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Engineering

原子力显微镜悬臂式纳米压痕：空气和流体中纳米级机械性能测量

Published: December 2, 2022 doi: 10.3791/64497
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 4, 5, 4, 6, 6, 3,7, 2, 1,8
1Micron School of Materials Science & Engineering, Boise State University, 2Department of Mechanical & Biomedical Engineering, Boise State University, 3Department of Physics, Boise State University, 4Energy and Environmental Science and Technology, Idaho National Laboratory, 5Science and Technology, Idaho National Laboratory, 6Harold Hamm School of Geology & Geological Engineering, University of North Dakota, 7Biomolecular Sciences Graduate Program, Boise State University, 8Center for Advanced Energy Studies

Summary

量化原子力显微镜（AFM）探针尖端施加到样品表面的接触面积和力，可以确定纳米级机械性能。讨论了在软硬样品的空气或流体中实施基于AFM悬臂的纳米压痕的最佳实践，以测量弹性模量或其他纳米力学性能。

Abstract

原子力显微镜（AFM）从根本上测量纳米级AFM探针尖端与样品表面之间的相互作用。如果探针尖端施加的力及其与样品的接触面积可以量化，则可以确定被探测表面的纳米级机械性能（例如，弹性或杨氏模量）。这里提供了进行定量AFM悬臂式纳米压痕实验的详细程序，并提供了如何应用该技术来确定从kPa到GPa的各种样品类型的弹性模量的代表性示例。这些包括生理缓冲液中的活间充质干细胞（MSCs）和细胞核，树脂嵌入的脱水松横截面以及不同成分的Bakken页岩。

此外，基于AFM悬臂的纳米压痕用于探测磷脂双层的断裂强度（即突破力）。讨论了重要的实际考虑因素，例如方法选择和开发、探头选择和校准、感兴趣区域识别、样品异质性、特征尺寸和纵横比、尖端磨损、表面粗糙度以及数据分析和测量统计，以帮助正确实施该技术。最后，证明了AFM衍生的纳米力学图与电子显微镜技术的共定位，该技术提供了有关元素组成的附加信息。

Introduction

了解材料的机械性能是工程中最基本和最重要的任务之一。对于散装材料性能的分析，有许多方法可用于表征材料系统的机械性能，包括拉伸试验1，压缩试验2和三点或四点弯曲（弯曲）试验3。虽然这些微观测试可以提供有关散装材料特性的宝贵信息，但它们通常是在失败的情况下进行的，因此具有破坏性。此外，它们缺乏准确研究当今感兴趣的许多材料系统的微米和纳米级特性所需的空间分辨率，例如薄膜，生物材料和纳米复合材料。为了开始解决大规模机械测试的一些问题，主要是其破坏性，从矿物学中采用了显微硬度测试。硬度是衡量材料在特定条件下对塑性变形的抵抗力的指标。通常，显微硬度测试使用通常由硬化钢或金刚石制成的硬探头压入材料中。然后可以使用所得压痕深度和/或面积来确定硬度。已经开发了几种方法，包括维氏硬度4、努氏硬度 5 和布氏硬度 6;每个都提供了微观材料硬度的测量，但在不同的条件和定义下，因此仅产生可以与在相同条件下进行的测试进行比较的数据。

开发了仪器化纳米压痕，以改进通过各种显微硬度测试方法获得的相对值，提高用于分析机械性能的空间分辨率，并能够分析薄膜。重要的是，通过利用Oliver和Pharr7首先开发的方法，可以通过仪器化纳米压痕确定样品材料的弹性或杨氏模量E。此外，通过使用Berkovich三面锥体纳米压痕探头（其理想的尖端面积函数与维氏四面锥体探头相匹配）8，可以直接比较纳米级和更传统的微米级硬度测量。随着AFM的普及，基于AFM悬臂的纳米压痕也开始受到关注，特别是在测量较软材料的机械性能方面。因此，如图1所示，目前用于询问和量化纳米级机械性能的两种最常用的技术是仪器化纳米压痕（图1A）和基于AFM悬臂的纳米压痕（图1B）9，后者是本工作的重点。

Figure 1
图 1：仪器化和基于 AFM 悬臂的纳米压痕系统的比较。 示意图描述了用于进行（A）仪器化纳米压痕和（B）基于AFM悬臂的纳米压痕的典型系统。这个数字是从钱等人51修改而来的。缩写：AFM = 原子力显微镜。 请点击此处查看此图的大图。

仪器化和基于AFM悬臂的纳米压痕都使用刚性探针使感兴趣的样品表面变形，并监测合力和位移作为时间的函数。通常，所需的负载（即力）或（Z压电）位移曲线由用户 通过 软件界面指定并由仪器直接控制，而另一个参数则被测量。最常从纳米压痕实验中获得的机械性能是弹性模量（E），也称为杨氏模量，它具有压力单位。材料的弹性模量是与粘结刚度有关的基本属性，定义为在塑性变形开始之前，拉伸或压应力（σ，每单位面积施加的力）与轴向应变（ε，沿压痕轴的比例变形）之比（即可逆或暂时）变形（方程 [1]）：

Equation 1（1）

应该注意的是，由于许多材料（特别是生物组织）实际上是粘弹性的，因此实际上，（动态或复杂）模量由弹性（存储，同相）和粘性（损失，异相）成分组成。在实际操作中，在纳米压痕实验中测量的是还原模量 E*，它与目标的真实样品模量 E有关，如公式（2）所示：

Equation 2（二）

其中 E 尖端和 ν 尖端分别是纳米压痕尖端的弹性模量和泊松比，ν 是样品的估计泊松比。泊松比是横向应变与轴向应变的负比，因此表示样品在承受轴向应变时（例如，在纳米压痕载荷期间）的横向伸长程度，如公式（3）所示：

Equation 3（三）

从降低模量转换为实际模量是必要的，因为a）压头尖端施加的一些轴向应变可以转换为横向应变（即，样品可能通过垂直于加载方向的膨胀或收缩而变形），以及b）压头不是无限硬的，因此压痕样品的行为导致尖端的一些（小）变形量。请注意，在E尖端>>E的情况下（即压头比样品硬得多，这在使用金刚石探头时通常是正确的），减少的样品模量和实际样品模量之间的关系大大简化为E ≈ E*（1 - v2）。 虽然仪器化纳米压痕在准确的力表征和动态范围方面具有优势，但基于AFM悬臂的纳米压痕速度更快，提供更高数量级的力和位移灵敏度，可实现更高分辨率的成像和改进的压痕定位，并且可以同时探测纳米级的磁性和电学特性9.特别是，基于AFM悬臂的纳米压痕在纳米级软材料（例如，聚合物，凝胶，脂质双层和细胞或其他生物材料），极薄（亚μm）薄膜（基底效应可能取决于压痕深度）10，11和悬浮二维（2D）材料12，13，14（例如石墨烯）的纳米级机械性能方面具有优越性15，16，云母17，六方氮化硼（h-BN）18或过渡金属硫族化物（TMDC;例如MoS2）19。这是由于其精细的力（sub-nN）和位移（sub-nm）灵敏度，这对于准确确定初始接触点并保持在弹性变形区域内非常重要。

在基于AFM悬臂的纳米压痕中，AFM探针向样品表面的位移由校准的压电元件驱动（图1B），柔性悬臂最终由于与样品表面接触时经历的电阻力而弯曲。悬臂的这种弯曲或偏转通常通过将激光从悬臂背面反射到光电探测器（位置敏感探测器 [PSD]）中来监测。再加上悬臂刚度（以nN / nm为单位）和偏转灵敏度（以nm/V为单位）的知识，可以将测量的悬臂挠度（以V为单位）转换为施加在样品上的力（以nN为单位）。接触后，Z-压电运动和悬臂偏转之间的差异会产生样品压痕深度。结合尖端面积功能的知识，可以计算尖端-样品接触面积。然后可以使用适当的接触力学模型（请参阅讨论的 数据分析 部分）拟合所得力-距离或力-位移（F-D）曲线的接触部分的斜率，以确定样品的纳米力学性能。虽然基于AFM悬臂的纳米压痕与上述仪器化纳米压痕相比具有一些明显的优势，但它也带来了一些实际实施挑战，例如校准，尖端磨损和数据分析，本文将对此进行讨论。基于AFM悬臂的纳米压痕的另一个潜在缺点是假设线性弹性，因为接触半径和压痕深度需要远小于压头半径，这在使用纳米级AFM探头和/或表现出显着表面粗糙度的样品时可能难以实现。

传统上，纳米压痕仅限于单个位置或小网格压痕实验，其中选择所需的位置（即感兴趣区域[ROI]）并且单个受控压痕，单个位置中的多个压痕由一些等待时间隔开，和/或以Hz量级的速率执行缩进的粗网格。然而，AFM的最新进展允许通过使用基于高速力曲线的成像模式（根据系统制造商的不同商品名称）同时获取机械性能和形貌，其中力曲线在负载控制下以kHz速率进行，最大尖端样品力用作成像设定点。还开发了傻瓜式方法，允许获取AFM形貌图像，然后在图像内的兴趣点进行选择性纳米压痕，从而对纳米压痕位置进行纳米级空间控制。虽然不是这项工作的主要重点，但代表性结果中提供了基于力曲线的成像和基于傻瓜悬臂的纳米压痕的特定 选定应用示例 ，并且可以与下面概述的协议结合使用（如果在采用的特定AFM平台上可用）。具体来说，这项工作概述了在任何有能力的AFM系统上实际实施基于AFM悬臂的纳米压痕的通用协议，并提供了该技术的四个用例示例（两个在空气中，两个在流体中），包括代表性结果和对细微差别的深入讨论，挑战和成功使用该技术的重要考虑因素。

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Protocol

注意：由于商用AFM种类繁多，并且基于悬臂的纳米压痕存在多种样品类型和应用，因此以下方案有意设计为相对通用的性质，侧重于所有悬臂式纳米压痕实验所需的共享步骤，无论仪器或制造商如何。正因为如此，作者假设读者至少对操作用于执行悬臂式纳米压痕的特定仪器具有基本的熟悉程度。然而，除了下面概述的一般协议外，还包括特定于AFM和此处使用的软件的详细分步标准操作程序（SOP）（参见材料 表），重点是悬臂式样品在流体中的纳米压痕，作为 补充材料。

