈ E * (1 - v²). Terwijl geïnstrumenteerde nano-indentatie superieur is in termen van nauwkeurige krachtkarakterisering en dynamisch bereik, is AFM cantilever-gebaseerde nano-indentatie sneller, biedt ordes van grootte grotere kracht- en verplaatsingsgevoeligheid, maakt beeldvorming met een hogere resolutie en verbeterde inspringing lokalisatie mogelijk en kan tegelijkertijd magnetische en elektrische eigenschappen op nanoschaal onderzoeken⁹. In het bijzonder is AFM cantilever-gebaseerde nano-indentatie superieur voor de kwantificering van mechanische eigenschappen op nanoschaal van zachte materialen (bijv. polymeren, gels, lipide bilayers en cellen of andere biologische materialen), extreem dunne (sub-μm) films (waarbij substraateffecten een rol kunnen spelen afhankelijk van de inkepingsdiepte)^10,11, en gesuspendeerde tweedimensionale (2D) materialen^12,13,14 zoals grafeen ^15,16, mica¹⁷, hexagonaal boornitride (h-BN)18, of overgangsmetaaldichalcogeniden (TMDC's; bijv. MoS₂)¹⁹. Dit komt door de voortreffelijke kracht (sub-nN) en verplaatsingsgevoeligheid (sub-nm), die belangrijk is voor het nauwkeurig bepalen van het begincontactpunt en het blijven binnen het elastische vervormingsgebied.

Bij AFM cantilever-gebaseerde nano-indentatie wordt de verplaatsing van een AFM-sonde naar het monsteroppervlak geactiveerd door een gekalibreerd piëzo-elektrisch element (figuur 1B), waarbij de flexibele cantilever uiteindelijk buigt als gevolg van de weerstandskracht die wordt ervaren bij contact met het monsteroppervlak. Deze buiging of afbuiging van de cantilever wordt meestal bewaakt door een laser van de achterkant van de cantilever te reflecteren en in een fotodetector (positiegevoelige detector [PSD]). In combinatie met de kennis van de cantileverstijfheid (in nN/nm) en doorbuigingsgevoeligheid (in nm/V) is het mogelijk om deze gemeten cantileverafbuiging (in V) om te zetten in de kracht (in nN) die op het monster wordt uitgeoefend. Na contact levert het verschil tussen de Z-piëzobeweging en de cantileverafbuiging de inkepingdiepte van het monster op. In combinatie met de kennis van de tipgebiedfunctie maakt dit de berekening van het tip-monster contactgebied mogelijk. De helling van de contactgedeelten van de resulterende krachtafstands- of krachtverplaatsingscurven (F-D) kan vervolgens worden aangepast met behulp van een geschikt contactmechanicamodel (zie het gedeelte Gegevensanalyse van de discussie) om de nanomechanische eigenschappen van het monster te bepalen. Hoewel AFM cantilever-gebaseerde nano-indentatie een aantal duidelijke voordelen heeft ten opzichte van geïnstrumenteerde nano-indentatie zoals hierboven beschreven, brengt het ook verschillende praktische implementatie-uitdagingen met zich mee, zoals kalibratie, tipslijtage en data-analyse, die hier zullen worden besproken. Een ander potentieel nadeel van AFM cantilever-gebaseerde nano-indentatie is de aanname van lineaire elasticiteit, omdat de contactradius en indrukkingsdiepten veel kleiner moeten zijn dan de indrukkerijradius, wat moeilijk te bereiken kan zijn bij het werken met AFM-sondes op nanoschaal en / of monsters met een aanzienlijke oppervlakteruwheid.

Traditioneel is nano-indentatie beperkt tot individuele locaties of kleine rasterinspringingsexperimenten, waarbij een gewenste locatie (d.w.z. regio van belang [ROI]) wordt geselecteerd en een enkele gecontroleerde inspringing, meerdere inspringingen op een enkele locatie gescheiden door enige wachttijd, en / of een grof raster van inspringingen worden uitgevoerd met een snelheid in de orde van Hz. Recente ontwikkelingen in de AFM maken het echter mogelijk om mechanische eigenschappen en topografie gelijktijdig te verwerven door het gebruik van op hoge snelheid op krachtcurve gebaseerde beeldvormingsmodi (aangeduid met verschillende handelsnamen, afhankelijk van de systeemfabrikant), waarbij krachtcurven worden uitgevoerd met een kHz-snelheid onder belastingscontrole, waarbij de maximale tip-samplekracht wordt gebruikt als het beeldvormingsinstelpunt. Er zijn ook point-and-shoot-methoden ontwikkeld, die het mogelijk maken om een AFM-topografiebeeld te verkrijgen, gevolgd door daaropvolgende selectieve nano-indentatie op interessante punten in het beeld, waardoor ruimtelijke controle op nanoschaal over de locatie van nano-indentatie mogelijk is. Hoewel dit niet de primaire focus van dit werk is, worden specifieke geselecteerde toepassingsvoorbeelden van zowel op krachtcurve gebaseerde beeldvorming als op point-and-shoot cantilever-gebaseerde nano-indentatie gepresenteerd in de representatieve resultaten en kunnen worden gebruikt in combinatie met het onderstaande protocol, indien beschikbaar op het specifieke AFM-platform dat wordt gebruikt. In het bijzonder schetst dit werk een algemeen protocol voor de praktische implementatie van AFM cantilever-gebaseerde nano-indentatie op elk capabel AFM-systeem en biedt vier use case-voorbeelden (twee in lucht, twee in vloeistof) van de techniek, inclusief representatieve resultaten en een diepgaande bespreking van de nuances, uitdagingen en belangrijke overwegingen om de techniek met succes toe te passen.

Protocol

OPMERKING: Vanwege de grote verscheidenheid aan commercieel verkrijgbare AFM's en de diversiteit van monstertypen en toepassingen die bestaan voor op cantilever gebaseerde nano-indentatie, is het volgende protocol opzettelijk ontworpen om relatief algemeen van aard te zijn, met de nadruk op de gedeelde stappen die nodig zijn voor alle op cantilever gebaseerde nano-indentatie-experimenten, ongeacht het instrument of de fabrikant. Daarom gaan de auteurs ervan uit dat de lezer op zijn minst basiskennis bezit van het bedienen van het specifieke instrument dat is gekozen voor het uitvoeren van op cantilever gebaseerde nano-indentatie. Naast het hieronder beschreven algemene protocol is echter een gedetailleerde stapsgewijze standaardwerkwijze (SOP) specifiek voor de AFM en de hier gebruikte software (zie materiaaltabel), gericht op cantilever-gebaseerde nano-indentatie van monsters in vloeistof, opgenomen als aanvullend materiaal.

1. Monstervoorbereiding en instrumentopstelling

1. Bereid het monster voor op een manier die zowel de oppervlakteruwheid (idealiter nanometerschaal, ~ 10x minder dan de beoogde inkepingsdiepte) als verontreiniging minimaliseert zonder de mechanische eigenschappen van het (de) betreffende gebied (en) te wijzigen.
2. Selecteer een geschikte AFM-sonde voor nano-indentatie van het beoogde monster op basis van het medium (d.w.z. lucht of vloeistof), verwachte modulus, monstertopografie en relevante objectgroottes (zie de overwegingen voor de selectie van de sonde in de discussie). Laad de sonde op de sondehouder (zie Materiaaltabel) en bevestig de sondehouder aan de AFM-scankop.
3. Selecteer een geschikte nano-indentatiemodus in de AFM-software die de gebruiker controle biedt over individuele hellingen (d.w.z. krachtverplaatsingscurven).
   OPMERKING: De specifieke modus verschilt per AFM-fabrikant en afzonderlijke instrumenten (zie SOP in het aanvullende materiaal voor meer informatie en een specifiek voorbeeld).
4. Lijn de laser uit op de achterkant van de sonde, tegenover de locatie van de sondepunt en in de PSD.
   OPMERKING: Zie het voorbeeld van de mesenchymale stamceltoepassing voor meer informatie over belangrijke overwegingen bij het uitlijnen van de laser en het uitvoeren van nano-indentatie in vloeistof, in het bijzonder het vermijden van zwevend puin en / of luchtbellen, die de straal kunnen verstrooien of breken. De AFM-optiek moet mogelijk ook worden aangepast om de brekingsindex van de vloeistof te compenseren en om te voorkomen dat de sonde crasht wanneer deze het oppervlak raakt.
   1. Centreer de laserstraalspot op de achterkant van de cantilever door de somspanning te maximaliseren (figuur 2A).
   2. Centreer de gereflecteerde laserstraalspot op de PSD door de X- en Y-afbuigingssignalen (d.w.z. horizontaal en verticaal) zo dicht mogelijk bij nul te brengen (figuur 2A), waardoor het maximaal detecteerbare doorbuigingsbereik wordt geboden voor het produceren van een uitgangsspanning die evenredig is met de uitkragende doorbuiging.
5. Als u niet zeker bent van de topografie, oppervlakteruwheid en/of oppervlaktedichtheid van het monster (in het geval van vlokken of deeltjes), voert u een AFM-topografie-enquêtescan uit voorafgaand aan nano-indentatie-experimenten om de geschiktheid van het monster te bevestigen, zoals beschreven in stap 1.1 en het monstervoorbereidingsgedeelte van de discussie.

Figuur 2: Positiegevoelige detectormonitor . (A) PSD-display dat een correct uitgelijnde laser aangeeft die weerkaatst op de achterkant van de sonde en op het midden van de PSD (zoals blijkt uit de grote somspanning en het ontbreken van verticale of horizontale doorbuiging) voordat deze op het monsteroppervlak wordt ingeschakeld (d.w.z. sonde die niet in contact komt met het monster). (B) De verticale doorbuigingsspanning neemt toe wanneer de cantilever wordt afgebogen (bijvoorbeeld wanneer de sonde contact maakt met het monster). Afkortingen: PSD = positiegevoelige detector; VERT = verticaal; HORIZ = horizontaal; AMPL = amplitude; n.v.t. = niet van toepassing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Kalibratie van de sonde

OPMERKING: Er zijn drie waarden nodig om de mechanische eigenschappen van een monster te kwantificeren met behulp van de F-D-curvegegevens die zijn verzameld tijdens nano-indentatie op basis van cantilever: de doorbuigingsgevoeligheid (DS) van het cantilever/PSD-systeem (nm/V of V/nm), de cantileverveerconstante (nN/nm) en het contactoppervlak van de sonde, vaak uitgedrukt in termen van de effectieve straal van de sondepunt (nm) bij een bepaalde indrukkingsdiepte kleiner dan de sondestraal in het geval van een bolvormige sonde fooi.

1. Kalibreer de DS van het sonde/AFM-systeem door op een extreem hard materiaal (bijv. saffier, E = 345 GPa) te slaan, zodat de vervorming van het monster tot een minimum wordt beperkt en dus de gemeten Z-beweging van de piëzo na het initiëren van tip-monstercontact uitsluitend wordt omgezet in cantileverafbuiging.
   OPMERKING: De DS-kalibratie moet worden uitgevoerd onder dezelfde omstandigheden als de geplande nano-indentatie-experimenten (d.w.z. temperatuur, medium, enz.) om de DS van het systeem tijdens de experimenten nauwkeurig weer te geven. Een lange (30 min) laseropwarmperiode kan nodig zijn voor maximale nauwkeurigheid om tijd te geven voor het bereiken van thermisch evenwicht en het vaststellen van een stabiel laseruitgangsvermogen en richtstabiliteit. De DS moet opnieuw worden gemeten telkens wanneer de laser opnieuw wordt uitgelijnd, zelfs als dezelfde sonde wordt gebruikt, omdat de DS afhankelijk is van de laserintensiteit en positie op de cantilever, evenals de kwaliteit van de reflectie van de sonde (d.w.z. degradatie van de achterkant van de sonde zal de DS beïnvloeden) en gevoeligheid van de PSD²⁰.
   1. Stel de DS-kalibratie-inspringingen op de saffier in en voer deze uit om ongeveer dezelfde sondeafbuiging (in V of nm) te bereiken als de geplande monsterinkepingen, aangezien de gemeten verplaatsing een functie is van de doorbuigingshoek van de punt en niet-lineair wordt voor grote doorbuigingen.
   2. Bepaal de DS (in nm/V), of als alternatief, de inverse optische hefboomgevoeligheid (in V/nm), uit de helling van het lineaire deel van het contactregime na het eerste contactpunt in de resulterende F-D-curve, zoals weergegeven in figuur 3A.
   3. Herhaal de helling minstens 5x en noteer elke DS-waarde. Gebruik het gemiddelde van de waarden voor maximale nauwkeurigheid. Als de relatieve standaardafwijking (RSD) van de metingen groter is dan ~1%, meet de DS dan opnieuw, omdat de eerste paar F-D-curven soms niet ideaal zijn vanwege de initiële introductie van kleefkrachten.
   4. Als de veerconstante van de sonde, k, niet in de fabriek is gekalibreerd (bijvoorbeeld via laser-Dopplervibrometrie [LDV]), kalibreer dan de veerconstante.
      OPMERKING: De thermische afstemmingsmethode is optimaal voor relatief zachte uitkragingen met k < 10 N/m (zie het gedeelte met de veerconstante van de discussie voor een lijst en beschrijving van alternatieve methoden, met name voor stijve uitkragingen met k > 10 N/m). Zoals weergegeven in figuur 3B, C, is thermische afstemming meestal geïntegreerd in de AFM-besturingssoftware.
2. Als de sonde niet wordt geleverd met een in de fabriek gekalibreerde tipradiusmeting (bijvoorbeeld via scanning electron microscope [SEM] beeldvorming), meet dan de effectieve tipradius, R.
   OPMERKING: Er zijn twee veelgebruikte methoden voor het meten van de tipradius (zie de bijbehorende discussiesectie), maar de meest voorkomende voor sondetips op nanometerschaal is de blinde tipreconstructie (BTR) -methode, die een ruwheidsstandaard gebruikt (zie Tabel met materialen) met tal van extreem scherpe (sub-nm) kenmerken die dienen om de tip effectief in beeld te brengen, in plaats van de tip die het monster afbeeldt.
   1. Als u de BTR-methode gebruikt, moet u het ruwheidsmonster (tipkarakterisering) afbeelden met behulp van een langzame scansnelheid (<0,5 Hz) en hoge feedbackwinsten om het volgen van de zeer scherpe functies te optimaliseren. Kies een afbeeldingsgrootte en pixeldichtheid (resolutie) op basis van de verwachte tipradius (een afbeelding van 1024 x 1024 pixels van een gebied van 3 μm x 3 μm heeft bijvoorbeeld een zijdelingse resolutie van ~ 3 nm).
   2. Gebruik AFM-beeldanalysesoftware (zie materiaaltabel) om de sondepunt te modelleren en de eindradius en effectieve tipdiameter te schatten bij de verwachte inkepingdiepte van het monster, zoals weergegeven in figuur 3D-F.
3. Voer na het voltooien van de kalibratie van de sonde de DS-, k- en R-waarden in de instrumentsoftware in, zoals weergegeven in figuur 4A.
   1. Voer een schatting in van de Poisson-verhouding van het monster, ν, om de gemeten gereduceerde modulus om te zetten in de werkelijke monstermodulus⁹. Als u een conisch of conisferisch contactmechanicamodel gebruikt op basis van de tipvorm en inkepingdiepte, is het ook noodzakelijk om de tiphelfthoek in te voeren (figuur 4C).
      OPMERKING: De modulus is relatief ongevoelig voor kleine fouten of onzekerheden in de geschatte Poisson-verhouding. Een schatting van ν = 0,2-0,3 is voor veel materialen een goed uitgangspunt²¹.

