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원자력 현미경 캔틸레버 기반 나노인덴테이션: 공기 및 유체의 나노 스케일에서 기계적 특성 측정

Published: December 2, 2022 doi: 10.3791/64497
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 4, 5, 4, 6, 6, 3,7, 2, 1,8
1Micron School of Materials Science & Engineering, Boise State University, 2Department of Mechanical & Biomedical Engineering, Boise State University, 3Department of Physics, Boise State University, 4Energy and Environmental Science and Technology, Idaho National Laboratory, 5Science and Technology, Idaho National Laboratory, 6Harold Hamm School of Geology & Geological Engineering, University of North Dakota, 7Biomolecular Sciences Graduate Program, Boise State University, 8Center for Advanced Energy Studies

Summary

원자력 현미경(AFM) 프로브 팁이 샘플 표면에 가하는 접촉 면적과 힘을 정량화하면 나노 크기의 기계적 특성을 측정할 수 있습니다. 탄성 계수 또는 기타 나노기계적 특성을 측정하기 위해 연질 및 경질 샘플의 공기 또는 유체에서 AFM 캔틸레버 기반 나노인덴테이션을 구현하는 모범 사례에 대해 설명합니다.

Abstract

원자간력 현미경(AFM)은 기본적으로 나노 스케일 AFM 프로브 팁과 샘플 표면 사이의 상호 작용을 측정합니다. 프로브 팁에 의해 가해지는 힘과 샘플과의 접촉 면적을 정량화할 수 있는 경우, 프로브되는 표면의 나노스케일 기계적 특성(예: 탄성 또는 영률)을 결정할 수 있습니다. 정량적 AFM 캔틸레버 기반 나노인덴테이션 실험을 수행하기 위한 자세한 절차가 여기에 제공되며, kPa에서 GPa에 이르는 다양한 샘플 유형의 탄성 계수를 결정하기 위해 기술을 적용할 수 있는 방법의 대표적인 예가 제공됩니다. 여기에는 살아있는 중간엽 줄기 세포(MSC)와 생리학적 완충액의 핵, 수지에 묻힌 탈수 로블로리 소나무 단면 및 다양한 구성의 Bakken 셰일이 포함됩니다.

또한 AFM 캔틸레버 기반 나노인덴테이션은 인지질 이중층의 파열 강도(즉, 파열력)를 조사하는 데 사용됩니다. 방법의 적절한 구현을 돕기 위해 분석법 선택 및 개발, 프로브 선택 및 교정, 관심 영역 식별, 시료 이질성, 특징 크기 및 종횡비, 팁 마모, 표면 거칠기, 데이터 분석 및 측정 통계와 같은 중요한 실제 고려 사항에 대해 설명합니다. 마지막으로, 원소 조성에 관한 추가 정보를 제공하는 전자 현미경 기술과 AFM 유래 나노 역학 맵의 공동 국소화가 시연됩니다.

Introduction

재료의 기계적 특성을 이해하는 것은 엔지니어링에서 가장 기본적이고 필수적인 작업 중 하나입니다. 벌크 재료 특성 분석을 위해 인장 시험1, 압축 시험2, 3점 또는 4점 굽힘(굴곡) 시험3을 포함하여 재료 시스템의 기계적 특성을 특성화하는 데 사용할 수 있는 다양한 방법이 있습니다. 이러한 마이크로 스케일 테스트는 벌크 재료 특성에 관한 귀중한 정보를 제공 할 수 있지만 일반적으로 실패로 수행되므로 파괴적입니다. 또한 박막, 생물학적 재료 및 나노 복합 재료와 같이 오늘날 관심 있는 많은 재료 시스템의 마이크로 및 나노 규모 특성을 정확하게 조사하는 데 필요한 공간 분해능이 부족합니다. 대규모 기계적 테스트의 일부 문제, 주로 파괴적인 특성을 해결하기 위해 광물학에서 미세 경도 테스트를 채택했습니다. 경도는 특정 조건에서 소성 변형에 대한 재료의 저항을 측정한 것입니다. 일반적으로 미세경도 시험은 일반적으로 경화된 강철이나 다이아몬드로 만든 뻣뻣한 프로브를 사용하여 재료에 움푹 들어간 곳을 만듭니다. 그 후, 결과적인 압흔 깊이 및/또는 면적을 사용하여 경도를 결정할 수 있습니다. Vickers4, Knoop5 및 Brinell6 경도를 포함한 여러 방법이 개발되었습니다. 각각은 마이크로 스케일 재료 경도의 측정값을 제공하지만 조건과 정의가 다르기 때문에 동일한 조건에서 수행된 테스트와 비교할 수 있는 데이터만 생성합니다.

계장화 나노인덴테이션은 다양한 미세경도 테스트 방법을 통해 얻은 상대 값을 개선하고, 기계적 특성 분석에 가능한 공간 분해능을 개선하고, 박막 분석을 가능하게 하기 위해 개발되었습니다. 중요하게도, Oliver와 Pharr7에 의해 처음 개발된 방법을 활용하여, 샘플 물질의 탄성 또는 영률(E)은 계장화된 나노인덴테이션을 통해 측정될 수 있다. 또한 Berkovich 3면 피라미드 나노 인덴터 프로브 (이상적인 팁 영역 기능이 Vickers 4면 피라미드 프로브와 일치)8를 사용하여 나노 스케일과 보다 전통적인 마이크로 스케일 경도 측정을 직접 비교할 수 있습니다. AFM의 인기가 높아짐에 따라 AFM 캔틸레버 기반 나노인덴테이션은 특히 부드러운 재료의 기계적 특성을 측정하는 데 주목을 받기 시작했습니다. 그 결과, 그림 1에 개략적으로 묘사된 바와 같이, 나노 스케일의 기계적 특성을 조사하고 정량화하기 위해 오늘날 가장 일반적으로 사용되는 두 가지 기술은 계측 나노인덴테이션(그림 1A)과 AFM 캔틸레버 기반 나노인덴테이션(그림 1B)9이며, 후자는 이 작업의 초점입니다.

Figure 1
그림 1: 계장화 및 AFM 캔틸레버 기반 나노인덴테이션 시스템 비교. (A) 계장화 나노인덴테이션 및 (B) AFM 캔틸레버 기반 나노인덴테이션을 수행하기 위한 일반적인 시스템을 보여주는 개략도. 이 수치는 Qian et al.51에서 수정되었습니다. 약어: AFM = 원자력 현미경. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

계장화 및 AFM 캔틸레버 기반 나노인덴테이션은 모두 뻣뻣한 프로브를 사용하여 관심 있는 샘플 표면을 변형하고 결과적인 힘과 변위를 시간의 함수로 모니터링합니다. 일반적으로 원하는 하중(즉, 힘) 또는 (Z-피에조) 변위 프로파일은 소프트웨어 인터페이스를 통해 사용자가 지정하고 기기에 의해 직접 제어되는 반면 다른 매개변수는 측정됩니다. 나노인덴테이션 실험에서 가장 자주 얻어지는 기계적 특성은 탄성률(E)로, 압력 단위가 있는 영률(Young's modulus)이라고도 합니다. 재료의 탄성률은 결합 강성과 관련된 기본 특성이며 소성 변형이 시작되기 전에 탄성(즉, 가역적 또는 일시적) 변형 동안 인장 또는 압축 응력(σ, 단위 면적당 적용된 힘)과 축 변형률(ε, 압입 축을 따른 비례 변형)의 비율로 정의됩니다(방정식 [1]).

Equation 1(1개)

많은 물질(특히 생물학적 조직)이 실제로 점탄성이기 때문에 실제로 (동적 또는 복합적) 계수는 탄성(저장, 위상) 및 점성(손실, 위상 이외) 성분으로 구성된다는 점에 유의해야 합니다. 실제로 나노인덴테이션 실험에서 측정되는 것은 감소된 모듈러스 E*이며, 이는 방정식 (2)와 같이 실제 관심 샘플 모듈러스 E와 관련이 있습니다.

Equation 2(2개)

여기서 E 팁과 ν 팁은 각각 나노인덴터 팁의 탄성 계수와 푸아송 비율이고, ν는 샘플의 추정된 푸아송 비율입니다. 푸아송 비는 횡방향 변형률과 축 방향 변형률의 음의 비율이며, 따라서 식 (3)과 같이 축 방향 변형을 받을 때(예: 나노인덴테이션 하중 중) 샘플의 가로 신장 정도를 나타냅니다.

Equation 3(3)

감소된 모듈러스에서 실제 모듈러스로의 변환이 필요한 이유는 a) 인덴터 팁에 의해 부여된 축 방향 변형률의 일부가 횡방향 변형률로 변환될 수 있고(즉, 샘플이 하중 방향에 수직인 팽창 또는 수축을 통해 변형될 수 있음), b) 인덴터 팁이 무한히 단단하지 않아서 샘플을 압입하는 행위로 인해 팁의 일부(작은) 변형이 발생하기 때문입니다. E 팁이 E>> 경우(즉, 인덴터 팁이 샘플보다 훨씬 단단하며, 다이아몬드 프로브를 사용할 때 종종 해당됨) 감소된 샘플 계수와 실제 샘플 계수 간의 관계는 E ≈ E*(1 - v2)로 크게 단순화됩니다. 계측된 나노인덴테이션은 정확한 힘 특성화 및 다이내믹 레인지 측면에서 우수하지만, AFM 캔틸레버 기반 나노인덴테이션은 더 빠르고, 훨씬 더 큰 힘과 변위 감도를 제공하며, 고해상도 이미징과 향상된 압흔 위치 파악을 가능하게 하고, 나노스케일의 자기 및 전기적 특성을 동시에 조사할 수 있습니다9. 특히, AFM 캔틸레버 기반 나노인덴테이션은 연질 물질(예를 들어, 폴리머, 겔, 지질 이중층, 세포 또는 기타 생물학적 물질), 매우 얇은 (서브 μm) 필름(기판 효과가 압흔 깊이에 따라 작용할 수 있는 곳)10,11 및 그래핀과 같은 부유 2차원(2D) 재료(12,13,14)의 나노스케일에서 기계적 특성의 정량화에 탁월하다 15,16, 운모17, 육각형 질화붕소(h-BN)18 또는 전이 금속 디칼코게나이드(TMDC, 예: MoS2)19. 이는 절묘한 힘(sub-nN)과 변위(sub-nm) 감도 때문이며, 이는 초기 접촉점을 정확하게 결정하고 탄성 변형 영역 내에 남아 있는 데 중요합니다.

AFM 캔틸레버 기반 나노인덴테이션에서 샘플 표면을 향한 AFM 프로브의 변위는 보정된 압전 소자(그림 1B)에 의해 작동되며, 샘플 표면과 접촉할 때 발생하는 저항력으로 인해 유연한 캔틸레버가 결국 구부러집니다. 캔틸레버의 이러한 굽힘 또는 처짐은 일반적으로 캔틸레버 후면에서 광검출기(위치 감지 검출기[PSD])로 레이저를 반사하여 모니터링됩니다. 캔틸레버 강성(nN/nm) 및 처짐 감도(nm/V)에 대한 지식과 함께 측정된 캔틸레버 처짐(V)을 샘플에 가해지는 힘(nN)으로 변환할 수 있습니다. 접촉 후 Z-피에조 이동과 캔틸레버 편향 간의 차이로 인해 샘플 압흔 깊이가 산출됩니다. 팁 영역 기능에 대한 지식과 결합하면 팁-샘플 접촉 면적을 계산할 수 있습니다. 결과적인 힘-거리 또는 힘-변위(F-D) 곡선의 접촉 부분의 기울기는 샘플의 나노기계적 특성을 결정하기 위해 적절한 접촉 역학 모델(논의의 데이터 분석 섹션 참조)을 사용하여 적합할 수 있습니다. AFM 캔틸레버 기반 나노인덴테이션은 위에서 설명한 것처럼 계측된 나노인덴테이션에 비해 몇 가지 뚜렷한 이점을 가지고 있지만, 여기에서 논의할 교정, 팁 마모 및 데이터 분석과 같은 몇 가지 실용적인 구현 과제도 제시합니다. AFM 캔틸레버 기반 나노인덴테이션의 또 다른 잠재적인 단점은 접촉 반경과 압흔 깊이가 인덴터 반경보다 훨씬 작아야 하기 때문에 선형 탄성을 가정한다는 것인데, 이는 나노스케일 AFM 프로브 및/또는 상당한 표면 거칠기를 나타내는 샘플로 작업할 때 달성하기 어려울 수 있습니다.

전통적으로, 나노인덴테이션은 개별 위치 또는 작은 그리드 인덴테이션 실험으로 제한되어 왔으며, 여기서 원하는 위치(즉, 관심 영역[ROI])가 선택되고 단일 제어된 인덴트, 일부 대기 시간으로 분리된 단일 위치에서의 다중 인덴트 및/또는 인덴트의 거친 그리드가 Hz 정도의 속도로 수행됩니다. 그러나 AFM의 최근 발전으로 인해 고속 힘 곡선 기반 이미징 모드(시스템 제조업체에 따라 다양한 상표명으로 참조)를 활용하여 기계적 특성과 지형을 동시에 획득할 수 있으며, 여기서 힘 곡선은 부하 제어 하에서 kHz 속도로 수행되며 최대 팁-샘플 힘은 이미징 설정점으로 활용됩니다. 포인트 앤 슛 (point-and-shoot) 방법도 개발되어 AFM 지형 이미지를 획득 한 후 이미지 내의 관심 지점에서 선택적 나노 인덴테이션을 수행하여 나노 인덴테이션 위치에 대한 나노 스케일 공간 제어를 제공합니다. 이 연구의 주요 초점은 아니지만, 힘 곡선 기반 이미징 및 포인트 앤 슛 캔틸레버 기반 나노 인덴테이션의 특정 선택된 응용 사례 가 대표 결과에 제시되어 있으며, 사용되는 특정 AFM 플랫폼에서 사용 가능한 경우 아래에 설명된 프로토콜과 함께 사용할 수 있습니다. 특히, 이 작업은 모든 가능한 AFM 시스템에서 AFM 캔틸레버 기반 나노인덴테이션의 실제 구현을 위한 일반화된 프로토콜을 간략하게 설명하고, 대표적인 결과와 이 기술을 성공적으로 채택하기 위한 뉘앙스, 과제 및 중요한 고려 사항에 대한 심층적인 논의를 포함하여 기술의 4가지 사용 사례 예(공기 중 2개, 유체 중 2개)를 제공합니다.

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Protocol

참고: 상업적으로 이용 가능한 다양한 AFM과 캔틸레버 기반 나노인덴테이션에 존재하는 다양한 샘플 유형 및 응용 분야로 인해 다음 프로토콜은 기기 또는 제조업체에 관계없이 모든 캔틸레버 기반 나노인덴테이션 실험에 필요한 공유 단계에 초점을 맞춰 본질적으로 비교적 일반적으로 설계되도록 의도적으로 설계되었습니다. 이 때문에 저자는 독자가 캔틸레버 기반 나노인덴테이션을 수행하기 위해 선택한 특정 기기를 작동하는 데 최소한 기본적인 친숙함을 가지고 있다고 가정합니다. 그러나 아래에 설명된 일반 프로토콜 외에도 유체 내 샘플의 캔틸레버 기반 나노 압입에 중점을 둔 AFM 및 여기에 사용된 소프트웨어에 대한 자세한 단계별 표준 운영 절차( SOP)(재료 표 참조)가 보충 자료로 포함되어 있습니다.

