Microscopie à force atomique Nanoindentation basée sur le porte-à-faux: mesures des propriétés mécaniques à l’échelle nanométrique dans l’air et les fluides

Summary

La quantification de la zone de contact et de la force appliquée par la pointe d’une sonde de microscope à force atomique (AFM) à une surface d’échantillon permet de déterminer les propriétés mécaniques à l’échelle nanométrique. Les meilleures pratiques pour mettre en œuvre la nanoindentation à base de porte-à-faux AFM dans l’air ou le fluide sur des échantillons mous et durs pour mesurer le module d’élasticité ou d’autres propriétés nanomécaniques sont discutées.

Abstract

Un microscope à force atomique (AFM) mesure fondamentalement l’interaction entre la pointe d’une sonde AFM à l’échelle nanométrique et la surface de l’échantillon. Si la force appliquée par la pointe de la sonde et sa zone de contact avec l’échantillon peuvent être quantifiées, il est possible de déterminer les propriétés mécaniques à l’échelle nanométrique (par exemple, élastique ou module de Young) de la surface sondée. Une procédure détaillée pour effectuer des expériences quantitatives de nanoindentation AFM basées sur le porte-à-faux est fournie ici, avec des exemples représentatifs de la façon dont la technique peut être appliquée pour déterminer les modules élastiques d’une grande variété de types d’échantillons, allant de kPa à GPa. Il s’agit notamment de cellules souches mésenchymateuses vivantes (CSM) et de noyaux dans un tampon physiologique, de sections transversales de pin loblolly déshydraté incorporées dans la résine et de schistes de Bakken de composition variable.

De plus, la nanoindentation en porte-à-faux AFM est utilisée pour sonder la résistance à la rupture (c’est-à-dire la force de percée) des bicouches phospholipidiques. D’importantes considérations pratiques telles que le choix et le développement de la méthode, la sélection et l’étalonnage de la sonde, l’identification de la région d’intérêt, l’hétérogénéité de l’échantillon, la taille et le rapport d’aspect des caractéristiques, l’usure de la pointe, la rugosité de surface et l’analyse des données et les statistiques de mesure sont discutées pour faciliter la mise en œuvre correcte de la technique. Enfin, la colocalisation de cartes nanomécaniques dérivées de l’AFM avec des techniques de microscopie électronique qui fournissent des informations supplémentaires sur la composition élémentaire est démontrée.

Introduction

Comprendre les propriétés mécaniques des matériaux est l’une des tâches les plus fondamentales et essentielles de l’ingénierie. Pour l’analyse des propriétés des matériaux en vrac, il existe de nombreuses méthodes pour caractériser les propriétés mécaniques des systèmes de matériaux, y compris les essais de traction¹, les essais de compression² et les essais de flexion à trois ou quatre points (flexion)³. Bien que ces tests à l’échelle microscopique puissent fournir des informations précieuses sur les propriétés des matériaux en vrac, ils sont généralement effectués jusqu’à la défaillance et sont donc destructeurs. De plus, ils n’ont pas la résolution spatiale nécessaire pour étudier avec précision les propriétés à l’échelle micro et nanométrique de nombreux systèmes de matériaux qui présentent un intérêt aujourd’hui, tels que les couches minces, les matériaux biologiques et les nanocomposites. Pour commencer à résoudre certains des problèmes liés aux essais mécaniques à grande échelle, principalement sa nature destructive, les essais de microdureté ont été adoptés à partir de la minéralogie. La dureté est une mesure de la résistance d’un matériau à la déformation plastique dans des conditions spécifiques. En général, les tests de microdureté utilisent une sonde rigide, généralement en acier trempé ou en diamant, pour s’indenter dans un matériau. La profondeur et/ou la surface d’indentation résultante peuvent ensuite être utilisées pour déterminer la dureté. Plusieurs méthodes ont été développées, y compris la dureté Vickers⁴, Knoop⁵ et Brinell⁶ ; Chacun fournit une mesure de la dureté du matériau à l’échelle microscopique, mais dans des conditions et des définitions différentes, et ne produit donc que des données qui peuvent être comparées à des essais effectués dans les mêmes conditions.

La nanoindentation instrumentée a été développée pour améliorer les valeurs relatives obtenues via les différentes méthodes d’essai de microdureté, améliorer la résolution spatiale possible pour l’analyse des propriétés mécaniques et permettre l’analyse des couches minces. Il est important de noter qu’en utilisant la méthode développée pour la première fois par Oliver et Pharr⁷, l’élastique ou le module de Young, E, d’un matériau échantillon peut être déterminé par nanoindentation instrumentée. En outre, en utilisant une sonde de nanopénétrateur pyramidal à trois côtés Berkovich (dont la fonction d’aire de pointe idéale correspond à celle de la sonde pyramidale à quatre côtés Vickers)⁸, il est possible d’effectuer une comparaison directe entre les mesures de dureté à l’échelle nanométrique et à l’échelle microscopique plus traditionnelles. Avec la popularité croissante de l’AFM, la nanoindentation à base de porte-à-faux AFM a également commencé à attirer l’attention, en particulier pour mesurer les propriétés mécaniques des matériaux plus mous. En conséquence, comme illustré schématiquement à la figure 1, les deux techniques les plus couramment utilisées aujourd’hui pour interroger et quantifier les propriétés mécaniques à l’échelle nanométrique sont la nanoindentation instrumentée (Figure 1A) et la nanoindentation en porte-à-faux AFM (Figure 1B)⁹, cette dernière étant au centre de ce travail.

Figure 1 : Comparaison des systèmes instrumentés et des systèmes de nanoindentation en porte-à-faux AFM. Diagrammes schématiques illustrant des systèmes typiques pour la conduite (A) de nanoindentation instrumentée et (B) de nanoindentation en porte-à-faux AFM. Ce chiffre a été modifié à partir de Qian et ^al.51. Abréviation : AFM = microscopie à force atomique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

La nanoindentation instrumentée et la nanoindentation en porte-à-faux AFM utilisent une sonde rigide pour déformer une surface d’échantillon d’intérêt et surveiller la force et le déplacement résultants en fonction du temps. En règle générale, le profil de déplacement de la charge souhaitée (c’est-à-dire la force) ou le profil de déplacement (Z-piézo) est spécifié par l’utilisateur via l’interface du logiciel et directement contrôlé par l’instrument, tandis que l’autre paramètre est mesuré. La propriété mécanique la plus souvent obtenue à partir d’expériences de nanoindentation est le module élastique (E), également appelé module de Young, qui a des unités de pression. Le module d’élasticité d’un matériau est une propriété fondamentale relative à la rigidité de liaison et est défini comme le rapport de la contrainte de traction ou de compression (σ, la force appliquée par unité de surface) à la déformation axiale (ε, la déformation proportionnelle le long de l’axe d’indentation) pendant la déformation élastique (c’est-à-dire réversible ou temporaire) avant le début de la déformation plastique (équation [1]):

(1)

Il convient de noter que, parce que de nombreux matériaux (en particulier les tissus biologiques) sont en fait viscoélastiques, en réalité, le module (dynamique ou complexe) est constitué à la fois de composants élastiques (stockage, en phase) et visqueux (perte, déphasés). Dans la pratique, ce qui est mesuré dans une expérience de nanoindentation est le module réduit, E *, qui est lié au véritable module d’intérêt de l’échantillon, E, comme le montre l’équation (2):

(2)

Où E pointe et ν _pointe sont respectivement le module d’élasticité et le rapport de Poisson de la pointe nanopénétreur, et ν est le rapport de Poisson estimé de l’échantillon. Le rapport de Poisson est le rapport négatif de la déformation transversale à la déformation axiale, et indique donc le degré d’allongement transversal d’un échantillon lorsqu’il est soumis à une déformation axiale (par exemple, pendant la charge de nanoindentation), comme le montre l’équation (3):

(3)

La conversion du module réduit au module réel est nécessaire parce que a) une partie de la déformation axiale conférée par la pointe du pénétrateur peut être convertie en déformation transversale (c’est-à-dire que l’échantillon peut se déformer par expansion ou contraction perpendiculairement à la direction de chargement), et b) la pointe du pénétrateur n’est pas infiniment dure, et donc l’acte d’indenter l’échantillon entraîne une certaine (petite) déformation de la pointe. Notez que dans le cas où la _pointe E >> E (c’est-à-dire que la pointe du pénétrateur est beaucoup plus dure que l’échantillon, ce qui est souvent vrai lors de l’utilisation d’une sonde en diamant), la relation entre le module d’échantillon réduit et réel se simplifie grandement à E ≈ E*(1 - v²). Alors que la nanoindentation instrumentée est supérieure en termes de caractérisation précise de la force et de plage dynamique, la nanoindentation en porte-à-faux AFM est plus rapide, fournit des ordres de grandeur plus de force et de sensibilité au déplacement, permet une imagerie à plus haute résolution et une localisation améliorée de l’indentation, et peut sonder simultanément les propriétés magnétiques et électriques à l’échelle nanométrique⁹. En particulier, la nanoindentation à base de porte-à-faux AFM est supérieure pour la quantification des propriétés mécaniques à l’échelle nanométrique des matériaux mous (par exemple, polymères, gels, bicouches lipidiques et cellules ou autres matériaux biologiques), des films extrêmement minces (sub-μm) (où les effets du substrat peuvent entrer en jeu en fonction de la profondeur d’indentation)^10,11 et des matériaux bidimensionnels (2D) en suspension^12,13,14 tels que le graphène ^15,16, mica¹⁷, nitrure de bore hexagonal (h-BN)18 ou dichalcogénures de métaux de transition (TMDC; p. ex. MoS₂)¹⁹. Cela est dû à sa force exquise (sub-nN) et à sa sensibilité au déplacement (sub-nm), ce qui est important pour déterminer avec précision le point de contact initial et rester dans la région de déformation élastique.

Dans la nanoindentation en porte-à-faux AFM, le déplacement d’une sonde AFM vers la surface de l’échantillon est actionné par un élément piézoélectrique étalonné (Figure 1B), le porte-à-faux flexible finissant par se plier en raison de la force résistive ressentie au contact de la surface de l’échantillon. Cette flexion ou déviation du porte-à-faux est généralement surveillée en réfléchissant un laser à l’arrière du porte-à-faux et dans un photodétecteur (détecteur sensible à la position [PSD]). Couplé à la connaissance de la rigidité en porte-à-faux (en nN/nm) et de la sensibilité à la déflexion (en nm/V), il est possible de convertir cette déformation en porte-à-faux mesurée (en V) en force (en nN) appliquée à l’échantillon. Après contact, la différence entre le mouvement Z-piézo et la déviation en porte-à-faux donne la profondeur d’indentation de l’échantillon. Combiné à la connaissance de la fonction de zone de pointe, cela permet de calculer la surface de contact de l’échantillon de pointe. La pente des parties en contact des courbes force-distance ou force-déplacement (F-D) résultantes peut ensuite être ajustée à l’aide d’un modèle de mécanique de contact approprié (voir la section Analyse des données de la discussion) pour déterminer les propriétés nanomécaniques de l’échantillon. Bien que la nanoindentation en porte-à-faux AFM présente certains avantages distincts par rapport à la nanoindentation instrumentée décrite ci-dessus, elle présente également plusieurs défis pratiques de mise en œuvre, tels que l’étalonnage, l’usure des pointes et l’analyse des données, qui seront discutés ici. Un autre inconvénient potentiel de la nanoindentation en porte-à-faux AFM est l’hypothèse d’élasticité linéaire, car le rayon de contact et les profondeurs d’indentation doivent être beaucoup plus petits que le rayon de pénétration, ce qui peut être difficile à réaliser lorsque vous travaillez avec des sondes AFM à l’échelle nanométrique et / ou des échantillons présentant une rugosité de surface importante.

Traditionnellement, la nanoindentation a été limitée à des emplacements individuels ou à de petites expériences d’indentation de grille, dans lesquelles un emplacement souhaité (c’est-à-dire une région d’intérêt [ROI]) est sélectionné et un seul retrait contrôlé, plusieurs retraits dans un seul endroit séparés par un certain temps d’attente et / ou une grille grossière de retraits sont effectués à une vitesse de l’ordre de Hz. Cependant, les progrès récents de l’AFM permettent l’acquisition simultanée des propriétés mécaniques et de la topographie grâce à l’utilisation de modes d’imagerie basés sur des courbes de force à grande vitesse (désignés par divers noms commerciaux selon le fabricant du système), dans lesquels les courbes de force sont conduites à une vitesse de kHz sous contrôle de charge, la force maximale de l’échantillon de pointe étant utilisée comme point de consigne d’imagerie. Des méthodes point-and-shoot ont également été développées, permettant l’acquisition d’une image topographique AFM suivie d’une nanoindentation sélective ultérieure aux points d’intérêt de l’image, permettant un contrôle spatial à l’échelle nanométrique sur l’emplacement de la nanoindentation. Bien que ce ne soit pas l’objectif principal de ce travail, des exemples d’application spécifiques sélectionnés de l’imagerie basée sur la courbe de force et de la nanoindentation en porte-à-faux point-and-shoot sont présentés dans les résultats représentatifs et peuvent être utilisés conjointement avec le protocole décrit ci-dessous s’il est disponible sur la plate-forme AFM particulière utilisée. Plus précisément, ce travail décrit un protocole généralisé pour la mise en œuvre pratique de la nanoindentation AFM basée sur le porte-à-faux sur tout système AFM capable et fournit quatre exemples de cas d’utilisation (deux dans l’air, deux dans le fluide) de la technique, y compris des résultats représentatifs et une discussion approfondie des nuances, des défis et des considérations importantes pour utiliser avec succès la technique.

Protocol

REMARQUE: En raison de la grande variété de MFA disponibles dans le commerce et de la diversité des types d’échantillons et des applications qui existent pour la nanoindentation en porte-à-faux, le protocole qui suit est intentionnellement conçu pour être de nature relativement générale, en se concentrant sur les étapes partagées nécessaires pour toutes les expériences de nanoindentation basées sur le porte-à-faux, quel que soit l’instrument ou le fabricant. Pour cette raison, les auteurs supposent que le lecteur possède au moins une familiarité de base avec l’utilisation de l’instrument spécifique choisi pour effectuer une nanoindentation basée sur un porte-à-faux. Cependant, en plus du protocole général décrit ci-dessous, une procédure opérationnelle normalisée (PON) détaillée étape par étape spécifique à l’AFM et au logiciel utilisé ici (voir le tableau des matériaux), axée sur la nanoindentation en porte-à-faux d’échantillons dans un fluide, est incluse en tant que matériel supplémentaire.

1. Préparation des échantillons et configuration des instruments

1. Préparez l’échantillon de manière à minimiser à la fois la rugosité de surface (idéalement à l’échelle nanométrique, ~10x moins que la profondeur d’indentation prévue) et la contamination sans altérer les propriétés mécaniques de la ou des zones d’intérêt.
2. Choisir une sonde AFM appropriée pour la nanoindentation de l’échantillon prévu en fonction du milieu (c.-à-d. air ou fluide), du module attendu, de la topographie de l’échantillon et de la taille des caractéristiques pertinentes (voir les considérations relatives à la sélection de la sonde dans la discussion). Chargez la sonde sur le support de sonde (voir Tableau des matériaux) et fixez le porte-sonde à la tête de balayage AFM.
3. Sélectionnez un mode de nanoindentation approprié dans le logiciel AFM qui permet à l’utilisateur de contrôler les rampes individuelles (c.-à-d. les courbes force-déplacement).
   REMARQUE: Le mode spécifique diffère selon les fabricants AFM et les instruments individuels (voir les SOP fournies dans le matériel supplémentaire pour plus de détails et un exemple spécifique).
4. Alignez le laser à l’arrière du porte-à-faux de la sonde, à l’opposé de l’emplacement de la pointe de la sonde et dans le PSD.
   REMARQUE: Voir l’exemple d’application de cellules souches mésenchymateuses pour plus de détails sur les considérations importantes lors de l’alignement du laser et de la nanoindentation dans le fluide, en particulier, éviter les débris flottants et / ou les bulles d’air, qui peuvent disperser ou réfracter le faisceau. L’optique AFM peut également devoir être ajustée pour compenser l’indice de réfraction du fluide et éviter de faire tomber la sonde lors de l’engagement de la surface.
   1. Centrez le point de faisceau laser à l’arrière du porte-à-faux en maximisant la tension totale (Figure 2A).
   2. Centrer le point de faisceau laser réfléchi sur le PSD en ajustant les signaux de déviation X et Y (c.-à-d. horizontaux et verticaux) pour qu’ils soient aussi proches de zéro que possible (Figure 2A), fournissant ainsi la plage de déflexion détectable maximale pour produire une tension de sortie proportionnelle à la déviation en porte-à-faux.
5. Si vous n’êtes pas certain de la topographie de l’échantillon, de la rugosité de la surface et/ou de la densité de surface (dans le cas des flocons ou des particules), effectuez une analyse topographique AFM avant toute expérience de nanoindentation pour confirmer la pertinence de l’échantillon, comme décrit à l’étape 1.1 et dans la partie de la discussion consacrée à la préparation de l’échantillon.