1. 样品制备和仪器设置

  1. 在不改变感兴趣区域的机械性能的情况下，以最小化表面粗糙度（理想情况下为纳米级，比预期的压痕深度小~10倍）和污染的方式制备样品。
  2. 根据介质（即空气或流体）、预期模量、样品形貌和相关特征尺寸选择合适的AFM探针，对目标样品进行纳米压痕（请参阅讨论中的 探针选择注意事项 ）。将探头装载到探头支架上（参见 材料表），并将探头支架连接到AFM扫描头。
  3. 在AFM软件中选择合适的纳米压痕模式，使用户能够控制单个斜坡（即力-位移曲线）。
    注意：不同AFM制造商和单个仪器的具体模式会有所不同（有关更多详细信息和具体示例，请参阅 补充材料 中提供的SOP）。
  4. 将激光对准探头悬臂的背面，与探头尖端的位置相对并进入PSD。
    注意：有关对准激光和在流体中进行纳米压痕时的重要考虑因素的更多详细信息，请参阅间充质干细胞 应用示例 ，特别是避免漂浮的碎片和/或气泡，这些碎片和/或气泡会散射或折射光束。AFM光学元件可能还需要调整，以补偿流体的折射率，并避免在啮合表面时使探头崩溃。
    1. 通过最大化总电压，将激光束光斑居中悬臂背面（图2A）。
    2. 通过将 X 和 Y（即水平和垂直）偏转信号调整为尽可能接近零，将反射的激光束光斑居中在 PSD 上（图 2A），从而提供最大的可检测偏转范围，以产生与悬臂偏转成比例的输出电压。
  5. 如果不确定样品形貌、表面粗糙度和/或表面密度（在薄片或颗粒的情况下），请在进行任何纳米压痕实验之前进行AFM形貌测量扫描，以确认样品的适用性，如步骤1.1和样品制备部分所述讨论。

Figure 2
图 2：位置敏感探测器监视器。 （A） PSD显示，指示在与样品表面接合之前，正确对准的激光从探头悬臂的背面反射到PSD的中心（如大总电压和没有垂直或水平偏转所证明的那样）（即探头与样品脱离接触）。（B）当悬臂偏转时（例如，当探头与样品接触时），垂直偏转电压增加。缩写：PSD = 位置敏感探测器;垂直 = 垂直;霍里兹 = 水平;AMPL = 振幅;不适用 = 不适用。 请点击此处查看此图的大图。

2. 探头校准

注意：使用悬臂纳米压痕期间收集的F-D曲线数据量化样品的机械性能需要三个值： 悬臂/ PSD系统的偏转灵敏度（DS ）（nm / V或V / nm）， 悬臂弹簧常数 （nN / nm）和探针 接触面积，通常以给定压痕深度下的有效探针尖端半径（nm）表示，小于球形探针的探头半径提示。

  1. 通过在极硬的材料（例如蓝宝石， E = 345 GPa）上斜坡来校准探头/AFM系统的DS，以便最小化样品的变形，从而在尖端 - 样品接触开始后测量的压电陶瓷Z运动仅转换为悬臂偏转。
    注意：DS校准必须在与计划的纳米压痕实验相同的条件下进行（即温度，介质等），以准确反映实验期间系统的DS。可能需要很长（30分钟）的激光预热期才能获得最大精度，以便有时间达到热平衡并建立稳定的激光输出功率和指向稳定性。 每次 重新对准激光时都必须重新测量 DS，即使使用相同的探头，因为 DS 取决于激光强度和悬臂上的位置，以及探头反射的质量（即探头背面涂层的退化会影响 DS）和 PSD20 的灵敏度。
    1. 在蓝宝石上设置并执行 DS 校准压痕，以实现与计划样品 压痕 大致相同的探头偏转（以 V 或 nm 为单位），因为测量的位移是尖端偏转角的函数，并且在大挠度时变为非线性。
    2. 确定DS（以nm/V为单位），或者从所得F-D曲线中初始接触点之后接触状态的线性部分的斜率确定 反向 光学杠杆灵敏度（以V/nm为单位），如图 3A所示。
    3. 重复斜坡至少 5 次，记录每个 DS 值。使用值的平均值以获得最大精度。如果测量的相对标准偏差（RSD）超过~1%，则重新测量DS，因为有时由于最初引入粘附力，前几条F-D曲线不理想。
    4. 如果探头悬臂的 弹簧常数 k 未经过工厂校准（例如， 通过 激光多普勒测振法 [LDV]），请校准弹簧常数。
      注意：热调谐方法最适合k<10 N/m的相对柔软的悬臂（有关替代方法的列表和说明，请参阅讨论的弹簧常数部分，特别是对于k>10 N/m的刚性悬臂）。如图3B，C所示，热调谐通常集成到AFM控制软件中。
  2. 如果探头没有出厂校准的尖端半径测量（例如， 通过 扫描电子显微镜[SEM]成像），则测量有效尖端半径 R。
    注意：测量尖端半径有两种常用方法（请参阅相应的讨论部分），但纳米级探针尖端最常见的方法是盲尖重建（BTR）方法，该方法利用粗糙度标准（参见材料表），其中包含许多极其尖锐（亚nm）特征，用于有效地对尖端进行成像，而不是尖端对样品进行成像。
    1. 如果使用BTR方法，请使用慢速扫描速率（<0.5 Hz）和高反馈增益对粗糙度（尖端表征）样品进行成像，以帮助优化对非常清晰的特征的跟踪。根据预期的尖端半径选择图像尺寸和像素密度（分辨率）（例如，3 μm x 3 μm区域的1024 x 1024像素图像将具有~3 nm横向分辨率）。
    2. 使用AFM图像分析软件（参见材料表）对探针尖端进行建模，并在预期的样品压痕深度处估计其末端半径和有效尖端直径，如图3D-F所示。
  3. 完成探头校准后，在仪器软件中输入 DS、 k 和 R 值，如图 4A 所示。
    1. 输入样品泊松比 ν 的估计值，以便将测量的还原模量转换为实际样本模量9。如果采用基于尖端形状和压痕深度的圆锥形或圆锥形接触力学模型，则还需要输入尖端半角（图4C）。
      注意：模量对估计泊松比中的小误差或不确定性相对不敏感。ν = 0.2-0.3的估计值是许多材料的良好起点21。

Figure 3
图 3：探头校准。 （A） 偏转灵敏度测定。在蓝宝石衬底（E = 345 GPa）上进行的具有代表性的偏转灵敏度测量的结果，用于具有反射背面铝涂层的标准攻丝模式探头（标称k = 42 N/m;参见材料表）。图中显示了测量的进近（蓝色迹线）和退刀或退线（红色迹线）曲线。测得的偏转灵敏度为59.16 nm/V，通过拟合捕捉接触点和转弯点之间的接近曲线来确定，如垂直虚线之间的区域所示。在拉开表面之前，缩回/退缩曲线中明显的负向偏转区域表明尖端-样品粘附。（乙，丙）热调谐。代表性悬臂热噪声光谱（蓝色迹线）与两个不同探头的相应拟合（红色迹线）。（B） 基于标准力曲线的AFM成像探头（见材料表）的热调谐设置和拟合参数，其标称弹簧常数k = 0.4 N / m用作初始猜测。悬臂热噪声频谱的拟合产生f 0 = 79.8 kHz的基波谐振频率，这与f0 = 70 kHz的标称值相当吻合。测得的Q因子为58.1。拟合优度 （R2 = 0.99） 基于拟合与两条垂直红色虚线之间的数据的一致性。请注意，了解并输入环境温度和挠度灵敏度以获得准确的结果非常重要。（C） 悬臂热噪声频谱和相应的拟合（即热调谐），计算出用于对活细胞和分离的细胞核进行纳米力学测量的极软悬臂的弹簧常数 k = 0.105 N/m。请注意，~2-3 kHz的固有谐振频率明显较低。（D-F）盲尖重建。金刚石尖端探头的代表性盲尖重建工作流程（标称R = 40 nm;参见材料表）。（D） 尖端表征样品的 5 μm x 5 μm 图像，由一系列极其锋利的 （亚纳米） 钛尖峰组成，用于对 AFM 探针尖端进行成像。（E）探针尖端的结果重建模型（倒置高度图像）。（F） 盲尖重建拟合结果，包括用户选择的距尖端顶点 8 nm 高度（即压痕深度 << R）处估计的端半径 R = 29 nm 和有效尖端直径 40 nm，通过将该高度的针尖-样品接触面积转换为假设圆形轮廓的有效直径（即， A = πr 2 = π（d/2）2），用于球面接触力学模型。缩写：AFM = 原子力显微镜;ETD = 有效尖端直径。请点击此处查看此图的大图。

Figure 4
图 4：软件接口输入。 （A） 探头校准常数。软件用户界面（参见 材料表）用于输入测量的偏转灵敏度、弹簧常数和尖端半径，以实现定量纳米力学测量。探针和样品的泊松比对于从悬臂式纳米压痕力曲线计算样品的弹性或杨氏模量是必需的。（B） 坡道控制窗口。软件用户界面（参见 材料表），用于设置基于悬臂的纳米压痕实验，分为描述斜坡本身（即压痕曲线）、仪器触发（例如力与位移控制）、后续力分析和移动限制的参数（通过缩小 A/D 转换器在控制 Z 压电和读取 PSD 偏转时必须操作的范围来提高测量灵敏度）。（C） 如果使用圆锥形、金字塔形或圆锥形接触力学模型（例如 Sneddon），则尖端半角（基于探头几何形状或直接测量）很重要。 请点击此处查看此图的大图。