1. 시료 전처리 및 기기 설정

  1. 관심 영역의 기계적 특성을 변경하지 않고 표면 거칠기(이상적으로는 나노미터 규모, 의도한 압흔 깊이보다 ~10배 작음)와 오염을 모두 최소화하는 방식으로 샘플을 준비합니다.
  2. 매체(예: 공기 또는 유체), 예상 계수, 샘플 지형 및 관련 피처 크기를 기반으로 의도한 샘플의 나노인덴테이션에 적합한 AFM 프로브를 선택합니다(논의에서 프로브 선택 고려 사항 참조). 프로브를 프로브 홀더에 로드하고( 재료 표 참조) 프로브 홀더를 AFM 스캔 헤드에 부착합니다.
  3. AFM 소프트웨어에서 사용자가 개별 램프(즉, 힘-변위 곡선)를 제어할 수 있는 적절한 나노인덴테이션 모드를 선택합니다.
    알림: 특정 모드는 AFM 제조업체 및 개별 기기에 따라 다릅니다(자세한 내용 및 특정 예는 보충 자료 에 제공된 SOP 참조amp르).
  4. 레이저를 프로브 캔틸레버 뒷면, 프로브 팁 위치 반대편, PSD에 맞춥니다.
    참고: 레이저를 정렬하고 유체에서 나노인덴테이션을 수행할 때, 특히 빔을 산란시키거나 굴절시킬 수 있는 부유 파편 및/또는 기포를 피할 때 중요한 고려 사항에 대한 자세한 내용은 중간엽 줄기 세포 적용 예를 참조하십시오. AFM 광학 장치는 유체의 굴절률을 보상하고 표면과 맞물릴 때 프로브가 충돌하는 것을 방지하기 위해 조정해야 할 수도 있습니다.
    1. 합계 전압을 최대화하여 캔틸레버 뒷면의 레이저 빔 스폿을 중앙에 배치합니다(그림 2A).
    2. X 및 Y(즉, 수평 및 수직) 편향 신호를 가능한 한 0에 가깝게 조정하여(그림 2A) 반사된 레이저 빔 스폿을 PSD의 중앙에 배치함으로써 캔틸레버 편향에 비례하는 출력 전압을 생성하기 위한 최대 감지 가능한 편향 범위를 제공합니다.
  5. 샘플 지형, 표면 거칠기 및/또는 표면 밀도(플레이크 또는 입자의 경우)가 확실하지 않은 경우 나노인덴테이션 실험 전에 AFM 지형 조사 스캔을 수행하여 샘플 적합성, 1.1단계 및 샘플 준비 부분에 설명된 대로.

Figure 2
그림 2: 위치 감지 감지기 모니터. (A) 샘플 표면에 맞물리기 전에(즉, 프로브가 샘플과 접촉하지 않음) 프로브 캔틸레버의 후면에서 PSD의 중심으로 반사되는 적절하게 정렬된 레이저를 나타내는 PSD 디스플레이(큰 합계 전압 및 수직 또는 수평 처짐의 부족으로 입증됨). (B) 수직 편향 전압은 캔틸레버가 편향될 때(예를 들어, 프로브가 샘플과 접촉할 때) 증가한다. 약어: PSD = 위치 감지 검출기; VERT = 수직; HORIZ = 수평; AMPL = 진폭; N/A = 해당 사항 없음. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. 프로브 교정

참고: 캔틸레버 기반 나노인덴테이션 중에 수집된 F-D 곡선 데이터를 사용하여 샘플의 기계적 특성을 정량화하려면 캔틸 레버/PSD 시스템의 편향 감도(DS)( nm/V 또는 V/nm), 캔틸레버 스프링 상수 (nN/nm) 및 프로브 접촉 면적(종종 구형 프로브의 경우 프로브 반경보다 작은 주어진 압흔 깊이에서 유효 프로브 팁 반경(nm)으로 표현됨) 팁.

  1. 매우 단단한 재료(예: 사파이어, E = 345 GPa)를 램핑하여 프로브/AFM 시스템의 DS를 보정하여 샘플의 변형이 최소화되도록 하여 팁-샘플 접촉이 시작된 후 피에조의 측정된 Z 이동이 캔틸레버 편향으로만 변환되도록 합니다.
    알림: DS 보정은 실험 중 시스템의 DS를 정확하게 반영하기 위해 계획된 나노인덴테이션 실험과 동일한 조건(예: 온도, 매체 등)에서 수행해야 합니다. 열 평형에 도달하고 안정적인 레이저 출력 전력 및 포인팅 안정성을 확립할 수 있는 시간을 허용하기 위해 최대 정확도를 위해 긴(30분) 레이저 예열 기간이 필요할 수 있습니다. DS는 레이저 강도와 캔틸레버의 위치, 프로브의 반사 품질(즉, 프로브의 후면 코팅이 저하되면 DS에 영향을 미침) 및 PSD20의 감도에 따라 달라지므로 동일한 프로브를 사용하더라도 레이저를 재정렬할 때마다 DS를 다시 측정해야 합니다.
    1. 사파이어에 DS 보정 인 덴트를 설정하고 수행하여 계획된 샘플 인덴트와 거의 동일한 프로브 편향(V 또는 nm 단위)을 달성하는데, 이는 측정된 변위가 팁 편향 각도의 함수이고 큰 편향에 대해 비선형이 되기 때문입니다.
    2. 그림 3A와 같이 결과 F-D 곡선에서 초기 접촉점 이후의 인접촉 영역의 선형 부분의 기울기에서 DS(nm/V 단위) 또는 역방향 광학 레버 감도(V/nm)를 결정합니다.
    3. r을 반복amp 각 DS 값을 기록하면서 최소 5배. 최대 정확도를 위해 값의 평균을 사용합니다. 측정값의 상대 표준 편차(RSD)가 ~1%를 초과하면 접착력의 초기 도입으로 인해 처음 몇 개의 F-D 곡선이 이상적이지 않은 경우가 있으므로 DS를 다시 측정합니다.
    4. 프로브 캔틸레버의 스프링 상수 k가 공장에서 보정되지 않은 경우(예: 레이저 도플러 진동계[LDV]를 통해) 스프링 상수를 보정합니다.
      알림: 열 조정 방법은 k < 10N/m인 비교적 부드러운 캔틸 레버에 최적입니다(특히 k > 10N/m인 뻣뻣한 캔틸레버의 경우 대체 방법에 대한 목록 및 설명은 토론의 스프링 상수 섹션 참조). 그림 3B, C에서 볼 수 있듯이 열 튜닝은 일반적으로 AFM 제어 소프트웨어에 통합됩니다.
  2. 프로브가 공장에서 보정된 팁 반경 측정과 함께 제공되지 않는 경우(예: 주사 전자 현미경[SEM] 이미징을 통해 ) 유효 팁 반경 R을 측정합니다.
    참고: 팁 반경을 측정하는 두 가지 일반적인 방법이 있지만(해당 논의 섹션 참조), 나노미터 규모의 프로브 팁에 가장 일반적인 방법은 블라인드 팁 재구성(BTR) 방법으로, 팁을 효과적으로 이미징하는 데 도움이 되는 수많은 매우 날카로운(sub-nm) 기능을 포함하는 거칠기 표준( 재료 표 참조)을 활용합니다.
    1. BTR 방법을 사용하는 경우 느린 스캔 속도(<0.5Hz)와 높은 피드백 이득을 사용하여 거칠기(팁 특성화) 샘플을 이미지화하여 매우 선명한 특징의 추적을 최적화합니다. 예상 팁 반경을 기준으로 이미지 크기와 픽셀 밀도(해상도)를 선택합니다(예: 3μm x 3μm 영역의 1024 x 1024 픽셀 이미지는 ~3nm 측면 해상도를 가짐).
    2. 그림 3D-F와 같이 AFM 이미지 분석 소프트웨어(재료 표 참조)를 사용하여 프로브 팁을 모델링하고 예상 샘플 압흔 깊이에서 프로브 팁의 끝 반경과 유효 팁 직경을 추정합니다.
  3. 프로브 교정이 완료되면 그림 4A와 같이 기기 소프트웨어에 DS, k 및 R 값을 입력합니다.
    1. 측정된 감소 계수를 실제 샘플 계수 9로 변환할 수 있도록 샘플의 포아송 비율 추정값ν를 입력합니다. 팁 모양과 압흔 깊이를 기반으로 하는 원뿔형 또는 원뿔형 접촉 역학 모델을 사용하는 경우 팁 절반 각도를 입력해야 합니다(그림 4C).
      참고: 계수는 추정된 푸아송 비율의 작은 오류나 불확실성에 상대적으로 민감하지 않습니다. ν = 0.2-0.3의 추정치는 많은 재료에 대한 좋은 출발점이다21.

Figure 3
그림 3: 프로브 보정. (A) 편향 감도 측정. 반사 후면 알루미늄 코팅이 된 표준 태핑 모드 프로브(공칭 k = 42N/m, 재료 표 참조)에 대해 사파이어 기판(E = 345GPa)에서 수행한 대표적인 편향 감도 측정 결과. 측정된 접근 방식(파란색 추적)과 후퇴 또는 철회(빨간색 추적) 곡선이 표시됩니다. 59.16nm/V의 측정된 편향 감도는 빨간색 수직 점선 사이의 영역으로 표시된 대로 스냅-접촉점과 턴어라운드 지점 사이의 접근 곡선을 피팅하여 결정되었습니다. 표면을 떼어내기 전에 수축/인출 곡선에서 명백한 음의 편향 영역은 팁-샘플 접착을 나타냅니다. (나,씨) 열 튜닝. 대표적인 캔틸레버 열 잡음 스펙트럼(파란색 트레이스)과 두 개의 서로 다른 프로브에 해당하는 피팅(빨간색 트레이스). (B) 공칭 스프링 상수 k = 0.4N/m가 초기 추측으로 사용된 표준 힘 곡선 기반 AFM 이미징 프로브(재료 표 참조)에 대한 열 조정 설정 및 맞춤 매개변수. 캔틸레버 열 잡음 스펙트럼의 적합도는 f 0 = 79.8kHz의 기본 공진 주파수를 산출하며, 이는 f0 = 70kHz의 공칭 값과 상당히 잘 일치합니다. 측정된 Q 계수는 58.1입니다. 적합도(R2 = 0.99)는 두 빨간색 수직 점선 사이의 데이터와 적합도의 일치도를 기반으로 합니다. 정확한 결과를 얻으려면 주변 온도와 편향 감도를 모두 알고 입력하는 것이 중요합니다. (C) 캔틸레버 열 잡음 스펙트럼 및 결과 계산된 스프링 상수 k = 0.105 N/m의 해당 적합(즉, 열 조정)은 살아있는 세포 및 분리된 핵에 대한 나노 역학 측정을 수행하는 데 사용되는 매우 부드러운 캔틸레버에 대해 사용됩니다. ~2-3kHz의 상당히 낮은 자연 공명 주파수에 유의하십시오. (D-F) 블라인드 팁 재구성. 다이아몬드 팁 프로브에 대한 대표적인 블라인드 팁 재구성 워크플로우(공칭 R = 40nm, 재료 표 참조). (D) AFM 프로브 팁을 이미지화하는 역할을 하는 일련의 매우 날카로운(sub-nm) 티타늄 스파이크로 구성된 팁 특성화 샘플의 5μm x 5μm 이미지. (E) 프로브 팁의 결과 재구성 모델(반전된 높이 이미지). (F) 팁 정점에서 사용자가 선택한 높이 8nm(즉, 압흔 깊이 << R)에서 추정 끝 반경 R = 29nm 및 유효 팁 직경 40nm를 포함하는 블라인드 팁 재구성 피팅 결과, 해당 높이의 팁-샘플 접촉 면적을 원형 프로파일(즉, A = πr 2 = π(d/2)2) 구면 접촉 역학 모델과 함께 사용합니다. 약어: AFM = 원자력 현미경; ETD = 유효 팁 직경. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 소프트웨어 인터페이스 입력. (A) 프로브 교정 상수. 측정된 편향 감도, 스프링 상수 및 팁 반경을 입력하여 정량적인 나노 기계 측정을 가능하게 하는 소프트웨어 사용자 인터페이스( 재료 표 참조). 프로브와 샘플의 푸아송 비율은 캔틸레버 기반 나노인덴테이션 힘 곡선에서 샘플의 탄성 또는 영률(Young's modulus)을 계산하는 데 필요합니다. (B) Ramp 제어 창. 램프 자체(즉, 압흔 프로파일), 기기 트리거링(예: 힘 대 변위 제어), 후속 힘 분석 및 이동 한계(Z-피에조를 제어하고 PSD 편향을 판독할 때 A/D 변환기가 작동해야 하는 범위를 좁혀 측정 감도를 개선하기 위해)를 설명하는 매개변수로 구성된 캔틸레버 기반 나노인덴테이션 실험을 설정하기 위한 소프트웨어 사용자 인터페이스( 재료 표 참조). (C) 원뿔형, 피라미드형 또는 원뿔형 접촉 역학 모델(예: Sneddon)을 사용하는 경우 팁 반각(프로브 형상 또는 직접 측정 기준)이 중요합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3. 힘 진지변환 (F-D) 자료 수집

알림: 여기에 제시된 매개변수 값( 그림 4B 참조)은 주어진 샘플의 힘 및 압흔 범위에 따라 달라질 수 있습니다.

  1. AFM 헤드 아래의 샘플을 탐색하고 원하는 관심 영역에 참여합니다.
    1. 수직 편향 신호(그림 2B)를 모니터링하거나 작은(~50-200nm) 초기 램프(그림 4B)를 수행하여 팁과 샘플이 접촉하는지 확인합니다(그림 5A 참조).
    2. AFM 헤드 위치를 약간 위쪽으로 조정하십시오(전체 r의 ~50%에 해당하는 단계로amp 크기) 및 ramp 다시. 거의 평평한 램프(그림 5B)와 캔틸레버의 최소 수직 편향(그림 2A)에서 알 수 있듯이 팁과 샘플이 접촉하지 않을 때까지 반복합니다.
    3. 명백한 팁-샘플 상호 작용이 존재하지 않으면(그림 2A와 그림 2B 비교) 램프 크기의 ~50%-100%에 해당하는 양만큼 AFM 헤드를 낮추어 프로브 팁이 샘플에 충돌하지 않도록 합니다.amp AFM 헤드를 수동으로 이동하는 동안. 좋은 곡선(그림 5D) 또는 그림 5C와 유사한 곡선이 관찰될 때까지 다시 램프를 반복합니다. 후자의 경우, r의 ~20%-50%에 해당하는 작은 AFM 헤드 하강 조정을 한 번 더 수행하십시오.amp 좋은 접촉과 그림 5D에 표시된 것과 유사한 힘 곡선을 얻기 위한 크기.
  2. r을 조정amp 매개변수(아래 설명 및 그림 참조) 그림 4B)를 사용하여 기기, 프로브 및 s에 대해 최적화합니다.amps, 에 표시된 것과 유사한 램프를 얻습니다. 그림 5D.
    1. 샘플(예: 두께, 예상 탄성률, 표면 거칠기) 및 원하는 압흔 깊이에 따라 적절한 램프 크기(즉, 한 램프 사이클을 통한 총 Z-피에조 이동)를 선택합니다.
      참고: 더 뻣뻣한 샘플의 경우, 더 적은 샘플 변형(따라서 주어진 Z-피에조 이동에 대해 더 많은 프로브 편향)이 발생할 가능성이 높으므로 램프 크기는 일반적으로 더 부드러운 샘플보다 작을 수 있습니다. 뻣뻣한 샘플 및 캔틸레버에 대한 일반적인 램프 크기는 수십 nm일 수 있는 반면, 소프트 샘플 및 캔틸레버의 경우 램프는 크기가 수백 nm 내지 수 μm일 수 있습니다. 선택된 특정 적용 사례 는 대표 결과 섹션에 나와 있습니다. 가능한 최소 및 최대 램프 크기는 기기에 따라 다릅니다.
    2. 적절한 램프 속도를 선택합니다(대부분의 샘플에서 1Hz가 좋은 시작점임).
      알림: ramp 속도는 제어 및/또는 감지 전자 속도/대역폭에 의해 제한될 수 있습니다. 램프 크기와 함께 램프 속도는 팁 속도를 결정합니다. 팁 속도는 점탄성 효과로 인해 히스테리시스 아티팩트(hysteresis artifacts)가 발생할 수 있는 부드러운 재료를 압입할 때 특히 중요합니다 9,22.
    3. 트리거된(부하 제어) 또는 트리거되지 않은(변위 제어) 램프를 사용할지 여부를 선택합니다.
      알림: 트리거된 r에서amp, 시스템은 s에 접근합니다.amp 사용자 정의 단계(r에 따라amp 크기 및 분해능 또는 데이터 포인트 수) 원하는 트리거 임계값(즉, 설정값 힘 또는 캔틸레버 편향)이 감지될 때까지 시스템은 원래 위치로 후퇴하고 F-D 곡선을 표시합니다. 트리거되지 않은 램프에서 시스템은 단순히 Z-피에조를 사용자 정의 램프 크기에 의해 지정된 거리만큼 확장하고 측정된 F-D 곡선을 표시합니다. 트리거된 램프는 대부분의 사용 사례에서 선호되지만, 트리거되지 않은 램프는 날카롭고 쉽게 식별할 수 있는 접점을 나타내지 않는 부드러운 재료를 조사할 때 유용할 수 있습니다.
      1. 트리거된 램프를 선택한 경우 트리거 임계값(사용자 정의 최대 허용 힘 또는 램프의 편향)을 설정하여 샘플에 원하는 압흔을 가져옵니다.
        알림: 트리거 임계값을 사용한다는 것은 r이 종료될 수 있음을 의미합니다.amp 전체 r에 도달하기 전에 r이 종료될 수 있습니다.amp 크기(Z-piezo extension)가 지정됩니다. 값은 팁-샘플 시스템에 따라 수 nN에서 수 μN까지 다양할 수 있습니다.
      2. r을 설정합니다.amp 위치를 사용하여 r을 실행하는 데 사용할 Z-piezo의 최대 범위 부분을 결정합니다.amp 실행합니다. 램프 크기의 전체 범위가 최대 Z-피에조 범위를 벗어나 시작하거나 끝나지 않는지 확인하십시오(그림 6의 대표적인 예 참조), 그렇지 않으면 F-D 곡선의 일부가 물리적 측정을 나타내지 않습니다(즉, Z-피에조는 움직이지 않고 완전히 확장되거나 후퇴됨).
    4. 원하는 측정 분해능(즉, F-D 곡선의 점 밀도)을 얻기 위해 샘플/램프(예: 512개 샘플/램프 )의 수를 설정합니다.
      알림: 최대 샘플/ramp 소프트웨어(파일 크기) 또는 하드웨어 제약(예: r에 따라 아날로그에서 디지털[A/D] 변환 속도)에 의해 제한될 수 있습니다. 또한 허용 가능한 Z-피에조 또는 편향 범위( 그림 4B의 한계 매개변수 참조)를 제한하여 시스템 A/D 컨버터의 유효 분해능을 높일 수 있습니다.
    5. X-회전을 설정하여 s의 전단력을 줄이십시오.ampZ 방향(캔틸레버에 수직)으로 움푹 들어가면서 동시에 프로브를 X 방향(캔틸레버와 평행)으로 약간 움직여 팁. 표면 수직에 대한 프로브 홀더의 오프셋 각도와 동일한 X-회전 값을 사용합니다(12°가 일반적임).
      알림: 입사 레이저 빔이 PSD로 반사될 수 있도록 캔틸레버가 표면에 대해 작은 각도로 프로브 홀더에 장착되기 때문에 X-회전이 필요합니다. 부가적으로, 프로브 팁의 전방 및 후방 각도는 서로 상이할 수 있다(즉, 프로브 팁은 비대칭일 수 있다). 보다 구체적인 정보는 개별 프로브 및 AFM 제조업체에서 얻을 수 있습니다.