Figure 2 : Moniteur de détecteur sensible à la position. (A) Affichage PSD indiquant un laser correctement aligné se réfléchissant à l’arrière du porte-à-faux de la sonde et au centre du PSD (comme en témoignent la tension de somme élevée et l’absence de déviation verticale ou horizontale) avant de s’engager sur la surface de l’échantillon (c.-à-d. sonde hors de contact avec l’échantillon). (B) La tension de déviation verticale augmente lorsque le porte-à-faux est dévié (par exemple, lorsque la sonde entre en contact avec l’échantillon). Abréviations : PSD = détecteur sensible à la position; VERT = vertical; HORIZ = horizontal; AMPL = amplitude; s.o. = sans objet. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

2. Calibrage de la sonde

NOTE: Trois valeurs sont nécessaires pour quantifier les propriétés mécaniques d’un échantillon à l’aide des données de courbe F-D recueillies au cours de la nanoindentation en porte-à-faux: la sensibilité à la déviation (DS) du système cantilever/PSD (nm/V ou V/nm), la constante du ressort en porte-à-faux (nN/nm) et la surface de contact de la sonde, souvent exprimée en termes de rayon effectif de pointe de la sonde (nm) à une profondeur d’indentation donnée inférieure au rayon de la sonde dans le cas d’une sonde sphérique. pourboire.

1. Calibrer le DS du système sonde/AFM en rampant sur un matériau extrêmement dur (par exemple, saphir, E = 345 GPa) de sorte que la déformation de l’échantillon soit minimisée et que le mouvement Z mesuré du piézo après le début du contact pointe-échantillon soit converti uniquement en déviation en porte-à-faux.
   REMARQUE: L’étalonnage DS doit être effectué dans les mêmes conditions que les expériences de nanoindentation prévues (c’est-à-dire la température, le milieu, etc.) pour refléter avec précision le DS du système pendant les expériences. Une longue période de réchauffement laser (30 minutes) peut être nécessaire pour une précision maximale permettant d’atteindre l’équilibre thermique et d’établir une puissance de sortie laser stable et une stabilité de pointage. Le DS doit être remesuré chaque fois que le laser est réaligné, même si la même sonde est utilisée, car la DS dépend de l’intensité et de la position du laser sur le porte-à-faux, ainsi que de la qualité de la réflexion de la sonde (c’est-à-dire que la dégradation du revêtement arrière de la sonde affectera la DS) et de la sensibilité du PSD²⁰.
   1. Configurez et effectuez les retraits d’étalonnage DS sur le saphir pour obtenir approximativement la même déviation de la sonde (en V ou nm) que les retraits d’échantillon prévus, car le déplacement mesuré est fonction de l’angle de déviation de la pointe et devient non linéaire pour les grandes flèches.
   2. Déterminer le DS (en nm/V), ou bien la sensibilité inverse du levier optique (en V/nm), à partir de la pente de la partie linéaire du régime en contact après le point de contact initial dans la courbe F-D résultante, comme indiqué à la figure 3A.
   3. Répétez la rampe au moins 5x, en enregistrant chaque valeur DS. Utilisez la moyenne des valeurs pour une précision maximale. Si l’écart type relatif (DSR) des mesures dépasse ~1%, remesurez le DS, car parfois les premières courbes F-D ne sont pas idéales en raison de l’introduction initiale des forces adhésives.
   4. Si la constante de ressort du porte-à-faux, k, n’est pas étalonnée en usine (par exemple, via la vibrométrie Doppler laser [LDV]), étalonnez la constante du ressort.
      NOTE: La méthode de réglage thermique est optimale pour les porte-à-faux relativement mous avec k < 10 N/m (voir la section constante de ressort de la discussion pour une liste et une description des méthodes alternatives, en particulier pour les porte-à-faux rigides avec k > 10 N/m). Comme le montre la figure 3B, C, le réglage thermique est généralement intégré au logiciel de contrôle AFM.
2. Si la sonde n’est pas livrée avec une mesure du rayon de pointe étalonnée en usine (par exemple, via l’imagerie au microscope électronique à balayage [MEB]), mesurez le rayon de pointe effectif, R.
   REMARQUE: Il existe deux méthodes courantes pour mesurer le rayon de la pointe (voir la section de discussion correspondante), mais la plus courante pour les pointes de sonde à l’échelle nanométrique est la méthode de reconstruction de la pointe aveugle (BTR), qui utilise une norme de rugosité (voir le tableau des matériaux) contenant de nombreuses caractéristiques extrêmement nettes (sub-nm) qui servent à imager efficacement la pointe, plutôt que la pointe imageant l’échantillon.
   1. Si vous utilisez la méthode BTR, imagez l’échantillon de rugosité (caractérisation de la pointe) en utilisant une vitesse de balayage lente (<0,5 Hz) et des gains de rétroaction élevés pour aider à optimiser le suivi des caractéristiques très nettes. Choisissez une taille d’image et une densité de pixels (résolution) en fonction du rayon de pointe attendu (par exemple, une image de 1024 x 1024 pixels d’une zone de 3 μm x 3 μm aura une résolution latérale de ~3 nm).
   2. Utilisez le logiciel d’analyse d’images AFM (voir le tableau des matériaux) pour modéliser la pointe de la sonde et estimer son rayon d’extrémité et son diamètre effectif à la profondeur d’indentation prévue de l’échantillon, comme illustré à la figure 3D-F.
3. Une fois l’étalonnage de la sonde terminé, entrez les valeurs DS, k et R dans le logiciel de l’instrument, comme illustré à la figure 4A.
   1. Entrez une estimation du rapport de Poisson de l’échantillon, ν, pour permettre la conversion du module réduit mesuré en module réel de l’échantillon⁹. Si vous utilisez un modèle de mécanique de contact conique ou conisphérique basé sur la forme de la pointe et la profondeur d’indentation, il est également nécessaire d’entrer le demi-angle de la pointe (Figure 4C).
      REMARQUE : Le module est relativement insensible aux petites erreurs ou incertitudes dans le ratio de Poisson estimé. Une estimation de ν = 0,2-0,3 est un bon point de départ pour de nombreux matériaux²¹.

Figure 3 : Calibrage de la sonde. (A) Détermination de la sensibilité à la déflexion. Résultat d’une mesure représentative de la sensibilité à la déflexion effectuée sur un substrat saphir (E = 345 GPa) pour une sonde standard en mode de taraudage (nominal k = 42 N/m ; voir tableau des matériaux) avec un revêtement en aluminium réfléchissant à l’arrière. Les courbes d’approche mesurée (trace bleue) et de retrait (trace rouge) sont représentées. La sensibilité de déviation mesurée de 59,16 nm/V a été déterminée en ajustant la courbe d’approche entre les points d’encliquetage au contact et de retournement, comme l’indique la région située entre les lignes rouges pointillées verticales. La région de déformation négative évidente dans la courbe de retrait/retrait avant le retrait de la surface indique l’adhérence de l’échantillon de pointe. (B,C) Réglage thermique. Spectres de bruit thermique en porte-à-faux représentatifs (traces bleues) avec ajustements correspondants (traces rouges) pour deux sondes différentes. (B) Paramètres de réglage thermique et d’ajustement pour une sonde d’imagerie AFM basée sur une courbe de force standard (voir le tableau des matériaux) avec sa constante nominale de ressort k = 0,4 N/m utilisée comme estimation initiale. L’ajustement du spectre de bruit thermique en porte-à-faux donne une fréquence de résonance fondamentale de f 0 = 79,8 kHz, ce qui est raisonnablement en accord avec la valeur nominale de f₀ = 70 kHz. Le facteur Q mesuré est de 58,1. La qualité de l’ajustement (R² = 0,99) est basée sur l’accord de l’ajustement avec les données entre les deux lignes rouges pointillées verticales. Notez qu’il est important de connaître et d’entrer à la fois la température ambiante et la sensibilité à la déflexion pour des résultats précis. (C) Spectre de bruit thermique en porte-à-faux et ajustement correspondant (c’est-à-dire réglage thermique) avec constante de ressort calculée résultante k = 0,105 N/m pour un porte-à-faux extrêmement mou utilisé pour effectuer des mesures nanomécaniques sur des cellules vivantes et des noyaux isolés. Notez la fréquence de résonance naturelle significativement plus faible de ~2-3 kHz. (D-F) Reconstruction de l’extrémité aveugle. Flux de travail représentatif de reconstruction de l’extrémité aveugle pour une sonde à pointe diamantée (nominal R = 40 nm; voir Tableau des matériaux). (D) Image de 5 μm x 5 μm d’un échantillon de caractérisation de la pointe constitué d’une série de pointes de titane extrêmement nettes (inférieures au nm) qui servent à imager l’extrémité de la sonde AFM. (E) Modèle reconstruit résultant (image de hauteur inversée) de la pointe de la sonde. (F) Résultats de l’ajustement de la reconstruction de l’extrémité aveugle, y compris un rayon d’extrémité estimé de R = 29 nm et un diamètre effectif de l’extrémité de 40 nm à une hauteur choisie par l’utilisateur de 8 nm (c.-à-d. profondeur d’indentation << R) à partir du sommet de la pointe, calculés en convertissant la zone de contact de l’échantillon de pointe à cette hauteur en un diamètre effectif en supposant un profil circulaire (c.-à-d. A = πr 2 = π(d/2)²) pour une utilisation avec des modèles de mécanique de contact sphérique. Abréviations : AFM = microscopie à force atomique; ETD = diamètre effectif de la pointe. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Entrées de l’interface logicielle. (A) Constantes d’étalonnage de la sonde. Interface utilisateur du logiciel (voir Tableau des matériaux) pour entrer la sensibilité de déflexion mesurée, la constante de ressort et le rayon de pointe pour permettre des mesures nanomécaniques quantitatives. Le rapport de Poisson de la sonde et de l’échantillon est nécessaire pour calculer l’élasticité ou le module de Young de l’échantillon à partir des courbes de force de nanoindentation basées sur le porte-à-faux. (B) Fenêtre de contrôle de la rampe. Interface utilisateur du logiciel (voir le tableau des matériaux) pour la mise en place d’expériences de nanoindentation basées sur le porte-à-faux, organisées en paramètres décrivant la rampe elle-même (c.-à-d. profil d’indentation), déclenchement de l’instrument (par exemple, contrôle de la force par rapport au déplacement), analyse de force ultérieure et limites de mouvement (pour améliorer la sensibilité de mesure en réduisant la plage sur laquelle le convertisseur A/N doit fonctionner pour contrôler le piézo Z et lire la déviation PSD). (C) Le demi-angle de pointe (basé sur la géométrie de la sonde ou la mesure directe) est important si un modèle de mécanique de contact conique, pyramidale ou conishérique (par exemple, Sneddon) est utilisé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

3. Recueillir des données sur le déplacement de force (F-D)

REMARQUE : Les valeurs des paramètres présentées ici (voir la figure 4B) peuvent varier en fonction de la force et de la plage d’indentation pour un échantillon donné.

1. Parcourez l’échantillon sous la tête AFM et engagez-vous sur la région d’intérêt souhaitée.
   1. Surveillez le signal de déviation verticale (figure 2B) ou effectuez une petite rampe initiale (~50-200 nm) (figure 4B) pour vérifier que la pointe et l’échantillon sont en contact (voir la figure 5A).
   2. Ajustez la position de la tête AFM légèrement vers le haut (par pas correspondant à ~50% de la taille totale de la rampe) et rampez à nouveau. Répéter l’opération jusqu’à ce que la pointe et l’échantillon soient juste hors de contact, comme en témoignent une rampe presque plate (figure 5B) et une déviation verticale minimale du porte-à-faux (figure 2A).
   3. Lorsqu’aucune interaction évidente entre la pointe et l’échantillon n’est présente (comparer la figure 2A et la figure 2B), abaissez la tête AFM d’une quantité correspondant à ~50%-100% de la taille de la rampe pour vous assurer que la pointe de la sonde ne s’écrasera pas dans l’échantillon lors du déplacement manuel de la tête AFM. Ramper à nouveau, en répétant jusqu’à ce qu’on observe une bonne courbe (figure 5D) ou une courbe semblable à la figure 5C. Dans ce dernier cas, effectuez un petit réglage supplémentaire de la hauteur AFM égal à ~20%-50% de la taille de la rampe pour obtenir un bon contact et une courbe de force similaire à celle illustrée à la figure 5D.
2. Ajustez les paramètres de rampe (comme décrit ci-dessous et illustré dans Graphique 4B) afin d’optimiser l’instrument, la sonde et l’échantillon, et d’obtenir des rampes semblables à celles illustrées dans Graphique 5D.
   1. Choisir une taille de rampe appropriée (c.-à-d. mouvement Z-piézo total à travers un cycle de rampe) en fonction de l’échantillon (p. ex. épaisseur, module prévu, rugosité de surface) et de la profondeur d’indentation souhaitée.
      NOTE: Pour les échantillons plus rigides, moins de déformation de l’échantillon (et donc plus de déviation de la sonde pour un mouvement Z-piézo donné) est susceptible de se produire, de sorte que la taille de la rampe peut généralement être plus petite que pour les échantillons plus mous. La taille typique des rampes pour les échantillons rigides et les porte-à-faux peut être de plusieurs dizaines de nm, tandis que pour les échantillons mous et les porte-à-faux, les rampes peuvent être de plusieurs centaines de nm à quelques μm; Des exemples d’application spécifiques sélectionnés sont présentés dans la section Résultats représentatifs. Notez que les tailles de rampe minimales et maximales possibles dépendent des instruments.
   2. Sélectionnez un taux de rampe approprié (1 Hz est un bon point de départ pour la plupart des échantillons).
      NOTA : Le taux de rampe peut être limité par les vitesses et les largeurs de bande électroniques de contrôle et/ou de détection. En combinaison avec la taille de la rampe, le taux de rampe détermine la vitesse de pointe. La vitesse de pointe est particulièrement importante à prendre en compte lors de l’indentation de matériaux mous où des effets viscoélastiques peuvent provoquer des artefacts d’hystérésis ^9,22.
   3. Choisissez d’utiliser une rampe déclenchée (à charge contrôlée) ou non déclenchée (à déplacement contrôlé).
      REMARQUE : Dans une rampe déclenchée, le système s’approche de l’échantillon par étapes définies par l’utilisateur (en fonction de la taille et de la résolution de la rampe ou du nombre de points de données) jusqu’à ce que le seuil de déclenchement souhaité (c.-à-d. force de consigne ou déviation en porte-à-faux) soit détecté, après quoi le système se rétracte à sa position initiale et affiche la courbe F-D. Dans une rampe non déclenchée, le système étend simplement le Z-piézo la distance spécifiée par la taille de rampe définie par l’utilisateur et affiche la courbe F-D mesurée. Les rampes déclenchées sont préférées pour la plupart des cas d’utilisation, mais les rampes non déclenchées peuvent être utiles lors de l’étude de matériaux mous qui ne présentent pas de point de contact pointu et facilement identifiable.
      1. Si une rampe déclenchée est choisie, définissez le seuil de déclenchement (force maximale autorisée définie par l’utilisateur ou déviation de la rampe) pour obtenir l’indentation souhaitée dans l’échantillon.
         REMARQUE : L’utilisation d’un seuil de déclenchement signifie qu’une rampe peut se terminer (c.-à-d. que la sonde peut commencer à se rétracter) avant d’atteindre la taille complète de la rampe (extension Z-piézo) spécifiée. Les valeurs peuvent varier de quelques nN à quelques μN, selon le système d’échantillonnage de pointe.
      2. Définissez la position de la rampe pour déterminer la partie de la portée maximale du Z-piézo qui sera utilisée pour exécuter la rampe. S’assurer que la plage totale de la taille de la rampe ne commence pas ou ne se termine pas en dehors de la plage Z-piézo maximale (voir les exemples représentatifs à la figure 6), sinon une partie de la courbe F-D ne représentera aucune mesure physique (c.-à-d. que le Z-piézo sera complètement étendu ou rétracté, sans bouger).
   4. Définir le nombre d’échantillons/rampe (p. ex., 512 échantillons/rampe ) pour obtenir la résolution souhaitée de la mesure (c.-à-d. densité ponctuelle de la courbe F-D).
      REMARQUE : Le nombre maximal d’échantillons/rampes peut être limité par des contraintes logicielles (taille du fichier) ou matérielles (p. ex., vitesse de conversion analogique-numérique, selon le taux de rampe). Il est également possible de limiter la plage Z-piézo ou de déviation admissible (voir les paramètres limites à la figure 4B) pour augmenter la résolution effective du convertisseur A/N du système.
   5. Réglez la rotation X pour réduire les forces de cisaillement sur l’échantillon et la pointe en déplaçant simultanément la sonde légèrement dans la direction X (parallèle au porte-à-faux) tout en indentant dans la direction Z (perpendiculaire au porte-à-faux). Utilisez une valeur pour la rotation X égale à l’angle de décalage du porte-sonde par rapport à la normale de surface (12° est typique).
      REMARQUE: La rotation X est nécessaire car le porte-à-faux est monté dans le support de sonde à un petit angle par rapport à la surface pour permettre au faisceau laser incident de se réfléchir dans le PSD. De plus, les angles avant et arrière de la pointe de la sonde peuvent différer les uns des autres (c.-à-d. que la pointe de la sonde peut être asymétrique). Des informations plus spécifiques peuvent être obtenues auprès des fabricants individuels de sondes et d’AFM.

