Atomic Force Microscopy Cantilever-Based Nanoindentation: Mechanical Property Measurements at the Nanoscale in Air and Fluid

Summary

La cuantificación del área de contacto y la fuerza aplicada por la punta de una sonda de microscopio de fuerza atómica (AFM) a una superficie de muestra permite la determinación de propiedades mecánicas a nanoescala. Se discuten las mejores prácticas para implementar la nanoindentación basada en voladizo AFM en aire o fluido en muestras blandas y duras para medir el módulo elástico u otras propiedades nanomecánicas.

Abstract

Un microscopio de fuerza atómica (AFM) mide fundamentalmente la interacción entre la punta de una sonda AFM a nanoescala y la superficie de la muestra. Si se puede cuantificar la fuerza aplicada por la punta de la sonda y su área de contacto con la muestra, es posible determinar las propiedades mecánicas a nanoescala (por ejemplo, elástico o módulo de Young) de la superficie que se está sondeando. Aquí se proporciona un procedimiento detallado para realizar experimentos cuantitativos de nanoindentación basados en voladizo AFM, con ejemplos representativos de cómo se puede aplicar la técnica para determinar los módulos elásticos de una amplia variedad de tipos de muestras, que van desde kPa hasta GPa. Estos incluyen células madre mesenquimales vivas (MSC) y núcleos en tampón fisiológico, secciones transversales de pino loblolly deshidratado incrustado en resina y esquistos Bakken de composición variable.

Además, la nanoindentación basada en voladizo AFM se utiliza para probar la resistencia a la ruptura (es decir, la fuerza de ruptura) de las bicapas de fosfolípidos. Se discuten consideraciones prácticas importantes como la elección y el desarrollo del método, la selección y calibración de la sonda, la identificación de la región de interés, la heterogeneidad de la muestra, el tamaño de la característica y la relación de aspecto, el desgaste de la punta, la rugosidad de la superficie y el análisis de datos y las estadísticas de medición para ayudar a la implementación adecuada de la técnica. Finalmente, se demuestra la colocalización de mapas nanomecánicos derivados de AFM con técnicas de microscopía electrónica que proporcionan información adicional sobre la composición elemental.

Introduction

Comprender las propiedades mecánicas de los materiales es una de las tareas más fundamentales y esenciales en ingeniería. Para el análisis de las propiedades de los materiales a granel, existen numerosos métodos disponibles para caracterizar las propiedades mecánicas de los sistemas de materiales, incluidas las pruebas de tracción¹, las pruebas de compresión² y las pruebas de flexión (flexión) de tres o cuatro puntos³. Si bien estas pruebas a microescala pueden proporcionar información invaluable sobre las propiedades del material a granel, generalmente se realizan hasta el fracaso y, por lo tanto, son destructivas. Además, carecen de la resolución espacial necesaria para investigar con precisión las propiedades a micro y nanoescala de muchos sistemas de materiales que son de interés hoy en día, como películas delgadas, materiales biológicos y nanocompuestos. Para comenzar a abordar algunos de los problemas con las pruebas mecánicas a gran escala, principalmente su naturaleza destructiva, se adoptaron pruebas de microdureza de la mineralogía. La dureza es una medida de la resistencia de un material a la deformación plástica bajo condiciones específicas. En general, las pruebas de microdureza utilizan una sonda rígida, generalmente hecha de acero endurecido o diamante, para sangrar en un material. La profundidad de indentación resultante y / o el área se pueden usar para determinar la dureza. Se han desarrollado varios métodos, incluyendo la dureza Vickers⁴, Knoop⁵ y Brinell⁶ ; Cada uno proporciona una medida de la dureza del material a microescala, pero bajo diferentes condiciones y definiciones, y como tal solo produce datos que se pueden comparar con las pruebas realizadas en las mismas condiciones.

La nanoindentación instrumentada se desarrolló para mejorar los valores relativos obtenidos a través de los diversos métodos de prueba de microdureza, mejorar la resolución espacial posible para el análisis de propiedades mecánicas y permitir el análisis de películas delgadas. Es importante destacar que, al utilizar el método desarrollado por primera vez por Oliver y Pharr⁷, el elástico o módulo de Young, E, de un material de muestra se puede determinar a través de nanoindentación instrumentada. Además, al emplear una sonda nanoindentadora piramidal de tres lados Berkovich (cuya función ideal del área de punta coincide con la de la sonda piramidal de cuatro lados Vickers)⁸, se puede realizar una comparación directa entre las mediciones de dureza a nanoescala y microescala más tradicionales. Con el crecimiento de la popularidad del AFM, la nanoindentación basada en voladizo AFM también comenzó a recibir atención, particularmente para medir las propiedades mecánicas de materiales más blandos. Como resultado, como se muestra esquemáticamente en la Figura 1, las dos técnicas más comúnmente empleadas hoy en día para interrogar y cuantificar las propiedades mecánicas a nanoescala son la nanoindentación instrumentada (Figura 1A) y la nanoindentación basada en voladizo AFM (Figura 1B)⁹, la última de las cuales es el foco de este trabajo.

Figura 1: Comparación de sistemas de nanoindentación instrumentados y basados en voladizo AFM. Diagramas esquemáticos que representan sistemas típicos para realizar (A) nanoindentación instrumentada y (B) nanoindentación basada en voladizo AFM. Esta figura fue modificada de Qian et ^al.51. Abreviatura: AFM = microscopía de fuerza atómica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tanto la nanoindentación instrumentada como la basada en voladizo AFM emplean una sonda rígida para deformar una superficie de muestra de interés y monitorear la fuerza y el desplazamiento resultantes en función del tiempo. Normalmente, el perfil de desplazamiento de carga deseado (es decir, fuerza) o (Z-piezo) es especificado por el usuario a través de la interfaz del software y controlado directamente por el instrumento, mientras que el otro parámetro se mide. La propiedad mecánica que se obtiene con mayor frecuencia de los experimentos de nanoindentación es el módulo elástico (E), también conocido como módulo de Young, que tiene unidades de presión. El módulo elástico de un material es una propiedad fundamental relacionada con la rigidez de enlace y se define como la relación entre la tensión de tracción o compresión (σ, la fuerza aplicada por unidad de área) y la deformación axial (ε, la deformación proporcional a lo largo del eje de indentación) durante la deformación elástica (es decir, reversible o temporal) antes del inicio de la deformación plástica (ecuación [1]):

(1)

Cabe señalar que, debido a que muchos materiales (especialmente los tejidos biológicos) son de hecho viscoelásticos, en realidad, el módulo (dinámico o complejo) consiste en componentes elásticos (almacenamiento, en fase) y viscosos (pérdida, fuera de fase). En la práctica real, lo que se mide en un experimento de nanoindentación es el módulo reducido, E *, que está relacionado con el verdadero módulo de interés de la muestra, E, como se muestra en la ecuación (2):

(2)

Donde la punta E y la punta ν son el módulo elástico y la relación de Poisson, respectivamente, de la _punta nanopenetradora, y ν es la relación de Poisson estimada de la muestra. La relación de Poisson es la relación negativa de la deformación transversal a axial, y por lo tanto indica el grado de elongación transversal de una muestra al ser sometida a deformación axial (por ejemplo, durante la carga de nanoindentación), como se muestra en la ecuación (3):

(3)

La conversión de módulo reducido a módulo real es necesaria porque a) parte de la deformación axial impartida por la punta del penetrador puede convertirse en deformación transversal (es decir, la muestra puede deformarse por expansión o contracción perpendicular a la dirección de carga), y b) la punta del penetrador no es infinitamente dura y, por lo tanto, el acto de sangrar la muestra da como resultado una (pequeña) cantidad de deformación de la punta. Tenga en cuenta que en el caso de que la punta E >> E (es decir, la _punta penetradora es mucho más dura que la muestra, lo que a menudo es cierto cuando se usa una sonda de diamante), la relación entre el módulo de muestra reducido y real se simplifica enormemente a E ≈ E * (1 - v²). Mientras que la nanoindentación instrumentada es superior en términos de caracterización precisa de la fuerza y rango dinámico, la nanoindentación basada en voladizo AFM es más rápida, proporciona órdenes de magnitud mayor fuerza y sensibilidad al desplazamiento, permite imágenes de mayor resolución y una mejor localización de la sangría, y puede sondear simultáneamente las propiedades magnéticas y eléctricas a nanoescala⁹. En particular, la nanoindentación basada en voladizo AFM es superior para la cuantificación de propiedades mecánicas a nanoescala de materiales blandos (por ejemplo, polímeros, geles, bicapas lipídicas y células u otros materiales biológicos), películas extremadamente delgadas (sub-μm) (donde los efectos de sustrato pueden entrar en juego dependiendo de la profundidad de indentación)^10,11, y materiales bidimensionales suspendidos (2D)^12,13,14 como el grafeno ^15,16, mica¹⁷, nitruro de boro hexagonal (h-BN)18, o dicalcogenuros de metales de transición (TMDC; por ejemplo, MoS₂)¹⁹. Esto se debe a su exquisita sensibilidad de fuerza (sub-nN) y desplazamiento (sub-nm), que es importante para determinar con precisión el punto de contacto inicial y permanecer dentro de la región de deformación elástica.

En la nanoindentación basada en voladizo AFM, el desplazamiento de una sonda AFM hacia la superficie de la muestra es accionado por un elemento piezoeléctrico calibrado (Figura 1B), con el voladizo flexible eventualmente doblado debido a la fuerza resistiva experimentada al contacto con la superficie de la muestra. Esta flexión o desviación del voladizo generalmente se monitorea reflejando un láser desde la parte posterior del voladizo y en un fotodetector (detector sensible a la posición [PSD]). Junto con el conocimiento de la rigidez en voladizo (en nN/nm) y la sensibilidad a la deflexión (en nm/V), es posible convertir esta deflexión en voladizo medida (en V) en la fuerza (en nN) aplicada a la muestra. Después del contacto, la diferencia entre el movimiento Z-piezo y la deflexión en voladizo produce la profundidad de indentación de la muestra. Combinado con el conocimiento de la función del área de punta, esto permite calcular el área de contacto punta-muestra. La pendiente de las porciones en contacto de las curvas de fuerza-distancia o fuerza-desplazamiento (F-D) resultantes se puede ajustar utilizando un modelo mecánico de contacto apropiado (consulte la sección Análisis de datos de la discusión) para determinar las propiedades nanomecánicas de la muestra. Si bien la nanoindentación basada en voladizo AFM posee algunas ventajas distintivas sobre la nanoindentación instrumentada como se describió anteriormente, también presenta varios desafíos prácticos de implementación, como la calibración, el desgaste de la punta y el análisis de datos, que se discutirán aquí. Otra desventaja potencial de la nanoindentación basada en voladizo AFM es la suposición de elasticidad lineal, ya que el radio de contacto y las profundidades de hendidura deben ser mucho más pequeñas que el radio del penetrador, lo que puede ser difícil de lograr cuando se trabaja con sondas AFM a nanoescala y / o muestras que exhiben una rugosidad superficial significativa.

Tradicionalmente, la nanoindentación se ha limitado a ubicaciones individuales o pequeños experimentos de indentación de cuadrícula, en los que se selecciona una ubicación deseada (es decir, región de interés [ROI]) y se realiza una sola sangría controlada, múltiples sangrías en una sola ubicación separadas por un tiempo de espera y / o una cuadrícula gruesa de sangrías a una velocidad del orden de Hz. Sin embargo, los avances recientes en AFM permiten la adquisición simultánea de propiedades mecánicas y topografía mediante la utilización de modos de imagen basados en curvas de fuerza de alta velocidad (a los que se refieren varios nombres comerciales según el fabricante del sistema), en los que las curvas de fuerza se realizan a una velocidad de kHz bajo control de carga, con la fuerza máxima de la muestra de punta utilizada como punto de ajuste de imagen. También se han desarrollado métodos de apuntar y disparar, lo que permite la adquisición de una imagen de topografía AFM seguida de una posterior nanoindentación selectiva en puntos de interés dentro de la imagen, lo que permite un control espacial a nanoescala sobre la ubicación de la nanoindentación. Si bien no es el enfoque principal de este trabajo, en los resultados representativos se presentan ejemplos de aplicaciones específicas seleccionadas tanto de imágenes basadas en curvas de fuerza como de nanoindentación basada en voladizos de apuntar y disparar, y se pueden usar junto con el protocolo descrito a continuación si está disponible en la plataforma AFM particular empleada. Específicamente, este trabajo describe un protocolo generalizado para la implementación práctica de la nanoindentación basada en voladizo AFM en cualquier sistema AFM capaz y proporciona cuatro ejemplos de casos de uso (dos en aire, dos en fluido) de la técnica, incluidos resultados representativos y una discusión en profundidad de los matices, desafíos y consideraciones importantes para emplear con éxito la técnica.

Protocol

NOTA: Debido a la amplia variedad de AFM disponibles comercialmente y la diversidad de tipos de muestras y aplicaciones que existen para la nanoindentación basada en voladizo, el protocolo que sigue está diseñado intencionalmente para ser de naturaleza relativamente general, centrándose en los pasos compartidos necesarios para todos los experimentos de nanoindentación basados en voladizo, independientemente del instrumento o fabricante. Debido a esto, los autores asumen que el lector posee al menos una familiaridad básica con el funcionamiento del instrumento específico elegido para realizar la nanoindentación basada en voladizo. Sin embargo, además del protocolo general descrito a continuación, se incluye como material suplementario un procedimiento operativo estándar (POE) detallado paso a paso específico para el AFM y el software utilizado aquí (consulte la Tabla de materiales), centrado en la nanoindentación de muestras en fluidos basada en voladizo.

1. Preparación de la muestra y configuración del instrumento

1. Prepare la muestra de una manera que minimice tanto la rugosidad de la superficie (idealmente a escala nanométrica, ~ 10 veces menos que la profundidad de hendidura prevista) como la contaminación sin alterar las propiedades mecánicas de las áreas de interés.
2. Seleccione una sonda AFM adecuada para la nanoindentación de la muestra prevista en función del medio (es decir, aire o fluido), el módulo esperado, la topografía de la muestra y los tamaños de características relevantes (consulte las consideraciones de selección de la sonda en la discusión). Cargue la sonda en el soporte de la sonda (consulte Tabla de materiales) y fije el soporte de la sonda al cabezal de exploración AFM.
3. Seleccione un modo de nanoindentación apropiado en el software AFM que permita al usuario controlar rampas individuales (es decir, curvas de fuerza-desplazamiento).
   NOTA: El modo específico diferirá entre los diferentes fabricantes de AFM e instrumentos individuales (consulte el POE proporcionado en el Material complementario para obtener más detalles y un ejemplo específico).
4. Alinee el láser en la parte posterior del voladizo de la sonda, frente a la ubicación de la punta de la sonda y en el PSD.
   NOTA: Consulte el ejemplo de aplicación de células madre mesenquimales para obtener más detalles sobre consideraciones importantes al alinear el láser y realizar nanoindentaciones en fluidos, en particular, evitando desechos flotantes y / o burbujas de aire, que pueden dispersar o refractar el haz. La óptica AFM también puede necesitar ser ajustada para compensar el índice de refracción del fluido y para evitar chocar la sonda al atacar la superficie.
   1. Centra el punto del rayo láser en la parte posterior del voladizo maximizando la suma de voltaje (Figura 2A).
   2. Centrar el punto del rayo láser reflejado en el PSD ajustando las señales de deflexión X e Y (es decir, horizontal y vertical) para que estén lo más cerca posible de cero (Figura 2A), proporcionando así el rango de deflexión máximo detectable para producir un voltaje de salida proporcional a la deflexión en voladizo.
5. Si no está seguro de la topografía de la muestra, la rugosidad de la superficie y/o la densidad de la superficie (en el caso de escamas o partículas), realice un escaneo de topografía AFM antes de cualquier experimento de nanoindentación para confirmar la idoneidad de la muestra, como se describe en el paso 1.1 y la parte de preparación de la muestra de la discusión.