Figure 5
그림 5: 좋은 힘 곡선을 얻기 위해 결합 후 팁-샘플 분리를 최적화합니다. 반경 5μm 반구형 팁에서 끝나는 보정된 연질 질화규소 캔틸레버(공칭 k = 0.04N/m)를 사용하여 살아있는 중간엽 줄기 세포 핵에서 유체(인산염 완충 식염수)를 압입하는 동안 얻은 대표적인 힘-변위 곡선의 순차적 예( 재료 표 참조). 곡선은 세포 표면과 결합하고 압흔 매개변수를 최적화하는 과정에서 얻어졌으며 프로브 접근 방식은 파란색으로 표시되고 수축/철회는 빨간색으로 표시되었습니다. (A) 팁은 램프를 시작하기 전에 이미 맞물려 샘플과 접촉하여 평평한 사전 접촉 기준선 없이 큰 캔틸레버 편향 및 힘을 유발합니다. (B) 팁을 샘플에서 충분히 멀리 수동으로 이동한 후 트리거되지 않은 2μm 램프는 거의 평평한(즉, 힘의 변화가 거의 없음) F-D 곡선을 생성합니다. 주변 조건에서는 곡선이 더 평평하지만 유체에서는 매체의 점도로 인해 표면 접촉이 없더라도 여기에서 볼 수 있듯이 램프 동안 프로브 캔틸레버가 약간 처질 수 있습니다. (C) 경사로를 시작하기 전에 표면에 약간 더 가까이 접근한 후, 접근 및 후퇴 곡선은 경사로의 턴어라운드 지점 근처에서 약간의 힘 증가(경사 증가)를 보여줍니다(즉, 접근에서 후퇴로의 전환). 찾아야 할 명백한 징후는 접근(파란색) 및 철회(빨간색) 곡선이 겹치기 시작한다는 것(검은색 원으로 표시된 영역)이며, 이는 표면과의 물리적 상호 작용을 나타냅니다. (D) 램프 파라미터를 최적화하고 C 보다 셀 표면에 약간(~1μm) 더 가까이 접근하여 프로브가 램프의 약 절반을 셀과 접촉하여 접근 곡선의 접촉 부분에 맞고 탄성 계수를 결정하기에 충분한 변형을 가능하게 합니다. 상대적으로 길고, 평평하며, 잡음이 적은 베이스라인은 피팅 알고리즘이 접점을 더 쉽게 결정할 수 있도록 합니다. 약어: F-D = 힘-변위. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
그림 6: 램프 크기 및 위치. 사용 가능한 총 Z-피에조 이동 범위(녹색 막대)에 대한 램프(파란색 막대)의 범위를 보여주는 Z-피에조 모니터. (A) Z-피에조 위치는 파란색 막대가 대략 녹색 막대의 중간에 있고 현재 Z-피에조 전압(-78.0V)이 완전히 수축된(-212.2V)과 확장(+102.2V) 값 사이에 있는 것으로 표시된 바와 같이 이동 범위의 중간에 가깝습니다. (B) Z-피에조는 바이어스 전압이 적용되지 않은 상태에서 A에 대해 확장됩니다. (C) Z-피에조는 A와 B에 대해 수축됩니다. (D) Z-피에조 위치는 -156.0V에서 C와 동일하지만 Z-피에조의 전체 동작 범위를 더 많이 활용하기 위해 AC에 비해 램프 크기가 증가했습니다. € 램프 크기가 현재 램프 위치에 비해 너무 커서 Z-피에조가 범위 끝까지 확장됩니다. 이렇게 하면 시스템이 Z-피에조를 더 확장할 수 없으므로 F-D 곡선이 평평해집니다. 약어: F-D = 힘-변위. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

4. F-D 곡선 분석

  1. 적절한 데이터 분석 소프트웨어 패키지를 선택합니다. 분석할 데이터를 선택하여 불러옵니다.
    참고: 많은 AFM 제조업체와 AFM 이미지 처리 소프트웨어 프로그램은 F-D 곡선 분석을 기본적으로 지원합니다. 대안적으로, 오픈 소스 AtomicJ 소프트웨어 패키지와 같은 전용 F-D 곡선 분석 패키지의 증가된 유연성 및 특징은, 특히 대규모 데이터 세트의 배치 처리 및 통계 분석 또는 복잡한 접촉 역학 모델을 구현하는 데 유익할 수 있다(23).
  2. 스프링 상수, DS 및 프로브 팁 반경에 대한 보정된 값과 프로브 팁에 대한 영률 및 푸아송 비율(재료 구성 기준) 및 샘플의 푸아송 비율 추정치와 함께 입력합니다.
    참고: 다이아몬드 팁 압자를 사용하는 경우 E 팁 = 1140 GPa 및 ν 팁 = 0.07 값을21,24,25,26으로 사용할 수 있습니다. 표준 실리콘 프로브의 경우, E tip = 170 GPa 및 νtip = 0.27이 전형적으로 사용될 수 있지만, 실리콘의 영률은 결정학적 배향에 따라 달라진다27.
  3. 팁과 샘플에 적합한 나노인덴테이션 접촉 역학 모델을 선택합니다.
    참고: 많은 일반적인 구형 팁 모델(예: Hertz, Maugis, DMT, JKR)의 경우 샘플의 압흔 깊이가 팁 반경보다 작아야 합니다. 그렇지 않으면 프로브 팁의 구형 형상이 원뿔형 또는 피라미드형 모양으로 바뀝니다(그림 4C). 원뿔형(예를 들어, Sneddon28) 및 피라미드형 모델의 경우, 팁 반쪽 각도(즉, 팁의 측벽과 팁 단부에 수직인 이등분선 사이의 각도; 그림 4C) 알고 있어야 하며 일반적으로 프로브 제조업체에서 구할 수 있습니다. 접촉 역학 모델에 대한 자세한 내용은 thedDiscussion의 데이터 분석 섹션을 참조하십시오.
  4. 피팅 알고리즘을 실행합니다. FD 곡선이 제대로 맞는지 확인하십시오. 단위 근처의 평균 R2(예를 들어,R2 > 0.9)에 대응하는 낮은 잔류 오차는 전형적으로 선택된 모델(29,30)에 대한 양호한 적합을 나타낸다. 원하는 경우 개별 곡선을 스폿 체크하여 곡선, 모델 적합도 및 계산된 접점을 육안으로 검사합니다(예: 그림 7 및 논의의 데이터 분석 섹션 참조).

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Representative Results

힘-변위 곡선
그림 7은 중간엽 줄기 세포(MSC) 핵(그림 7B)의 수지 포매 로블로리 소나무 샘플(그림 7A) 및 유체(인산염 완충 식염수[PBS])에서 공기 중에서 수행된 나노인덴테이션 실험에서 얻은 대표적이고 거의 이상적인 F-D 곡선을 보여줍니다. 모든 접촉 역학 모델의 사용은 초기 팁-샘플 접점의 정확하고 신뢰할 수 있는 결정에 의존합니다. 따라서 그림 7에 표시된 F-D 곡선의 초기 접점 앞의 비교적 평탄하고 노이즈가 적은 베이스라인과 접촉 부분의 부드러운 기울기는 접근 곡선(파란색 트레이스)과 인서트의 해당 피팅(녹색 트레이스) 간의 탁월한 일치로 입증된 바와 같이 기계적 특성을 추출하기 위한 분석에 이상적입니다.

반대로, 사용자가 캔틸레버 기반 나노인덴테이션을 수행하는 동안 발생할 수 있는 몇 가지 일반적인 문제가 있으며, 이는 이상적이지 않은 F-D 곡선으로 이어집니다. 가장 일반적인 문제 중 하나는, 특히 맞물린 직후, 램프가 시작되기 전에 프로브 팁이 이미 샘플과 접촉하고 있다는 것인데(그림 5A), 이로 인해 초기 접점을 결정하는 데 필요한 비접촉 기준선을 획득할 수 없습니다. 이것은 또한 트리거되지 않은(즉, 제어된 변위) 램프의 경우 지나치게 큰 힘으로 이어질 수 있습니다. 이는 뻣뻣한 캔틸레버를 사용하여 큰 r을 수행할 때 특히 중요합니다.amp결과적인 힘으로 인해 캔틸레버가 파손되거나 샘플 또는 팁이 손상될 수 있습니다. 이를 방지하려면 수직 편향 볼륨을 모니터링하십시오.tage 초기 결합 중 및 후. 측정된 수직 편향 전압이 양수이면(적절한 초기 정렬을 가정할 때) 그림 2B와 같이 캔틸레버가 편향되고 팁이 샘플과 접촉합니다. 더 큰 양의 전압은 더 큰 캔틸레버 편향에 해당하지만 편향의 크기에 관계없이 사용자는 AFM 헤드를 수동으로 들어 올려야 합니다(예: 스테퍼 모터 사용). 수직 편향 전압은 서서히 감소해야 하며 팁-샘플 접착력이 강한 경우 일시적으로 0 이하로 떨어질 수도 있지만, 팁이 더 이상 샘플과 접촉하지 않으면 결국 0V(또는 0V에 가까움)에 도달하게 됩니다(그림 2A). 이 시점부터 사용자는 램프 파라미터 최적화와 인덴트 수행을 재개할 수 있습니다.

또 다른 일반적인 문제(특히 트리거되지 않은 램프의 경우)는 그림 5B에서 이전에 볼 수 있듯이 팁-샘플 상호 작용의 명백한 징후 없이 전체 F-D 곡선이 거의 평평하게 나타나는 것입니다. 기기에서 사용할 수 있는 경우 이에 대한 해결책은 SPM 헤드를 램프 크기보다 ~10% 작게 수동으로 낮추고(프로브 팁이 충돌하는 것을 방지하기 위해) 다시 램프를 반복하여 팁-샘플 상호 작용으로 인해 명백한 힘 증가가 관찰될 때까지 반복하는 것입니다(그림 5C, D) 다른 램프 매개변수를 최적화하기 전에.

팁 마모
그림 8은 실험 환경에서의 팁 마모의 예를 보여줍니다. 고속(kHz 속도) 힘 곡선 기반 이미징 방법을 사용하여 Bakken 셰일 샘플의 여러 넓은 영역을 이미지화하기 위해 단일 뻣뻣한 실리콘 태핑 모드 AFM 프로브( 재료 표 참조)를 사용했으며(자세한 내용은 해당 응용 사례 참조), BTR 방법을 사용하여 팁 형상을 모델링하고 3개의 연속 이미지 전후의 팁 끝 반경을 추정했습니다. 조사중인 셰일 샘플은 점토와 유기 물질 (E ~ 5 GPa)의 매트릭스로 구성되었으며, 훨씬 더 단단한 무기 광물 개재물이 (E > 30 GPa) 분산되어있었습니다. 샘플에는 이미지화된 넓은 스캔 영역(85μm x 85μm)에 걸쳐 표면 지형(±2μm)의 상당한 변화가 포함되어 있기 때문에 스캔 속도는 사용된 기기에서 허용되는 최소 0.1Hz로 설정되었습니다. 2kHz의 힘 곡선 획득 속도와 0.1Hz의 스캔 속도로 단일 1024 x 1024 픽셀 이미지 과정에서 2천만 개 이상의 팁-샘플 상호 작용이 있었습니다. 그 결과, 프로브 팁은 샘플을 이미징하는 과정에서 원래 상태(그림 8A)에 비해 상당한 마모를 경험했으며, 3개의 이미지가 끝날 때 ~11nm의 유효 끝 반경에서 ~129nm까지 한 자릿수 이상 증가했습니다(그림 8D). 첫 번째 이미지에서 팁이 부러진 것으로 보이며, 그 결과 그림 8B에서 볼 수 있는 큰 형태학적 변화가 나타납니다. 각각의 후속 이미지에서 팁은 점점 더 둥글게 되는데, 이는 점진적인 마모의 보다 일반적인 현상의 훌륭한 예입니다(토론 참조). BTR 모델의 추정 팁 반경은 그림 8에 포함되어 있습니다.

대조적으로, 그림 8E, F는 6개월 간격으로 획득한 다이아몬드 팁 프로브(재료 표 참조)의 BTR 모델을 나타내며, 그 사이에 수천 개의 나노인덴트와 수억 개의 힘 곡선 이미징 기반 팁-샘플 상호 작용이 발생합니다. 29nm(그림 8E) 및 28nm(그림 8F)의 추정된 팁 반경에서 알 수 있듯이 프로브 팁 반경은 BTR 방법의 한계 내에서 변경되지 않았으며 다이아몬드의 극한의 내마모성을 강조합니다. 그러나 다이아몬드 팁 프로브(모든 AFM 프로브와 마찬가지로)는 팁 영역 기능과 유효 경도에 영향을 줄 수 있는 느슨하게 부착된 파편으로 인한 오염에 취약하다는 점에 유의해야 합니다. 따라서 시료 청결도는 팁 보존과 정확한 나노기계 측정에 매우 중요합니다.

적용 사례
프로브 재료 조성, 캔틸레버 스프링 상수, 팁 형상 및 반경의 현명한 선택을 통해 캔틸레버 기반 나노인덴테이션을 사용하여 유체 및 주변 조건 모두에서 kPa에서 GPa 범위의 탄성 계수를 가진 재료의 나노 스케일 기계적 특성을 정량화할 수 있습니다. 다음은 캔틸레버 기반 나노인덴테이션에 사용할 수 있는 광범위한 사용 사례 중 몇 가지를 강조하기 위해 선택된 응용 사례를 보여줍니다.