3. 收集力-位移 （F-D） 数据

注意：此处提供的参数值（见 图4B）可能因给定样品的力和压痕范围而异。

  1. 在AFM头下导航样品，并在所需的感兴趣区域接合。
    1. 监测垂直偏转信号（图2B）或执行小（~50-200nm）初始斜坡（图4B）以验证尖端和样品是否接触（见图5A）。
    2. 稍微向上调整AFM头部位置（步长相当于全斜坡尺寸的~50%）并再次斜坡。重复直到尖端和样品刚好不接触，如几乎平坦的斜坡（图5B）和悬臂的最小垂直偏转（图2A）所证明的那样。
    3. 一旦不存在明显的针尖-样品相互作用（比较图2A和图2B），将AFM头降低相当于斜坡尺寸的~50%-100%，以确保探头在手动移动AFM头时不会撞到样品中。再次斜坡，重复直到观察到良好的曲线（图5D）或类似于图5C的曲线。在后一种情况下，执行一次额外的小的AFM降头调整，等于斜坡尺寸的~20%-50%，以获得良好的接触和类似于图5D所示的力曲线。
  2. 调整斜坡参数（如下所述，如 图 4B） 以针对仪器、探头和样品进行优化，并获得类似于 图 5D.
    1. 根据样品（例如厚度、预期模量、表面粗糙度）和所需的压痕深度选择合适的斜坡尺寸（即，通过一个斜坡周期的总Z压电运动）。
      注意：对于较硬的样品，可能会发生较少的样品变形（因此对于给定的Z压电运动，探针偏转更大），因此斜坡尺寸通常可以小于较软的样品。刚性样品和悬臂的典型斜坡尺寸可能为数十纳米，而软样品和悬臂的斜坡尺寸可能为数百纳米至几微米;具体选定的 应用示例 在代表性结果部分提供。请注意，最小和最大可能的斜坡尺寸取决于仪器。
    2. 选择合适的斜坡速率（1 Hz是大多数样品的良好起点）。
      注意：斜坡速率可能受到控制和/或检测电子速度/带宽的限制。结合斜坡尺寸，斜坡速率决定了倾斜速度。在压痕软材料时，尖端速度尤为重要，因为粘弹性效应可能导致滞后伪影9，22。
    3. 选择是采用触发（负载控制）还是非触发（位移控制）斜坡。
      注意：在触发斜坡中，系统将以用户定义的步骤（基于斜坡大小和分辨率或数据点数量）接近样品，直到检测到所需的触发阈值（即设定点力或悬臂偏转），此时系统将缩回其原始位置并显示F-D曲线。在未触发斜坡中，系统只需将Z压电二极管延长用户定义的斜坡尺寸指定的距离，并显示测量的F-D曲线。对于大多数用例，触发斜坡是首选，但在研究没有尖锐、易于识别的接触点的软材料时，未触发斜坡可能很有用。
      1. 如果选择了触发斜坡，请设置触发阈值（用户定义的最大允许力或斜坡偏转），以在样品中产生所需的压痕。
        注意：使用触发阈值意味着斜坡可能会在达到指定的完整斜坡尺寸（Z-压电延伸）之前终止（即，探头可能开始缩回）。值范围从几nN到几μN，具体取决于针尖样品系统。
      2. 设置斜坡位置以确定Z压电陶瓷最大范围内将用于执行 斜坡 的部分。确保 斜坡尺寸的总 范围不会在最大Z压电效应范围之外开始或结束（参见 图6中的代表性示例），否则F-D曲线的一部分将不代表任何物理测量值（即，Z压电陶瓷将完全伸展或缩回，而不是移动）。
    4. 设置 每个斜坡的样本数 （例如，512个样本/斜坡）以实现所需的测量分辨率（即F-D曲线的点密度）。
      注意：最大采样/斜坡可能受到软件（文件大小）或硬件限制（例如，模拟到数字[A/D]转换速度，取决于斜坡速率）的限制。还可以限制允许的Z压电或偏转范围（参见 图4B中的限制参数），以提高系统A/D转换器的有效分辨率。
    5. 设置 X 旋转 以减少样品和尖端上的剪切力，方法是同时在 X 方向（平行于悬臂）上稍微移动探头，同时在 Z 方向（垂直于悬臂）上缩进。X旋转值等于探头支架相对于表面法线的偏移角度（典型值为12°）。
      注意：X 旋转是必要的，因为悬臂以相对于表面的小角度安装在探头支架中，以允许入射激光束反射到 PSD 中。此外，探头尖端的前后角度可能彼此不同（即，探针尖端可能是不对称的）。更具体的信息可以从各个探头和AFM制造商处获得。

Figure 5
图 5：在啮合后优化针尖-样品分离以获得良好的力曲线。 在活间充质干细胞核上压入液体（磷酸盐缓冲盐水）时获得的代表性力-位移曲线的连续示例，带有校准的软氮化硅悬臂（标称 k = 0.04 N / m），终止于半径为5μm的半球形尖端（参见 材料表）。在啮合细胞表面和优化压痕参数的过程中获得曲线，探头方法以蓝色显示，缩回/撤回以红色显示。（A）在开始斜坡之前，尖端已经与样品啮合并接触，导致悬臂挠度和力较大，没有平坦的预接触基线。（B）手动将尖端移动到离样品足够远的地方后，未触发的2μm斜坡导致F-D曲线几乎平坦（即力几乎没有变化）。在环境条件下，曲线会更平坦，但在流体中，介质的粘度会导致探头悬臂在斜坡期间轻微偏转，即使没有表面接触也是如此。（C）在开始斜坡之前稍微接近表面后，接近和退刀曲线在斜坡的转弯点附近显示出力（增加的坡度）略有增加（即从接近到撤退的过渡）。要寻找的迹象是接近（蓝色）和退弧（红色）曲线开始重叠（黑色圆圈表示的区域），这表明与表面的物理相互作用。（D） 在优化斜坡参数并比 C 中更接近电池表面略微 （~1 μm） 后获得的理想 F-D 曲线，以便探头花费大约一半的斜坡与电池接触，从而产生足够的变形以拟合接近曲线的接触部分并确定弹性模量。相对较长、平坦、低噪声的基线使拟合算法更容易确定接触点。缩写：F-D = 力-位移。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 6
图 6：斜坡尺寸和位置。 Z-压电监视器显示斜坡的范围（蓝色条）相对于总可用Z压电运动范围（绿色条）。（A） Z-压电位置接近其运动范围的中间，如蓝色条大致位于绿色条的中间和当前的Z压电电压（-78.0 V）大致在其完全缩回（-212.2 V）和扩展（+102.2 V）值之间。（B） Z-压电相对于A扩展，不施加偏置电压。（C） Z-压电相对于A和B缩回。（D） Z-压电陶瓷位置与C中的Z压电陶瓷位置相同，电压-156.0 V，但斜坡尺寸相对于A-C增加，以利用Z压电陶瓷的全范围运动。€ 斜坡尺寸对于当前斜坡位置来说太大，导致 Z 压电扩展到其范围的末端。这将导致F-D曲线变平，因为系统无法进一步扩展Z压电陶瓷。缩写：F-D = 力-位移。请点击此处查看此图的大图。

4. F-D曲线分析

  1. 选择合适的数据分析软件包。选择并加载要分析的数据。
    注意：许多AFM制造商和AFM图像处理软件程序都内置了对F-D曲线分析的支持。或者，专用F-D曲线分析包（例如开源AtomicJ软件包）的灵活性和功能增加可能是有益的23，特别是对于大型数据集的批处理和统计分析或实现复杂的接触力学模型。
  2. 输入弹簧常数、DS和探头尖端半径的校准值，以及探针尖端的杨氏模量和泊松比的估计值（基于其材料成分）和样品的泊松比。
    注意： 如果使用金刚石尖端压头，则值 E 尖端 = 1140 GPa 和 ν尖端 = 0.07 可用于21，24，25，26。对于标准硅探针，通常可以使用E尖端= 170 GPa和ν尖端= 0.27，尽管硅的杨氏模量因晶体取向而变化27。
  3. 选择适合针尖和样品的纳米压痕接触力学模型。
    注意：对于许多常见的球形吸头型号（例如，赫兹、莫吉斯、DMT、JKR），样品的压痕深度必须小于针尖半径;否则，探头尖端的球形几何形状会让位于圆锥形或金字塔形（图4C）。对于圆锥形（例如，Sneddon28）和金字塔形模型，尖端半角（即尖端侧壁与垂直于尖端的平分线之间的角度; 图4C）必须知道，并且通常可从探头制造商处获得。有关接触力学模型的更多信息，请参阅thedDiscussion的 数据分析 部分。
  4. 运行拟合算法。检查 F-D 曲线是否正确拟合;对应于接近单位的平均 R 2 的低残余误差（例如，R2 > 0.9）通常表明与所选模型29，30 的良好拟合。如果需要，抽查单个曲线以目视检查曲线、模型拟合和计算的接触点（例如，请参阅图 7 和讨论的数据分析部分）。

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Representative Results

力-位移曲线
图 7 显示了在树脂嵌入的枇杷松样品（图 7A）和间充质干细胞 （MSC） 细胞核上的液体（磷酸盐缓冲盐水 [PBS]）上进行的纳米压痕实验中获得的具有代表性的、近乎理想的 F-D 曲线（图 7B）。任何接触力学模型的使用都依赖于对初始针尖-样品接触点的准确可靠测定。因此，初始接触点之前相对平坦、低噪声的基线和图7所示F-D曲线接触部分的平滑斜率使其成为分析提取机械性能的理想选择，插图中的接近曲线（蓝色迹线）和相应的拟合（绿色迹线）之间的出色一致性证明了这一点。

相反，用户在执行基于悬臂的纳米压痕时可能会遇到几个常见问题，这些问题将导致不理想的F-D曲线。最常见的问题之一，特别是在接合后立即，是探针尖端在开始斜坡之前已经与样品接触（图5A），这阻止了获取确定初始接触点所需的非接触基线。在未触发（即受控位移）斜坡的情况下，这也可能导致力过大。当使用刚性悬臂进行大型斜坡时，这一点尤其值得关注，因为由此产生的力可能会破坏悬臂和/或损坏样品或尖端。为避免这种情况，请在初始接合期间和之后监控垂直偏转电压。如果测得的垂直偏转电压为正（假设初始对准正确），如图 2B所示，则悬臂被偏转并且尖端与样品接触。较大的正电压对应于较大的悬臂偏转，但无论挠度的大小如何，用户都应手动将AFM头抬离样品（例如，通过使用步进电机）。垂直偏转电压应缓慢降低，在尖端-样品粘附力较强的情况下甚至可能暂时降至零以下，但一旦尖端不再与样品接触，最终将达到0 V（或接近0 V）（图2A）。从这一点开始，用户可以继续优化斜坡参数和执行缩进。