Figure 5 : Optimisation de la séparation pointe-échantillon après engagement pour obtenir de bonnes courbes de force. Exemples séquentiels de courbes représentatives force-déplacement obtenues lors de l’indentation dans un fluide (solution saline tamponnée au phosphate) sur un noyau de cellules souches mésenchymateuses vivantes avec un cantilever étalonné en nitrure de silicium mou étalonné (nominal k = 0,04 N/m) se terminant par une pointe hémisphérique de rayon de 5 μm (voir le tableau des matériaux). Des courbes ont été obtenues dans le processus d’engagement de la surface de la cellule et d’optimisation des paramètres d’indentation, avec l’approche de la sonde indiquée en bleu et la rétraction/retrait en rouge. (A) La pointe est déjà engagée et en contact avec l’échantillon avant le début de la rampe, ce qui entraîne une déviation et des forces en porte-à-faux importantes, sans ligne de base plate avant contact. (B) Après avoir éloigné manuellement l’extrémité suffisamment loin de l’échantillon, une rampe non déclenchée de 2 μm donne une courbe F-D presque plate (c.-à-d. pratiquement aucun changement de force). Dans des conditions ambiantes, la courbe serait plus plate, mais dans un fluide, la viscosité du milieu peut provoquer de légères déviations du porte-à-faux de la sonde lors d’une rampe comme on le voit ici, même sans contact de surface. (C) Après s’être approché un peu plus près de la surface avant le début de la rampe, les courbes d’approche et de retrait montrent une légère augmentation de la force (pente accrue) près du point de retournement de la rampe (c.-à-d. transition de l’approche à la retrait). Le signe révélateur à rechercher est que les courbes d’approche (bleu) et de retrait (rouge) commencent à se chevaucher (région indiquée par le cercle noir), ce qui indique une interaction physique avec la surface. (D) Courbe F-D idéale acquise après optimisation des paramètres de rampe et s’approchant légèrement (~1 μm) plus près de la surface de la cellule qu’en C de sorte que la sonde passe environ la moitié de la rampe en contact avec la cellule, permettant une déformation suffisante pour s’adapter à la partie de contact de la courbe d’approche et déterminer le module d’élasticité. La ligne de base relativement longue, plate et peu bruyante facilite la détermination du point de contact par l’algorithme d’ajustement. Abréviation : F-D = force-déplacement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Taille et position de la rampe. Moniteur Z-piézo montrant l’étendue de la rampe (barre bleue) par rapport à la plage totale de mouvement Z-piézo disponible (barre verte). (A) La position Z-piézo est proche du milieu de son amplitude de mouvement, comme l’indique à la fois la barre bleue située approximativement au milieu de la barre verte et la tension Z-piézo actuelle (-78,0 V) se situant approximativement entre ses valeurs complètement rétractées (-212,2 V) et étendues (+102,2 V). (B) Z-piézo est étendu par rapport à A, sans tension de polarisation appliquée. (C) Z-piézo est rétracté par rapport à A et B. (D) La position Z-piézo est la même qu’en C à -156,0 V, mais la taille de la rampe a été augmentée par rapport à A-C pour tirer parti d’une plus grande partie de l’amplitude de mouvement complète du Z-piézo. € La taille de la rampe est trop grande pour la position actuelle de la rampe, ce qui entraîne l’extension du Z-piézo jusqu’à la fin de sa gamme. Cela entraînera l’aplatissement de la courbe F-D car le système ne peut pas étendre davantage le piézo Z. Abréviation : F-D = force-déplacement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

4. Analyse de la courbe F-D

1. Choisissez un progiciel d’analyse de données approprié. Sélectionnez et chargez les données à analyser.
   REMARQUE: De nombreux fabricants AFM et logiciels de traitement d’images AFM ont une prise en charge intégrée pour l’analyse de courbe F-D. Alternativement, la flexibilité et les fonctionnalités accrues d’un progiciel d’analyse de courbe F-D dédié, tel que le progiciel open source AtomicJ, peuvent être bénéfiques²³, en particulier pour le traitement par lots et l’analyse statistique de grands ensembles de données ou la mise en œuvre de modèles complexes de mécanique de contact.
2. Valeurs étalonnées d’entrée pour la constante de ressort, DS et le rayon de pointe de la sonde, ainsi que des estimations du module de Young et du rapport de Poisson pour la pointe de la sonde (en fonction de sa composition matérielle) et du rapport de Poisson de l’échantillon.
   REMARQUE: Si vous utilisez un pénétrateur à pointe de diamant, les valeurs E tip = 1140 GPa et ν _tip = 0.07 peuvent être utilisées^21,24,25,26. Pour une sonde de silicium standard, la pointe E = 170 GPa et la_pointe ν = 0,27 peuvent généralement être utilisées, bien que le module de Young du silicium varie en fonction de l’orientation cristallographique²⁷.
3. Choisissez un modèle de mécanique de contact de nanoindentation approprié pour la pointe et l’échantillon.
   REMARQUE : Pour les nombreux modèles de pointes sphériques courants (par exemple, Hertz, Maugis, DMT, JKR), il est impératif que la profondeur d’indentation dans l’échantillon soit inférieure au rayon de la pointe; sinon la géométrie sphérique de la pointe de la sonde cède la place à une forme conique ou pyramidale (Figure 4C). Pour les modèles coniques (p. ex., Sneddon²⁸) et pyramidaux, le demi-angle de la pointe (c.-à-d. l’angle entre la paroi latérale de la pointe et une ligne bissectaire perpendiculaire à l’extrémité de la pointe; Figure 4C) doit être connu et est généralement disponible auprès du fabricant de la sonde. Pour plus d’informations sur les modèles de mécanique de contact, veuillez consulter la section Analyse des données de thedDiscussion.
4. Exécutez l’algorithme d’ajustement. Vérifier le bon ajustement des courbes F-D; une faible erreur résiduelle correspondant à une moyenne de^R2 proche de l’unité (par exemple, R² > 0,9) indique généralement un bon ajustement au modèle choisi^29,30. Vérifiez ponctuellement les courbes individuelles pour inspecter visuellement la courbe, l’ajustement du modèle et les points de contact calculés si vous le souhaitez (p. ex., voir la figure 7 et la section Analyse des données de la discussion).

Representative Results

Courbes force-déplacement
La figure 7 montre des courbes F-D représentatives et presque idéales obtenues à partir d’expériences de nanoindentation réalisées dans l’air sur des échantillons de pin loblolly incorporés dans de la résine (figure 7A) et dans un fluide (solution saline tamponnée au phosphate [PBS]) sur des noyaux de cellules souches mésenchymateuses (CSM) (figure 7B). L’utilisation de tout modèle de mécanique de contact repose sur la détermination précise et fiable du point de contact initial de l’échantillon de pointe. Ainsi, la ligne de base relativement plate et peu bruyante précédant le point de contact initial et la pente lisse de la partie contact des courbes F-D illustrées à la figure 7 les rendent idéales pour l’analyse afin d’extraire les propriétés mécaniques, comme en témoigne l’excellent accord entre les courbes d’approche (traces bleues) et les ajustements correspondants (traces vertes) dans les encarts.

Inversement, il existe plusieurs problèmes courants qu’un utilisateur peut rencontrer lors de l’exécution d’une nanoindentation basée sur un porte-à-faux qui conduira à des courbes F-D non idéales. L’un des problèmes les plus courants, en particulier immédiatement après l’engagement, est que l’extrémité de la sonde est déjà en contact avec l’échantillon avant le début d’une rampe (figure 5A), ce qui empêche l’acquisition de la ligne de base hors contact nécessaire pour déterminer le point de contact initial. Cela peut également entraîner des forces excessivement importantes dans le cas de rampes non déclenchées (c.-à-d. à déplacement contrôlé). Ceci est particulièrement préoccupant lors de l’exécution d’une grande rampe avec un porte-à-faux rigide, car les forces résultantes peuvent briser le porte-à-faux et / ou endommager l’échantillon ou la pointe. Pour éviter cela, surveillez la tension de déviation verticale pendant et après l’engagement initial. Si la tension de déflexion verticale mesurée est positive (en supposant un alignement initial correct) comme le montre la figure 2B, le porte-à-faux est dévié et la pointe est en contact avec l’échantillon. Des tensions positives plus importantes correspondent à des déflexions en porte-à-faux plus importantes, mais quelle que soit l’ampleur de la flèche, l’utilisateur doit soulever manuellement la tête AFM (par exemple, en utilisant un moteur pas à pas) loin de l’échantillon. La tension de déflexion verticale devrait diminuer lentement et peut même descendre temporairement en dessous de zéro dans le cas de fortes forces adhésives de l’échantillon de pointe, mais atteindra finalement 0 V (ou près de 0 V) une fois que la pointe n’est plus en contact avec l’échantillon (Figure 2A). À partir de ce moment, l’utilisateur peut reprendre l’optimisation des paramètres de rampe et effectuer des retraits.

Un autre problème courant (en particulier pour les rampes non déclenchées) est que toute la courbe F-D semble presque plate, sans signe évident d’interaction pointe-échantillon, comme le montre précédemment la figure 5B. Si cela est disponible sur l’instrument, la solution consiste à abaisser manuellement la tête SPM de ~10% de moins que la taille de la rampe (pour éviter de casser la pointe de la sonde) et à remonter la rampe, en répétant jusqu’à ce qu’une augmentation évidente de la force soit observée en raison de l’interaction pointe-échantillon (Figure 5C, D) avant de procéder à l’optimisation des autres paramètres de rampe.

Usure des pointes
La figure 8 présente un exemple d’usure des pointes dans un contexte expérimental. Une sonde AFM à mode de taraudage au silicium unique et rigide (voir le tableau des matériaux) a été utilisée pour imager plusieurs grandes zones d’un échantillon de schiste de Bakken (voir l’exemple d’application correspondant pour plus de détails) en utilisant une méthode d’imagerie rapide (taux kHz) basée sur la courbe de force, et la méthode BTR a été utilisée pour modéliser la géométrie de la pointe et estimer le rayon d’extrémité de la pointe avant et après chacune des trois images consécutives. Les échantillons de schiste étudiés consistaient en une matrice d’argile et de matière organique (E ~5 GPa) avec des inclusions minérales inorganiques beaucoup plus dures dispersées partout (E > 30 GPa). Étant donné que l’échantillon contenait des variations importantes de topographie de surface (±2 μm) sur les grandes zones de balayage (85 μm x 85 μm) imagées, la vitesse de balayage a été réglée au minimum autorisé sur l’instrument utilisé, soit 0,1 Hz. Avec un taux d’acquisition de la courbe de force de 2 kHz et un taux de balayage de 0,1 Hz, au cours d’une seule image de 1024 x 1024 pixels, il y a eu plus de 20 millions d’interactions tip-échantillon. Par conséquent, la pointe de la sonde a subi une usure importante par rapport à son état vierge (figure 8A) au cours de l’imagerie de l’échantillon, augmentant de plus d’un ordre de grandeur d’un rayon d’extrémité effectif de ~11 nm reçu à ~129 nm à la fin des trois images (figure 8D). Au cours de la première image, la pointe semble avoir été brisée, ce qui a entraîné le grand changement morphologique observé à la figure 8B. Dans chaque image suivante, la pointe devient progressivement plus arrondie, un excellent exemple du phénomène plus courant de l’usure progressive (voir discussion). Les rayons de pointe estimés des modèles BTR sont inclus à la figure 8.

En revanche, la figure 8E,F présente les modèles BTR d’une sonde à pointe de diamant (voir Tableau des matériaux) acquise à 6 mois d’intervalle, avec des milliers de nanoindents et des centaines de millions d’interactions d’imagerie de la courbe de force basées sur l’imagerie de la pointe et des échantillons se produisant entre les deux. Comme le montrent les rayons de pointe estimés de 29 nm (figure 8E) et 28 nm (figure 8F), le rayon de pointe de la sonde n’a pas changé dans les limites de la méthode BTR, ce qui met en évidence l’extrême résistance à l’usure du diamant. Il convient toutefois de noter que les sondes à pointe diamantée (comme toutes les sondes AFM) sont susceptibles d’être contaminées par des débris faiblement collés qui peuvent avoir une incidence sur la fonction de la zone de pointe et la dureté effective. En conséquence, la propreté des échantillons reste vitale pour la préservation de la pointe et des mesures nanomécaniques précises.

Exemples d’application
Grâce au choix judicieux de la composition du matériau de la sonde, de la constante du ressort en porte-à-faux, de la géométrie et du rayon de la pointe, la nanoindentation basée sur le porte-à-faux peut être utilisée pour quantifier les propriétés mécaniques à l’échelle nanométrique de matériaux avec des modules élastiques allant de kPa à GPa, à la fois dans le fluide et dans des conditions ambiantes. Des exemples d’application sélectionnés suivent pour mettre en évidence quelques-uns des nombreux cas d’utilisation possibles pour la nanoindentation basée sur le porte-à-faux.