바이오 연료 응용을 위한 로블로리 소나무의 기계적 특성 조사
로블로리 소나무(Pinus taeda) 는 빠르게 자라는 침엽수 종으로 미국 남부에 매우 풍부하며 1,300만 헥타르 이상을 차지합니다31. 로블로리 소나무는 풍부하기 때문에 미국 남부에서 중요한 상업 작물로 목재와 펄프 목재 모두에 일반적으로 사용됩니다. 또한, 이들은 2세대 셀룰로오스 바이오연료 생산을 위한 중요한 자원이다32. 중요한 것은 2007 년 에너지 독립 및 보안법 (EISA)으로 인해 셀룰로오스 바이오 연료 공급 원료에 대한 수요가 증가하고 있으며, 2022 년까지 미국 운송 산업의 총 재생 가능 연료 사용량은 360 억 갤런이어야하며 160 억 갤런은 셀룰로오스 바이오 매스에서 파생됩니다. 따라서, loblolly 소나무의 빠른 성장 속도와 농림업 프로젝트에 대한 순응성으로 인해, 그것은 최근 몇 년 동안 큰 관심의 바이오 연료 공급 원료가되었습니다33. 개별 나무에 걸친 가변성, 해부학적 분획(예: 화이트우드, 나무 껍질, 바늘) 및 세포 영역(예: 세포벽 대 내부)을 포함하는 로블로리 소나무의 기계적 특성에 대한 지식은 기계적 처리 및 열화학적 전환을 최적화하기 위해 바이오매스 스트림의 표적 분리를 허용할 수 있습니다(34).

그림 9는 스테인리스 스틸 캔틸레버에 장착된 ~30nm 곡률 반경의 다이아몬드 팁 프로브를 가진 23년 된 로블로리 소나무의 가지에서 얻은 화이트우드의 단면 샘플의 대표적인 AFM 지형(높이 센서) 이미지(그림 9A) 및 해당 탄성률 맵(그림 9B)을 나타냅니다. = 256N/m). 지형 및 모듈러스 맵은 빠른 kHz 속도 힘 곡선 기반 AFM 이미징을 사용하여 동시에 생성되었으며, 모듈러스 맵은 프로브 보정 상수(즉, 스프링 상수, 편향 감도 및 팁 반경)에 대한 공칭 값을 기반으로 반정량적 결과를 제공하고 힘 곡선을 DMT(Derjaguin, Muller 및 Toporov) 접촉 역학 모델35에 실시간으로 맞춥니다. 모든 3 차원 (길이 x 너비 x 높이)에서 <3 mm로 트리밍 된 단면 샘플을 수지로 침투하기 전에 에탄올 농도 증가 (33 %, 55 %, 70 %, 90 % 및 100 % 36)를 사용하여 연속 탈수에 의해 이미징을 위해 준비되었습니다 (재료 표 참조) 60 °C에서 밤새 중합. 완전히 경화된 수지 포매 샘플을 먼저 분쇄한 다음 ~1mm/s의 절단 속도로 작동하는 다이아몬드 블레이드로 초미세 촬영하여 슬라이스당 1μm에서 50-70nm로 감소하는 피드 두께를 생성하여 AFM 이미징이 가능한 평평한 표면을 생성합니다. 그러나, 도 9A의 컬러 스케일 바에 의해 보여질 수 있는 바와 같이, 이 경우의 결과물은 여전히 상대적으로 거칠며, 아마도 샘플 표면 및/또는 울트라마이크로톰 블레이드에 잔류 파편이 존재하기 때문에, 절편 동안 블레이드 "채터(chatter)"를 유발하는 반면, 다른 샘플들은 훨씬 더 매끄러운 표면 지형을 나타내었다.

그림 9C는 그림 9A의 AFM 지형 이미지를 재현하지만, 문제의 프로젝트의 목표는 로블로리 소나무의 나노기계적 특성이 다양한 조직 유형과 나무 나이에 따라 어떻게 다른지 이해하는 것이었기 때문에 ROI 내에서 선택된 세포벽을 따라 수행될 50개의 나노인덴트로 구성된 8개 어레이의 위치를 나타내는 흰색 십자선이 있습니다. 일반적으로 램프(1Hz 램프 속도로 수행된 60nm 공칭 램프 크기)에 1μN의 트리거 임계값이 사용되어 세포벽을 따라 ~10nm(연구된 모든 샘플에서 8nm ± 2nm) 또는 세포벽보다 다소 부드러운 세포 내부에서 약간 더 깊은(14nm ± 4nm) 압흔 깊이가 발생합니다. 각 라인 내의 인덴트는 잘 분리되도록 ≥100nm 간격으로 배치되었으며, 램프당 1,024개의 데이터 포인트를 수집하여 잘 특성화된 접근 및 수축 곡선을 생성했습니다. 빠른 힘 곡선 기반 이미징과 포인트 앤 슛 캔틸레버 기반 나노인덴테이션을 결합하여 통계를 생성하고 셀 구조 전반에 걸친 모듈리의 차이를 결정할 수 있었습니다. 예를 들어, 표 1에 나타낸 바와 같이, 세포 내부의 평균 탄성 계수는 다양한 연령의 나무의 여러 가지로부터 유래된 화이트우드 샘플에 걸친 세포벽의 평균 탄성률의 약 절반인 것으로 밝혀졌다.

견본 위치 E* (GPa) E (GPa) 개악 (nm) 개수 (n)
1 내부 1.5 ± 0.4 1.4 ± 0.4 14 ± 2 199
벽 4.7 ± 1.3 4.3 ± 1.3 7 ± 2 202
2 내부 1.3 ± 0.3 1.2 ± 0.3 16 ± 3 198
벽 3.2 ± 0.9 2.9 ± 0.9 9 ± 2 199
3 내부 1.9 ± 0.6 1.7 ± 0.6 12 ± 3 198
벽 5.7 ± 1.2 5.2 ± 1.2 6 ± 1 199
4 내부 2.4 ± 0.8 2.2 ± 0.8 11 ± 3 202
벽 4.2 ± 2.1 3.8 ± 2.1 9 ± 4 193
5 내부 2.6 ± 0.8 2.3 ± 0.8 10 ± 2 198
벽 4.3 ± 1.6 3.9 ± 1.6 7 ± 2 199
평균의 내부 1.9 ± 0.6 1.8 ± 0.6 13 ± 3
벽 4.4 ± 1.4 4.0 ± 1.4 8 ± 2

표 1: Loblolly 소나무 탄성 계수 통계: 세포벽 대 세포 내부. 서로 다른 연령의 두 나무에서 수집된 5개의 로블로리 소나무 화이트우드 가지 샘플에 대한 세포벽 대 세포 내부의 탄성 계수를 측정했습니다. 모든 모듈러스 값은 힘 변위 곡선의 접근 부분을 DMT 모델에 피팅하고 샘플에 대한 푸아송 비를 0.3으로 가정하여 계산되었습니다. 모듈리는 각 샘플 위치에 대한 평균 ± 표준 편차로 보고되며, 보고된 결과를 생성하기 위해 분석된 힘 곡선의 수(개수, n)가 표시됩니다. 측정된 감소된 계수(E*)는 사용된 다이아몬드 팁 압자에 대한 영률이 1,140GPa이고 푸아송 비율이 0.07이라고 가정하여 실제 샘플 계수(E*)로 변환되었습니다. 또한 1μN의 적용된 하중에 대한 평균 샘플 변형도 표시됩니다.

Bakken 셰일의 상관 나노 역학 및 전자 미세 분광법
바켄 셰일 퇴적물은 미국 몬태나주와 노스다코타주의 윌리스턴 분지(Williston Basin)와 캐나다의 서스캐처원 일부 지역에서 발견된다. 그들은 미국에서 두 번째로 큰 탄화수소 저장소이지만 퇴적물에 대한 연구는 아직 초기 단계에 있습니다37. 그림 10과 같이 주사 전자 현미경(SEM) 이미징 및 에너지 분산 분광법(EDS) 원소 조성 특성화와 함께 AFM 캔틸레버 기반 나노인덴테이션을 공동 국소화하여 조성 및 열 성숙도의 함수로서 Bakken 셰일의 나노기계적 특성에 대한 조사를 수행했습니다. 구체적으로, SEM-EDS 매핑을 사용하여 원소 분포를 특성화하고(그림 10C), 셰일 매트릭스 내에서 다양한 광물 내포물의 존재와 위치를 결정했습니다. 이차 전자(SE) SEM 이미지(그림 10A)에서 광학적으로 식별 가능한 기원을 정의하고 AFM 및 SEM38의 스테이지 이동을 추적하여 고속(kHz 속도) 힘 곡선 기반 AFM 이미징(그림 10B)을 SEM-EDS 맵과 함께 국소화했습니다. 뻣뻣한 스테인리스강 캔틸레버에 장착된 다이아몬드 팁 프로브를 다시 사용함으로써, 관심 있는 개재물을 포함하는 넓은 영역(85 μm x 85 μm)에 대한 탄성 계수의 변화 매핑이 가능했습니다(그림 10D). 그림 10D에 제시된 모듈러스 맵은 이미징 및 데이터 수집 전에 적절한 프로브 교정 상수가 소프트웨어에 입력되지 않았기 때문에 본질적으로 정량적이라기보다는 정성적입니다.

그림 10B 및 그림 10D의 AFM 이미지는 또한 사용된 다이아몬드 팁 프로브의 단점 중 하나, 즉 큐브 모서리 팁 형상으로 인해 높은 종횡비 특징(그림 10B의 검은색 타원형 영역 참조)을 정확하게 추적할 수 없다는 점을 강조합니다. 분해능이 감소하고 가파른 형상을 정확하게 추적할 수 없는 현상은 그림 11에서 더 명확하게 확인할 수 있으며, 여기서 Bakken 셰일 샘플의 동일한 일반 영역은 큐브 코너 다이아몬드 팁(그림 11A)과 훨씬 더 선명하고 더 높은 종횡비의 경직 태핑 모드 실리콘 AFM 프로브(그림 11B)로 이미지화되었습니다. 보다 구체적으로, 도 11B에 도시된 이미지는 도 8A-D의 특성화된 프로브를 사용하여 획득되었으며, 도 8A의 BTR 모델(R=11 nm)과 도 8B(R=43 nm) 사이이다. 직접적인 비교를 위해 그림 11C,D와 그림 11E,F는 각각 다이아몬드 팁과 실리콘 프로브로 얻은 동일한 샘플 표면 특징의 확대 이미지를 표시하여 팁 형상 및 반경이 이미지 해상도 및 충실도에 미치는 영향을 보여줍니다. 그림 11G는 날카롭고 높은 측면의 실리콘 프로브로 획득한 표면 지형(그림 8A, B)과 오버레이된 컬러 스킨으로 인코딩된 다이아몬드 팁 프로브(그림 8E, F)로 획득한 모듈러스 값을 결합한 복합 3D 이미지를 나타냅니다.

그림 10 및 그림 11에 표시된 큰 이미지 외에도 완전히 보정된 다이아몬드 팁 프로브를 사용하여 더 작은(10μm x 10μm) 빠른 힘 곡선 기반 이미지를 획득했습니다. 이 이미지는 주변 유기 매트릭스의 특성을 더 자세히 조사하기 위해 광학적으로 볼 수 있는 무기 광물 내포물이 없는 영역에 초점을 맞췄습니다. 512 x 512(즉, ~20nm x 20nm 샘플링 픽셀)의 픽셀 해상도를 사용하여 각 10μm x 10μm 이미지와 함께 >262,000개의 개별 F-D 곡선을 캡처하고 저장하여 우수한 통계를 가능하게 했습니다. F-D 데이터는 Derjaguin-Muller-Toporov (DMT) (35 접촉 역학) 모델을 구현하기 위해 AtomicJ 소프트웨어 패키지(23)를 사용하여 배치 처리 및 분석되었다. 피팅 후, 데이터는 다른<연구와 유사하게 계산된 탄성 계수 <0(비물리적) 또는 >30 GPa(이 연구는 셰일의 비광물 부분에 초점을 맞추었기 때문에, E << 30 GPa)를 초래하는 곡선을 제거하기 위해 정리되었습니다. R2 컷오프는 다소 임의적이지만 모델이 분명히 정확하게 맞출 수 없는 데이터만 제거하도록 선택되었습니다. 이미징 영역에 큰 미네랄 함유물을 포함하는 하나의 이상치를 제외하고 제거된 곡선은 각 이미지에 대한 전체 데이터의 0.5% 미만을 차지했습니다. 통계 결과의 요약은 표 2에서 찾을 수 있습니다. 계산 된 탄성 계수는 3.5에서 6.1 GPa까지 다양하며 유사한 연구에서39,40이 발견 된 범위 내에서 다양합니다.

견본 E (GPa) 데이터 정리 후 수율 개수 (n)
1 6.1 ± 3.8 93.70% 7,36,874
2 5.1 ± 2.6 99.70% 7,84,267
3 3.5 ± 1.9 99.60% 7,83,427

표 2: Bakken 셰일의 탄성 계수 통계. 서로 다른 조성과 열 성숙도를 가진 3개의 Bakken 셰일 샘플에서 유기 매트릭스의 탄성 계수를 측정했습니다. 샘플 1은 대조군이고, 샘플 2 및 3은 인위적으로 열 성숙을 시뮬레이션하기 위해 각각 12시간 및 48시간 동안 어닐링되었습니다. 탄성 계수는 각 샘플 위치에 대한 평균 ± 표준 편차로 보고되며, 표시된 텍스트에 설명된 데이터 정리 절차를 사용한 후 분석에 포함된 힘 곡선의 수(개수, n)가 있습니다. 계산 된 평균 계수 (3.5-6.1 GPa)는 2.9-11.8 GPa의 계수 범위를 발견 한 Li et al.40과 같은 다른 유사한 연구에서보고 된 범위 내에 있습니다.

외부 자극에 의한 중간엽 줄기세포 핵경직도 변화
중간엽 줄기세포(Mesenchymal stem cells, MSCs)는 연골세포, 지방세포, 조골세포, 근세포가 될 수 있는 전구세포이다41. 이러한 다양한 조직 유형으로의 MSC 분화는 세포골격 및 핵골격(LINC) 복합체의 링커를 통해 세포에 대한 외부 기계적 자극에 의해 영향을 받으며, 이는 외부 세포막을 핵막(41)에 물리적으로 연결합니다. LINC 복합체는 세포 골격과 상호 작용하여 세포에 가해지는 물리적 힘을 감지하고 분화 과정을 시작하기 위해 기계 감성 인자 β-카테닌 및 YAP의 핵 수입을 촉진하는 SUN 및 Nesprin 단백질로 구성됩니다42,43,44. 세포의 기계적 자극 후 β-카테닌 및 YAP의 핵 수입과 함께 세포 골격은 핵 주위에 F-액틴 필라멘트의 형성과 액틴44,45,46의 핵 전좌를 포함하여 재배열을 겪습니다. 기계 자극은 세포 세포 골격의 변화와 액틴의 핵 진입을 시작하기 때문에 세포와 핵의 전체 강성(탄성률)이 영향을 받으며 AFM 캔틸레버 기반 나노인덴테이션으로 측정할 수 있습니다. 이전 연구에서는 LINC 복합체의 파괴 후 세포 및 핵 탄성률의 감소를 감지하고, 반대로 MSC47의 기계적 자극 후 세포 및 핵 탄성률의 증가를 감지함으로써 이를 확인했습니다. 현재 연구는 여전히 핵으로의 액틴 수입 메커니즘과 액틴 중합이 기계 자극 후 세포 및 핵 탄성률에 미치는 영향을 조사하고 있습니다.

살아있는 세포의 기계적 특성을 조사하기 위해 실험은 완충 용액(일반적으로 PBS)에서 수행되어야 합니다. 유체에서 캔틸레버 기반 나노인덴테이션을 수행하는 것은 특히 중간엽(E≈ 2kPa)과 같은 매우 부드러운 샘플의 측정에 고유한 문제를 제기합니다. 특히, 살아있는 세포의 낮은 탄성 계수는 세포 구조에 부여되는 응력을 줄이고 멤브레인의 천공을 피하기 위해 큰 프로브 반경의 사용을 필요로 합니다. 또한, 이러한 낮은 탄성 계수를 측정하기 위해서는 매우 낮은 스프링 상수 캔틸레버(k = 0.04N/m)가 필요하지만, 이는 유체의 점성 항력으로 인해 잘못된 결합의 가능성을 증가시켜 AFM 결합 공정의 초기 빠른 하강 단계에서 연질 캔틸레버의 편향을 초래합니다. 잘못된 결합에 대한 더 높은 성향에 대응하려면 더 큰 결합 설정값(즉, 편향 전압 트리거 임계값을 사용하여 결합 프로세스를 종료해야 함)을 사용해야 할 수 있습니다. 더 부드러운 캔틸레버는 일반적으로 뻣뻣한 캔틸레버보다 더 큰 정도로 탄성적으로 변형될 수 있기 때문에, 유체에서 더 높은 맞물림 설정점으로 경험되는 더 큰 굽힘은 일반적으로 이러한 소프트 프로브에 해롭지 않습니다. 또한 부유 파편이나 기포가 유체를 통해 PSD로 레이저를 전달하는 것을 일시적으로 방해하거나 캔틸레버에 부착되어 레이저를 차단할 수 있으므로 유체 환경에서 사용되는 용액에는 파편과 기포가 없어야 합니다. 레이저 빔과의 간섭은 결과 F-D 곡선에 부정적인 영향을 미치고 종종 잘못된 충돌 감지 또는 잘못된 결합을 초래합니다. 마지막으로, 살아있는 세포에 대한 나노 압흔은 더 단단하고 무생물적인 물질보다 더 많은 사용자 입력이 필요합니다. 특히, 세포와 세포의 유체 환경이 훨씬 더 역동적이기 때문에 양호한 F-D 곡선을 얻기 위해 각 램프에 대한 프로브의 높이를 능동적으로 조정해야 할 수 있습니다.