另一个常见问题（特别是对于未触发的斜坡）是整个F-D曲线看起来几乎平坦，没有明显的针尖-样品相互作用迹象，如前面 的图5B所示。如果仪器上可用，解决方案是手动将SPM头降低~10%，比斜坡尺寸小（以避免探头尖端崩溃），然后再次斜坡，重复直到由于针尖-样品相互作用而观察到力明显增加（图5C，D），然后再继续优化其他斜坡参数。

尖端磨损
图8显示了实验环境中的尖端磨损示例。使用基于快速（kHz速率）力曲线的成像方法，使用单个刚性硅攻丝模式AFM探针（见 材料表）对Bakken页岩样品的几个大区域进行成像（更多详细信息，请参阅相应的 应用示例 ），并使用BTR方法对尖端几何形状进行建模，并估计三个连续图像中每个图像前后的尖端端半径。正在研究的页岩样品由粘土和有机物质基质（E ~5 GPa）组成，其中更硬的无机矿物内含物散布在整个（E > 30 GPa）。由于样品在成像的大扫描区域（85 μm x 85 μm）上表面形貌（±2 μm）存在显着变化，因此扫描速率设置为所用仪器允许的最小值0.1 Hz。在 2 kHz 的力曲线采集速率和 0.1 Hz 的扫描速率下，在单个 1024 x 1024 像素图像的过程中，有超过 2000 万次针尖-样品相互作用。结果，在对样品进行成像的过程中，探针尖端相对于其原始状态（图8A）经历了显着的磨损，从接收的有效端半径~11 nm增加到三个图像结束时的~129 nm，增加了一个数量级以上（图8D）。在第一个图像中，尖端似乎已经破裂，导致 图8B中看到的较大的形态变化。在随后的每个图像中，尖端逐渐变得更加圆润，这是更常见的逐渐磨损现象的一个很好的例子（见讨论）。BTR模型的估计尖端半径包含在 图8中。

相比之下， 图8E，F 显示了相隔6个月采集的金刚石尖端探针的BTR模型（参见 材料表），中间发生了数千个纳米压痕和数亿次基于力曲线成像的尖端 - 样品相互作用。从估计的尖端半径29 nm（图8E）和28 nm（图8F）可以看出，探针尖端半径在BTR方法的范围内没有变化，突出了金刚石的极端耐磨性。然而，应该注意的是，金刚石尖端探头（与所有AFM探头一样）容易受到松散粘附的碎屑的污染，这些碎屑会影响尖端区域功能和有效硬度。因此，样品清洁度对于尖端保存和准确的纳米力学测量仍然至关重要。

应用示例
通过明智地选择探针材料成分、悬臂弹簧常数以及尖端几何形状和半径，基于悬臂的纳米压痕可用于量化弹性模量范围从kPa到GPa的材料在流体和环境条件下的纳米级机械性能。以下是选定的应用示例，重点介绍悬臂式纳米压痕可能的一些广泛用例。

研究用于生物燃料应用的枇杷松的机械性能
枇杷松树（Pinus taeda） 是一种生长迅速的软木树种，在美国南部非常丰富，占地超过1300万公顷31。由于其丰富，枇杷松树是美国南部的重要经济作物，通常用于木材和纸浆木材。此外，它们是第二代纤维素生物燃料生产的重要资源32。重要的是，由于2007年的能源独立和安全法案（EISA），对纤维素生物燃料原料的需求一直在增长，该法案规定，到2022年，美国运输业的可再生燃料使用总量应为360亿加仑，其中160亿加仑来自纤维素生物质。因此，由于枇杷松的快速生长速度和农林业项目的适应性，它已成为近年来备受关注的生物燃料原料33。了解枇杷松的机械特性，包括单个树木、解剖部分（例如，白木、树皮、针）和细胞区域（例如，细胞壁与内部）之间的变异性，可以允许有针对性地分离生物质流以优化机械加工和热化学转化34。

图9显示了从23年树龄的枇杷松树枝上获得的白木横截面样品的代表性AFM形貌（高度传感器）图像（图9A）和相应的弹性模量图（图9B），该枇杷松的曲率半径为~30 nm，金刚石尖端探头安装在不锈钢悬臂上（k= 256 N/m）。使用基于快速kHz速率力曲线的AFM成像同时生成形貌图和模量图，模量图根据探头校准常数（即弹簧常数、挠度灵敏度和尖端半径）的标称值显示半定量结果，并将力曲线实时拟合到DMT（Derjaguin，Muller和Toporov）接触力学模型35.制备在所有三个维度（长 x 宽 x 高）修剪为 <3 mm 的横截面样品，使用增加浓度的乙醇（33%、55%、70%、90% 和 100%）36 进行连续脱水成像，然后用树脂渗透（参见材料表）并在 60 °C 下聚合过夜。首先研磨完全固化的树脂包埋样品，然后用金刚石刀片进行超薄切片，以~1 mm / s的切割速度运行，进料厚度从每片1μm降低到50-70nm，以产生适合AFM成像的平坦表面。然而，从图9A中的色阶条可以看出，在这种情况下，所得表面仍然相对粗糙，可能是由于样品表面和/或超薄切片机刀片上存在残留碎屑，导致切片过程中叶片“颤动”，而其他样品表现出更光滑的表面形貌。

图9C再现了图9A中的AFM形貌图像，但白色十字准线表示沿着ROI内选定的细胞壁执行的八个50个纳米压痕阵列的位置，因为该项目的目标是了解枇杷松的纳米力学性能如何因各种组织类型和树龄而异。斜坡通常采用1 μN的触发阈值（以1 Hz斜坡速率进行的60 nm标称斜坡尺寸），导致沿细胞壁的压痕深度为~10 nm（所有研究的样品为8 ± 2 nm）或略深（14 ± 4 nm），比细胞壁略软。每条线内的压痕间隔≥100 nm，以确保它们被很好地分离，并且每个斜坡收集1，024个数据点，以产生表征良好的进近和退刀曲线。通过将基于快速力曲线的成像与基于傻瓜悬臂的纳米压痕相结合，可以生成统计数据并确定细胞结构之间的模量差异。例如，如表1所示，发现细胞内部的平均弹性模量约为来自不同树龄的多个树枝的白木样品的细胞壁的一半。

样本 位置 E* （GPa） E （GPa） 变形（纳米） 计数 （n）
1 内部 1.5 ± 0.4 1.4 ± 0.4 14 ± 2 199
墙 4.7 ± 1.3 4.3 ± 1.3 7 ± 2 202
2 内部 1.3 ± 0.3 1.2 ± 0.3 16 ± 3 198
墙 3.2 ± 0.9 2.9 ± 0.9 9 ± 2 199
3 内部 1.9 ± 0.6 1.7 ± 0.6 12 ± 3 198
墙 5.7 ± 1.2 5.2 ± 1.2 6 ± 1 199
4 内部 2.4 ± 0.8 2.2 ± 0.8 11 ± 3 202
墙 4.2 ± 2.1 3.8 ± 2.1 9 ± 4 193
5 内部 2.6 ± 0.8 2.3 ± 0.8 10 ± 2 198
墙 4.3 ± 1.6 3.9 ± 1.6 7 ± 2 199
平均 内部 1.9 ± 0.6 1.8 ± 0.6 13 ± 3
墙 4.4 ± 1.4 4.0 ± 1.4 8 ± 2

表1：松松弹性模量统计：细胞壁与细胞内部的关系。 测量从两棵不同树龄的树上收集的五个枇杷松白木枝样本的细胞壁与细胞内部的弹性模量。所有模量值都是通过将力位移曲线的接近部分拟合到 DMT 模型并假设样品的泊松比为 0.3 来计算的。模量报告为每个样品位置的平均±标准偏差，并分析力曲线的数量（计数，n）以产生报告的结果。假设使用的金刚石尖端压头的杨氏模量为 1，140 GPa，泊松比为 0.07，则将测量的还原模量 （E*） 转换为实际样品模量 （E*）。还显示了施加1 μN载荷时的平均样品变形。

巴肯页岩相关纳米力学与电子显微光谱研究
巴肯页岩矿床位于美国蒙大拿州和北达科他州的威利斯顿盆地以及加拿大萨斯喀彻温省的部分地区。它们是美国第二大碳氢化合物储层，但对这些矿床的研究仍处于起步阶段37。通过将基于AFM悬臂的纳米压痕与扫描电子显微镜（SEM）成像和能量色散光谱（EDS）元素组成表征共定位，对Bakken页岩的纳米力学特性作为成分和热成熟度的函数进行了研究，如图10所示。具体而言，SEM-EDS映射用于表征元素分布（图10C），从而确定页岩基质中各种矿物内含物的存在和位置。通过在二次电子（SE）SEM图像（图10A）中定义光学可识别的原点并跟踪AFM和SEM38的载物台运动，基于快速（kHz速率）力曲线的AFM成像（图10B）与SEM-EDS图共同定位。通过再次使用安装在刚性不锈钢悬臂上的金刚石尖端探头，可以绘制包含目标夹杂物的大区域（85 μm x 85 μm）的弹性模量变化图（图10D）。请注意，图10D所示的模量图本质上是定性的，而不是定量的，因为在成像和数据采集之前，没有将正确的探头校准常数输入软件。