Figuur 3: Kalibratie van de sonde. (A) Bepaling van de doorbuigingsgevoeligheid. Resultaat van een representatieve doorbuigingsgevoeligheidsmeting uitgevoerd op een saffiersubstraat (E = 345 GPa) voor een standaard tapmodussonde (nominaal k = 42 N/m; zie materiaaltabel) met een reflecterende aluminiumcoating aan de achterkant. Getoond zijn de gemeten naderingscurven (blauw spoor) en intrekken of terugtrekken (rood spoor). De gemeten doorbuigingsgevoeligheid van 59,16 nm/V werd bepaald door de naderingscurve tussen de snap-to-contact- en turn-around-punten aan te passen, zoals aangegeven door het gebied tussen de verticale gestippelde rode lijnen. Het gebied van negatief gaande afbuiging dat zichtbaar is in de intrek-/terugtrekkingscurve voorafgaand aan het aftrekken van het oppervlak, is indicatief voor de hechting van het tipmonster. (B,C) Thermische afstemming. Representatieve cantilever thermische ruisspectra (blauwe sporen) met bijbehorende pasvormen (rode sporen) voor twee verschillende sondes. (B) Thermische afstemmingsinstelling en pasvormparameters voor een standaard op krachtcurve gebaseerde AFM-beeldvormingsonde (zie materiaaltabel) met de nominale veerconstante k = 0,4 N/m als eerste schatting. De pasvorm van het vrijdragende thermische ruisspectrum levert een fundamentele resonantiefrequentie op van f 0 = 79,8 kHz, wat redelijk overeenkomt met de nominale waarde van f₀ = 70 kHz. De gemeten Q-factor is 58,1. Goodness of fit (R² = 0,99) is gebaseerd op overeenstemming van de pasvorm met de gegevens tussen de twee verticale onderbroken rode lijnen. Merk op dat het belangrijk is om zowel de omgevingstemperatuur als de doorbuigingsgevoeligheid te kennen en in te voeren voor nauwkeurige resultaten. (C) Cantilever thermisch geluidsspectrum en overeenkomstige pasvorm (d.w.z. thermische afstemming) met resulterende berekende veerconstante k = 0,105 N/m voor een extreem zachte cantilever die wordt gebruikt voor het uitvoeren van nanomechanische metingen aan levende cellen en geïsoleerde kernen. Let op de aanzienlijk lagere natuurlijke resonantiefrequentie van ~2-3 kHz. (D-F) Blinde tip reconstructie. Representatieve blinde tip reconstructie workflow voor een diamanttip sonde (nominale R = 40 nm; zie Tabel van Materialen). (D) Een afbeelding van 5 μm x 5 μm van een tipkarakteriseringsmonster bestaande uit een reeks extreem scherpe (sub-nm) titanium spikes die dienen om de AFM-sondepunt in beeld te brengen. (E) Resultant gereconstrueerd model (omgekeerde hoogtebeeld) van de sondepunt. F) Resultaten van de montage van blinde punten, met inbegrip van een geschatte eindstraal van R = 29 nm en een effectieve tipdiameter van 40 nm op een door de gebruiker gekozen hoogte van 8 nm (d.w.z. indrukkingsdiepte << R) vanaf de top van de punt, berekend door het contactoppervlak van het tipmonster op die hoogte om te zetten in een effectieve diameter, uitgaande van een cirkelvormig profiel (d.w.z. A = πr 2 = π(d/2)²) voor gebruik met sferische contactmechanicamodellen. Afkortingen: AFM = atoomkrachtmicroscopie; ETD = effectieve tipdiameter. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Software interface ingangen. (A) Kalibratieconstanten van de sonde. Software-gebruikersinterface (zie materiaaltabel) om gemeten doorbuigingsgevoeligheid, veerconstante en tipradius in te voeren om kwantitatieve nanomechanische metingen mogelijk te maken. De Poisson-verhouding van zowel de sonde als het monster is nodig voor het berekenen van het elastische of Young's modulus van het monster uit de op cantilever gebaseerde nano-indentatiekrachtcurven. (B) Venster voor oprijplaatbesturing. Software-gebruikersinterface (zie materiaaltabel) voor het opzetten van op cantilever gebaseerde nano-indentatie-experimenten, georganiseerd in de parameters die de helling zelf beschrijven (d.w.z. inspringingsprofiel), instrumentactivering (bijv. Kracht versus verplaatsingsregeling), daaropvolgende krachtanalyse en bewegingslimieten (om de meetgevoeligheid te verbeteren door het bereik te verkleinen waarover de A / D-converter moet werken bij het regelen van de Z-piëzo en het lezen van de PSD-afbuiging). (C) De halve tiphoek (gebaseerd op de geometrie van de sonde of directe meting) is belangrijk als een conisch, piramidaal of conisferisch contactmechanicamodel (bijv. Sneddon) wordt gebruikt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Verzamel gegevens over krachtverplaatsing (F-D)

OPMERKING: De hier weergegeven parameterwaarden (zie figuur 4B) kunnen variëren afhankelijk van de kracht en het indrukkingsbereik voor een bepaald monster.

1. Navigeer het voorbeeld onder het AFM-hoofd en ga in op het gewenste interessegebied.
   1. Bewaak het verticale doorbuigingssignaal (figuur 2B) of voer een kleine (~50-200 nm) initiële helling uit (figuur 4B) om te controleren of de tip en het monster met elkaar in contact zijn (zie figuur 5A).
   2. Stel de AFM-koppositie iets naar boven in (in stappen die overeenkomen met ~ 50% van de volledige oprijplaatgrootte) en opnieuw oprijplaat. Herhaal dit totdat de punt en het monster net geen contact meer hebben, zoals blijkt uit een bijna vlakke helling (figuur 5B) en minimale verticale doorbuiging van de uitkraging (figuur 2A).
   3. Zodra er geen duidelijke interactie tussen tip en monster aanwezig is (vergelijk figuur 2A en figuur 2B), verlaagt u de AFM-kop met een hoeveelheid die overeenkomt met ~ 50% -100% van de hellinggrootte om ervoor te zorgen dat de sondepunt niet tegen het monster botst terwijl u de AFM-kop handmatig beweegt. Ramp opnieuw, herhaal totdat een goede curve (figuur 5D) of een curve vergelijkbaar met figuur 5C wordt waargenomen. Voer in het laatste geval één extra kleine AFM-kopverlagingsaanpassing uit die gelijk is aan ~ 20% -50% van de hellinggrootte om een goed contact en een krachtcurve te bereiken die vergelijkbaar is met die in figuur 5D.
2. Pas de parameters van de helling aan (zoals hieronder beschreven en weergegeven in Figuur 4B) om te optimaliseren voor het instrument, de sonde en het monster, en om hellingen te verkrijgen die vergelijkbaar zijn met die in Figuur 5D.
   1. Selecteer een geschikte hellinggrootte (d.w.z. totale Z-piëzobeweging door één hellingcyclus) afhankelijk van het monster (bijv. dikte, verwachte modulus, oppervlakteruwheid) en gewenste inkepingsdiepte.
      OPMERKING: Voor stijvere monsters is het waarschijnlijk dat er minder monstervervorming (en dus meer sondeafbuiging voor een bepaalde Z-piëzobeweging) optreedt, dus de hellingsgrootte kan over het algemeen kleiner zijn dan voor zachtere monsters. Typische hellingmaten voor stijve monsters en cantilevers kunnen tientallen nm zijn, terwijl voor zachte monsters en cantilevers hellingen honderden nm tot een paar μm groot kunnen zijn; Specifieke geselecteerde toepassingsvoorbeelden worden gepresenteerd in de sectie Representatieve resultaten. Houd er rekening mee dat minimale en maximaal mogelijke hellingmaten instrumentafhankelijk zijn.
   2. Selecteer een geschikte rampsnelheid (1 Hz is een goed startpunt voor de meeste samples).
      OPMERKING: De hellingsnelheid kan worden beperkt door elektronische snelheden/bandbreedtes voor besturing en/of detectie. In combinatie met de oprijplaatgrootte bepaalt de hellingsnelheid de tipsnelheid. De tipsnelheid is vooral belangrijk om te overwegen bij het inspringen van zachte materialen waar visco-elastische effecten hystereseartefacten kunnen veroorzaken ^9,22.
   3. Kies of u een geactiveerde (belastinggestuurde) of niet-getriggerde (verplaatsingsgestuurde) oprijplaat wilt gebruiken.
      OPMERKING: Bij een geactiveerde helling nadert het systeem het monster in door de gebruiker gedefinieerde stappen (op basis van de grootte en resolutie van de helling of het aantal gegevenspunten) totdat de gewenste triggerdrempel (d.w.z. instelpuntkracht of cantileverafbuiging) wordt gedetecteerd, waarna het systeem zich terugtrekt naar zijn oorspronkelijke positie en de F-D-curve weergeeft. In een niet-getriggerde helling verlengt het systeem eenvoudig de Z-piëzo de afstand die is opgegeven door de door de gebruiker gedefinieerde hellinggrootte en geeft het de gemeten F-D-curve weer. Getriggerde hellingen hebben de voorkeur voor de meeste gebruikssituaties, maar niet-getriggerde oprijplaten kunnen nuttig zijn bij het onderzoeken van zachte materialen die geen scherp, gemakkelijk identificeerbaar contactpunt vertonen.
      1. Als een geactiveerde helling wordt gekozen, stelt u de triggerdrempel (door de gebruiker gedefinieerde maximaal toegestane kracht of doorbuiging van de helling) in om de gewenste inspringing in het monster te verkrijgen.
         OPMERKING: Het gebruik van een triggerdrempel betekent dat een helling kan eindigen (d.w.z. dat de sonde kan beginnen in te trekken) voordat de volledige oprijplaat (Z-piëzo-extensie) is bereikt. Waarden kunnen variëren van enkele nN tot enkele μN, afhankelijk van het tip-sample systeem.
      2. Stel de hellingpositie in om het deel van het maximale bereik van de Z-piëzo te bepalen dat zal worden gebruikt om de oprit uit te voeren. Zorg ervoor dat het totale bereik van de hellinggrootte niet begint of eindigt buiten het maximale Z-piëzobereik (zie representatieve voorbeelden in figuur 6), anders vertegenwoordigt een deel van de F-D-curve geen fysieke meting (d.w.z. de Z-piëzo wordt volledig uitgeschoven of ingetrokken en beweegt niet).
   4. Stel het aantal monsters/helling in (bijv. 512 monsters/helling ) om de gewenste resolutie van de meting te bereiken (d.w.z. puntdichtheid van de F-D-curve).
      OPMERKING: De maximale samples/ramp kunnen worden beperkt door software (bestandsgrootte) of hardwarebeperkingen (bijv. analoog naar digitaal [A/D] conversiesnelheid, afhankelijk van de rampsnelheid). Het is ook mogelijk om het toegestane Z-piëzo- of doorbuigingsbereik te beperken (zie limietparameters in figuur 4B) om de effectieve resolutie van de A/D-converter van het systeem te verhogen.
   5. Stel de X-rotatie in om de schuifkrachten op het monster en de punt te verminderen door de sonde tegelijkertijd iets in de X-richting te bewegen (parallel aan de cantilever) terwijl de sonde in de Z-richting inspringt (loodrecht op de cantilever). Gebruik een waarde voor de X-rotatie die gelijk is aan de offsethoek van de sondehouder ten opzichte van het normale oppervlak (12° is typisch).
      OPMERKING: De X-rotatie is nodig omdat de cantilever in de sondehouder is gemonteerd onder een kleine hoek ten opzichte van het oppervlak om de invallende laserstraal in de PSD te laten reflecteren. Bovendien kunnen de voor- en achterhoeken van de sondepunt van elkaar verschillen (d.w.z. de sondepunt kan asymmetrisch zijn). Meer specifieke informatie kan worden verkregen bij individuele sonde- en AFM-fabrikanten.

Figuur 5: Optimaliseren van tip-sample scheiding na het inschakelen om goede krachtcurven te verkrijgen. Opeenvolgende voorbeelden van representatieve krachtverplaatsingscurven verkregen tijdens het inspringen in vloeistof (fosfaat-gebufferde zoutoplossing) op een levende mesenchymale stamcelkern met een gekalibreerde zachte siliciumnitride cantilever (nominaal k = 0,04 N/m) eindigend in een hemisferische punt met een straal van 5 μm (zie tabel met materialen). Curven werden verkregen tijdens het inschakelen van het celoppervlak en het optimaliseren van de indrukkingsparameters, waarbij de sondebenadering in blauw werd weergegeven en in rood werd ingetrokken / teruggetrokken. (A) De punt is al ingeschakeld en in contact met het monster voordat de hellingbaan begint, wat leidt tot grote uitkragende doorbuiging en krachten, zonder vlakke voorcontactbasislijn. (B) Nadat de punt handmatig voldoende ver van het monster is verplaatst, resulteert een niet-getriggerde helling van 2 μm in een F-D-curve die bijna vlak is (d.w.z. vrijwel geen verandering in kracht). In omgevingsomstandigheden zou de curve vlakker zijn, maar in vloeistof kan de viscositeit van het medium lichte afbuigingen van de sondecantilever veroorzaken tijdens een helling zoals hier te zien is, zelfs zonder oppervlaktecontact. (C) Nadat de naderings- en intrekbochten iets dichter bij het oppervlak zijn gekomen voordat aan de oprijplaat wordt begonnen, vertonen zij een lichte toename van de kracht (verhoogde helling) in de buurt van het keerpunt van de oprijplaat (d.w.z. overgang van nadering naar terugtrekken). Het veelbetekenende teken om naar te zoeken is dat de naderingscurven (blauw) en teruggetrokken (rood) elkaar beginnen te overlappen (gebied aangegeven door de zwarte cirkel), wat wijst op een fysieke interactie met het oppervlak. (D) Een ideale F-D-curve die wordt verkregen na optimalisatie van de rampparameters en iets (~ 1 μm) dichter bij het celoppervlak nadert dan in C , zodat de sonde ongeveer de helft van de helling in contact met de cel doorbrengt, waardoor voldoende vervorming mogelijk is om in het contactgedeelte van de naderingscurve te passen en de elastische modulus te bepalen. De relatief lange, vlakke, ruisarme basislijn maakt het voor het aanpassingsalgoritme gemakkelijker om het contactpunt te bepalen. Afkorting: F-D = krachtverplaatsing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Grootte en positie van de hellingbaan. Z-piëzomonitor toont de omvang van de helling (blauwe balk) ten opzichte van het totale beschikbare Z-piëzo-bewegingsbereik (groene balk). (A) De Z-piëzopositie bevindt zich in het midden van zijn bewegingsbereik, zoals wordt aangegeven door zowel de blauwe balk die zich ongeveer in het midden van de groene balk bevindt als de huidige Z-piëzospanning (-78,0 V) die ruwweg tussen de volledig ingetrokken (-212,2 V) en uitgebreide (+102,2 V) waarden ligt. (B) Z-piëzo is verlengd ten opzichte van A, zonder dat er een biasspanning wordt toegepast. (C) Z-piëzo wordt ingetrokken ten opzichte van A en B. (D) De Z-piëzopositie is hetzelfde als in C bij -156,0 V, maar de hellingsgrootte is vergroot ten opzichte van A-C om te profiteren van meer van het volledige bewegingsbereik van de Z-piëzo. € De oprijplaatmaat is te groot voor de huidige hellingpositie, waardoor de Z-piëzo wordt verlengd tot het einde van zijn bereik. Dit zal ervoor zorgen dat de F-D-curve vlak wordt, omdat het systeem de Z-piëzo niet verder kan verlengen. Afkorting: F-D = krachtverplaatsing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. F-D curve analyse