Étude des propriétés mécaniques du pin loblolly pour les applications de biocarburants
Les pins loblolly (Pinus taeda) sont une espèce de résineux à croissance rapide qui est très abondante dans le sud des États-Unis, occupant plus de 13 millions d’hectares³¹. En raison de leur abondance, les pins loblolly sont une culture commerciale essentielle dans le sud des États-Unis, couramment utilisée pour le bois d’œuvre et le bois à pâte. En outre, ils constituent une ressource importante pour la production de biocarburants cellulosiques de deuxième génération³². Il est important de noter que la demande de matières premières de biocarburants cellulosiques a augmenté en raison de la Loi sur l’indépendance et la sécurité énergétiques (EISA) de 2007, qui stipule que d’ici 2022, l’utilisation totale de carburant renouvelable dans l’industrie du transport américaine devrait être de 36 milliards de gallons, dont 16 milliards de gallons provenant de la biomasse cellulosique. En conséquence, en raison du taux de croissance rapide du pin loblolly et de son aptitude aux projets agroforestiers, il est devenu une matière première de biocarburants d’un grand intérêt ces dernières années³³. La connaissance des propriétés mécaniques du pin loblolly, y compris la variabilité entre les arbres individuels, les fractions anatomiques (p. ex. bois blanc, écorce, aiguilles) et les zones cellulaires (p. ex. paroi cellulaire par rapport à l’intérieur), peut permettre la séparation ciblée des flux de biomasse afin d’optimiser le traitement mécanique et la conversion thermochimique³⁴.

La figure 9 présente une image représentative de la topographie AFM (capteur de hauteur) (figure 9A) et la carte du module d’élasticité correspondante (figure 9B) d’un échantillon de coupe transversale de bois blanc obtenu à partir d’une branche sur un pin loblolly de 23 ans avec un rayon de ~30 nm de courbure sonde diamantée montée sur un porte-à-faux en acier inoxydable (k = 256 N/m). Les cartes de topographie et de module ont été générées simultanément à l’aide de l’imagerie AFM basée sur la courbe de force de vitesse rapide kHz, la carte de module présentant des résultats semi-quantitatifs basés sur les valeurs nominales des constantes d’étalonnage de la sonde (c.-à-d. constante de ressort, sensibilité de déviation et rayon de pointe) et ajustant les courbes de force en temps réel à la mécanique de contact DMT (Derjaguin, Muller et Toporov) modèle³⁵. Des échantillons en coupe transversale taillés à <3 mm dans les trois dimensions (longueur x largeur x hauteur) ont été préparés pour l’imagerie par déshydratation en série à l’aide de concentrations croissantes d’éthanol (33 %, 55 %, 70 %, 90 % et 100 %)³⁶, avant de s’infiltrer avec de la résine (voir le tableau des matériaux) et de polymériser à 60 °C pendant la nuit. Les échantillons entièrement durcis incorporés dans de la résine ont d’abord été broyés, puis ultramicrotomés avec une lame diamantée fonctionnant à une vitesse de coupe de ~1 mm/s avec une épaisseur d’alimentation diminuant de 1 μm à 50-70 nm par tranche pour produire une surface plane se prêtant à l’imagerie AFM. Cependant, comme on peut le voir par la barre d’échelle de couleur de la figure 9A, la surface résultante dans ce cas est encore relativement rugueuse, peut-être en raison de la présence de débris résiduels sur la surface de l’échantillon et / ou de la lame ultramicrotome, conduisant à un « claquement » de la lame pendant la section, alors que d’autres échantillons présentaient une topographie de surface beaucoup plus lisse.

La figure 9C reproduit l’image topographique AFM de la figure 9A, mais avec un réticule blanc indiquant les emplacements de huit réseaux de 50 nanoindents chacun à effectuer le long de parois cellulaires sélectionnées dans le ROI, car le but du projet en question était de comprendre comment les propriétés nanomécaniques du pin loblolly diffèrent selon les différents types de tissus et l’âge des arbres. Un seuil de déclenchement de 1 μN a généralement été utilisé pour les rampes (taille nominale de rampe de 60 nm conduite à une vitesse de rampe de 1 Hz), conduisant à une profondeur d’indentation de ~ 10 nm le long des parois cellulaires (8 ± 2 nm dans tous les échantillons étudiés) ou légèrement plus profonde (14 ± 4 nm) à l’intérieur des cellules, qui sont un peu plus molles que les parois cellulaires. Les retraits à l’intérieur de chaque ligne ont été espacés de ≥ 100 nm pour s’assurer qu’ils étaient bien séparés, et 1 024 points de données ont été recueillis par rampe pour produire des courbes d’approche et de retrait bien caractérisées. En combinant l’imagerie basée sur la courbe de force rapide avec la nanoindentation point-and-shoot basée sur le porte-à-faux, il a été possible de générer des statistiques et de déterminer les différences de modules entre les structures cellulaires. Par exemple, comme le montre le tableau 1, on a constaté que le module d’élasticité moyen de l’intérieur de la cellule était environ la moitié de celui de la paroi cellulaire sur des échantillons de bois blanc provenant de plusieurs branches d’arbres d’âges variés.

Échantillon	Emplacement	E* (GPa)	E (GPa)	Déformation (nm)	Chef d’accusation (n)
1	Intérieur	1,5 ± 0,4	1,4 ± 0,4	14 ± 2	199
	Mur	4,7 ± 1,3	4.3 ± 1.3	7 ± 2	202
2	Intérieur	1,3 ± 0,3	1,2 ± 0,3	16 ± 3	198
	Mur	3,2 ± 0,9	2,9 ± 0,9	9 ± 2	199
3	Intérieur	1,9 ± 0,6	1,7 ± 0,6	12 ± 3	198
	Mur	5,7 ± 1,2	5,2 ± 1,2	6 ± 1	199
4	Intérieur	2,4 ± 0,8	2,2 ± 0,8	11 ± 3	202
	Mur	4.2 ± 2.1	3,8 ± 2,1	9 ± 4	193
5	Intérieur	2,6 ± 0,8	2,3 ± 0,8	10 ± 2	198
	Mur	4,3 ± 1,6	3,9 ± 1,6	7 ± 2	199
Moyenne	Intérieur	1,9 ± 0,6	1,8 ± 0,6	13 ± 3
	Mur	4,4 ± 1,4	4,0 ± 1,4	8 ± 2

Tableau 1 : Statistiques du module élastique du pin loblolly : parois cellulaires versus intérieur de cellules. Modules élastiques mesurés des parois cellulaires par rapport à l’intérieur des cellules pour cinq échantillons de branches de bois blanc de pin loblolly prélevés sur deux arbres d’âges différents. Toutes les valeurs de module ont été calculées en ajustant la partie d’approche de la courbe de déplacement de force au modèle DMT et en supposant un rapport de Poisson de 0,3 pour l’échantillon. Les modules sont rapportés sous forme d’écart type moyen ± pour chaque emplacement d’échantillon, le nombre de courbes de force (nombre, n) étant analysé pour produire le résultat rapporté. Les modules réduits mesurés (E*) ont été convertis en modules d’échantillon réels (E), en supposant un module de Young de 1 140 GPa et un rapport de Poisson de 0,07 pour le pénétrateur à pointe de diamant utilisé. La déformation moyenne de l’échantillon pour la charge appliquée de 1 μN est également indiquée.

Nanomécanique corrélée et microspectroscopie électronique sur les schistes de Bakken
Les gisements de schiste de Bakken se trouvent dans le bassin Williston au Montana et au Dakota du Nord aux États-Unis et dans certaines parties de la Saskatchewan au Canada. Ils constituent le deuxième plus grand réservoir d’hydrocarbures aux États-Unis, mais l’étude des gisements en est encore à ses balbutiements^[37]. Une étude des propriétés nanomécaniques du schiste de Bakken en fonction de la composition et de la maturité thermique a été menée en co-localisant la nanoindentation à base de porte-à-faux AFM avec l’imagerie au microscope électronique à balayage (MEB) et la caractérisation de la composition élémentaire par spectroscopie à dispersion d’énergie (EDS), comme le montre la figure 10. Plus précisément, la cartographie SEM-EDS a été utilisée pour caractériser la distribution élémentaire (figure 10C), déterminant ainsi la présence et l’emplacement de diverses inclusions minérales dans la matrice de schiste. L’imagerie AFM basée sur la courbe de force rapide (kHz) (Figure 10B) a été colocalisée avec les cartes SEM-EDS en définissant une origine optiquement identifiable dans l’image SEM de l’électron secondaire (SE) (Figure 10A) et en suivant le mouvement de scène de l’AFM et du SEM³⁸. En utilisant à nouveau une sonde à pointe diamantée montée sur un porte-à-faux rigide en acier inoxydable, il a été possible de cartographier les variations du module d’élasticité pour de grandes régions (85 μm x 85 μm) contenant des inclusions d’intérêt (figure 10D). Il est à noter que la carte des modules présentée à la figure 10D est de nature qualitative plutôt que quantitative, car les constantes d’étalonnage de sonde appropriées n’ont pas été entrées dans le logiciel avant l’imagerie et l’acquisition des données.

Les images AFM de la figure 10B et de la figure 10D mettent également en évidence l’un des inconvénients de la sonde à pointe de diamant utilisée, à savoir son incapacité à suivre avec précision les caractéristiques du rapport d’aspect élevé (voir la région ovale noire à la figure 10B) en raison de la géométrie de son extrémité d’angle de cube. La résolution réduite et l’incapacité de suivre avec précision les caractéristiques abruptes peuvent être vues plus clairement à la figure 11, où la même zone générale d’un échantillon de schiste de Bakken a été imagée par la pointe diamantée d’angle cubique (Figure 11A) et une sonde AFM en silicium en mode de taraudage rigide significativement plus nette et au rapport d’aspect plus élevé (Figure 11B). Plus précisément, l’image montrée à la figure 11B a été acquise avec la sonde caractérisée à la figure 8A-D, entre les modèles BTR de la figure 8A (R = 11 nm) et de la figure 8B (R = 43 nm). Pour une comparaison directe, les paires d’images Figure 11C,D, ainsi que Figure 11E,F, présentent des images agrandies des mêmes caractéristiques de surface d’échantillon obtenues avec la pointe diamantée et la sonde en silicium, respectivement, montrant l’effet de la géométrie et du rayon de la pointe sur la résolution et la fidélité de l’image. La figure 11G présente une image 3D composite combinant la topographie de surface acquise avec la sonde en silicium pointue et à haut aspect (Figure 8A,B) et les valeurs de module acquises avec la sonde de pointe diamantée (Figure 8E,F) codées comme la peau colorée superposée.

En plus des grandes images montrées à la figure 10 et à la figure 11, des images plus petites (10 μm x 10 μm) basées sur la courbe de force rapide ont été acquises à l’aide de la sonde à pointe de diamant entièrement calibrée. Ces images se sont concentrées sur des zones sans inclusions minérales inorganiques optiquement visibles afin d’étudier plus en détail les propriétés de la matrice organique environnante. En utilisant une résolution de pixels de 512 x 512 (c’est-à-dire ~20 nm x 20 nm pixels d’échantillonnage), > 262 000 courbes F-D individuelles ont été capturées et enregistrées avec chaque image de 10 μm x 10 μm, permettant d’excellentes statistiques. Les données F-D ont été traitées par lots et analysées à l’aide du progiciel AtomicJ²³ pour mettre en œuvre le modèle de mécanique de contact Derjaguin-Muller-Toporov (DMT)³⁵. Après l’ajustement, les données ont été nettoyées pour éliminer les courbes qui ont abouti à un module d’élasticité calculé <0 (non physique) ou >30 GPa (puisque l’étude était axée sur la partie non minérale du schiste, E << 30 GPa) similaire à d’autres études^39,40, ainsi que des données avec un modèle d’ajustement R² < ^0,7. Bien que le seuil R² soit quelque peu arbitraire, il a été choisi pour ne supprimer que les données que le modèle ne pouvait manifestement pas ajuster avec précision. À l’exception d’une valeur aberrante qui comprenait une grande inclusion minérale dans la zone d’imagerie, les courbes retirées représentaient moins de 0,5 % des données totales pour chaque image. Un résumé des résultats statistiques se trouve au tableau 2. Les modules d’élasticité calculés varient de 3,5 à 6,1 GPa, dans la plage de ce que des études similaires ont également trouvé^39,40.

Échantillon	E (GPa)	Rendement après nettoyage des données	Chef d’accusation (n)
1	6.1 ± 3.8	93.70%	7,36,874
2	5,1 ± 2,6	99.70%	7,84,267
3	3,5 ± 1,9	99.60%	7,83,427

Tableau 2 : Statistiques du module d’élasticité des schistes de Bakken. Modules élastiques mesurés des matrices organiques dans trois échantillons de schiste de Bakken de composition et de maturité thermique différentes. L’échantillon 1 est un témoin, tandis que les échantillons 2 et 3 ont été recuits pendant 12 h et 48 h, respectivement, pour simuler artificiellement la maturation thermique. Les modules d’élasticité sont exprimés sous forme d’écart type moyen ± pour chaque emplacement d’échantillon, le nombre de courbes de force (nombre, n) étant inclus dans l’analyse après l’utilisation de la procédure de nettoyage des données décrite dans le texte indiqué. Les modules moyens calculés (3,5-6,1 GPa) se situent dans la plage rapportée dans d’autres études similaires telles que celle de Li et ^al.40, qui ont trouvé une plage de modules de 2,9-11,8 GPa.

Changements de rigidité nucléaire des cellules souches mésenchymateuses dus à des stimuli externes
Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) sont des cellules progénitrices qui peuvent devenir des chondrocytes, des adipocytes, des ostéoblastes et des myocytes⁴¹. La différenciation des CSM en ces différents types de tissus est affectée par des stimuli mécaniques externes sur la cellule via le complexe Linker of the Cytoskeleton and Nucleoskeleton (LINC), qui relie physiquement la membrane cellulaire externe à la membrane nucléaire⁴¹. Le complexe LINC est composé de protéines SUN et Nesprin qui interagissent avec le cytosquelette cellulaire pour détecter les forces physiques sur la cellule et faciliter l’importation nucléaire des facteurs mécanosensibles β-caténine et YAP pour initier le processus de différenciation^42,43,44. Parallèlement à l’importation nucléaire de β-caténine et de YAP après la mécanostimulation des cellules, le cytosquelette subit également un réarrangement, y compris la formation de filaments F-actine autour du noyau ainsi que la translocation nucléaire de l’actine^44,45,46. Étant donné que la mécanostimulation initie des changements dans le cytosquelette cellulaire et l’entrée nucléaire de l’actine, la rigidité globale (module) des cellules et des noyaux est affectée et peut être mesurée par nanoindentation en porte-à-faux AFM. Des études antérieures l’ont confirmé en détectant une diminution du module cellulaire et nucléaire après perturbation du complexe LINC, et inversement une augmentation du module cellulaire et nucléaire après la mécanostimulation des CSM⁴⁷. Les recherches actuelles étudient toujours les mécanismes d’importation d’actine dans le noyau et comment la polymérisation de l’actine affecte le module cellulaire et nucléaire après mécanostimulation.