Figura 2: Monitor detector sensible a la posición. (A) Pantalla PSD que indica un láser correctamente alineado que se refleja en la parte posterior del voladizo de la sonda y en el centro de la PSD (como lo demuestra el voltaje de suma grande y la falta de deflexión vertical u horizontal) antes de acoplarse a la superficie de la muestra (es decir, la sonda fuera de contacto con la muestra). (B) El voltaje de deflexión vertical aumenta cuando se desvía el voladizo (por ejemplo, cuando la sonda entra en contacto con la muestra). Abreviaturas: PSD = detector sensible a la posición; VERT = vertical; HORIZ = horizontal; AMPL = amplitud; n/d = no aplicable. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Calibración de la sonda

NOTA: Se necesitan tres valores para cuantificar las propiedades mecánicas de una muestra utilizando los datos de la curva F-D recopilados durante la nanoindentación basada en voladizo: la sensibilidad a la deflexión (DS ) del sistema en voladizo/PSD (nm/V o V/nm), la constante de resorte en voladizo (nN/nm) y el área de contacto de la sonda, a menudo expresada en términos del radio efectivo de la punta de la sonda (nm) a una profundidad de hendidura dada menor que el radio de la sonda en el caso de una sonda esférica Propina.

1. Calibre el DS del sistema de sonda/AFM mediante rampas sobre un material extremadamente duro (por ejemplo, zafiro, E = 345 GPa) para minimizar la deformación de la muestra y, por lo tanto, el movimiento Z medido del piezo después del inicio del contacto punta-muestra se convierte únicamente en deflexión en voladizo.
   NOTA: La calibración DS debe realizarse en las mismas condiciones que los experimentos de nanoindentación planificados (es decir, temperatura, medio, etc.) para reflejar con precisión el DS del sistema durante los experimentos. Puede ser necesario un período de calentamiento láser largo (30 minutos) para obtener la máxima precisión y permitir que se alcance el equilibrio térmico y se establezca una potencia de salida láser estable y una estabilidad de apuntamiento. El DS debe volver a medirse cada vez que se realinea el láser, incluso si se utiliza la misma sonda, ya que el DS depende de la intensidad y la posición del láser en el voladizo, así como de la calidad de la reflexión de la sonda (es decir, la degradación del revestimiento posterior de la sonda afectará al DS) y la sensibilidad del PSD²⁰.
   1. Configure y realice las sangrías de calibración DS en el zafiro para lograr aproximadamente la misma deflexión de la sonda (en V o nm) que las sangrías de muestra planificadas, ya que el desplazamiento medido es una función del ángulo de deflexión de la punta y se vuelve no lineal para deflexiones grandes.
   2. Determine el DS (en nm/V), o alternativamente, la sensibilidad inversa de la palanca óptica (en V/nm), a partir de la pendiente de la porción lineal del régimen de contacto después del punto de contacto inicial en la curva F-D resultante, como se muestra en la Figura 3A.
   3. Repita la rampa al menos 5 veces, registrando cada valor de DS. Utilice el promedio de los valores para obtener la máxima precisión. Si la desviación estándar relativa (RSD) de las mediciones excede ~1%, vuelva a medir el DS, ya que a veces las primeras curvas F-D no son ideales debido a la introducción inicial de fuerzas adhesivas.
   4. Si la constante de resorte del voladizo de la sonda, k, no está calibrada de fábrica (por ejemplo, mediante vibrometría láser Doppler [LDV]), calibre la constante de resorte.
      NOTA: El método de ajuste térmico es óptimo para voladizos relativamente blandos con k < 10 N/m (consulte la sección de la constante de resorte de la discusión para obtener una lista y descripción de métodos alternativos, particularmente para voladizos rígidos con k > 10 N/m). Como se muestra en la Figura 3B, C, el ajuste térmico generalmente se integra en el software de control AFM.
2. Si la sonda no viene con una medición del radio de la punta calibrada de fábrica (por ejemplo, a través de imágenes de microscopio electrónico de barrido [SEM]), mida el radio efectivo de la punta, R.
   NOTA: Hay dos métodos comunes para medir el radio de la punta (consulte la sección de discusión correspondiente), pero el más común para las puntas de sonda a escala nanométrica es el método de reconstrucción de punta ciega (BTR), que utiliza un estándar de rugosidad (consulte la Tabla de materiales) que contiene numerosas características extremadamente nítidas (sub-nm) que sirven para obtener imágenes efectivas de la punta, en lugar de la punta que obtiene imágenes de la muestra.
   1. Si emplea el método BTR, cree una imagen de la muestra de rugosidad (caracterización de la punta) utilizando una velocidad de escaneo lenta (<0.5 Hz) y altas ganancias de retroalimentación para ayudar a optimizar el seguimiento de las características muy nítidas. Elija un tamaño de imagen y una densidad de píxeles (resolución) en función del radio de punta esperado (por ejemplo, una imagen de 1024 x 1024 píxeles de un área de 3 μm x 3 μm tendrá una resolución lateral de ~ 3 nm).
   2. Utilice el software de análisis de imágenes AFM (consulte la Tabla de materiales) para modelar la punta de la sonda y estimar su radio final y el diámetro efectivo de la punta a la profundidad de indentación de la muestra esperada, como se muestra en la Figura 3D-F.
3. Al completar la calibración de la sonda, introduzca los valores DS, k y R en el software del instrumento, como se muestra en la Figura 4A.
   1. Introduzca una estimación de la relación de Poisson de la muestra, ν, para permitir la conversión del módulo reducido medido al módulo de muestra real⁹. Si se emplea un modelo mecánico de contacto cónico o conisférico basado en la forma de la punta y la profundidad de hendidura, también es necesario introducir el ángulo medio de la punta (Figura 4C).
      NOTA: El módulo es relativamente insensible a pequeños errores o incertidumbres en la relación de Poisson estimada. Una estimación de ν = 0,2-0,3 es un buen punto de partida para muchos materiales²¹.

Figura 3: Calibración de la sonda. (A) Determinación de la sensibilidad a la deflexión. Resultado de una medición representativa de la sensibilidad a la deflexión realizada en un sustrato de zafiro (E = 345 GPa) para una sonda de modo de roscado estándar (k nominal = 42 N/m; ver Tabla de materiales) con un revestimiento de aluminio reflectante en la parte posterior. Se muestran las curvas de aproximación medida (traza azul) y retracción o retirada (traza roja). La sensibilidad de deflexión medida de 59,16 nm/V se determinó ajustando la curva de aproximación entre los puntos de ajuste al contacto y de giro, como lo indica la región entre las líneas rojas punteadas verticales. La región de deflexión negativa evidente en la curva de retracción/retirada antes de arrancar la superficie es indicativa de la adhesión de la punta de la muestra. (B,C) Puesta a punto térmica. Espectros representativos de ruido térmico en voladizo (trazas azules) con ajustes correspondientes (trazas rojas) para dos sondas diferentes. (B) Configuración de ajuste térmico y parámetros de ajuste para una sonda de imagen AFM basada en curva de fuerza estándar (consulte la Tabla de materiales) con su constante de resorte nominal k = 0.4 N / m utilizada como una estimación inicial. El ajuste del espectro de ruido térmico en voladizo produce una frecuencia de resonancia fundamental de f 0 = 79,8 kHz, que está razonablemente bien de acuerdo con el valor nominal de f₀ = 70 kHz. El factor Q medido es 58,1. La bondad del ajuste (R² = 0,99) se basa en la concordancia del ajuste con los datos entre las dos líneas rojas discontinuas verticales. Tenga en cuenta que es importante conocer e introducir tanto la temperatura ambiente como la sensibilidad a la deflexión para obtener resultados precisos. (C) Espectro de ruido térmico en voladizo y ajuste correspondiente (es decir, sintonía térmica) con la constante de resorte calculada resultante k = 0.105 N / m para un voladizo extremadamente blando utilizado para realizar mediciones nanomecánicas en células vivas y núcleos aislados. Tenga en cuenta la frecuencia de resonancia natural significativamente más baja de ~ 2-3 kHz. (D-F) Reconstrucción con punta ciega. Flujo de trabajo representativo de reconstrucción de punta ciega para una sonda de punta de diamante (nominal R = 40 nm; consulte la Tabla de materiales). (D) Una imagen de 5 μm x 5 μm de una muestra de caracterización de punta que consiste en una serie de picos de titanio extremadamente afilados (sub-nm) que sirven para obtener imágenes de la punta de la sonda AFM. (E) Modelo reconstruido resultante (imagen de altura invertida) de la punta de la sonda. (F) Resultados del ajuste de reconstrucción de la punta ciega, incluido un radio final estimado de R = 29 nm y un diámetro efectivo de la punta de 40 nm a una altura seleccionada por el usuario de 8 nm (es decir, profundidad de hendidura << R) desde el vértice de la punta, calculado convirtiendo el área de contacto punta-muestra a esa altura en un diámetro efectivo suponiendo un perfil circular (es decir, A = πr 2 = π(d/2)²) para su uso con modelos mecánicos de contacto esférico. Abreviaturas: AFM = microscopía de fuerza atómica; ETD = diámetro efectivo de la punta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Entradas de interfaz de software. (A) Constantes de calibración de la sonda. Interfaz de usuario de software (consulte Tabla de materiales) para introducir la sensibilidad de deflexión medida, la constante de resorte y el radio de punta para permitir mediciones nanomecánicas cuantitativas. La relación de Poisson tanto de la sonda como de la muestra es necesaria para calcular el elástico o el módulo de Young de la muestra a partir de las curvas de fuerza de nanoindentación basadas en voladizo. (B) Ventana de control de rampa. Interfaz de usuario de software (consulte la Tabla de materiales) para configurar experimentos de nanoindentación basados en voladizo, organizados en los parámetros que describen la rampa en sí (es decir, perfil de hendidura), activación del instrumento (por ejemplo, control de fuerza frente a desplazamiento), análisis de fuerza posterior y límites de movimiento (para mejorar la sensibilidad de medición al reducir el rango sobre el cual el convertidor A / D tiene que operar para controlar el piezo Z y leer la desviación PSD). (C) El ángulo medio de la punta (basado en la geometría de la sonda o la medición directa) es importante si se emplea un modelo mecánico de contacto cónico, piramidal o conisférico (por ejemplo, Sneddon). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Recopilar datos de desplazamiento de fuerza (F-D)

NOTA: Los valores de los parámetros presentados aquí (consulte la figura 4B) pueden variar según la fuerza y el rango de sangría para una muestra determinada.

1. Navegue por la muestra debajo del encabezado AFM y participe en la región de interés deseada.
   1. Monitoree la señal de deflexión vertical (Figura 2B) o realice una rampa inicial pequeña (~50-200 nm) (Figura 4B) para verificar que la punta y la muestra estén en contacto (consulte la Figura 5A).
   2. Ajuste la posición de la cabeza AFM ligeramente hacia arriba (en pasos correspondientes a ~ 50% del tamaño total de la rampa) y vuelva a rampa. Repita hasta que la punta y la muestra estén fuera de contacto, como lo demuestra una rampa casi plana (Figura 5B) y una desviación vertical mínima del voladizo (Figura 2A).
   3. Una vez que no haya una interacción obvia entre la punta y la muestra (compare la Figura 2A y la Figura 2B), baje el cabezal AFM en una cantidad correspondiente a ~ 50% -100% del tamaño de la rampa para asegurarse de que la punta de la sonda no choque contra la muestra mientras mueve manualmente el cabezal AFM. Rampa de nuevo, repitiendo hasta que se observe una buena curva (Figura 5D) o una curva similar a la Figura 5C. En este último caso, realice un pequeño ajuste adicional de descenso de la cabeza de AFM igual a ~ 20% -50% del tamaño de la rampa para lograr un buen contacto y una curva de fuerza similar a la que se muestra en la Figura 5D.
2. Ajuste los parámetros de la rampa (como se describe a continuación y se muestra en Figura 4B) para optimizar el instrumento, la sonda y la muestra, y obtener rampas similares a las que se muestran en Figura 5D.
   1. Seleccione un tamaño de rampa apropiado (es decir, movimiento total de Z-piezo a través de un ciclo de rampa) dependiendo de la muestra (por ejemplo, espesor, módulo esperado, rugosidad de la superficie) y la profundidad de hendidura deseada.
      NOTA: Para muestras más rígidas, es probable que ocurra menos deformación de la muestra (y, por lo tanto, más deflexión de la sonda para un movimiento piezoeléctrico en Z dado), por lo que el tamaño de la rampa generalmente puede ser más pequeño que para muestras más blandas. Los tamaños de rampa típicos para muestras rígidas y voladizos pueden ser de decenas de nm, mientras que para muestras blandas y voladizos las rampas pueden ser de cientos de nm a unos pocos μm de tamaño; Los ejemplos específicos de aplicaciones seleccionadas se presentan en la sección Resultados representativos. Tenga en cuenta que los tamaños de rampa mínimos y máximos posibles dependen del instrumento.
   2. Seleccione una velocidad de rampa adecuada (1 Hz es un buen punto de partida para la mayoría de las muestras).
      NOTA: La velocidad de rampa puede estar limitada por velocidades / anchos de banda electrónicos de control y / o detección. En combinación con el tamaño de la rampa, la velocidad de rampa determina la velocidad de la punta. La velocidad de la punta es particularmente importante a considerar cuando se sangran materiales blandos donde los efectos viscoelásticos pueden causar artefactos de histéresis ^9,22.
   3. Elija si desea emplear una rampa activada (controlada por carga) o no activada (controlada por desplazamiento).
      NOTA: En una rampa activada, el sistema se acercará a la muestra en pasos definidos por el usuario (según el tamaño y la resolución de la rampa o el número de puntos de datos) hasta que se detecte el umbral de activación deseado (es decir, la fuerza del punto de consigna o la desviación en voladizo), momento en el que el sistema se retraerá a su posición original y mostrará la curva F-D. En una rampa no activada, el sistema simplemente extiende el Z-piezo la distancia especificada por el tamaño de rampa definido por el usuario y muestra la curva F-D medida. Las rampas activadas son preferidas para la mayoría de los casos de uso, pero las rampas no activadas pueden ser útiles cuando se investigan materiales blandos que no exhiben un punto de contacto afilado y fácilmente identificable.
      1. Si se elige una rampa activada , establezca el umbral de activación (fuerza máxima permitida definida por el usuario o deflexión de la rampa) para obtener la hendidura deseada en la muestra.
         NOTA: El uso de un umbral de activación significa que una rampa puede terminar (es decir, la sonda puede comenzar a retraerse) antes de alcanzar el tamaño de rampa completo (extensión Z-piezo) especificado. Los valores pueden variar de unos pocos nN a unos pocos μN, dependiendo del sistema de punta y muestra.
      2. Establezca la posición de la rampa para determinar la parte del rango máximo del Z-piezo que se utilizará para ejecutar la rampa. Asegúrese de que el rango total del tamaño de la rampa no comience o termine fuera del rango máximo de Z-piezo (ver ejemplos representativos en la Figura 6), de lo contrario, una parte de la curva F-D no representará ninguna medida física (es decir, el Z-piezo estará completamente extendido o retraído, no se moverá).
   4. Establezca el número de muestras/rampa (por ejemplo, 512 muestras/ rampa) para lograr la resolución deseada de la medición (es decir, densidad de puntos de la curva F-D).
      NOTA: Las muestras/rampa máximas pueden estar limitadas por restricciones de software (tamaño de archivo) o hardware (por ejemplo, velocidad de conversión de analógico a digital [A/D], dependiendo de la velocidad de rampa). También es posible limitar el rango Z-piezo o de deflexión permitido (consulte los parámetros de límites en la Figura 4B) para aumentar la resolución efectiva del convertidor A/D del sistema.
   5. Ajuste la rotación X para reducir las fuerzas de cizallamiento en la muestra y la punta moviendo simultáneamente la sonda ligeramente en la dirección X (paralela al voladizo) mientras se sangra en la dirección Z (perpendicular al voladizo). Utilice un valor para la rotación X igual al ángulo de desplazamiento del soporte de la sonda en relación con la superficie normal (12° es típico).
      NOTA: El giro X es necesario porque el voladizo está montado en el soporte de la sonda en un ángulo pequeño con respecto a la superficie para permitir que el rayo láser incidente se refleje en el PSD. Además, los ángulos frontal y posterior de la punta de la sonda pueden diferir entre sí (es decir, la punta de la sonda puede ser asimétrica). Se puede obtener información más específica de los fabricantes individuales de sondas y AFM.

