Atomic Force Microscopy Cantilever-Based Nanoindentation: Mekaniske egenskabsmålinger på nanoskala i luft og væske

Summary

Kvantificering af kontaktområdet og kraften, der påføres af et atomkraftmikroskop (AFM) sondespids på en prøveoverflade, muliggør bestemmelse af mekaniske egenskaber i nanoskala. Bedste praksis for implementering af AFM-udkragningsbaseret nanoindrykning i luft eller væske på bløde og hårde prøver til måling af elastisk modul eller andre nanomekaniske egenskaber diskuteres.

Abstract

Et atomkraftmikroskop (AFM) måler fundamentalt interaktionen mellem en nanoskala AFM-sondespids og prøveoverfladen. Hvis den kraft, der påføres af sondespidsen og dens kontaktområde med prøven, kan kvantificeres, er det muligt at bestemme nanoskalaens mekaniske egenskaber (f.eks. elastik eller Youngs modul) af overfladen, der undersøges. En detaljeret procedure til udførelse af kvantitative AFM cantilever-baserede nanoindrykningseksperimenter gives her med repræsentative eksempler på, hvordan teknikken kan anvendes til at bestemme de elastiske moduli af en lang række prøvetyper, lige fra kPa til GPa. Disse omfatter levende mesenkymale stamceller (MSC'er) og kerner i fysiologisk buffer, harpiksindlejrede dehydrerede loblolly fyrretræstværsnit og Bakken-skifer af varierende sammensætning.

Derudover anvendes AFM-udkragningsbaseret nanoindrykning til at undersøge brudstyrken (dvs. gennembrudskraften) af phospholipid-dobbeltlag. Vigtige praktiske overvejelser såsom metodevalg og udvikling, sondevalg og kalibrering, identifikation af interesseområde, prøveheterogenitet, funktionsstørrelse og billedformat, spidsslid, overfladeruhed og dataanalyse og målestatistikker diskuteres for at hjælpe med korrekt implementering af teknikken. Endelig demonstreres samlokalisering af AFM-afledte nanomekaniske kort med elektronmikroskopiteknikker, der giver yderligere information om elementær sammensætning.

Introduction

Forståelse af materialers mekaniske egenskaber er en af de mest grundlæggende og væsentlige opgaver inden for teknik. Til analyse af bulkmaterialeegenskaber er der adskillige metoder til rådighed til at karakterisere de mekaniske egenskaber ved materialesystemer, herunder træktest¹, kompressionstest² og tre- eller firepunkts bøjningstest (bøjning)³. Mens disse mikroskalatest kan give uvurderlig information om bulkmaterialeegenskaber, udføres de generelt til fiasko og er derfor destruktive. Derudover mangler de den rumlige opløsning, der er nødvendig for nøjagtigt at undersøge mikro- og nanoskalaegenskaberne for mange materialesystemer, der er af interesse i dag, såsom tyndfilm, biologiske materialer og nanokompositter. For at begynde at løse nogle af problemerne med storskala mekanisk testning, hovedsageligt dens destruktive karakter, blev mikrohårdhedstest vedtaget fra mineralogi. Hårdhed er et mål for et materiales modstand mod plastisk deformation under specifikke forhold. Generelt bruger mikrohardhedstest en stiv sonde, normalt lavet af hærdet stål eller diamant, til at indrykke i et materiale. Den resulterende indrykningsdybde og / eller areal kan derefter bruges til at bestemme hårdheden. Flere metoder er blevet udviklet, herunder Vickers⁴, Knoop⁵ og Brinell⁶ hårdhed; Hver giver et mål for mikroskala materialehårdhed, men under forskellige betingelser og definitioner, og producerer som sådan kun data, der kan sammenlignes med test udført under de samme betingelser.

Instrumenteret nanoindrykning blev udviklet for at forbedre de relative værdier opnået via de forskellige mikrohårdhedstestmetoder, forbedre den rumlige opløsning, der er mulig til analyse af mekaniske egenskaber, og muliggøre analyse af tynde film. Det er vigtigt, at ved at bruge metoden, der først blev udviklet af Oliver og Pharr⁷, kan elastikken eller Youngs modul, E, af et prøvemateriale bestemmes via instrumenteret nanoindrykning. Ved at anvende en Berkovich tresidet pyramideformet nanoindentersonde (hvis ideelle spidsområdefunktion matcher Vickers firesidede pyramidesonde)⁸, kan der desuden foretages direkte sammenligning mellem nanoskala og mere traditionelle mikroskala hårdhedsmålinger. Med AFM's voksende popularitet begyndte AFM-udkragningsbaseret nanoindrykning også at få opmærksomhed, især til måling af blødere materialers mekaniske egenskaber. Som et resultat, som vist skematisk i figur 1, er de to mest almindeligt anvendte teknikker i dag til at forhøre og kvantificere mekaniske egenskaber i nanoskala instrumenteret nanoindrykning (figur 1A) og AFM-udkragningsbaseret nanoindrykning (figur 1B)⁹, hvoraf sidstnævnte er fokus for dette arbejde.

Figur 1: Sammenligning af instrumenterede og AFM-udkragningsbaserede nanoindrykningssystemer. Skematiske diagrammer, der viser typiske systemer til udførelse af (A) instrumenteret nanoindrykning og (B) AFM-udkragningsbaseret nanoindrykning. Dette tal blev ændret fra Qian et ^al.51. Forkortelse: AFM = atomkraftmikroskopi. Klik her for at se en større version af denne figur.

Både instrumenteret og AFM-udkragningsbaseret nanoindrykning anvender en stiv sonde til at deformere en prøveoverflade af interesse og overvåge den resulterende kraft og forskydning som en funktion af tiden. Typisk specificeres enten den ønskede belastnings- (dvs. kraft) eller (Z-piezo) forskydningsprofil af brugeren via softwaregrænsefladen og styres direkte af instrumentet, mens den anden parameter måles. Den mekaniske egenskab, der oftest opnås ved nanoindrykningseksperimenter, er det elastiske modul (E), også kaldet Youngs modul, som har trykenheder. Et materiales elastiske modul er en grundlæggende egenskab i forbindelse med bindingsstivheden og defineres som forholdet mellem træk- eller trykspænding (σ, den påførte kraft pr. arealenhed) og aksial belastning (ε, den proportionale deformation langs indrykningsaksen) under elastisk (dvs. reversibel eller midlertidig) deformation før plastisk deformation (ligning [1]):

(1)

Det skal bemærkes, at fordi mange materialer (især biologiske væv) faktisk er viskoelastiske, består det (dynamiske eller komplekse) modul i virkeligheden af både elastiske (opbevaring, i fase) og viskøse (tab, ud af fase) komponenter. I praksis er det, der måles i et nanoindrykningseksperiment, det reducerede modul, E *, som er relateret til det sande prøvemodul af interesse, E, som vist i ligning (2):

(2)

Hvor _E-spids og _ν-spids er henholdsvis det elastiske modul og Poissons forhold mellem nanoindenterspidsen, og ν er det estimerede Poissons forhold mellem prøven. Poissons forhold er det negative forhold mellem den tværgående og aksiale stamme og angiver derfor graden af tværgående forlængelse af en prøve, når den udsættes for aksial belastning (f.eks. under nanoindrykningsbelastning), som vist i ligning (3):

(3)

Omdannelsen fra reduceret til faktisk modul er nødvendig, fordi a) noget af den aksiale belastning, der tilføres af indenterspidsen, kan omdannes til tværgående belastning (dvs. prøven kan deformeres via ekspansion eller sammentrækning vinkelret på belastningsretningen), og b) indenterspidsen ikke er uendelig hård, og således resulterer handlingen med at indrykke prøven i en vis (lille) deformation af spidsen. Bemærk, at i det tilfælde, hvor E-spidsen >> E (dvs. indenterspidsen er meget hårdere end prøven, hvilket ofte er sandt, når man bruger en diamantsonde), forenkles forholdet mellem det reducerede og faktiske prøvemodul meget til E ≈ E * (1 - v²). Mens instrumenteret nanoindrykning er overlegen med hensyn til nøjagtig kraftkarakterisering og dynamisk område, er AFM-udkragningsbaseret nanoindrykning hurtigere, giver størrelsesordener større kraft og forskydningsfølsomhed, muliggør billeddannelse med højere opløsning og forbedret indrykningslokalisering og kan samtidig undersøge magnetiske og elektriske egenskaber i nanoskala⁹. Især er AFM-udkragningsbaseret nanoindrykning overlegen til kvantificering af mekaniske egenskaber på nanoskala af bløde materialer (f.eks. polymerer, geler, lipiddobbeltlag og celler eller andre biologiske materialer), ekstremt tynde (sub-μm) film (hvor substrateffekter kan komme i spil afhængigt af indrykningsdybde)^10,11 og suspenderede todimensionelle (2D) materialer^12,13,14 såsom grafen ^15,16, glimmer¹⁷, sekskantet bornitrid (h-BN)¹⁸ eller overgangsmetaldichalcogenider (TMDC'er; f.eks. MoS₂)¹⁹. Dette skyldes dets udsøgte kraft (sub-nN) og forskydning (sub-nm) følsomhed, hvilket er vigtigt for nøjagtigt at bestemme det oprindelige kontaktpunkt og forblive inden for det elastiske deformationsområde.

I AFM-udkragningsbaseret nanoindrykning aktiveres forskydningen af en AFM-sonde mod prøveoverfladen af et kalibreret piezoelektrisk element (figur 1B), hvor den fleksible udkragning til sidst bøjes på grund af den resistive kraft, der opleves ved kontakt med prøveoverfladen. Denne bøjning eller afbøjning af udkragningen overvåges typisk ved at reflektere en laser fra bagsiden af udkragningen og ind i en fotodetektor (positionsfølsom detektor [PSD]). Sammen med kendskabet til udkragningsstivheden (i nN/nm) og afbøjningsfølsomheden (i nm/V) er det muligt at konvertere denne målte udkragningsafbøjning (i V) til den kraft (i nN), der påføres prøven. Efter kontakt giver forskellen mellem Z-piezo-bevægelsen og udkragningsudbøjningen prøveindrykningsdybden. Kombineret med kendskabet til tipområdets funktion muliggør dette beregning af tipprøvekontaktområdet. Hældningen af de kontaktende dele af de resulterende kraft-distance eller kraftforskydningskurver (F-D) kan derefter tilpasses ved hjælp af en passende kontaktmekanikmodel (se afsnittet Dataanalyse i diskussionen) for at bestemme prøvens nanomekaniske egenskaber. Mens AFM-udkragningsbaseret nanoindrykning har nogle klare fordele i forhold til instrumenteret nanoindrykning som beskrevet ovenfor, præsenterer den også flere praktiske implementeringsudfordringer, såsom kalibrering, spidsslid og dataanalyse, som vil blive diskuteret her. En anden potentiel ulempe ved AFM-udkragningsbaseret nanoindrykning er antagelsen om lineær elasticitet, da kontaktradius og indrykningsdybder skal være meget mindre end indenterradius, hvilket kan være vanskeligt at opnå, når man arbejder med nanoskala AFM-sonder og / eller prøver, der udviser betydelig overfladeruhed.

Traditionelt har nanoindrykning været begrænset til individuelle placeringer eller små gitterindrykningseksperimenter, hvor en ønsket placering (dvs. interesseområde [ROI]) vælges, og et enkelt kontrolleret indryk, flere indrykninger på et enkelt sted adskilt af en vis ventetid og / eller et groft gitter af indrykninger udføres med en hastighed i størrelsesordenen Hz. Imidlertid giver de seneste fremskridt inden for AFM mulighed for samtidig erhvervelse af mekaniske egenskaber og topografi gennem anvendelse af højhastighedskraftkurvebaserede billeddannelsestilstande (omtalt af forskellige handelsnavne afhængigt af systemproducenten), hvor kraftkurver udføres med en kHz hastighed under belastningskontrol, med den maksimale tipprøvekraft anvendt som billeddannelsessætpunkt. Point-and-shoot-metoder er også blevet udviklet, hvilket giver mulighed for erhvervelse af et AFM-topografibillede efterfulgt af efterfølgende selektiv nanoindrykning på interessepunkter i billedet, hvilket giver rumlig kontrol i nanoskala over nanoindrykningsplacering. Selvom det ikke er det primære fokus for dette arbejde, præsenteres specifikke udvalgte applikationseksempler på både kraftkurvebaseret billeddannelse og peg-og-skyd-cantilever-baseret nanoindrykning i de repræsentative resultater og kan bruges sammen med protokollen skitseret nedenfor, hvis den er tilgængelig på den særlige anvendte AFM-platform. Specifikt skitserer dette arbejde en generaliseret protokol til praktisk implementering af AFM-cantilever-baseret nanoindrykning på ethvert kapabelt AFM-system og giver fire eksempler på brugssager (to i luft, to i væske) af teknikken, herunder repræsentative resultater og en grundig diskussion af nuancer, udfordringer og vigtige overvejelser for at kunne anvende teknikken med succes.

Protocol

BEMÆRK: På grund af den brede vifte af kommercielt tilgængelige AFM'er og mangfoldigheden af prøvetyper og applikationer, der findes til cantilever-baseret nanoindrykning, er den følgende protokol bevidst designet til at være relativt generel og fokusere på de fælles trin, der er nødvendige for alle cantilever-baserede nanoindrykningseksperimenter uanset instrument eller producent. På grund af dette antager forfatterne, at læseren i det mindste har grundlæggende fortrolighed med at betjene det specifikke instrument, der er valgt til at udføre cantilever-baseret nanoindrykning. Ud over den generelle protokol, der er skitseret nedenfor, er en detaljeret trin-for-trin standarddriftsprocedure (SOP), der er specifik for AFM og software, der anvendes her (se materialetabel), der fokuserer på cantilever-baseret nanoindrykning af prøver i væske, inkluderet som et supplerende materiale.

1. Prøveforberedelse og instrumentopsætning

1. Forbered prøven på en måde, der minimerer både overfladeruhed (ideelt set nanometerskala, ~ 10x mindre end den tilsigtede fordybningsdybde) og forurening uden at ændre de mekaniske egenskaber for det eller de relevante områder.
2. Vælg en passende AFM-sonde til nanoindrykning af den påtænkte prøve baseret på mediet (dvs. luft eller væske), forventet modul, prøvetopografi og relevante funktionsstørrelser (se overvejelserne om sondevalg i diskussionen). Læg sonden på sondeholderen (se materialetabellen), og fastgør sondeholderen til AFM-scanningshovedet.
3. Vælg en passende nanoindrykningstilstand i AFM-softwaren, der giver brugeren kontrol over individuelle ramper (dvs. kraftforskydningskurver).
   BEMÆRK: Den specifikke tilstand vil variere på tværs af forskellige AFM-producenter og individuelle instrumenter (se SOP i det supplerende materiale for flere detaljer og et specifikt eksempel).
4. Juster laseren på bagsiden af sondeudkragningen, modsat sondespidsens placering og ind i PSD'en.
   BEMÆRK: Se eksemplet med mesenkymal stamcelleapplikation for flere detaljer om vigtige overvejelser ved justering af laseren og udførelse af nanoindrykning i væske, især undgå flydende affald og / eller luftbobler, som kan sprede eller bryde strålen. AFM-optikken skal muligvis også justeres for at kompensere for væskens brydningsindeks og for at undgå at styrte sonden ned, når overfladen aktiveres.
   1. Centrer laserstrålepunktet på bagsiden af udkragningen ved at maksimere sumspændingen (figur 2A).
   2. Centrer det reflekterede laserstrålepunkt på PSD'en ved at justere X- og Y-afbøjningssignalerne (dvs. vandret og lodret) til at være så tæt på nul som muligt (figur 2A), hvorved der tilvejebringes det maksimale detekterbare afbøjningsområde for frembringelse af en udgangsspænding, der er proportional med udkragningens udkragning.
5. Hvis du er usikker på prøvetopografi, overfladeruhed og/eller overfladetæthed (i tilfælde af flager eller partikler), skal du udføre en AFM-topografiundersøgelse forud for nanoindrykningseksperimenter for at bekræfte prøvens egnethed, som beskrevet i trin 1.1 og prøveforberedelsesdelen af diskussionen.