Pour étudier les propriétés mécaniques des cellules vivantes, les expériences doivent être menées dans une solution tampon, généralement PBS. La réalisation de nanoindentation en porte-à-faux dans un fluide pose des problèmes uniques, en particulier pour la mesure d’échantillons très mous tels que les CSM (E≈ 2 kPa). En particulier, les faibles modules élastiques des cellules vivantes nécessitent l’utilisation d’un grand rayon de sonde pour réduire la contrainte exercée sur la structure cellulaire et éviter la perforation de la membrane. De plus, des porte-à-faux à très faible constante de ressort (k = 0,04 N/m) sont nécessaires pour mesurer des modules d’élasticité aussi faibles, mais cela augmente la probabilité de faux engagement en raison de la traînée visqueuse du fluide, conduisant à la déviation du porte-à-faux souple pendant l’étape initiale d’abaissement rapide du processus d’engagement AFM. Pour contrer la propension plus élevée aux faux engagements, il peut être nécessaire d’utiliser un point de consigne d’engagement plus élevé (c’est-à-dire un seuil de déclenchement de tension de déviation pour mettre fin au processus d’engagement). Étant donné que les porte-à-faux plus souples peuvent généralement être déformés élastiquement dans une plus grande mesure que les porte-à-faux rigides, la plus grande flexion subie avec un point de consigne d’engagement plus élevé dans le fluide n’est généralement pas préjudiciable à ces sondes molles. En outre, il est impératif que les solutions utilisées dans un environnement fluide soient exemptes de débris et de bulles, car les débris flottants ou les bulles peuvent interférer transitoirement avec la transmission du laser à travers le fluide au PSD ou adhérer au porte-à-faux et bloquer le laser. L’interférence avec le faisceau laser aura un impact négatif sur les courbes F-D résultantes et entraîne souvent une fausse détection de collision ou un faux engagement. Enfin, la nanoindentation sur des cellules vivantes nécessite également plus d’intervention de l’utilisateur que sur des matériaux inanimés plus durs. En particulier, comme les cellules et leur environnement fluide sont beaucoup plus dynamiques, il peut être nécessaire d’ajuster activement la hauteur de la sonde pour chaque rampe afin d’obtenir une bonne courbe F-D.

Dans la nanoindentation de cellules vivantes, une déformation d’échantillon beaucoup plus importante est souvent nécessaire pour obtenir la même déviation en porte-à-faux par rapport à des échantillons plus rigides. Cette déformation plus importante peut entraîner des résultats expérimentaux s’écartant de l’hypothèse d’élasticité linéaire du modèle de Hertz et, par conséquent, un facteur de correction peut devoir être appliqué pour tenir compte du comportement hyperélastique pour une analyse F-D précise⁴⁸. Il a été constaté que le rapport de taille géométrique, où R ₂ est le rayon du pénétrateur et R₁ est le rayon de la cellule (voir Figure 12A), peut être utilisé pour prédire l’adhésion des données résultantes à la mécanique hertzienne. Le rapport de taille géométrique idéal s’est avéré être β = 0,3, avec des valeurs β <0,3 conduisant à sous-estimer le module d’élasticité et β valeurs > 0,3 conduisant à surestimer le module d’élasticité lorsqu’il est analysé avec la théorie du contact de Hertz⁴⁸. Une façon courante d’éviter les effets non linéaires est de garder les déformations petites. Dans cette étude, la profondeur d’indentation était limitée à 500 nm-1 μm.

Un ensemble de données représentatif montrant les résultats d’un seul ensemble d’expériences de nanoindentation sur des CSM et des noyaux isolés est présenté à la figure 12B. Dans les données présentées à la figure 12B, préétalonnées (constante de ressort via LDV et rayon de pointe via MEB), des sondes hémisphériques de rayon de 5 μm avec une constante de ressort nominale de k = 0,04 N/m ont été utilisées pour étudier les différences de module entre les CSM vivantes intactes et les noyaux isolés des CSM, qui ont servi de témoins pour tester les effets des déformations statiques et dynamiques sur les propriétés mécaniques des cellules et nucléaires⁴⁶ . En raison des différences et des défis liés à l’engagement sur les cellules et les noyaux, les données de module extraites ont tendance à présenter une grande variation (c.-à-d. distribution des valeurs). Par conséquent, l’ensemble de données de la figure 12B présente un 75e centile des données recueillies. En raison de cette variabilité innée entre les cellules vivantes et de la propagation des mesures qui en résulte, il est recommandé de mener des expériences de nanoindentation répliquées sur un grand nombre d’échantillons avec au moins trois réplicas biologiques afin de générer des statistiques robustes pour l’analyse et l’interprétation^{des données 30}.

Propriétés mécaniques des bicouches lipidiques contenant du cholestérol
Des membranes lipidiques soutenues avec une teneur très élevée (>50 mol%) en cholestérol (Chol), typique de la composition trouvée dans les membranes du cristallin, ont été préparées et incubées sur du mica muscovite⁴⁹ fraîchement clivé. Une image topographique AFM représentative d’une telle membrane lipidique supportée (SLM) préparée à un rapport de mélange Chol/POPC (POPC = 1-palmitoyl-2-oléoyl-glycéro-3-phosphocholine) de 1 est montrée à la figure 13A, avec le profil de hauteur le long de la ligne violette dans l’image montrée sous la figure. Le SLM de la figure 13A recouvrait complètement la surface du mica exposé avec un temps d’incubation suffisant (~25 min) et une concentration lipidique suffisante (0,3 mg/mL), comme en témoigne l’absence de caractéristiques distinctives dans l’image topographique. De même, le profil de hauteur à travers l’image fournit des détails structurels concernant la rugosité de la surface de la membrane, avec le SLM lisse comme prévu.

La figure 13B présente un ensemble de sections d’approche des courbes de force saisies sur le SLM illustré à la figure 13A. Pour obtenir de meilleures statistiques concernant les propriétés mécaniques du SLM, des courbes de force ont été collectées en des points équidistants espacés d’au moins 100 nm, couvrant presque toute la largeur du SLM. L’espacement entre les points (≥10x la profondeur d’indentation) a été choisi pour éviter que l’indentation ne se produise trop près les uns des autres. Les courbes de force montrent un événement décisif évident, comme en témoigne la discontinuité ou le saut soudain entre les distances de séparation ~0 et ~5 nm dans la section d’approche des courbes de force où la force chute précipitamment de ~10 nN à ~5 nN. La force de percée moyenne de la membrane représentée à la figure 13A (rapport de mélange Chol/POPC de 1) basée sur les courbes d’approche de la figure 13B est calculée comme étant de 9,25 ± 0,27 nN.

En revanche, la figure 13C montre une image topographique AFM de la membrane partielle ou des plaques membranaires formées par des membranes d’incubation à nouveau à un rapport de mélange Chol/POPC de 1, mais à une concentration beaucoup plus faible de lipides (~15 μg/mL) et avec un temps d’incubation plus court (~5-6 min)⁴⁹. Le profil de hauteur le long de la ligne rouge à travers la tache de membrane au centre de l’image est montré sous la figure. La mesure à travers la bicouche partielle fournit l’épaisseur du SLM, indiquée par les lignes pointillées noires de la figure 13C comme étant ~7 nm. Cependant, cette épaisseur mesurée incorpore également une couche d’eau de 1-2 nm entre la membrane et le disque de mica⁵⁰. Il convient de noter que la membrane partielle n’est souvent que faiblement attachée à la surface du mica, ce qui peut entraîner l’élimination des particules lipidiques du bord des plaques membranaires partielles pendant le balayage, mais un temps d’incubation légèrement plus long ou une diminution de la force d’imagerie peut éliminer cette difficulté.

L’étalonnage de la sonde AFM est crucial pour quantifier avec précision les propriétés mécaniques SLM. En particulier, bien que la constante du ressort de pointe reste constante dans l’air ou le milieu fluide, la sensibilité à la déformation doit être étalonnée dans le même milieu où les expériences sont effectuées. Il est essentiel de calibrer la sensibilité à la déviation immédiatement avant chaque série d’acquisitions de courbes de force pour garantir des résultats reproductibles, car l’alignement laser et / ou la réflectivité du revêtement arrière peuvent changer avec le temps, en particulier dans le fluide. Les sondes très tranchantes sont déconseillées pour capturer les courbes de force de la membrane, car elles perforent facilement le SLM et peuvent conduire à mesurer une force de percée erronéement faible ou aucune percée du tout. Cependant, l’utilisation répétée de la même pointe sans nettoyage approprié augmente le risque que des débris s’accumulent sur la pointe et ternissent ainsi la pointe ou affectent les forces adhésives de l’échantillon de pointe. L’absence d’événements de percée évidente dans les courbes de force d’approche peut également correspondre à une poussée uniquement sur le mica plutôt que sur la membrane réelle; Ainsi, une confirmation visuelle de la formation de la membrane avant de capturer les courbes de force est nécessaire.

Figure 7 : Courbes représentatives force-déplacement (F-D) dans l’air et les fluides. Courbes de force représentatives obtenues sur (A) un pin loblolly dans l’air avec ajustement du modèle DMT qui l’accompagne, et (B) un noyau MSC vivant dans PBS avec un ajustement de modèle Hertz d’accompagnement. Les encarts des panneaux A et B montrent un zoom de la région de contact des courbes d’approche correspondantes (traces bleues) avec ajustement d’accompagnement (traces vertes). Dans chaque panneau, le point de contact initial de l’échantillon de pointe (tel que déterminé par l’algorithme d’ajustement) est indiqué par un losange vert, tandis que le point de retournement (c.-à-d. la transition de l’approche au retrait ou au retrait) est indiqué par un cercle cyan. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8 : Comparaison de l’usure de l’embout de la sonde en silicium par rapport à celle de la sonde diamantée. (A-D) Pointe de sonde en silicium. Série de modèles créés par la méthode de reconstruction de l’extrémité aveugle à la suite de l’imagerie d’un échantillon de caractérisation de la pointe, démontrant l’évolution du rayon d’une sonde rigide à pointe en silicium cantilever (voir Tableau des matériaux) en raison de l’usure progressive de la pointe au cours de trois images séquentielles de 85 μm x 85 μm (1024 x 1024 pixels) basées sur la courbe de force d’un échantillon de schiste de Bakken, effectuées à une fréquence de balayage linéaire de 0,1 Hz et à une fréquence d’échantillonnage de la courbe de force de 2 kHz (c.-à-d. ~20 millions d’interactions/image/échantillonnage). (A) Pourboire tel que reçu (prêt à l’emploi), avant utilisation. R = 11 nm. (B) Pointe après une image (R = 43 nm). (C) Pointe après deux images (R = 94 nm). (D) Pointe après trois images (R = 129 nm). (E,F) Pointe de sonde diamant. Modèles BTR de la même sonde à pointe de diamant (voir le tableau des matériaux) obtenus à ~6 mois d’intervalle. Entre l’acquisition des images de pointe utilisées pour générer les modèles montrés en E et F, des milliers de nanoindents ont été effectués avec la sonde et des centaines de millions d’interactions pointe-échantillon au cours de l’imagerie basée sur la courbe de force se sont produites. Néanmoins, en raison de la dureté du diamant, le rayon d’extrémité estimé de ~30 nm n’a pas changé dans les limites d’incertitude de la technique BTR entre l’acquisition des images initiales (E) et de suivi (F) de la pointe. L’aspérité observée dans le modèle précédent (indiquée par le cercle noir dans le panneau E) est très probablement un artefact de la méthode BTR ou due à la présence d’un contaminant à l’échelle nanométrique (p. ex. particule de poussière) sur le côté de la pointe. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 9 : Topographie AFM et cartes de module d’un échantillon de pin loblolly. Données AFM représentatives acquises dans l’air sur un échantillon de pin loblolly en coupe transversale incorporé dans de la résine pour permettre des mesures de nanoindentation en porte-à-faux sur les parois cellulaires. (A) Image topographique AFM couvrant plusieurs cellules acquises via un mode d’imagerie basé sur une courbe de force rapide, présentée sous la forme d’une représentation pseudo-3D. (B) Carte de module d’Elastic ou Young générée en temps réel par le logiciel AFM en analysant la courbe de force acquise à chaque pixel et en ajustant les données au modèle DMT, montrant que les parois cellulaires sont plus rigides que les intérieurs des cellules. Notez que les paramètres d’étalonnage nominals, plutôt que mesurés, ont été utilisés, de sorte que les valeurs de module doivent être traitées comme qualitatives ou seulement semi-quantitatives. (C) Vue d’ensemble du retour sur investissement indiquant les emplacements (huit lignes composées de 50 réticules blancs espacées de ≥100 nm) où 400 nanoindents (taille nominale de rampe de 60 nm, avec un seuil de déclenchement de 1 μN correspondant à une profondeur d’indentation moyenne de ~10 nm) ont été effectués le long de parois cellulaires sélectionnées après l’acquisition de l’image AFM pour permettre la localisation des retraits avec une précision à l’échelle nanométrique. Barres d’échelle = 20 μm (A,B). Abréviations : AFM = microscopie à force atomique; DMT = Derjaguin-Muller-Toporov. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 10 : AFM et SEM/EDS co-localisés d’un échantillon de schiste de Bakken. (A) Image MEB électronique secondaire d’une partie d’un échantillon de schiste de Bakken. (B) Image topographique AFM de la région indiquée par l’encadré noir en A. L’ovale noir indique une région où le faible rapport d’aspect de la sonde conduit à l’imagerie de la paroi latérale de la sonde plutôt que la fonction de topographie de surface à rapport d’aspect raide et élevé. (C) Carte de composition élémentaire EDS obtenue pour l’image SEM illustrée en A. (D) L’élastique dérivé de l’AFM ou la carte du module de Young générée au cours de l’obtention de l’image topographique AFM en B, montrant que l’inclusion minérale au centre des images A-D est significativement plus difficile que la matrice organique environnante. Barres d’échelle = 50 μm. Abréviations : AFM = microscopie à force atomique; MEB = microscopie électronique à balayage; EDS = spectroscopie dispersive d’énergie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 11 : Effet du rayon et de la forme de la pointe de la sonde sur l’apparence des caractéristiques de rapport d’aspect élevé. Comparaison de la résolution des caractéristiques obtenue à l’aide soit (A) d’une sonde de pointe diamantée R≈ 30 nm à faible rapport d’aspect (demi-angle de pointe = 47°) (voir le tableau des matériaux) ou (B) d’une sonde rigide en silicium R≈ 10 nm (demi-angle de pointe ≈ 19°) (nominale k = 200 N/m; voir le tableau des matériaux) pour imager le même emplacement sur un échantillon de schiste de Bakken. (C-F) Images agrandies des zones bleues (C, D) et orange (E, F) dans A et B obtenues avec la sonde à pointe diamant à faible rapport d’aspect (C, E) à plus grand rayon de courbure (C, E) ou la sonde à mode de tapotement en silicium rigide (D, F), plus nette et plus élevée au format d’image, mettant en évidence la diminution de la résolution des caractéristiques et l’introduction d’artefacts de paroi latérale de pointe dans la topographie AFM Image obtenue avec la sonde de pointe diamantée en raison de son rayon de pointe plus grand et demi-angle. Les zones mises en évidence dans C à F contiennent des caractéristiques escarpées et profondes qui démontrent les compromis en termes de résolution latérale, de suivi précis et de fidélité d’image entre une sonde en silicium plus facilement émoussée et initialement pointue ou une sonde à pointe diamant plus émoussée et résistante à l’usure. (G) Image 3D composite générée en combinant la topographie AFM acquise avec la sonde en silicium rigide à rapport d’aspect plus élevé avec des données de module (peau colorée superposée) dérivées de l’imagerie de la courbe de force rapide de la même zone de l’échantillon avec la sonde à pointe de diamant. Les caractéristiques mises en évidence par les cases bleues et blanches de A et B sont également indiquées dans G. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 12 : Nanoindentation en porte-à-faux sur des cellules ou des noyaux. (A) Une cellule de rayon R ₁ située sur un substrat plat et rigide est dentelée à une profondeur d par un pénétrateur sphérique de rayon R₂. Cette figure a été reproduite à partir de Ding et ^al.48. (B) Graphiques de valeurs individuelles de mesures de module représentatif obtenues à partir d’expériences de nanoindentation en porte-à-faux AFM sur des CSM de souris et des noyaux isolés extraits de CSM de souris. Au total, 10 cellules et 10 noyaux ont été mesurés cinq fois chacun à une profondeur d’indentation de 500 à 600 nm (choisi pour permettre l’utilisation du modèle de mécanique de contact de Hertz). Les données brutes de la courbe F-D résultantes ont été traitées à l’aide de l’Atomic J²³ pour calculer les modules élastiques. En raison de la grande variabilité innée des cellules, un 75e^percentile des données est tracé. Les noyaux cellulaires et isolés ne présentaient aucune différence statistique dans le module d’élasticité, avec des modules moyens mesurés de 0,75 ± 0,22 kPa et 0,73 ± 0,22 kPa, respectivement. Des données similaires ont été recueillies et analysées pour déterminer les différences de rigidité nucléaire dues à la stimulation mécanique, aux knockouts protéiques et aux traitements chimiques. Abréviations : MSC = cellule souche mésenchymateuse; AFM = microscopie à force atomique; F-D = force-déplacement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 13 : Morphologie et propriétés nanomécaniques des bicouches lipidiques. (A) Image topographique AFM montrant la variation minimale de hauteur d’une membrane lipidique supportée complète (SLM) composée de Chol/POPC à un rapport de mélange de 1 qui s’est formée sur toute la surface de mica exposée avec un long temps d’incubation (~25 min) et une concentration lipidique élevée (0,3 mg/mL). Le profil de hauteur le long de la ligne violette au milieu de l’image est montré sous la figure, fournissant des détails structurels de la surface de la membrane. Comme prévu, le SLM est extrêmement fluide. (B) Collecte des sections d’approche des courbes de force capturées sur le SLM illustré au point A. Des courbes de force ont été recueillies à des points équidistants de ≥100 nm couvrant presque tout le SLM. Les courbes de force montrent un événement de percée claire, comme en témoigne la discontinuité ou le saut soudain dans la section d’approche des courbes de force. La force de percée moyenne est de 9,25 ± 0,27 nN. (C) Plaques membranaires partielles ou membranaires formées par incubation de membranes à un rapport de mélange Chol/POPC de 1 avec un temps d’incubation plus court (~5-6 min) et une concentration lipidique plus faible (~15 μg/mL) par rapport à A⁴⁹. Le profil de hauteur le long de la ligne rouge sur le patch est affiché sous l’image. La bicouche partielle permet de mesurer l’épaisseur du SLM, représentée par les lignes pointillées noires dans le profil de hauteur. Notez que l’épaisseur mesurée incorpore également une couche d’eau de 1-2 nm entre la membrane et le disque de mica⁵⁰. Cette figure a été adaptée de Khadka et ^al.49 avec la permission d’Elsevier. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Préparation des échantillons
Pour la nanoindentation dans l’air, les méthodes de préparation courantes comprennent la cryosectionnement (p. ex., échantillons de tissus), le broyage et/ou le polissage suivi d’un ultramicrotoming (p. ex., échantillons biologiques incorporés dans la résine), le broyage ionique ou la préparation par faisceau d’ions focalisés (p. ex. échantillons semi-conducteurs, poreux ou de dureté mixte ne se prêtant pas au polissage), le polissage mécanique ou électrochimique (p. ex. alliages métalliques) ou le dépôt de couches minces (p. ex., dépôt chimique en phase vapeur, épitaxie par faisceau moléculaire). L’objectif est de créer un échantillon avec une rugosité de surface minimale (idéalement à l’échelle nm, ≤0,1x la profondeur d’indentation prévue). Avec bon nombre des méthodes précédentes, l’échantillon peut devoir être ensuite rincé et/ou soniqué dans un solvant filtré de haute pureté (p. ex. qualité CLHP) et séché avec de l’azote (_N2) de très haute pureté (99,999 %) pour éliminer les débris particulaires. Alternativement, les flocons (par exemple, les matériaux 2D) ou les particules (par exemple, les nanoparticules ou les microcapsules) peuvent être enduits d’essorage ou coulés à partir de solutions préparées à l’aide de solvants filtrés de haute pureté. Dans ce cas, l’objectif est d’obtenir une densité de surface qui produit plusieurs flocons ou particules qui ne se chevauchent pas dans le champ de vision dans n’importe quelle zone choisie au hasard sur l’échantillon. Pour la nanoindentation dans un fluide (souvent utilisée pour les échantillons biologiques nécessitant une solution tampon pour rester viable), le dépôt ou la préparation d’échantillons sur un substrat lisse (rugosité de surface à l’échelle nanométrique) (p. ex. lame de microscope, boîte de Petri ou mica muscovite fraîchement clivé) est nécessaire^46,47,49.