图10B和图10D中的AFM图像还突出了所采用的金刚石尖端探头的一个缺点，即由于其立方体角尖几何形状，它无法准确跟踪高纵横比特征（参见图10B中的黑色椭圆形区域）。在图11中可以更清楚地看到分辨率降低和无法准确跟踪陡峭的特征，其中巴肯页岩样品的相同一般区域已通过立方角金刚石尖端（图11A）和明显更锐利，更高的纵横比刚性攻丝模式硅AFM探针（图11B）成像。更具体地说，图11B所示的图像是用图8A-D中表征的探针在图8A（R = 11 nm）和图8B（R = 43 nm）之间的BTR模型之间采集的。为了进行直接比较，图像对图11C，D以及图11E，F分别显示了使用金刚石尖端和硅探针获得的相同样品表面特征的放大图像，显示了尖端几何形状和半径对图像分辨率和保真度的影响。图11G展示了一张复合3D图像，结合了使用尖锐的高纵横比硅探针（图8A，B）获取的表面形貌和用编码为叠加彩色皮肤的金刚石尖端探头（图8E，F）获取的模量值。

除了图10和图11所示的大图像外，使用完全校准的金刚石尖端探头还获得了较小的（10 μm x 10 μm）快速力曲线图像。这些图像集中在没有光学可见无机矿物内含物的区域，以更详细地研究周围有机基质的特性。通过采用 512 x 512 像素分辨率（即 ~20 nm x 20 nm 采样像素），捕获了 >262，000 条单独的 F-D 曲线，并与每张 10 μm x 10 μm 图像一起保存，从而实现出色的统计数据。使用AtomicJ软件包23对F-D数据进行批处理和分析，以实现Derjaguin-Muller-Toporov（DMT）35接触力学模型。拟合后，对数据进行清理以删除曲线，这些曲线导致计算出的弹性模量<0（非物理）或>30 GPa（因为该研究侧重于页岩的非矿物部分，E << 30 GPa）与其他研究相似39，40，以及模型拟合R2<0.7的数据。虽然 R2 截止值有些武断，但它被选择只删除模型显然无法准确拟合的数据。除了一个异常值在成像区域中包括大量矿物内含物外，移除的曲线占每张图像总数据的不到0.5%。统计结果的摘要见表2。计算出的弹性模量从 3.5 到 6.1 GPa 不等，在类似研究也发现的 39，40 范围内。

样本 E （GPa） 数据清理后的产量 计数 （n）
1 6.1 ± 3.8 93.70% 7,36,874
2 5.1 ± 2.6 99.70% 7,84,267
3 3.5 ± 1.9 99.60% 7,83,427

表2：巴肯页岩弹性模量统计。 测量了3个不同组成和热成熟度的巴肯页岩样品中有机基质的弹性模量。样品1是对照，而样品2和3分别退火12小时和48小时，以人工模拟热成熟。弹性模量报告为每个样品位置的平均±标准偏差，采用所示文本中描述的数据清理程序后，力曲线的数量（计数，n）包含在分析中。计算出的平均模量（3.5-6.1 GPa）落在其他类似研究中报告的范围内，例如Li等人40的模量范围，该研究发现模量范围为2.9-11.8 GPa。

间充质干细胞核硬度因外部刺激而改变
间充质干细胞（MSCs）是祖细胞，可以变成软骨细胞，脂肪细胞，成骨细胞和肌细胞41。MSC分化为这些不同的组织类型受到细胞上的外部机械刺激的影响，通过细胞骨架和核骨架（LINC）复合物的接头，其物理连接外细胞膜和核膜41。LINC复合物由SUN和Nesprin蛋白组成，它们与细胞骨架相互作用以检测细胞上的物理力并促进机械敏感因子β-连环蛋白和YAP的核输入以启动分化过程42，43，44。随着细胞机械刺激后β连环蛋白和YAP的核输入，细胞骨架也经历了重排，包括在细胞核周围形成F-肌动蛋白丝以及肌动蛋白44，45，46的核易位。由于机械刺激启动细胞细胞骨架和肌动蛋白的核进入的变化，因此细胞和细胞核的整体刚度（模量）受到影响，可以通过基于AFM悬臂的纳米压痕来测量。以前的研究已经通过检测LINC复合物破坏后细胞和核模量的降低以及MSC47机械刺激后细胞和核模量的增加来证实这一点。目前的研究仍在研究肌动蛋白导入细胞核的机制以及肌动蛋白聚合如何影响机械刺激后的细胞和核模量。

为了研究活细胞的机械性能，实验必须在缓冲溶液中进行，通常是PBS。在流体中进行基于悬臂的纳米压痕会带来独特的问题，特别是对于测量非常软的样品，例如MSC （E≈ 2 kPa）。特别是，活细胞的低弹性模量需要使用大探头半径来减少施加在细胞结构上的应力并避免膜穿刺。此外，测量如此低的弹性模量需要非常低的弹簧常数悬臂（k = 0.04 N/m），但由于流体的粘性阻力，这增加了假啮合的可能性，导致软悬臂在AFM啮合过程的初始快速下降步骤中偏转。为了抵消误接合的较高倾向，可能需要利用更大的啮合设定点（即偏转电压触发阈值来结束啮合过程）。由于较软的悬臂通常比刚性悬臂的弹性变形程度更大，因此流体中较高的啮合设定点所经历的更大弯曲通常不会对这种软探头有害。此外，流体环境中使用的解决方案必须没有碎屑和气泡，因为漂浮的碎片或气泡会暂时干扰激光通过流体传输到PSD或粘附在悬臂上并阻挡激光。对激光束的干扰会对产生的F-D曲线产生负面影响，并且通常会导致错误的碰撞检测或错误的啮合。最后，活细胞上的纳米压痕也比更硬的无生命材料需要更多的用户输入。特别是，由于细胞及其流体环境更加动态，因此可能需要主动调整每个斜坡的探针高度，以确保获得良好的F-D曲线。

在活细胞纳米压痕中，通常需要更大的样品变形才能导致相对于较硬样品的悬臂挠度相同。这种较大的变形可能导致实验结果偏离赫兹模型的线性弹性假设，因此可能需要应用校正因子来解释超弹性行为，以进行准确的F-D分析48。已经发现几何尺寸比Equation 4，其中R 2是压头的半径，R1是电池的半径（见图12A），可用于预测结果数据是否符合赫兹力学。已经发现理想的几何尺寸比为β = 0.3，当用赫兹接触理论48分析时，β值<0.3导致低估弹性模量，>0.3 β值导致高估弹性模量。避免非线性效应的一种常见方法是保持较小的变形。在这项研究中，压痕深度被限制在500nm-1μm。

图12B显示了在MSCs和分离的细胞核上进行单组纳米压痕实验结果的代表性数据集。在图12B所示的数据中，使用标称弹簧常数k = 0.04 N / m的5 μm半径的预校准（通过LDV的弹簧常数和通过SEM的尖端半径）进行预校准的半球形探头来研究完整活MSC和分离的MSC细胞核之间的模量差异，作为对照来测试静态和动态应变对细胞和核力学性能的影响46.由于细胞和细胞核之间的差异和挑战，提取的模量数据往往表现出较大的变化（即值的分布）。因此，图 12B 中的数据集显示了所收集数据的第 75个百分位数。由于活细胞之间的这种先天变异性和由此产生的测量范围，建议对至少具有三个生物重复的大量样品进行重复纳米压痕实验，以便为数据分析和解释生成可靠的统计数据30。

含胆固醇脂质双层的机械性能
制备具有非常高（>50摩尔%）胆固醇（Chol）含量的负载脂膜，这是眼晶状体膜中发现的典型成分，并在新鲜裂解的白云母49上孵育。在Chol/POPC（POPC = 1-棕榈酰基-2-油酰基-甘油-3-磷酸胆碱）混合比例为1下制备的这种负载脂质膜（SLM）的代表性AFM形貌图像如图 13A所示，其沿紫色线的高度剖面如下图所示。 图13A 中的SLM以足够的孵育时间（~25分钟）和足够的脂质浓度（0.3 mg / mL）完全覆盖了暴露的云母表面，如形貌图像中缺乏可区分的特征所证明的那样。同样，整个图像的高度剖面提供了有关膜表面粗糙度的结构细节，SLM如预期的那样平滑。

图13B显示了在图13A所示的SLM上捕获的力曲线的接近部分的集合。为了更好地统计SLM的机械性能，在相距至少100nm的等距点处收集了力曲线，几乎覆盖了SLM的整个宽度。选择点之间的间距（≥压痕深度的 10 倍）是为了防止缩进发生得太近。力曲线显示出明显的突破事件，力曲线接近部分~0和~5 nm分离距离之间的不连续性或突然跳跃证明了这一点，其中力从~10 nN急剧下降到~5 nN。根据图13B中的接近曲线，图13A所示膜的平均突破力（Chol/POPC混合比为1）计算为9.25±0.27 nN。

相比之下， 图13C 显示了通过以Chol/POPC混合比1再次孵育膜而形成的部分膜或膜贴片的AFM形貌图像，但脂质浓度（~15μg/ mL）要低得多，孵育时间更短（~5-6分钟）49。图像中心沿红线穿过膜贴片的高度剖面如下图所示。部分双层的测量提供了SLM的厚度， 如图13C 中的黑色虚线所示为~7 nm。然而，该测量的厚度还包含膜和云母盘50之间的1-2nm水层。需要注意的是，部分膜通常仅弱附着在云母表面，这会导致扫描过程中脂质颗粒从部分膜贴片的边缘去除，但稍长的孵育时间或降低成像力可以消除这种困难。

AFM探头的校准对于准确量化SLM机械性能至关重要。特别是，尽管尖端弹簧常数在空气或流体介质中保持一致，但必须在进行实验的同一介质中校准挠度灵敏度。在每组力曲线采集之前立即校准偏转灵敏度以确保结果可重复至关重要，因为背面涂层的激光对准和/或反射率会随着时间的推移而变化，特别是在流体中。不建议使用非常锋利的探头来捕获膜力曲线，因为它们很容易刺穿SLM，并可能导致测量错误的低穿透力或根本没有突破。然而，在没有适当清洁的情况下重复使用同一吸头会增加碎屑积聚在吸头上的机会，从而使吸头变钝或影响吸头-样品的粘附力。在接近力曲线中缺乏明显的突破事件也可能对应于仅推动云母而不是实际膜;因此，在捕获力曲线之前目视确认膜的形成是必要的。