라이브 셀 나노인덴테이션에서는 더 단단한 샘플에 비해 동일한 캔틸레버 편향을 초래하기 위해 훨씬 더 큰 샘플 변형이 필요한 경우가 많습니다. 이러한 더 큰 변형은 선형 탄성에 대한 헤르츠 모델의 가정으로부터 벗어난 실험 결과를 초래할 수 있으며, 따라서 정확한 F-D 분석(48)을 위해 초탄성 거동을 설명하기 위해 보정 계수가 적용될 필요가 있을 수 있다. 기하학적 크기 비율 Equation 4, 여기서 R2는 압자의 반경이고 R1은 셀의 반경(그림 12A 참조)은 결과 데이터가 헤르츠 역학을 준수하는지 예측하는 데 사용할 수 있습니다. 이상적인 기하학적 크기 비율은 β = 0.3인 것으로 밝혀졌으며, β 값 <0.3은 탄성 계수를 과소평가하고 β 값은 0.3> 헤르츠 접촉 이론48로 분석할 때 탄성 계수를 과대평가하게 합니다. 비선형 효과를 피하는 일반적인 방법 중 하나는 변형을 작게 유지하는 것입니다. 본 연구에서는 압입 깊이를 500nm-1μm로 제한하였다.

중간엽 줄기세포(MSC)와 분리된 핵에 대한 단일 세트의 나노인덴테이션(nanoindentation) 실험의 결과를 보여주는 대표적인 데이터 세트가 도 12B에 나와 있다. 그림 12B에 제시된 데이터에서 사전 보정된(LDV를 통한 스프링 상수 및 SEM을 통한 팁 반경), 공칭 스프링 상수가 k = 0.04N/m인 5μm 반경 반구형 프로브를 사용하여 손상되지 않은 살아있는 MSC와 분리된 MSC 핵 사이의 계수 차이를 조사했으며, 이는 정적 및 동적 변형이 세포 및 핵 기계적 특성에 미치는 영향을 테스트하기 위한 대조군 역할을 했습니다46. 세포와 핵에 관여하는 것의 차이와 어려움으로 인해 추출된 모듈러스 데이터는 큰 변화(즉, 값 분포)를 나타내는 경향이 있습니다. 따라서 그림 12B 의 데이터 세트는 수집된 데이터의 75번째 백분위수를 나타냅니다. 살아있는 세포들 사이의 이러한 타고난 가변성과 결과적인 측정 확산으로 인해, 데이터 분석 및 해석을 위한 강력한 통계를 생성하기 위해 적어도 3개의 생물학적 복제물을 갖는 많은 수의 샘플에 대해 복제 나노인덴테이션 실험을 수행하는 것이 권장된다30.

콜레스테롤 함유 지질 이중층의 기계적 성질
눈 수정체 막에서 발견되는 전형적인 조성물인 매우 높은(>50mol%) 콜레스테롤(Chol) 함량을 갖는 지지된 지질막을 준비하고 갓 절단된 백운모49에서 배양했습니다. Chol/POPC(POPC = 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine) 혼합 비율 1에서 제조된 이러한 담지 지질막(SLM)의 대표적인 AFM 지형 이미지가 그림 13A에 나와 있으며, 그림 아래에 표시된 이미지에서 보라색 선을 따른 높이 프로파일이 있습니다. 그림 13A 의 SLM은 지형 이미지에서 구별할 수 있는 특징이 없는 것으로 입증된 바와 같이 충분한 배양 시간(~25분)과 충분한 지질 농도(0.3mg/mL)로 노출된 운모 표면을 완전히 덮었습니다. 마찬가지로, 이미지 전체의 높이 프로파일은 멤브레인 표면의 거칠기에 대한 구조적 세부 정보를 제공하며 SLM은 예상대로 매끄럽습니다.

도 13B는 도 13A에 도시된 SLM 상에 캡처된 힘 곡선의 접근 섹션들의 모음을 나타낸다. SLM의 기계적 특성에 관한 더 나은 통계를 얻기 위해, 힘 곡선은 SLM의 거의 전체 폭을 커버하는 적어도 100 nm 간격의 등거리 지점에서 수집되었다. 점 사이의 간격(압입 깊이의 ≥10배)은 압입이 너무 가깝게 발생하는 것을 방지하기 위해 선택되었습니다. 힘 곡선은 힘이 ~10nN에서 ~5nN으로 급격히 떨어지는 힘 곡선의 접근 섹션에서 ~0 및 ~5nm 이격 거리 사이의 불연속 또는 갑작스러운 점프에 의해 입증되는 명확한 돌파구 이벤트를 보여줍니다. 도 13B의 접근 곡선에 기초하여 도 13A에 도시된 멤브레인에 대한 평균 파과력(Chol/POPC 혼합 비율 1)은 0.27 nN ± 9.25인 것으로 계산된다.

대조적으로, 그림 13C 는 Chol/POPC 혼합 비율 1에서 막을 다시 배양하여 형성된 부분 막 또는 막 패치의 AFM 지형 이미지를 보여주지만 훨씬 낮은 농도의 지질(~15μg/mL) 및 더 짧은 배양 시간(~5-6분)49. 이미지 중앙의 멤브레인 패치를 가로지르는 빨간색 선을 따라 높이 프로파일이 그림 아래에 나와 있습니다. 부분 이중층을 통한 측정은 SLM의 두께를 제공하며, 그림 13C 에서 검은색 점선으로 ~7nm로 표시됩니다. 그러나, 이러한 측정된 두께는 또한 멤브레인과 운모 디스크(50) 사이에 1-2 nm 수층을 혼입시킨다. 부분 멤브레인은 종종 운모 표면에 약하게 부착되어 스캐닝 중에 부분 멤브레인 패치의 가장자리에서 지질 입자가 제거될 수 있지만 배양 시간이 약간 길거나 이미징 력을 낮추면 이러한 어려움을 제거할 수 있습니다.

AFM 프로브의 교정은 SLM 기계적 특성을 정확하게 정량화하는 데 중요합니다. 특히, 팁 스프링 상수는 공기 또는 유체 매체에서 일관되게 유지되지만 변형도 실험이 수행되는 동일한 매체에서 보정해야 합니다. 후면 코팅의 레이저 정렬 및/또는 반사율은 특히 유체에서 시간이 지남에 따라 변할 수 있으므로 재현 가능한 결과를 보장하기 위해 각 힘 곡선 획득 직전에 편향 감도를 보정하는 것이 중요합니다. 매우 날카로운 프로브는 SLM에 쉽게 구멍을 뚫고 잘못 낮은 돌파력을 측정하거나 돌파구가 전혀 없을 수 있으므로 멤브레인 힘 곡선을 캡처하는 데 권장되지 않습니다. 그러나 적절한 세척 없이 동일한 팁을 반복적으로 사용하면 팁에 이물질이 쌓여 팁이 무뎌지거나 팁-샘플 접착력에 영향을 미칠 가능성이 높아집니다. 접근력 곡선에서 명백한 돌파구 이벤트의 부족은 실제 멤브레인이 아닌 운모에만 미는 것과 일치할 수도 있습니다. 따라서 힘 곡선을 포착하기 전에 멤브레인 형성을 육안으로 확인해야 합니다.

Figure 7
그림 7: 공기와 유체의 대표적인 힘-변위(F-D) 곡선. (A) DMT 모델 적합이 수반되는 공기 중의 로블로리 소나무 및 (B) Hertz 모델 적합이 수반되는 PBS의 살아있는 MSC 핵에서 얻은 대표 힘 곡선. 패널 A 와 B 의 삽입물은 해당 접근 곡선(파란색 트레이스)의 접촉 영역을 피팅(녹색 트레이스)과 함께 확대/축소하여 보여줍니다. 각 패널에서 초기 팁-샘플 접점(피팅 알고리즘에 의해 결정됨)은 녹색 다이아몬드로 표시되고, 턴어라운드 지점(즉, 어프로치에서 리트랙트 또는 리트랙트로의 전환)은 청록색 원으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 8
그림 8: 실리콘과 다이아몬드 프로브 팁 마모 비교. (A-D) 실리콘 프로브 팁. 팁 특성화 샘플의 이미징 후 블라인드 팁 재구성 방법으로 생성된 일련의 모델로, Bakken 셰일 샘플의 3개의 순차적인 85μm x 85μm(1024 x 1024픽셀) 힘 곡선 기반 이미지 과정에서 경험한 점진적인 팁 마모로 인한 뻣뻣한 캔틸레버 실리콘 팁 프로브(재료 표 참조)의 반경 변화를 보여줍니다. 0.1Hz의 라인 스캔 속도와 2kHz의 힘 곡선 샘플링 속도(즉, ~2천만 팁-샘플 상호 작용/이미지)로 수행됩니다. (A) 사용하기 전에 받은 대로(상자 밖에서) 팁. R = 11 나노 미터. (B) 팁 후 하나의 이미지 (R = 43 nm). (C) 팁 후 2개의 이미지(R=94 nm). (D) 팁 후 3개의 이미지(R=129 nm). (E,에프) 다이아몬드 프로브 팁. 동일한 다이아몬드 팁 프로브의 BTR 모델(재료 표 참조)을 ~6개월 간격으로 얻었습니다. E와 F에 표시된 모델을 생성하는 데 사용된 팁 이미지를 획득하는 사이에 프로브로 수천 개의 나노인덴트가 수행되었으며 힘 곡선 기반 이미징 중에 수억 개의 팁-샘플 상호 작용이 발생했습니다. 그럼에도 불구하고, 다이아몬드의 경도로 인해, ~ 30 nm의 추정 팁 끝 반경은 팁의 초기 (E)와 후속 (F) 이미지의 획득 사이의 BTR 기술의 불확도 한계 내에서 변하지 않았다. 이전 모델에서 관찰된 돌기(패널 E에서 검은색 원으로 표시됨)는 BTR 방법의 인공물이거나 팁 측면에 나노 크기 오염 물질(예: 먼지 입자)이 존재하기 때문일 가능성이 큽니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 9
그림 9: 로블로리 소나무 샘플의 AFM 지형 및 모듈러스 맵. 세포벽에서 캔틸레버 기반 나노인덴테이션 측정이 가능하도록 수지에 내장된 단면 로블로리 소나무 샘플의 공기 중에서 획득한 대표적인 AFM 데이터. (A) 의사 3D 묘사로 제시된 빠른 힘 곡선 기반 이미징 모드를 통해 획득한 여러 세포를 포함하는 AFM 지형 이미지. (B) 각 픽셀에서 획득 한 힘 곡선을 분석하고 데이터를 DMT 모델에 피팅하여 AFM 소프트웨어에 의해 실시간으로 생성 된 Elastic 또는 Young 's modulus 맵은 세포벽이 세포 내부보다 더 단단하다는 것을 보여줍니다. 측정된 프로브 교정 매개변수가 아닌 명목상의 프로브 교정 매개변수가 사용되었으므로 계수 값은 정성적 또는 반정량적 값으로 취급되어야 합니다. (C) 400개의 나노인덴트(60nm 공칭 램프 크기, ~10nm의 평균 압흔 깊이에 해당하는 1μN 트리거 임계값)가 나노 스케일 정밀도로 압흔을 찾을 수 있도록 AFM 이미지를 획득한 후 선택된 세포벽을 따라 수행된 위치(각각 50개의 흰색 십자선으로 구성된 8개의 선≥100nm 간격)를 나타내는 ROI 개요. 스케일 바 = 20 μm (A, B). 약어: AFM = 원자력 현미경; DMT = Derjaguin-Muller-Toporov. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 10
그림 10: Bakken 셰일 샘플의 공동 국소화된 AFM 및 SEM/EDS. (A) Bakken 셰일 샘플의 일부에 대한 2차 전자 SEM 이미지. (B) A에서 블랙박스로 표시된 영역의 AFM 지형 이미지. 검은색 타원형은 프로브의 낮은 종횡비가 가파르고 높은 종횡비 표면 지형 특징이 아닌 프로브 측벽의 이미징으로 이어지는 영역을 나타냅니다. (C) A에 나타낸 SEM 이미지에 대해 얻어진 EDS 원소 조성 지도. (D) AFM 유래 탄성률 맵은 A-D 영상의 중심에 광물 내포가 주변 유기기질보다 현저히 단단함을 보여주는 A-D 지형 영상을 획득하는 과정에서 발생한다. 스케일 바 = 50 μm. 약어: AFM = 원자력 현미경; SEM = 주사 전자 현미경; EDS = 에너지 분산 분광법. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 11
그림 11: 프로브 팁 반경 및 모양이 높은 종횡비 형상의 모양에 미치는 영향. (A) R≈ 30nm의 낮은 종횡비(팁 반쪽 각도 = 47°) 다이아몬드 팁 프로브(재료 표 참조) 또는 (B) R≈ 10nm의 높은 종횡비(팁 절반 각도 ≈ 19°) 뻣뻣한 실리콘 프로브(공칭 k = 200N/m, 재료 표 참조)를 사용하여 얻은 형상 분해능을 비교하여 Bakken 셰일 샘플에서 동일한 위치를 이미지화합니다. (C-F) 더 큰 곡률 반경의 낮은 종횡비 다이아몬드 팁 프로브(C,E) 또는 더 선명하고 높은 종횡비의 강성 실리콘 태핑 모드 프로브(D,F)로 얻은 A 및 B의 파란색 (C, D) 및 주황색 (E, F) 박스 영역의 확대 이미지로, 더 큰 팁 반경으로 인해 다이아몬드 팁 프로브로 얻은 AFM 지형 이미지에서 감소된 형상 해상도 및 팁 측벽 아티팩트 도입을 강조합니다. 절반 각도. C-F에서 강조 표시된 영역에는 측면 분해능, 정확한 추적 및 더 쉽게 무뎌지고 처음에는 날카로운 실리콘 프로브 또는 무딘 내마모성 다이아몬드 팁 프로브 간의 이미지 충실도 측면에서 절충점을 보여주는 가파르고 깊은 우물과 같은 특징이 포함되어 있습니다. (G) 선명하고 더 높은 종횡비의 뻣뻣한 실리콘 프로브로 획득한 AFM 지형과 다이아몬드 팁 프로브가 있는 샘플의 동일한 영역의 빠른 힘 곡선 이미징에서 파생된 모듈러스 데이터(오버레이드 컬러 스킨)를 결합하여 생성된 합성 3D 이미지. A와 B의 파란색과 흰색 상자로 강조 표시된 기능은 G에도 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 12
그림 12: 세포 또는 핵에 대한 캔틸레버 기반 나노인덴테이션. (A) 평평하고 단단한 기판 상에 위치한 반지름 R1을 갖는 셀은 반지름 R2를 갖는 구형 압자에 의해 깊이 d로 압흔된다. 이 수치는 Ding et al.48에서 재현되었습니다. (B) 마우스 중간엽 줄기 세포에 대한 AFM 캔틸레버 기반 나노 인덴테이션 실험에서 얻은 대표 모듈러스 측정의 개별 값 플롯 및 마우스 중간엽에서 추출한 분리된 핵. 총 10개의 세포와 10개의 핵을 500-600nm의 압흔 깊이에서 각각 5회 측정했습니다(Hertz 접촉 역학 모델의 사용을 허용하도록 선택됨). 생성된 원시 F-D 곡선 데이터는 탄성 계수를 계산하기 위해 Atomic J23을 사용하여 처리되었습니다. 세포의 선천적 변동성이 크기 때문에 데이터의 75번째 백분위수가 표시됩니다. 세포와 분리된 핵은 각각 0.75 ± 0.22 kPa 및 0.73 ± 0.22 kPa의 측정된 평균 계수로 탄성 계수에서 통계적 차이를 나타내지 않았습니다. 기계적 자극, 단백질 녹아웃 및 화학적 처리로 인한 핵 강성의 차이를 결정하기 위해 유사한 데이터를 수집하고 분석했습니다. 약어: MSC = 중간엽 줄기세포; AFM = 원자력 현미경; F-D = 힘-변위. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 13
그림 13: 지질 이중층의 형태 및 나노기계적 특성. (A) 긴 배양 시간(~25분)과 높은 지질 농도(0.3mg/mL)로 노출된 운모 표면 전체에 걸쳐 형성된 1의 혼합 비율로 Chol/POPC로 구성된 완전 지지 지질막(SLM)의 최소 높이 변화를 보여주는 AFM 지형 이미지. 이미지 중앙을 가로지르는 보라색 선을 따라 높이 프로파일이 그림 아래에 표시되어 멤브레인 표면의 구조적 세부 정보를 제공합니다. 예상대로 SLM은 매우 부드럽습니다. (B) A에 표시된 SLM에서 캡처된 힘 곡선의 접근 섹션 모음. 힘 곡선은 거의 전체 SLM을 덮는 등거리 지점 ≥100 nm에서 수집되었습니다. 힘 곡선은 힘 곡선의 접근 부분의 불연속 또는 갑작스런 점프에 의해 입증되는 명확한 돌파구 이벤트를 보여줍니다. 평균 파과력은 9.25 ± 0.27 nN입니다. (C) A49에 비해 더 짧은 배양 시간(~5-6분) 및 더 낮은 지질 농도(~15μg/mL)로 Chol/POPC 혼합 비율 1로 막을 배양하여 형성된 부분 막 또는 막 패치. 패치의 빨간색 선을 따라 있는 높이 프로필이 이미지 아래에 표시됩니다. 부분 이중층을 사용하면 높이 프로파일에서 검은색 점선으로 표시되는 SLM의 두께를 측정할 수 있습니다. 측정된 두께는 또한 멤브레인과 운모 디스크(50) 사이에 1-2 nm 수층을 혼입시킨다는 점에 유의한다. 이 수치는 엘스비어의 허가를 받아 Khadka et al.49에서 수정한 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