Considérations relatives à la sélection des sondes
Le choix d’une sonde appropriée est de la plus haute importance pour l’analyse quantitative des courbes F-D, car l’interaction pointe-échantillon est la propriété fondamentale mesurée dans la nanoindentation en porte-à-faux. Les questions suivantes sont particulièrement importantes lors du choix d’une sonde pour une expérience donnée. Quelle est la rugosité de surface attendue (ou mesurée) de l’échantillon et la plage de modules d’élasticité? Les échantillons à forte rugosité peuvent entraîner une usure accélérée par rapport aux échantillons plus lisses en raison des forces latérales accrues présentes sur la pointe lors du suivi des caractéristiques abruptes, ainsi que d’augmenter la probabilité d’événements de rupture de pointe⁵³. De même, plus l’échantillon est dur, plus il portera rapidement la pointe de la sonde. De plus, combien d’images et/ou de nanoindents sont nécessaires ? Avec moins d’imagerie et d’indentation, on peut s’attendre à moins d’usure des pointes. Comme décrit plus en détail ci-dessous, l’usure des pointes peut être réduite en utilisant des revêtements en carbone de type diamant (DLC) ou pratiquement éliminée en utilisant des sondes à pointe diamantée (le coût élevé d’acquisition étant compensé au fil du temps par la durée de vie presque infinie de la sonde).

Une autre considération dans le choix d’une sonde appropriée est la taille des caractéristiques d’intérêt. Pour la nanoindentation, il est souvent préférable d’utiliser la plus grande taille de pointe possible tout en conservant la résolution spatiale nécessaire pour le ou les échantillons en question et le contenu d’information souhaité, car les pointes plus grandes sont moins susceptibles de subir des changements soudains de géométrie de la pointe en raison d’une rupture et présenteront également des taux d’usure plus faibles⁵⁴. Il est également important de déterminer s’il existe d’autres méthodes AFM à co-localiser avec la nanoindentation, telles que l’AFM^{conductrice 55}, la microscopie à force de sonde Kelvin (KPFM)⁵⁶ ou la microscopie à force magnétique (MFM)⁵⁷. Si des métrologies supplémentaires comme celles-ci doivent être utilisées, la pointe de la sonde peut avoir besoin d’être électriquement conductrice ou magnétique, ce qui aura un impact sur la composition du matériau et donc sur une foule de propriétés, y compris la dureté, la résistance à l’usure et le rayon de la pointe. De même, si l’indentation doit être effectuée dans un fluide, la composition du revêtement arrière réfléchissant de la sonde (le cas échéant) est une autre considération importante, car elle doit être résistante à la corrosion (par exemple, un revêtement arrière Au est courant pour les sondes fluides). Enfin, et c’est peut-être le plus important, la constante de ressort du porte-à-faux de la sonde doit être adaptée à la plage attendue de modules élastiques à mesurer. Si la constante du ressort ne correspond pas bien au module d’échantillonnage, l’un des deux cas suivants peut se produire. Si le porte-à-faux est trop rigide, peu ou pas de déviation sera mesurée et la caractérisation deviendra impossible; A l’inverse, si le porte-à-faux est trop mou, il ne pourra pas déformer suffisamment l’échantillon pour mesurer ses propriétés mécaniques.

Usure des pointes
L’usure peut être définie de nombreuses façons; pour la discussion de l’usure de la pointe de sonde AFM ici, elle sera définie comme tout changement de topographie de surface de la pointe de la sonde dû à une déformation plastique sans aucune perte de matériau, ainsi que tout enlèvement de matériau de la surface dû à des interactions physiques⁵⁸. Dans un sens plus large, l’usure peut également impliquer des réactions chimiques telles que l’oxydation et l’hydratation. Dans les applications AFM normales, la résolution spatiale latérale est généralement limitée par le rayon de pointe⁵⁹, et l’interaction pointe-échantillon est la principale propriété mesurée. Étant donné que le rayon de la pointe est un paramètre clé dans la modélisation de la mécanique de contact du système d’échantillonnage de pointe et dans la détermination ultérieure des propriétés mécaniques, l’usure de la pointe est particulièrement préoccupante lors de la réalisation d’expériences de nanoindentation et constitue une limitation clé pour l’interprétation précise des résultats de nanoindentation⁵³. En raison de la nature normalement graduelle de l’usure de la pointe (à l’exception des ruptures de pointe), il n’est pas possible de quantifier l’usure de la pointe due à un seul cycle de nanoindentation (c.-à-d. rampe). De plus, le mouvement perpendiculaire de la pointe de la sonde par rapport à l’échantillon en nanoindentation (en excluant l’imagerie basée sur la courbe de force rapide) se prête à réduire le taux d’usure, car le mode primaire d’usure de la pointe est généralement les forces de cisaillement se développant pendant les modes de balayage⁶⁰. En tant que tel, la principale source d’usure de la pointe dans les expériences de nanoindentation est toute imagerie effectuée après l’étalonnage initial de la sonde (en particulier, les mesures de sensibilité à la déviation et du rayon de la pointe) mais avant la nanoindentation. Il est donc recommandé que si des sondes de silicium ou de nitrure de silicium sont utilisées, le rayon de la pointe soit vérifié avant et après chaque expérience afin de surveiller et de tenir compte de toute usure de la pointe à l’aide de l’une des méthodes décrites ci-dessus (p. ex., analyse MEB ou BTR).

Matériaux de la sonde
Carbone de type diamant (DLC)
Grâce à l’utilisation d’embouts de sonde revêtus de DLC ou de pointes en diamant, l’usure des pointes peut être considérablement réduite ou complètement annulée⁵³. La résistance accrue à l’usure de ces matériaux de pointe alternatifs est très attrayante pour la mesure des propriétés mécaniques, en particulier des matériaux très rigides. Il a été démontré que les pointes de sonde DLC peuvent montrer une résistance à l’usure 1 600 fois supérieure à celle des pointes de sonde en silicium normales⁵⁴. Cette augmentation spectaculaire de la résistance à l’usure peut être attribuée à plusieurs facteurs. Premièrement, les liaisons présentes dans le DLC (C-C et C = C) et son interface avec le silicium (Si-O, Si-C) sont parmi les liaisons les plus fortes de toutes les paires élémentaires, et beaucoup plus fortes que les liaisons Si-Si présentes dans les pointes de silicium. Le DLC a également pour effet de diminuer le frottement, ce qui réduit les contraintes de cisaillement à l’intérieur de la pointe, réduisant ainsi l’usure. De plus, la chimie de surface DLC est différente de celle d’une pointe en silicium, car les pointes en silicium peuvent subir une gravure tribochimique dans des conditions d’humidité ambiante, alors que les pointes DLC ne le font pas (ou du moins pas de manière significative par rapport au mode d’usure primaire)⁵⁴. Le principal inconvénient des embouts revêtus de DLC (au-delà de l’augmentation du prix par rapport aux embouts en silicium non revêtus standard) est l’augmentation du rayon de la pointe due au revêtement lui-même. La plupart des rayons d’extrémité de sonde DLC sont de ≥30 nm, tandis que les pointes non revêtues de DLC peuvent atteindre de manière fiable 1-2 nm dans un rayon⁶¹. Cependant, un rayon de pointe plus grand peut souvent être souhaitable pour les expériences de nanoindentation afin de réduire les erreurs dans les mesures de propriété, car les écarts à l’échelle nanométrique entre la fonction de profondeur de zone idéale et la fonction de profondeur de surface réelle, en raison de défauts ou d’aspérités de sonde, affecteront de manière disproportionnée les mesures effectuées avec des sondes de plus petit rayon en raison de l’erreur relative plus importante. En outre, malgré sa résistance supérieure à l’usure, le revêtement DLC peut éventuellement s’user par endroits, entraînant une usure différentielle entre le noyau de silicium exposé et le revêtement DLC restant. Malheureusement, la résistance à l’usure du revêtement DLC peut également être limitée par l’adhérence du revêtement à la pointe en silicium plutôt que par la dureté réelle du revêtement seul.

Diamant
Le diamant est bien connu comme l’un des matériaux les plus durs et les plus résistants à l’usure sur Terre. Néanmoins, il a été démontré qu’une usure importante peut encore se produire dans les pointes de diamant lors de l’utilisation de forces importantes (60 μN) dans une tentative délibérée d’explorer l’usure de la pointe⁶². Inversement, dans les scénarios normaux de nanoindentation et d’imagerie où les forces exercées sur la pointe sont beaucoup moins importantes, il n’y a pas eu d’études rigoureuses sur l’usure de la pointe du diamant. Cependant, comme le montre la figure 8E, F, la modélisation BTR de la même pointe de sonde diamantée dans des conditions identiques sur le même échantillon de caractérisation de la pointe à 6 mois d’intervalle a généré des modèles de forme de pointe pratiquement impossibles à distinguer (c.-à-d. aucune preuve perceptible d’usure). Entre la première et la deuxième image BTR, la sonde a été utilisée pour effectuer des milliers de nanoindents et a subi des centaines de millions d’interactions pointe-échantillon tout en imageant une variété de matériaux rigides (E > 15 GPa), y compris le bois (pin loblolly), le schiste, le graphite pyrolytique hautement ordonné (HOPG) et divers films minces de graphène. De manière significative, le rayon de pointe estimé a changé de ~1 nm entre les deux images de la figure 8E,F, ce qui correspond bien à l’erreur⁶³ de la méthode BTR. Bien qu’il ne s’agisse pas d’une étude complète, cette comparaison démontre l’excellente durabilité d’une sonde diamantée dans des conditions normales de nanoindentation expérimentale (et même d’imagerie). Les principaux inconvénients associés à l’utilisation de pointes en diamant (au-delà du coût initial élevé) sont l’augmentation du rayon de la pointe et, à certains égards plus préoccupants, le faible rapport d’aspect de la géométrie des coins de cube de la plupart des pointes de diamant disponibles dans le commerce. La figure 11A,B présente côte à côte, des images comparatives AFM de la même zone d’un échantillon de schiste de Bakken acquis avec une sonde en silicium pointue avec un rayon nominal de pointe de 8 nm et un demi-angle moyen de ~19° par rapport à une sonde diamant avec un rayon nominal de pointe de 40 nm et un angle latéral moyen de 47°. Lorsque les zones agrandies sont comparées (Figure 11C,D et Figure 11E,F), il est évident que la sonde de pointe diamantée est incapable de résoudre et de suivre avec précision les caractéristiques plus raides (rapport d’aspect plus élevé) dans l’image. Au lieu de cela, lorsque des caractéristiques abruptes sont présentes, la paroi latérale de la pointe entre en contact avec le bord supérieur et le système AFM suit essentiellement la paroi latérale de la sonde jusqu’à ce que l’extrémité de la pointe entre à nouveau en contact avec la surface et que le suivi normal reprenne.

Correspondance constante du ressort/module
Comme mentionné ci-dessus, la constante de ressort du porte-à-faux de la sonde doit être adaptée à la plage attendue de modules élastiques à mesurer. Pour faciliter le choix d’une sonde appropriée, le tableau 3 présente les constantes de ressort cantilever nominales approximatives suggérées adaptées à de larges gammes sélectionnées de modules élastiques d’échantillon attendus allant de quelques MPa à 100 GPa dans le cas de pointes de sonde de ~30-40 nm de rayon souvent utilisées pour la nanoindentation⁵². Des sondes à constante de ressort inférieure (k < 0,1 N/m) sont disponibles pour des matériaux encore plus mous (gamme kPa) tels que les cellules.

Constante du ressort (N/m)	Plage de modules d’échantillonnage attendue
0.25	≤ 15 MPa
5	5 – 500 MPa
40	200 – 8 000 (0,2 – 8 GPa)
200	1 000 – 50 000 (1 – 50 GPa)
450	10 000 – 100 000 (10 – 100 GPa)

Tableau 3 : Constantes de ressort de sonde idéales pour mesurer différentes plages de modules. Constantes de ressort nominales de sonde approximatives pour une mesure optimale des modules élastiques sur des plages variables de quelques MPa à 100 GPa, en supposant un rayon de sonde typique de ~30-40 nm⁵².