Figure 7
图 7：空气和流体中的代表性力-位移 （F-D） 曲线。 在 （A） 空气中的枇杷松树和 （B） 伴随的赫兹模型拟合的 PBS 中的活 MSC 核上获得的代表性力曲线。图 A 和 B 中的插图显示了相应接近曲线（蓝色迹线）的接触区域的缩放，并伴有拟合（绿色迹线）。在每个面板中，初始尖端-样品接触点（由拟合算法确定）由绿色菱形表示，而转折点（即从接近到缩回或撤回的过渡）由青色圆圈表示。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 8
图 8：硅探头尖端与金刚石探头尖端磨损的比较。 （A-D） 硅探头尖端。在尖端表征样品成像后，通过盲尖重建方法创建的一系列模型，展示了刚性悬臂硅尖端探针半径的演变（参见材料表），这是由于在三个连续的85 μm x 85 μm（1024 x 1024像素）基于巴肯页岩样品的力曲线图像过程中经历的渐进尖端磨损， 以0.1 Hz的线扫描速率和2 kHz的力曲线采样率进行（即~2000万次针尖-样品相互作用/图像）。（A） 使用前收到（开箱即用）的提示。R = 11 nm。（B） 一个图像后的提示 （R = 43 nm）。（C）两个图像后的提示（R = 94nm）。（D） 三个图像后的提示 （R = 129 nm）。（中、女）金刚石探头尖端。相隔~6个月获得的相同金刚石尖端探头的BTR模型（见材料表）。在采集用于生成E和F所示模型的尖端图像之间，使用探针执行了数千个纳米压痕，并且在基于力曲线的成像过程中发生了数亿次尖端 - 样品相互作用。然而，由于金刚石的硬度，在获取尖端的初始（E）和后续（F）图像之间的BTR技术的不确定性范围内，估计的尖端半径~30 nm没有变化。在早期模型中观察到的粗糙度（由图E中的黑色圆圈表示）很可能是BTR方法的伪影，或者由于尖端侧面存在纳米级污染物（例如灰尘颗粒）。请点击此处查看此图的大图。

Figure 9
图 9：枇杷松样品的 AFM 形貌和模量图。在嵌入树脂的横截面松树样品上在空气中获取的代表性AFM数据，以便在细胞壁上进行基于悬臂的纳米压痕测量。（A）通过基于快速力曲线的成像模式获得的覆盖多个细胞的AFM形貌图像，以伪3D描绘的形式呈现。（B）AFM软件通过分析每个像素处获取的力曲线并将数据拟合到DMT模型实时生成的弹性或杨氏模量图，表明细胞壁比细胞内部更硬。请注意，使用的是标称而非测量的探头校准参数，因此模量值应被视为定性或仅半定量。（C）ROI概述，指示位置（八条线由50个白色十字准线组成，每条线间隔≥相距100nm），其中400个纳米压痕（60 nm标称斜坡尺寸，1μN触发阈值对应于~10nm的平均压痕深度）在采集AFM图像后沿选定的细胞壁进行，以便能够以纳米级精度定位压痕。比例尺 = 20 μm （A，B）。缩写：AFM = 原子力显微镜;DMT = Derjaguin-Muller-Toporov。请点击此处查看此图的大图。

Figure 10
图10：巴肯页岩样品的共定位AFM和SEM / EDS。 （A）部分巴肯页岩样品的二次电子SEM图像。（B）A中黑匣子指示的区域的AFM地形图像。黑色椭圆表示探头的低纵横比导致探头侧壁成像的区域，而不是陡峭的高纵横比表面形貌特征。（C）获得的EDS元素组成图，用于A所示的SEM图像。（D）在获得原子力显微镜（B）过程中生成的弹性或杨氏模量图，显示A-D图像中心的矿物内含物明显比周围的有机基质更硬。比例尺 = 50 μm。缩写：AFM = 原子力显微镜;扫描电镜=扫描电子显微镜;EDS = 能量色散光谱。请点击此处查看此图的大图。

Figure 11
图 11：探头尖端半径和形状对高纵横比特征外观的影响。比较使用（A）R≈30 nm低纵横比（尖端半角= 47°）金刚石尖端探针（见材料表）或（B）R≈10 nm高纵横比（尖端半角≈19°）刚性硅探针（标称k = 200 N / m;见材料表）获得的特征分辨率比较，以在Bakken页岩样品上对同一位置进行成像。（C-F）使用较大的曲率半径低纵横比金刚石尖端探头 （C，E） 或更清晰、更高纵横比的刚性硅攻丝模式探头 （D，F） 获得的 A 和 B 中蓝色 （C，D） 和橙色 （E，F） 框区域的放大图像，突出显示了使用金刚石尖端探头获得的 AFM 形貌图像中特征分辨率降低和尖端侧壁伪影的引入，因为它的尖端半径较大，半角。C-F中突出显示的区域包含陡峭、深井状特征，这些特征展示了在横向分辨率、精确跟踪和图像保真度方面更容易变暗、最初锋利的硅探针或更钝、耐磨的金刚石尖端探头之间的权衡。（G） 将获得的AFM形貌与尖锐、高纵横比刚性硅探针与模量数据（叠加彩色皮肤）相结合生成的复合3D图像，这些数据来自金刚石尖端探头对样品相同区域的快速力曲线成像。A 和 B 中的蓝色和白色框突出显示的特征也以 G 表示。请点击此处查看此图的大图。

Figure 12
图 12：细胞或细胞核上基于悬臂的纳米压痕。 （A） 半径为 R1 的电池位于平坦的刚性基板上，通过半径为R 2 的球形压头缩进到深度 d。这个数字转载自丁等人48。（B）从基于悬臂的小鼠MSCs纳米压痕实验和从小鼠MSC中提取的分离细胞核中获得的代表性模量测量的个体值图。在500-600nm的压痕深度下，总共测量了10个细胞和10个细胞核，各测量了5次（选择以允许使用赫兹接触力学模型）。使用AtomicJ 23处理所得原始F-D曲线数据以计算弹性模量。由于细胞的先天变异性很大，因此绘制了第 75个百分位数的数据。细胞和分离细胞核的弹性模量无统计学差异，测得的平均模量分别为0.75 ± 0.22 kPa和0.73 ± 0.22 kPa。已经收集和分析了类似的数据，以确定由于机械刺激，蛋白质敲除和化学处理引起的核刚度差异。缩写：MSC = 间充质干细胞;AFM = 原子力显微镜;F-D = 力-位移。请点击此处查看此图的大图。

Figure 13
图13：脂质双层的形态和纳米力学性能。 （A） AFM 形貌图像显示了由 Chol/POPC 组成的完全支撑脂膜 （SLM） 的最小高度变化，混合比例为 1，在整个暴露的云母表面上形成，孵育时间长（~25 分钟）和高脂质浓度 （0.3 mg/mL）。图中下方显示了沿图像中间紫色线的高度剖面，提供了膜表面的结构细节。正如预期的那样，SLM 非常流畅。（B） A所示SLM上捕获的力曲线的接近部分的集合。在相距≥100 nm的等距点处收集力曲线，几乎覆盖整个SLM。力曲线显示出明显的突破事件，力曲线的进近部分的不连续性或突然跳跃证明了这一点。平均突破力为9.25±0.27 nN。（C）部分膜或膜贴片，通过以Chol / POPC混合比1孵育膜而形成的，相对于 A49，孵育时间更短（~5-6分钟）和脂质浓度（~15μg/ mL）。沿贴片上红线的高度剖面显示在图像下方。部分双层可以测量SLM的厚度，由高度剖面中的黑色虚线显示。注意，测得的厚度还在膜和云母盘50之间包含一个1-2nm的水层。该图改编自Khadka等人49 ，并得到爱思唯尔的许可。 请点击此处查看此图的大图。

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Discussion

样品制备
对于空气中的纳米压痕，常见的制备方法包括冷冻切片（例如，组织样品）、研磨和/或抛光，然后进行超薄切片（例如，树脂嵌入的生物样品）、离子研磨或聚焦离子束制备（例如，不适合抛光的半导体、多孔或混合硬度样品）、机械或电化学抛光（例如，金属合金）或薄膜沉积（例如，原子层或化学气相沉积， 分子束外延）。目标是创建具有最小表面粗糙度的样品（理想情况下是nm级，≤预期压痕深度的0.1倍）。对于上述许多方法，样品可能需要随后用高纯度过滤（例如HPLC级）溶剂冲洗和/或超声处理，并用超高纯度（99.999%）氮气（N2）干燥以去除颗粒碎片。或者，薄片（例如，2D材料）或颗粒（例如，纳米颗粒或微胶囊）可以旋涂或使用高纯度过滤溶剂制备的溶液中滴铸出来。在这种情况下，目标是实现表面密度，在样品上任何随机选择的区域的视场内产生多个不重叠的薄片或颗粒。对于流体中的纳米压痕（通常用于需要缓冲溶液保持活力的生物样品），需要在光滑（纳米级表面粗糙度）基底（例如，显微镜载玻片，培养皿或新鲜切割的白云母）上沉积或制备样品46，47，49。

探头选择注意事项
选择合适的探针对于F-D曲线的定量分析至关重要，因为尖端-样品相互作用是悬臂式纳米压痕中测量的基本特性。在为给定实验选择探针时，以下问题尤为重要。样品的预期（或测量）表面粗糙度和弹性模量范围是多少？与更光滑的样品相比，高粗糙度样品会导致加速磨损，因为在跟踪陡峭特征时尖端上的侧向力增加，并增加尖端断裂事件的可能性53。同样，样品越硬，探针尖端磨损的速度就越快。此外，需要多少图像和/或纳米压痕？由于成像和压痕更少，可以预期更少的尖端磨损。如下所述，使用类金刚石碳（DLC）涂层可以减少尖端磨损，或者通过使用金刚石尖端探头几乎消除尖端磨损（随着时间的推移，探头寿命几乎无限，因此高购置成本会抵消）。