시료 전처리
공기 중의 나노인덴테이션의 경우, 일반적인 준비 방법에는 극저온 절편(예: 조직 샘플), 분쇄 및/또는 연마 후 울트라마이크로토밍(예: 수지 포매 생물학적 샘플), 이온 밀링 또는 집속 이온빔 준비(예: 반도체, 다공성 또는 연마가 불가능한 혼합 경도 샘플), 기계적 또는 전기화학적 연마(예: 금속 합금) 또는 박막 증착(예: 원자층 또는 화학 기상 증착, 분자 빔 에피 택시). 목표는 표면 거칠기를 최소화한 샘플을 만드는 것입니다(이상적으로는 nm 스케일, 의도한 압입 깊이의 ≤0.1배). 앞의 많은 방법을 사용하여 샘플을 고순도 여과(예: HPLC 등급) 용매로 헹구고 및/또는 초음파 처리하고 미립자 파편을 제거하기 위해 초고순도(99.999%) 질소(N2) 가스로 건조해야 할 수 있습니다. 대안적으로, 플레이크(예를 들어, 2D 물질) 또는 입자(예를 들어, 나노입자 또는 마이크로캡슐)는 고순도 여과된 용매를 사용하여 제조된 용액으로부터 스핀 코팅되거나 드롭캐스트될 수 있다. 이 경우, 목표는 샘플에서 임의로 선택된 영역에서 시야 내에서 겹치지 않는 여러 플레이크 또는 입자를 생성하는 표면 밀도를 달성하는 것입니다. 유체 내 나노인덴테이션(종종 생존 가능한 상태를 유지하기 위해 완충 용액을 필요로 하는 생물학적 샘플에 사용됨)의 경우, 매끄러운(나노미터 규모의 표면 거칠기) 기판(예: 현미경 슬라이드, 페트리 접시 또는 갓 절단된 백운모 운모)에 샘플의 증착 또는 준비가 필요합니다(46,47,49).

프로브 선택 고려 사항
F-D 곡선의 정량 분석에는 적절한 프로브를 선택하는 것이 가장 중요한데, 이는 팁-샘플 상호작용이 캔틸레버 기반 나노인덴테이션에서 측정되는 기본 특성이기 때문입니다. 다음 질문은 주어진 실험에 대한 프로브를 선택할 때 특히 중요합니다. 샘플의 예상(또는 측정된) 표면 거칠기 및 탄성 계수 범위는 얼마입니까? 높은 거칠기 샘플은 가파른 형상을 추적할 때 팁에 존재하는 증가된 횡력으로 인해 더 부드러운 샘플에 비해 마모를 가속화할 수 있을 뿐만 아니라 팁 파손 이벤트(53)의 가능성을 증가시킬 수 있습니다. 마찬가지로 샘플이 단단할수록 프로브 팁이 더 빨리 마모됩니다. 또한 얼마나 많은 이미지 및/또는 나노인덴트가 필요합니까? 이미징 및 압흔이 적기 때문에 팁 마모가 줄어들 수 있습니다. 아래에서 자세히 설명하듯이 다이아몬드 유사 탄소(DLC) 코팅을 사용하여 팁 마모를 줄이거나 다이아몬드 팁 프로브를 사용하여 사실상 제거할 수 있습니다(시간이 지남에 따라 거의 무한한 프로브 수명으로 높은 획득 비용이 상쇄됨).

적절한 프로브를 선택할 때 고려해야 할 또 다른 사항은 관심 있는 기능의 크기입니다. 나노인덴테이션의 경우, 더 큰 팁은 파괴로 인한 갑작스러운 팁 지오메트리 변화를 경험할 가능성이 적고 또한 더 낮은 마모율을 나타내기 때문에 문제의 샘플(들) 및 원하는 정보 내용에 필요한 공간 분해능을 유지하면서 가능한 가장 큰 팁 크기를 사용하는 것이 가장 좋습니다(54). 전도성 AFM55, 켈빈 프로브 힘 현미경 (KPFM) 56 또는 자기 힘 현미경 (MFM) 57과 같이 나노 인덴테이션과 함께 국소화 할 수있는 다른 AFM 방법이 있는지 여부를 고려하는 것도 중요합니다. 이와 같은 추가 계측을 활용해야 하는 경우 프로브 팁은 전기 전도성 또는 자성을 가져야 할 수 있으며, 이는 재료 구성에 영향을 미치고 경도, 내마모성 및 팁 반경을 포함한 다양한 특성에 영향을 미칩니다. 마찬가지로, 압흔이 유체에서 수행되는 경우, 내식성이 있어야 하기 때문에 프로브의 반사 후면 코팅(있는 경우)의 조성이 또 다른 중요한 고려 사항입니다(예: 유체 프로브의 경우 Au 후면 코팅이 일반적임). 마지막으로, 그리고 아마도 가장 중요한 것은 프로브 캔틸레버의 스프링 상수가 측정할 탄성 계수의 예상 범위와 일치해야 한다는 것입니다. 스프링 상수가 샘플 계수와 잘 일치하지 않으면 두 가지 경우 중 하나가 발생할 수 있습니다. 캔틸레버가 너무 뻣뻣하면 처짐이 거의 또는 전혀 측정되지 않으며 특성화가 불가능해집니다. 반대로, 캔틸레버가 너무 부드러우면 기계적 특성을 측정할 만큼 샘플을 변형시킬 수 없습니다.

팁 마모
마모는 다양한 방법으로 정의할 수 있습니다. 여기서는 AFM 프로브 팁 마모에 대한 논의를 위해, 물리적 상호작용으로 인한 표면으로부터의 재료의 제거뿐만 아니라 재료의 손실 없이 소성 변형으로 인한 프로브 팁의 표면 지형의 변화로 정의될 것이다(58). 더 넓은 의미에서 마모는 산화 및 수화와 같은 화학 반응을 포함할 수도 있습니다. 통상의 AFM 어플리케이션에서, 측면 공간 분해능은 일반적으로 팁 반경(59)에 의해 제한되며, 팁-샘플 상호작용이 주요 측정 특성이다. 팁 반경은 팁-샘플 시스템의 접촉 역학을 모델링하고 후속적으로 기계적 특성을 결정하는 데 있어 핵심 파라미터이기 때문에, 팁 마모는 나노인덴테이션 실험을 수행할 때 특히 중요하며, 나노인덴테이션 결과의 정확한 해석을 위한 핵심 한계이다(53). 팁 마모의 일반적인 점진적인 특성으로 인해(팁 파손 이벤트 제외) 단일 나노인덴테이션 주기(즉, 램프)로 인해 팁 마모를 정량화할 수 없습니다. 또한, 나노인덴테이션(빠른 힘 곡선 기반 이미징 할인)에서 샘플에 대한 프로브 팁의 수직 이동은 마모 속도를 감소시키는 데 적합한데, 이는 팁 마모의 기본 모드가 일반적으로 스캐닝 모드(60) 동안 발생하는 전단력이기 때문이다. 따라서 나노인덴테이션 실험에서 팁 마모의 주요 원인은 초기 프로브 보정(특히 편향 감도 및 팁 반경 측정) 후 나노인덴테이션 전에 수행된 모든 이미징입니다. 따라서 실리콘 또는 질화규소 프로브를 사용하는 경우 각 실험 전후에 팁 반경을 확인하여 위에서 설명한 방법(예: SEM 분석 또는 BTR) 중 하나를 사용하여 팁 마모를 모니터링하고 설명하는 것이 좋습니다.

프로브 재료
다이아몬드 라이크 카본(DLC)
DLC 코팅된 프로브 팁 또는 다이아몬드 팁을 사용함으로써, 팁 마모를 크게 줄이거나 완전히 무효화할 수 있다(53). 이러한 대체 팁 재료의 향상된 내마모성은 기계적 특성, 특히 매우 단단한 재료의 측정에 매우 매력적입니다. DLC 프로브 팁은 일반 실리콘 프로브 팁에 비해 내마모성이 1,600배 증가할 수 있는 것으로 나타났습니다(54). 이러한 내마모성의 급격한 증가는 여러 요인에 기인할 수 있습니다. 첫째, DLC (C-C 및 C = C)에 존재하는 결합과 실리콘 (Si-O, Si-C)과의 계면은 모든 원소 쌍 중 가장 강한 결합 중 일부이며 실리콘 팁에 존재하는 Si-Si 결합보다 훨씬 강합니다. DLC는 또한 마찰을 감소시켜 팁 내의 전단 응력을 낮추어 마모를 줄이는 효과가 있습니다. 또한, DLC 표면 화학은 실리콘 팁의 표면 화학과 다른데, 실리콘 팁은 주변 습도 조건에서 마찰화학적 에칭을 경험할 수 있는 반면, DLC 팁은 그렇지 않습니다(또는 적어도 1차 마모 모드와 비교하여 의미 있는 방식으로 에칭되지 않음)54. DLC 코팅 팁의 주요 단점(표준 코팅되지 않은 실리콘 팁에 비해 가격이 상승한 것 이상)은 코팅 자체로 인해 팁 반경이 증가한다는 것입니다. 대부분의 DLC 프로브 팁 반경은 ≥30nm인 반면, DLC 코팅되지 않은 팁은 반경61에서 1-2nm에 안정적으로 도달할 수 있습니다. 그러나 프로브 결함 또는 돌출로 인해 이상적인 면적-깊이 함수와 실제 면적-깊이 함수 사이의 나노 스케일 불일치는 더 큰 상대 오류로 인해 더 작은 반경 프로브로 이루어진 측정에 불균형적으로 영향을 미치기 때문에 특성 측정의 오류를 줄이기 위해 나노인덴테이션 실험에 더 큰 팁 반경이 바람직할 수 있습니다. 또한 DLC 코팅은 우수한 내마모성에도 불구하고 결국 스폿에서 마모되어 노출된 실리콘 코어와 나머지 DLC 코팅 사이의 마모가 차등할 수 있습니다. 불행하게도, DLC 코팅의 내마모성은 코팅 단독의 실제 경도보다는 실리콘 팁에 대한 코팅의 접착력에 의해 제한될 수도 있습니다.

다이아몬드
다이아몬드는 지구상에서 가장 단단하고 내마모성이 뛰어난 재료 중 하나로 잘 알려져 있습니다. 그럼에도 불구하고, 팁 마모(62)를 탐색하기 위한 의도적인 시도에서 큰(60μN) 힘을 사용할 때 다이아몬드 팁에서 여전히 상당한 마모가 발생할 수 있음이 입증되었습니다. 반대로, 팁에 가해지는 힘이 훨씬 적은 일반적인 나노인덴테이션 및 이미징 시나리오에서는 다이아몬드 팁 마모에 대한 엄격한 연구가 없었습니다. 그러나, 도 8E,F에서 볼 수 있는 바와 같이, 동일한 팁 특성화 샘플에서 동일한 조건 하에서 동일한 다이아몬드 프로브 팁의 BTR 모델링은 사실상 구별할 수 없는 팁 형상 모델을 생성하였다(즉, 마모의 식별 가능한 증거 없음). 첫 번째와 두 번째 BTR 이미지 사이에서, 프로브는 수천 개의 나노 인덴트를 수행하는 데 사용되었으며, 목재 (loblolly pine), 셰일, 고도로 정렬 된 열분해 흑연 (HOPG) 및 다양한 그래 핀 박막을 포함한 다양한 뻣뻣한 물질 (E > 15 GPa)을 이미징하면서 수억 개의 팁-샘플 상호 작용을 거쳤습니다. 의미심장하게도, 추정된 팁 반경은 그림 8E,F의 두 이미지 사이에서 ~1nm 변경되었으며, 이는 BTR 방법의 오차63 내에 있습니다. 완전한 연구는 아니지만 이 비교는 일반적인 실험적 나노인덴테이션(및 이미징) 조건에서 다이아몬드 프로브의 우수한 내구성을 보여줍니다. 다이아몬드 팁의 사용과 관련된 주요 단점(고가의 선행 비용 이상)은 팁 반경의 증가이며, 더 우려되는 몇 가지 측면에서는 대부분의 상업적으로 이용 가능한 다이아몬드 팁의 큐브 코너 지오메트리의 낮은 종횡비입니다. 그림 11A,B는 공칭 팁 반경이 8nm이고 평균 반각이 ~19°인 날카로운 실리콘 프로브로 획득한 Bakken 셰일 샘플과 공칭 팁 반경이 40nm이고 평균 측면 각도가 47°인 다이아몬드 팁 프로브로 획득한 동일한 영역의 비교 AFM 이미지를 나란히 보여줍니다. 확대된 영역을 비교하면(그림 11C,D 및 그림 11E,F) 다이아몬드 팁 프로브가 이미지 내에서 더 가파른(더 높은 종횡비) 특징을 해석하고 정확하게 추적할 수 없다는 것이 쉽게 알 수 있습니다. 대신, 가파른 형상이 있는 경우 팁 측벽이 상단 가장자리와 접촉하고 AFM 시스템은 팁 끝이 표면과 다시 접촉하고 정상적인 추적이 재개될 때까지 기본적으로 프로브의 측벽을 추적합니다.

스프링 상수/모듈러스 매칭
위에서 언급했듯이 프로브 캔틸레버의 스프링 상수는 측정할 탄성 계수의 예상 범위와 일치해야 합니다. 적절한 프로브를 선택하는 데 도움을 주기 위해, 표 3 은 나노인덴테이션(nanoindentation)에 자주 사용되는 ~30-40 nm 반경 프로브 팁의 경우, 수 MPa에서 100 GPa에 이르는 예상되는 샘플 탄성 계수의 선택된 넓은 범위에 적합한 제안된 대략적인 공칭 캔틸레버 스프링 상수를 제시한다(52). 하부 스프링 상수 프로브(k < 0.1N/m)는 셀과 같은 더 부드러운 재료(kPa 범위)에도 사용할 수 있습니다.

스프링 상수 (N/m) 예상 샘플 모듈러스 범위
0.25 ≤ 15 MPa의
5 5 - 500 MPa의
40 200 – 8,000 (0.2 – 8 GPa)
200 1,000 – 50,000 (1 – 50 GPa)
450 10,000 – 100,000 (10 – 100 GPa)

표 3: 다양한 모듈러스 범위를 측정하기 위한 이상적인 프로브 스프링 상수. 일반적인 프로브 반경이 ~30-40nm라고 가정할 때 수 MPa에서 100GPa까지 다양한 범위에서 탄성 계수를 최적으로 측정하기 위한 대략적인 공칭 프로브 스프링 상수52.