Figura 5: Optimización de la separación punta-muestra después del acoplamiento para obtener buenas curvas de fuerza. Ejemplos secuenciales de curvas representativas de fuerza-desplazamiento obtenidas al sangrar en fluido (solución salina tamponada con fosfato) en un núcleo vivo de células madre mesenquimales con un voladizo de nitruro de silicio blando calibrado ( k nominal = 0.04 N/m) que termina en una punta hemisférica de 5 μm de radio (ver Tabla de materiales). Las curvas se obtuvieron en el proceso de acoplamiento de la superficie celular y la optimización de los parámetros de hendidura, con el enfoque de la sonda mostrada en azul y retracción / retirada en rojo. (A) La punta ya está enganchada y en contacto con la muestra antes de comenzar la rampa, lo que lleva a una gran deflexión y fuerzas en voladizo, sin una línea de base plana de precontacto. (B) Después de mover manualmente la punta lo suficientemente lejos de la muestra, una rampa de 2 μm no activada da como resultado una curva F-D que es casi plana (es decir, prácticamente sin cambio en la fuerza). En condiciones ambientales, la curva sería más plana, pero en fluido, la viscosidad del medio puede causar ligeras deflexiones del voladizo de la sonda durante una rampa como se ve aquí, incluso sin contacto con la superficie. (C) Después de acercarse ligeramente a la superficie antes de comenzar la rampa, las curvas de aproximación y retracción muestran un ligero aumento de la fuerza (aumento de la pendiente) cerca del punto de giro de la rampa (es decir, transición de aproximación a retirada). La señal reveladora a buscar es que las curvas de aproximación (azul) y retirada (rojo) comienzan a superponerse (región indicada por el círculo negro), lo que es indicativo de una interacción física con la superficie. (D) Una curva F-D ideal adquirida después de la optimización de los parámetros de rampa y acercándose ligeramente (~ 1 μm) más cerca de la superficie de la celda que en C para que la sonda pase aproximadamente la mitad de la rampa en contacto con la celda, lo que permite una deformación suficiente para ajustar la parte de contacto de la curva de aproximación y determinar el módulo elástico. La línea de base relativamente larga, plana y de bajo ruido facilita que el algoritmo de ajuste determine el punto de contacto. Abreviatura: F-D = fuerza-desplazamiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Tamaño y posición de la rampa. Monitor Z-piezo que muestra la extensión de la rampa (barra azul) en relación con el rango total de movimiento Z-piezo disponible (barra verde). (A) La posición piezoeléctrica Z está cerca de la mitad de su rango de movimiento, como lo indica tanto la barra azul que se encuentra aproximadamente en el centro de la barra verde como el voltaje actual Z-piezoeléctrico (-78.0 V) que se encuentra aproximadamente entre sus valores completamente retraídos (-212.2 V) y extendidos (+102.2 V). (B) Z-piezo se extiende con respecto a A, sin voltaje de polarización aplicado. (C) Z-piezo se retrae en relación con A y B. (D) La posición piezoeléctrica Z es la misma que en C a -156.0 V, pero el tamaño de la rampa se ha incrementado en relación con A-C para aprovechar más del rango completo de movimiento del Z-piezo. € El tamaño de la rampa es demasiado grande para la posición actual de la rampa, lo que hace que el Z-piezo se extienda hasta el final de su rango. Esto hará que la curva F-D se aplane ya que el sistema no puede extender el Z-piezo aún más. Abreviatura: F-D = fuerza-desplazamiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Análisis de curva F-D

1. Elija un paquete de software de análisis de datos adecuado. Seleccione y cargue los datos a analizar.
   NOTA: Muchos fabricantes de AFM y programas de software de procesamiento de imágenes AFM tienen soporte incorporado para el análisis de curvas F-D. Alternativamente, la mayor flexibilidad y características de un paquete dedicado de análisis de curvas F-D, como el paquete de software de código abierto AtomicJ, puede ser beneficioso²³, particularmente para el procesamiento por lotes y el análisis estadístico de grandes conjuntos de datos o la implementación de modelos complejos de mecánica de contacto.
2. Valores calibrados de entrada para la constante de resorte, DS y radio de la punta de la sonda, junto con estimaciones del módulo de Young y la relación de Poisson para la punta de la sonda (en función de su composición de material) y la relación de Poisson de la muestra.
   NOTA: Si se utiliza un penetrador de punta de diamante, los valores E tip = 1140 GPa y ν _tip = 0.07 se pueden usar^21,24,25,26. Para una sonda de silicio estándar, normalmente se puede usar la punta E = 170 GPa y la _punta ν = 0.27, aunque el módulo de silicio de Young varía dependiendo de la orientación cristalográfica²⁷.
3. Elija un modelo de mecánica de contacto de nanoindentación apropiado para la punta y la muestra.
   NOTA: Para los muchos modelos comunes de punta esférica (por ejemplo, Hertz, Maugis, DMT, JKR), es imperativo que la profundidad de hendidura en la muestra sea menor que el radio de la punta; de lo contrario, la geometría esférica de la punta de la sonda da paso a una forma cónica o piramidal (Figura 4C). Para modelos cónicos (por ejemplo, Sneddon²⁸) y piramidales, el medio ángulo de la punta (es decir, el ángulo entre la pared lateral de la punta y una línea de bisección perpendicular al extremo de la punta; Figura 4C) debe ser conocido y generalmente está disponible en el fabricante de la sonda. Para obtener más información sobre los modelos de mecánica de contacto, consulte la sección Análisis de datos de thedDiscussion.
4. Ejecute el algoritmo de ajuste. Compruebe el ajuste adecuado de las curvas F-D; un bajo error residual correspondiente a un promedio de R 2 cerca de la unidad (por ejemplo, R² > 0.9) es típicamente indicativo de un buen ajuste al modelo elegido^29,30. Verifique las curvas individuales para inspeccionar visualmente la curva, el ajuste del modelo y los puntos de contacto calculados si lo desea (por ejemplo, consulte la Figura 7 y la sección Análisis de datos de la discusión).

Representative Results

Curvas fuerza-desplazamiento
La Figura 7 muestra curvas F-D representativas y casi ideales obtenidas de experimentos de nanoindentación realizados en aire en muestras de pino loblolly incrustadas en resina (Figura 7A) y en fluido (solución salina tamponada con fosfato [PBS]) en núcleos de células madre mesenquimales (MSC) (Figura 7B). El uso de cualquier modelo mecánico de contacto se basa en la determinación precisa y fiable del punto de contacto inicial de la punta y la muestra. Por lo tanto, la línea de base relativamente plana y de bajo ruido que precede al punto de contacto inicial y la suave pendiente de la porción de contacto de las curvas F-D que se muestran en la Figura 7 las hace ideales para el análisis para extraer propiedades mecánicas, como lo demuestra la excelente concordancia entre las curvas de aproximación (trazas azules) y los ajustes correspondientes (trazas verdes) en los recuadros.

Por el contrario, hay varios problemas comunes que un usuario puede encontrar al realizar una nanoindentación basada en voladizo que conducirá a curvas F-D no ideales. Uno de los problemas más comunes, particularmente inmediatamente después del enganche, es que la punta de la sonda ya está en contacto con la muestra antes del inicio de una rampa (Figura 5A), lo que impide la adquisición de la línea de base fuera de contacto necesaria para determinar el punto de contacto inicial. Esto también puede conducir a fuerzas excesivamente grandes en el caso de rampas no activadas (es decir, desplazamiento controlado). Esto es particularmente preocupante cuando se realiza una rampa grande con un voladizo rígido, ya que las fuerzas resultantes pueden romper el voladizo y / o dañar la muestra o la punta. Para evitar esto, controle el voltaje de deflexión vertical durante y después del acoplamiento inicial. Si el voltaje de deflexión vertical medido es positivo (suponiendo una alineación inicial adecuada) como se muestra en la Figura 2B, entonces el voladizo se está desviando y la punta está en contacto con la muestra. Los voltajes positivos más grandes corresponden a deflexiones en voladizo más grandes, pero independientemente de la magnitud de la deflexión, el usuario debe elevar manualmente la cabeza AFM (por ejemplo, empleando un motor paso a paso) lejos de la muestra. El voltaje de deflexión vertical debe disminuir lentamente e incluso puede descender temporalmente por debajo de cero en el caso de fuertes fuerzas adhesivas de la muestra de punta, pero eventualmente alcanzará 0 V (o cerca de 0 V) una vez que la punta ya no esté en contacto con la muestra (Figura 2A). A partir de este punto, el usuario puede reanudar la optimización de los parámetros de rampa y la realización de sangrías.

Otro problema común (particularmente para rampas no activadas) es que toda la curva F-D aparece casi plana, sin signos obvios de interacción punta-muestra, como se muestra anteriormente en la Figura 5B. Si está disponible en el instrumento, la solución a esto es bajar manualmente la cabeza SPM en ~ 10% menos que el tamaño de la rampa (para evitar chocar la punta de la sonda) y volver a rampar, repitiendo hasta que se observe un aumento obvio en la fuerza debido a la interacción punta-muestra (Figura 5C, D) antes de proceder a optimizar otros parámetros de rampa.

Desgaste de la punta
La figura 8 presenta un ejemplo de desgaste de la punta en un entorno experimental. Se utilizó una sola sonda AFM rígida en modo de roscado de silicio (consulte la Tabla de materiales) para obtener imágenes de varias áreas grandes de una muestra de esquisto de Bakken (consulte el ejemplo de aplicación correspondiente para obtener más detalles) utilizando un método de imagen basado en curvas de fuerza rápida (velocidad de kHz), y el método BTR se utilizó para modelar la geometría de la punta y estimar el radio del extremo de la punta antes y después de cada una de las tres imágenes consecutivas. Las muestras de esquisto bajo investigación consistieron en una matriz de arcilla y material orgánico (E ~ 5 GPa) con inclusiones minerales inorgánicas mucho más duras dispersas por todas partes (E > 30 GPa). Debido a que la muestra contenía variaciones significativas en la topografía de la superficie (±2 μm) en las grandes áreas de escaneo (85 μm x 85 μm) fotografiadas, la velocidad de escaneo se estableció en el mínimo permitido en el instrumento utilizado, 0.1 Hz. Con una tasa de adquisición de curva de fuerza de 2 kHz y una velocidad de escaneo de 0,1 Hz, en el transcurso de una sola imagen de 1024 x 1024 píxeles hubo más de 20 millones de interacciones de muestra de punta. Como resultado, la punta de la sonda experimentó un desgaste significativo en relación con su estado prístino (Figura 8A) en el transcurso de la obtención de imágenes de la muestra, aumentando en más de un orden de magnitud desde un radio final efectivo de ~ 11 nm como se recibió a ~ 129 nm al final de las tres imágenes (Figura 8D). Durante la primera imagen, la punta parece haberse roto, lo que resulta en el gran cambio morfológico visto en la Figura 8B. En cada imagen posterior, la punta se vuelve progresivamente más redondeada, un excelente ejemplo del fenómeno más común de desgaste gradual (ver discusión). Los radios de punta estimados de los modelos BTR se incluyen en la Figura 8.

En contraste, la Figura 8E,F presenta modelos BTR de una sonda de punta de diamante (ver Tabla de materiales) adquirida con 6 meses de diferencia, con miles de nanoindentas y cientos de millones de interacciones entre imágenes de curvas de fuerza basadas en puntas y muestras. Como se puede ver en los radios de punta estimados de 29 nm (Figura 8E) y 28 nm (Figura 8F), el radio de la punta de la sonda no cambió dentro de los límites del método BTR, destacando la extrema resistencia al desgaste del diamante. Cabe señalar, sin embargo, que las sondas de punta de diamante (como todas las sondas AFM) son susceptibles a la contaminación de residuos poco adheridos que pueden afectar la función del área de la punta y la dureza efectiva. En consecuencia, la limpieza de la muestra sigue siendo vital para la preservación de la punta y las mediciones nanomecánicas precisas.

Ejemplos de aplicación
A través de la elección juiciosa de la composición del material de la sonda, la constante del resorte en voladizo y la geometría y el radio de la punta, la nanoindentación basada en voladizo se puede utilizar para cuantificar las propiedades mecánicas a nanoescala de materiales con módulos elásticos que van desde kPa hasta GPa, tanto en fluidos como en condiciones ambientales. A continuación se presentan ejemplos de aplicaciones seleccionadas para destacar algunos de la amplia gama de casos de uso posibles para la nanoindentación basada en voladizo.