Figur 2: Positionsfølsom detektormonitor . (A) PSD-display, der indikerer en korrekt justeret laser, der reflekteres fra bagsiden af sondens udkragning og ind på midten af PSD'en (som det fremgår af den store sumspænding og manglen på lodret eller vandret afbøjning), før den aktiveres på prøveoverfladen (dvs. sonde ude af kontakt med prøven). (B) Den lodrette afbøjningsspænding øges, når udkragningen afbøjes (f.eks. når sonden kommer i kontakt med prøven). Forkortelser: PSD = positionsfølsom detektor; VERT = lodret; HORIZ = vandret; AMPL = amplitude; n/a = ikke relevant. Klik her for at se en større version af denne figur.

2. Sondekalibrering

BEMÆRK: Tre værdier er nødvendige for at kvantificere en prøves mekaniske egenskaber ved hjælp af F-D-kurvedata indsamlet under cantilever-baseret nanoindrykning: udkragningsfølsomheden (DS) for cantilever/PSD-systemet (nm/V eller V/nm), udkragningsfjederkonstanten (nN/nm) og sondekontaktområdet, ofte udtrykt i form af den effektive sondespidsradius (nm) ved en given indrykningsdybde, der er mindre end sonderadiusen, hvis der er tale om en sfærisk sonde drikkepenge.

1. Sondens/AFM-systemets DS kalibreres ved at trampe på et ekstremt hårdt materiale (f.eks. safir, E = 345 GPa), således at deformation af prøven minimeres, og piezoens målte Z-bevægelse efter initiering af kontakt med spidsprøven omdannes således udelukkende til udkragningsafbøjning.
   BEMÆRK: DS-kalibreringen skal udføres under de samme betingelser som de planlagte nanoindrykningseksperimenter (dvs. temperatur, medium osv.) for nøjagtigt at afspejle systemets DS under forsøgene. En lang (30 min) laseropvarmningsperiode kan være nødvendig for maksimal nøjagtighed for at give tid til termisk ligevægt og etablering af stabil laserudgangseffekt og pegestabilitet. DS skal måles igen, hver gang laseren justeres, selvom den samme sonde anvendes, da DS afhænger af laserintensiteten og positionen på udkragningen samt kvaliteten af refleksionen fra sonden (dvs. nedbrydning af sondens bagsidebelægning vil påvirke DS) og følsomheden af PSD²⁰.
   1. Opsæt og udfør DS-kalibreringsindrykningerne på safiren for at opnå omtrent samme sondeafbøjning (i V eller nm) som de planlagte prøveindrykninger, da den målte forskydning er en funktion af spidsens afbøjningsvinkel og bliver ikke-lineær for store udbøjninger.
   2. DS (i nm/V) eller alternativt den inverse optiske håndtagsfølsomhed (i V/nm) bestemmes ud fra hældningen af den lineære del af kontaktregimet efter det oprindelige kontaktpunkt i den resulterende F-D-kurve som vist i figur 3A.
   3. Gentag rampen mindst 5x, og optag hver DS-værdi. Brug gennemsnittet af værdierne for maksimal nøjagtighed. Hvis målingernes relative standardafvigelse (RSD) overstiger ~1%, måles DS igen, da de første par F-D-kurver undertiden ikke er ideelle på grund af den indledende introduktion af klæbekræfter.
   4. Hvis sondeudkragningens fjederkonstant, k, ikke er fabrikskalibreret (f.eks. via laser Doppler-vibrometry [LDV]), kalibreres fjederkonstanten.
      BEMÆRK: Termisk tunemetoden er optimal for relativt bløde udkragninger med k < 10 N/m (se afsnittet om fjederkonstant i diskussionen for en liste og beskrivelse af alternative metoder, især for stive udkragninger med k > 10 N/m). Som vist i figur 3B, C er termisk tuning typisk integreret i AFM-styringssoftwaren.
2. Hvis sonden ikke leveres med en fabrikskalibreret spidsradiusmåling (f.eks. via scanningelektronmikroskop [SEM]-billeddannelse), måles den effektive spidsradius, R.
   BEMÆRK: Der er to almindelige metoder til måling af spidsradius (se det tilsvarende diskussionsafsnit), men den mest almindelige for sondespidser i nanometerskala er BTR-metoden (blind tip rekonstruktion), der anvender en ruhedsstandard (se materialetabel), der indeholder adskillige ekstremt skarpe (sub-nm) funktioner, der tjener til effektivt at afbilde spidsen snarere end spidsbilleddannelsen af prøven.
   1. Hvis du anvender BTR-metoden, skal du afbilde ruhedsprøven (spidskarakterisering) ved hjælp af en langsom scanningshastighed (<0,5 Hz) og høje feedbackgevinster for at hjælpe med at optimere sporing af de meget skarpe funktioner. Vælg en billedstørrelse og pixeltæthed (opløsning) baseret på den forventede spidsradius (f.eks. vil et billede på 1024 x 1024 pixel af et område på 3 μm x 3 μm have ~3 nm lateral opløsning).
   2. Brug AFM-billedanalysesoftware (se materialetabel) til at modellere sondespidsen og estimere dens enderadius og effektive spidsdiameter ved den forventede prøveindrykningsdybde, som vist i figur 3D-F.
3. Når sondekalibreringen er afsluttet, skal du indtaste DS-, k- og R-værdierne i instrumentsoftwaren som vist i figur 4A.
   1. Angiv et skøn over prøvens Poisson-forhold, ν, for at gøre det muligt at konvertere det målte reducerede modul til det faktiske prøvemodul⁹. Hvis der anvendes en konisk eller konisfærisk kontaktmekanikmodel baseret på spidsformen og indrykningsdybden, er det også nødvendigt at indtaste spidsens halvvinkel (figur 4C).
      BEMÆRK: Modulet er relativt ufølsomt over for små fejl eller usikkerheder i det estimerede Poissons forhold. Et estimat på ν = 0,2-0,3 er et godt udgangspunkt for mange materialer²¹.

Figur 3: Sondekalibrering. (A) Bestemmelse af afbøjningsfølsomhed. Resultatet af en repræsentativ måling af afbøjningsfølsomhed udført på et safirsubstrat (E = 345 GPa) for en standardtappetilstandssonde (nominel k = 42 N/m; se materialetabellen) med en reflekterende aluminiumsbelægning på bagsiden. Vist er den målte tilgang (blå spor) og tilbagetrækning eller tilbagetrækning (rød spor) kurver. Den målte afbøjningsfølsomhed på 59,16 nm/V blev bestemt ved at tilpasse tilkørselskurven mellem snap-til-kontakt- og vendepunkterne som angivet af området mellem de lodrette stiplede røde linjer. Det område med negativ afbøjning, der er tydelig i tilbagetræknings-/tilbagetrækningskurven, før overfladen trækkes af, er tegn på vedhæftning af spidsprøven. (B,C) Termisk tuning. Repræsentative cantilever termiske støjspektre (blå spor) med tilsvarende pasformer (røde spor) for to forskellige sonder. (B) Termiske indstillings- og tilpasningsparametre for en standard kraftkurvebaseret AFM-billedsonde (se materialetabel) med dens nominelle fjederkonstant k = 0,4 N/m anvendt som et første gæt. Tilpasningen af det cantilever termiske støjspektrum giver en grundlæggende resonansfrekvens på f 0 = 79, 8 kHz, hvilket er i rimelig god overensstemmelse med den nominelle værdi af f₀ = 70 kHz. Den målte Q-faktor er 58,1. Godhed af pasform (R² = 0,99) er baseret på overensstemmelse mellem pasformen og dataene mellem de to lodrette stiplede røde linjer. Bemærk, at det er vigtigt at kende og indtaste både omgivelsestemperatur og afbøjningsfølsomhed for nøjagtige resultater. C) Cantilever termisk støjspektrum og tilsvarende tilpasning (dvs. termisk tune) med resulterende beregnet fjederkonstant k = 0,105 N/m for en ekstremt blød udkragning, der anvendes til udførelse af nanomekaniske målinger på levende celler og isolerede kerner. Bemærk den signifikant lavere naturlige resonansfrekvens på ~ 2-3 kHz. (D-F) Rekonstruktion af blinde spidser. Repræsentativ arbejdsgang til rekonstruktion af blindspidser for en diamantspidssonde (nominel R = 40 nm; se materialetabel). (D) Et 5 μm x 5 μm billede af en spidskarakteriseringsprøve bestående af en række ekstremt skarpe (sub-nm) titanpigge, der tjener til at afbilde AFM-sondespidsen. E) Resulterende rekonstrueret model (billede med omvendt højde) af sondespidsen. F) Resultater af rekonstruktion af blindspidsen, herunder en anslået enderadius på R = 29 nm og en effektiv spidsdiameter på 40 nm i en brugervalgt højde på 8 nm (dvs. indrykningsdybde << R) fra spidsspidsen, beregnet ved at konvertere kontaktfladen med spidsprøven i denne højde til en effektiv diameter under forudsætning af en cirkulær profil (dvs. A = πr 2 = π(d/2)²) til brug med sfæriske kontaktmekaniske modeller. Forkortelser: AFM = atomkraftmikroskopi; ETD = effektiv spidsdiameter. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: Input til softwaregrænsefladen. A) Sondekalibreringskonstanter. Softwarebrugergrænseflade (se materialetabel) til indtastning af målt afbøjningsfølsomhed, fjederkonstant og spidsradius for at muliggøre kvantitative nanomekaniske målinger. Poissons forhold mellem både sonden og prøven er nødvendig for at beregne elastikken eller Youngs modul af prøven fra de cantilever-baserede nanoindrykningskraftkurver. (B) Rampekontrolvindue. Softwarebrugergrænseflade (se materialetabel) til opsætning af cantilever-baserede nanoindrykningseksperimenter, organiseret i parametre, der beskriver selve rampen (dvs. indrykningsprofil), instrumentudløsning (f.eks. kraft vs. forskydningskontrol), efterfølgende kraftanalyse og bevægelsesgrænser (for at forbedre målefølsomheden ved at indsnævre det område, som A / D-konverteren skal fungere over ved styring af Z-piezo og aflæsning af PSD-afbøjningen). (C) Spidshalvvinklen (baseret på sondens geometri eller direkte måling) er vigtig, hvis der anvendes en konisk, pyramideformet eller konisfærisk kontaktmekanikmodel (f.eks. Sneddon). Klik her for at se en større version af denne figur.

3. Indsaml data om kraftforskydning (F-D)

BEMÆRK: De parameterværdier, der vises her (se figur 4B), kan variere afhængigt af kraft- og indrykningsområdet for en given prøve.

1. Naviger prøven under AFM-hovedet, og engager dig i det ønskede interesseområde.
   1. Overvåg det lodrette afbøjningssignal (figur 2B), eller udfør en lille (~50-200 nm) startrampe (figur 4B) for at kontrollere, at spidsen og prøven er i kontakt (se figur 5A).
   2. Juster AFM-hovedpositionen lidt opad (i trin svarende til ~50% af den fulde rampestørrelse) og rampen igen. Gentag det, indtil spidsen og prøven lige er ude af kontakt, hvilket fremgår af en næsten flad rampe (figur 5B) og minimal lodret afbøjning af udkragningen (figur 2A).
   3. Når der ikke er nogen åbenlys interaktion mellem spids og prøve (sammenlign figur 2A og figur 2B), sænk AFM-hovedet med en mængde svarende til ~ 50% -100% af rampestørrelsen for at sikre, at sondespidsen ikke styrter ned i prøven, mens AFM-hovedet manuelt flyttes. Rampe igen, gentages, indtil enten en god kurve (figur 5D) eller en kurve svarende til figur 5C er observeret. I sidstnævnte tilfælde skal du udføre en ekstra lille AFM-hovedsænkningsjustering svarende til ~ 20% -50% af rampestørrelsen for at opnå god kontakt og en kraftkurve svarende til den, der er vist i figur 5D.
2. Juster rampeparametre (som beskrevet nedenfor og vist i Figur 4B) for at optimere instrumentet, sonden og prøven og opnå ramper svarende til dem, der er vist i Figur 5D.
   1. Vælg en passende rampestørrelse (dvs. total Z-piezo-bevægelse gennem en rampecyklus) afhængigt af prøven (f.eks. tykkelse, forventet modul, overfladeruhed) og ønsket indrykningsdybde.
      BEMÆRK: For stivere prøver vil der sandsynligvis forekomme mindre prøvedeformation (og dermed mere sondeafbøjning for en given Z-piezo-bevægelse), så rampestørrelsen kan generelt være mindre end for blødere prøver. Typiske rampestørrelser for stive prøver og udkragninger kan være snesevis af nm, mens ramper for bløde prøver og udkragninger kan være hundreder af nm til et par μm i størrelse; Specifikke udvalgte applikationseksempler præsenteres i afsnittet Repræsentative resultater. Bemærk, at minimum og maksimum mulige rampestørrelser er instrumentafhængige.
   2. Vælg en passende rampehastighed (1 Hz er et godt udgangspunkt for de fleste prøver).
      BEMÆRK: Rampehastigheden kan være begrænset af kontrol og/eller detektering af elektroniske hastigheder/båndbredder. I kombination med rampestørrelsen bestemmer rampehastigheden spidshastigheden. Spidshastigheden er især vigtig at overveje ved indrykning af bløde materialer, hvor viskoelastiske virkninger kan forårsage hystereseartefakter ^9,22.
   3. Vælg, om du vil anvende en udløst (belastningsstyret) eller ikke-udløst (forskydningsstyret) rampe.
      BEMÆRK: I en udløst rampe vil systemet nærme sig prøven i brugerdefinerede trin (baseret på rampestørrelse og opløsning eller antal datapunkter), indtil den ønskede udløsningstærskel (dvs. sætpunktskraft eller udkragningsafbøjning) detekteres, hvorefter systemet trækker sig tilbage til sin oprindelige position og viser F-D-kurven. I en ikke-udløst rampe udvider systemet simpelthen Z-piezo den afstand, der er angivet af den brugerdefinerede rampestørrelse, og viser den målte F-D-kurve. Udløste ramper foretrækkes til de fleste brugssager, men ikke-udløste ramper kan være nyttige, når man undersøger bløde materialer, der ikke udviser et skarpt, let identificerbart kontaktpunkt.
      1. Hvis der vælges en udløst rampe , skal du indstille udløsningstærsklen (brugerdefineret maksimalt tilladt kraft eller rampens afbøjning) for at resultere i den ønskede fordybning i prøven.
         BEMÆRK: Brug af en udløsertærskel betyder, at en rampe kan afslutte (dvs. sonden kan begynde at trække sig tilbage), før den fulde rampestørrelse (Z-piezo-udvidelse) er angivet. Værdierne kan variere fra nogle få nN til nogle få μN, afhængigt af tipprøvesystemet.
      2. Indstil rampepositionen for at bestemme den del af Z-piezoens maksimale rækkevidde, der skal bruges til at udføre rampen. Sørg for, at rampestørrelsens samlede rækkevidde ikke starter eller slutter uden for det maksimale Z-piezoområde (se repræsentative eksempler i figur 6), ellers vil en del af F-D-kurven ikke repræsentere nogen fysisk måling (dvs. Z-piezoen vil være helt forlænget eller trukket tilbage og ikke bevæge sig).
   4. Indstil antallet af prøver/rampe (f.eks. 512 prøver/rampe ) for at opnå den ønskede opløsning af målingen (dvs. F-D-kurvens punkttæthed).
      BEMÆRK: De maksimale prøver/ramper kan være begrænset af software (filstørrelse) eller hardwarebegrænsninger (f.eks. analog til digital [A/D] konverteringshastighed, afhængigt af rampehastigheden). Det er også muligt at begrænse det tilladte Z-piezo- eller afbøjningsområde (se grænseparametre i figur 4B) for at øge den effektive opløsning af systemets A/D-konverter.
   5. Indstil X-rotationen for at reducere forskydningskræfterne på prøven og spidsen ved samtidig at flytte sonden lidt i X-retningen (parallelt med udkragningen), mens den indrykker i Z-retningen (vinkelret på udkragningen). Brug en værdi for X-rotationen svarende til sondeholderens forskydningsvinkel i forhold til overfladen normal (12° er typisk).
      BEMÆRK: X-rotationen er nødvendig, fordi udkragningen er monteret i sondeholderen i en lille vinkel i forhold til overfladen for at tillade den indfaldende laserstråle at reflektere ind i PSD'en. Derudover kan sondespidsens forreste og bageste vinkler afvige fra hinanden (dvs. sondespidsen kan være asymmetrisk). Mere specifikke oplysninger kan fås fra individuelle sonde- og AFM-producenter.