选择合适的探头的另一个考虑因素是感兴趣特征的大小。对于纳米压痕，通常最好使用尽可能大的尖端尺寸，同时保持相关样品所需的空间分辨率和所需的信息内容，因为较大的尖端不太可能因断裂而发生突然的尖端几何形状变化，并且磨损率也较低54。同样重要的是要考虑是否有其他AFM方法与纳米压痕共定位，例如导电AFM55，开尔文探针力显微镜（KPFM）56或磁力显微镜（MFM）57。如果要使用诸如此类的其他计量方法，探头尖端可能需要导电或磁性，这将影响材料成分，从而影响许多性能，包括硬度、耐磨性和尖端半径。同样，如果要在流体中进行压痕，则探头的反射背面涂层（如果存在）的成分是另一个重要的考虑因素，因为它必须耐腐蚀（例如，金背面涂层对于流体探头很常见）。最后，也许也是最重要的一点，探头悬臂的弹簧常数必须与要测量的预期弹性模量范围相匹配。如果弹簧常数与样品模量不匹配，则可能会出现以下两种情况之一。如果悬臂太硬，将测量很少或没有偏转，并且无法表征;相反，如果悬臂太软，它将无法使样品变形到足以测量其机械性能的程度。

尖端磨损
磨损可以通过多种方式定义;对于此处对AFM探针尖端磨损的讨论，它将定义为由于塑性变形而导致探针尖端表面形貌的任何变化，而不会损失任何材料，以及由于物理相互作用而从表面去除材料58。从广义上讲，磨损还可能涉及氧化和水合作用等化学反应。在正常的AFM应用中，横向空间分辨率通常受到尖端半径59的限制，并且尖端 - 样品相互作用是主要的测量属性。由于尖端半径是模拟尖端-样品系统的接触力学并随后确定机械性能的关键参数，因此在进行纳米压痕实验时，尖端磨损是特别关注的问题，并且是准确解释纳米压痕结果的关键限制53。由于吸头磨损通常具有渐进性（除了吸头断裂事件），因此无法量化由于单个纳米压痕循环（即斜坡）引起的吸头磨损。此外，探针尖端相对于纳米压痕中样品的垂直运动（折扣基于快速力曲线的成像）有助于降低磨损率，因为尖端磨损的主要模式通常是扫描模式60期间产生的剪切力。因此，纳米压痕实验中尖端磨损的主要来源是在初始探针校准之后（特别是偏转灵敏度和尖端半径测量）之后但在纳米压痕之前进行的任何成像。因此，如果使用硅或氮化硅探针，则应在每次实验之前和之后检查尖端半径，以使用上述方法之一（例如，SEM分析或BTR）监测和说明任何尖端磨损。

探头材料
类金刚石碳 （DLC）
通过使用DLC涂层的探针尖端或金刚石尖端，可以大大减少或完全消除尖端磨损53。这些替代尖端材料的耐磨性增强，对于机械性能的测量非常诱人，特别是非常坚硬的材料。研究表明，与普通硅探针尖端相比，DLC 探针尖端的耐磨性可以提高 1，600 倍54。耐磨性的急剧提高可归因于几个因素。首先，DLC中存在的键（C-C和C = C）及其与硅的界面（Si-O，Si-C）是任何元素对中最强的键，并且比硅尖端中的Si-Si键强得多。DLC还具有减少摩擦的作用，从而降低尖端内的剪切应力，从而减少磨损。此外，DLC尖端的表面化学性质与硅尖端不同，因为硅尖端在环境湿度条件下会经历摩擦化学蚀刻，而DLC尖端不会（或者至少与主要磨损模式相比没有任何有意义的方式）54。DLC涂层吸头的主要缺点（相对于标准无涂层硅吸头的价格增加）是由于涂层本身而增加的吸头半径。大多数 DLC 探针尖端半径为 ≥30 nm，而非 DLC 涂层尖端在半径 61 时可以可靠地达到 1-2 nm。然而，纳米压痕实验通常需要更大的尖端半径以减少性能测量中的误差，因为由于探头缺陷或粗糙，理想面积深度函数和实际面积深度函数之间的纳米级差异将不成比例地影响使用较小半径探头进行的测量，因为相对误差较大。此外，尽管DLC涂层具有优异的耐磨性，但最终可能会出现斑点磨损，从而导致裸露的硅芯与剩余的DLC涂层之间的磨损差异。不幸的是，类金刚石涂层的耐磨性也可能受到涂层与硅尖端的附着力的限制，而不仅仅是涂层的实际硬度。

钻石
众所周知，钻石是地球上最坚硬、最耐磨的材料之一。然而，已经证明，当故意尝试探索尖端磨损时，使用较大的（60 μN）力时，金刚石尖端仍可能发生严重磨损62。相反，在施加在尖端上的力要小得多的正常纳米压痕和成像场景中，没有对金刚石尖端磨损进行严格的研究。然而，如图8E，F所示，在相同条件下，同一金刚石探针尖端的BTR建模在相隔6个月的同一尖端表征样品上生成了几乎无法区分的尖端形状模型（即，没有明显的磨损证据）。在第一个和第二个BTR图像之间，探针用于执行数千个纳米压痕，并经历了数亿次尖端 - 样品相互作用，同时成像各种刚性材料（E > 15 GPa），包括木材（loblolly pine），页岩，高度有序的热解石墨（HOPG）和各种石墨烯薄膜。值得注意的是，图8E，F中的两个图像之间的估计尖端半径变化了~1 nm，这完全在BTR方法的误差63范围内。虽然不是完整的研究，但这种比较证明了金刚石探针在正常实验纳米压痕（甚至成像）条件下的出色耐用性。与使用金刚石尖端相关的主要缺点（除了昂贵的前期成本）是增加的尖端半径，并且在某些方面更令人担忧的是，大多数市售金刚石尖端的立方角几何形状的纵横比较低。图11A，B显示了使用标称尖端半径为8 nm，平均半角为~19°的锐利硅探针与标称尖端半径为40 nm，平均侧角为47°的金刚石尖端探针采集的相同区域的贝肯页岩样品的并排比较AFM图像。当比较放大的区域（图11C，D和图11E，F）时，很明显，金刚石尖端探头无法分辨和准确跟踪图像中更陡峭（更高的纵横比）特征。相反，在存在陡峭特征的地方，尖端侧壁与上边缘接触，AFM系统基本上跟踪探头的侧壁，直到尖端再次与表面接触并恢复正常的跟踪。

弹簧常数/模量匹配
如上所述，探头悬臂的弹簧常数必须与要测量的预期弹性模量范围相匹配。为了帮助选择合适的探头， 表3 提供了建议的近似标称悬臂弹簧常数，适用于所选的宽范围的预期样品弹性模量，范围从几MPa到100GPa，在~30-40nm半径探头尖端通常用于纳米压痕的情况下52。较低的弹簧常数探头（k <0.1 N/m）可用于更软的材料（kPa范围），例如电池。

弹簧常数 （N/m） 预期样品模量范围
0.25 ≤ 15 兆帕
5 5 – 500 兆帕
40 200 – 8，000 （0.2 – 8 GPa）
200 1，000 – 50，000 （1 – 50 GPa）
450 10，000 – 100，000 （10 – 100 GPa）

表 3：用于测量各种模量范围的理想探头弹簧常数。 假设典型探头半径为 ~30-40 nm52，则在从几 MPa 到 100 GPa 的不同范围内对弹性模量进行最佳测量的近似标称探头弹簧常数。

除了弹簧常数外，在生物材料的特殊情况下，必须仔细考虑成像和纳米压痕过程中施加的尖端半径和力，以避免损坏。在涉及测量含胆固醇脂质双层机械性能的应用 示例中 ，在代表性结果部分介绍，一个相对锋利的（10 nm）尖端专门用于分析脂质双层中的突破力。相反，如果材料ROI足够大（例如，细胞和细胞核的情况）并且担心穿刺的可能性，则较大的微米级半球形尖端，例如在代表性结果部分的一个 应用示例中 描述的MSC核刚度测量中使用的尖端是理想的，并且为柔软的，提供出色的结果， 易碎样品，如活细胞和分离的细胞核。Kain等人深入讨论了如何选择探头半径和弹簧常数的最佳组合，以实现此类样品的最高测量灵敏度64。

探头校准
偏转灵敏度
偏转灵敏度将Z压电陶瓷的运动（假设在小挠度极限下工作，在无限刚性基板上压痕时悬臂的偏转）与PSD65上测量的电压变化有关。偏转灵敏度（有时也称为反向光学杠杆灵敏度 [InvOLS]）可能以 nm/V 或 V/nm 为单位报告。下面概述了最常见的偏转灵敏度校准方法。

硬表面接触
确定光束反射激光/AFM探头/PSD系统的偏转灵敏度的最简单和最流行的方法是恰当地命名为“硬表面接触”方法65。它的简单性、易于集成到 AFM 控制软件工作流程中以及原位性质都增加了硬表面接触方法的吸引力和广泛使用。为了实现这种方法，AFM探头尖端在比悬臂硬得多的材料上倾斜。然后，力-位移曲线接触部分的斜率（显示为PSD上垂直偏转误差信号的伏特，作为Z压电运动（以nm为单位）或施加电压的函数）给出偏转灵敏度（图3A）。使用刚性基板可确保所有测量的偏转都来自悬臂弯曲，而不是样品变形和悬臂位移的卷积。对于软悬臂（例如，k < 10 N/m）、硅（E ≈ 170 GPa）27 或云母17 是易于接近且易于使用的材料（或玻璃、E≈ 70 GPa，或在细胞固定在显微镜载玻片或培养皿上的情况下使用适当的硬塑料），而对于较硬的悬臂， 例如用于某些纳米压痕实验的那些（例如，k > 200 N/m;表3），可能需要使用蓝宝石（E≈ 345 GPa）26，66来确保不会发生样品变形。由于这种方法取决于力-位移测量，AFM扫描仪的Z压电必须采用闭环高度传感器，或者使用各种高度标准进行良好校准（如果在开环模式下工作）。硬表面接触方法误差的最大因素是由于热波动导致悬臂上的激光光斑移动。悬臂温度的变化最常由检测激光引起，尽管周围电子设备中的焦耳热也可能有所贡献。据报道，悬臂和环境空气之间的总温差为6°C，这可能导致激光光斑偏移几微米67。考虑到任何加热，建议在初始激光光斑对准后等待≥30分钟，以使悬臂与其周围环境达到热平衡，以获得最佳和最准确的结果。对每次灵敏度测量的进近斜率和退缩曲线求平均值将考虑任何尖端摩擦或滑动效应，如果可能，应制定68.此外，对多个灵敏度测量进行平均将有助于衡量测量的可靠性和可重复性。良好的灵敏度测量应导致≤1%的偏差，并以与预期的实验纳米压痕大致相同的偏转进行，以最大限度地提高校准的有效性69。硬表面接触方法的主要缺点是校准所需的物理接触可能会损坏脆弱的硅尖端（例如，变钝或产生尖端伪影，例如双尖端）。