Investigación de las propiedades mecánicas del pino loblolly para aplicaciones de biocombustibles
Los pinos loblolly (Pinus taeda) son una especie de madera blanda de rápido crecimiento que son muy abundantes en el sur de los Estados Unidos, ocupando más de 13 millones de hectáreas³¹. Debido a su abundancia, los pinos loblolly son un cultivo comercial crítico en el sur de los Estados Unidos, comúnmente utilizado tanto para madera como para madera de pulpa. Además, son un recurso importante para la producción de biocombustibles celulósicos de segunda generación³². Es importante destacar que la demanda de materia prima de biocombustibles celulósicos ha estado creciendo debido a la Ley de Independencia y Seguridad Energética (EISA) de 2007, que exige que para 2022, el uso total de combustible renovable en la industria del transporte de los Estados Unidos sea de 36 mil millones de galones, con 16 mil millones de galones derivados de la biomasa celulósica. En consecuencia, debido a la rápida tasa de crecimiento del pino loblolly y la facilidad para los proyectos agroforestales, se ha convertido en una materia prima para biocombustibles de gran interés en los últimos años³³. El conocimiento de las propiedades mecánicas del pino loblolly, incluida la variabilidad entre árboles individuales, fracciones anatómicas (por ejemplo, madera blanca, corteza, agujas) y áreas celulares (por ejemplo, pared celular versus interior), puede permitir la separación específica de corrientes de biomasa para optimizar el procesamiento mecánico y la conversión termoquímica³⁴.

La Figura 9 presenta una imagen representativa de la topografía AFM (sensor de altura) (Figura 9A) y el correspondiente mapa de módulo elástico (Figura 9B) de una muestra de sección transversal de madera blanca obtenida de una rama en un pino loblolly de 23 años con un radio de ~30 nm de sonda de punta de diamante de curvatura montada en un voladizo de acero inoxidable (k = 256 N/m). Los mapas de topografía y módulo se generaron simultáneamente utilizando imágenes AFM basadas en curvas de fuerza de velocidad de velocidad rápida de kHz, con el mapa de módulos presentando resultados semicuantitativos basados en valores nominales para las constantes de calibración de la sonda (es decir, constante de resorte, sensibilidad de deflexión y radio de punta) y ajustando las curvas de fuerza en tiempo real al modelo³⁵ de mecánica de contacto DMT (Derjaguin, Muller y Toporov). Las muestras transversales recortadas para ser <3 mm en las tres dimensiones (largo x ancho x alto) se prepararon para obtener imágenes por deshidratación en serie utilizando concentraciones crecientes de etanol (33%, 55%, 70%, 90% y 100%)³⁶, antes de infiltrarse con resina (ver Tabla de materiales) y polimerizar a 60 ° C durante la noche. Las muestras completamente curadas incrustadas en resina se molieron primero, luego se ultramicrotomaron con una cuchilla de diamante que operaba a una velocidad de corte de ~ 1 mm / s con un espesor de alimentación que disminuyó de 1 μm a 50-70 nm por rebanada para producir una superficie plana susceptible de imágenes AFM. Sin embargo, como se puede ver en la barra de escala de color en la Figura 9A, la superficie resultante en este caso sigue siendo relativamente rugosa, tal vez debido a la presencia de residuos residuales en la superficie de la muestra y / o cuchilla de ultramicrotomo, lo que lleva a la "charla" de la hoja durante la sección, mientras que otras muestras exhibieron una topografía de superficie mucho más suave.

La Figura 9C reproduce la imagen de topografía AFM de la Figura 9A, pero con un punto de mira blanco que indica las ubicaciones de ocho matrices de 50 nanoindentas cada una que se realizarán a lo largo de paredes celulares seleccionadas dentro del ROI, ya que el objetivo del proyecto en cuestión era comprender cómo las propiedades nanomecánicas del pino loblolly difieren en varios tipos de tejidos y la edad del árbol. Normalmente se empleó un umbral de activación de 1 μN para las rampas (tamaño de rampa nominal de 60 nm realizado a una velocidad de rampa de 1 Hz), lo que lleva a una profundidad de indentación de ~ 10 nm a lo largo de las paredes celulares (8 ± 2 nm en todas las muestras estudiadas) o ligeramente más profundo (14 ± 4 nm) en los interiores de las células, que son algo más suaves que las paredes celulares. Las sangrías dentro de cada línea se espaciaron ≥100 nm para garantizar que estuvieran bien separadas, y se recopilaron 1.024 puntos de datos por rampa para producir curvas de aproximación y retracción bien caracterizadas. Al combinar imágenes basadas en curvas de fuerza rápidas con nanoindentación basada en voladizo de apuntar y disparar, fue posible generar estadísticas y determinar diferencias en los módulos entre las estructuras celulares. Por ejemplo, como se muestra en la Tabla 1, se encontró que el módulo elástico promedio del interior celular era aproximadamente la mitad que el de la pared celular a través de muestras de madera blanca derivadas de múltiples ramas de árboles de diferentes edades.

Muestra	Ubicación	E* (GPa)	E (GPa)	Deformación (nm)	Conteo (n)
1	Interior	1,5 ± 0,4	1.4 ± 0.4	14 ± 2	199
	Pared	4.7 ± 1.3	4.3 ± 1.3	7 ± 2	202
2	Interior	1.3 ± 0.3	1.2 ± 0.3	16 ± 3	198
	Pared	3.2 ± 0.9	2.9 ± 0.9	9 ± 2	199
3	Interior	1,9 ± 0,6	1.7 ± 0.6	12 ± 3	198
	Pared	5.7 ± 1.2	5.2 ± 1.2	6 ± 1	199
4	Interior	2.4 ± 0.8	2.2 ± 0.8	11 ± 3	202
	Pared	4.2 ± 2.1	3.8 ± 2.1	9 ± 4	193
5	Interior	2,6 ± 0,8	2.3 ± 0.8	10 ± 2	198
	Pared	4.3 ± 1.6	3.9 ± 1.6	7 ± 2	199
Promedio	Interior	1,9 ± 0,6	1,8 ± 0,6	13 ± 3
	Pared	4.4 ± 1.4	4.0 ± 1.4	8 ± 2

Tabla 1: Estadísticas del módulo elástico del pino loblolly: paredes celulares versus interior celular. Se midieron los módulos elásticos de las paredes celulares frente a los interiores celulares para cinco muestras de ramas de madera blanca de pino loblolly recolectadas de dos árboles de diferentes edades. Todos los valores del módulo se calcularon ajustando la porción de aproximación de la curva de desplazamiento de fuerza al modelo DMT y asumiendo una relación de Poisson de 0,3 para la muestra. Los módulos se informan como promedio ± desviación estándar para cada ubicación de la muestra, con el número de curvas de fuerza (recuento, n) analizadas para producir el resultado reportado indicado. Los módulos reducidos medidos (E*) se convirtieron a módulos de muestra reales (E), asumiendo un módulo de Young de 1.140 GPa y una relación de Poisson de 0,07 para el penetrador de punta de diamante empleado. También se muestra la deformación media de la muestra para la carga aplicada de 1 μN.

Nanomecánica correlacionada y microespectroscopia electrónica en esquistos de Bakken
Los depósitos de esquisto de Bakken se encuentran dentro de la cuenca Williston en Montana y Dakota del Norte en los Estados Unidos y partes de Saskatchewan en Canadá. Son el segundo reservorio de hidrocarburos más grande de los Estados Unidos, pero el estudio de los depósitos aún está en su infancia³⁷. Se realizó una investigación de las propiedades nanomecánicas del esquisto de Bakken en función de la composición y la madurez térmica mediante la colocalización de la nanoindentación basada en voladizo AFM con imágenes de microscopio electrónico de barrido (SEM) y la caracterización de la composición elemental de la espectroscopia de dispersión de energía (EDS), como se muestra en la Figura 10. Específicamente, se utilizó el mapeo SEM-EDS para caracterizar la distribución elemental (Figura 10C), determinando así la presencia y ubicación de varias inclusiones minerales dentro de la matriz de esquisto. Las imágenes AFM basadas en curvas de fuerza rápidas (velocidad de kHz) (Figura 10B) se colocalizaron con los mapas SEM-EDS definiendo un origen ópticamente identificable en la imagen SEM del electrón secundario (SE) (Figura 10A) y rastreando el movimiento de la etapa tanto del AFM como del SEM³⁸. Al utilizar nuevamente una sonda de punta de diamante montada en un voladizo rígido de acero inoxidable, fue posible mapear las variaciones en el módulo elástico para grandes regiones (85 μm x 85 μm) que contienen inclusiones de interés (Figura 10D). Tenga en cuenta que el mapa de módulos presentado en la Figura 10D es de naturaleza cualitativa en lugar de cuantitativa, ya que las constantes de calibración de la sonda adecuadas no se introdujeron en el software antes de la obtención de imágenes y datos.

Las imágenes AFM en la Figura 10B y la Figura 10D también resaltan uno de los inconvenientes de la sonda de punta de diamante empleada, a saber, su incapacidad para rastrear con precisión las características de alta relación de aspecto (consulte la región ovalada negra en la Figura 10B) debido a su geometría de punta de esquina de cubo. La resolución reducida y la incapacidad de rastrear con precisión las características empinadas se pueden ver más claramente en la Figura 11, donde la misma área general de una muestra de esquisto de Bakken ha sido fotografiada por la punta de diamante de la esquina del cubo (Figura 11A) y una sonda AFM de silicio de modo de roscado rígido significativamente más nítida y de mayor relación de aspecto (Figura 11B). Más específicamente, la imagen mostrada en la Figura 11B fue adquirida con la sonda caracterizada en la Figura 8A-D, entre los modelos BTR en la Figura 8A (R = 11 nm) y la Figura 8B (R = 43 nm). Para la comparación directa, los pares de imágenes de la Figura 11C, D, junto con la Figura 11E, F, presentan imágenes ampliadas de las mismas características de la superficie de la muestra obtenidas con la punta de diamante y la sonda de silicio, respectivamente, que muestran el efecto de la geometría y el radio de la punta en la resolución y fidelidad de la imagen. La Figura 11G presenta una imagen 3D compuesta que combina la topografía de la superficie adquirida con la sonda de silicio de aspecto alto y nítido (Figura 8A, B) y los valores de módulo adquiridos con la sonda de punta de diamante (Figura 8E, F) codificada como la piel de color superpuesta.

Además de las imágenes grandes que se muestran en la Figura 10 y la Figura 11, se adquirieron imágenes más pequeñas (10 μm x 10 μm) basadas en curvas de fuerza rápida utilizando la sonda de punta de diamante totalmente calibrada. Estas imágenes se centraron en áreas sin inclusiones minerales inorgánicas ópticamente visibles para investigar las propiedades de la matriz orgánica circundante con más detalle. Al emplear una resolución de píxeles de 512 x 512 (es decir, ~ 20 nm x 20 nm píxeles de muestreo), se capturaron y guardaron > 262,000 curvas F-D individuales con cada imagen de 10 μm x 10 μm, lo que permite excelentes estadísticas. Los datos F-D se procesaron por lotes y se analizaron utilizando el paquete de software^{AtomicJ 23} para implementar el modelo mecánico de contacto Derjaguin-Muller-Toporov (DMT)³⁵. Después del ajuste, los datos se limpiaron para eliminar las curvas que resultaron en un módulo elástico calculado <0 (no físico) o >30 GPa (ya que el estudio se centró en la porción no mineral del esquisto, E << 30 GPa) similar a otros estudios^39,40, así como datos con un ajuste de modelo R² < 0.7. Si bien el límite de R² es algo arbitrario, se eligió eliminar solo los datos que el modelo obviamente no podía ajustar con precisión. Con la excepción de un valor atípico que incluía una gran inclusión mineral en el área de imágenes, las curvas eliminadas representaron menos del 0,5% de los datos totales de cada imagen. Un resumen de los resultados estadísticos se puede encontrar en la Tabla 2. Los módulos elásticos calculados varían de 3.5 a 6.1 GPa, dentro del rango de lo que estudios similares también han encontrado ^39,40.

Muestra	E (GPa)	Rendimiento después de la limpieza de datos	Conteo (n)
1	6.1 ± 3.8	93.70%	7,36,874
2	5.1 ± 2.6	99.70%	7,84,267
3	3.5 ± 1.9	99.60%	7,83,427

Tabla 2: Estadísticas del módulo elástico de los esquistos de Bakken. Medición de módulos elásticos de las matrices orgánicas en tres muestras de esquisto Bakken de diferente composición y madurez térmica. La muestra 1 es un control, mientras que las muestras 2 y 3 fueron recocidas durante 12 h y 48 h, respectivamente, para simular artificialmente la maduración térmica. Los módulos elásticos se informan como promedio ± desviación estándar para cada ubicación de la muestra, con el número de curvas de fuerza (conteo, n) incluidas en el análisis después de emplear el procedimiento de limpieza de datos descrito en el texto indicado. Los módulos medios calculados (3,5-6,1 GPa) se sitúan dentro del rango reportado en otros estudios similares como el de Li et ^al.40, que encontraron un rango de módulo de 2,9-11,8 GPa.

La rigidez nuclear de las células madre mesenquimales cambia debido a estímulos externos
Las células madre mesenquimales (CMM) son células progenitoras que pueden convertirse en condrocitos, adipocitos, osteoblastos y miocitos⁴¹. La diferenciación de MSC en estos diversos tipos de tejidos se ve afectada por estímulos mecánicos externos en la célula a través del complejo Linker of the Cytoskeleton and Nucleoskeleton (LINC), que une físicamente la membrana celular externa a la membrana nuclear⁴¹. El complejo LINC está compuesto por proteínas SUN y Nesprin que interactúan con el citoesqueleto celular para detectar fuerzas físicas sobre la célula y facilitar la importación nuclear de los factores mecanosensibles β-catenina y YAP para iniciar el proceso de diferenciación^42,43,44. Junto con la importación nuclear de β-catenina y YAP después de la mecanoestimulación de las células, el citoesqueleto también sufre un reordenamiento, incluida la formación de filamentos de actina F alrededor del núcleo, así como la translocación nuclear de actina^44,45,46. Debido a que la mecanoestimulación inicia cambios en el citoesqueleto celular y la entrada nuclear de actina, la rigidez general (módulo) de las células y los núcleos se ve afectada y puede medirse mediante nanoindentación basada en voladizo AFM. Estudios previos han confirmado esto al detectar una disminución en el módulo celular y nuclear después de la interrupción del complejo LINC, e inversamente un aumento en el módulo celular y nuclear después de la mecanoestimulación de MSCs⁴⁷. La investigación actual todavía está investigando los mecanismos para la importación de actina al núcleo y cómo la polimerización de actina afecta el módulo celular y nuclear después de la mecanoestimulación.

Para investigar las propiedades mecánicas de las células vivas, los experimentos deben realizarse en una solución tampón, típicamente PBS. La realización de nanoindentaciones basadas en voladizo en fluidos plantea problemas únicos, específicamente para la medición de muestras muy blandas como MSC (E≈ 2 kPa). En particular, los bajos módulos elásticos de las células vivas requieren el uso de un gran radio de sonda para reducir la tensión impartida sobre la estructura celular y evitar la perforación de la membrana. Además, se necesitan voladizos constantes de resorte muy bajos (k = 0.04 N / m) para medir módulos elásticos tan bajos, pero esto aumenta la probabilidad de un falso acoplamiento debido al arrastre viscoso del fluido, lo que lleva a la desviación del voladizo blando durante el paso inicial de descenso rápido del proceso de acoplamiento AFM. Para contrarrestar la mayor propensión a los falsos acoplamientos, puede ser necesario utilizar un punto de ajuste de acoplamiento más grande (es decir, umbral de activación de voltaje de deflexión para finalizar el proceso de acoplamiento). Dado que los voladizos más blandos generalmente pueden deformarse elásticamente en mayor medida que los voladizos rígidos, la mayor flexión experimentada con un punto de ajuste de enganchamiento más alto en el fluido generalmente no es perjudicial para tales sondas blandas. Además, es imperativo que las soluciones utilizadas en un entorno fluido estén libres de escombros y burbujas, ya que los desechos flotantes o burbujas pueden interferir transitoriamente con la transmisión del láser a través del fluido al PSD o adherirse al voladizo y bloquear el láser. La interferencia con el rayo láser tendrá un impacto negativo en las curvas F-D resultantes y, a menudo, dará como resultado una detección de choque falso o un falso acoplamiento. Finalmente, la nanoindentación en células vivas también requiere más participación del usuario que en materiales inanimados más duros. En particular, debido a que las células y su entorno fluido son mucho más dinámicos, puede ser necesario ajustar activamente la altura de la sonda para cada rampa para garantizar que se obtenga una buena curva F-D.