1. Kies een geschikt softwarepakket voor gegevensanalyse. Selecteer en laad de te analyseren gegevens.
   OPMERKING: Veel AFM-fabrikanten en AFM-beeldverwerkingssoftwareprogramma's hebben ingebouwde ondersteuning voor F-D-curveanalyse. Als alternatief kunnen de verhoogde flexibiliteit en functies van een speciaal F-D-curveanalysepakket, zoals het open source AtomicJ-softwarepakket, gunstig zijn²³, met name voor batchverwerking en statistische analyse van grote datasets of het implementeren van complexe contactmechanicamodellen.
2. Voer gekalibreerde waarden in voor de veerconstante, DS en de straal van de sondepunt, samen met schattingen van de Young-modulus en de Poisson-verhouding voor de sondepunt (op basis van de materiaalsamenstelling) en de Poisson-verhouding van het monster.
   OPMERKING: Bij gebruik van een diamantpunt indrukking kunnen de waarden E tip = 1140 GPa en ν _tip = 0,07 worden gebruikt^21,24,25,26. Voor een standaard siliciumsonde kunnen meestal E-tip = 170 GPa en _ν-tip = 0,27 worden gebruikt, hoewel de Young-modulus van silicium varieert afhankelijk van de kristallografische oriëntatie²⁷.
3. Kies een nano-indentatiecontactmechanicamodel dat geschikt is voor de tip en het monster.
   OPMERKING: Voor de vele gangbare bolvormige tipmodellen (bijv. Hertz, Maugis, DMT, JKR) is het noodzakelijk dat de indrukkingsdiepte in het monster kleiner is dan de tipradius; anders maakt de bolvormige geometrie van de sondepunt plaats voor een conische of piramidale vorm (figuur 4C). Voor conische (bijv. Sneddon²⁸) en piramidale modellen, de punthelfthoek (d.w.z. de hoek tussen de zijwand van de punt en een snijdende lijn loodrecht op het puntuiteinde; Figuur 4C) moet bekend zijn en is meestal verkrijgbaar bij de fabrikant van de sonde. Voor meer informatie over contactmechanicamodellen, zie de sectie Data-analyse van thedDiscussion.
4. Voer het aanpassingsalgoritme uit. Controleer op de juiste pasvorm van de F-D-curven; een lage restfout die overeenkomt met een gemiddelde R 2 in de buurt van eenheid (bijv. R² > 0,9) is typisch indicatief voor een goede pasvorm met het gekozen model^29,30. Controleer steekproefsgewijs individuele curven om de curve, de pasvorm van het model en de berekende contactpunten indien gewenst visueel te inspecteren (zie bijvoorbeeld figuur 7 en het gedeelte Gegevensanalyse van de discussie).

Representative Results

Kracht-verplaatsingscurven
Figuur 7 toont representatieve, bijna ideale F-D-curven verkregen uit nano-indentatie-experimenten uitgevoerd in lucht op in hars ingebedde loblolly-dennenmonsters (figuur 7A) en in vloeistof (fosfaat-gebufferde zoutoplossing [PBS]) op mesenchymale stamcelkernen (MSC) (figuur 7B). Het gebruik van elk contactmechanicamodel is afhankelijk van de nauwkeurige en betrouwbare bepaling van het initiële tip-monstercontactpunt. De relatief vlakke, ruisarme basislijn voorafgaand aan het initiële contactpunt en de gladde helling van het contactgedeelte van de F-D-curven in figuur 7 maken ze dus ideaal voor analyse om mechanische eigenschappen te extraheren, zoals blijkt uit de uitstekende overeenstemming tussen de naderingscurven (blauwe sporen) en overeenkomstige pasvormen (groene sporen) in de inzetstukken.

Omgekeerd zijn er verschillende veelvoorkomende problemen die een gebruiker kan tegenkomen tijdens het uitvoeren van op cantilever gebaseerde nano-indentatie die zal leiden tot niet-ideale F-D-curven. Een van de meest voorkomende problemen, met name onmiddellijk na het inschakelen, is dat de sondepunt al in contact is met het monster voordat een hellingbaan wordt gestart (figuur 5A), waardoor de noodzakelijke uitgangswaarde voor het bepalen van het initiële contactpunt wordt voorkomen. Dit kan ook leiden tot te grote krachten in het geval van niet-getriggerde (d.w.z. gecontroleerde verplaatsing) hellingen. Dit is met name van belang bij het uitvoeren van een grote helling met een stijve cantilever, omdat de resulterende krachten de cantilever kunnen breken en / of het monster of de tip kunnen beschadigen. Om dit te voorkomen, controleert u de verticale doorbuigingsspanning tijdens en na de initiële inschakeling. Als de gemeten verticale doorbuigingsspanning positief is (uitgaande van de juiste initiële uitlijning) zoals weergegeven in figuur 2B, wordt de uitkraging afgebogen en staat de punt in contact met het monster. Grotere positieve spanningen komen overeen met grotere cantileverafbuigingen, maar ongeacht de grootte van de doorbuiging, moet de gebruiker de AFM-kop handmatig optillen (bijvoorbeeld door een stappenmotor te gebruiken) weg van het monster. De verticale doorbuigingsspanning zou langzaam moeten afnemen en kan zelfs tijdelijk onder nul dalen in het geval van sterke kleefkrachten van het tipmonster, maar zal uiteindelijk 0 V (of bijna 0 V) bereiken zodra de punt niet langer in contact is met het monster (figuur 2A). Vanaf dit punt kan de gebruiker doorgaan met het optimaliseren van de rampparameters en het uitvoeren van inspringingen.

Een ander veel voorkomend probleem (met name voor niet-getriggerde hellingen) is dat de hele F-D-curve bijna vlak lijkt, zonder duidelijke tekenen van interactie tussen tip en monster, zoals eerder weergegeven in figuur 5B. Indien beschikbaar op het instrument, is de oplossing hiervoor om de SPM-kop handmatig te verlagen met ~ 10% minder dan de hellinggrootte (om te voorkomen dat de sondepunt crasht) en opnieuw op te slaan, herhalend totdat een duidelijke toename van de kracht wordt waargenomen als gevolg van tip-sample interactie (figuur 5C, D) voordat verder wordt gegaan met het optimaliseren van andere rampparameters.

Tip slijtage
Figuur 8 geeft een voorbeeld van tipslijtage in een experimentele setting. Een enkele, stijve, silicium tapmodus AFM-sonde (zie Materiaaltabel) werd gebruikt om verschillende grote gebieden van een Bakken-schaliemonster in beeld te brengen (zie het overeenkomstige toepassingsvoorbeeld voor meer details) met behulp van een snelle (kHz-snelheid) op krachtcurve gebaseerde beeldvormingsmethode, en de BTR-methode werd gebruikt om de tipgeometrie te modelleren en de eindstraal van de tip voor en na elk van de drie opeenvolgende afbeeldingen te schatten. De onderzochte schaliemonsters bestonden uit een matrix van klei en organisch materiaal (E ~ 5 GPa) met veel hardere anorganische minerale insluitsels verspreid over het hele gebied (E > 30 GPa). Omdat het monster significante variaties in oppervlaktetopografie (±2 μm) bevatte over de grote scangebieden (85 μm x 85 μm) die werden afgebeeld, werd de scansnelheid ingesteld op het minimaal toegestane op het gebruikte instrument, 0,1 Hz. Met een krachtcurve-acquisitiesnelheid van 2 kHz en een scansnelheid van 0,1 Hz waren er in de loop van een enkel beeld van 1024 x 1024 pixels meer dan 20 miljoen tip-sample-interacties. Als gevolg hiervan ondervond de sondepunt aanzienlijke slijtage ten opzichte van zijn ongerepte toestand (figuur 8A) in de loop van de beeldvorming van het monster, toenemend met meer dan een orde van grootte van een effectieve eindradius van ~ 11 nm zoals ontvangen tot ~ 129 nm aan het einde van de drie beelden (figuur 8D). Tijdens de eerste opname lijkt de punt te zijn gebroken, wat resulteert in de grote morfologische verandering die te zien is in figuur 8B. In elke volgende afbeelding wordt de punt geleidelijk meer afgerond, een uitstekend voorbeeld van het meer voorkomende fenomeen van geleidelijke slijtage (zie discussie). De geschatte tipradii van de BTR-modellen zijn opgenomen in figuur 8.

Figuur 8E,F daarentegen toont BTR-modellen van een diamantpuntsonde (zie materiaaltabel) die 6 maanden na elkaar is verkregen, met duizenden nano-indenten en honderden miljoenen op krachtcurve gebaseerde tip-sample interacties daartussenin. Zoals blijkt uit de geschatte tipradii van 29 nm (figuur 8E) en 28 nm (figuur 8F), veranderde de straal van de sondepunt niet binnen de grenzen van de BTR-methode, wat de extreme slijtvastheid van diamant benadrukt. Er moet echter worden opgemerkt dat diamantpuntsondes (zoals alle AFM-sondes) gevoelig zijn voor verontreiniging door losgehecht puin dat de functie van het tipgebied en de effectieve hardheid kan beïnvloeden. Dienovereenkomstig blijft de reinheid van monsters van vitaal belang voor het behoud van de tip en nauwkeurige nanomechanische metingen.

Toepassingsvoorbeelden
Door de oordeelkundige keuze van de samenstelling van het sondemateriaal, de cantileverveerconstante en de tipgeometrie en -straal, kan op cantilever gebaseerde nano-indentatie worden gebruikt om de mechanische eigenschappen op nanoschaal van materialen met elastische moduli variërend van kPa tot GPa te kwantificeren, zowel in vloeistof als onder omgevingsomstandigheden. Geselecteerde toepassingsvoorbeelden volgen om enkele van de brede reeks gebruiksscenario's te benadrukken die mogelijk zijn voor op cantilever gebaseerde nano-indentatie.

Onderzoek naar de mechanische eigenschappen van loblolly pine voor biobrandstoftoepassingen
Loblolly-dennenbomen (Pinus taeda) zijn een snelgroeiende naaldhoutsoort die zeer overvloedig voorkomt in het zuiden van de Verenigde Staten, met een oppervlakte van meer dan 13 miljoen hectare³¹. Vanwege hun overvloed zijn loblolly-dennenbomen een cruciaal commercieel gewas in het zuiden van de VS, vaak gebruikt voor zowel hout als pulphout. Bovendien zijn ze een belangrijke hulpbron voor de productie van cellulosebiobrandstoffen van de tweede generatie³². Belangrijk is dat de vraag naar cellulosebiobrandstofgrondstoffen is gegroeid als gevolg van de Energy Independence and Security Act (EISA) van 2007, die voorschrijft dat tegen 2022 het totale gebruik van hernieuwbare brandstoffen in de Amerikaanse transportsector 36 miljard gallon moet zijn, waarbij 16 miljard gallons wordt afgeleid van cellulosebiomassa. Dienovereenkomstig, als gevolg van loblolly pine's snelle groeisnelheid en de ontvankelijkheid voor agroforestry projecten, is het uitgegroeid tot een biobrandstof grondstof van groot belang in de afgelopen jaren³³. Kennis van de mechanische eigenschappen van loblolly-den, inclusief variabiliteit tussen individuele bomen, anatomische fracties (bijv. Naaldhout, schors, naalden) en celgebieden (bijv. Celwand versus binnenkant), kan de gerichte scheiding van biomassastromen mogelijk maken om mechanische verwerking en thermochemische conversie te optimaliseren³⁴.

Figuur 9 toont een representatief beeld van de AFM-topografie (hoogtesensor) (figuur 9A) en de bijbehorende elastische moduluskaart (figuur 9B) van een dwarsdoorsnedemonster van vurenhout verkregen uit een tak op een 23-jarige loblolly-den met een kromtestraal van ~30 nm diamantpuntsonde gemonteerd op een roestvrijstalen cantilever (k = 256 N/m). De topografie- en moduluskaarten werden gelijktijdig gegenereerd met behulp van op snelle kHz-snelheidskrachtcurve gebaseerde AFM-beeldvorming, waarbij de moduluskaart semi-kwantitatieve resultaten presenteerde op basis van nominale waarden voor de sondekalibratieconstanten (d.w.z. veerconstante, doorbuigingsgevoeligheid en tipradius) en de krachtcurven in realtime aanpaste aan de DMT (Derjaguin, Muller en Toporov) contactmechanica model³⁵. Monsters met een dwarsdoorsnede van <3 mm in alle drie de dimensies (lengte x breedte x hoogte) werden voorbereid voor beeldvorming door seriële dehydratie met behulp van toenemende concentraties ethanol (33%, 55%, 70%, 90% en 100%)³⁶, voordat ze infiltreerden met hars (zie materiaaltabel) en 's nachts polymeriseerden bij 60 °C. Volledig uitgeharde hars-ingebedde monsters werden eerst gemalen en vervolgens ultramicroom met een diamantblad dat werkte met een snijsnelheid van ~ 1 mm / s met een invoerdikte die afnam van 1 μm tot 50-70 nm per plak om een vlak oppervlak te produceren dat geschikt is voor AFM-beeldvorming. Zoals echter te zien is aan de kleurenschaalbalk in figuur 9A, is het resulterende oppervlak in dit geval nog steeds relatief ruw, misschien vanwege de aanwezigheid van restafval op het monsteroppervlak en / of ultramicrotoomblad, wat leidt tot "gebabbel" van het blad tijdens het sectieren, terwijl andere monsters een veel gladdere oppervlaktetopografie vertoonden.

Figuur 9C reproduceert het AFM-topografiebeeld uit figuur 9A, maar met witte draden die de locaties aangeven voor acht arrays van 50 nano-indenten per stuk die langs geselecteerde celwanden binnen de ROI moeten worden uitgevoerd, omdat het doel van het project in kwestie was om te begrijpen hoe de nanomechanische eigenschappen van loblolly-dennen verschillen tussen verschillende weefseltypen en boomleeftijd. Een triggerdrempel van 1 μN werd meestal gebruikt voor de hellingen (60 nm nominale hellingsgrootte uitgevoerd met een hellingssnelheid van 1 Hz), wat leidde tot een inkepingsdiepte van ~ 10 nm langs de celwanden (8 ± 2 nm over alle bestudeerde monsters) of iets dieper (14 ± 4 nm) in de celinterieurs, die iets zachter zijn dan de celwanden. Inspringingen binnen elke lijn werden ≥ 100 nm uit elkaar geplaatst om ervoor te zorgen dat ze goed gescheiden waren, en 1.024 gegevenspunten werden per helling verzameld om goed gekarakteriseerde naderings- en intrekcurven te produceren. Door snelle krachtcurve-gebaseerde beeldvorming te combineren met point-and-shoot cantilever-gebaseerde nano-indentatie, was het mogelijk om statistieken te genereren en verschillen in moduli tussen celstructuren te bepalen. Zoals te zien is in tabel 1, bleek bijvoorbeeld dat de gemiddelde elastische modulus van het celinterieur ongeveer de helft was van die van de celwand over vurenhoutmonsters afkomstig van meerdere takken van bomen van verschillende leeftijden.