En plus de la constante de ressort, dans le cas particulier des matériaux biologiques, le rayon de pointe et les forces appliquées lors de l’imagerie et de la nanoindentation doivent être soigneusement examinés pour éviter les dommages. Dans l’exemple d’application impliquant la mesure des propriétés mécaniques des bicouches lipidiques contenant du cholestérol, présenté dans la section des résultats représentatifs, une pointe relativement tranchante (10 nm) a été spécifiquement utilisée pour l’analyse de la force de percée dans les bicouches lipidiques. En revanche, si le retour sur investissement du matériau est suffisamment important (p. ex., comme c’est le cas pour les cellules et les noyaux cellulaires) et que le potentiel de ponction suscite des inquiétudes, des pointes hémisphériques plus grandes à l’échelle du micron, comme celles utilisées dans les mesures de rigidité sur les noyaux MSC décrites dans l’un des exemples d’application de la section des résultats représentatifs, sont idéales et fournissent d’excellents résultats pour les noyaux mous, échantillons fragiles tels que des cellules vivantes et des noyaux isolés. Kain et al. présentent une discussion approfondie sur la façon de choisir la combinaison optimale du rayon de la sonde et de la constante du ressort pour obtenir la sensibilité de mesure la plus élevée possible pour de tels échantillons⁶⁴.

Calibrage de la sonde
Sensibilité à la déviation
La sensibilité à la déviation relie le mouvement du Z-piézo (et donc la déviation du porte-à-faux lors de l’indentation sur un substrat infiniment rigide, en supposant un fonctionnement dans la limite des petites flèches) à un changement mesuré de tension sur le PSD⁶⁵. La sensibilité de déflexion (aussi parfois appelée sensibilité inverse du levier optique [InvOLS]) peut être indiquée en nm/V ou V/nm. Un aperçu des méthodes d’étalonnage de sensibilité à la déviation les plus courantes est fourni ci-dessous.

Contact avec une surface dure
La méthode la plus simple et la plus populaire pour déterminer la sensibilité à la déviation du système laser à rebond de faisceau/sonde AFM/PSD est la méthode⁶⁵ qui porte bien son nom de « contact avec surface dure ». Sa simplicité, sa facilité d’intégration dans les flux de travail des logiciels de contrôle AFM et sa nature in situ ajoutent à l’attrait et à l’utilisation généralisée de la méthode de contact avec surface dure. Pour mettre en œuvre cette méthode, la pointe de la sonde AFM est rampée contre un matériau beaucoup plus rigide que le porte-à-faux. La pente de la partie en contact de la courbe force-déplacement (représentée en volts du signal d’erreur de déviation verticale sur le PSD en fonction du mouvement Z-piézo en nm ou de la tension appliquée) donne alors la sensibilité de déviation (figure 3A). L’utilisation d’un substrat rigide garantit que toute la déflexion mesurée provient de la flexion du porte-à-faux plutôt que d’une convolution de la déformation de l’échantillon et du déplacement du porte-à-faux. Dans le cas des porte-à-faux souples (par exemple, k < 10 N/m), du silicium (E ≈ 170 GPa)²⁷ ou du mica¹⁷ sont des matériaux facilement accessibles et facilement utilisables (ou bien du verre, E≈ 70 GPa, ou du plastique convenablement dur dans le cas de cellules immobilisées sur une lame de microscope ou une boîte de Pétri), tandis que pour les porte-à-faux plus rigides, comme celles utilisées pour certaines expériences de nanoindentation (p. ex., k > 200 N/m; Tableau 3), il peut être nécessaire d’utiliser du saphir (E≈ 345 GPa)^26,66 pour s’assurer qu’aucune déformation de l’échantillon ne se produit. Étant donné que cette méthode dépend de la mesure force-déplacement, le Z-piézo du scanner AFM doit soit utiliser un capteur de hauteur en boucle fermée, soit être bien étalonné (s’il fonctionne en mode boucle ouverte) à l’aide de diverses normes de hauteur. Le plus grand contributeur à l’erreur dans la méthode de contact avec la surface dure est le mouvement de la tache laser sur le porte-à-faux en raison des fluctuations thermiques. Les changements de température du porte-à-faux sont le plus souvent causés par le laser de détection, bien que le chauffage Joule dans l’électronique environnante puisse également y contribuer. Des différences de température globales de 6 °C entre le porte-à-faux et l’air ambiant ont été rapportées, ce qui peut entraîner des décalages ponctuels laser de plusieurs microns⁶⁷. Pour tenir compte de tout échauffement, il est conseillé d’attendre ≥30 minutes après l’alignement initial du spot laser pour permettre au porte-à-faux d’entrer en équilibre thermique avec son environnement pour obtenir les résultats les meilleurs et les plus précis. La moyenne des pentes de l’approche et des courbes de retrait pour chaque mesure de sensibilité tiendra compte de tout frottement de la pointe ou effet de glissement et devrait être adoptée si possible⁶⁸. De plus, la moyenne sur plusieurs mesures de sensibilité aidera à évaluer la fiabilité et la reproductibilité de la mesure. De bonnes mesures de sensibilité devraient entraîner des écarts de ≤1 % et être effectuées à peu près à la même déviation que les nanoindents expérimentaux attendus afin de maximiser l’efficacité de l’étalonnage⁶⁹. Le principal inconvénient de la méthode de contact avec surface dure est que le contact physique nécessaire à l’étalonnage peut potentiellement endommager les pointes fragiles en silicium (par exemple, ternir ou créer des artefacts de pointe tels qu’une double pointe).

Méthode du bruit thermique
La méthode de détermination de la sensibilité au bruit thermique nécessite un étalonnage préalable de la constante du ressort en porte-à-faux et la capacité de mesurer le spectre de bruit thermique du porte-à-faux⁶⁷. La méthode du bruit thermique est souvent intégrée dans le logiciel de contrôle AFM moderne et peut être utilisée en tandem avec la méthode Sader (voir ci-dessous) pour une analyse et un calcul rapides de la constante du ressort et de la sensibilité de déflexion. Cependant, il peut être difficile, voire impossible, d’utiliser la méthode du bruit thermique sur des porte-à-faux plus rigides (k > 10 N/m) en raison de la diminution de l’amplitude des vibrations. De plus, l’incertitude relative rapportée de la méthode du bruit thermique est significativement plus grande, ~20% par rapport à la méthode de contact avec surface dure décrite ci-dessus⁷⁰. Cette technique ne peut être utilisée si la méthode de réglage thermique pour déterminer la constante de ressort décrite ci-dessous est utilisée⁶⁷.

Constante du ressort
L’étalon-or pour mesurer les constantes de ressort en porte-à-faux est la vibrométrie Doppler laser (LDV), et il existe maintenant de nombreuses sondes disponibles dans le commerce qui sont fournies avec des informations d’étalonnage de la constante de ressort dérivées de LDV fournies par le fabricant pour chaque sonde individuelle (voir le tableau des matériaux). Cependant, alors que la mesure précise de la constante de ressort en porte-à-faux est une nécessité absolue pour les mesures nanomécaniques quantitatives, les méthodes pratiques pour le faire dans le laboratoire typique pour les sondes non étalonnées sont très variées et peuvent être quelque peu complexes. Par conséquent, seul un bref aperçu des deux méthodes d’étalonnage constant à ressort sur site les plus courantes est fourni ici, avec une liste de méthodes supplémentaires et des citations de la littérature appropriées à consulter pour plus d’informations.

Méthode de réglage thermique
Probablement la méthode la plus courante disponible dans les AFM commerciaux d’aujourd’hui, la méthode de réglage thermique pour déterminer les constantes de ressort en porte-à-faux est intégrée au logiciel de contrôle de nombreux systèmes. Bien qu’elle ne soit pas idéale pour les porte-à-faux plus rigides (k > 10 N/m) en raison de la détection de déviation en porte-à-faux réduite et de la bande passante électronique limitée, la méthode de réglage thermique est relativement facile à mettre en œuvre et est valable pour une large gamme de géométries de pointe⁷¹. La méthode de réglage thermique utilise la mesure et l’ajustement du spectre de bruit thermique du porte-à-faux, suivi de l’application du théorème d’équipartition pour calculer l’énergie potentielle du porte-à-faux, le porte-à-faux étant généralement modélisé comme un simple oscillateur harmonique⁷². La méthode de réglage thermique présente une erreur de ~5%-10% pour les sondes souples et est applicable à toute forme de porte-à-faux^73,74. Pour de plus amples renseignements, voir les références citées dans cette section.

Méthode Sader
La méthode Sader est une autre méthode souvent intégrée dans le logiciel de contrôle de nombreux AFM modernes^75,76,77. La méthode Sader utilise la charge hydrodynamique subie par un porte-à-faux lorsqu’il vibre dans un milieu fluide (généralement de l’air ou de l’eau) ainsi que les dimensions de la vue en plan et le facteur de qualité du porte-à-faux pour calculer la constante du ressort en porte-à-faux. La méthode Sader conduit à une erreur de ~10%-15% pour la constante de ressort cantilever⁷⁴. Les documents correspondants sur la « méthode originale"76,78, la « méthode générale"⁷⁹, une extension de la méthode générale ^77, et la documentation spécifique à l’instrument peuvent fournir plus de détails.

Autres méthodes
Plusieurs autres méthodes ont été développées et mises en œuvre pour déterminer la constante de ressort des porte-à-faux AFM qui dépassent le cadre de cet article. Bien qu’aucune de ces méthodes ne soit aussi facile à mettre en œuvre ou aussi répandue que les méthodes Sader ou d’étalonnage thermique, elles présentent chacune des avantages et des inconvénients uniques; La littérature citée fournit des détails sur leur application et leur mise en œuvre. En particulier, Sikora fournit une excellente revue de nombreuses méthodes d’étalonnage constant à ressort et est une excellente ressource sur le sujet⁷². Une liste non exhaustive d’autres méthodes pour déterminer les constantes de ressort comprend la vibrométrie Doppler laser (LDV)73,74,80, les dispositifs basés sur des systèmes micro-électriques-mécaniques (MEMS)⁸¹, le porte-à-faux de référence 82,83, la masse ajoutée (dynamique ⁷⁵ et statique ⁸⁴), la balance de précision^85,86, l’actionnement électromagnétique ⁸⁷ et l’analyse par éléments finis (FEA) ^88,89.

Rayon de pointe
Les méthodes courantes pour déterminer le rayon de la pointe comprennent à la fois l’imagerie SEM électronique secondaire et la méthode de reconstruction de la pointe aveugle (BTR).

Analyse SEM
L’imagerie SEM électronique secondaire peut fournir une résolution allant jusqu’à 1 nm, ce qui permet de comparer directement et facilement des images progressives de l’usure. Un inconvénient de l’imagerie MEB est que, comme il n’existe que des outils AFM-SEM combinés hautement expérimentaux⁹⁰, la sonde AFM doit généralement être démontée et transportée vers le MEB pour analyse, ce qui peut prendre beaucoup de temps et potentiellement soumettre la sonde à la contamination. Un autre inconvénient du SEM est que l’image résultante est intrinsèquement une projection 2D de la pointe, sans aucune information 3D quantitative disponible. Il faut veiller à aligner la sonde exactement dans la même orientation à chaque fois pour que les résultats comparatifs soient significatifs, car même de petits changements dans l’angle incident du faisceau d’électrons peuvent modifier la taille et la forme apparentes de la pointe de la sonde. Enfin, l’imagerie MEB peut être affectée par des effets de charge et une contamination par le carbone, qui peuvent brouiller l’image ou provoquer des modifications physiques de la pointe de la sonde, respectivement.

Reconstruction de l’extrémité aveugle
Contrairement au MEB, la méthode BTR est une technique in situ dans laquelle la géométrie de la pointe 3D est modélisée sur la base de l’imagerie d’un échantillon avec de nombreuses caractéristiques nettes (rapport d’aspect élevé) beaucoup plus petites que le rayon de la sonde. Cette méthode fonctionne parce que dans AFM, l’image observée est toujours une convolution de la forme de la pointe de la sonde et de la forme de la caractéristique de l’échantillon, donc en modélisant des caractéristiques extrêmement nettes comme infiniment nettes, la forme de la pointe peut être estimée. Malheureusement, en plus de l’hypothèse de pointes infiniment nettes (c.-à-d. des caractéristiques de surface beaucoup plus petites que le rayon de la pointe), la technique BTR peut être influencée par le bruit d’imagerie et les paramètres de balayage, de sorte que des images comparatives doivent être obtenues en utilisant des paramètres d’imagerie très similaires. De plus, étant donné que plusieurs « images » de la pointe sont utilisées pour reconstruire sa géométrie, un calcul inverse direct de la forme de la pointe est impossible. En raison de sa nature, la méthode BTR n’est pratiquement capable d’informer l’utilisateur que de la limite supérieure de la forme de la pointe⁶³, et le fait d’imager la sonde pour mettre en œuvre la méthode BTR peut entraîner une usure de la pointe (par exemple, ternissement ou écaillage de la pointe de la sonde).

Calibrage relatif
Parfois, une propriété particulière de la sonde ne peut pas être mesurée facilement et avec précision. Par exemple, la constante de ressort des porte-à-faux plus rigides est difficile ou impossible à mesurer avec la méthode de réglage thermique en raison des limitations de bande passante et de déflexion⁹¹. Comme indiqué ci-dessus, il existe d’autres méthodes pour déterminer la constante de ressort, mais comme la méthode de réglage thermique est intégrée dans de nombreux AFM modernes, elle est souvent mise en œuvre pour une utilisation quotidienne simple. De même, la sensibilité à la déviation doit toujours être calibrée avant l’expérimentation pour la conversion du mouvement laser sur le PSD en déviation physique du porte-à-faux de la sonde. En pratique, cependant, la mesure du rayon de la pointe est l’étape d’étalonnage la plus longue et la plus susceptible d’endommager la pointe de la sonde. S’il n’est pas possible de mesurer directement le rayon de la pointe par MEB ou BTR, une procédure d’étalonnage relatif peut être utilisée comme alternative pour déterminer le rayon effectif de la pointe, à condition qu’un échantillon de référence standard avec une rugosité de surface minimale (idéalement atomiquement plat) et un module bien connu proche du module expérimental attendu soit disponible. Des exemples de ces étalons de référence idéaux pour l’étalonnage relatif comprennent le mica muscovite 17,92,93,94,95 et HOPG ^96, mais servent également à mettre en évidence la difficulté d’identifier des étalons de référence appropriés pour des échantillons plus mous avec des modules compris entre kPa et MPa. Pour effectuer un étalonnage relatif, la sensibilité de déflexion doit d’abord être étalonnée comme décrit dans le protocole principal. Deuxièmement, la constante nominale du ressort de la sonde doit être saisie (généralement fournie avec la sonde) ou mesurée par l’une des méthodes décrites ci-dessus. La troisième étape consiste à indenter la surface de l’échantillon de l’étalon de référence du module à l’aide de paramètres appropriés. Enfin, les données recueillies sur la courbe F-D doivent être analysées et le paramètre du rayon de pointe ajusté jusqu’à ce que le module réduit mesuré expérimentalement corresponde au module réduit attendu. Il convient de noter la profondeur de déformation moyenne obtenue sur l’échantillon de référence, car cette profondeur doit être maintenue lors de l’indentation sur l’échantillon expérimental d’intérêt pour que l’étalonnage soit pertinent. Maintenant, une indentation sur l’échantillon d’intérêt peut se produire, en ajustant les paramètres de rampe pour correspondre à la profondeur de déformation obtenue sur le matériau de référence standard de module.