En la nanoindentación de células vivas, a menudo se necesita una deformación de muestra mucho mayor para dar como resultado la misma desviación en voladizo en relación con las muestras más rígidas. Esta deformación más grande puede resultar en resultados experimentales que se desvían de la suposición del modelo de Hertz de elasticidad lineal y, por lo tanto, puede ser necesario aplicar un factor de corrección para tener en cuenta el comportamiento hiperelástico para un análisis F-D preciso⁴⁸. Se ha encontrado que la relación de tamaño geométrico, donde R ₂ es el radio del penetrador y R₁ es el radio de la celda (ver Figura 12A), se puede utilizar para predecir la adherencia de los datos resultantes a la mecánica hertziana. Se ha encontrado que la relación de tamaño geométrico ideal es β = 0.3, con valores β <0.3 que conducen a subestimar el módulo elástico y valores β > 0.3 que conducen a sobreestimar el módulo elástico cuando se analiza con la teoría de contacto de Hertz⁴⁸. Una forma común de evitar efectos no lineales es mantener las deformaciones pequeñas. En este estudio, la profundidad de indentación se limitó a 500 nm-1 μm.

En la Figura 12B se muestra un conjunto de datos representativos que muestran los resultados de un único conjunto de experimentos de nanoindentación en MSC y núcleos aislados. En los datos presentados en la Figura 12B, precalibrados (constante de resorte vía LDV y radio de punta vía SEM), se utilizaron sondas hemisféricas de 5 μm de radio con una constante de resorte nominal de k = 0,04 N/m para investigar las diferencias en el módulo entre las MSC vivas intactas y los núcleos MSC aislados, que sirvieron como controles para probar los efectos de las deformaciones estáticas y dinámicas en las propiedades de la mecánica celular y nuclear⁴⁶. Debido a las diferencias y los desafíos en la participación en las células y los núcleos, los datos del módulo extraído tienden a exhibir una gran variación (es decir, distribución de valores). En consecuencia, el conjunto de datos de la Figura 12B presenta^{un percentil} 75 de los datos recopilados. Debido a esta variabilidad innata entre las células vivas y la propagación de la medición resultante, se recomienda realizar experimentos de nanoindentación replicada en un gran número de muestras con al menos tres réplicas biológicas para generar estadísticas robustas para el análisis e interpretación de datos³⁰.

Propiedades mecánicas de las bicapas lipídicas que contienen colesterol
Las membranas lipídicas soportadas con un contenido muy alto (>50 mol%) de colesterol (Chol), típico de la composición que se encuentra en las membranas de las lentes oculares, se prepararon e incubaron en mica moscovita⁴⁹ recién escindida. En la Figura 13A se muestra una imagen representativa de la topografía AFM de una membrana lipídica soportada (SLM) preparada en una relación de mezcla Chol/POPC (POPC = 1-palmitoil-2-oleoil-glycero-3-phosphocholine) de 1, con el perfil de altura a lo largo de la línea púrpura en la imagen que se muestra debajo de la figura. El SLM en la Figura 13A cubrió completamente la superficie de mica expuesta con suficiente tiempo de incubación (~ 25 min) y una concentración de lípidos suficiente (0.3 mg / ml), como lo demuestra la falta de características distinguibles en la imagen topográfica. Del mismo modo, el perfil de altura a través de la imagen proporciona detalles estructurales con respecto a la rugosidad de la superficie de la membrana, con el SLM liso como se esperaba.

La Figura 13B presenta una colección de secciones de aproximación de curvas de fuerza capturadas en el SLM que se muestra en la Figura 13A. Para lograr mejores estadísticas con respecto a las propiedades mecánicas del SLM, se recolectaron curvas de fuerza en puntos equidistantes espaciados al menos 100 nm de distancia, cubriendo casi todo el ancho del SLM. El espaciado entre puntos (≥10 veces la profundidad de sangría) se eligió para evitar que la sangría se produjera demasiado junta. Las curvas de fuerza muestran un claro evento de avance, como lo demuestra la discontinuidad o el salto repentino entre las distancias de separación de ~0 y ~5 nm en la sección de aproximación de las curvas de fuerza donde la fuerza cae precipitadamente de ~10 nN a ~5 nN. La fuerza de ruptura promedio para la membrana que se muestra en la Figura 13A (relación de mezcla Chol/POPC de 1) basada en las curvas de aproximación de la Figura 13B se calcula en 9.25 ± 0.27 nN.

En contraste, la Figura 13C muestra una imagen topográfica AFM de la membrana parcial o parches de membrana formados por membranas nuevamente incubadoras a una relación de mezcla Chol/POPC de 1, pero a una concentración mucho menor de lípidos (~15 μg/mL) y con un tiempo de incubación más corto (~5-6 min)⁴⁹. El perfil de altura a lo largo de la línea roja a través del parche de membrana en el centro de la imagen se muestra debajo de la figura. La medición a través de la bicapa parcial proporciona el espesor del SLM, mostrado por las líneas discontinuas negras en la Figura 13C como ~7 nm. Sin embargo, este espesor medido también incorpora una capa de agua de 1-2 nm entre la membrana y el disco de mica⁵⁰. Cabe señalar que la membrana parcial a menudo solo está débilmente unida a la superficie de la mica, lo que puede hacer que las partículas de lípidos se eliminen del borde de los parches parciales de la membrana durante el escaneo, pero un tiempo de incubación ligeramente más largo o la reducción de la fuerza de imagen puede eliminar esta dificultad.

La calibración de la sonda AFM es crucial para cuantificar con precisión las propiedades mecánicas SLM. En particular, aunque la constante del resorte de la punta permanece constante en el medio de aire o fluido, la sensibilidad de deflexión debe calibrarse en el mismo medio donde se realizan los experimentos. Es fundamental calibrar la sensibilidad a la deflexión inmediatamente antes de cada conjunto de adquisiciones de curvas de fuerza para garantizar resultados reproducibles, ya que la alineación láser y / o la reflectividad del recubrimiento posterior pueden cambiar con el tiempo, particularmente en fluidos. Se desaconsejan las sondas muy afiladas para capturar curvas de fuerza de membrana, ya que perforan fácilmente el SLM y pueden llevar a medir una fuerza de avance erróneamente baja o ninguna ruptura en absoluto. Sin embargo, el uso repetido de la misma punta sin una limpieza adecuada aumenta la posibilidad de que se acumulen residuos en la punta y, por lo tanto, opaquen la punta o afecten las fuerzas adhesivas de la muestra de la punta. La falta de eventos de avance evidentes en las curvas de fuerza de aproximación también puede corresponder a empujar solo la mica en lugar de la membrana real; Por lo tanto, es necesaria la confirmación visual de la formación de membranas antes de capturar las curvas de fuerza.

Figura 7: Curvas representativas de fuerza-desplazamiento (F-D) en aire y fluido. Curvas de fuerza representativas obtenidas en (A) un pino loblolly en el aire con ajuste de modelo DMT acompañante, y (B) un núcleo MSC vivo en PBS con un ajuste de modelo Hertz acompañante. Los recuadros en los paneles A y B muestran un zoom de la región de contacto de las curvas de aproximación correspondientes (trazas azules) con ajuste acompañante (trazos verdes). En cada panel, el punto de contacto inicial de la punta y la muestra (según lo determinado por el algoritmo de ajuste) se indica con un diamante verde, mientras que el punto de giro (es decir, la transición de la aproximación a la retracción o retirada) se indica mediante un círculo cian. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Comparación del desgaste de la punta de la sonda de silicio versus el de diamante. (A-D) Punta de sonda de silicio. Serie de modelos creados por el método de reconstrucción de la punta ciega después de la obtención de imágenes de una muestra de caracterización de la punta, que demuestran la evolución en radio de una sonda de punta de silicio en voladizo rígido (consulte la Tabla de materiales) debido al desgaste progresivo de la punta experimentado en el transcurso de tres imágenes secuenciales de 85 μm x 85 μm (1024 x 1024 píxeles) basadas en la curva de fuerza de una muestra de esquisto de Bakken, realizado a una velocidad de barrido lineal de 0,1 Hz y una frecuencia de muestreo de curva de fuerza de 2 kHz (es decir, ~20 millones de interacciones/imagen entre la punta y la muestra). (A) Propina tal como se recibió (fuera de la caja), antes de su uso. R = 11 nm. (B) Punta después de una imagen (R = 43 nm). (C) Punta después de dos imágenes (R = 94 nm). (D) Punta después de tres imágenes (R = 129 nm). (E,F) Punta de sonda de diamante. Modelos BTR de la misma sonda de punta de diamante (ver Tabla de materiales) obtenidos con ~ 6 meses de diferencia. Entre la adquisición de las imágenes de punta utilizadas para generar los modelos que se muestran en E y F, se realizaron miles de nanoindentaciones con la sonda y se produjeron cientos de millones de interacciones punta-muestra durante las imágenes basadas en curvas de fuerza. Sin embargo, debido a la dureza del diamante, el radio estimado del extremo de la punta de ~ 30 nm no cambió dentro de los límites de incertidumbre de la técnica BTR entre la adquisición de las imágenes iniciales (E) y de seguimiento (F) de la punta. La aspereza observada en el modelo anterior (indicada por el círculo negro en el panel E) es muy probablemente un artefacto del método BTR o debido a la presencia de un contaminante a nanoescala (por ejemplo, partícula de polvo) en el lado de la punta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9: Mapas de topografía y módulo AFM de una muestra de pino loblolly. Datos representativos de AFM adquiridos en el aire en una muestra de pino loblolly de sección transversal incrustada en resina para permitir mediciones de nanoindentación basadas en voladizo en paredes celulares. (A) Imagen topográfica AFM que cubre múltiples celdas adquiridas a través de un modo de imagen basado en curva de fuerza rápida, presentado como una representación pseudo-3D. (B) Mapa de módulo elástico o de Young generado en tiempo real por el software AFM analizando la curva de fuerza adquirida en cada píxel y ajustando los datos al modelo DMT, mostrando que las paredes celulares son más rígidas que los interiores de las celdas. Tenga en cuenta que se utilizaron los parámetros de calibración nominales, en lugar de medidos, de la sonda, por lo que los valores del módulo deben tratarse como cualitativos o solo semicuantitativos. (C) Descripción general del ROI indicando las ubicaciones (ocho líneas que consisten en 50 puntos de mira blancos cada uno espaciados ≥100 nm de distancia) donde se realizaron 400 nanoindentaciones (tamaño de rampa nominal de 60 nm, con un umbral de activación de 1 μN correspondiente a una profundidad de indentación promedio de ~ 10 nm) a lo largo de las paredes celulares seleccionadas después de la adquisición de la imagen AFM para permitir la localización de sangrías con precisión a nanoescala. Barras de escala = 20 μm (A,B). Abreviaturas: AFM = microscopía de fuerza atómica; DMT = Derjaguin-Muller-Toporov. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 10: AFM y SEM/EDS colocalizados de una muestra de esquisto de Bakken. (A) Imagen SEM de electrones secundarios de una porción de una muestra de esquisto de Bakken. (B) Imagen topográfica AFM de la región indicada por el recuadro negro en A. El óvalo negro indica una región donde la baja relación de aspecto de la sonda conduce a la obtención de imágenes de la pared lateral de la sonda en lugar de la característica de topografía de superficie de alta relación de aspecto. (C) Mapa de composición elemental EDS obtenido para la imagen SEM mostrada en A. (D) Elástico derivado de AFM o mapa de módulo de Young generado en el curso de la obtención de la imagen de topografía AFM en B, que muestra que la inclusión mineral en el centro de las imágenes A-D es significativamente más dura que la matriz orgánica circundante. Barras de escala = 50 μm. Abreviaturas: AFM = microscopía de fuerza atómica; SEM = microscopía electrónica de barrido; EDS = espectroscopia de dispersión de energía. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 11: Efecto del radio y la forma de la punta de la sonda en la apariencia de las características de alta relación de aspecto. Comparación de la resolución de características obtenida utilizando (A) una sonda de punta de diamante R≈ 30 nm de relación de aspecto baja (ángulo medio de punta = 47°) (consulte la Tabla de materiales) o (B) una sonda de silicio rígida R≈ de 10 nm (ángulo medio de punta ≈ 19°) (k nominal = 200 N / m; consulte la Tabla de materiales) para obtener imágenes de la misma ubicación en una muestra de esquisto de Bakken. (C-F) Imágenes ampliadas de las regiones en caja azul (C, D) y naranja (E, F) en A y B obtenidas con la sonda de punta de diamante de baja relación de aspecto de radio de curvatura mayor (C, E) o la sonda de modo de roscado de silicio rígido (D, F) más nítida y de mayor relación de aspecto, destacando la disminución de la resolución de características y la introducción de artefactos de la pared lateral de la punta en la imagen de topografía AFM obtenida con la sonda de punta de diamante debido a su mayor radio de punta y medio ángulo. Las áreas resaltadas en C-F contienen características empinadas y profundas que demuestran las compensaciones en términos de resolución lateral, seguimiento preciso y fidelidad de imagen entre una sonda de silicio más fácil de opacar e inicialmente nítida o una sonda de punta de diamante más roma y resistente al desgaste. (G) Imagen 3D compuesta generada combinando la topografía AFM adquirida con la sonda de silicio rígido de mayor relación de aspecto con datos de módulo (piel coloreada superpuesta) derivados de imágenes de curva de fuerza rápida de la misma área de la muestra con la sonda de punta de diamante. Las características resaltadas por los cuadros azul y blanco en A y B también se indican en G. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 12: Nanoindentación basada en voladizo en células o núcleos . (A) Una celda con radio R₁ ubicada en un sustrato plano y rígido está indentada a una profundidad d por un penetrador esférico con radio R₂. Esta figura fue reproducida de Ding et ^al.48. (B) Gráficos de valores individuales de mediciones representativas del módulo obtenidas de experimentos de nanoindentación basados en voladizo AFM en MSC de ratón y núcleos aislados extraídos de MSC de ratón. Un total de 10 células y 10 núcleos se midieron cinco veces cada uno a una profundidad de hendidura de 500-600 nm (elegido para permitir el uso del modelo de mecánica de contacto de Hertz). Los datos brutos resultantes de la curva F-D se procesaron utilizando Atomic J²³ para calcular los módulos elásticos. Debido a la gran variabilidad innata de las células, se traza^{un percentil} 75 de los datos. Los núcleos celulares y aislados no mostraron diferencia estadística en el módulo elástico, con un módulo promedio medido de 0,75 ± 0,22 kPa y 0,73 ± 0,22 kPa, respectivamente. Se han recopilado y analizado datos similares para determinar las diferencias en la rigidez nuclear debido a la estimulación mecánica, los knockouts de proteínas y los tratamientos químicos. Abreviaturas: MSC = célula madre mesenquimal; AFM = microscopía de fuerza atómica; F-D = fuerza-desplazamiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 13: Morfología y propiedades nanomecánicas de bicapas lipídicas . (A) Imagen topográfica de AFM que muestra la variación mínima de altura de una membrana lipídica completa soportada (SLM) compuesta de Chol / POPC en una proporción de mezcla de 1 que se formó en toda la superficie de mica expuesta con un largo tiempo de incubación (~ 25 min) y alta concentración de lípidos (0.3 mg / ml). El perfil de altura a lo largo de la línea púrpura a través del centro de la imagen se muestra debajo de la figura, proporcionando detalles estructurales de la superficie de la membrana. Como era de esperar, el SLM es extremadamente suave. (B) Colección de secciones de aproximación de curvas de fuerza capturadas en el SLM que se muestra en A. Las curvas de fuerza se recogieron en puntos equidistantes separados ≥100 nm cubriendo casi todo el SLM. Las curvas de fuerza muestran un claro evento de ruptura, como lo demuestra la discontinuidad o salto repentino en la sección de aproximación de las curvas de fuerza. La fuerza de avance promedio es de 9.25 ± 0.27 nN. (C) Membrana parcial o parches de membrana formados por incubación de membranas a una relación de mezcla Chol/POPC de 1 con un tiempo de incubación más corto (~5-6 min) y menor concentración de lípidos (~15 μg/mL) en relación con A⁴⁹. El perfil de altura a lo largo de la línea roja en el parche se muestra debajo de la imagen. La bicapa parcial permite medir el espesor del SLM, mostrado por las líneas discontinuas negras en el perfil de altura. Tenga en cuenta que el espesor medido también incorpora una capa de agua de 1-2 nm entre la membrana y el disco de mica⁵⁰. Esta figura fue adaptada de Khadka et ^al.49 con permiso de Elsevier. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Preparación de muestras
Para la nanoindentación en el aire, los métodos de preparación comunes incluyen criosección (por ejemplo, muestras de tejido), esmerilado y / o pulido seguido de ultramicrotoming (por ejemplo, muestras biológicas incrustadas en resina), molienda de iones o preparación de haz de iones enfocado (por ejemplo, muestras de dureza semiconductora, porosa o mixta no susceptibles de pulido), pulido mecánico o electroquímico (por ejemplo, aleaciones metálicas) o deposición de película delgada (por ejemplo, capa atómica o deposición química de vapor, epitaxia de haz molecular). El objetivo es crear una muestra con una rugosidad superficial mínima (idealmente escala nm, ≤0,1 veces la profundidad de sangría prevista). Con muchos de los métodos anteriores, es posible que la muestra deba enjuagarse posteriormente con y/o sonicarse en disolvente filtrado de alta pureza (por ejemplo, grado HPLC) y secarse con gas nitrógeno (_N2) de pureza ultra alta (99,999%) para eliminar los restos de partículas. Alternativamente, las escamas (por ejemplo, materiales 2D) o las partículas (por ejemplo, nanopartículas o microcápsulas) pueden recubrirse por centrifugado o expulsarse de soluciones preparadas con disolventes filtrados de alta pureza. En este caso, el objetivo es lograr una densidad superficial que produzca múltiples escamas o partículas no superpuestas dentro del campo de visión en cualquier área elegida al azar en la muestra. Para la nanoindentación en fluido (a menudo empleada para muestras biológicas que requieren solución tampón para permanecer viable), es necesaria la deposición o preparación de muestras en un sustrato liso (rugosidad superficial a escala nanométrica) (por ejemplo, portaobjetos de microscopio, placa de Petri o mica moscovita recién escindida) ^46,47,49.