Monster	Plaats	E* (GPa)	E (GPa)	Vervorming (nm)	Aantal (n)
1	Binnenste	1,5 ± 0,4	1,4 ± 0,4	14 ± 2	199
	Muur	4,7 ± 1,3	4,3 ± 1,3	7 ± 2	202
2	Binnenste	1,3 ± 0,3	1,2 ± 0,3	16 ± 3	198
	Muur	3,2 ± 0,9	2,9 ± 0,9	9 ± 2	199
3	Binnenste	1,9 ± 0,6	1,7 ± 0,6	12 ± 3	198
	Muur	5,7 ± 1,2	5,2 ± 1,2	6 ± 1	199
4	Binnenste	2,4 ± 0,8	2,2 ± 0,8	11 ± 3	202
	Muur	4,2 ± 2,1	3,8 ± 2,1	9 ± 4	193
5	Binnenste	2,6 ± 0,8	2,3 ± 0,8	10 ± 2	198
	Muur	4,3 ± 1,6	3,9 ± 1,6	7 ± 2	199
Gemiddeld	Binnenste	1,9 ± 0,6	1,8 ± 0,6	13 ± 3
	Muur	4,4 ± 1,4	4,0 ± 1,4	8 ± 2

Tabel 1: Loblolly pine elastic modulus statistics: cell walls versus cell interior. Gemeten elastische moduli van de celwanden versus celinterieurs voor vijf loblolly pine whitewood takmonsters verzameld van twee bomen van verschillende leeftijden. Alle moduluswaarden werden berekend door het naderingsgedeelte van de krachtverplaatsingscurve aan te passen aan het DMT-model en uit te gaan van een Poisson-verhouding van 0,3 voor het monster. Moduli worden gerapporteerd als gemiddelde ± standaarddeviatie voor elke monsterlocatie, waarbij het aantal krachtcurven (telling, n) wordt geanalyseerd om het gerapporteerde resultaat te produceren. Gemeten gereduceerde moduli (E*) werden omgezet in werkelijke monstermoduli (E), uitgaande van een Young's modulus van 1.140 GPa en Poisson's ratio van 0,07 voor de gebruikte diamanttip indenter. Ook wordt de gemiddelde monstervervorming voor de toegepaste belasting van 1 μN getoond.

Gecorreleerde nanomechanica en elektronenmicrospectroscopie op Bakken-schalie
Bakken schalieafzettingen zijn te vinden in het Williston-bekken in Montana en North Dakota in de Verenigde Staten en delen van Saskatchewan in Canada. Ze zijn het op een na grootste koolwaterstofreservoir in de Verenigde Staten, maar de studie van de afzettingen staat nog in de kinderschoenen³⁷. Een onderzoek naar de nanomechanische eigenschappen van Bakken-schalie als functie van samenstelling en thermische rijpheid werd uitgevoerd door het co-lokaliseren van AFM cantilever-gebaseerde nano-indentatie met scanning elektronenmicroscoop (SEM) beeldvorming en energiedispersieve spectroscopie (EDS) elementaire samenstellingskarakterisering, zoals weergegeven in figuur 10. In het bijzonder werd SEM-EDS-mapping gebruikt om de elementaire verdeling te karakteriseren (figuur 10C), waardoor de aanwezigheid en locatie van verschillende minerale insluitsels in de schaliematrix werd bepaald. Snelle (kHz rate) force curve-based AFM imaging (Figuur 10B) werd samen met de SEM-EDS kaarten gelokaliseerd door een optisch identificeerbare oorsprong te definiëren in het secundaire elektron (SE) SEM-beeld (Figuur 10A) en de fasebeweging van zowel de AFM als SEM³⁸ te volgen. Door opnieuw gebruik te maken van een diamantpuntsonde gemonteerd op een stijve roestvrijstalen cantilever, was het in kaart brengen van variaties in de elastische modulus mogelijk voor grote gebieden (85 μm x 85 μm) met insluitsels van belang (figuur 10D). Merk op dat de moduluskaart in figuur 10D eerder kwalitatief dan kwantitatief van aard is, omdat de juiste sondekalibratieconstanten niet in de software zijn ingevoerd voorafgaand aan beeldvorming en gegevensverzameling.

De AFM-beelden in figuur 10B en figuur 10D benadrukken ook een van de nadelen van de gebruikte diamantpuntsonde, namelijk het onvermogen om kenmerken met een hoge beeldverhouding nauwkeurig te volgen (zie het zwarte ovale gebied in figuur 10B) vanwege de geometrie van de kubushoekpunt. De verminderde resolutie en het onvermogen om steile kenmerken nauwkeurig te volgen, zijn duidelijker te zien in figuur 11, waar hetzelfde algemene gebied van een Bakken-schaliemonster is afgebeeld door de kubushoekdiamantpunt (figuur 11A) en een aanzienlijk scherpere, hogere beeldverhouding stijve tapmodus silicium AFM-sonde (figuur 11B). Meer specifiek werd het beeld in figuur 11B verkregen met de sonde gekarakteriseerd in figuur 8A-D, tussen de BTR-modellen in figuur 8A (R = 11 nm) en figuur 8B (R = 43 nm). Voor directe vergelijking presenteren beeldparen Figuur 11C, D, samen met Figuur 11E, F, ingezoomde afbeeldingen van dezelfde monsteroppervlakkenmerken die zijn verkregen met respectievelijk de diamantpunt en de siliciumsonde, die het effect van tipgeometrie en straal op de beeldresolutie en -getrouwheid laten zien. Figuur 11G toont een samengesteld 3D-beeld dat de oppervlaktetopografie combineert die is verkregen met de scherpe, hoogaspect siliciumsonde (figuur 8A, B) en de moduluswaarden verkregen met de diamantpuntsonde (figuur 8E, F) gecodeerd als de bedekte gekleurde huid.

Naast de grote beelden in figuur 10 en figuur 11 werden kleinere (10 μm x 10 μm) op de snelkrachtcurve gebaseerde beelden verkregen met behulp van de volledig gekalibreerde diamantpuntsonde. Deze beelden richtten zich op gebieden zonder optisch zichtbare anorganische minerale insluitsels om de eigenschappen van de omringende organische matrix in meer detail te onderzoeken. Door gebruik te maken van een pixelresolutie van 512 x 512 (d.w.z. ~ 20 nm x 20 nm sampling pixels), werden > 262.000 individuele F-D-curven vastgelegd en opgeslagen met elk beeld van 10 μm x 10 μm, waardoor uitstekende statistieken mogelijk waren. De F-D-gegevens werden batchgewijs verwerkt en geanalyseerd met behulp van het AtomicJ-softwarepakket²³ om het Derjaguin-Müller-Toporov (DMT) 35-contactmechanicamodel te implementeren. Na het aanbrengen werden de gegevens gereinigd om curven te verwijderen die resulteerden in een berekende elastische modulus <0 (niet-fysiek) of >30 GPa (aangezien de studie was gericht op het niet-minerale deel van de schalie, E << 30 GPa) vergelijkbaar met andere studies^39,40, evenals gegevens met een model fit R² < ^0,7. Hoewel de R^2-cutoff enigszins willekeurig is, werd ervoor gekozen om alleen gegevens te verwijderen die het model duidelijk niet nauwkeurig kon passen. Met uitzondering van één uitschieter die een grote mineraalopname in het beeldvormingsgebied omvatte, waren de verwijderde curven goed voor minder dan 0,5% van de totale gegevens voor elk beeld. Een samenvatting van de statistische resultaten is te vinden in tabel 2. De berekende elastische moduli variëren van 3,5 tot 6,1 GPa, binnen het bereik van wat vergelijkbare studies ook^39,40 hebben gevonden.

Monster	E (GPa)	Opbrengst na het opschonen van gegevens	Aantal (n)
1	6,1 ± 3,8	93.70%	7,36,874
2	5,1 ± 2,6	99.70%	7,84,267
3	3,5 ± 1,9	99.60%	7,83,427

Tabel 2: De elastische modulusstatistieken van Bakken-schalie. Gemeten elastische moduli van de organische matrices in drie Bakken schaliemonsters van verschillende samenstelling en thermische rijpheid. Monster 1 is een controle, terwijl monsters 2 en 3 respectievelijk 12 uur en 48 uur werden gegloeid om thermische rijping kunstmatig te simuleren. Elastische moduli worden gerapporteerd als gemiddelde ± standaardafwijking voor elke monsterlocatie, waarbij het aantal krachtcurven (telling, n) in de analyse is opgenomen na toepassing van de in de aangegeven tekst beschreven procedure voor het opschonen van gegevens. De berekende gemiddelde moduli (3,5-6,1 GPa) vallen binnen het bereik dat is gerapporteerd in andere vergelijkbare studies zoals die van Li et ^al.40, die een modulusbereik van 2,9-11,8 GPa vonden.

Mesenchymale stamcelkernstijfheid verandert als gevolg van externe stimuli
Mesenchymale stamcellen (MSC's) zijn voorlopercellen die chondrocyten, adipocyten, osteoblasten en myocyten kunnen worden⁴¹. MSC-differentiatie in deze verschillende weefseltypen wordt beïnvloed door externe mechanische stimuli op de cel via de linker van het cytoskelet en nucleoskeleton (LINC) -complex, dat het buitenste celmembraan fysiek verbindt met het kernmembraan⁴¹. Het LINC-complex bestaat uit SUN- en Nesprin-eiwitten die interageren met het celcytoskelet om fysieke krachten op de cel te detecteren en nucleaire import van de mechanosensitieve factoren β-catenine en YAP te vergemakkelijken om het differentiatieproces te initiëren^42,43,44. Samen met de nucleaire import van β-catenine en YAP na de mechanostimulatie van cellen, ondergaat het cytoskelet ook een herschikking, waaronder de vorming van F-actinefilamenten rond de kern en de nucleaire translocatie van actine^44,45,46. Omdat mechanostimulatie veranderingen in het celcytoskelet en nucleaire invoer van actine initieert, wordt de algehele stijfheid (modulus) van cellen en kernen beïnvloed en kan deze worden gemeten met AFM-nano-indentatie op basis van cantilever. Eerdere studies hebben dit bevestigd door een afname van de cel- en kernmodulus te detecteren na verstoring van het LINC-complex, en omgekeerd een toename van de cel- en kernmodulus na de mechanostimulatie van MSCs⁴⁷. Huidig onderzoek onderzoekt nog steeds de mechanismen voor actine-import naar de kern en hoe actinepolymerisatie de cel- en kernmodulus beïnvloedt na mechanostimulatie.

Om de mechanische eigenschappen van levende cellen te onderzoeken, moeten de experimenten worden uitgevoerd in een bufferoplossing, meestal PBS. Het uitvoeren van op cantilever gebaseerde nano-indentatie in vloeistof levert unieke problemen op, met name voor het meten van zeer zachte monsters zoals MSCs (E≈ 2 kPa). Met name de lage elastische moduli van levende cellen vereisen het gebruik van een grote sondestraal om de spanning op de celstructuur te verminderen en punctie van het membraan te voorkomen. Bovendien zijn zeer lage veerconstante uitkragingen (k = 0,04 N/m) nodig om dergelijke lage elastische moduli te meten, maar dit verhoogt de kans op valse betrokkenheid als gevolg van de viskeuze weerstand van de vloeistof, wat leidt tot afbuiging van de zachte cantilever tijdens de eerste snelle verlagingsstap van het AFM-inschakelproces. Om de hogere neiging tot valse engages tegen te gaan, kan het nodig zijn om een groter engage setpoint te gebruiken (d.w.z. deflection voltage trigger threshold om het engage proces te beëindigen). Aangezien zachtere cantilevers over het algemeen in grotere mate elastisch kunnen worden vervormd dan stijve cantilevers, is de grotere buiging die wordt ervaren met een hoger inzetpunt in vloeistof over het algemeen niet schadelijk voor dergelijke zachte sondes. Bovendien is het noodzakelijk dat de oplossingen die in een vloeibare omgeving worden gebruikt, vrij zijn van puin en bellen, omdat zwevend puin of bellen tijdelijk de transmissie van de laser door de vloeistof naar de PSD kunnen verstoren of zich aan de cantilever kunnen hechten en de laser kunnen blokkeren. Interferentie met de laserstraal heeft een negatieve invloed op de resulterende F-D-curven en resulteert vaak in valse crashdetectie of valse betrokkenheid. Ten slotte vereist nano-indentatie op levende cellen ook meer gebruikersinvoer dan op hardere, levenloze materialen. Met name omdat de cellen en hun vloeibare omgeving veel dynamischer zijn, kan het nodig zijn om de hoogte van de sonde voor elke helling actief aan te passen om ervoor te zorgen dat een goede F-D-curve wordt verkregen.

Bij nano-indentatie van levende cellen is vaak een veel grotere monstervervorming nodig om te resulteren in dezelfde cantileverafbuiging ten opzichte van stijvere monsters. Deze grotere vervorming kan resulteren in experimentele resultaten die afwijken van de aanname van lineaire elasticiteit van het Hertz-model, en daarom moet mogelijk een correctiefactor worden toegepast om rekening te houden met het hyperelastische gedrag voor nauwkeurige F-D-analyse⁴⁸. Het is gebleken dat de geometrische grootteverhouding , waarbij R ₂ de straal van het indruklichaam is en R₁ de straal van de cel (zie figuur 12A), kan worden gebruikt om de naleving van de resulterende gegevens aan de Hertziaanse mechanica te voorspellen. De ideale geometrische grootteverhouding bleek β = 0,3 te zijn, waarbij β waarden <0,3 leiden tot onderschatting van de elastische modulus en β waarden > 0,3, wat leidt tot overschatting van de elastische modulus bij analyse met Hertz-contacttheorie⁴⁸. Een veel voorkomende manier om niet-lineaire effecten te voorkomen, is door vervormingen klein te houden. In deze studie was de inkepingsdiepte beperkt tot 500 nm-1 μm.

Een representatieve dataset met resultaten van een enkele reeks nano-indentatie-experimenten op MSC's en geïsoleerde kernen is weergegeven in figuur 12B. In de gegevens in figuur 12B werden vooraf gekalibreerde (veerconstante via LDV en tipradius via SEM), hemisferische sondes met een straal van 5 μm met een nominale veerconstante van k = 0,04 N/m gebruikt om verschillen in modulus tussen intacte levende MSC's en geïsoleerde MSC-kernen te onderzoeken, die dienden als controles om de effecten van statische en dynamische spanningen op cel- en nucleaire mechanische eigenschappen te testen⁴⁶. Vanwege verschillen tussen en uitdagingen bij het betrekken van de cellen en kernen, hebben de geëxtraheerde modulusgegevens de neiging om een grote variatie te vertonen (d.w.z. verdeling van waarden). Dienovereenkomstig presenteert de dataset in figuur 12B een^75e percentiel van de verzamelde gegevens. Vanwege deze aangeboren variabiliteit tussen levende cellen en de resulterende metingsverspreiding, wordt aanbevolen om replicatie-nano-indentatie-experimenten uit te voeren op grote aantallen monsters met ten minste drie biologische replicaties om robuuste statistieken te genereren voor gegevensanalyse en interpretatie³⁰.