Figur 5: Optimering af adskillelse af spidsprøver efter aktivering for at opnå gode kraftkurver. Sekventielle eksempler på repræsentative kraftforskydningskurver opnået under indrykning i væske (fosfatbufret saltvand) på en levende mesenkymal stamcellekerne med en kalibreret blød siliciumnitridudkragning (nominel k = 0,04 N/m), der ender i en halvkugleformet spids med en radius på 5 μm (se materialetabel). Kurver blev opnået i processen med at engagere celleoverfladen og optimere indrykningsparametrene, med sondetilgang vist i blåt og tilbagetrækning / tilbagetrækning i rødt. (A) Spidsen er allerede i indgreb og i kontakt med prøven, inden rampen påbegyndes, hvilket fører til stor udkragning og kræfter uden flad basislinje for forkontakt. (B) Efter manuel flytning af spidsen tilstrækkeligt langt væk fra prøveemnet resulterer en uudløst rampe på 2 μm i en F-D-kurve, der er næsten flad (dvs. praktisk talt ingen ændring i kraft). Under omgivelsesforhold ville kurven være fladere, men i væske kan mediets viskositet forårsage små afbøjninger af sondeudkragningen under en rampe som vist her, selv uden overfladekontakt. (C) Efter at have nærmet sig lidt tættere på overfladen, før rampen påbegyndes, viser indflyvnings- og tilbagetrækningskurverne en lille stigning i kraft (øget hældning) nær rampens vendepunkt (dvs. overgang fra indflyvning til tilbagetrækning). Det afslørende tegn at kigge efter er, at tilgangen (blå) og tilbagetrækning (rød) kurver begynder at overlappe hinanden (region angivet med den sorte cirkel), hvilket er tegn på en fysisk interaktion med overfladen. (D) En ideel F-D-kurve opnået efter optimering af rampeparametrene og nærmer sig lidt (~ 1 μm) tættere på celleoverfladen end i C , således at sonden bruger ca. halvdelen af rampen i kontakt med cellen, hvilket muliggør tilstrækkelig deformation til at passe til kontaktdelen af tilgangskurven og bestemme det elastiske modul. Den relativt lange, flade, støjsvage basislinje gør det lettere for tilpasningsalgoritmen at bestemme kontaktpunktet. Forkortelse: F-D = kraftforskydning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 6: Rampestørrelse og position. Z-piezo-skærm, der viser rampens omfang (blå bjælke) i forhold til det samlede tilgængelige Z-piezo-bevægelsesområde (grøn bjælke). (A) Z-piezo-positionen er nær midten af dens bevægelsesområde, hvilket fremgår både af, at den blå bjælke er placeret omtrent midt i den grønne bjælke, og at den aktuelle Z-piezo-spænding (-78,0 V) er omtrent mellem dens fuldt tilbagetrukne (-212,2 V) og udvidede (+102,2 V) værdier. (B) Z-piezo forlænges i forhold til A uden anvendt biasspænding. (C) Z-piezo trækkes tilbage i forhold til A og B. (D) Z-piezo-positionen er den samme som i C ved -156,0 V, men rampestørrelsen er øget i forhold til A-C for at drage fordel af mere af Z-piezoens fulde bevægelsesområde. € Rampestørrelsen er for stor til den aktuelle rampeposition, hvilket resulterer i, at Z-piezo forlænges til slutningen af sit område. Dette vil få F-D-kurven til at flade ud, da systemet ikke kan forlænge Z-piezoen yderligere. Forkortelse: F-D = kraftforskydning. Klik her for at se en større version af denne figur.

4. F-D kurve analyse

1. Vælg en passende softwarepakke til dataanalyse. Vælg og indlæs de data, der skal analyseres.
   BEMÆRK: Mange AFM-producenter og AFM-billedbehandlingssoftwareprogrammer har indbygget understøttelse af F-D-kurveanalyse. Alternativt kan den øgede fleksibilitet og funktionerne i en dedikeret F-D-kurveanalysepakke, såsom open source AtomicJ-softwarepakken, være gavnlig²³, især til batchbehandling og statistisk analyse af store datasæt eller implementering af komplekse kontaktmekaniske modeller.
2. Inputkalibrerede værdier for fjederkonstanten, DS- og sondespidsradius sammen med estimater af Youngs modul og Poissons forhold for sondespidsen (baseret på dens materialesammensætning) og Poissons forhold mellem prøven.
   BEMÆRK: Hvis du bruger en diamantspidsindenter, kan værdierne E tip = 1140 GPa og ν _tip = 0,07 bruges^21,24,25,26. For en standard siliciumsonde kan _E-tip = 170 GPa og ν_tip = 0,27 typisk anvendes, selvom Youngs siliciummodul varierer afhængigt af den krystallografiske orientering²⁷.
3. Vælg en nanoindrykningskontaktmekanikmodel, der passer til spidsen og prøven.
   BEMÆRK: For de mange almindelige sfæriske spidsmodeller (f.eks. Hertz, Maugis, DMT, JKR) er det afgørende, at fordybningsdybden i prøven er mindre end spidsradius; ellers giver sondespidsens sfæriske geometri plads til en konisk eller pyramideformet form (figur 4C). For koniske (f.eks. Sneddon²⁸) og pyramidemodeller, spidsens halvvinkel (dvs. vinklen mellem spidsens sidevæg og en skærende linje vinkelret på spidsenden; Figur 4C) skal være kendt og fås normalt hos sondeproducenten. For mere information om kontaktmekanikmodeller, se afsnittet Dataanalyse i thedDiscussion.
4. Kør tilpasningsalgoritmen. Kontroller, at F-D-kurverne er korrekt monteret; en lav restfejl svarende til en gennemsnitlig R 2 nær enhed (f.eks. R² > 0,9) er typisk tegn på en god pasform til den valgte model^29,30. Stikprøvekontroller individuelle kurver for visuelt at inspicere kurven, modeltilpasning og beregnede kontaktpunkter, hvis det ønskes (se f.eks. figur 7 og afsnittet Dataanalyse i diskussionen).

Representative Results

Kraftforskydningskurver
Figur 7 viser repræsentative, næsten ideelle F-D-kurver opnået fra nanoindrykningseksperimenter udført i luft på harpiksindlejrede loblolly fyrretræsprøver (figur 7A) og i væske (fosfatbufret saltvand [PBS]) på mesenkymale stamcellekerner (MSC) (figur 7B). Brugen af enhver kontaktmekanikmodel afhænger af den nøjagtige og pålidelige bestemmelse af det indledende tip-prøvekontaktpunkt. Således gør den relativt flade, støjsvage basislinje forud for det oprindelige kontaktpunkt og den glatte hældning af kontaktdelen af F-D-kurverne vist i figur 7 dem ideelle til analyse for at udtrække mekaniske egenskaber, hvilket fremgår af den fremragende overensstemmelse mellem tilgangskurverne (blå spor) og tilsvarende tilpasninger (grønne spor) i indsatserne.

Omvendt er der flere almindelige problemer, som en bruger kan støde på, mens han udfører cantilever-baseret nanoindrykning, der vil føre til ikke-ideelle F-D-kurver. Et af de mest almindelige problemer, især umiddelbart efter aktivering, er, at sondespidsen allerede er i kontakt med prøven forud for initiering af en rampe (figur 5A), hvilket forhindrer erhvervelse af den nødvendige baseline uden for kontakt til bestemmelse af det oprindelige kontaktpunkt. Dette kan også føre til for store kræfter i tilfælde af uudløste (dvs. kontrollerede forskydning) ramper. Dette er især bekymrende, når du udfører en stor rampe med en stiv udkragning, da de resulterende kræfter kan bryde udkragningen og / eller beskadige prøven eller spidsen. For at undgå dette skal du overvåge den lodrette afbøjningsspænding under og efter den første tilkobling. Hvis den målte lodrette afbøjningsspænding er positiv (under forudsætning af korrekt indledende justering) som vist i figur 2B, afbøjes udkragningen, og spidsen er i kontakt med prøven. Større positive spændinger svarer til større udkragningsudbøjninger, men uanset størrelsen af udbøjningen skal brugeren manuelt hæve AFM-hovedet (f.eks. ved at anvende en stepmotor) væk fra prøven. Den lodrette afbøjningsspænding skal langsomt falde og kan endda midlertidigt dykke under nul i tilfælde af stærke klæbende kræfter på spidsprøven, men vil til sidst nå 0 V (eller tæt på 0 V), når spidsen ikke længere er i kontakt med prøven (figur 2A). Fra dette tidspunkt kan brugeren genoptage optimering af rampeparametrene og udførelse af indrykninger.

Et andet almindeligt problem (især for ikke-udløste ramper) er, at hele F-D-kurven ser næsten flad ud uden tydelige tegn på interaktion mellem spids og prøve, som vist tidligere i figur 5B. Hvis det er tilgængeligt på instrumentet, er løsningen på dette manuelt at sænke SPM-hovedet med ~ 10% mindre end rampestørrelsen (for at undgå at styrte sondespidsen) og rampen igen og gentage, indtil der observeres en åbenlys stigning i kraft på grund af tip-prøve-interaktion (figur 5C, D), før du fortsætter med at optimere andre rampeparametre.

Tip slid
Figur 8 viser et eksempel på slid på lossepladser i forsøgsøjemed. En enkelt, stiv, siliciumtappende AFM-sonde (se materialetabel) blev brugt til at afbilde flere store områder af en Bakken-skiferprøve (se det tilsvarende applikationseksempel for flere detaljer) ved hjælp af en hurtig (kHz hastighed) kraftkurvebaseret billeddannelsesmetode, og BTR-metoden blev brugt til at modellere spidsgeometrien og estimere spidsens enderadius før og efter hvert af tre på hinanden følgende billeder. De undersøgte skiferprøver bestod af en matrix af ler og organisk materiale (E ~ 5 GPa) med meget hårdere uorganiske mineralindeslutninger spredt over hele (E > 30 GPa). Da prøven indeholdt betydelige variationer i overfladetopografi (±2 μm) på tværs af de store scanningsområder (85 μm x 85 μm), der blev afbildet, blev scanningshastigheden indstillet til det mindste tilladte på det anvendte instrument, 0,1 Hz. Med en kraftkurveoptagelseshastighed på 2 kHz og en scanningshastighed på 0,1 Hz var der i løbet af et enkelt 1024 x 1024 pixelbillede over 20 millioner tip-sample-interaktioner. Som følge heraf oplevede sondespidsen betydeligt slid i forhold til sin uberørte tilstand (figur 8A) i løbet af billeddannelsen af prøven, stigende med over en størrelsesorden fra en effektiv enderadius på ~ 11 nm som modtaget til ~ 129 nm ved afslutningen af de tre billeder (figur 8D). Under det første billede ser spidsen ud til at være blevet brudt, hvilket resulterer i den store morfologiske ændring, der ses i figur 8B. I hvert efterfølgende billede bliver spidsen gradvist mere afrundet, et glimrende eksempel på det mere almindelige fænomen gradvis slid (se diskussion). De estimerede spidsradier fra BTR-modellerne er inkluderet i figur 8.

I modsætning hertil viser figur 8E, F BTR-modeller af en diamantspidssonde (se materialetabel) erhvervet med 6 måneders mellemrum, med tusindvis af nanoindrykninger og hundreder af millioner kraftkurvebilleddannelsesbaserede tip-prøve-interaktioner, der forekommer imellem. Som det fremgår af de estimerede spidsradier på 29 nm (figur 8E) og 28 nm (figur 8F), ændrede sondespidsradius sig ikke inden for grænserne for BTR-metoden, hvilket fremhæver diamantens ekstreme slidstyrke. Det skal dog bemærkes, at diamantspidssonder (som alle AFM-sonder) er modtagelige for forurening fra løst klæbende affald, der kan påvirke spidsområdets funktion og effektive hårdhed. Derfor er prøvernes renhed fortsat afgørende for konservering af lossepladser og nøjagtige nanomekaniske målinger.

Eksempler på anvendelse
Gennem det velovervejede valg af sondematerialesammensætning, cantileverfjederkonstant og spidsgeometri og radius kan cantilever-baseret nanoindrykning bruges til at kvantificere nanoskalaens mekaniske egenskaber af materialer med elastiske moduli, der spænder fra kPa til GPa, både i væske og under omgivende forhold. Udvalgte applikationseksempler følger for at fremhæve nogle få af de mange anvendelsesmuligheder, der er mulige for cantilever-baseret nanoindrykning.