Consideraciones sobre la selección del sondeo
La selección de una sonda apropiada es de suma importancia para el análisis cuantitativo de curvas F-D, ya que la interacción punta-muestra es la propiedad fundamental que se mide en la nanoindentación basada en voladizo. Las siguientes preguntas son de particular importancia al elegir una sonda para un experimento determinado. ¿Cuál es la rugosidad superficial esperada (o medida) de la muestra y el rango de módulo elástico? Las muestras de alta rugosidad pueden causar un desgaste acelerado en comparación con las muestras más suaves debido al aumento de las fuerzas laterales presentes en la punta al rastrear características empinadas, así como aumentar la probabilidad de eventos de rotura de la punta⁵³. Del mismo modo, cuanto más dura sea la muestra, más rápido desgastará la punta de la sonda. Además, ¿cuántas imágenes y/o nanosangrías son necesarias? Con menos imágenes y sangrías, se puede esperar menos desgaste de la punta. Como se describe con mayor detalle a continuación, el desgaste de la punta puede reducirse mediante el uso de recubrimientos de carbono similares al diamante (DLC) o eliminarse virtualmente mediante el uso de sondas de punta de diamante (con el alto costo de adquisición compensado con el tiempo por la vida útil casi infinita de la sonda).

Otra consideración al elegir una sonda apropiada es el tamaño de las características de interés. Para la nanoindentación, a menudo es mejor utilizar el tamaño de punta más grande posible mientras se mantiene la resolución espacial necesaria para la(s) muestra(s) en cuestión y el contenido de información deseado, porque las puntas más grandes tienen menos probabilidades de experimentar cambios repentinos en la geometría de la punta debido a la fractura y también exhibirán tasas de desgaste más bajas⁵⁴. También es importante considerar si existen otros métodos de AFM para ser co-localizados con nanoindentación, como AFM⁵⁵ conductivo, microscopía de fuerza de sonda Kelvin (KPFM)⁵⁶ o microscopía de fuerza magnética (MFM)⁵⁷. Si se van a utilizar metrologías adicionales como estas, es posible que la punta de la sonda deba ser eléctricamente conductora o magnética, lo que afectará la composición del material y, por lo tanto, una serie de propiedades, incluida la dureza, la resistencia al desgaste y el radio de la punta. Del mismo modo, si la hendidura se realizará en fluido, la composición del recubrimiento reflectante de la parte posterior de la sonda (si está presente) es otra consideración importante, ya que debe ser resistente a la corrosión (por ejemplo, un recubrimiento trasero Au es común para las sondas de fluidos). Finalmente, y quizás lo más importante, la constante de resorte del voladizo de la sonda debe coincidir con el rango esperado de módulos elásticos a medir. Si la constante de resorte no coincide bien con el módulo de muestra, puede ocurrir uno de dos casos. Si el voladizo es demasiado rígido, se medirá poca o ninguna desviación y la caracterización se vuelve imposible; Por el contrario, si el voladizo es demasiado blando, no podrá deformar la muestra lo suficiente como para medir sus propiedades mecánicas.

Desgaste de la punta
El desgaste se puede definir de muchas maneras; para la discusión del desgaste de la punta de la sonda AFM aquí, se definirá como cualquier cambio en la topografía de la superficie de la punta de la sonda debido a la deformación plástica sin pérdida de material, así como cualquier eliminación de material de la superficie debido a interacciones físicas⁵⁸. En un sentido más amplio, el desgaste también puede implicar reacciones químicas como la oxidación y la hidratación. En aplicaciones normales de AFM, la resolución espacial lateral suele estar limitada por el radio de punta⁵⁹, y la interacción punta-muestra es la propiedad principal medida. Dado que el radio de la punta es un parámetro clave para modelar la mecánica de contacto del sistema de muestra de punta y determinar posteriormente las propiedades mecánicas, el desgaste de la punta es de particular preocupación cuando se realizan experimentos de nanoindentación y es una limitación clave para la interpretación precisa de los resultados de nanoindentación⁵³. Debido a la naturaleza normalmente gradual del desgaste de la punta (aparte de los eventos de rotura de la punta), no es posible cuantificar el desgaste de la punta debido a un solo ciclo de nanoindentación (es decir, rampa). Además, el movimiento perpendicular de la punta de la sonda en relación con la muestra en nanoindentación (descontando las imágenes basadas en curvas de fuerza rápida) se presta a reducir la tasa de desgaste, ya que el modo principal de desgaste de la punta suele ser el desarrollo de fuerzas de cizallamiento durante los modos de escaneo⁶⁰. Como tal, la principal fuente de desgaste de la punta en los experimentos de nanoindentación es cualquier imagen realizada después de la calibración inicial de la sonda (en particular, la sensibilidad a la deflexión y las mediciones del radio de la punta) pero antes de la nanoindentación. Por lo tanto, se recomienda que si se utilizan sondas de silicio o nitruro de silicio, se verifique el radio de la punta antes y después de cada experimento para monitorear y tener en cuenta cualquier desgaste de la punta utilizando uno de los métodos descritos anteriormente (por ejemplo, análisis SEM o BTR).

Materiales de la sonda
Carbono similar al diamante (DLC)
Mediante el uso de puntas de sonda recubiertas de DLC o puntas de diamante, el desgaste de la punta puede reducirse enormemente o anularse por completo⁵³. La resistencia al desgaste mejorada de estos materiales de punta alternativos es muy atractiva para la medición de propiedades mecánicas, particularmente de materiales muy rígidos. Se ha demostrado que las puntas de sonda DLC pueden mostrar un aumento de 1.600 veces en la resistencia al desgaste en comparación con las puntas de sonda de silicona normales⁵⁴. Este aumento dramático en la resistencia al desgaste puede atribuirse a varios factores. Primero, los enlaces presentes en DLC (C-C y C = C) y su interfaz con el silicio (Si-O, Si-C) son algunos de los enlaces más fuertes de cualquier par elemental, y mucho más fuertes que los enlaces Si-Si presentes en las puntas de silicio. DLC también tiene el efecto de disminuir la fricción, lo que a su vez reduce las tensiones de cizallamiento dentro de la punta, reduciendo así el desgaste. Además, la química de la superficie DLC es diferente de la de una punta de silicio, ya que las puntas de silicio pueden experimentar grabado triboquímico en condiciones de humedad ambiente, mientras que las puntas DLC no lo hacen (o al menos no de ninguna manera significativa en comparación con el modo de desgaste primario)⁵⁴. La principal desventaja de las puntas recubiertas de DLC (más allá del aumento del precio en relación con las puntas de silicio sin recubrimiento estándar) es el aumento del radio de la punta debido al recubrimiento en sí. La mayoría de los radios de punta de la sonda DLC son de ≥30 nm, mientras que las puntas no recubiertas de DLC pueden alcanzar de manera confiable 1-2 nm en radio⁶¹. Sin embargo, un radio de punta más grande a menudo puede ser deseable para los experimentos de nanoindentación para reducir el error en las mediciones de propiedades, ya que las discrepancias a nanoescala entre la función ideal de área-profundidad y la función real de área-profundidad, debido a defectos o asperezas de sonda, afectarán desproporcionadamente las mediciones realizadas con sondas de radio más pequeño debido al error relativo más grande. Además, a pesar de su resistencia superior al desgaste, el recubrimiento DLC puede eventualmente desgastarse en manchas, lo que lleva a un desgaste diferencial entre el núcleo de silicio expuesto y el recubrimiento DLC restante. Desafortunadamente, la resistencia al desgaste del recubrimiento DLC también puede estar limitada por la adhesión del recubrimiento a la punta de silicio en lugar de la dureza real del recubrimiento solo.

Diamante
El diamante es bien conocido como uno de los materiales más duros y resistentes al desgaste en la Tierra. Sin embargo, se ha demostrado que todavía puede ocurrir un desgaste significativo en las puntas de diamante cuando se utilizan fuerzas grandes (60 μN) en un intento deliberado de explorar el desgaste de la punta⁶². Por el contrario, en escenarios normales de nanoindentación e imágenes donde las fuerzas ejercidas sobre la punta son mucho menores, no se han realizado estudios rigurosos sobre el desgaste de la punta del diamante. Sin embargo, como se ve en la Figura 8E, F, el modelado BTR de la misma punta de sonda de diamante en condiciones idénticas en la misma muestra de caracterización de punta con 6 meses de diferencia generó modelos de forma de punta prácticamente indistinguibles (es decir, sin evidencia discernible de desgaste). Entre la primera y la segunda imagen de BTR, la sonda se utilizó para realizar miles de nanoindentaciones y se sometió a cientos de millones de interacciones de punta y muestra mientras se obtenían imágenes de una variedad de materiales rígidos (E > 15 GPa), incluida la madera (pino loblolly), el esquisto, el grafito pirolítico altamente ordenado (HOPG) y varias películas delgadas de grafeno. Significativamente, el radio de punta estimado cambió en ~ 1 nm entre las dos imágenes en la Figura 8E, F, que está dentro del error⁶³ del método BTR. Aunque no es un estudio completo, esta comparación demuestra la excelente durabilidad de una sonda de diamante en condiciones normales de nanoindentación experimental (e incluso imágenes). Los principales inconvenientes asociados con el uso de puntas de diamante (más allá del costoso costo inicial) son el aumento del radio de la punta y, en algunos aspectos más preocupantes, la baja relación de aspecto de la geometría de la esquina del cubo de la mayoría de las puntas de diamante disponibles comercialmente. La Figura 11A,B presenta imágenes AFM comparativas lado a lado de la misma área de una muestra de esquisto de Bakken adquirida con una sonda de silicio afilada con un radio de punta nominal de 8 nm y un ángulo medio promedio de ~19° frente a una sonda de punta de diamante con un radio de punta nominal de 40 nm y un ángulo lateral promedio de 47°. Cuando se comparan las áreas ampliadas (Figura 11C, D y Figura 11E, F), es evidente que la sonda de punta de diamante no puede resolver y rastrear con precisión las características más pronunciadas (relación de aspecto más alta) dentro de la imagen. En cambio, cuando hay características empinadas, la pared lateral de la punta hace contacto con el borde superior y el sistema AFM esencialmente rastrea la pared lateral de la sonda hasta que el extremo de la punta vuelve a hacer contacto con la superficie y se reanuda el seguimiento normal.

Coincidencia de constante/módulo de resorte
Como se mencionó anteriormente, la constante de resorte del voladizo de la sonda debe coincidir con el rango esperado de módulos elásticos a medir. Para ayudar a elegir una sonda apropiada, la Tabla 3 presenta constantes de resorte en voladizo nominales nominales sugeridas adecuadas para amplios rangos seleccionados de módulos elásticos de muestra esperados que van desde pocos MPa hasta 100 GPa en el caso de puntas de sonda de radio ~ 30-40 nm a menudo empleadas para la nanoindentación⁵². Las sondas de resorte constante inferior (k < 0,1 N/m) están disponibles para materiales aún más blandos (rango de kPa), como las células.