Mechanische eigenschappen van cholesterolbevattende lipide bilayers
Ondersteunde lipidemembranen met een zeer hoog (>50 mol%) cholesterolgehalte (Chol), typisch voor de samenstelling in ooglensmembranen, werden bereid en geïncubeerd op vers gespleten muskoviet mica⁴⁹. Een representatief AFM-topografiebeeld van een dergelijk ondersteund lipidemembraan (SLM) bereid bij een Chol/POPC (POPC = 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-fosfocholine) mengverhouding van 1 is weergegeven in figuur 13A, met het hoogteprofiel langs de paarse lijn in de afbeelding onder de figuur. De SLM in figuur 13A bedekte het blootgestelde mica-oppervlak volledig met voldoende incubatietijd (~ 25 min) en een voldoende lipideconcentratie (0, 3 mg / ml), zoals blijkt uit het ontbreken van onderscheidende kenmerken in het topografiebeeld. Evenzo biedt het hoogteprofiel over de afbeelding structurele details met betrekking tot de ruwheid van het membraanoppervlak, waarbij de SLM glad is zoals verwacht.

Figuur 13B toont een verzameling naderingssecties van krachtcurven die zijn vastgelegd op de SLM in figuur 13A. Om betere statistieken te verkrijgen over de mechanische eigenschappen van de SLM, werden krachtcurven verzameld op gelijke afstand van punten op ten minste 100 nm van elkaar, die bijna de gehele breedte van de SLM beslaan. De afstand tussen de punten (≥10x de inkepingsdiepte) is gekozen om te voorkomen dat inspringingen te dicht bij elkaar komen. De krachtcurven laten een duidelijke doorbraakgebeurtenis zien, zoals blijkt uit de discontinuïteit of plotselinge sprong tussen de ~0 en ~5 nm scheidingsafstanden in het naderingsgedeelte van de krachtcurven waar de kracht snel daalt van ~10 nN naar ~5 nN. De gemiddelde doorbraakkracht voor het membraan in figuur 13A (Chol/POPC-mengverhouding van 1) op basis van de naderingscurven in figuur 13B wordt berekend op 9,25 ± 0,27 nN.

Figuur 13C toont daarentegen een AFM-topografiebeeld van de partiële membraan- of membraanpleisters gevormd door opnieuw incuberende membranen bij een Chol/POPC-mengverhouding van 1, maar bij een veel lagere concentratie lipiden (~15 μg/ml) en met een kortere incubatietijd (~5-6 min)⁴⁹. Het hoogteprofiel langs de rode lijn over het membraanvlak in het midden van de afbeelding wordt onder de afbeelding weergegeven. De meting over de partiële dubbellaag geeft de dikte van de SLM weer, weergegeven door de zwarte stippellijnen in figuur 13C als ~7 nm. Deze gemeten dikte bevat echter ook een waterlaag van 1-2 nm tussen het membraan en de micaschijf⁵⁰. Opgemerkt moet worden dat het gedeeltelijke membraan vaak slechts zwak aan het mica-oppervlak is bevestigd, waardoor lipidedeeltjes tijdens het scannen van de rand van de partiële membraanpleisters kunnen worden verwijderd, maar een iets langere incubatietijd of het verlagen van de beeldvormingskracht kan deze moeilijkheid elimineren.

Kalibratie van de AFM-sonde is cruciaal om de mechanische eigenschappen van SLM nauwkeurig te kwantificeren. Hoewel de puntveerconstante consistent blijft in lucht of vloeibaar medium, moet de doorbuigingsgevoeligheid worden gekalibreerd in hetzelfde medium waar experimenten worden uitgevoerd. Het is van cruciaal belang om de doorbuigingsgevoeligheid onmiddellijk vóór elke set krachtcurve-acquisities te kalibreren om reproduceerbare resultaten te garanderen, omdat de laseruitlijning en / of reflectiviteit van de achtercoating in de loop van de tijd kan veranderen, met name in vloeistof. Zeer scherpe sondes worden afgeraden voor het vastleggen van membraankrachtcurven, omdat ze de SLM gemakkelijk doorboren en kunnen leiden tot het meten van een ten onrechte lage doorbraakkracht of helemaal geen doorbraak. Herhaald gebruik van dezelfde tip zonder de juiste reiniging verhoogt echter de kans dat vuil zich ophoopt op de punt en daardoor de punt afstompt of de kleefkrachten van het tipmonster beïnvloedt. Een gebrek aan doorbraakgebeurtenissen die zichtbaar zijn in de naderingskrachtcurven kan ook overeenkomen met het alleen duwen op mica in plaats van het eigenlijke membraan; Visuele bevestiging van membraanvorming vóór het vastleggen van krachtcurven is dus noodzakelijk.

Figuur 7: Representatieve krachtverplaatsingscurven (F-D) in lucht en vloeistof. Representatieve krachtcurven verkregen op (A) een loblolly den in lucht met bijbehorende DMT-modelfit, en (B) een levende MSC-kern in PBS met een bijbehorende Hertz-modelfit. Inzetstukken in panelen A en B tonen een zoom van het contactgebied van de overeenkomstige naderingscurven (blauwe sporen) met bijbehorende pasvorm (groene sporen). In elk paneel wordt het initiële tip-sample contactpunt (zoals bepaald door het montagealgoritme) aangegeven door een groene ruit, terwijl het omslagpunt (d.w.z. overgang van nadering naar intrekken of terugtrekken) wordt aangegeven door een cyaancirkel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8: Vergelijking van silicium versus diamant sonde tip slijtage. (A-D) Silicium sonde tip. Reeks modellen gemaakt door de blindepuntreconstructiemethode na beeldvorming van een tipkarakteriseringsmonster, waaruit de evolutie in straal van een stijve cantilever silicium tipsonde blijkt (zie Materiaaltabel) als gevolg van progressieve tipslijtage ervaren in de loop van drie opeenvolgende 85 μm x 85 μm (1024 x 1024 pixels) krachtcurve-gebaseerde beelden van een Bakken-schaliemonster, uitgevoerd met een lijnscansnelheid van 0,1 Hz en een bemonsteringsfrequentie van de krachtcurve van 2 kHz (d.w.z. ~ 20 miljoen tip-sample interacties / beeld). (A) Tip zoals ontvangen (uit de doos), voorafgaand aan gebruik. R = 11 nm. (B) Tip na één afbeelding (R = 43 nm). (C) Tip na twee afbeeldingen (R = 94 nm). (D) Tip na drie afbeeldingen (R = 129 nm). (E,F) Diamant sonde tip. BTR-modellen van dezelfde diamantpuntsonde (zie materiaaltabel) verkregen ~ 6 maanden uit elkaar. Tussen de acquisitie van de tipbeelden die werden gebruikt om de modellen in E en F te genereren, werden duizenden nano-indenten uitgevoerd met de sonde en honderden miljoenen tip-sample interacties tijdens op krachtcurve gebaseerde beeldvorming vonden plaats. Niettemin, als gevolg van de hardheid van diamant, veranderde de geschatte tip-eindradius van ~ 30 nm niet binnen de onzekerheidsgrenzen van de BTR-techniek tussen de verwerving van de initiële (E) en follow-up (F) beelden van de tip. De asperiteit waargenomen in het eerdere model (aangegeven door de zwarte cirkel in paneel E is hoogstwaarschijnlijk een artefact van de BTR-methode of vanwege de aanwezigheid van een verontreiniging op nanoschaal (bijvoorbeeld stofdeeltje) aan de zijkant van de punt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 9: AFM-topografie en moduluskaarten van een loblolly-dennenmonster. Representatieve AFM-gegevens verkregen in lucht op een doorsneded loblolly-denmonster ingebed in hars om op cantilever gebaseerde nano-indentatiemetingen op celwanden mogelijk te maken. (A) AFM-topografiebeeld dat meerdere cellen omvat die zijn verkregen via een op snelle krachtcurve gebaseerde beeldvormingsmodus, gepresenteerd als een pseudo-3D-weergave. (B) Elastic of Young's moduluskaart gegenereerd in realtime door de AFM-software door de krachtcurve te analyseren die bij elke pixel wordt verkregen en de gegevens aan te passen aan het DMT-model, waaruit blijkt dat de celwanden stijver zijn dan de celinterieurs. Merk op dat de nominale, in plaats van gemeten, sondekalibratieparameters werden gebruikt, dus de moduluswaarden moeten worden behandeld als kwalitatief of alleen semikwantitatief. (C) Overzicht van de ROI met vermelding van de locaties (acht lijnen bestaande uit 50 witte draden per stuk op een afstand van ≥100 nm uit elkaar) waar 400 nano-indenten (60 nm nominale hellinggrootte, met een triggerdrempel van 1 μN overeenkomend met een gemiddelde inkepingsdiepte van ~ 10 nm) werden uitgevoerd langs geselecteerde celwanden na verwerving van het AFM-beeld om het lokaliseren van inspringingen met precisie op nanoschaal mogelijk te maken. Schaalstaven = 20 μm (A,B). Afkortingen: AFM = atoomkrachtmicroscopie; DMT = Derjaguin-Müller-Toporov. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 10: Co-gelokaliseerde AFM en SEM/EDS van een Bakken schaliemonster. (A) Secundair elektronen-SEM-beeld van een deel van een Bakken-schaliemonster. (B) AFM-topografiebeeld van het gebied dat wordt aangegeven door het zwarte vak in A. Zwarte ovaal geeft een gebied aan waar de lage beeldverhouding van de sonde leidt tot beeldvorming van de zijwand van de sonde in plaats van de steile, hoge beeldverhouding oppervlaktetopografiefunctie. (C) EDS elementaire compositiekaart verkregen voor de SEM-afbeelding weergegeven in A. (D) AFM-afgeleide elastische of Young's moduluskaart gegenereerd in de loop van het verkrijgen van het AFM-topografiebeeld in B, waaruit blijkt dat de minerale opname in het midden van afbeeldingen A-D aanzienlijk moeilijker is dan de omringende organische matrix. Schaalstaven = 50 μm. Afkortingen: AFM = atoomkrachtmicroscopie; SEM = scanning elektronenmicroscopie; EDS = energiedispersieve spectroscopie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 11: Effect van de straal en vorm van de sondepunt op het uiterlijk van kenmerken met een hoge beeldverhouding. Vergelijking van de functieresolutie verkregen met behulp van (A) een R≈ 30 nm lage beeldverhouding (tiphalfhoek = 47°) diamantpuntsonde (zie materiaaltabel) of (B) een R≈ 10 nm hoge beeldverhouding (tip halve hoek ≈ 19°) stijve siliciumsonde (nominaal k = 200 N/m; zie materiaaltabel) om dezelfde locatie op een Bakken-schaliemonster in beeld te brengen. (C-F) Ingezoomde beelden van de blauwe (C,D) en oranje (E,F) gedooste gebieden in A en B verkregen met ofwel de grotere kromtestraal van de diamantpuntsonde met lage beeldverhouding (C,E) of de scherpere, hogere beeldverhouding stijve silicium tapmodussonde (D,F), die de verminderde functieresolutie en introductie van tipzijwandartefacten in het AFM-topografiebeeld benadrukt dat is verkregen met de diamantpuntsonde vanwege de grotere tipradius en halve hoek. De gebieden gemarkeerd in C-F bevatten steile, diepe putachtige kenmerken die de afwegingen aantonen in termen van laterale resolutie, nauwkeurige tracking en beeldgetrouwheid tussen een gemakkelijker afgestompte, aanvankelijk scherpe siliciumsonde of een stompere, slijtvaste diamantpuntsonde. (G) Samengesteld 3D-beeld gegenereerd door AFM-topografie verkregen met de scherpe, hogere beeldverhouding stijve silicium sonde te combineren met modulusgegevens (bedekte gekleurde huid) afgeleid van snelle krachtcurve-beeldvorming van hetzelfde gebied van het monster met de diamantpuntsonde. De kenmerken die worden gemarkeerd door de blauwe en witte vakken in A en B worden ook in G aangegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 12: Op cantelever gebaseerde nano-indentatie op cellen of kernen. (A) Een cel met straal R ₁ op een plat, stijf substraat wordt ingesprongen tot een diepte d door een bolvormig indruklichaam met straal R₂. Deze figuur is gereproduceerd uit Ding et ^al.48. (B) Individuele waardeplots van representatieve modulusmetingen verkregen uit AFM-nano-indentatie-experimenten op op muizen-MSC's en geïsoleerde kernen geëxtraheerd uit muis-MSC's. Een totaal van 10 cellen en 10 kernen werden elk vijf keer gemeten op een inkepingsdiepte van 500-600 nm (gekozen om het gebruik van het Hertz-contactmechanicamodel mogelijk te maken). De resulterende ruwe F-D-curvegegevens werden verwerkt met behulp van Atomic J²³ om de elastische moduli te berekenen. Vanwege de grote aangeboren variabiliteit van de cellen wordt een^75e percentiel van de gegevens uitgezet. Cel- en geïsoleerde kernen vertoonden geen statistisch verschil in elastische modulus, met een gemeten gemiddelde moduli van respectievelijk 0,75 ± 0,22 kPa en 0,73 ± 0,22 kPa. Vergelijkbare gegevens zijn verzameld en geanalyseerd om verschillen in nucleaire stijfheid te bepalen als gevolg van mechanische stimulatie, eiwit knock-outs en chemische behandelingen. Afkortingen: MSC = mesenchymale stamcel; AFM = atoomkrachtmicroscopie; F-D = krachtverplaatsing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 13: Morfologie en nanomechanische eigenschappen van lipide bilayers. (A) AFM-topografiebeeld met de minimale hoogtevariatie van een volledig ondersteund lipidemembraan (SLM) bestaande uit Chol / POPC bij een mengverhouding van 1 die zich over het gehele blootgestelde mica-oppervlak vormde met een lange incubatietijd (~ 25 min) en een hoge lipideconcentratie (0,3 mg / ml). Het hoogteprofiel langs de paarse lijn over het midden van de afbeelding wordt onder de afbeelding weergegeven en geeft structurele details van het membraanoppervlak. Zoals verwacht is de SLM extreem soepel. (B) Verzameling van naderingssecties van krachtcurven die zijn vastgelegd op de SLM zoals weergegeven in A. Krachtcurven werden verzameld op gelijke afstand van punten ≥ 100 nm uit elkaar die bijna de hele SLM bedekten. De krachtcurven vertonen een duidelijke doorbraakgebeurtenis, zoals blijkt uit de discontinuïteit of plotselinge sprong in het naderingsgedeelte van de krachtcurven. De gemiddelde doorbraakkracht is 9,25 ± 0,27 nN. (C) Partiële membraan- of membraanpleisters gevormd door het incuberen van membranen bij een Chol/POPC-mengverhouding van 1 met een kortere incubatietijd (~5-6 min) en een lagere lipideconcentratie (~15 μg/ml) ten opzichte van A⁴⁹. Het hoogteprofiel langs de rode lijn op de patch wordt onder de afbeelding weergegeven. De gedeeltelijke tweelaagse laag maakt het mogelijk om de dikte van de SLM te meten, weergegeven door de zwarte stippellijnen in het hoogteprofiel. Merk op dat de gemeten dikte ook een waterlaag van 1-2 nm bevat tussen het membraan en de micaschijf⁵⁰. Deze figuur is met toestemming van Elsevier overgenomen uit Khadka et ^al.49 . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Monstervoorbereiding
Voor nano-indentatie in lucht omvatten gebruikelijke bereidingsmethoden cryosectie (bijv. weefselmonsters), slijpen en / of polijsten gevolgd door ultramicrotoming (bijv. In hars ingebedde biologische monsters), ionenfrezen of voorbereiding van gerichte ionenbundels (bijv. halfgeleider-, poreuze of gemengde hardheidsmonsters die niet geschikt zijn voor polijsten), mechanisch of elektrochemisch polijsten (bijv. Metaallegeringen) of dunnefilmafzetting (bijv. Atomaire laag of chemische dampafzetting, moleculaire bundel epitaxie). Het doel is om een monster te maken met minimale oppervlakteruwheid (idealiter nm-schaal, ≤0,1x de beoogde inkepingsdiepte). Bij veel van de voorgaande methoden moet het monster mogelijk vervolgens worden gespoeld met en/of gesoniseerd in een zeer zuiver gefilterd oplosmiddel (bijv. HPLC-kwaliteit) en gedroogd met ultrahoge zuiverheid (99,999%) stikstofgas (N₂) om deeltjesresten te verwijderen. Als alternatief kunnen vlokken (bijv. 2D-materialen) of deeltjes (bijv. nanodeeltjes of microcapsules) worden gecoat of uit oplossingen worden gegoten die zijn bereid met behulp van zeer zuivere gefilterde oplosmiddelen. In dit geval is het doel om een oppervlaktedichtheid te bereiken die meerdere niet-overlappende vlokken of deeltjes binnen het gezichtsveld oplevert in een willekeurig gekozen gebied op het monster. Voor nano-indentatie in vloeistof (vaak gebruikt voor biologische monsters die een bufferoplossing nodig hebben om levensvatbaar te blijven), is depositie of bereiding van monsters op een glad substraat (oppervlakteruwheid op nanometerschaal) (bijv. microscoopglaasje, petrischaal of vers gekloofd moskovietmica) noodzakelijk^46,47,49.