스프링 상수 외에도 생물학적 물질의 특수한 경우 이미징 및 나노인덴테이션 중에 가해지는 팁 반경과 힘을 신중하게 고려하여 손상을 방지해야 합니다. 대표적인 결과 섹션에 제시된 콜레스테롤 함유 지질 이중층의 기계적 특성 측정과 관련된 적용 예 에서 지질 이중층의 파과력 분석을 위해 비교적 날카로운(10nm) 팁이 특별히 사용되었습니다. 대조적으로, 재료 ROI가 충분히 크고(예를 들어, 세포 및 세포 핵의 경우와 같이) 펑크 가능성에 대한 우려가 있는 경우, 대표적인 결과 섹션의 적용 예 중 하나에 설명된 MSC 핵에 대한 강성 측정에 사용된 것과 같은 더 큰 미크론 규모의 반구형 팁이 이상적이며 연질에 대한 우수한 결과를 제공합니다. 살아있는 세포 및 분리된 핵과 같은 깨지기 쉬운 샘플. Kain et al. 이러한 샘플에 대해 가능한 가장 높은 측정 감도를 달성하기 위해 프로브 반경과 스프링 상수의 최적 조합을 선택하는 방법에 대한 심층적 인 논의를 제시합니다64.

프로브 교정
편향 감도
편향 감도는 Z-피에조의 이동(따라서 작은 편향의 한계에서 작동한다고 가정할 때 무한히 뻣뻣한 기판 상에 압입할 때 캔틸레버의 편향)을 PSD65 상의 측정된 전압 변화와 관련시킨다. 편향 감도(역 광학 레버 감도[InvOLS]라고도 함)는 nm/V 또는 V/nm로 보고될 수 있습니다. 가장 일반적인 편향 감도 교정 방법에 대한 개요는 아래에 나와 있습니다.

단단한 표면 접촉
빔 바운스 레이저/AFM 프로브/PSD 시스템의 편향 감도를 결정하기 위한 가장 쉽고 가장 보편적인 방법은 적절하게 명명된 "경표면 접촉" 방법(65)이다. 단순성, AFM 제어 소프트웨어 워크플로우에 대한 통합 용이성 및 현장 특성은 모두 경질 표면 접촉 방법의 매력과 광범위한 사용을 더합니다. 이 방법을 구현하기 위해 AFM 프로브 팁은 캔틸레버보다 훨씬 더 단단한 재료에 대해 램프됩니다. 힘-변위 곡선의 접촉 부분의 기울기(nm 단위의 Z-피에조 이동 또는 인가 전압의 함수로 PSD에 수직 편향 오류 신호의 볼트로 표시됨)는 편향 감도를 제공합니다(그림 3A). 뻣뻣한 기판을 사용하면 측정된 모든 처짐이 샘플 변형과 캔틸레버 변위의 컨볼루션이 아닌 캔틸레버 굽힘에서 발생합니다. 연질 캔틸레버(예를 들어, k < 10N/m)의 경우, 실리콘 (E ≈ 170 GPa)27 또는 운모(17)는 쉽게 접근할 수 있고 쉽게 사용되는 재료(또는 대안적으로 유리, E≈ 70 GPa, 또는 현미경 슬라이드 또는 페트리 접시에 고정된 세포의 경우 적절하게 단단한 플라스틱)인 반면, 더 단단한 캔틸레버의 경우, 일부 나노인덴테이션 실험에 사용된 것과 같은(예: k > 200N/m; 표 3), 사파이어(E≈ 345 GPa)26,66을 사용하여 샘플 변형이 발생하지 않도록 해야 할 수 있습니다. 이 방법은 힘-변위 측정에 의존하기 때문에 AFM 스캐너의 Z-피에조는 폐쇄 루프 높이 센서를 사용하거나 다양한 높이 표준을 사용하여 잘 보정되어야 합니다(개방 루프 모드에서 작동하는 경우). 경질 표면 접촉 방법의 오류에 가장 큰 기여는 열 변동으로 인한 캔틸레버의 레이저 스폿 이동입니다. 캔틸레버의 온도 변화는 감지 레이저에 의해 가장 일반적으로 발생하지만 주변 전자 장치의 줄 가열도 기여할 수 있습니다. 캔틸레버와 주변 공기 사이의 6°C의 전체 온도 차이가 보고되었으며, 이는 수 미크론의 레이저 스폿 이동을 초래할 수 있다(67). 가열을 고려하려면 캔틸레버가 주변 환경과 열 평형을 이루도록 초기 레이저 스폿 정렬 후 ≥30분 정도 기다려 가장 정확하고 최상의 결과를 얻을 수 있도록 하는 것이 좋습니다. 각 감도 측정에 대한 접근 및 인출 곡선의 기울기를 평균화하면 팁 마찰 또는 슬라이딩 효과를 설명할 수 있으며 가능하면 제정해야 합니다68. 또한 여러 감도 측정에 대한 평균을 구하면 측정의 신뢰성과 재현성을 측정하는 데 도움이 됩니다. 양호한 감도 측정은 ≤1%의 편차를 초래해야 하며, 교정69의 효과를 최대화하기 위해 예상되는 실험용 나노인덴트와 거의 동일한 편향에서 수행되어야 한다. 경질 표면 접촉 방법의 주요 단점은 교정에 필요한 물리적 접촉이 잠재적으로 깨지기 쉬운 실리콘 팁에 손상을 줄 수 있다는 것입니다(예: 이중 팁과 같은 팁 아티팩트의 무뎌짐 또는 생성).

열 소음 방식
편향 감도를 결정하는 열 잡음 방법은 캔틸레버 스프링 상수의 사전 교정 및 캔틸레버(67)의 열 잡음 스펙트럼을 측정하는 능력을 필요로 한다. 열 노이즈 방법은 최신 AFM 제어 소프트웨어에 통합되는 경우가 많으며 스프링 상수 및 편향 감도를 빠르게 분석하고 계산하기 위해 Sader 방법(아래 참조)과 함께 사용할 수 있습니다. 그러나 진동 진폭 감소로 인해 더 단단한(k > 10N/m) 캔틸레버에서 열 소음 방법을 사용하는 것이 어렵거나 불가능할 수 있습니다. 부가적으로, 열 잡음 방법의 보고된 상대적 불확도는 상술한 경질 표면 접촉 방법에 비해 ~20%로 상당히 크다(70). 이 기술은 이하에서 설명되는 스프링 상수를 결정하기 위한 써멀 튠 방법이 채용되고 있는 경우에는 사용할 수 없다(67).

스프링 상수
캔틸레버 스프링 상수 측정을 위한 황금 표준은 레이저 도플러 진동 측정법(LDV)이며, 현재 각 개별 프로브에 대해 제조업체에서 제공하는 LDV 파생 스프링 상수 교정 정보와 함께 제공되는 상업적으로 이용 가능한 프로브가 많이 있습니다( 재료 표 참조). 그러나 캔틸레버 스프링 상수의 정확한 측정은 정량적 나노 기계 측정에 절대적으로 필요하지만, 보정되지 않은 프로브에 대한 일반적인 실험실에서 이를 수행하는 실용적인 방법은 매우 다양하고 다소 복잡할 수 있습니다. 따라서 가장 일반적인 두 가지 현장 스프링 상수 교정 방법에 대한 간략한 개요만 여기에 제공되며 추가 방법 목록 및 자세한 내용은 참조할 적절한 문헌 인용이 제공됩니다.

열 튜닝 방법
오늘날의 상용 AFM에서 사용할 수 있는 가장 일반적인 방법인 캔틸레버 스프링 상수를 측정하기 위한 열 튜닝 방법은 많은 시스템의 제어 소프트웨어에 내장되어 있습니다. 감소된 캔틸레버 편향 검출 및 제한된 전자 대역폭으로 인해 더 단단한 캔틸레버(k > 10N/m)에는 이상적이지 않지만, 열 튜닝 방법은 비교적 구현하기 쉽고 광범위한 팁 형상(71)에 유효하다. 열 튠 방법은 캔틸레버의 열 잡음 스펙트럼의 측정 및 피팅을 이용하고, 이어서 등분할 정리를 적용하여 캔틸레버의 위치 에너지를 계산하며, 캔틸레버는 일반적으로 단순 고조파 발진기(72)로 모델링된다. 열 조정 방법은 소프트 프로브에 대해 ~ 5 % -10 %의 오차를 가지며 모든 캔틸레버 모양에 적용 할 수 있습니다 73,74. 자세한 내용은 이 섹션에 인용된 참고 문헌을 참조하십시오.

Sader 방법
Sader 방법은 종종 많은 최신 AFM75,76,77의 제어 소프트웨어에 통합되는 또 다른 방법입니다. Sader 방법은 캔틸레버 스프링 상수를 계산하기 위해 캔틸레버의 평면도 치수 및 품질 계수와 함께 유체 매체 (일반적으로 공기 또는 물)에서 진동 할 때 캔틸레버가 경험하는 유체 역학적 하중을 사용합니다. Sader 방법은 캔틸레버 스프링 상수74에 대해 ~10%-15%의 오차를 유발합니다. "원래 방법"76,78, "일반 방법"79, 일반 방법77의 확장 및 기기별 문서에 대한 해당 논문에서 자세한 내용을 제공할 수 있습니다.

다른 방법들
이 문서의 범위를 벗어나는 AFM 캔틸레버의 스프링 상수를 결정하기 위해 개발 및 구현된 몇 가지 다른 방법이 있습니다. 이러한 방법 중 어느 것도 Sader 또는 열 조정 보정 방법만큼 구현하기 쉽거나 널리 퍼져 있지는 않지만 각각 고유한 장점과 단점을 가지고 있습니다. 인용된 문헌은 적용 및 구현에 대한 세부 정보를 제공합니다. 특히, Sikora는 많은 스프링 상수 교정 방법에 대한 훌륭한 검토를 제공하며 주제72에 대한 훌륭한 리소스입니다. 스프링 상수를 결정하기 위한 다른 방법의 비철저한 목록에는 레이저 도플러 진동측정법(LDV)73,74,80, 미세-전기-기계 시스템(MEMS) 기반 장치(81), 기준 캔틸레버(82,83), 부가질량(동적 75 및 정적 84 모두), 정밀 균형(85,86), 전자기 작동(87) 및 유한 요소 분석(FEA)이 포함된다 88,89.

팁 반경
팁 반경을 결정하는 일반적인 방법에는 2차 전자 SEM 이미징과 블라인드 팁 재구성 방법(BTR)이 모두 포함됩니다.

SEM 분석
2차 전자 SEM 이미징은 최저 1nm의 해상도를 제공할 수 있어 마모의 진행 이미지를 직접적이고 쉽게 비교할 수 있습니다. SEM 이미징의 단점은 고도로 실험적인 결합 AFM-SEM 도구(90)만 존재하기 때문에 AFM 프로브는 일반적으로 분석을 위해 장착을 해제하고 SEM으로 운반해야 하며, 이는 시간이 많이 걸리고 잠재적으로 프로브가 오염될 수 있다는 것입니다. SEM의 또 다른 단점은 결과 이미지가 본질적으로 팁의 2D 투영이며 정량적 3D 정보를 사용할 수 없다는 것입니다. 전자빔의 입사각이 조금만 변경되어도 프로브 팁의 겉보기 크기와 모양이 바뀔 수 있으므로 비교 결과가 의미가 있으려면 매번 프로브를 정확히 동일한 방향으로 정렬하도록 주의해야 합니다. 마지막으로, SEM 이미징은 각각 이미지를 흐리게 하거나 프로브 팁에 물리적 변화를 일으킬 수 있는 대전 효과와 탄소 오염으로 인해 어려움을 겪을 수 있습니다.

블라인드 팁 재구성
SEM과 달리 BTR 방법은 프로브 반경보다 훨씬 작은 수많은 샤프(고종횡비) 특징을 가진 샘플의 이미징을 기반으로 3D 팁 형상을 모델링하는 현장 기술입니다. 이 방법은 AFM에서 관찰된 이미지가 항상 프로브 팁 모양과 샘플 특징 모양의 컨볼루션이므로 매우 선명한 형상을 무한히 선명하게 모델링하여 팁 모양을 추정할 수 있기 때문에 효과적입니다. 불행하게도, 무한히 날카로운 스파이크(즉, 팁 반경보다 훨씬 작은 표면 특징)의 가정에 더하여, BTR 기술은 이미징 노이즈 및 스캐닝 파라미터에 의해 영향을 받을 수 있으므로, 비교 이미지는 매우 유사한 이미징 파라미터를 사용하여 얻어져야 한다. 또한 팁의 여러 "이미지"를 사용하여 형상을 재구성하기 때문에 팁 형상을 직접 일대일로 역계산하는 것은 불가능합니다. 그 특성으로 인해, BTR 방법은 단지 실질적으로 사용자에게 팁 형상(63)의 상한을 알릴 수 있고, BTR 방법을 구현하기 위해 프로브를 이미징하는 작용은 팁 마모(예를 들어, 프로브 팁의 둔화 또는 치핑)를 야기할 수 있다.

상대 교정
때로는 특정 프로브 특성을 쉽고 정확하게 측정할 수 없습니다. 예를 들어, 더 단단한 캔틸레버의 스프링 상수는 대역폭 및 편향 제한(91) 때문에 열 튜닝 방법으로 측정하기 어렵거나 불가능하다. 위에서 논의한 바와 같이, 스프링 상수를 결정하는 다른 방법들이 존재하지만, 써멀 튠 방법은 많은 최신 AFM에 통합되어 있기 때문에, 그것은 종종 간단한 일상적인 사용을 위해 구현된다. 마찬가지로, 편향 감도는 PSD상의 레이저 이동을 프로브 캔틸레버의 물리적 편향으로 변환하기 위해 실험 전에 항상 보정되어야 합니다. 그러나 실제로 팁 반경 측정은 가장 시간이 많이 소요되는 교정 단계이며 프로브 팁을 손상시킬 가능성이 가장 높은 단계입니다. SEM 또는 BTR을 통해 팁 반경을 직접 측정할 수 없는 경우, 최소 표면 거칠기(이상적으로는 원자적으로 평평함)를 가진 표준 기준 샘플과 예상 실험 계수에 가까운 잘 알려진 계수를 사용할 수 있는 경우 유효 팁 반경을 결정하기 위한 대안으로 상대 보정 절차를 활용할 수 있습니다. 상대 보정을 위한 이상적인 기준 표준물질의 예로는 백운모 17,92,93,94,95 및 HOPG 96이 포함되지만, kPa 내지 MPa 범위의 모듈리를 갖는 보다 부드러운 시료에 적합한 기준 표준물질을 식별하는 데 어려움이 있음을 강조하는 역할도 합니다. 상대 교정을 수행하려면 먼저 주 프로토콜에 설명된 대로 편향 감도를 교정해야 합니다. 둘째, 프로브의 공칭 스프링 상수를 입력하거나(일반적으로 프로브와 함께 제공) 위에서 설명한 방법 중 하나를 통해 측정해야 합니다. 세 번째 단계는 적절한 파라미터를 사용하여 모듈러스 기준 표준 샘플 표면에 압흔을 넣는 것입니다. 마지막으로, 수집된 F-D 곡선 데이터를 분석하고 실험적으로 측정된 감소된 계수가 예상되는 감소된 계수와 일치할 때까지 팁 반경 매개변수를 조정해야 합니다. 기준 샘플에서 달성된 평균 변형 깊이에 유의해야 하며, 이 깊이는 보정이 관련되기 위해 관심 있는 실험 샘플에 들여쓰기할 때 유지되어야 합니다. 이제 관심 샘플에 압흔이 발생하여 모듈러스 표준 표준 물질에서 달성된 변형 깊이와 일치하도록 램프 파라미터를 조정할 수 있습니다.

상대 교정 방법의 한 가지 장점은 편향 감도, 스프링 상수 및 팁 반경(52)의 부정확한 교정으로 인해 발생할 수 있는 누적 오류를 방지한다는 것입니다. 또한 BTR 방법보다 프로브가 손상될 가능성이 약간 더 빠르고 적습니다. 상대 보정 방법의 가장 큰 단점은 1) 실험 샘플과 동일한 프로브로 분석할 수 있는 관심 샘플과 유사한 nm-에서 옹스트롬 규모의 표면 거칠기 및 잘 알려진 기계적 특성을 가진 고품질 참조 샘플의 필요성, 2) 보정이 유효하기 위해 기준 샘플과 실험 샘플 모두에서 동일하거나 매우 유사한 변형 깊이를 달성해야 하는 요구 사항입니다. 따라서, 가능하면 팁 반경을 직접 측정하는 것이 바람직하다.