Undersøgelse af loblolly fyr mekaniske egenskaber til biobrændstof applikationer
Loblolly fyrretræer (Pinus taeda) er en hurtigt voksende nåletræsart, der er meget rigelige i det sydlige USA og besætter over 13 millioner hektar³¹. På grund af deres overflod er loblolly fyrretræer en kritisk kommerciel afgrøde i det sydlige USA, der almindeligvis anvendes til både tømmer og papirmassetræ. Desuden er de en vigtig ressource til produktion af celluloseholdige biobrændstoffer af anden generation³². Det er vigtigt, at efterspørgslen efter celluloseholdige biobrændstofråmaterialer er vokset på grund af Energy Independence and Security Act (EISA) fra 2007, som kræver, at det samlede forbrug af vedvarende brændstof i den amerikanske transportindustri i 2022 skal være 36 milliarder gallon, hvor 16 milliarder gallon stammer fra cellulosebiomasse. På grund af loblolly fyrretræs hurtige vækstrate og modtagelighed for skovlandbrugsprojekter er det derfor blevet et råmateriale til biobrændstoffer af stor interesse i de senere år³³. Viden om loblolfyrs mekaniske egenskaber, herunder variabilitet på tværs af individuelle træer, anatomiske fraktioner (f.eks. hvidtræ, bark, nåle) og celleområder (f.eks. cellevæg versus indre), kan muliggøre målrettet adskillelse af biomassestrømme for at optimere mekanisk behandling og termokemisk omdannelse³⁴.

Figur 9 viser et repræsentativt AFM-topografibillede (højdesensor) (figur 9A) og tilsvarende elastisk modulkort (figur 9B) af en tværsnitsprøve af hvidtræ opnået fra en gren på en 23-årig loblolly fyr med en ~ 30 nm krumningsradius diamantspidssonde monteret på en rustfri ståludkragning (k = 256 N/m). Topografi- og modulkortene blev genereret samtidigt ved hjælp af hurtig kHz hastighedskraftkurvebaseret AFM-billeddannelse, hvor moduluskortet præsenterede semikvantitative resultater baseret på nominelle værdier for sondekalibreringskonstanterne (dvs. fjederkonstant, afbøjningsfølsomhed og spidsradius) og tilpasning af kraftkurverne i realtid til DMT (Derjaguin, Müller og Toporov) kontaktmekanik model³⁵. Tværsnitsprøver trimmet til at være <3 mm i alle tre dimensioner (længde x bredde x højde) blev forberedt til billeddannelse ved seriel dehydrering ved hjælp af stigende koncentrationer af ethanol (33%, 55%, 70%, 90% og 100%)³⁶, før de infiltrerede med harpiks (se materialetabellen) og polymeriserede ved 60 °C natten over. Fuldt hærdede harpiksindlejrede prøver blev først formalet, derefter ultramikrotomed med et diamantblad, der arbejder med en skærehastighed på ~ 1 mm / s med en fodertykkelse, der falder fra 1 μm ned til 50-70 nm pr. skive for at producere en flad overflade, der er modtagelig for AFM-billeddannelse. Som det kan ses af farveskalabjælken i figur 9A, er den resulterende overflade i dette tilfælde stadig relativt ru, måske på grund af tilstedeværelsen af resterende affald på prøveoverfladen og / eller ultramikrotombladet, hvilket fører til bladets "chatter" under sektionering, mens andre prøver udviste meget glattere overfladetopografi.

Figur 9C gengiver AFM-topografibilledet fra figur 9A, men med hvidt trådkors, der angiver placeringen af otte arrays af 50 nanoindrykninger stykket, der skal udføres langs udvalgte cellevægge inden for ROI, da målet med det pågældende projekt var at forstå, hvordan de nanomekaniske egenskaber af loblolly fyr adskiller sig på tværs af forskellige vævstyper og træalder. En triggertærskel på 1 μN blev typisk anvendt til ramperne (60 nm nominel rampestørrelse udført ved en 1 Hz rampehastighed), hvilket førte til en fordybningsdybde på ~ 10 nm langs cellevæggene (8 ± 2 nm på tværs af alle undersøgte prøver) eller lidt dybere (14 ± 4 nm) i celleinteriørerne, som er noget blødere end cellevæggene. Indrykninger inden for hver linje blev placeret ≥100 nm fra hinanden for at sikre, at de var godt adskilt, og 1.024 datapunkter blev indsamlet pr. rampe for at producere velkarakteriserede indflyvnings- og tilbagetrækningskurver. Ved at kombinere hurtig kraftkurvebaseret billeddannelse med point-and-shoot cantilever-baseret nanoindrykning var det muligt at generere statistik og bestemme forskelle i moduli på tværs af cellestrukturer. For eksempel, som vist i tabel 1, blev det konstateret, at det gennemsnitlige elastiske modul i celleinteriøret var omkring halvdelen af cellevæggen på tværs af hvidtræsprøver afledt af flere grene af træer i forskellige aldre.

Prøve	Sted	E* (GPa)	E (GPa)	Deformation (nm)	Greve (n)
1	Indre	1.5 ± 0.4	1.4 ± 0.4	14 ± 2	199
	Væg	4.7 ± 1.3	4.3 ± 1.3	7 ± 2	202
2	Indre	1.3 ± 0.3	1.2 ± 0.3	16 ± 3	198
	Væg	3.2 ± 0.9	2.9 ± 0.9	9 ± 2	199
3	Indre	1.9 ± 0.6	1.7 ± 0.6	12 ± 3	198
	Væg	5.7 ± 1.2	5.2 ± 1.2	6 ± 1	199
4	Indre	2.4 ± 0.8	2.2 ± 0.8	11 ± 3	202
	Væg	4.2 ± 2.1	3.8 ± 2.1	9 ± 4	193
5	Indre	2.6 ± 0.8	2.3 ± 0.8	10 ± 2	198
	Væg	4.3 ± 1.6	3.9 ± 1.6	7 ± 2	199
Gennemsnitlig	Indre	1.9 ± 0.6	1.8 ± 0.6	13 ± 3
	Væg	4.4 ± 1.4	4.0 ± 1.4	8 ± 2

Tabel 1: Loblolly fyr elastisk modul statistik: cellevægge versus celle interiør. Målte elastiske moduli af cellevæggene versus celleinteriører for fem loblolly fyrretræ grenprøver indsamlet fra to træer i forskellige aldre. Alle modulværdier blev beregnet ved at tilpasse tilgangsdelen af kraftforskydningskurven til DMT-modellen og antage et Poissons forhold på 0,3 for prøven. Moduli rapporteres som gennemsnitlig ± standardafvigelse for hvert prøvested, hvor antallet af kraftkurver (antal, n) analyseres for at frembringe det rapporterede resultat angivet. Målte reducerede moduli (E *) blev konverteret til faktiske prøvemoduli (E), idet der antages et Youngs modul på 1.140 GPa og Poissons forhold på 0,07 for den anvendte diamantspidsindenter. Også vist er den gennemsnitlige prøvedeformation for den påførte belastning på 1 μN.

Korreleret nanomekanik og elektronmikrospektroskopi på Bakken skifer
Bakken skiferaflejringer findes i Williston Basin i Montana og North Dakota i USA og dele af Saskatchewan i Canada. De er det næststørste kulbrintereservoir i USA, men undersøgelsen af aflejringerne er stadig i sin barndom³⁷. En undersøgelse af Bakken-skiferens nanomekaniske egenskaber som funktion af sammensætning og termisk modenhed blev udført ved at co-lokalisere AFM-udkragningsbaseret nanoindrykning med scanningelektronmikroskop (SEM) billeddannelse og karakterisering af energidispersiv spektroskopi (EDS) elementær sammensætning, som vist i figur 10. Specifikt blev SEM-EDS-kortlægning brugt til at karakterisere elementfordelingen (figur 10C) og derved bestemme tilstedeværelsen og placeringen af forskellige mineralindeslutninger inden for skifermatrixen. Hurtig (kHz hastighed) kraftkurvebaseret AFM-billeddannelse (figur 10B) blev lokaliseret sammen med SEM-EDS-kortene ved at definere en optisk identificerbar oprindelse i SEM-billedet (sekundær elektron) (figur 10A) og spore scenebevægelsen af både AFM og SEM³⁸. Ved igen at bruge en diamantspidssonde monteret på en stiv udkragning i rustfrit stål var kortlægning af variationer i det elastiske modul mulig for store områder (85 μm x 85 μm), der indeholdt indeslutninger af interesse (figur 10D). Bemærk, at modulkortet præsenteret i figur 10D er kvalitativt snarere end kvantitativt, da de korrekte sondekalibreringskonstanter ikke blev indtastet i softwaren før billeddannelse og dataindsamling.

AFM-billederne i figur 10B og figur 10D fremhæver også en af ulemperne ved den anvendte diamantspidssonde, nemlig dens manglende evne til nøjagtigt at spore funktioner med højt billedformat (se det sorte ovale område i figur 10B) på grund af dens terninghjørnespidsgeometri. Den reducerede opløsning og manglende evne til nøjagtigt at spore stejle træk kan ses tydeligere i figur 11, hvor det samme generelle område af en Bakken-skiferprøve er blevet afbildet af terninghjørnediamantspidsen (figur 11A) og en signifikant skarpere, højere billedformat stiv tappetilstand silicium AFM-sonde (figur 11B). Mere specifikt blev billedet vist i figur 11B erhvervet med sonden karakteriseret i figur 8A-D mellem BTR-modellerne i figur 8A (R = 11 nm) og figur 8B (R = 43 nm). Til direkte sammenligning viser billedparrene figur 11C, D sammen med figur 11E, F zoomede billeder af de samme prøveoverfladeegenskaber opnået med henholdsvis diamantspidsen og siliciumsonden, der viser effekten af spidsgeometri og radius på billedopløsning og nøjagtighed. Figur 11G viser et sammensat 3D-billede, der kombinerer overfladetopografien erhvervet med den skarpe, højaspektsiliciumsonde (figur 8A, B) og modulværdierne erhvervet med diamantspidssonden (figur 8E, F) kodet som den overlejrede farvede hud.

Ud over de store billeder, der er vist i figur 10 og figur 11, blev der taget mindre (10 μm x 10 μm) hurtige kraftkurvebaserede billeder ved hjælp af den fuldt kalibrerede diamantspidssonde. Disse billeder fokuserede på områder uden optisk synlige uorganiske mineralindeslutninger for at undersøge egenskaberne af den omgivende organiske matrix mere detaljeret. Ved at anvende en pixelopløsning på 512 x 512 (dvs. ~20 nm x 20 nm samplingpixels) blev >262.000 individuelle F-D-kurver fanget og gemt med hvert 10 μm x 10 μm billede, hvilket muliggjorde fremragende statistik. F-D-dataene blev batchbehandlet og analyseret ved hjælp af AtomicJ-softwarepakke²³ for at implementere Derjaguin-Muller-Toporov (DMT)^{35-kontaktmekanikmodellen}. Efter montering blev dataene renset for at fjerne kurver, der resulterede i et beregnet elastisk modul <0 (ikke-fysisk) eller >30 GPa (da undersøgelsen var fokuseret på den ikke-mineralske del af skiferen, E << 30 GPa) svarende til andre undersøgelser^39,40, samt data med en model, der passer til^R2 < ^0,7. Mens R 2-afskæringen er noget vilkårlig, blev den valgt til kun at fjerne data, som modellen tydeligvis ikke kunne passe nøjagtigt. Med undtagelse af en outlier, der omfattede en stor mineraloptagelse i billedområdet, tegnede de fjernede kurver sig for mindre end 0,5% af de samlede data for hvert billede. Et resumé af de statistiske resultater findes i tabel 2. De beregnede elastiske moduli varierer fra 3,5 til 6,1 GPa, inden for rækkevidden af, hvad lignende undersøgelser også har fundet ^39,40.

Prøve	E (GPa)	Udbytte efter datarensning	Greve (n)
1	6.1 ± 3.8	93.70%	7,36,874
2	5.1 ± 2.6	99.70%	7,84,267
3	3.5 ± 1.9	99.60%	7,83,427

Tabel 2: Bakken skifers elastiske modulstatistik . Målte elastiske moduli af de organiske matricer i tre Bakken skiferprøver af forskellig sammensætning og termisk modenhed. Prøve 1 er en kontrol, mens prøve 2 og 3 blev udglødet i henholdsvis 12 timer og 48 timer for kunstigt at simulere termisk modning. Elastiske moduli rapporteres som gennemsnitlig ± standardafvigelse for hvert prøvested med antallet af kraftkurver (antal, n) inkluderet i analysen efter anvendelse af datarensningsproceduren beskrevet i den angivne tekst. Den beregnede gennemsnitlige moduli (3,5-6,1 GPa) falder inden for det interval, der er rapporteret i andre lignende undersøgelser, såsom Li et ^al.40, som fandt et modulområde på 2,9-11,8 GPa.

Mesenkymal stamcellekernestivhed ændres på grund af eksterne stimuli
Mesenkymale stamceller (MSC'er) er stamceller, der kan blive chondrocytter, adipocytter, osteoblaster og myocytter⁴¹. MSC-differentiering i disse forskellige vævstyper påvirkes af eksterne mekaniske stimuli på cellen via Linker of the Cytoskeleton and Nucleoskeleton (LINC) komplekset, som fysisk forbinder den ydre cellemembran med kernemembranen⁴¹. LINC-komplekset består af SUN- og Nesprin-proteiner, der interagerer med cellecytoskelettet for at detektere fysiske kræfter på cellen og lette nuklear import af de mekanofølsomme faktorer β-catenin og YAP for at initiere differentieringsprocessen^42,43,44. Sammen med den nukleare import af β-catenin og YAP efter mekanostimulering af celler gennemgår cytoskelettet også omlejring, herunder dannelsen af F-actinfilamenter omkring kernen samt den nukleare translokation af actin^44,45,46. Fordi mekanostimulering initierer ændringer i cellecytoskelettet og nuklear indgang af actin, påvirkes den samlede stivhed (modul) af celler og kerner og kan måles ved AFM-cantilever-baseret nanoindrykning. Tidligere undersøgelser har bekræftet dette ved at detektere et fald i celle- og kernemodul efter forstyrrelse af LINC-komplekset og omvendt en stigning i celle- og kernemodul efter mekanostimulering af MSC'er⁴⁷. Aktuel forskning undersøger stadig mekanismerne for actinimport til kernen, og hvordan actinpolymerisering påvirker celle- og kernemodul efter mekanostimulering.

For at undersøge levende cellers mekaniske egenskaber skal forsøgene udføres i en bufferopløsning, typisk PBS. Gennemførelse af cantilever-baseret nanoindrykning i væske udgør unikke problemer, specifikt til måling af meget bløde prøver såsom MSC'er (E≈ 2 kPa). Især kræver de lave elastiske moduler i levende celler brugen af en stor sonderadius for at reducere belastningen på cellestrukturen og undgå punktering af membranen. Derudover er meget lave fjederkonstante udkragninger (k = 0,04 N/m) nødvendige for at måle sådanne lave elastiske moduler, men dette øger sandsynligheden for falsk indgreb på grund af væskens viskøse træk, hvilket fører til afbøjning af den bløde udkragning under det indledende hurtige sænkningstrin i AFM-indgrebsprocessen. For at modvirke den højere tilbøjelighed til falske indgreb kan det være nødvendigt at bruge et større indgrebssætpunkt (dvs. udløsningstærskel for afbøjningsspænding for at afslutte aktiveringsprocessen). Da blødere udkragninger generelt kan deformeres elastisk i større grad end stive udkragninger, er den større bøjning, der opleves med et højere indgrebssætpunkt i væske, generelt ikke skadelig for sådanne bløde sonder. Derudover er det afgørende, at de opløsninger, der anvendes i et flydende miljø, er fri for snavs og bobler, da flydende affald eller bobler forbigående kan forstyrre overførslen af laseren gennem væsken til PSD eller klæbe til udkragningen og blokere laseren. Interferens med laserstrålen vil påvirke de resulterende F-D-kurver negativt og resulterer ofte i falsk kollisionsregistrering eller falsk aktivering. Endelig kræver nanoindrykning på levende celler også mere brugerinput end på hårdere, livløse materialer. Især fordi cellerne og deres væskemiljø er meget mere dynamiske, kan det være nødvendigt aktivt at justere sondens højde for hver rampe for at sikre, at der opnås en god F-D-kurve.