Overwegingen bij het selecteren van sondes
De selectie van een geschikte sonde is van het grootste belang voor kwantitatieve analyse van F-D-curven, omdat de interactie tussen tip en monster de fundamentele eigenschap is die wordt gemeten in nano-indentatie op basis van cantilever. De volgende vragen zijn van bijzonder belang bij het kiezen van een sonde voor een bepaald experiment. Wat is de verwachte (of gemeten) oppervlakteruwheid en het elastische modulusbereik van het monster? Monsters met een hoge ruwheid kunnen versnelde slijtage veroorzaken in vergelijking met gladdere monsters vanwege de verhoogde zijdelingse krachten die op de punt aanwezig zijn bij het volgen van steile kenmerken, en verhogen de kans op tipbreukgebeurtenissen⁵³. Evenzo, hoe harder het monster is, hoe sneller het de sondepunt zal dragen. Bovendien, hoeveel afbeeldingen en/of nano-indenten zijn er nodig? Met minder beeldvorming en inkepingen kan minder tipslijtage worden verwacht. Zoals hieronder in meer detail wordt beschreven, kan tipslijtage worden verminderd door gebruik te maken van diamantachtige koolstofcoatings (DLC) of vrijwel worden geëlimineerd door diamantpuntsondes te gebruiken (waarbij de hoge aanschafkosten in de loop van de tijd worden gecompenseerd door de bijna oneindige levensduur van de sonde).

Een andere overweging bij het kiezen van een geschikte sonde is de grootte van de interessante kenmerken. Voor nano-indentatie is het vaak het beste om de grootst mogelijke tipgrootte te gebruiken met behoud van de ruimtelijke resolutie die nodig is voor het monster (en) in kwestie en de gewenste informatie-inhoud, omdat grotere tips minder kans hebben op plotselinge veranderingen in de tipgeometrie als gevolg van breuk en ook lagere slijtagepercentages zullen vertonen⁵⁴. Het is ook belangrijk om te overwegen of er andere AFM-methoden zijn die samen met nano-indentatie moeten worden gelokaliseerd, zoals geleidende AFM⁵⁵, Kelvin probe force microscopy (KPFM)56 of magnetic force microscopy (MFM)⁵⁷. Als extra metrologieën zoals deze moeten worden gebruikt, moet de sondepunt mogelijk elektrisch geleidend of magnetisch zijn, wat van invloed is op de materiaalsamenstelling en dus op een groot aantal eigenschappen, waaronder hardheid, slijtvastheid en tipradius. Evenzo, als inkeping in vloeistof wordt uitgevoerd, is de samenstelling van de reflecterende achterkant van de sonde (indien aanwezig) een andere belangrijke overweging, omdat deze corrosiebestendig moet zijn (bijv. Een Au-coating aan de achterkant is gebruikelijk voor vloeistofsondes). Ten slotte, en misschien wel het belangrijkste, moet de veerconstante van de sondecantilever worden afgestemd op het verwachte bereik van elastische moduli die moeten worden gemeten. Als de veerconstante niet goed overeenkomt met de monstermodulus, kan een van de twee gevallen optreden. Als de cantilever te stijf is, wordt er weinig of geen doorbuiging gemeten en wordt karakterisering onmogelijk; Omgekeerd, als de cantilever te zacht is, zal deze niet in staat zijn om het monster voldoende te vervormen om de mechanische eigenschappen ervan te meten.

Tip slijtage
Slijtage kan op verschillende manieren worden gedefinieerd; voor de bespreking van de slijtage van de AFM-sondepunt hier, zal deze worden gedefinieerd als elke verandering in de oppervlaktetopografie van de sondepunt als gevolg van plastische vervorming zonder materiaalverlies, evenals elke verwijdering van materiaal van het oppervlak als gevolg van fysieke interacties⁵⁸. In bredere zin kan slijtage ook chemische reacties zoals oxidatie en hydratatie met zich meebrengen. In normale AFM-toepassingen wordt de laterale ruimtelijke resolutie meestal beperkt door de tipradius⁵⁹ en is de tip-sample interactie de primaire gemeten eigenschap. Aangezien de tipradius een belangrijke parameter is bij het modelleren van de contactmechanica van het tip-samplesysteem en vervolgens het bepalen van de mechanische eigenschappen, is tipslijtage van bijzonder belang bij het uitvoeren van nano-indentatie-experimenten en is het een belangrijke beperking voor de nauwkeurige interpretatie van nano-indentatieresultaten⁵³. Vanwege de normaal gesproken geleidelijke aard van tipslijtage (afgezien van tipbreukgebeurtenissen), is het niet mogelijk om tipslijtage te kwantificeren als gevolg van een enkele nano-indentatiecyclus (d.w.z. helling). Bovendien leent de loodrechte beweging van de sondepunt ten opzichte van het monster in nano-indentatie (waarbij beeldvorming op basis van snelle krachtcurve wordt verdisconteerd) zich voor het verminderen van de slijtagesnelheid, omdat de primaire modus van tipslijtage meestal schuifkrachten zijn die zich ontwikkelen tijdens scanmodi⁶⁰. Als zodanig is de primaire bron van tipslijtage in nano-indentatie-experimenten elke beeldvorming die wordt uitgevoerd na de initiële sondekalibratie (met name doorbuigingsgevoeligheid en tipradiusmetingen) maar vóór nano-indentatie. Het wordt daarom aanbevolen dat als silicium- of siliciumnitride-sondes worden gebruikt, de tipradius zowel voor als na elk experiment moet worden gecontroleerd om eventuele tipslijtage te controleren en te verantwoorden met behulp van een van de hierboven beschreven methoden (bijv. SEM-analyse of BTR).

Sonde materialen
Diamantachtige koolstof (DLC)
Door het gebruik van DLC-gecoate sondepunten of diamantpunten kan de slijtage van de tip enorm worden verminderd of helemaal tenietgedaan⁵³. De verbeterde slijtvastheid van deze alternatieve tipmaterialen is zeer verleidelijk voor het meten van mechanische eigenschappen, met name van zeer stijve materialen. Het is aangetoond dat DLC-sondetips een 1.600-voudige toename van de slijtvastheid kunnen vertonen in vergelijking met normale siliciumsondetips⁵⁴. Deze dramatische toename van de slijtvastheid kan worden toegeschreven aan verschillende factoren. Ten eerste zijn de bindingen die aanwezig zijn in DLC (C-C en C = C) en de interface met silicium (Si-O, Si-C) enkele van de sterkste bindingen van alle elementaire paren, en veel sterker dan de Si-Si-bindingen die aanwezig zijn in siliciumtips. DLC heeft ook het effect van het verminderen van wrijving, wat op zijn beurt de schuifspanningen in de punt verlaagt, waardoor slijtage wordt verminderd. Bovendien is de oppervlaktechemie van de DLC anders dan die van een siliciumpunt, omdat siliciumtips tribochemische etsen kunnen ervaren in omgevingsvochtigheidsomstandigheden, terwijl DLC-tips dat niet doen (of in ieder geval niet op een zinvolle manier in vergelijking met de primaire slijtagemodus)⁵⁴. Het belangrijkste nadeel van DLC-gecoate tips (naast de hogere prijs ten opzichte van standaard ongecoate siliciumtips) is de grotere tipradius als gevolg van de coating zelf. De meeste DLC-sondetipradii zijn ≥30 nm, terwijl niet-DLC-gecoate tips betrouwbaar 1-2 nm kunnen bereiken in straal⁶¹. Een grotere tipradius kan echter vaak wenselijk zijn voor nano-indentatie-experimenten om fouten in eigenschapsmetingen te verminderen, omdat verschillen op nanoschaal tussen de ideale gebiedsdieptefunctie en de werkelijke gebiedsdieptefunctie, als gevolg van sondedefecten of asperiteiten, onevenredig veel invloed zullen hebben op metingen met sondes met een kleinere straal vanwege de grotere relatieve fout. Bovendien kan de DLC-coating, ondanks de superieure slijtvastheid, uiteindelijk op plekken doorslijten, wat leidt tot differentiële slijtage tussen de blootgestelde siliciumkern en de resterende DLC-coating. Helaas kan de slijtvastheid van de DLC-coating ook worden beperkt door de hechting van de coating op de siliconen tip in plaats van de werkelijke hardheid van de coating alleen.

Diamant
Diamant staat bekend als een van de hardste en meest slijtvaste materialen op aarde. Niettemin is aangetoond dat er nog steeds aanzienlijke slijtage kan optreden in diamantpunten bij het gebruik van grote (60 μN) krachten in een opzettelijke poging om tipslijtage^{te onderzoeken 62}. Omgekeerd, in normale nano-indentatie- en beeldvormingsscenario's waarbij de krachten die op de punt worden uitgeoefend veel minder zijn, zijn er geen rigoureuze studies geweest naar de slijtage van diamantpunten. Zoals te zien is in figuur 8E,F, genereerde BTR-modellering van dezelfde diamantsondepunt onder identieke omstandigheden op hetzelfde tipkarakteriseringsmonster met een tussenpoos van 6 maanden na elkaar vrijwel niet te onderscheiden tipvormmodellen (d.w.z. geen waarneembaar bewijs van slijtage). Tussen de eerste en tweede BTR-beelden werd de sonde gebruikt om duizenden nano-indenten uit te voeren en onderging honderden miljoenen tip-sample-interacties terwijl hij een verscheidenheid aan stijve materialen (E > 15 GPa) in beeld bracht, waaronder hout (loblolly pine), leisteen, hooggeordend pyrolytisch grafiet (HOPG) en verschillende grafeen dunne films. Significant is dat de geschatte tipradius met ~ 1 nm veranderde tussen de twee afbeeldingen in figuur 8E, F, wat ruim binnen de fout⁶³ van de BTR-methode ligt. Hoewel het geen volledige studie is, toont deze vergelijking de uitstekende duurzaamheid van een diamantsonde onder normale experimentele nano-indentatie (en zelfs beeldvorming) omstandigheden. De belangrijkste nadelen van het gebruik van diamantpunten (afgezien van dure kosten vooraf) zijn de grotere tipradius en, in sommige opzichten van meer zorg, de lage beeldverhouding van de kubushoekgeometrie van de meeste commercieel verkrijgbare diamantpunten. Figuur 11A,B toont naast elkaar vergelijkende AFM-beelden van hetzelfde gebied van een Bakken-schaliemonster verkregen met een scherpe siliciumsonde met een nominale tipradius van 8 nm en een gemiddelde halve hoek van ~19° versus een diamantpuntsonde met een nominale tipradius van 40 nm en een gemiddelde zijhoek van 47°. Wanneer de vergrote gebieden worden vergeleken (figuur 11C, D en figuur 11E, F), is het duidelijk dat de diamantpuntsonde niet in staat is om de steilere (hogere beeldverhouding) kenmerken in het beeld op te lossen en nauwkeurig te volgen. In plaats daarvan, waar steile kenmerken aanwezig zijn, maakt de zijwand van de tip contact met de bovenrand en volgt het AFM-systeem in wezen de zijwand van de sonde totdat het tipuiteinde weer contact maakt met het oppervlak en de normale tracking wordt hervat.

Veerconstante/modulus matching
Zoals hierboven vermeld, moet de veerconstante van de sondecantilever worden afgestemd op het verwachte bereik van elastische moduli die moeten worden gemeten. Om te helpen bij het kiezen van een geschikte sonde, worden in tabel 3 geschatte nominale cantileverveerconstanten weergegeven die geschikt zijn voor geselecteerde brede reeksen verwachte elastische moduli van monsters, variërend van enkele MPa tot 100 GPa in het geval van ~ 30-40 nm radius sondetips die vaak worden gebruikt voor nano-indentatie⁵². Lagere veerconstante sondes (k < 0,1 N/m) zijn beschikbaar voor nog zachtere materialen (kPa-bereik) zoals cellen.

Veerconstante (N/m)	Verwacht monstermodulusbereik
0.25	≤ 15 MPa
5	5 tot 500 MPa
40	200 – 8.000 (0,2 – 8 GPa)
200	1.000 – 50.000 (1 – 50 GPa)
450	10.000 – 100.000 (10 – 100 GPa)

Tabel 3: Ideale sondeveerconstanten voor het meten van verschillende modulusbereiken. Geschatte nominale sondeveerconstanten voor optimale meting van elastische moduli over verschillende bereiken van enkele MPa tot 100 GPa, uitgaande van een typische sondestraal van ~ 30-40 nm⁵².

Naast de veerconstante moeten in het speciale geval van biologische materialen de tipradius en de krachten die worden uitgeoefend tijdens beeldvorming en nano-indentatie zorgvuldig worden overwogen om schade te voorkomen. In het toepassingsvoorbeeld met meting van de mechanische eigenschappen van cholesterolbevattende lipide bilayers, gepresenteerd in de sectie representatieve resultaten, werd een relatief scherpe (10 nm) tip specifiek gebruikt voor de analyse van de doorbraakkracht in lipide bilayers. Als de ROI van het materiaal daarentegen groot genoeg is (bijv. zoals het geval is voor cellen en celkernen) en er bezorgdheid bestaat over het potentieel voor punctie, zijn hemisferische tips op grotere micronschaal, zoals die worden gebruikt in de stijfheidsmetingen op MSC-kernen die worden beschreven in een van de toepassingsvoorbeelden in de sectie representatieve resultaten, ideaal en bieden uitstekende resultaten voor zachte, fragiele monsters zoals levende cellen en geïsoleerde kernen. Kain et al. presenteren een diepgaande discussie over het kiezen van de optimale combinatie van sondestraal en veerconstante om de hoogst mogelijke meetgevoeligheid voor dergelijke monsters te bereiken⁶⁴.