Constante de resorte (N/m)	Rango de módulo de muestra esperado
0.25	≤ 15 MPa
5	5 – 500 MPa
40	200 – 8.000 (0,2 – 8 GPa)
200	1.000 – 50.000 (1 – 50 GPa)
450	10.000 – 100.000 (10 – 100 GPa)

Tabla 3: Constantes de resorte de sonda ideales para medir varios rangos de módulo. Constantes de resorte de sonda nominales aproximadas para una medición óptima de módulos elásticos en rangos variables desde pocos MPa hasta 100 GPa, suponiendo un radio de sonda típico de ~ 30-40 nm⁵².

Además de la constante de resorte, en el caso especial de materiales biológicos, el radio de la punta y las fuerzas aplicadas durante la obtención de imágenes y la nanoindentación deben considerarse cuidadosamente para evitar daños. En el ejemplo de aplicación que involucra la medición de las propiedades mecánicas de las bicapas lipídicas que contienen colesterol, presentado en la sección de resultados representativos, se utilizó específicamente una punta relativamente afilada (10 nm) para el análisis de la fuerza de avance en bicapas lipídicas. Por el contrario, si el ROI del material es lo suficientemente grande (por ejemplo, como es el caso de las células y los núcleos celulares) y existe preocupación con respecto al potencial de punción, las puntas hemisféricas a escala micrométrica más grandes, como las utilizadas en las mediciones de rigidez en núcleos MSC descritas en uno de los ejemplos de aplicación en la sección de resultados representativos son ideales y proporcionan excelentes resultados para los blandos, muestras frágiles como células vivas y núcleos aislados. Kain et al. presentan una discusión en profundidad sobre cómo elegir la combinación óptima de radio de sonda y constante de resorte para lograr la mayor sensibilidad de medición posible para tales muestras⁶⁴.

Calibración de la sonda
Sensibilidad a la deflexión
La sensibilidad de deflexión relaciona el movimiento del piezo Z (y, por lo tanto, la deflexión del voladizo cuando se sangra sobre un sustrato infinitamente rígido, suponiendo el funcionamiento en el límite de pequeñas deflexiones) con un cambio medido en el voltaje en el PSD⁶⁵. La sensibilidad de deflexión (también denominada a veces sensibilidad de palanca óptica inversa [InvOLS]) puede informarse en nm/V o V/nm. A continuación se proporciona una descripción general de los métodos de calibración de sensibilidad de deflexión más comunes.

Contacto con superficies duras
El método más fácil y popular para determinar la sensibilidad a la deflexión del láser de rebote del haz / sonda AFM / sistema PSD es el acertadamente llamado método de "contacto de superficie dura"⁶⁵. Su simplicidad, facilidad de integración en los flujos de trabajo del software de control AFM y naturaleza in situ se suman al atractivo y uso generalizado del método de contacto de superficie dura. Para implementar este método, la punta de la sonda AFM se rampa contra un material mucho más rígido que el voladizo. La pendiente de la parte en contacto de la curva fuerza-desplazamiento (mostrada como voltios de señal de error de deflexión vertical en el PSD en función del movimiento piezoeléctrico Z en nm o voltaje aplicado) da entonces la sensibilidad de deflexión (Figura 3A). El uso de un sustrato rígido asegura que toda la deflexión medida surja de la flexión del voladizo en lugar de una convolución de la deformación de la muestra y el desplazamiento del voladizo. En el caso de los voladizos blandos (por ejemplo, k < 10 N/m), el silicio (E ≈ 170 GPa)²⁷ o la mica¹⁷ son materiales de fácil acceso y fácil uso (o, alternativamente, vidrio, E≈ 70 GPa, o plástico adecuadamente duro en el caso de células inmovilizadas en un portaobjetos de microscopio o placa de Petri), mientras que para voladizos más rígidos, como los utilizados para algunos experimentos de nanoindentación (por ejemplo, k > 200 N/m; Tabla 3), puede ser necesario utilizar zafiro (E≈ 345 GPa)^26,66 para garantizar que no se produzca ninguna deformación de la muestra. Debido a que este método depende de la medición de fuerza-desplazamiento, el Z-piezo del escáner AFM debe emplear un sensor de altura de bucle cerrado o estar bien calibrado (si funciona en modo de bucle abierto) utilizando una variedad de estándares de altura. El mayor contribuyente al error en el método de contacto con la superficie dura es el movimiento del punto láser en el voladizo debido a las fluctuaciones térmicas. Los cambios en la temperatura del voladizo son más comúnmente causados por el láser de detección, aunque el calentamiento Joule en la electrónica circundante también puede contribuir. Se han reportado diferencias de temperatura general de 6 °C entre el voladizo y el aire ambiente, lo que puede conducir a cambios puntuales del láser de varias micras⁶⁷. Para tener en cuenta cualquier calentamiento, es aconsejable esperar ≥30 minutos después de la alineación inicial del punto láser para permitir que el voladizo entre en equilibrio térmico con su entorno para obtener los mejores y más precisos resultados. Promediar las pendientes de las curvas de aproximación y retirada para cada medición de sensibilidad tendrá en cuenta cualquier fricción de la punta o efectos de deslizamiento y debe promulgarse si es posible⁶⁸. Además, promediar múltiples mediciones de sensibilidad ayudará a medir la confiabilidad y reproducibilidad de la medición. Las buenas mediciones de sensibilidad deben dar lugar a desviaciones del ≤1% y realizarse aproximadamente a la misma deflexión que las nanosangrías experimentales esperadas para maximizar la eficacia de la calibración⁶⁹. El principal inconveniente del método de contacto con la superficie dura es que el contacto físico necesario para la calibración puede causar daños a las frágiles puntas de silicio (por ejemplo, embotamiento o creación de artefactos de punta como una punta doble).

Método de ruido térmico
El método de ruido térmico para determinar la sensibilidad a la deflexión requiere una calibración previa de la constante de resorte en voladizo y la capacidad de medir el espectro de ruido térmico del voladizo⁶⁷. El método de ruido térmico a menudo se integra en el software de control AFM moderno y se puede utilizar junto con el método Sader (ver más abajo) para un análisis y cálculo rápidos tanto de la constante de resorte como de la sensibilidad de deflexión. Sin embargo, puede ser difícil o imposible utilizar el método de ruido térmico en voladizos más rígidos (k > 10 N/m) debido a la disminución de la amplitud de la vibración. Además, la incertidumbre relativa reportada del método de ruido térmico es significativamente mayor, ~ 20% en comparación con el método de contacto con la superficie dura descrito anteriormente⁷⁰. Esta técnica no se puede utilizar si se emplea el método de ajuste térmico para determinar la constante de resorte que se describe a continuación⁶⁷.

Constante de resorte
El estándar de oro para medir las constantes de resorte en voladizo es la vibrometría láser Doppler (LDV), y ahora hay muchas sondas disponibles comercialmente que vienen con información de calibración constante de resorte derivada de LDV proporcionada por el fabricante para cada sonda individual (consulte la Tabla de materiales). Sin embargo, aunque la medición precisa de la constante de resorte en voladizo es una necesidad absoluta para las mediciones nanomecánicas cuantitativas, los métodos prácticos para hacerlo en el laboratorio típico para sondas no calibradas son muy variados y pueden ser algo complejos. Como tal, solo se proporciona una breve descripción de los dos métodos de calibración constante de resorte in situ más comunes, con una lista de métodos adicionales y citas bibliográficas apropiadas para consultar para obtener más información.

Método de ajuste térmico
Probablemente el método más común disponible en los AFM comerciales de hoy en día, el método de ajuste térmico para determinar las constantes de resorte en voladizo está integrado en el software de control para muchos sistemas. Aunque no es ideal para voladizos más rígidos (k > 10 N/m) debido a la detección reducida de la deflexión en voladizo y al ancho de banda electrónico limitado, el método de ajuste térmico es relativamente fácil de implementar y es válido para una amplia gama de geometrías de punta⁷¹. El método de sintonía térmica utiliza la medición y el ajuste del espectro de ruido térmico del voladizo, seguido de la aplicación del teorema de equipartición para calcular la energía potencial del voladizo, con el voladizo generalmente modelado como un oscilador armónico simple⁷². El método de ajuste térmico tiene un error de ~ 5% -10% para sondas blandas y es aplicable para cualquier forma en voladizo^73,74. Para obtener información más detallada, consulte las referencias citadas en esta sección.

Método Sader
El método Sader es otro método a menudo integrado en el software de control de muchos AFM modernos^75,76,77. El método Sader utiliza la carga hidrodinámica experimentada por un voladizo cuando vibra en un medio fluido (generalmente aire o agua) junto con las dimensiones de la vista en planta del voladizo y el factor de calidad para calcular la constante del resorte en voladizo. El método de Sader conduce a un error de ~10%-15% para la constante de resorte en voladizo⁷⁴. Los documentos correspondientes sobre el "método original"76,78, el "método general"^79, una extensión del método general⁷⁷ y la documentación específica del instrumento pueden proporcionar más detalles.

Otros métodos
Hay varios otros métodos que se han desarrollado e implementado para determinar la constante de resorte de los voladizos AFM que están más allá del alcance de este documento. Aunque ninguno de estos métodos es tan fácil de implementar o tan extendido como los métodos de calibración Sader o de ajuste térmico, cada uno posee ventajas y desventajas únicas; La literatura citada proporciona detalles sobre su aplicación e implementación. En particular, Sikora proporciona una excelente revisión de muchos métodos de calibración constante de resorte y es un excelente recurso sobre el tema⁷². Una lista no exhaustiva de otros métodos para determinar las constantes de resorte incluye vibrometría láser Doppler (LDV)73,74,80, dispositivos basados en sistemas microeléctricos-mecánicos (MEMS) 81, voladizo de referencia 82,83, masa agregada (tanto dinámica 75 como estática ⁸⁴), balanza de precisión^85,86, accionamiento electromagnético ⁸⁷ y análisis de elementos finitos (FEA) ^88,89.

Radio de punta
Los métodos comunes para determinar el radio de la punta incluyen tanto la imagen SEM de electrones secundarios como el método de reconstrucción de punta ciega (BTR).

Análisis SEM
Las imágenes SEM de electrones secundarios pueden proporcionar una resolución de hasta 1 nm, lo que permite comparar directa y fácilmente las imágenes progresivas del desgaste. Una desventaja de las imágenes SEM es que debido a que solo existen herramientas AFM-SEM combinadas altamente experimentales⁹⁰, la sonda AFM generalmente debe desmontarse y transportarse al SEM para su análisis, lo que puede llevar mucho tiempo y potencialmente someter a la sonda a contaminación. Otra desventaja de SEM es que la imagen resultante es inherentemente una proyección 2D de la punta, sin información cuantitativa 3D disponible. Se debe tener cuidado de alinear la sonda en la misma orientación exacta cada vez para que los resultados comparativos sean significativos, ya que incluso pequeños cambios en el ángulo incidente del haz de electrones pueden alterar el tamaño aparente y la forma de la punta de la sonda. Finalmente, las imágenes SEM pueden estar plagadas de efectos de carga y contaminación de carbono, que pueden difuminar la imagen o causar cambios físicos en la punta de la sonda, respectivamente.

Reconstrucción de punta ciega
A diferencia de SEM, el método BTR es una técnica in situ en la que la geometría de la punta 3D se modela en función de la obtención de imágenes de una muestra con numerosas características nítidas (alta relación de aspecto) mucho más pequeñas que el radio de la sonda. Este método funciona porque en AFM, la imagen observada es siempre una convolución de la forma de la punta de la sonda y la forma de la característica de la muestra, por lo que al modelar características extremadamente nítidas como infinitamente nítidas, se puede estimar la forma de la punta. Desafortunadamente, además de la suposición de picos infinitamente afilados (es decir, características de la superficie mucho más pequeñas que el radio de la punta), la técnica BTR puede verse influenciada por el ruido de la imagen y los parámetros de escaneo, por lo que las imágenes comparativas deben obtenerse utilizando parámetros de imagen muy similares. Además, debido a que se utilizan múltiples "imágenes" de la punta para reconstruir su geometría, es imposible un cálculo inverso directo uno a uno de la forma de la punta. Debido a su naturaleza, el método BTR solo es prácticamente capaz de informar al usuario del límite superior de la forma de la punta⁶³, y el acto de obtener imágenes de la sonda para implementar el método BTR puede provocar un desgaste de la punta (por ejemplo, embotamiento o astillado de la punta de la sonda).

Calibración relativa
A veces, una propiedad de sonda en particular no se puede medir de manera fácil y precisa. Por ejemplo, la constante de resorte de los voladizos más rígidos es difícil o imposible de medir con el método de sintonía térmica debido a las limitaciones de ancho de banda y deflexión⁹¹. Como se discutió anteriormente, existen otros métodos para determinar la constante de resorte, pero debido a que el método de ajuste térmico está integrado en muchos AFM modernos, a menudo se implementa para un uso diario simple. Del mismo modo, la sensibilidad a la deflexión siempre debe calibrarse antes de la experimentación para la conversión del movimiento láser en el PSD a la deflexión física del voladizo de la sonda. En términos prácticos, sin embargo, la medición del radio de la punta es el paso de calibración que más tiempo consume y el que tiene más probabilidades de dañar la punta de la sonda. Si no es posible medir directamente el radio de la punta a través de SEM o BTR, entonces se puede utilizar un procedimiento de calibración relativo como alternativa para determinar el radio efectivo de la punta, siempre que se disponga de una muestra de referencia estándar con una rugosidad superficial mínima (idealmente atómicamente plana) y un módulo bien conocido cercano al módulo experimental esperado. Ejemplos de tales patrones de referencia ideales para la calibración relativa incluyen la mica moscovita 17,92,93,94,95 y HOPG ^96, pero también sirven para resaltar la dificultad de identificar patrones de referencia adecuados para muestras más blandas con módulos en el rango de kPa a MPa. Para realizar una calibración relativa, primero se debe calibrar la sensibilidad de deflexión como se describe en el protocolo principal. En segundo lugar, la constante de resorte nominal para la sonda debe ingresarse (generalmente suministrada con la sonda) o medirse a través de uno de los métodos descritos anteriormente. El tercer paso es la sangría en la superficie de la muestra estándar de referencia del módulo utilizando los parámetros apropiados. Finalmente, los datos recopilados de la curva F-D deben analizarse y ajustarse el parámetro del radio de punta hasta que el módulo reducido medido experimentalmente coincida con el módulo reducido esperado. Debe tenerse en cuenta la profundidad media de deformación alcanzada en la muestra de referencia, ya que esta profundidad debe mantenerse al sangrar en la muestra experimental de interés para que la calibración sea pertinente. Ahora, puede producirse una hendidura en la muestra de interés, ajustando los parámetros de la rampa para que coincidan con la profundidad de deformación alcanzada en el material de referencia estándar del módulo.

Una ventaja del método de calibración relativa es que evita posibles errores acumulados causados por una calibración inexacta de la sensibilidad a la deflexión, la constante de resorte y el radio de punta⁵². Además, es quizás un poco más rápido y menos probable que dañe la sonda que el método BTR. Los mayores inconvenientes del método de calibración relativa son: 1) la necesidad de una muestra de referencia de alta calidad con rugosidad superficial a escala de nm a Angstrom y propiedades mecánicas bien conocidas similares a las de la muestra de interés que puedan analizarse con la misma sonda que la muestra experimental, y 2) el requisito de lograr la misma o muy similar profundidad de deformación tanto en las muestras de referencia como en las experimentales para que la calibración sea válida. En consecuencia, es preferible medir directamente el radio de la punta si es posible.