I levende celle nanoindrykning er der ofte behov for meget større prøvedeformation for at resultere i den samme udkragning i forhold til stivere prøver. Denne større deformation kan resultere i eksperimentelle resultater, der afviger fra Hertz-modellens antagelse om lineær elasticitet, og derfor kan det være nødvendigt at anvende en korrektionsfaktor for at tage højde for den hyperelastiske opførsel for nøjagtig F-D-analyse⁴⁸. Det har vist sig, at det geometriske størrelsesforhold, hvor _R2 er indentens radius og _R1 er cellens radius (se figur 12A), kan bruges til at forudsige de resulterende datas overholdelse af Hertzian-mekanikken. Det ideelle geometriske størrelsesforhold har vist sig at være β = 0,3, hvor β værdier <0,3 fører til undervurdering af det elastiske modul og β værdier > 0,3, hvilket fører til overvurdering af det elastiske modul, når det analyseres med Hertz kontaktteori⁴⁸. En almindelig måde at undgå ikke-lineære effekter på er at holde deformationer små. I denne undersøgelse var indrykningsdybden begrænset til 500 nm-1 μm.

Figur 12B viser et repræsentativt datasæt, der viser resultaterne af et enkelt sæt nanoindrykningsforsøg på MSC'er og isolerede kerner. I dataene præsenteret i figur 12B, prækalibreret (fjederkonstant via LDV og spidsradius via SEM), blev halvkugleformede sonder med en radius på 5 μm med en nominel fjederkonstant på k = 0,04 N/m anvendt til at undersøge forskelle i modul mellem intakte levende MSC'er og isolerede MSC-kerner, der fungerede som kontroller for at teste virkningerne af statiske og dynamiske stammer på celle- og kernemekaniske egenskaber⁴⁶ . På grund af forskelle mellem og udfordringer med at engagere sig på cellerne og kernerne har de ekstraherede moduldata tendens til at udvise en stor variation (dvs. fordeling af værdier). Datasættet i figur 12B viser derfor en^75-procentil af de indsamlede data. På grund af denne medfødte variation blandt levende celler og den deraf følgende målespredning anbefales det at udføre replikate nanoindrykningsforsøg på et stort antal prøver med mindst tre biologiske replikater for at generere robuste statistikker til dataanalyse og fortolkning³⁰.

Mekaniske egenskaber af kolesterolholdige lipiddobbeltlag
Understøttede lipidmembraner med meget højt (>50 mol%) kolesterolindhold (Chol), typisk for sammensætningen, der findes i øjenlinsemembraner, blev fremstillet og inkuberet på frisk spaltet muscovitglimmer⁴⁹. Figur 13A viser et repræsentativt AFM-topografibillede af en sådan understøttet lipidmembran (SLM) fremstillet ved et Chol/POPC-blandingsforhold (POPC = 1-palmitoyl-2-oleoylglycero-3-phosphocholin) på 1 med højdeprofilen langs den lilla linje på billedet vist under figuren. SLM i figur 13A dækkede fuldstændigt den eksponerede glimmeroverflade med tilstrækkelig inkubationstid (~ 25 min) og en tilstrækkelig lipidkoncentration (0,3 mg / ml), hvilket fremgår af manglen på skelnelige træk i topografibilledet. På samme måde giver højdeprofilen på tværs af billedet strukturelle detaljer vedrørende ruheden af membranoverfladen, med SLM glat som forventet.

Figur 13B viser en samling af indflyvningsafsnit af kraftkurver fanget på SLM vist i figur 13A. For at opnå bedre statistikker vedrørende SLM's mekaniske egenskaber blev kraftkurver indsamlet på lige fjerne punkter med en indbyrdes afstand på mindst 100 nm og dækkede næsten hele SLM's bredde. Afstanden mellem punkterne (≥10x indrykningsdybden) blev valgt for at forhindre, at indrykning forekommer for tæt på hinanden. Kraftkurverne viser en klar gennembrudsbegivenhed, som det fremgår af diskontinuiteten eller det pludselige spring mellem ~0 og ~5 nm separationsafstandene i tilgangsafsnittet af kraftkurverne, hvor kraften falder brat fra ~ 10 nN til ~ 5 nN. Den gennemsnitlige gennembrudskraft for membranen vist i figur 13A (Chol/POPC-blandingsforholdet på 1) baseret på indflyvningskurverne i figur 13B er beregnet til at være 9,25 ± 0,27 nN.

I modsætning hertil viser figur 13C et AFM-topografibillede af partielle membran- eller membranpletter dannet ved igen at inkubere membraner ved et Chol/POPC-blandingsforhold på 1, men ved en meget lavere koncentration af lipider (~15 μg/ml) og med en kortere inkubationstid (~5-6 min)⁴⁹. Højdeprofilen langs den røde linje over membranplasteret i midten af billedet er vist under figuren. Målingen på tværs af det delvise dobbeltlag giver tykkelsen af SLM, vist med de sorte stiplede linjer i figur 13C til at være ~ 7 nm. Denne målte tykkelse inkorporerer imidlertid også et 1-2 nm vandlag mellem membranen og glimmerskiven⁵⁰. Det skal bemærkes, at den delvise membran ofte kun er svagt fastgjort til glimmeroverfladen, hvilket kan forårsage, at lipidpartikler fjernes fra kanten af de delvise membranpletter under scanning, men en lidt længere inkubationstid eller sænkning af billedkraften kan eliminere denne vanskelighed.

Kalibrering af AFM-sonden er afgørende for nøjagtigt at kvantificere SLM's mekaniske egenskaber. Selv om spidsfjederkonstanten forbliver konsistent i luft eller væskemedium, skal afbøjningsfølsomheden kalibreres i det samme medium, som forsøgene udføres. Det er afgørende at kalibrere afbøjningsfølsomheden umiddelbart før hvert sæt kraftkurveoptagelser for at sikre reproducerbare resultater, da laserjusteringen og/eller reflektionsevnen af bagsidebelægningen kan ændre sig over tid, især i væske. Meget skarpe sonder frarådes til at fange membrankraftkurver, da de let punkterer SLM og kan føre til måling af en fejlagtigt lav gennembrudskraft eller slet intet gennembrud. Gentagen brug af den samme spids uden ordentlig rengøring øger imidlertid risikoen for, at snavs samler sig på spidsen og derved sløver spidsen eller påvirker spidsprøvens klæbekræfter. En mangel på gennembrudshændelser, der er tydelige i indflyvningskraftkurverne, kan også svare til kun at skubbe på glimmer i stedet for den faktiske membran; Således er visuel bekræftelse af membrandannelse før indfangning af kraftkurver nødvendig.

Figur 7: Repræsentative kraftforskydningskurver (F-D) i luft og væske. Repræsentative kraftkurver opnået på (A) en loblolly fyr i luft med tilhørende DMT-modeltilpasning og (B) en strømførende MSC-kerne i PBS med en ledsagende Hertz-modeltilpasning. Indsatser i panel A og B viser en zoom af kontaktområdet for de tilsvarende indflyvningskurver (blå spor) med tilhørende pasform (grønne spor). I hvert panel er det indledende kontaktpunkt for spidsprøven (som bestemt af tilpasningsalgoritmen) angivet med en grøn diamant, mens vendepunktet (dvs. overgangen fra tilgang til tilbagetrækning eller tilbagetrækning) er angivet med en cyancirkel. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 8: Sammenligning af slid på silicium versus diamantsondespids. (A-D) Spids af siliciumsonde. Serie af modeller skabt ved rekonstruktionsmetoden blind tip efter billeddannelse af en spidskarakteriseringsprøve, der demonstrerer udviklingen i radius af en stiv cantilever siliciumspidssonde (se materialetabel) på grund af progressivt spidsslid oplevet i løbet af tre sekventielle 85 μm x 85 μm (1024 x 1024 pixels) kraftkurvebaserede billeder af en Bakken-skiferprøve, udført ved en linjescanningshastighed på 0,1 Hz og kraftkurvesamplingshastighed på 2 kHz (dvs. ~20 millioner tip-sample-interaktioner/billede). (A) Drikkepenge som modtaget (ud af æsken) før brug. R = 11 nm. (B) Tip efter et billede (R = 43 nm). (C) Tip efter to billeder (R = 94 nm). (D) Tip efter tre billeder (R = 129 nm). (E,F) Diamant sonde tip. BTR-modeller af den samme diamantspidssonde (se materialetabel) opnået ~ 6 måneders mellemrum. Mellem erhvervelsen af spidsbillederne, der blev brugt til at generere modellerne vist i E og F, blev tusindvis af nanoindrykninger udført med sonden, og hundreder af millioner af spidsprøveinteraktioner under kraftkurvebaseret billeddannelse fandt sted. På grund af diamantens hårdhed ændrede den estimerede spidsenderadius på ~30 nm sig ikke inden for BTR-teknikkens usikkerhedsgrænser mellem erhvervelse af de indledende (E) og opfølgende (F) billeder af spidsen. Asperiteten observeret i den tidligere model (angivet med den sorte cirkel i panel E er sandsynligvis enten en artefakt af BTR-metoden eller på grund af tilstedeværelsen af et nanoskala forurenende stof (f.eks. Støvpartikel) på siden af spidsen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 9: AFM-topografi og modulkort over en loblolly fyrretræsprøve. Repræsentative AFM-data indsamlet i luft på en tværsnittet loblolly fyrretræsprøve indlejret i harpiks for at muliggøre cantilever-baserede nanoindrykningsmålinger på cellevægge. (A) AFM-topografibillede, der dækker flere celler erhvervet via en hurtig kraftkurvebaseret billeddannelsestilstand, præsenteret som en pseudo-3D-afbildning. (B) Elastic eller Youngs modulkort genereret i realtid af AFM-softwaren ved at analysere kraftkurven erhvervet ved hver pixel og tilpasse dataene til DMT-modellen, hvilket viser, at cellevæggene er stivere end celleinteriørerne. Bemærk, at de nominelle, snarere end målte, sondekalibreringsparametre blev anvendt, så modulværdierne skal behandles som kvalitative eller kun semikvantitative. (C) Oversigt over investeringsafkastet med angivelse af de steder (otte linjer bestående af 50 hvide trådkors stykket med en indbyrdes afstand ≥100 nm fra hinanden), hvor 400 nanoindrykninger (nominel rampestørrelse på 60 nm med en udløsningstærskel på 1 μN svarende til en gennemsnitlig indrykningsdybde på ~10 nm) blev udført langs udvalgte cellevægge efter erhvervelse af AFM-billedet for at muliggøre lokalisering af indrykninger med nanoskalapræcision. Skalastænger = 20 μm (A,B). Forkortelser: AFM = atomkraftmikroskopi; DMT = Derjaguin-Müller-Toporov. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 10: Samlokaliseret AFM og SEM/EDS af en Bakken-skiferprøve. (A) Sekundær elektron SEM-billede af en del af en Bakken-skiferprøve. B) AFM-topografibillede af regionen angivet med den sorte boks i A. Sort oval angiver et område, hvor sondens lave billedformat fører til billeddannelse af sondens sidevæg i stedet for den stejle overfladetopografifunktion med højt billedformat. C) EDS-kort over grundstofsammensætningen, der er indhentet for SEM-billedet vist i A. (D) AFM-afledt elastik eller Youngs modulkort, der genereres i løbet af opnåelsen af AFM-topografibilledet i B, der viser, at mineraloptagelsen i midten af billederne A-D er betydeligt hårdere end den omgivende organiske matrix. Skalastænger = 50 μm. Forkortelser: AFM = atomkraftmikroskopi; SEM = scanning elektronmikroskopi; EDS = energidispersiv spektroskopi. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 11: Effekt af sondespidsens radius og form på udseendet af funktioner med højt billedformat. Sammenligning af funktionsopløsning opnået ved hjælp af enten (A) en R≈ 30 nm lavt billedformat (spidshalvvinkel = 47°) diamantspidssonde (se materialetabel) eller (B) en R≈ 10 nm højt billedformat (spidshalvvinkel ≈ 19°) stiv siliciumsonde (nominel k = 200 N/m; se materialetabel) for at afbilde den samme placering på en Bakken-skiferprøve. (C-F) Zoomede billeder af de blå (C,D) og orange (E,F) indrammede områder i A og B opnået med enten den større krumningsradius med lavt billedformat diamantspidssonde (C,E) eller den skarpere, højere billedformat stiv siliciumtappetilstandssonde (D,F), der fremhæver den reducerede funktionsopløsning og introduktionen af spidssidevægsartefakter i AFM-topografibilledet opnået med diamantspidssonden på grund af dens større spidsradius og halv vinkel. De områder, der er fremhævet i CF, indeholder stejle, dybe vellignende funktioner, der demonstrerer afvejningerne med hensyn til lateral opløsning, nøjagtig sporing og billedfidelitet mellem en lettere sløvet, oprindeligt skarp siliciumsonde eller en stumpere, slidstærk diamantspidssonde. (G) Sammensat 3D-billede genereret ved at kombinere AFM-topografi erhvervet med den skarpe, højere billedformat stive siliciumsonde med moduldata (overlejret farvet hud) afledt af hurtig kraftkurvebilleddannelse af det samme område af prøven med diamantspidssonden. De funktioner, der fremhæves af de blå og hvide felter i A og B, er også angivet i G. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 12: Cantilever-baseret nanoindrykning på celler eller kerner. A) En celle med radius R ₁ placeret på et fladt, stift substrat indrykkes til en dybde d af en sfærisk indenter med radius R₂. Denne figur blev gengivet fra Ding et ^al.48. B) Individuelle værdidiagrammer for repræsentative modulmålinger opnået fra AFM-udkragningsbaserede nanoindrykningsforsøg på MSC'er med mus og isolerede kerner ekstraheret fra MSC'er med mus. I alt 10 celler og 10 kerner blev målt fem gange hver ved en fordybningsdybde på 500-600 nm (valgt for at tillade brug af Hertz kontaktmekanikmodellen). De resulterende rå F-D-kurvedata blev behandlet ved hjælp af Atomic J²³ til beregning af de elastiske moduli. På grund af cellernes store medfødte variabilitet afbildes en 75. percentil af dataene^. Celle- og isolerede kerner udviste ingen statistisk forskel i elastisk modul med et målt gennemsnitligt moduli på henholdsvis 0,75 ± 0,22 kPa og 0,73 ± 0,22 kPa. Lignende data er blevet indsamlet og analyseret for at bestemme forskelle i nuklear stivhed på grund af mekanisk stimulering, proteinudskæringer og kemiske behandlinger. Forkortelser: MSC = mesenkymal stamcelle; AFM = atomkraftmikroskopi; F-D = kraftforskydning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 13: Morfologi og nanomekaniske egenskaber af lipiddobbeltlag. (A) AFM-topografibillede, der viser den minimale højdevariation af en komplet understøttet lipidmembran (SLM) sammensat af Chol/POPC ved et blandingsforhold på 1, der dannes over hele den eksponerede glimmeroverflade med lang inkubationstid (~25 min) og høj lipidkoncentration (0,3 mg/ml). Højdeprofilen langs den lilla linje over midten af billedet er vist under figuren, hvilket giver strukturelle detaljer om membranoverfladen. Som forventet er SLM ekstremt glat. (B) Samling af indflyvningssektioner af kraftkurver fanget på SLM vist i A. Kraftkurver blev indsamlet på lige store punkter ≥100 nm fra hinanden, der dækkede næsten hele SLM. Kraftkurverne viser en klar gennembrudsbegivenhed, som det fremgår af diskontinuiteten eller det pludselige spring i kraftkurvernes tilgangsafsnit. Den gennemsnitlige gennembrudskraft er 9,25 ± 0,27 nN. (C) Delmembran- eller membranplastre dannet ved inkubation af membraner ved et Chol/POPC-blandingsforhold på 1 med en kortere inkubationstid (~5-6 min) og lavere lipidkoncentration (~15 μg/ml) i forhold til A⁴⁹. Højdeprofilen langs den røde linje på plasteret vises under billedet. Det delvise dobbeltlag muliggør måling af tykkelsen af SLM, vist ved de sorte stiplede linjer i højdeprofilen. Bemærk, at den målte tykkelse også indeholder et 1-2 nm vandlag mellem membranen og glimmerskiven⁵⁰. Denne figur blev tilpasset fra Khadka et ^al.49 med tilladelse fra Elsevier. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