데이터 분석
측정된 F-D 곡선에서 샘플의 기계적 특성을 결정하는 데 사용되는 분석 방법은 나노인덴테이션 데이터 자체의 품질만큼이나 중요합니다. 다양한 기본 가정을 기반으로 힘-변위 관계를 모델링하는 몇 가지 일반적인 접촉 역학 이론이 있습니다(따라서 다양한 시나리오에 적용 가능). 이러한 접촉 역학 모델에는 Hertz 97, Sneddon 28, JKR(Johnson, Kendall 및 Roberts)98, DMT(Derjaguin, Muller 및 Toporov)35,99, MD(Maugis-Dugdale)100 및 MYD(Muller, Yushchenko 및 Derjaguin)101,102가 포함됩니다. 다양한 접촉 역학 모델과 분석을 위한 적용에 대한 심층 분석 및 비교가 다른 곳에서 제시되었습니다(29,30,103,104). 이 문서의 범위를 벗어나지만 표 4는 가장 일반적인 접촉 역학 모델 중 일부에 대한 간략한 개요를 제공합니다. 특히 JKR, DMT 등과 같은 보다 복잡한 모델에는 팁-샘플 접착력 30,35,98,99,100,101,102,103,104의 영향이 포함되어 있으며, 이는 중요할 수 있으며 힘 곡선에서 음의 편향이 나타나는 것으로 쉽게 식별할 수 있습니다(그림 3 참조)). 실제로 선택한 해석 모델은 수집된 F-D 데이터를 피팅하고 탄성 계수와 같은 기계적 특성을 결정하는 데 사용됩니다. 데이터를 적절하게 적합시키려면 초기 접촉점 또는 모형과의 상관 관계가 가장 큰 실험 데이터 부분에 맞는 유효 접촉점을 결정하기 위해 평평한 기준선이 필요합니다.

이론 적용 가정 제한
헤르츠 간단한; 유체의 샘플에 자주 사용됩니다. 접착력이 없습니다. 접착력이 있는 시스템에는 유효하지 않습니다.
데르자갱-뮐러-토포로프 (DMT) 작은 변형으로 뻣뻣합니다. 접촉 영역에서의 단거리 접착과 접촉 영역 밖에서의 장거리 접착. 제한된 형상으로 인해 접촉 영역이 과소 평가될 수 있습니다.
존슨-켄달-로버츠 (JKR) 큰 변형으로 부드럽습니다. 접촉 영역에서만 단거리 접착력. 접착력으로 인한 하중을 과소 평가할 수 있습니다.
마우기스 - 더그데일(MD) 이 일반 솔루션은 다른 접착제 모델에도 적용됩니다. 크랙으로 모델링된 팁 샘플 인터페이스. 파라메트릭 방정식을 포함하는 분석 솔루션.

표 4: 일반적인 접촉 역학 모델. 적용 가능성, 가정 및 제한 사항이 언급된 선택된 공통 접촉 역학 모델.

F-D 곡선을 분석하기 위해 위에서 언급한 모델을 실제로 적용하려면 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 짧은 시간에 수천 또는 수백만 개의 곡선을 대규모로 일괄 처리하고 결과에 대한 통계 분석을 수행해야 합니다. 사내에서 작성된 코드는 종종 F-D 데이터 분석에 사용되며 다양한 AFM 제조업체도 소프트웨어 패키지를 제공합니다. 그러나 오픈 소스 특성, 사용 용이성 및 자세한 보충 정보로 인해 저자는 AtomicJ23의 사용을 권장합니다. 이 프로그램은 위에서 설명한 이론과 다른 여러 이론을 사용하여 FD 데이터를 간단하고 정확하게 분석 할 수 있습니다. 코드가 오픈 소스이기 때문에 복잡한 코드를 처음부터 빌드할 필요 없이 특정 사용 사례에 맞게 쉽게 조작하고 사용자 지정할 수 있습니다. AtomicJ 소프트웨어 패키지에 대한 자세한 내용은 Hermanowicz et al.23 을 참조하십시오.

결론적으로, 프로브의 세심한 보정을 통해 AFM 프로브 팁이 샘플 표면에 가하는 접촉 면적과 힘을 정량화하여 나노 스케일의 기계적 특성, 특히 탄성 계수를 측정할 수 있습니다. kPa에서 GPa 범위의 탄성 계수를 사용하여 연질 및 경질 샘플 모두에서 공기 또는 유체에서 AFM 캔틸레버 기반 나노인덴테이션을 성공적으로 구현하기 위한 모범 사례를 강조하는 일반화된 프로토콜이 제공된 대표적인 예와 함께 제시되었습니다. 프로브 선택(샘플 표면 거칠기, 피처 크기, 프로브 종횡비 및 팁 마모 포함), 프로브 교정 및 데이터 분석(접촉 역학 모델 및 측정 통계 포함)과 같은 중요한 고려 사항에 대해 논의했습니다. 마지막으로, SEM/EDS와 같은 조성 정보를 제공하는 다른 특성화 기술과 AFM 유래 나노역학 맵의 공동 국소화가 입증되었으며, AFM 캔틸레버 기반 나노인덴테이션을 통해 탄성 계수(즉, 지질 이중층 파열력) 이외의 나노기계적 특성을 측정하여 기술의 추가 시너지 응용 사례의 예를 제공합니다. 종합하면, 여기에 제공된 예제와 논의는 거의 모든 샘플 유형의 기계적 특성을 측정하기 위해 AFM 캔틸레버 기반 나노인덴테이션을 사용하려는 연구자에게 진입점을 제공해야 합니다.

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Disclosures

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgments

모든 AFM 실험은 보이시 주립대학교 표면과학연구소(SSL)에서 수행하였다. SEM 특성화는 Boise State Center for Materials Characterization (BSCMC)에서 수행되었습니다. 바이오 연료 공급 원료에 관한이 간행물에보고 된 연구는 미국 에너지 부, 에너지 효율 및 재생 에너지 사무소, 공급 원료 변환 인터페이스 컨소시엄 (FCIC)의 일부인 바이오 에너지 기술 사무소 및 DOE 아이다 호 운영 사무소 계약 DE-AC07-051ID14517에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 세포 역학 연구는 미국 국립 보건원 (National Institutes of Health, USA)의 보조금 AG059923, AR075803 및 P20GM109095과 미국 국립 과학 재단 (National Science Foundation)의 보조금 1929188 및 2025505의 지원을 받았습니다. 모델 지질 이중층 시스템 작업은 보조금 R01 EY030067에 따라 미국 국립 보건원(National Institutes of Health)의 지원을 받았습니다. 저자는 그림 11에 표시된 합성 이미지를 제작한 Elton Graugnard 박사에게 감사를 표합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Atomic force microscope Bruker Dimension Icon Uses Nanoscope control software, including PeakForce Quantitative Nanomechanical Mapping (PF-QNM), FastForce Volume (FFV), and Point-and-Shoot Ramping experimental workspaces
AtomicJ American Institute of Physics https://doi.org/10.1063/1.4881683 Flexible, powerful, free open source Java-based force curve analysis software package. Supports numerous contact mechanic models, such as Hertz, Sneddon DMT, JKR, Maugis, and cone or pyramid (including blunt and truncated). Also includes a variety of initial contact point estimation methods to choose from. Supports batch processing of data and subsequent statistical analysis (e.g., averages, standard deviations, histograms, goodness of fit, etc.). Literature citation is: P. Hermanowicz, M. Sarna, K. Burda, and H. GabryEquation 1, “AtomicJ: An open source software for analysis of force curves” Rev. Sci. Instrum. 85: 063703 (2014), https://doi.org/10.1063/1.4881683
Buffer solution (PBS) Fisher Chemical (NaCl), Sigma Aldrich (KCl), Fisher BioReagents (Na2HPO4 and KH2PO4) S271 (>99% purity NaCl), P9541 (>99% purity KCl), BP332(>99% purity Na2HPO4), BP362 (>99% purity KH2PO4) Phosphate buffered saline (PBS) was prepared in the laboratory as an aqueous solution consisting of 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, and 1.8 mM KH2PO4 dissolved in ultrapure water. Reagents were measured out using an analytical balance, and glassware was cleaned with soap and water followed by autoclaving immediately prior to use.
Chloroform
Diamond tip AFM probe Bruker PDNISP Pre-mounted factory-calibrated cube corner diamond (E = 1140 GPa) tip AFM probe (nominal R = 40 nm) with a stainless steel cantilever (nominal k = 225 N/m, f0 = 50 kHz). Spring constant is measured at the factory (k = 256 N/m for the probe, Serial #13435414, used here) and calibration data (including AFM images of indents showing probe geometry) is provided with the probe.
Diamond ultramicrotome blade Diatome Ultra 35° 2.1 mm width. Also used a standard glass blade for intial rough cut of sample surface before transitioning to diamond blade for final surface preparation
Epoxy Gorilla Glue 26853-31-6 Epoxy resin and hardner were mixed in a 1:1 ratio, a small drop was placed on a stainless steel sample puck (Ted Pella), and V1 grade muscovite mica (Ted Pella) was attached to create an atomically flat surface for preparation of phospholipid membranes.
Ethanol
LR white resin, medium grade (catalyzed) Electron Microscopy Sciences 14381 500 mL bottle, Lot #150629
Mesenchymal stem cells (MSCs) N/A N/A MSCs for nanomechanical studies were primary cells harvested from 8-10 week old male C57BL/6 mice as described in Goelzer, M. et al. "Lamin A/C Is Dispensable to Mechanical Repression of Adipogenesis" Int J Mol Sci 22: 6580 (2021) doi:10.3390/ijms22126580 and Peister, A. et al. "Adult stem cells from bone marrow (MSCs) isolated from different strains of inbred mice vary in surface epitopes, rates of proliferation, and differentiation potential" Blood 103: 1662-1668 (2004), doi:10.1182/blood-2003-09-3070.
Modulus standards Bruker PFQNM-SMPKIT-12M Used HOPG (E = 18 GPa) and PS (E = 2.7 GPa). Also contains 2x PDMS (Tack 0, E = 2.5 MPa; Tack 4, E = 3.5 MPa), PS-LDPE (E = 2.0/0.2 GPa), fused silica (E = 72.9 GPa), sapphire (E - 345 GPa), and tip characterization (titanium roughness) sample. All samples come pre-mounted on a 12 mm diameter steel disc (sample puck).
Muscovite mica Ted Pella 50-12 12 mm diameter, V1 grade muscovite mica
Nanscope Analysis Bruker Version 2.0 Free AFM image processing and analysis software package, but designed for, and proprietary/limited to Bruker AFMs; similar functionality is available from free, platform-independent AFM image processing and analysis software packages such as Gwyddion, WSxM, and others. Has built-in capabilities for force curve analysis, but AtomicJ is more flexible/full featured (e.g., more built-in contact mechanics models to choose from, statistical analysis of force curve fitting results, etc.) for force curve analysis and handles batch processing of force curves.
Phospholipids: POPC, Cholesterol (ovine) Avanti Polar Lipids POPC: CAS # 26853-31-6, Cholesterol: CAS # 57-88-5 POPC lipid dissolved in chloroform (25 mg/mL) was obtained from vendor and used without further purification. Cholesterol powder from the same vendor was dissolved in chloroform (20 mg/mL). 
Probe holder (fluid, lipid bilayers) Bruker MTFML-V2 Specific to the particular AFM used; MTFML-V2 is a glass probe holder for scanning in fluid on a MultiMode AFM.
Probe holder (fluid, MSCs) Bruker FastScan Bio Z-scanner Used with Dimension FastScan head (XY flexure scanners). Serial number MXYPOM5-1B154.
Probe holder (standard, ambient) Bruker DAFMCH Specific to the particular AFM used; DAFMCH is the standard contact and tapping mode probe holder for the Dimension Icon AFM, suitable for nanoindentation (PF-QNM, FFV, and point-and-shoot ramping)
Sample Puck Ted Pella 16218 Product number is for 15 mm diameter stainless steel sample puck. Also available in 6 mm, 10 mm, 12 mm, and 20 mm diameters at https://www.tedpella.com/AFM_html/AFM.aspx#anchor842459
Sapphire substrate Bruker PFQNM-SMPKIT-12M Extremely hard surface (E = 345 GPa) for measuring deflection sensitivity of probes (want all of the deflection to come from the probe, not the substrate). Part of the PF-QNM/modulus standards kit.
Scanning electron microscope Hitachi S-3400N-II Located at Boise State. Used to perform co-localized SEM/EDS on all samples except additively manufactured (AM) Ti-6Al-4V.
Silicon AFM probes (standard) NuNano Scout 350 Standard tapping mode silicon probe with reflective aluminum backside coating; k = 42 N/m (nominal), f0 = 350 kHz. Nominal R = 5 nm. Also available uncoated or with reflective gold backside coating. Probes with similar specifications are available from other manufacturers (e.g., Bruker TESPA-V2).
Silicon AFM probes (stiff) Bruker RTESPA-525, RTESPA-525-30  Rotated tip etched silicon probes with reflective aluminum backside coating; k = 200 N/m (nominal), f0 = 525 kHz. Nominal R = 8 nm for RTESPA-525, R = 30 nm for RTESPA-525-30. Spring constant of each RTESPA-525-30 is measured individually at the factory via laser Doppler vibrometry and supplied with the probe.
Silicon carbide grit paper (abrasive discs) Allied 50-10005 120 grit
Silicon nitride AFM probes (soft, large radius hemispherical tip) Bruker MLCT-SPH-5UM, MLCT-SPH-5UM-DC Also MLCT-SPH-1UM-DC. New product line of factory-calibrated (probe radius and spring constants of all cantilevers) large radius (R = 1 or 5 mm) hemispherical tip (at the end of a 23 mm long cylindrical shaft) probes. DC = drift compensation coating. 6 cantilevers/probe (A-F). Nominal spring constants: A, k = 0.07 N/m; B, k = 0.02 N/m; C, k = 0.01 N/m; D, k = 0.03 N/m; E, k = 0.1 N/m; F, k = 0.6 N/m.
Silicon nitride AFM probes (soft, medium sharp tip) Bruker DNP 4 cantilevers/probe (A-d). Nominal spring constants: A, k = 0.35 N/m; B, k = 0.12 N/m; C, k = 0.24 N/m; D, k = 0.06 N/m. Nominal radii of curvature, R = 10 nm.
Silicon nitride AFM probes (soft, sharp tip) Bruker ScanAsyst-Air Nominal values: resonance frequency, f0 = 70 kHz; spring constant, k = 0.4 N/m; radius of curvature, R = 2 nm. Designed for force curve based AFM imaging.
Superglue Henkel Loctite 495 Cyanoacrylate based instant adhesive. Lots of roughly equivalent products are readily available.
Syringe pump New Era Pump Systems NE1000US One channel syringe pump system with infusion and withdrawal capacity
Tip characterization standard Bruker PFQNM-SMPKIT-12M Titanium (Ti) roughness standard. Part of the PF-QNM/modulus standards kit.
Ultrahigh purity nitrogen (UHP N2), 99.999% Norco SPG TUHPNI - T T size compressed gas cylinder of ultrahigh purity (99.999%) nitrogen for drying samples
Ultramicrotome Leica EM UC6 Equipped with a glass blade (standard, for intial sample preparation) and a diamond blade (for final preparation)
Ultrapure water Thermo Fisher Barnstead Nanopure Model 7146 Model has been discontinued, but equivalent products are available. Produces ≥18.2 MΩ*cm ultrapure water with 1-5 ppb TOC (total organic content), per inline UV monitoring. Includes 0.2 µm particulate filter, ion exchange columns, and UV oxidation chamber.
Variable Speed Grinder Buehler EcoMet 3000 Used with silicon carbide grit papers during hand polishing.
Vibration isolation table (active) Herzan TS-140 Used with Bruker MultiMode AFM. Sits on a TMC 65-531 vibration isolation table. Bruker Dimension Icon AFM utilizes strictly passive vibration isolation (comes from manufacturer with custom acoustic hood, air table, and granite slab).
Vibration isolation table (passive) TMC 65-531 35" x 30" vibration isolation table with optional air damping (disabled). Used with Bruker MultiMode AFM. Herzan TS-140 "Table Stable" active vibration control table is located on top.

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공학 문제 190
원자력 현미경 캔틸레버 기반 나노인덴테이션: 공기 및 유체의 나노 스케일에서 기계적 특성 측정
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