Análisis de datos
El método de análisis utilizado para determinar las propiedades mecánicas de la muestra a partir de las curvas F-D medidas es tan importante como la calidad de los propios datos de nanoindentación. Existen varias teorías mecánicas de contacto comunes que modelan las relaciones fuerza-desplazamiento basadas en diferentes suposiciones subyacentes (y, por lo tanto, aplicables en diferentes escenarios). Estos modelos de mecánica de contacto incluyen Hertz 97, Sneddon 28, JKR (Johnson, Kendall y Roberts)⁹⁸, DMT (Derjaguin, Muller y Toporov) ^35,99, MD (Maugis-Dugdale) 100 y MYD (Muller, Yushchenko y Derjaguin) ^101,102. Un análisis en profundidad y una comparación de varios modelos de mecánica de contacto y su aplicación para el análisis se ha presentado en otra parte 29,30,103,104. Si bien está más allá del alcance de este documento, la Tabla 4 proporciona una breve descripción de algunos de los modelos de mecánica de contacto más comunes. Cabe destacar que los modelos más complejos como JKR, DMT y otros incorporan los efectos de la adhesión punta-muestra 30,35,98,99,100,101,102,103,104^, que pueden ser significativos y a menudo son fácilmente identificables por la aparición de deflexión negativa en la curva de fuerza (ver Figura 3). En la práctica, el modelo de análisis elegido se utiliza para ajustar los datos F-D recopilados y determinar las propiedades mecánicas, como el módulo elástico. Para ajustar adecuadamente los datos, es necesaria una línea de base plana para determinar el punto de contacto inicial o un punto de contacto efectivo que se ajuste a la parte de los datos experimentales con la mayor correlación con el modelo.

Teoría	Aplicabilidad	Suposiciones	Limitaciones
Hercio	Sencillo; A menudo se utiliza para muestras en fluido.	Sin adherencia.	No válido para sistemas que tienen fuerzas adhesivas presentes.
Derjaguin-Muller-Toporov (DMT)	Rígido con pequeñas deformaciones.	Adhesión de corto alcance en la región de contacto más adhesión de largo alcance fuera de la región de contacto.	La geometría restringida puede causar una subestimación del área de contacto.
Johnson-Kendall-Roberts (JKR)	Suave con grandes deformaciones.	Fuerzas adhesivas de corto alcance solo en la región de contacto.	Puede subestimar la carga debido a la adhesión.
Maugis – Dugdale (MD)	Esta solución general cubre los otros modelos de adhesivos.	Interfaz de muestra de punta modelada como una grieta.	Solución analítica que involucra ecuaciones paramétricas.

Tabla 4: Modelos comunes de mecánica de contacto. Modelos de mecánica de contacto comunes seleccionados con aplicabilidad, suposiciones y limitaciones anotadas.

La aplicación práctica de los modelos mencionados anteriormente para analizar curvas F-D requiere el uso de software informático para permitir el procesamiento por lotes a gran escala de miles o millones de curvas en un corto período de tiempo y realizar análisis estadísticos sobre los resultados. El código escrito interno se utiliza a menudo en el análisis de datos F-D, y varios fabricantes de AFM también proporcionan paquetes de software. Sin embargo, debido a su naturaleza de código abierto, facilidad de uso e información complementaria detallada, los autores recomiendan el uso de AtomicJ²³. El programa permite un análisis simple y preciso de los datos de F-D utilizando cualquiera de las teorías descritas anteriormente, así como varias otras. Debido a que el código es de código abierto, es fácil de manipular y personalizar para casos de uso específicos sin la necesidad de crear código complejo desde cero. Consulte Hermanowicz et ^al.23 para obtener información detallada sobre el paquete de software AtomicJ.

En conclusión, a través de una calibración cuidadosa de la sonda, el área de contacto y la fuerza aplicada por una punta de sonda AFM a una superficie de muestra se pueden cuantificar para permitir la determinación de las propiedades mecánicas a nanoescala, en particular el módulo elástico. Se ha presentado un protocolo generalizado que destaca las mejores prácticas para implementar con éxito la nanoindentación basada en voladizo AFM en aire o fluido en muestras blandas y duras, con módulos elásticos que van desde kPa hasta GPa, con ejemplos representativos. Se han discutido consideraciones importantes como la selección de la sonda (incluida la rugosidad de la superficie de la muestra, los tamaños de las características, la relación de aspecto de la sonda y el desgaste de la punta), la calibración de la sonda y el análisis de datos (incluidos los modelos de mecánica de contacto y las estadísticas de medición). Finalmente, se ha demostrado la colocalización de mapas nanomecánicos derivados de AFM con otras técnicas de caracterización que proporcionan información de composición como SEM / EDS, así como un ejemplo de medición de una propiedad nanomecánica distinta del módulo elástico (es decir, fuerza de ruptura de la bicapa lipídica) a través de nanoindentación basada en voladizo AFM para proporcionar ejemplos de aplicaciones sinérgicas adicionales de la técnica. Tomados en conjunto, los ejemplos y la discusión proporcionados aquí deberían proporcionar un punto de entrada para los investigadores que buscan emplear nanoindentación basada en voladizo AFM para medir las propiedades mecánicas de prácticamente cualquier tipo de muestra.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Atomic force microscope	Bruker	Dimension Icon	Uses Nanoscope control software, including PeakForce Quantitative Nanomechanical Mapping (PF-QNM), FastForce Volume (FFV), and Point-and-Shoot Ramping experimental workspaces
AtomicJ	American Institute of Physics	https://doi.org/10.1063/1.4881683	Flexible, powerful, free open source Java-based force curve analysis software package. Supports numerous contact mechanic models, such as Hertz, Sneddon DMT, JKR, Maugis, and cone or pyramid (including blunt and truncated). Also includes a variety of initial contact point estimation methods to choose from. Supports batch processing of data and subsequent statistical analysis (e.g., averages, standard deviations, histograms, goodness of fit, etc.). Literature citation is: P. Hermanowicz, M. Sarna, K. Burda, and H. Gabry, “AtomicJ: An open source software for analysis of force curves” Rev. Sci. Instrum. 85: 063703 (2014), https://doi.org/10.1063/1.4881683
Buffer solution (PBS)	Fisher Chemical (NaCl), Sigma Aldrich (KCl), Fisher BioReagents (Na2HPO4 and KH2PO4)	S271 (>99% purity NaCl), P9541 (>99% purity KCl), BP332(>99% purity Na2HPO4), BP362 (>99% purity KH2PO4)	Phosphate buffered saline (PBS) was prepared in the laboratory as an aqueous solution consisting of 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, and 1.8 mM KH2PO4 dissolved in ultrapure water. Reagents were measured out using an analytical balance, and glassware was cleaned with soap and water followed by autoclaving immediately prior to use.
Chloroform
Diamond tip AFM probe	Bruker	PDNISP	Pre-mounted factory-calibrated cube corner diamond (E = 1140 GPa) tip AFM probe (nominal R = 40 nm) with a stainless steel cantilever (nominal k = 225 N/m, f0 = 50 kHz). Spring constant is measured at the factory (k = 256 N/m for the probe, Serial #13435414, used here) and calibration data (including AFM images of indents showing probe geometry) is provided with the probe.
Diamond ultramicrotome blade	Diatome	Ultra 35°	2.1 mm width. Also used a standard glass blade for intial rough cut of sample surface before transitioning to diamond blade for final surface preparation
Epoxy	Gorilla Glue	26853-31-6	Epoxy resin and hardner were mixed in a 1:1 ratio, a small drop was placed on a stainless steel sample puck (Ted Pella), and V1 grade muscovite mica (Ted Pella) was attached to create an atomically flat surface for preparation of phospholipid membranes.
Ethanol
LR white resin, medium grade (catalyzed)	Electron Microscopy Sciences	14381	500 mL bottle, Lot #150629
Mesenchymal stem cells (MSCs)	N/A	N/A	MSCs for nanomechanical studies were primary cells harvested from 8-10 week old male C57BL/6 mice as described in Goelzer, M. et al. "Lamin A/C Is Dispensable to Mechanical Repression of Adipogenesis" Int J Mol Sci 22: 6580 (2021) doi:10.3390/ijms22126580 and Peister, A. et al. "Adult stem cells from bone marrow (MSCs) isolated from different strains of inbred mice vary in surface epitopes, rates of proliferation, and differentiation potential" Blood 103: 1662-1668 (2004), doi:10.1182/blood-2003-09-3070.
Modulus standards	Bruker	PFQNM-SMPKIT-12M	Used HOPG (E = 18 GPa) and PS (E = 2.7 GPa). Also contains 2x PDMS (Tack 0, E = 2.5 MPa; Tack 4, E = 3.5 MPa), PS-LDPE (E = 2.0/0.2 GPa), fused silica (E = 72.9 GPa), sapphire (E - 345 GPa), and tip characterization (titanium roughness) sample. All samples come pre-mounted on a 12 mm diameter steel disc (sample puck).
Muscovite mica	Ted Pella	50-12	12 mm diameter, V1 grade muscovite mica
Nanscope Analysis	Bruker	Version 2.0	Free AFM image processing and analysis software package, but designed for, and proprietary/limited to Bruker AFMs; similar functionality is available from free, platform-independent AFM image processing and analysis software packages such as Gwyddion, WSxM, and others. Has built-in capabilities for force curve analysis, but AtomicJ is more flexible/full featured (e.g., more built-in contact mechanics models to choose from, statistical analysis of force curve fitting results, etc.) for force curve analysis and handles batch processing of force curves.
Phospholipids: POPC, Cholesterol (ovine)	Avanti Polar Lipids	POPC: CAS # 26853-31-6, Cholesterol: CAS # 57-88-5	POPC lipid dissolved in chloroform (25 mg/mL) was obtained from vendor and used without further purification. Cholesterol powder from the same vendor was dissolved in chloroform (20 mg/mL).
Probe holder (fluid, lipid bilayers)	Bruker	MTFML-V2	Specific to the particular AFM used; MTFML-V2 is a glass probe holder for scanning in fluid on a MultiMode AFM.
Probe holder (fluid, MSCs)	Bruker	FastScan Bio Z-scanner	Used with Dimension FastScan head (XY flexure scanners). Serial number MXYPOM5-1B154.
Probe holder (standard, ambient)	Bruker	DAFMCH	Specific to the particular AFM used; DAFMCH is the standard contact and tapping mode probe holder for the Dimension Icon AFM, suitable for nanoindentation (PF-QNM, FFV, and point-and-shoot ramping)
Sample Puck	Ted Pella	16218	Product number is for 15 mm diameter stainless steel sample puck. Also available in 6 mm, 10 mm, 12 mm, and 20 mm diameters at https://www.tedpella.com/AFM_html/AFM.aspx#anchor842459
Sapphire substrate	Bruker	PFQNM-SMPKIT-12M	Extremely hard surface (E = 345 GPa) for measuring deflection sensitivity of probes (want all of the deflection to come from the probe, not the substrate). Part of the PF-QNM/modulus standards kit.
Scanning electron microscope	Hitachi	S-3400N-II	Located at Boise State. Used to perform co-localized SEM/EDS on all samples except additively manufactured (AM) Ti-6Al-4V.
Silicon AFM probes (standard)	NuNano	Scout 350	Standard tapping mode silicon probe with reflective aluminum backside coating; k = 42 N/m (nominal), f0 = 350 kHz. Nominal R = 5 nm. Also available uncoated or with reflective gold backside coating. Probes with similar specifications are available from other manufacturers (e.g., Bruker TESPA-V2).
Silicon AFM probes (stiff)	Bruker	RTESPA-525, RTESPA-525-30	Rotated tip etched silicon probes with reflective aluminum backside coating; k = 200 N/m (nominal), f0 = 525 kHz. Nominal R = 8 nm for RTESPA-525, R = 30 nm for RTESPA-525-30. Spring constant of each RTESPA-525-30 is measured individually at the factory via laser Doppler vibrometry and supplied with the probe.
Silicon carbide grit paper (abrasive discs)	Allied	50-10005	120 grit
Silicon nitride AFM probes (soft, large radius hemispherical tip)	Bruker	MLCT-SPH-5UM, MLCT-SPH-5UM-DC	Also MLCT-SPH-1UM-DC. New product line of factory-calibrated (probe radius and spring constants of all cantilevers) large radius (R = 1 or 5 mm) hemispherical tip (at the end of a 23 mm long cylindrical shaft) probes. DC = drift compensation coating. 6 cantilevers/probe (A-F). Nominal spring constants: A, k = 0.07 N/m; B, k = 0.02 N/m; C, k = 0.01 N/m; D, k = 0.03 N/m; E, k = 0.1 N/m; F, k = 0.6 N/m.
Silicon nitride AFM probes (soft, medium sharp tip)	Bruker	DNP	4 cantilevers/probe (A-d). Nominal spring constants: A, k = 0.35 N/m; B, k = 0.12 N/m; C, k = 0.24 N/m; D, k = 0.06 N/m. Nominal radii of curvature, R = 10 nm.
Silicon nitride AFM probes (soft, sharp tip)	Bruker	ScanAsyst-Air	Nominal values: resonance frequency, f0 = 70 kHz; spring constant, k = 0.4 N/m; radius of curvature, R = 2 nm. Designed for force curve based AFM imaging.
Superglue	Henkel	Loctite 495	Cyanoacrylate based instant adhesive. Lots of roughly equivalent products are readily available.
Syringe pump	New Era Pump Systems	NE1000US	One channel syringe pump system with infusion and withdrawal capacity
Tip characterization standard	Bruker	PFQNM-SMPKIT-12M	Titanium (Ti) roughness standard. Part of the PF-QNM/modulus standards kit.
Ultrahigh purity nitrogen (UHP N2), 99.999%	Norco	SPG TUHPNI - T	T size compressed gas cylinder of ultrahigh purity (99.999%) nitrogen for drying samples
Ultramicrotome	Leica	EM UC6	Equipped with a glass blade (standard, for intial sample preparation) and a diamond blade (for final preparation)
Ultrapure water	Thermo Fisher	Barnstead Nanopure Model 7146	Model has been discontinued, but equivalent products are available. Produces ≥18.2 MΩ*cm ultrapure water with 1-5 ppb TOC (total organic content), per inline UV monitoring. Includes 0.2 µm particulate filter, ion exchange columns, and UV oxidation chamber.
Variable Speed Grinder	Buehler	EcoMet 3000	Used with silicon carbide grit papers during hand polishing.
Vibration isolation table (active)	Herzan	TS-140	Used with Bruker MultiMode AFM. Sits on a TMC 65-531 vibration isolation table. Bruker Dimension Icon AFM utilizes strictly passive vibration isolation (comes from manufacturer with custom acoustic hood, air table, and granite slab).
Vibration isolation table (passive)	TMC	65-531	35" x 30" vibration isolation table with optional air damping (disabled). Used with Bruker MultiMode AFM. Herzan TS-140 "Table Stable" active vibration control table is located on top.