Forberedelse af prøver
For nanoindrykning i luft omfatter almindelige forberedelsesmetoder kryosektionering (f.eks. vævsprøver), slibning og/eller polering efterfulgt af ultramikrotoming (f.eks. harpiksindlejrede biologiske prøver), ionfræsning eller fokuseret ionstråleforberedelse (f.eks. halvleder-, porøse eller blandede hårdhedsprøver, der ikke kan poleres), mekanisk eller elektrokemisk polering (f.eks. metallegeringer) eller tyndfilmsaflejring (f.eks. atomlag eller kemisk dampaflejring, molekylær stråle epitaksi). Målet er at skabe en prøve med minimal overfladeruhed (ideelt nm-skala, ≤0,1x den tilsigtede indrykningsdybde). Med mange af de foregående metoder skal prøven muligvis efterfølgende skylles med og / eller sonikeres i filtreret opløsningsmiddel med høj renhed (f.eks. HPLC-kvalitet) og tørres med ultrahøj renhed (99,999%) nitrogen (_N2) gas for at fjerne partikelaffald. Alternativt kan flager (f.eks. 2D-materialer) eller partikler (f.eks. nanopartikler eller mikrokapsler) spinbelægges eller dråbestøbes ud af opløsninger fremstillet ved hjælp af filtrerede opløsningsmidler med høj renhed. I dette tilfælde er målet at opnå en overfladetæthed, der giver flere ikke-overlappende flager eller partikler inden for synsfeltet i ethvert tilfældigt valgt område på prøven. For nanoindrykning i væske (ofte anvendt til biologiske prøver, der kræver bufferopløsning for at forblive levedygtig), er deponering eller forberedelse af prøver på et glat substrat (nanometerskala overfladeruhed) substrat (f.eks. mikroskopglas, petriskål eller friskspaltet muscovitglimmer) nødvendigt^46,47,49.

Overvejelser ved valg af sonde
Valget af en passende sonde er af største betydning for kvantitativ analyse af F-D-kurver, da tip-prøve-interaktionen er den grundlæggende egenskab, der måles i cantilever-baseret nanoindrykning. Følgende spørgsmål er af særlig betydning, når du vælger en sonde til et givet eksperiment. Hvad er prøvens forventede (eller målte) overfladeruhed og elastiske modulområde? Prøver med høj ruhed kan forårsage accelereret slid sammenlignet med glattere prøver på grund af de øgede laterale kræfter, der findes på spidsen, når man sporer stejle træk, samt øge sandsynligheden for spidsbrudshændelser⁵³. Ligeledes, jo hårdere prøven er, jo hurtigere vil den bære sondespidsen. Derudover, hvor mange billeder og / eller nanoindrykninger er nødvendige? Med mindre billeddannelse og indrykning kan der forventes mindre slid på spidserne. Som beskrevet mere detaljeret nedenfor kan spidsslid reduceres ved at bruge diamantlignende kulstofbelægninger (DLC) eller praktisk talt elimineres ved hjælp af diamantspidssonder (med de høje omkostninger ved erhvervelse opvejet over tid af den næsten uendelige sondelevetid).

En anden overvejelse ved valg af en passende sonde er størrelsen af de interessante funktioner. Til nanoindrykning er det ofte bedst at bruge den størst mulige spidsstørrelse, samtidig med at den rumlige opløsning, der er nødvendig for den eller de pågældende prøver, og det ønskede informationsindhold opretholdes, fordi større spidser er mindre tilbøjelige til at opleve pludselige ændringer i spidsgeometrien på grund af brud og også vil udvise lavere slidhastigheder⁵⁴. Det er også vigtigt at overveje, om der er andre AFM-metoder, der skal lokaliseres sammen med nanoindrykning, såsom ledende AFM⁵⁵, Kelvin-sondekraftmikroskopi (KPFM)⁵⁶ eller magnetisk kraftmikroskopi (MFM)⁵⁷. Hvis yderligere metrologier som disse skal udnyttes, skal sondespidsen muligvis være elektrisk ledende eller magnetisk, hvilket vil påvirke materialesammensætningen og dermed en lang række egenskaber, herunder hårdhed, slidstyrke og spidsradius. Ligeledes, hvis indrykning udføres i væske, er sammensætningen af sondens reflekterende bagsidebelægning (hvis den er til stede) en anden vigtig overvejelse, da den skal være korrosionsbestandig (f.eks. En Au-bagsidebelægning er almindelig for væskesonder). Endelig, og måske vigtigst, skal sondeudkragningens fjederkonstant matches med det forventede interval af elastiske moduler, der skal måles. Hvis fjederkonstanten ikke stemmer godt overens med prøvemodulet, kan der forekomme et af to tilfælde. Hvis udkragningen er for stiv, måles ringe eller ingen afbøjning, og karakterisering bliver umulig; Omvendt, hvis udkragningen er for blød, vil den ikke være i stand til at deformere prøven nok til at måle dens mekaniske egenskaber.

Tip slid
Slid kan defineres på mange måder; til diskussion af slid på AFM-sondespidsen her defineres det som enhver ændring i sondespidsens overfladetopografi på grund af plastisk deformation uden tab af materiale samt enhver fjernelse af materiale fra overfladen på grund af fysiske interaktioner⁵⁸. I bredere forstand kan slid også involvere kemiske reaktioner såsom oxidation og hydrering. I normale AFM-applikationer er den laterale rumlige opløsning normalt begrænset af spidsradius⁵⁹, og tip-sample-interaktionen er den primære målte egenskab. Da spidsradius er en nøgleparameter i modellering af tipprøvesystemets kontaktmekanik og efterfølgende bestemmelse af de mekaniske egenskaber, er tipslid af særlig betydning ved udførelse af nanoindrykningseksperimenter og er en vigtig begrænsning for nøjagtig fortolkning af nanoindrykningsresultater⁵³. På grund af den normalt gradvise karakter af spidsslid (bortset fra spidsbrud) er det ikke muligt at kvantificere spidsslid på grund af en enkelt nanoindrykningscyklus (dvs. rampe). Desuden er sondespidsens vinkelrette bevægelse i forhold til prøven i nanoindrykning (diskontering af hurtig kraftkurvebaseret billeddannelse) egnet til at reducere slidhastigheden, da den primære tilstand af spidsslid typisk er forskydningskræfter, der udvikler sig under scanningstilstande⁶⁰. Som sådan er den primære kilde til tipslid i nanoindrykningseksperimenter enhver billeddannelse, der udføres efter den indledende sondekalibrering (især afbøjningsfølsomhed og spidsradiusmålinger), men før nanoindrykning. Det anbefales derfor, at hvis der anvendes silicium- eller siliciumnitridsonder, skal spidsradius kontrolleres både før og efter hvert forsøg for at overvåge og tage højde for eventuelt slid på lossepladsen ved hjælp af en af de ovenfor beskrevne metoder (f.eks. SEM-analyse eller BTR).

Sonde materialer
Diamantlignende kulstof (DLC)
Ved brug af DLC-belagte sondespidser eller diamantspidser kan slid på spidser reduceres eller negeres helt⁵³. Den forbedrede slidstyrke af disse alternative spidsmaterialer er meget lokkende til måling af mekaniske egenskaber, især af meget stive materialer. Det har vist sig, at DLC-sondespidser kan vise en 1.600 gange stigning i slidstyrke sammenlignet med normale siliciumsondespidser⁵⁴. Denne dramatiske stigning i slidstyrke kan tilskrives flere faktorer. For det første er de bindinger, der findes i DLC (C-C og C = C) og dens grænseflade med silicium (Si-O, Si-C) nogle af de stærkeste bindinger af ethvert elementært par og meget stærkere end Si-Si-bindingerne, der findes i siliciumspidser. DLC har også den virkning, at friktionen mindskes, hvilket igen sænker forskydningsspændingerne i spidsen og derved reducerer slid. Derudover er DLC-overfladekemien forskellig fra en siliciumspids, da siliciumspidser kan opleve tribokemisk ætsning under omgivende fugtighedsforhold, mens DLC-spidser ikke gør det (eller i det mindste ikke på nogen meningsfuld måde sammenlignet med den primære slidtilstand)⁵⁴. Den primære ulempe ved DLC-belagte spidser (ud over øget pris i forhold til standard ubelagte siliciumspidser) er den øgede spidsradius på grund af selve belægningen. De fleste DLC-sondespidsradier er ≥30 nm, mens ikke-DLC-coatede spidser pålideligt kan nå 1-2 nm i radius⁶¹. Imidlertid kan en større spidsradius ofte være ønskelig for nanoindrykningseksperimenter for at reducere fejl i egenskabsmålinger, da nanoskala uoverensstemmelser mellem den ideelle arealdybdefunktion og den faktiske arealdybdefunktion på grund af sondefejl eller asperiteter uforholdsmæssigt vil påvirke målinger foretaget med sonder med mindre radius på grund af den større relative fejl. På trods af sin overlegne slidstyrke kan DLC-belægningen desuden i sidste ende slides igennem i pletter, hvilket fører til differentiel slid mellem den eksponerede siliciumkerne og den resterende DLC-belægning. Desværre kan DLC-belægningens slidstyrke også være begrænset af belægningens vedhæftning til siliciumspidsen snarere end belægningens faktiske hårdhed alene.

Diamant
Diamant er kendt som et af de hårdeste og mest slidstærke materialer på jorden. Ikke desto mindre er det blevet påvist, at der stadig kan forekomme betydeligt slid i diamantspidser, når der anvendes store (60 μN) kræfter i et bevidst forsøg på at udforske spidsslid⁶². Omvendt har der i normale nanoindryknings- og billeddannelsesscenarier, hvor kræfterne på spidsen er meget mindre, ikke været nogen strenge undersøgelser af diamantspidsslid. Som det ses i figur 8E, F, genererede BTR-modellering af den samme diamantsondespids under identiske betingelser på den samme spidskarakteriseringsprøve med 6 måneders mellemrum praktisk talt uadskillelige spidsformmodeller (dvs. ingen mærkbare tegn på slid). Mellem det første og andet BTR-billede blev sonden brugt til at udføre tusindvis af nanoindrykninger og gennemgik hundreder af millioner af spidsprøveinteraktioner, mens den afbildede en række stive materialer (E > 15 GPa), herunder træ (loblolly fyr), skifer, højt ordnet pyrolytisk grafit (HOPG) og forskellige grafentynde film. Det er signifikant, at den estimerede spidsradius ændrede sig med ~ 1 nm mellem de to billeder i figur 8E, F, hvilket er godt inden for BTR-metodens fejl⁶³. Selvom det ikke er en fuldstændig undersøgelse, viser denne sammenligning den fremragende holdbarhed af en diamantsonde under normale eksperimentelle nanoindrykningsforhold (og endda billeddannelse). De største ulemper forbundet med brugen af diamantspidser (ud over dyre startomkostninger) er den øgede spidsradius og, på nogle måder mere bekymrende, det lave billedformat for terninghjørnegeometrien for de fleste kommercielt tilgængelige diamantspidser. Figur 11A,B viser sammenlignende AFM-billeder side om side af det samme område af en skiferprøve fra Bakken erhvervet med en skarp siliciumsonde med en nominel spidsradius på 8 nm og en gennemsnitlig halvvinkel på ~19° versus en diamantspidssonde med en nominel spidsradius på 40 nm og en gennemsnitlig sidevinkel på 47°. Når de forstørrede områder sammenlignes (figur 11C, D og figur 11E, F), er det let tydeligt, at diamantspidssonden ikke er i stand til at løse og nøjagtigt spore de stejlere (højere billedformat) funktioner i billedet. I stedet, hvor stejle træk er til stede, kommer spidsens sidevæg i kontakt med den øverste kant, og AFM-systemet sporer i det væsentlige sondens sidevæg, indtil spidsenden kommer i kontakt med overfladen igen, og normal sporing genoptages.

Fjederkonstant/modul matchning
Som nævnt ovenfor skal sondeudkragningens fjederkonstant matches med det forventede interval af elastiske moduler, der skal måles. For at hjælpe med at vælge en passende sonde viser tabel 3 foreslåede omtrentlige nominelle cantileverfjederkonstanter, der er egnede til udvalgte brede intervaller af forventede prøveelastiske moduli, der spænder fra få MPa til 100 GPa i tilfælde af ~ 30-40 nm radius sondespidser, der ofte anvendes til nanoindrykning⁵². Nedre fjeder konstante sonder (k < 0,1 N / m) er tilgængelige for endnu blødere materialer (kPa rækkevidde) såsom celler.

Fjederkonstant (N/m)	Forventet prøvemodulinterval
0.25	≤ 15 MPa
5	5 – 500 MPa
40	200 - 8,000 (0.2 - 8 GPa)
200	1,000 - 50,000 (1 - 50 GPa)
450	10,000 - 100,000 (10 - 100 GPa)

Tabel 3: Ideelle sondefjederkonstanter til måling af forskellige modulområder. Omtrentlige nominelle sondefjederkonstanter til optimal måling af elastiske moduli på tværs af forskellige områder fra få MPa til 100 GPa, forudsat en typisk sonderadius på ~ 30-40 nm⁵².