Kalibratie van sondes
Doorbuigingsgevoeligheid
De doorbuigingsgevoeligheid relateert beweging van de Z-piëzo (en dus afbuiging van de cantilever bij inkeping op een oneindig stijf substraat, uitgaande van werking in de limiet van kleine doorbuigingen) aan een gemeten verandering in spanning op de PSD⁶⁵. De doorbuigingsgevoeligheid (ook wel de inverse optische hefboomgevoeligheid [InvOLS] genoemd) kan worden gerapporteerd in nm/V of V/nm. Hieronder vindt u een overzicht van de meest voorkomende kalibratiemethoden voor de afbuigingsgevoeligheid.

Hard contact met het oppervlak
De eenvoudigste en meest populaire methode voor het bepalen van de doorbuigingsgevoeligheid van de straalweerkaatlaser / AFM-sonde / PSD-systeem is de toepasselijke naam "hard surface contact" -methode⁶⁵. De eenvoud, het gemak van integratie in AFM-besturingssoftwareworkflows en de in-situ aard dragen allemaal bij aan de aantrekkingskracht en het wijdverbreide gebruik van de harde oppervlakcontactmethode. Om deze methode te implementeren, wordt de AFM-sondepunt tegen een materiaal geschroefd dat veel stijver is dan de cantilever. De helling van het contactgedeelte van de krachtverplaatsingscurve (weergegeven als volt van het verticale afbuigingsfoutsignaal op de PSD als functie van de Z-piëzobeweging in nm of toegepaste spanning) geeft vervolgens de doorbuigingsgevoeligheid (figuur 3A). Het gebruik van een stijf substraat zorgt ervoor dat alle gemeten doorbuiging ontstaat door de uitkragende buiging in plaats van een convolutie van monstervervorming en de verplaatsing van de cantilever. In het geval van zachte cantilevers (bijv. k < 10 N/m), silicium (E ≈ 170 GPa)²⁷ of mica¹⁷ gemakkelijk toegankelijke en gemakkelijk te gebruiken materialen (of als alternatief glas, E≈ 70 GPa, of geschikte harde kunststof in het geval van cellen die op een microscoopglaasje of petrischaal zijn geïmmobiliseerd), terwijl voor stijvere cantilevers, zoals die welke worden gebruikt voor sommige nano-indentatie-experimenten (bijv. k > 200 N/m; Tabel 3), kan het nodig zijn saffier (E≈ 345 GPa)^26,66 te gebruiken om ervoor te zorgen dat er geen vervorming van het monster optreedt. Omdat deze methode afhankelijk is van de krachtverplaatsingsmeting, moet de Z-piëzo van de AFM-scanner een gesloten lushoogtesensor gebruiken of goed worden gekalibreerd (indien in open lusmodus) met behulp van verschillende hoogtenormen. De grootste bijdrage aan fouten in de contactmethode voor hard oppervlak is beweging van de laservlek op de cantilever als gevolg van thermische fluctuaties. Veranderingen in de temperatuur van de cantilever worden meestal veroorzaakt door de detectielaser, hoewel Joule-verwarming in de omringende elektronica ook kan bijdragen. Totale temperatuurverschillen van 6 °C tussen de cantilever en de omgevingslucht zijn gemeld, wat kan leiden tot laservlekkenverschuivingen van enkele microns⁶⁷. Om rekening te houden met eventuele verwarming, is het raadzaam om ≥30 minuten na de eerste laserspotuitlijning te wachten om de cantilever in thermisch evenwicht te laten komen met zijn omgeving voor de beste en meest nauwkeurige resultaten. Het gemiddelde van de hellingen van de naderings- en terugtrekkingscurven voor elke gevoeligheidsmeting houdt rekening met eventuele tipwrijvings- of glijeffecten en moet indien mogelijk worden vastgesteld⁶⁸. Bovendien helpt het gemiddelde over meerdere gevoeligheidsmetingen om de betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van de meting te meten. Goede gevoeligheidsmetingen moeten resulteren in afwijkingen van ≤1% en worden uitgevoerd met ongeveer dezelfde doorbuiging als de verwachte experimentele nano-indenten om de effectiviteit van de kalibratie^{te maximaliseren 69}. Het grote nadeel van de contactmethode met een hard oppervlak is dat het fysieke contact dat nodig is voor de kalibratie mogelijk schade kan veroorzaken aan fragiele siliconen tips (bijvoorbeeld afstomping of het creëren van tipartefacten zoals een dubbele tip).

Thermische geluidsmethode
De thermische ruismethode voor het bepalen van de doorbuigingsgevoeligheid vereist voorafgaande kalibratie van de cantileverveerconstante en de mogelijkheid om het thermische ruisspectrum van de cantilever⁶⁷ te meten. De thermische ruismethode is vaak geïntegreerd in moderne AFM-besturingssoftware en kan worden gebruikt in combinatie met de Sader-methode (zie hieronder) voor snelle analyse en berekening van zowel de veerconstante als de doorbuigingsgevoeligheid. Het kan echter moeilijk of onmogelijk zijn om de thermische ruismethode te gebruiken op stijvere (k > 10 N / m) cantilevers vanwege verminderde trillingsamplitude. Bovendien is de gerapporteerde relatieve onzekerheid van de thermische ruismethode aanzienlijk groter, ~ 20% in vergelijking met de hierboven beschreven harde oppervlaktecontactmethode⁷⁰. Deze techniek kan niet worden gebruikt als de hieronder beschreven thermische afstemmingsmethode voor het bepalen van de veerconstante^{wordt gebruikt 67}.

Veerconstante
De gouden standaard voor het meten van cantileverveerconstanten is laser-Dopplervibrometrie (LDV) en er zijn nu veel in de handel verkrijgbare sondes die worden geleverd met LDV-afgeleide veerconstante kalibratie-informatie die door de fabrikant voor elke afzonderlijke sonde wordt verstrekt (zie materiaaltabel). Hoewel nauwkeurige meting van de cantileverveerconstante een absolute noodzaak is voor kwantitatieve nanomechanische metingen, zijn de praktische methoden om dit te doen in het typische laboratorium voor niet-gekalibreerde sondes zeer gevarieerd en kunnen ze enigszins complex zijn. Als zodanig wordt hier slechts een kort overzicht gegeven van de twee meest voorkomende on-site veerconstante kalibratiemethoden, met een lijst van aanvullende methoden en geschikte literatuurcitaten om te raadplegen voor meer informatie.

Thermische tune methode
Waarschijnlijk de meest voorkomende methode die beschikbaar is in de commerciële AFM's van vandaag, de thermische afstemmingsmethode voor het bepalen van vrijdragende veerconstanten is ingebouwd in de besturingssoftware voor veel systemen. Hoewel niet ideaal voor stijvere cantilevers (k > 10 N/m) vanwege verminderde detectie van cantileverafbuiging en beperkte elektronicabandbreedte, is de thermische tunemethode relatief eenvoudig te implementeren en geldig voor een breed scala aan tipgeometrieën⁷¹. De thermische afstemmingsmethode maakt gebruik van het meten en aanpassen van het thermische ruisspectrum van de cantilever, gevolgd door de toepassing van de equipartitioneringsstelling om de potentiële energie van de cantilever te berekenen, waarbij de cantilever over het algemeen wordt gemodelleerd als een eenvoudige harmonische oscillator⁷². De thermische tune-methode heeft een fout van ~5%-10% voor zachte sondes en is toepasbaar voor elke cantilevervorm^73,74. Voor meer gedetailleerde informatie, zie de referenties die in deze sectie worden aangehaald.

Sader methode
De Sader-methode is een andere methode die vaak is geïntegreerd in de besturingssoftware van veel moderne AFM's^75,76,77. De Sader-methode maakt gebruik van de hydrodynamische belasting die een cantilever ervaart terwijl deze trilt in een vloeibaar medium (meestal lucht of water), samen met de planweergaveafmetingen en kwaliteitsfactor van de cantilever om de cantileverveerconstante te berekenen. De Sader-methode leidt tot een fout van ~10%-15% voor de sledeveerconstante⁷⁴. Overeenkomstige artikelen over de "oorspronkelijke methode"76,78, "algemene methode"^79, een uitbreiding van de algemene methode ⁷⁷ en instrumentspecifieke documentatie kunnen nadere bijzonderheden verschaffen.

Andere methoden
Er zijn verschillende andere methoden die zijn ontwikkeld en geïmplementeerd om de veerconstante van AFM-uitkragingen te bepalen die buiten het bestek van dit artikel vallen. Hoewel geen van deze methoden zo eenvoudig te implementeren of zo wijdverspreid is als de Sader- of thermische tune-kalibratiemethoden, hebben ze elk unieke voor- en nadelen; De geciteerde literatuur geeft details over de toepassing en implementatie ervan. In het bijzonder biedt Sikora een uitstekend overzicht van vele veerconstante kalibratiemethoden en is het een uitstekende bron over het onderwerp⁷². Een niet-uitputtende lijst van andere methoden om veerconstanten te bepalen omvat laser Doppler vibrometrie (LDV)73,74,80, micro-elektrisch-mechanische systemen (MEMS) gebaseerde apparaten⁸¹, referentie cantilever 82,83, toegevoegde massa (zowel dynamisch ⁷⁵ als statisch ⁸⁴), precisiebalans^85,86, elektromagnetische actuatie ⁸⁷ en eindige elementen analyse (FEA) ^88,89.

Tipradius
Veelgebruikte methoden voor het bepalen van de tipradius omvatten zowel secundaire elektronenSEM-beeldvorming als de blinde-puntreconstructiemethode (BTR).

SEM-analyse
Secundaire elektronenSEM-beeldvorming kan een resolutie tot 1 nm bieden, waardoor progressieve beelden van slijtage direct en gemakkelijk kunnen worden vergeleken. Een nadeel van SEM-beeldvorming is dat, omdat er alleen zeer experimentele gecombineerde AFM-SEM-tools bestaan⁹⁰, de AFM-sonde meestal moet worden gedemonteerd en naar de SEM moet worden getransporteerd voor analyse, wat zowel tijdrovend kan zijn als de sonde mogelijk aan contaminatie kan blootstellen. Een ander nadeel van SEM is dat het resulterende beeld inherent een 2D-projectie van de tip is, zonder kwantitatieve 3D-informatie beschikbaar. Er moet voor worden gezorgd dat de sonde elke keer in exact dezelfde richting wordt uitgelijnd om vergelijkende resultaten zinvol te maken, omdat zelfs kleine veranderingen in de invallende hoek van de elektronenbundel de schijnbare grootte en vorm van de sondepunt kunnen veranderen. Ten slotte kan SEM-beeldvorming worden geplaagd door oplaadeffecten en koolstofverontreiniging, die het beeld kunnen vervagen of fysieke veranderingen aan de sondepunt kunnen veroorzaken.

Blinde tip reconstructie
In tegenstelling tot SEM is de BTR-methode een in situ-techniek waarbij de 3D-tipgeometrie wordt gemodelleerd op basis van beeldvorming van een monster met tal van scherpe (hoge beeldverhouding) kenmerken die veel kleiner zijn dan de straal van de sonde. Deze methode werkt omdat in AFM het waargenomen beeld altijd een convolutie is van de vorm van de sondepunt en de vorm van de monsterfunctie, dus door extreem scherpe kenmerken als oneindig scherp te modelleren, kan de tipvorm worden geschat. Helaas kan de BTR-techniek, naast de aanname van oneindig scherpe pieken (d.w.z. oppervlaktekenmerken die veel kleiner zijn dan de tipradius), worden beïnvloed door beeldruis en scanparameters, dus vergelijkende beelden moeten worden verkregen met behulp van zeer vergelijkbare beeldparameters. Bovendien, omdat meerdere "afbeeldingen" van de tip worden gebruikt om de geometrie te reconstrueren, is een directe één-op-één omgekeerde berekening van de tipvorm onmogelijk. Vanwege zijn aard is de BTR-methode alleen praktisch in staat om de gebruiker te informeren over de bovengrens van de tipvorm⁶³, en de handeling van het in beeld brengen van de sonde om de BTR-methode te implementeren kan leiden tot tipslijtage (bijvoorbeeld afstomping of chippen van de sondepunt).

Relatieve kalibratie
Soms kan een bepaalde sonde-eigenschap niet gemakkelijk en nauwkeurig worden gemeten. De veerconstante van stijvere uitkragingen is bijvoorbeeld moeilijk of onmogelijk te meten met de thermische afstemmingsmethode vanwege bandbreedte- en doorbuigingsbeperkingen⁹¹. Zoals hierboven besproken, bestaan er andere methoden voor het bepalen van de veerconstante, maar omdat de thermische afstemmingsmethode in veel moderne AFM's is geïntegreerd, wordt deze vaak geïmplementeerd voor eenvoudig dagelijks gebruik. Evenzo moet de doorbuigingsgevoeligheid altijd voorafgaand aan het experiment worden gekalibreerd voor de omzetting van laserbeweging op de PSD in de fysieke afbuiging van de sondecantilever. Praktisch gezien is het meten van de tipradius echter de meest tijdrovende kalibratiestap en degene die de probepunt het meest waarschijnlijk beschadigt. Als het niet mogelijk is om de tipradius rechtstreeks te meten via SEM of BTR, kan een relatieve kalibratieprocedure worden gebruikt als alternatief voor het bepalen van de effectieve tipradius, op voorwaarde dat een standaardreferentiemonster met minimale oppervlakteruwheid (idealiter atomair vlak) en een bekende modulus die dicht bij de verwachte experimentele modulus ligt, beschikbaar is. Voorbeelden van dergelijke ideale referentiestandaarden voor relatieve kalibratie zijn muskovietmica 17,92,93,94,95 en HOPG ^96, maar dienen ook om te benadrukken hoe moeilijk het is om geschikte referentiestandaarden te identificeren voor zachtere monsters met moduli in het kPa tot MPa-bereik. Om een relatieve kalibratie uit te voeren, moet eerst de doorbuigingsgevoeligheid worden gekalibreerd zoals beschreven in het hoofdprotocol. Ten tweede moet de nominale veerconstante voor de sonde worden ingevoerd (meestal bij de sonde worden geleverd) of worden gemeten via een van de hierboven beschreven methoden. De derde stap is inkeping op het modulusreferentiestandaardmonsteroppervlak met behulp van geschikte parameters. Ten slotte moeten de verzamelde F-D-curvegegevens worden geanalyseerd en de tipradiusparameter worden aangepast totdat de experimenteel gemeten gereduceerde modulus overeenkomt met de verwachte gereduceerde modulus. Er moet rekening worden gehouden met de gemiddelde vervormingsdiepte die op het referentiemonster is bereikt, aangezien deze diepte moet worden gehandhaafd bij het inspringen op het experimentele monster dat van belang is om de kalibratie relevant te maken. Nu kan inkeping op het monster van belang optreden, waarbij de hellingparameters worden aangepast aan de vervormingsdiepte die wordt bereikt op het modulusstandaardreferentiemateriaal.

Een voordeel van de relatieve kalibratiemethode is dat het mogelijke geaccumuleerde fouten voorkomt die worden veroorzaakt door onnauwkeurige kalibratie van de doorbuigingsgevoeligheid, veerconstante en tipradius⁵². Bovendien is het misschien iets sneller en minder waarschijnlijk om de sonde te beschadigen dan de BTR-methode. De grootste nadelen van de relatieve kalibratiemethode zijn: 1) de behoefte aan een referentiemonster van hoge kwaliteit met een oppervlakteruwheid op nm- tot Angstrom-schaal en bekende mechanische eigenschappen die vergelijkbaar zijn met die van het monster van belang dat kan worden geanalyseerd met dezelfde sonde als het experimentele monster, en 2) de vereiste om dezelfde of zeer vergelijkbare vervormingsdiepte te bereiken op zowel de referentie- als de experimentele monsters om de kalibratie geldig te laten zijn. Daarom verdient het de voorkeur om de tipradius direct te meten als dat mogelijk is.