L’un des avantages de la méthode d’étalonnage relatif est qu’elle évite les erreurs accumulées potentielles causées par un étalonnage inexact de la sensibilité de déflexion, de la constante du ressort et du rayon de pointe⁵². De plus, elle est peut-être légèrement plus rapide et moins susceptible d’endommager la sonde que la méthode BTR. Les principaux inconvénients de la méthode d’étalonnage relatif sont: 1) la nécessité d’un échantillon de référence de haute qualité avec une rugosité de surface à l’échelle nm à Angstrom et des propriétés mécaniques bien connues similaires à celles de l’échantillon d’intérêt qui peut être analysé avec la même sonde que l’échantillon expérimental, et 2) la nécessité d’atteindre une profondeur de déformation identique ou très similaire sur les échantillons de référence et expérimental pour que l’étalonnage soit valide. En conséquence, il est préférable de mesurer directement le rayon de la pointe si possible.

Analyse des données
La méthode d’analyse utilisée pour déterminer les propriétés mécaniques de l’échantillon à partir des courbes F-D mesurées est tout aussi importante que la qualité des données de nanoindentation elles-mêmes. Il existe plusieurs théories courantes de la mécanique de contact qui modélisent les relations force-déplacement en fonction d’hypothèses sous-jacentes variables (et donc applicables dans différents scénarios). Ces modèles de mécanique de contact incluent Hertz 97, Sneddon²⁸, JKR (Johnson, Kendall et Roberts)98, DMT (Derjaguin, Muller et Toporov)^35,99, MD (Maugis-Dugdale)100 et MYD (Muller, Yushchenko et Derjaguin)^101,102. Une analyse approfondie et une comparaison de divers modèles de mécanique de contact et de leur application pour l’analyse ont été présentées ailleurs 29,30,103,104. Bien que cela dépasse la portée du présent document, le tableau 4 donne un bref aperçu de certains des modèles de mécanique de contact les plus courants. Il convient de noter en particulier que des modèles plus complexes tels que JKR, DMT et d’autres intègrent les effets de l’adhérence de l’échantillon de pointe 30,35,98,99,100,101,102,103,104^, qui peut être significative et est souvent facilement identifiable par l’apparition d’une déviation négative dans la courbe de force (voir Figure 3). En pratique, le modèle d’analyse choisi est utilisé pour ajuster les données F-D collectées et déterminer les propriétés mécaniques, telles que le module d’élasticité. Pour bien ajuster les données, une base de référence plate est nécessaire pour déterminer le point de contact initial ou un point de contact efficace qui correspond à la partie des données expérimentales présentant la plus grande corrélation avec le modèle.

Théorie	Applicabilité	Hypothèses	Limitations
Hertz	Simple; Souvent utilisé pour les échantillons dans le liquide.	Pas d’adhérence.	Non valide pour les systèmes présentant des forces adhésives.
Derjaguin-Muller-Toporov (DMT)	Rigide avec de petites déformations.	Adhérence à courte portée dans la région de contact et adhérence à longue portée en dehors de la région de contact.	Une géométrie restreinte peut entraîner une sous-estimation de la zone de contact.
Johnson-Kendall-Roberts (JKR)	Doux avec de grandes déformations.	Forces adhésives à courte portée dans la zone de contact uniquement.	Peut sous-estimer la charge due à l’adhérence.
Maugis – Dugdale (MD)	Cette solution générale couvre les autres modèles d’adhésifs.	Interface tip-sample modélisée comme une fissure.	Solution analytique impliquant des équations paramétriques.

Tableau 4 : Modèles courants de mécanique de contact. Sélection de modèles de mécanismes de contact communs avec applicabilité, hypothèses et limites notées.

L’application pratique des modèles mentionnés ci-dessus pour l’analyse des courbes F-D nécessite l’utilisation d’un logiciel informatique pour permettre le traitement par lots à grande échelle de milliers ou de millions de courbes en peu de temps et effectuer une analyse statistique sur les résultats. Le code écrit en interne est souvent utilisé dans l’analyse des données F-D, et divers fabricants AFM fournissent également des progiciels. Cependant, en raison de sa nature open-source, de sa facilité d’utilisation et de ses informations supplémentaires détaillées, les auteurs recommandent l’utilisation d’AtomicJ²³. Le programme permet une analyse simple et précise des données F-D en utilisant l’une des théories décrites ci-dessus ainsi que plusieurs autres. Parce que le code est open source, il est facile à manipuler et à personnaliser pour des cas d’utilisation spécifiques sans avoir besoin de construire du code complexe à partir de zéro. Reportez-vous à Hermanowicz et ^al.23 pour obtenir des informations détaillées sur le progiciel AtomicJ.

En conclusion, grâce à un étalonnage minutieux de la sonde, la surface de contact et la force appliquée par une pointe de sonde AFM à une surface d’échantillon peuvent être quantifiées pour permettre la détermination des propriétés mécaniques à l’échelle nanométrique, en particulier le module d’élasticité. Un protocole généralisé mettant en évidence les meilleures pratiques pour mettre en œuvre avec succès la nanoindentation à base de porte-à-faux AFM dans l’air ou le fluide sur des échantillons mous et durs, avec des modules élastiques allant de kPa à GPa, a été présenté avec des exemples représentatifs fournis. Des considérations importantes telles que la sélection de la sonde (y compris la rugosité de la surface de l’échantillon, la taille des caractéristiques, le rapport d’aspect de la sonde et l’usure de la pointe), l’étalonnage de la sonde et l’analyse des données (y compris les modèles de mécanique de contact et les statistiques de mesure) ont été discutées. Enfin, la co-localisation de cartes nanomécaniques dérivées de l’AFM avec d’autres techniques de caractérisation fournissant des informations de composition telles que MEB / EDS a été démontrée, ainsi qu’un exemple de mesure d’une propriété nanomécanique autre que le module d’élasticité (c.-à-d. la force de rupture de la bicouche lipidique) via la nanoindentation en porte-à-faux AFM pour fournir des exemples d’applications synergiques supplémentaires de la technique. Pris ensemble, les exemples et la discussion fournis ici devraient fournir un point d’entrée pour les chercheurs qui cherchent à utiliser la nanoindentation en porte-à-faux AFM pour mesurer les propriétés mécaniques de pratiquement n’importe quel type d’échantillon.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Atomic force microscope	Bruker	Dimension Icon	Uses Nanoscope control software, including PeakForce Quantitative Nanomechanical Mapping (PF-QNM), FastForce Volume (FFV), and Point-and-Shoot Ramping experimental workspaces
AtomicJ	American Institute of Physics	https://doi.org/10.1063/1.4881683	Flexible, powerful, free open source Java-based force curve analysis software package. Supports numerous contact mechanic models, such as Hertz, Sneddon DMT, JKR, Maugis, and cone or pyramid (including blunt and truncated). Also includes a variety of initial contact point estimation methods to choose from. Supports batch processing of data and subsequent statistical analysis (e.g., averages, standard deviations, histograms, goodness of fit, etc.). Literature citation is: P. Hermanowicz, M. Sarna, K. Burda, and H. Gabry, “AtomicJ: An open source software for analysis of force curves” Rev. Sci. Instrum. 85: 063703 (2014), https://doi.org/10.1063/1.4881683
Buffer solution (PBS)	Fisher Chemical (NaCl), Sigma Aldrich (KCl), Fisher BioReagents (Na2HPO4 and KH2PO4)	S271 (>99% purity NaCl), P9541 (>99% purity KCl), BP332(>99% purity Na2HPO4), BP362 (>99% purity KH2PO4)	Phosphate buffered saline (PBS) was prepared in the laboratory as an aqueous solution consisting of 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, and 1.8 mM KH2PO4 dissolved in ultrapure water. Reagents were measured out using an analytical balance, and glassware was cleaned with soap and water followed by autoclaving immediately prior to use.
Chloroform
Diamond tip AFM probe	Bruker	PDNISP	Pre-mounted factory-calibrated cube corner diamond (E = 1140 GPa) tip AFM probe (nominal R = 40 nm) with a stainless steel cantilever (nominal k = 225 N/m, f0 = 50 kHz). Spring constant is measured at the factory (k = 256 N/m for the probe, Serial #13435414, used here) and calibration data (including AFM images of indents showing probe geometry) is provided with the probe.
Diamond ultramicrotome blade	Diatome	Ultra 35°	2.1 mm width. Also used a standard glass blade for intial rough cut of sample surface before transitioning to diamond blade for final surface preparation
Epoxy	Gorilla Glue	26853-31-6	Epoxy resin and hardner were mixed in a 1:1 ratio, a small drop was placed on a stainless steel sample puck (Ted Pella), and V1 grade muscovite mica (Ted Pella) was attached to create an atomically flat surface for preparation of phospholipid membranes.
Ethanol
LR white resin, medium grade (catalyzed)	Electron Microscopy Sciences	14381	500 mL bottle, Lot #150629
Mesenchymal stem cells (MSCs)	N/A	N/A	MSCs for nanomechanical studies were primary cells harvested from 8-10 week old male C57BL/6 mice as described in Goelzer, M. et al. "Lamin A/C Is Dispensable to Mechanical Repression of Adipogenesis" Int J Mol Sci 22: 6580 (2021) doi:10.3390/ijms22126580 and Peister, A. et al. "Adult stem cells from bone marrow (MSCs) isolated from different strains of inbred mice vary in surface epitopes, rates of proliferation, and differentiation potential" Blood 103: 1662-1668 (2004), doi:10.1182/blood-2003-09-3070.
Modulus standards	Bruker	PFQNM-SMPKIT-12M	Used HOPG (E = 18 GPa) and PS (E = 2.7 GPa). Also contains 2x PDMS (Tack 0, E = 2.5 MPa; Tack 4, E = 3.5 MPa), PS-LDPE (E = 2.0/0.2 GPa), fused silica (E = 72.9 GPa), sapphire (E - 345 GPa), and tip characterization (titanium roughness) sample. All samples come pre-mounted on a 12 mm diameter steel disc (sample puck).
Muscovite mica	Ted Pella	50-12	12 mm diameter, V1 grade muscovite mica
Nanscope Analysis	Bruker	Version 2.0	Free AFM image processing and analysis software package, but designed for, and proprietary/limited to Bruker AFMs; similar functionality is available from free, platform-independent AFM image processing and analysis software packages such as Gwyddion, WSxM, and others. Has built-in capabilities for force curve analysis, but AtomicJ is more flexible/full featured (e.g., more built-in contact mechanics models to choose from, statistical analysis of force curve fitting results, etc.) for force curve analysis and handles batch processing of force curves.
Phospholipids: POPC, Cholesterol (ovine)	Avanti Polar Lipids	POPC: CAS # 26853-31-6, Cholesterol: CAS # 57-88-5	POPC lipid dissolved in chloroform (25 mg/mL) was obtained from vendor and used without further purification. Cholesterol powder from the same vendor was dissolved in chloroform (20 mg/mL).
Probe holder (fluid, lipid bilayers)	Bruker	MTFML-V2	Specific to the particular AFM used; MTFML-V2 is a glass probe holder for scanning in fluid on a MultiMode AFM.
Probe holder (fluid, MSCs)	Bruker	FastScan Bio Z-scanner	Used with Dimension FastScan head (XY flexure scanners). Serial number MXYPOM5-1B154.
Probe holder (standard, ambient)	Bruker	DAFMCH	Specific to the particular AFM used; DAFMCH is the standard contact and tapping mode probe holder for the Dimension Icon AFM, suitable for nanoindentation (PF-QNM, FFV, and point-and-shoot ramping)
Sample Puck	Ted Pella	16218	Product number is for 15 mm diameter stainless steel sample puck. Also available in 6 mm, 10 mm, 12 mm, and 20 mm diameters at https://www.tedpella.com/AFM_html/AFM.aspx#anchor842459
Sapphire substrate	Bruker	PFQNM-SMPKIT-12M	Extremely hard surface (E = 345 GPa) for measuring deflection sensitivity of probes (want all of the deflection to come from the probe, not the substrate). Part of the PF-QNM/modulus standards kit.
Scanning electron microscope	Hitachi	S-3400N-II	Located at Boise State. Used to perform co-localized SEM/EDS on all samples except additively manufactured (AM) Ti-6Al-4V.
Silicon AFM probes (standard)	NuNano	Scout 350	Standard tapping mode silicon probe with reflective aluminum backside coating; k = 42 N/m (nominal), f0 = 350 kHz. Nominal R = 5 nm. Also available uncoated or with reflective gold backside coating. Probes with similar specifications are available from other manufacturers (e.g., Bruker TESPA-V2).
Silicon AFM probes (stiff)	Bruker	RTESPA-525, RTESPA-525-30	Rotated tip etched silicon probes with reflective aluminum backside coating; k = 200 N/m (nominal), f0 = 525 kHz. Nominal R = 8 nm for RTESPA-525, R = 30 nm for RTESPA-525-30. Spring constant of each RTESPA-525-30 is measured individually at the factory via laser Doppler vibrometry and supplied with the probe.
Silicon carbide grit paper (abrasive discs)	Allied	50-10005	120 grit
Silicon nitride AFM probes (soft, large radius hemispherical tip)	Bruker	MLCT-SPH-5UM, MLCT-SPH-5UM-DC	Also MLCT-SPH-1UM-DC. New product line of factory-calibrated (probe radius and spring constants of all cantilevers) large radius (R = 1 or 5 mm) hemispherical tip (at the end of a 23 mm long cylindrical shaft) probes. DC = drift compensation coating. 6 cantilevers/probe (A-F). Nominal spring constants: A, k = 0.07 N/m; B, k = 0.02 N/m; C, k = 0.01 N/m; D, k = 0.03 N/m; E, k = 0.1 N/m; F, k = 0.6 N/m.
Silicon nitride AFM probes (soft, medium sharp tip)	Bruker	DNP	4 cantilevers/probe (A-d). Nominal spring constants: A, k = 0.35 N/m; B, k = 0.12 N/m; C, k = 0.24 N/m; D, k = 0.06 N/m. Nominal radii of curvature, R = 10 nm.
Silicon nitride AFM probes (soft, sharp tip)	Bruker	ScanAsyst-Air	Nominal values: resonance frequency, f0 = 70 kHz; spring constant, k = 0.4 N/m; radius of curvature, R = 2 nm. Designed for force curve based AFM imaging.
Superglue	Henkel	Loctite 495	Cyanoacrylate based instant adhesive. Lots of roughly equivalent products are readily available.
Syringe pump	New Era Pump Systems	NE1000US	One channel syringe pump system with infusion and withdrawal capacity
Tip characterization standard	Bruker	PFQNM-SMPKIT-12M	Titanium (Ti) roughness standard. Part of the PF-QNM/modulus standards kit.
Ultrahigh purity nitrogen (UHP N2), 99.999%	Norco	SPG TUHPNI - T	T size compressed gas cylinder of ultrahigh purity (99.999%) nitrogen for drying samples
Ultramicrotome	Leica	EM UC6	Equipped with a glass blade (standard, for intial sample preparation) and a diamond blade (for final preparation)
Ultrapure water	Thermo Fisher	Barnstead Nanopure Model 7146	Model has been discontinued, but equivalent products are available. Produces ≥18.2 MΩ*cm ultrapure water with 1-5 ppb TOC (total organic content), per inline UV monitoring. Includes 0.2 µm particulate filter, ion exchange columns, and UV oxidation chamber.
Variable Speed Grinder	Buehler	EcoMet 3000	Used with silicon carbide grit papers during hand polishing.
Vibration isolation table (active)	Herzan	TS-140	Used with Bruker MultiMode AFM. Sits on a TMC 65-531 vibration isolation table. Bruker Dimension Icon AFM utilizes strictly passive vibration isolation (comes from manufacturer with custom acoustic hood, air table, and granite slab).
Vibration isolation table (passive)	TMC	65-531	35" x 30" vibration isolation table with optional air damping (disabled). Used with Bruker MultiMode AFM. Herzan TS-140 "Table Stable" active vibration control table is located on top.