Ud over fjederkonstanten skal spidsradius og kræfter, der påføres under billeddannelse og nanoindrykning, i det særlige tilfælde af biologiske materialer overvejes nøje for at undgå skader. I applikationseksemplet , der involverede måling af de mekaniske egenskaber af kolesterolholdige lipiddobbeltlag, præsenteret i afsnittet om repræsentative resultater, blev en relativt skarp (10 nm) spids specifikt anvendt til analyse af gennembrudskraften i lipiddobbeltlag. I modsætning hertil, hvis materialets ROI er stort nok (f.eks. som det er tilfældet for celler og cellekerner), og der er bekymring for potentialet for punktering, er større halvkugleformede spidser i mikronskala, som dem, der anvendes i stivhedsmålingerne på MSC-kerner, der er beskrevet i et af applikationseksemplerne i afsnittet om repræsentative resultater, ideelle og giver fremragende resultater for bløde, skrøbelige prøver såsom levende celler og isolerede kerner. Kain et al. præsenterer en dybdegående diskussion af, hvordan man vælger den optimale kombination af sonderadius og fjederkonstant for at opnå den højest mulige målefølsomhed for sådanne prøver⁶⁴.

Kalibrering af sonde
Afbøjning følsomhed
Afbøjningsfølsomheden relaterer Z-piezoens bevægelse (og dermed udkragningens afbøjning ved indrykning på et uendeligt stift substrat under forudsætning af drift inden for grænsen for små udbøjninger) til en målt spændingsændring på PSD⁶⁵. Afbøjningsfølsomheden (også undertiden benævnt den inverse optiske håndtagsfølsomhed [InvOLS]) kan rapporteres i nm/V eller V/nm. En oversigt over de mest almindelige kalibreringsmetoder for afbøjningsfølsomhed findes nedenfor.

Kontakt med hård overflade
Den nemmeste og mest populære metode til bestemmelse af strålehoppelaserens/AFM-sondens / PSD-systemets afbøjningsfølsomhed er den passende betegnelse "hård overfladekontakt" metode⁶⁵. Dens enkelhed, nemme integration i AFM-styringssoftwarearbejdsgange og in situ-natur bidrager alle til den hårde overfladekontaktmetodes appel og udbredte anvendelse. For at implementere denne metode rampes AFM-sondespidsen mod et materiale, der er meget stivere end udkragningen. Hældningen af den kontaktende del af kraftforskydningskurven (vist som volt af lodret afbøjningsfejlsignal på PSD som funktion af Z-piezo-bevægelse i nm eller anvendt spænding) giver derefter afbøjningsfølsomheden (figur 3A). Brugen af et stift substrat sikrer, at al den målte afbøjning stammer fra udkragningsbøjningen snarere end en krumning af prøvedeformation og udkragningens forskydning. For bløde udkragninger (f.eks. k < 10 N/m), silicium (E ≈ 170 GPa)²⁷ eller glimmer¹⁷ er let tilgængelige og let anvendte materialer (eller alternativt glas, E≈ 70 GPa eller passende hård plast i tilfælde af celler, der er immobiliseret på et mikroskopglas eller en petriskål), mens der for stivere udkragninger såsom dem, der anvendes til nogle nanoindrykningseksperimenter (f.eks. k > 200 N/m; Tabel 3), skal safir (E≈ 345 GPa)^26,66 muligvis anvendes for at sikre^, at der ikke forekommer prøvedeformation. Da denne metode er afhængig af kraftforskydningsmålingen, skal AFM-scannerens Z-piezo enten anvende en højdesensor med lukket sløjfe eller være godt kalibreret (hvis den fungerer i åben sløjfetilstand) ved hjælp af en række højdestandarder. Den største bidragyder til fejl i metoden med hård overfladekontakt er bevægelse af laserpletten på udkragningen på grund af termiske udsving. Ændringer i cantileverens temperatur skyldes oftest detektionslaseren, selvom Joule-opvarmning i den omgivende elektronik også kan bidrage. Der er rapporteret om samlede temperaturforskelle på 6 °C mellem udkragningen og den omgivende luft, hvilket kan føre til laserpunktforskydninger på flere mikron⁶⁷. For at tage højde for eventuel opvarmning anbefales det at vente ≥30 minutter efter den indledende laserpunktjustering for at give udkragningen mulighed for at komme i termisk ligevægt med omgivelserne for at få de bedste og mest nøjagtige resultater. Gennemsnittet af hældningerne på indflyvnings- og tilbagetrækningskurverne for hver følsomhedsmåling vil tage højde for eventuelle spidsfriktions- eller glidevirkninger og bør om muligt^{vedtages 68}. Derudover vil gennemsnit på tværs af flere følsomhedsmålinger hjælpe med at måle målingens pålidelighed og reproducerbarhed. Gode følsomhedsmålinger bør resultere i afvigelser på ≤1 % og udføres med omtrent samme afbøjning som de forventede eksperimentelle nanoled for at maksimere kalibreringens effektivitet⁶⁹. Den største ulempe ved metoden med hård overfladekontakt er, at den fysiske kontakt, der er nødvendig for kalibreringen, potentielt kan forårsage skade på skrøbelige siliciumspidser (f.eks. sløvning eller oprettelse af spidsartefakter såsom en dobbelt spids).

Termisk støj metode
Termisk støj-metoden til bestemmelse af udbøjningsfølsomheden kræver forudgående kalibrering af udkragningsfjederkonstanten og evnen til at måle udkragningens termiske støjspektrum⁶⁷. Den termiske støjmetode er ofte integreret i moderne AFM-styringssoftware og kan bruges sammen med Sader-metoden (se nedenfor) til hurtig analyse og beregning af både fjederkonstanten og afbøjningsfølsomheden. Det kan dog være vanskeligt eller umuligt at anvende termisk støjmetode på stivere (k > 10 N/m) udkragninger på grund af nedsat vibrationsamplitude. Derudover er den rapporterede relative usikkerhed ved termisk støjmetode betydeligt større, ~ 20% sammenlignet med den hårde overfladekontaktmetode beskrevet ovenfor⁷⁰. Denne teknik kan ikke anvendes, hvis den nedenfor beskrevne termiske tunemetode til bestemmelse af fjederkonstanten^{anvendes 67}.

Forår konstant
Guldstandarden til måling af cantileverfjederkonstanter er laser Doppler vibrometry (LDV), og der er nu mange kommercielt tilgængelige sonder, der leveres med LDV-afledte fjederkonstantkalibreringsoplysninger fra producenten for hver enkelt sonde (se materialetabel). Mens nøjagtig måling af udkragningsfjederkonstanten er en absolut nødvendighed for kvantitative nanomekaniske målinger, er de praktiske metoder til at gøre det i det typiske laboratorium for ikke-kalibrerede sonder meget forskellige og kan være noget komplekse. Som sådan gives kun en kort oversigt over de to mest almindelige fjederkonstantkalibreringsmetoder på stedet her med en liste over yderligere metoder og passende litteraturcitater, der kan konsulteres for mere information.

Termisk tune metode
Sandsynligvis den mest almindelige metode, der er tilgængelig i nutidens kommercielle AFM'er, er den termiske tunemetode til bestemmelse af cantileverfjederkonstanter indbygget i styringssoftwaren til mange systemer. Selvom den termiske tunemetode ikke er ideel til stivere udkragninger (k > 10 N/m) på grund af reduceret udkragningsdetektering og begrænset elektronisk båndbredde, er den relativt nem at implementere og gælder for en lang række spidsgeometrier⁷¹. Den termiske melodimetode anvender måling og tilpasning af cantileverens termiske støjspektrum efterfulgt af anvendelse af ækvipartitionssætningen til beregning af cantileverens potentielle energi, hvor cantileveren generelt modelleres som en simpel harmonisk oscillator⁷². Den termiske tunemetode har en fejl på ~5% -10% for bløde sonder og kan anvendes til enhver udkragningsform^73,74. Du kan finde mere detaljerede oplysninger i de referencer, der er nævnt i dette afsnit.

Sader metode
Sader-metoden er en anden metode, der ofte er integreret i styringssoftwaren til mange moderne AFM'er^75,76,77. Sader-metoden bruger den hydrodynamiske belastning, som en udkragning oplever, da den vibrerer i et flydende medium (normalt luft eller vand) sammen med udkragningens planvisningsdimensioner og kvalitetsfaktor til beregning af udkragningsfjederkonstanten. Sader-metoden fører til en fejl på ~ 10% -15% for cantilever fjederkonstanten⁷⁴. Tilsvarende dokumenter om den "oprindelige metode"76,78, "generel metode"^79, en udvidelse af den generelle metode ⁷⁷ og instrumentspecifik dokumentation kan give yderligere detaljer.

Andre metoder
Der er flere andre metoder, der er udviklet og implementeret til at bestemme fjederkonstanten for AFM-udkragninger, der ligger uden for dette papirs anvendelsesområde. Selvom ingen af disse metoder er så lette at implementere eller så udbredte som Sader eller termiske tunekalibreringsmetoder, har de hver især unikke fordele og ulemper; Den citerede litteratur indeholder detaljer om deres anvendelse og implementering. Især giver Sikora en fremragende gennemgang af mange fjederkonstantkalibreringsmetoder og er en fremragende ressource om emnet⁷². En ikke-udtømmende liste over andre metoder til bestemmelse af fjederkonstanter omfatter laser Doppler vibrometry (LDV) 73,74,80, mikro-elektrisk-mekaniske systemer (MEMS) baserede enheder⁸¹, reference cantilever 82,83, tilføjet masse (både dynamisk ⁷⁵ og statisk ⁸⁴), præcisionsbalance^85,86, elektromagnetisk aktivering ⁸⁷ og finite element analyse (FEA) ^88,89.

Spids radius
Almindelige metoder til bestemmelse af spidsradius omfatter både sekundær elektron SEM-billeddannelse og rekonstruktionsmetoden for blinde spidser (BTR).

SEM-analyse
Sekundær elektron SEM-billeddannelse kan give opløsning ned til 1 nm, hvilket gør det muligt at sammenligne progressive billeder af slid direkte og nemt. En ulempe ved SEM-billeddannelse er, at fordi der kun findes meget eksperimentelle kombinerede AFM-SEM-værktøjer⁹⁰, skal AFM-sonden typisk afmonteres og transporteres til SEM til analyse, hvilket kan være både tidskrævende og potentielt udsætte sonden for kontaminering. En anden ulempe ved SEM er, at det resulterende billede i sagens natur er en 2D-projektion af spidsen, uden kvantitativ 3D-information tilgængelig. Der skal udvises omhu for at justere sonden i nøjagtig samme retning hver gang for at komparative resultater skal være meningsfulde, da selv små ændringer i elektronstrålens indfaldende vinkel kan ændre sondespidsens tilsyneladende størrelse og form. Endelig kan SEM-billeddannelse være plaget af opladningseffekter og kulstofforurening, som henholdsvis kan sløre billedet eller forårsage fysiske ændringer i sondespidsen.

Rekonstruktion af blinde spidser
I modsætning til SEM er BTR-metoden en in situ-teknik , hvor 3D-spidsgeometrien modelleres baseret på billeddannelse af en prøve med adskillige skarpe (højt billedformat) funktioner, der er meget mindre end sondens radius. Denne metode fungerer, fordi det observerede billede i AFM altid er en konvolution af sondespidsformen og prøvefunktionsformen, så ved at modellere ekstremt skarpe træk som uendeligt skarpe, kan spidsformen estimeres. Desværre kan BTR-teknikken ud over antagelsen om uendeligt skarpe pigge (dvs. overfladefunktioner, der er meget mindre end spidsradiusen) påvirkes af billedstøj og scanningsparametre, så sammenlignende billeder skal opnås ved hjælp af meget lignende billeddannelsesparametre. Derudover, fordi flere "billeder" af spidsen bruges til at rekonstruere dens geometri, er en direkte en-til-en omvendt beregning af spidsformen umulig. På grund af sin natur er BTR-metoden kun praktisk i stand til at informere brugeren om den øvre grænse for spidsformen⁶³, og handlingen med at afbilde sonden for at implementere BTR-metoden kan føre til spidsslid (f.eks. Sløvning eller flisning af sondespidsen).

Relativ kalibrering
Nogle gange kan en bestemt sondeegenskab ikke let og præcist måles. For eksempel er fjederkonstanten for stivere udkragninger vanskelig eller umulig at måle med termisk tunemetoden på grund af båndbredde- og afbøjningsbegrænsninger⁹¹. Som diskuteret ovenfor findes der andre metoder til bestemmelse af fjederkonstanten, men fordi den termiske tunemetode er integreret i mange moderne AFM'er, implementeres den ofte til enkel daglig brug. På samme måde skal afbøjningsfølsomheden altid kalibreres før forsøg med henblik på konvertering af laserbevægelse på PSD til sondeudkragningens fysiske afbøjning. I praksis er måling af spidsradius imidlertid det mest tidskrævende kalibreringstrin og det, der mest sandsynligt vil beskadige sondespidsen. Hvis det ikke er muligt direkte at måle spidsradius via SEM eller BTR, kan en relativ kalibreringsprocedure anvendes som et alternativ til bestemmelse af den effektive spidsradius, forudsat at der foreligger en standardreferenceprøve med minimal overfladeruhed (ideelt atomisk flad) og et velkendt modul tæt på det forventede eksperimentelle modul. Eksempler på sådanne ideelle referencestandarder for relativ kalibrering omfatter muscovitglimmer 17,92,93,94,95 og HOPG ^96, men tjener også til at fremhæve vanskeligheden ved at identificere passende referencestandarder for blødere prøver med moduli i kPa til MPa-området. For at udføre en relativ kalibrering skal afbøjningsfølsomheden først kalibreres som beskrevet i hovedprotokollen. For det andet skal sondens nominelle fjederkonstant indtastes (normalt leveres med sonden) eller måles via en af de ovenfor beskrevne metoder. Det tredje trin er fordybning på modulets referencestandardprøveoverflade ved hjælp af passende parametre. Endelig skal de indsamlede F-D-kurvedata analyseres, og tipradiusparameteren justeres, indtil det eksperimentelt målte reducerede modul matcher det forventede reducerede modul. Der bør tages hensyn til den gennemsnitlige deformationsdybde, der er opnået på referenceprøven, da denne dybde skal bevares, når den indrykkes på den forsøgsprøve, der er af interesse, for at kalibreringen er relevant. Nu kan indrykning på prøven af interesse forekomme, idet rampeparametrene justeres, så de matcher deformationsdybden opnået på modulets standardreferencemateriale.

En fordel ved den relative kalibreringsmetode er, at den undgår potentielle akkumulerede fejl forårsaget af unøjagtig kalibrering af afbøjningsfølsomhed, fjederkonstant og spidsradius⁵². Derudover er det måske lidt hurtigere og mindre sandsynligt, at sonden beskadiges end BTR-metoden. De største ulemper ved den relative kalibreringsmetode er: 1) behovet for en referenceprøve af høj kvalitet med nm- til Angstrom-skala overfladeruhed og velkendte mekaniske egenskaber svarende til dem for prøven af interesse, der kan analyseres med samme sonde som den eksperimentelle prøve, og 2) kravet om at opnå den samme eller meget lignende deformationsdybde på både reference- og eksperimentelle prøver, for at kalibreringen er gyldig. Derfor foretrækkes det at måle spidsradius direkte, hvis det overhovedet er muligt.