Data-analyse
De analysemethode die wordt gebruikt om de mechanische eigenschappen van het monster te bepalen uit de gemeten F-D-curven is net zo belangrijk als de kwaliteit van de nano-indentatiegegevens zelf. Er zijn verschillende gemeenschappelijke contactmechanische theorieën die kracht-verplaatsingsrelaties modelleren op basis van verschillende onderliggende aannames (en dus toepasbaar in verschillende scenario's). Deze contactmechanicamodellen omvatten Hertz⁹⁷, Sneddon 28, JKR (Johnson, Kendall en Roberts)⁹⁸, DMT (Derjaguin, Muller en Toporov)^35,99, MD (Maugis-Dugdale)100 en MYD (Muller, Yushchenko en Derjaguin)^101,102. Een diepgaande analyse en vergelijking van verschillende contactmechanicamodellen en hun toepassing voor analyse is elders gepresenteerd 29,30,103,104. Hoewel het buiten het bestek van dit artikel valt, geeft tabel 4 een kort overzicht van enkele van de meest voorkomende contactmechanicamodellen. Van bijzonder belang is dat complexere modellen zoals JKR, DMT en andere de effecten van tip-sample adhesie 30,35,98,99,100,101,102,103,104 bevatten^, die significant kan zijn en vaak gemakkelijk te herkennen is aan het verschijnen van negatieve afbuiging in de krachtcurve (zie figuur 3). In de praktijk wordt het gekozen analysemodel gebruikt om de verzamelde F-D-gegevens te passen en de mechanische eigenschappen, zoals de elastische modulus, te bepalen. Om de gegevens goed te passen, is een vlakke basislijn nodig om het initiële contactpunt te bepalen of een effectief contactpunt dat past bij het deel van de experimentele gegevens met de grootste correlatie met het model.

Theorie	Toepasselijkheid	Aannamen	Beperkingen
Hertz	Eenvoudig; vaak gebruikt voor monsters in vloeistof.	Geen hechting.	Ongeldig voor systemen waar houdkrachten aanwezig zijn.
Derjaguin-Müller-Toporov (DMT)	Stijg met kleine vervormingen.	Hechting op korte afstand in contactgebied plus hechting op lange afstand buiten contactgebied.	Beperkte geometrie kan een onderschatting van het contactoppervlak veroorzaken.
Johnson-Kendall-Roberts (JKR)	Zacht met grote vervormingen.	Korteafstands kleefkrachten alleen in het contactgebied.	Kan de belasting onderschatten door hechting.
Maugis - Dugdale (MD)	Deze algemene oplossing dekt de andere zelfklevende modellen.	Tip-sample interface gemodelleerd als een crack.	Analytische oplossing met parametrische vergelijkingen.

Tabel 4: Gemeenschappelijke contactmechanicamodellen. Geselecteerde gemeenschappelijke contactmechanicamodellen met toepasbaarheid, aannames en beperkingen genoteerd.

De praktische toepassing van de hierboven genoemde modellen voor het analyseren van F-D-curven vereist het gebruik van computersoftware om de grootschalige batchverwerking van duizenden of miljoenen curven in korte tijd mogelijk te maken en statistische analyses op de resultaten uit te voeren. In-house geschreven code wordt vaak gebruikt bij de analyse van F-D-gegevens en verschillende AFM-fabrikanten leveren ook softwarepakketten. Vanwege het open-source karakter, het gebruiksgemak en de gedetailleerde aanvullende informatie, raden de auteurs echter het gebruik van AtomicJ²³ aan. Het programma maakt een eenvoudige en nauwkeurige analyse van F-D-gegevens mogelijk met behulp van een van de hierboven beschreven theorieën en verschillende andere. Omdat de code open source is, is het gemakkelijk te manipuleren en aan te passen voor specifieke use-cases zonder de noodzaak om complexe code helemaal opnieuw te bouwen. Raadpleeg Hermanowicz et ^al.23 voor uitgebreide informatie over het AtomicJ-softwarepakket.

Kortom, door zorgvuldige kalibratie van de sonde kunnen het contactoppervlak en de kracht die door een AFM-sondepunt op een monsteroppervlak wordt uitgeoefend, worden gekwantificeerd om de mechanische eigenschappen op nanoschaal te kunnen bepalen, met name de elastische modulus. Een algemeen protocol met best practices voor het succesvol implementeren van AFM cantilever-gebaseerde nano-indentatie in lucht of vloeistof op zowel zachte als harde monsters, met elastische moduli variërend van kPa tot GPa, is gepresenteerd met representatieve voorbeelden. Belangrijke overwegingen zoals sondeselectie (inclusief monsteroppervlakruwheid, functiegroottes, beeldverhouding van de sonde en tipslijtage), sondekalibratie en gegevensanalyse (inclusief contactmechanicamodellen en meetstatistieken) zijn besproken. Ten slotte is co-lokalisatie van AFM-afgeleide nanomechanische kaarten met andere karakteriseringstechnieken die compositie-informatie verschaffen, zoals SEM / EDS, aangetoond, evenals een voorbeeld van meting van een nanomechanische eigenschap anders dan elastische modulus (d.w.z. lipide dubbellaagse breukkracht) via AFM cantilever-gebaseerde nano-indentatie om voorbeelden te geven van aanvullende synergetische toepassingen van de techniek. Alles bij elkaar genomen zouden de hier gegeven voorbeelden en discussies een startpunt moeten bieden voor onderzoekers die op AFM cantilever-gebaseerde nano-indentatie willen gebruiken om de mechanische eigenschappen van vrijwel elk monstertype te meten.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Atomic force microscope	Bruker	Dimension Icon	Uses Nanoscope control software, including PeakForce Quantitative Nanomechanical Mapping (PF-QNM), FastForce Volume (FFV), and Point-and-Shoot Ramping experimental workspaces
AtomicJ	American Institute of Physics	https://doi.org/10.1063/1.4881683	Flexible, powerful, free open source Java-based force curve analysis software package. Supports numerous contact mechanic models, such as Hertz, Sneddon DMT, JKR, Maugis, and cone or pyramid (including blunt and truncated). Also includes a variety of initial contact point estimation methods to choose from. Supports batch processing of data and subsequent statistical analysis (e.g., averages, standard deviations, histograms, goodness of fit, etc.). Literature citation is: P. Hermanowicz, M. Sarna, K. Burda, and H. Gabry, “AtomicJ: An open source software for analysis of force curves” Rev. Sci. Instrum. 85: 063703 (2014), https://doi.org/10.1063/1.4881683
Buffer solution (PBS)	Fisher Chemical (NaCl), Sigma Aldrich (KCl), Fisher BioReagents (Na2HPO4 and KH2PO4)	S271 (>99% purity NaCl), P9541 (>99% purity KCl), BP332(>99% purity Na2HPO4), BP362 (>99% purity KH2PO4)	Phosphate buffered saline (PBS) was prepared in the laboratory as an aqueous solution consisting of 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, and 1.8 mM KH2PO4 dissolved in ultrapure water. Reagents were measured out using an analytical balance, and glassware was cleaned with soap and water followed by autoclaving immediately prior to use.
Chloroform
Diamond tip AFM probe	Bruker	PDNISP	Pre-mounted factory-calibrated cube corner diamond (E = 1140 GPa) tip AFM probe (nominal R = 40 nm) with a stainless steel cantilever (nominal k = 225 N/m, f0 = 50 kHz). Spring constant is measured at the factory (k = 256 N/m for the probe, Serial #13435414, used here) and calibration data (including AFM images of indents showing probe geometry) is provided with the probe.
Diamond ultramicrotome blade	Diatome	Ultra 35°	2.1 mm width. Also used a standard glass blade for intial rough cut of sample surface before transitioning to diamond blade for final surface preparation
Epoxy	Gorilla Glue	26853-31-6	Epoxy resin and hardner were mixed in a 1:1 ratio, a small drop was placed on a stainless steel sample puck (Ted Pella), and V1 grade muscovite mica (Ted Pella) was attached to create an atomically flat surface for preparation of phospholipid membranes.
Ethanol
LR white resin, medium grade (catalyzed)	Electron Microscopy Sciences	14381	500 mL bottle, Lot #150629
Mesenchymal stem cells (MSCs)	N/A	N/A	MSCs for nanomechanical studies were primary cells harvested from 8-10 week old male C57BL/6 mice as described in Goelzer, M. et al. "Lamin A/C Is Dispensable to Mechanical Repression of Adipogenesis" Int J Mol Sci 22: 6580 (2021) doi:10.3390/ijms22126580 and Peister, A. et al. "Adult stem cells from bone marrow (MSCs) isolated from different strains of inbred mice vary in surface epitopes, rates of proliferation, and differentiation potential" Blood 103: 1662-1668 (2004), doi:10.1182/blood-2003-09-3070.
Modulus standards	Bruker	PFQNM-SMPKIT-12M	Used HOPG (E = 18 GPa) and PS (E = 2.7 GPa). Also contains 2x PDMS (Tack 0, E = 2.5 MPa; Tack 4, E = 3.5 MPa), PS-LDPE (E = 2.0/0.2 GPa), fused silica (E = 72.9 GPa), sapphire (E - 345 GPa), and tip characterization (titanium roughness) sample. All samples come pre-mounted on a 12 mm diameter steel disc (sample puck).
Muscovite mica	Ted Pella	50-12	12 mm diameter, V1 grade muscovite mica
Nanscope Analysis	Bruker	Version 2.0	Free AFM image processing and analysis software package, but designed for, and proprietary/limited to Bruker AFMs; similar functionality is available from free, platform-independent AFM image processing and analysis software packages such as Gwyddion, WSxM, and others. Has built-in capabilities for force curve analysis, but AtomicJ is more flexible/full featured (e.g., more built-in contact mechanics models to choose from, statistical analysis of force curve fitting results, etc.) for force curve analysis and handles batch processing of force curves.
Phospholipids: POPC, Cholesterol (ovine)	Avanti Polar Lipids	POPC: CAS # 26853-31-6, Cholesterol: CAS # 57-88-5	POPC lipid dissolved in chloroform (25 mg/mL) was obtained from vendor and used without further purification. Cholesterol powder from the same vendor was dissolved in chloroform (20 mg/mL).
Probe holder (fluid, lipid bilayers)	Bruker	MTFML-V2	Specific to the particular AFM used; MTFML-V2 is a glass probe holder for scanning in fluid on a MultiMode AFM.
Probe holder (fluid, MSCs)	Bruker	FastScan Bio Z-scanner	Used with Dimension FastScan head (XY flexure scanners). Serial number MXYPOM5-1B154.
Probe holder (standard, ambient)	Bruker	DAFMCH	Specific to the particular AFM used; DAFMCH is the standard contact and tapping mode probe holder for the Dimension Icon AFM, suitable for nanoindentation (PF-QNM, FFV, and point-and-shoot ramping)
Sample Puck	Ted Pella	16218	Product number is for 15 mm diameter stainless steel sample puck. Also available in 6 mm, 10 mm, 12 mm, and 20 mm diameters at https://www.tedpella.com/AFM_html/AFM.aspx#anchor842459
Sapphire substrate	Bruker	PFQNM-SMPKIT-12M	Extremely hard surface (E = 345 GPa) for measuring deflection sensitivity of probes (want all of the deflection to come from the probe, not the substrate). Part of the PF-QNM/modulus standards kit.
Scanning electron microscope	Hitachi	S-3400N-II	Located at Boise State. Used to perform co-localized SEM/EDS on all samples except additively manufactured (AM) Ti-6Al-4V.
Silicon AFM probes (standard)	NuNano	Scout 350	Standard tapping mode silicon probe with reflective aluminum backside coating; k = 42 N/m (nominal), f0 = 350 kHz. Nominal R = 5 nm. Also available uncoated or with reflective gold backside coating. Probes with similar specifications are available from other manufacturers (e.g., Bruker TESPA-V2).
Silicon AFM probes (stiff)	Bruker	RTESPA-525, RTESPA-525-30	Rotated tip etched silicon probes with reflective aluminum backside coating; k = 200 N/m (nominal), f0 = 525 kHz. Nominal R = 8 nm for RTESPA-525, R = 30 nm for RTESPA-525-30. Spring constant of each RTESPA-525-30 is measured individually at the factory via laser Doppler vibrometry and supplied with the probe.
Silicon carbide grit paper (abrasive discs)	Allied	50-10005	120 grit
Silicon nitride AFM probes (soft, large radius hemispherical tip)	Bruker	MLCT-SPH-5UM, MLCT-SPH-5UM-DC	Also MLCT-SPH-1UM-DC. New product line of factory-calibrated (probe radius and spring constants of all cantilevers) large radius (R = 1 or 5 mm) hemispherical tip (at the end of a 23 mm long cylindrical shaft) probes. DC = drift compensation coating. 6 cantilevers/probe (A-F). Nominal spring constants: A, k = 0.07 N/m; B, k = 0.02 N/m; C, k = 0.01 N/m; D, k = 0.03 N/m; E, k = 0.1 N/m; F, k = 0.6 N/m.
Silicon nitride AFM probes (soft, medium sharp tip)	Bruker	DNP	4 cantilevers/probe (A-d). Nominal spring constants: A, k = 0.35 N/m; B, k = 0.12 N/m; C, k = 0.24 N/m; D, k = 0.06 N/m. Nominal radii of curvature, R = 10 nm.
Silicon nitride AFM probes (soft, sharp tip)	Bruker	ScanAsyst-Air	Nominal values: resonance frequency, f0 = 70 kHz; spring constant, k = 0.4 N/m; radius of curvature, R = 2 nm. Designed for force curve based AFM imaging.
Superglue	Henkel	Loctite 495	Cyanoacrylate based instant adhesive. Lots of roughly equivalent products are readily available.
Syringe pump	New Era Pump Systems	NE1000US	One channel syringe pump system with infusion and withdrawal capacity
Tip characterization standard	Bruker	PFQNM-SMPKIT-12M	Titanium (Ti) roughness standard. Part of the PF-QNM/modulus standards kit.
Ultrahigh purity nitrogen (UHP N2), 99.999%	Norco	SPG TUHPNI - T	T size compressed gas cylinder of ultrahigh purity (99.999%) nitrogen for drying samples
Ultramicrotome	Leica	EM UC6	Equipped with a glass blade (standard, for intial sample preparation) and a diamond blade (for final preparation)
Ultrapure water	Thermo Fisher	Barnstead Nanopure Model 7146	Model has been discontinued, but equivalent products are available. Produces ≥18.2 MΩ*cm ultrapure water with 1-5 ppb TOC (total organic content), per inline UV monitoring. Includes 0.2 µm particulate filter, ion exchange columns, and UV oxidation chamber.
Variable Speed Grinder	Buehler	EcoMet 3000	Used with silicon carbide grit papers during hand polishing.
Vibration isolation table (active)	Herzan	TS-140	Used with Bruker MultiMode AFM. Sits on a TMC 65-531 vibration isolation table. Bruker Dimension Icon AFM utilizes strictly passive vibration isolation (comes from manufacturer with custom acoustic hood, air table, and granite slab).
Vibration isolation table (passive)	TMC	65-531	35" x 30" vibration isolation table with optional air damping (disabled). Used with Bruker MultiMode AFM. Herzan TS-140 "Table Stable" active vibration control table is located on top.