Analyse af data
Den analysemetode, der anvendes til at bestemme prøvens mekaniske egenskaber ud fra de målte F-D-kurver, er lige så vigtig som kvaliteten af selve nanoindrykningsdataene. Der er flere almindelige kontaktmekaniske teorier, der modellerer kraft-forskydningsforhold baseret på forskellige underliggende antagelser (og dermed anvendelige i forskellige scenarier). Disse kontaktmekaniske modeller inkluderer Hertz 97, Sneddon 28, JKR (Johnson, Kendall og Roberts)⁹⁸, DMT (Derjaguin, Müller og Toporov)^35,99, MD (Maugis-Dugdale)100 og MYD (Muller^, Jusjtjenko og Derjaguin)^101.102. En dybdegående analyse og sammenligning af forskellige kontaktmekaniske modeller og deres anvendelse til analyse er blevet præsenteret andetsteds 29,30,103,104. Selvom det ligger uden for rammerne af dette papir, giver tabel 4 et kort overblik over nogle af de mest almindelige kontaktmekaniske modeller. Det skal især bemærkes, at mere komplekse modeller som JKR, DMT og andre inkorporerer virkningerne af vedhæftning af spidsprøver 30,35,98,99,100,101,102,103,104^, som kan være signifikante og ofte let kan identificeres ved udseendet af negativ afbøjning i kraftkurven (se figur 3). I praksis bruges den valgte analysemodel til at tilpasse de indsamlede F-D data og bestemme de mekaniske egenskaber, såsom det elastiske modul. For at passe korrekt til dataene er det nødvendigt med en flad basislinje for at bestemme det oprindelige kontaktpunkt eller et effektivt kontaktpunkt, der passer til den del af eksperimentelle data med den største korrelation til modellen.

Teori	Anvendelighed	Antagelser	Begrænsninger
Hertz	Simpel; Ofte bruges til prøver i væske.	Ingen vedhæftning.	Ugyldig for systemer, der har klæbende kræfter til stede.
Derjaguin-Müller-Toporov (DMT)	Stiv med små deformationer.	Kortdistancevedhæftning i kontaktområde plus langtrækkende vedhæftning uden for kontaktområdet.	Begrænset geometri kan medføre en undervurdering af kontaktområdet.
Johnson-Kendall-Roberts (JKR)	Blød med store deformationer.	Klæbende kræfter med kort rækkevidde kun i kontaktområdet.	Kan undervurdere belastning på grund af vedhæftning.
Maugis - Dugdale (MD)	Denne generelle løsning dækker de andre klæbende modeller.	Tip-sample interface modelleret som en revne.	Analytisk løsning, der involverer parametriske ligninger.

Tabel 4: Almindelige kontaktmekaniske modeller. Udvalgte almindelige kontaktmekaniske modeller med anvendelighed, forudsætninger og begrænsninger noteret.

Den praktiske anvendelse af ovennævnte modeller til analyse af F-D-kurver kræver brug af computersoftware til at muliggøre storskala batchbehandling af tusinder eller millioner af kurver på kort tid og udføre statistisk analyse af resultaterne. Intern skriftlig kode bruges ofte til analyse af F-D-data, og forskellige AFM-producenter leverer også softwarepakker. På grund af dets open source-karakter, brugervenlighed og detaljerede supplerende oplysninger anbefaler forfatterne imidlertid brugen af AtomicJ²³. Programmet giver mulighed for enkel og præcis analyse af F-D data ved hjælp af nogen af de ovenfor beskrevne teorier samt flere andre. Fordi koden er open source, er det let at manipulere og tilpasse til specifikke brugssager uden behov for at opbygge kompleks kode fra bunden. Se Hermanowicz et ^al.23 for detaljerede oplysninger om AtomicJ-softwarepakken.

Det kan konkluderes, at kontaktområdet og kraften, der påføres af en AFM-sondespids på en prøveoverflade, kan kvantificeres gennem omhyggelig kalibrering af sonden for at muliggøre bestemmelse af mekaniske egenskaber i nanoskala, især det elastiske modul. En generaliseret protokol, der fremhæver bedste praksis for vellykket implementering af AFM-cantilever-baseret nanoindrykning i luft eller væske på både bløde og hårde prøver med elastiske moduli, der spænder fra kPa til GPa, er blevet præsenteret med repræsentative eksempler. Vigtige overvejelser såsom sondevalg (herunder prøveoverfladens ruhed, funktionsstørrelser, sondens størrelsesforhold og spidsslid), sondekalibrering og dataanalyse (herunder kontaktmekanikmodeller og målestatistikker) er blevet diskuteret. Endelig er der demonstreret samlokalisering af AFM-afledte nanomekaniske kort med andre karakteriseringsteknikker, der giver kompositionsinformation såsom SEM / EDS, samt et eksempel på måling af en anden nanomekanisk egenskab end elastisk modul (dvs. lipid dobbeltlags brudkraft) via AFM-cantilever-baseret nanoindrykning for at give eksempler på yderligere synergistiske anvendelser af teknikken. Samlet set bør eksemplerne og diskussionen her give et indgangspunkt for forskere, der søger at anvende AFM-udkragningsbaseret nanoindrykning til at måle de mekaniske egenskaber af stort set enhver prøvetype.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Atomic force microscope	Bruker	Dimension Icon	Uses Nanoscope control software, including PeakForce Quantitative Nanomechanical Mapping (PF-QNM), FastForce Volume (FFV), and Point-and-Shoot Ramping experimental workspaces
AtomicJ	American Institute of Physics	https://doi.org/10.1063/1.4881683	Flexible, powerful, free open source Java-based force curve analysis software package. Supports numerous contact mechanic models, such as Hertz, Sneddon DMT, JKR, Maugis, and cone or pyramid (including blunt and truncated). Also includes a variety of initial contact point estimation methods to choose from. Supports batch processing of data and subsequent statistical analysis (e.g., averages, standard deviations, histograms, goodness of fit, etc.). Literature citation is: P. Hermanowicz, M. Sarna, K. Burda, and H. Gabry, “AtomicJ: An open source software for analysis of force curves” Rev. Sci. Instrum. 85: 063703 (2014), https://doi.org/10.1063/1.4881683
Buffer solution (PBS)	Fisher Chemical (NaCl), Sigma Aldrich (KCl), Fisher BioReagents (Na2HPO4 and KH2PO4)	S271 (>99% purity NaCl), P9541 (>99% purity KCl), BP332(>99% purity Na2HPO4), BP362 (>99% purity KH2PO4)	Phosphate buffered saline (PBS) was prepared in the laboratory as an aqueous solution consisting of 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, and 1.8 mM KH2PO4 dissolved in ultrapure water. Reagents were measured out using an analytical balance, and glassware was cleaned with soap and water followed by autoclaving immediately prior to use.
Chloroform
Diamond tip AFM probe	Bruker	PDNISP	Pre-mounted factory-calibrated cube corner diamond (E = 1140 GPa) tip AFM probe (nominal R = 40 nm) with a stainless steel cantilever (nominal k = 225 N/m, f0 = 50 kHz). Spring constant is measured at the factory (k = 256 N/m for the probe, Serial #13435414, used here) and calibration data (including AFM images of indents showing probe geometry) is provided with the probe.
Diamond ultramicrotome blade	Diatome	Ultra 35°	2.1 mm width. Also used a standard glass blade for intial rough cut of sample surface before transitioning to diamond blade for final surface preparation
Epoxy	Gorilla Glue	26853-31-6	Epoxy resin and hardner were mixed in a 1:1 ratio, a small drop was placed on a stainless steel sample puck (Ted Pella), and V1 grade muscovite mica (Ted Pella) was attached to create an atomically flat surface for preparation of phospholipid membranes.
Ethanol
LR white resin, medium grade (catalyzed)	Electron Microscopy Sciences	14381	500 mL bottle, Lot #150629
Mesenchymal stem cells (MSCs)	N/A	N/A	MSCs for nanomechanical studies were primary cells harvested from 8-10 week old male C57BL/6 mice as described in Goelzer, M. et al. "Lamin A/C Is Dispensable to Mechanical Repression of Adipogenesis" Int J Mol Sci 22: 6580 (2021) doi:10.3390/ijms22126580 and Peister, A. et al. "Adult stem cells from bone marrow (MSCs) isolated from different strains of inbred mice vary in surface epitopes, rates of proliferation, and differentiation potential" Blood 103: 1662-1668 (2004), doi:10.1182/blood-2003-09-3070.
Modulus standards	Bruker	PFQNM-SMPKIT-12M	Used HOPG (E = 18 GPa) and PS (E = 2.7 GPa). Also contains 2x PDMS (Tack 0, E = 2.5 MPa; Tack 4, E = 3.5 MPa), PS-LDPE (E = 2.0/0.2 GPa), fused silica (E = 72.9 GPa), sapphire (E - 345 GPa), and tip characterization (titanium roughness) sample. All samples come pre-mounted on a 12 mm diameter steel disc (sample puck).
Muscovite mica	Ted Pella	50-12	12 mm diameter, V1 grade muscovite mica
Nanscope Analysis	Bruker	Version 2.0	Free AFM image processing and analysis software package, but designed for, and proprietary/limited to Bruker AFMs; similar functionality is available from free, platform-independent AFM image processing and analysis software packages such as Gwyddion, WSxM, and others. Has built-in capabilities for force curve analysis, but AtomicJ is more flexible/full featured (e.g., more built-in contact mechanics models to choose from, statistical analysis of force curve fitting results, etc.) for force curve analysis and handles batch processing of force curves.
Phospholipids: POPC, Cholesterol (ovine)	Avanti Polar Lipids	POPC: CAS # 26853-31-6, Cholesterol: CAS # 57-88-5	POPC lipid dissolved in chloroform (25 mg/mL) was obtained from vendor and used without further purification. Cholesterol powder from the same vendor was dissolved in chloroform (20 mg/mL).
Probe holder (fluid, lipid bilayers)	Bruker	MTFML-V2	Specific to the particular AFM used; MTFML-V2 is a glass probe holder for scanning in fluid on a MultiMode AFM.
Probe holder (fluid, MSCs)	Bruker	FastScan Bio Z-scanner	Used with Dimension FastScan head (XY flexure scanners). Serial number MXYPOM5-1B154.
Probe holder (standard, ambient)	Bruker	DAFMCH	Specific to the particular AFM used; DAFMCH is the standard contact and tapping mode probe holder for the Dimension Icon AFM, suitable for nanoindentation (PF-QNM, FFV, and point-and-shoot ramping)
Sample Puck	Ted Pella	16218	Product number is for 15 mm diameter stainless steel sample puck. Also available in 6 mm, 10 mm, 12 mm, and 20 mm diameters at https://www.tedpella.com/AFM_html/AFM.aspx#anchor842459
Sapphire substrate	Bruker	PFQNM-SMPKIT-12M	Extremely hard surface (E = 345 GPa) for measuring deflection sensitivity of probes (want all of the deflection to come from the probe, not the substrate). Part of the PF-QNM/modulus standards kit.
Scanning electron microscope	Hitachi	S-3400N-II	Located at Boise State. Used to perform co-localized SEM/EDS on all samples except additively manufactured (AM) Ti-6Al-4V.
Silicon AFM probes (standard)	NuNano	Scout 350	Standard tapping mode silicon probe with reflective aluminum backside coating; k = 42 N/m (nominal), f0 = 350 kHz. Nominal R = 5 nm. Also available uncoated or with reflective gold backside coating. Probes with similar specifications are available from other manufacturers (e.g., Bruker TESPA-V2).
Silicon AFM probes (stiff)	Bruker	RTESPA-525, RTESPA-525-30	Rotated tip etched silicon probes with reflective aluminum backside coating; k = 200 N/m (nominal), f0 = 525 kHz. Nominal R = 8 nm for RTESPA-525, R = 30 nm for RTESPA-525-30. Spring constant of each RTESPA-525-30 is measured individually at the factory via laser Doppler vibrometry and supplied with the probe.
Silicon carbide grit paper (abrasive discs)	Allied	50-10005	120 grit
Silicon nitride AFM probes (soft, large radius hemispherical tip)	Bruker	MLCT-SPH-5UM, MLCT-SPH-5UM-DC	Also MLCT-SPH-1UM-DC. New product line of factory-calibrated (probe radius and spring constants of all cantilevers) large radius (R = 1 or 5 mm) hemispherical tip (at the end of a 23 mm long cylindrical shaft) probes. DC = drift compensation coating. 6 cantilevers/probe (A-F). Nominal spring constants: A, k = 0.07 N/m; B, k = 0.02 N/m; C, k = 0.01 N/m; D, k = 0.03 N/m; E, k = 0.1 N/m; F, k = 0.6 N/m.
Silicon nitride AFM probes (soft, medium sharp tip)	Bruker	DNP	4 cantilevers/probe (A-d). Nominal spring constants: A, k = 0.35 N/m; B, k = 0.12 N/m; C, k = 0.24 N/m; D, k = 0.06 N/m. Nominal radii of curvature, R = 10 nm.
Silicon nitride AFM probes (soft, sharp tip)	Bruker	ScanAsyst-Air	Nominal values: resonance frequency, f0 = 70 kHz; spring constant, k = 0.4 N/m; radius of curvature, R = 2 nm. Designed for force curve based AFM imaging.
Superglue	Henkel	Loctite 495	Cyanoacrylate based instant adhesive. Lots of roughly equivalent products are readily available.
Syringe pump	New Era Pump Systems	NE1000US	One channel syringe pump system with infusion and withdrawal capacity
Tip characterization standard	Bruker	PFQNM-SMPKIT-12M	Titanium (Ti) roughness standard. Part of the PF-QNM/modulus standards kit.
Ultrahigh purity nitrogen (UHP N2), 99.999%	Norco	SPG TUHPNI - T	T size compressed gas cylinder of ultrahigh purity (99.999%) nitrogen for drying samples
Ultramicrotome	Leica	EM UC6	Equipped with a glass blade (standard, for intial sample preparation) and a diamond blade (for final preparation)
Ultrapure water	Thermo Fisher	Barnstead Nanopure Model 7146	Model has been discontinued, but equivalent products are available. Produces ≥18.2 MΩ*cm ultrapure water with 1-5 ppb TOC (total organic content), per inline UV monitoring. Includes 0.2 µm particulate filter, ion exchange columns, and UV oxidation chamber.
Variable Speed Grinder	Buehler	EcoMet 3000	Used with silicon carbide grit papers during hand polishing.
Vibration isolation table (active)	Herzan	TS-140	Used with Bruker MultiMode AFM. Sits on a TMC 65-531 vibration isolation table. Bruker Dimension Icon AFM utilizes strictly passive vibration isolation (comes from manufacturer with custom acoustic hood, air table, and granite slab).
Vibration isolation table (passive)	TMC	65-531	35" x 30" vibration isolation table with optional air damping (disabled). Used with Bruker MultiMode AFM. Herzan TS-140 "Table Stable" active vibration control table is located on top.