热噪声法
确定挠度灵敏度的热噪声方法需要事先校准悬臂弹簧常数和测量悬臂67的热噪声谱的能力。热噪声方法通常集成到现代AFM控制软件中，可以与Sader方法（见下文）结合使用，以快速分析和计算弹簧常数和挠度灵敏度。然而，由于振动幅度减小，在较硬（k > 10 N/m）悬臂上使用热噪声方法可能很困难或不可能。此外，报告的热噪声法的相对不确定性明显更大，与上述70%的硬表面接触法相比~20%。如果采用下面描述的用于确定弹簧常数的热调谐方法，则不能使用此技术67。

弹簧常数
测量悬臂弹簧常数的黄金标准是激光多普勒测振法（LDV），现在有许多市售探头都带有制造商为每个探头提供的LDV衍生弹簧常数校准信息（参见 材料表）。然而，虽然精确测量悬臂弹簧常数对于定量纳米力学测量是绝对必要的，但在非校准探头的典型实验室中，这样做的实用方法多种多样，并且可能有些复杂。因此，本文仅简要概述了两种最常见的现场弹簧常数校准方法，并列出了其他方法和适当的文献引用，以了解更多信息。

热调谐法
作为当今商用原子力显微镜中最常用的方法，用于确定悬臂弹簧常数的热调谐方法内置于许多系统的控制软件中。虽然由于悬臂偏转检测减少和电子带宽有限，对于较硬的悬臂（k > 10 N/m）并不理想，但热调谐方法相对容易实现，并且适用于各种尖端几何形状71。热调谐方法利用悬臂热噪声频谱的测量和拟合，然后应用均分定理来计算悬臂的势能，悬臂通常建模为简单的谐波振荡器72。热调谐方法对于软探头的误差为~5%-10%，适用于任何悬臂形状73，74。有关更多详细信息，请参阅本节中引用的参考文献。

萨德法
Sader方法是另一种通常集成到许多现代AFM 75，76，77的控制软件中的方法。Sader方法使用悬臂在流体介质（通常是空气或水）中振动时所承受的流体动力载荷以及悬臂的平面视图尺寸和品质因数来计算悬臂弹簧常数。Sader方法导致悬臂弹簧常数74的误差为~10%-15%。关于“原始方法”76，78，“通用方法”79，通用方法77的扩展以及仪器特定文档的相应论文可以提供更多详细信息。

其他方法
已经开发和实施了其他几种方法来确定AFM悬臂的弹簧常数，这些方法超出了本文的范围。虽然这些方法都不像Sader或热调谐校准方法那样容易实现或普及，但它们各有独特的优点和缺点;引用的文献提供了有关其应用和实施的详细信息。特别是，Sikora提供了对许多弹簧常数校准方法的出色回顾，并且是主题72的极好资源。确定弹簧常数的其他方法的非详尽列表包括激光多普勒测振法 （LDV）73、74、80、基于微机电系统 （MEMS） 的设备 81、参考悬臂 82，83、附加质量（动态 75 和静态 84）、精密天平85，86、电磁致动 87 和有限元分析 （FEA）88，89.

尖端半径
确定针尖半径的常用方法包括二次电子 SEM 成像和盲尖重建方法 （BTR）。

扫描电镜分析
二次电子 SEM 成像可以提供低至 1 nm 的分辨率，从而能够直接、轻松地比较磨损的逐行图像。SEM成像的一个缺点是，由于仅存在高度实验性的组合AFM-SEM工具90，因此通常必须将AFM探针卸下并运送到SEM进行分析，这可能既耗时又可能使探针受到污染。SEM的另一个缺点是，生成的图像本质上是尖端的2D投影，没有定量的3D信息可用。每次都必须注意将探头对准完全相同的方向，以使比较结果有意义，因为即使电子束入射角的微小变化也会改变探头尖端的表观尺寸和形状。最后，SEM成像可能会受到电荷效应和碳污染的困扰，这可能会分别模糊图像或导致探针尖端发生物理变化。

盲尖重建
与SEM相比，BTR方法是一种 原位 技术，其中3D尖端几何形状是基于具有许多比探针半径小得多的尖锐（高纵横比）特征的样品的成像建模的。这种方法之所以有效，是因为在AFM中，观察到的图像始终是探针尖端形状和样品特征形状的卷积，因此通过将极其尖锐的特征建模为无限锐利，可以估计尖端形状。不幸的是，除了假设无限尖锐的尖峰（即，表面特征远小于尖端半径）之外，BTR技术还可能受到成像噪声和扫描参数的影响，因此应使用非常相似的成像参数获得比较图像。此外，由于尖端的多个“图像”用于重建其几何形状，因此不可能对尖端形状进行直接的一对一逆计算。由于其性质，BTR方法实际上只能通知用户尖端形状63的上限，并且对探针进行成像以实现BTR方法的行为可能导致尖端磨损（例如，探针尖端变钝或碎裂）。

相对校准
有时，无法轻松准确地测量特定的探头特性。例如，由于带宽和偏转限制，较硬悬臂的弹簧常数很难或不可能用热调谐方法测量91。如上所述，确实存在确定弹簧常数的其他方法，但由于热调谐方法已集成到许多现代AFM中，因此通常将其用于简单的日常使用。同样，在将PSD上的激光运动转换为探头悬臂的物理偏转的实验之前，必须始终校准偏转灵敏度。然而，实际上，测量尖端半径是最耗时的校准步骤，也是最有可能损坏探头尖端的步骤。如果无法通过SEM或BTR直接测量针尖半径，则可以使用相对校准程序作为确定有效针尖半径的替代方法，前提是具有最小表面粗糙度（理想情况下原子平坦）的标准参考样品和接近预期实验模量的众所周知的模量可用。这种用于相对校准的理想参考标准品的例子包括白云母17，92，93，94，95和HOPG96，但也有助于强调为模量在kPa至MPa范围内的较软样品确定合适参考标准品的困难。要执行相对校准，首先应按照主协议中的说明校准偏转灵敏度。其次，应输入探头的标称弹簧常数（通常随探头一起提供）或通过上述方法之一进行测量。第三步是使用适当的参数在模量参考标准样品表面上压痕。最后，应分析收集的F-D曲线数据并调整尖端半径参数，直到实验测量的降低模量与预期的降低模量相匹配。应注意在参考样品上达到的平均变形深度，因为在感兴趣的实验样品上压痕时必须保持该深度，以使校准具有相关性。现在，可以在感兴趣的样品上发生压痕，调整斜坡参数以匹配模量标准参考材料上实现的变形深度。

相对校准方法的一个优点是，它避免了由于挠度灵敏度、弹簧常数和尖端半径52的校准不准确而导致的潜在累积误差。此外，与BTR方法相比，它可能更快，更不容易损坏探头。相对校准方法的最大缺点是：1）需要具有nm到埃级表面粗糙度和已知机械性能的高质量参考样品，该样品可以使用与实验样品相同的探针进行分析，以及2）要求在参考样品和实验样品上实现相同或非常相似的变形深度才能使校准有效。因此，如果可能的话，最好直接测量尖端半径。

数据分析
用于根据测量的F-D曲线确定样品机械性能的分析方法与纳米压痕数据本身的质量同样重要。有几种常见的接触力学理论基于不同的基本假设对力-位移关系进行建模（因此适用于不同的场景）。这些接触力学模型包括Hertz 97，Sneddon28，JKR（Johnson，Kendall和Roberts）98，DMT（Derjaguin，Muller和Toporov）35，99，MD（Maugis-Dugdale）100和MYD（Muller，Yushchenko和Derjaguin）101，102。对各种接触力学模型及其在分析中的应用的深入分析和比较已在其他地方介绍29，30，103，104.虽然超出了本文的范围，但表4提供了一些最常见的接触力学模型的简要概述。特别值得注意的是，更复杂的模型（如 JKR、DMT 等）包含针尖-样品粘附 30，35，98，99，100，101，102，103，104 的影响，这可能很重要，并且通常很容易通过力曲线中出现负挠度来识别（见图 3).在实践中，所选的分析模型用于拟合收集的F-D数据并确定机械性能，例如弹性模量。为了正确拟合数据，需要平坦的基线来确定初始接触点或拟合与模型相关性最大的实验数据部分的有效接触点。

理论 适用性 假设 局限性
赫 简单;常用于流体中的样品。 无粘连。 对于存在粘附力的系统无效。
Derjaguin-Muller-Toporov （DMT） 刚性好，变形小。 接触区域的短距离粘附加上接触区域外的长距离粘附。 受限的几何形状可能会导致接触面积被低估。
约翰逊-肯德尔-罗伯茨 （JKR） 柔软，变形大。 仅在接触区域具有短距离粘附力。 由于粘附，可能会低估负载。
毛吉斯 – 达格代尔（马里兰州） 这种通用解决方案涵盖了其他粘合剂型号。 建模为裂纹的尖端样品界面。 涉及参数方程的解析解。

表 4：常见接触力学模型。 选定的常见接触力学模型，并注明了适用性、假设和局限性。

上述模型在分析F-D曲线的实际应用中，需要使用计算机软件，以便在短时间内对数千或数百万条曲线进行大规模批处理，并对结果进行统计分析。内部编写的代码通常用于F-D数据的分析，各种AFM制造商也提供软件包。但是，由于其开源性质，易用性和详细的补充信息，作者建议使用AtomicJ23。该程序允许使用上述任何理论以及其他几种理论对F-D数据进行简单准确的分析。由于代码是开源的，因此可以轻松针对特定用例进行操作和自定义，而无需从头开始构建复杂的代码。有关 AtomicJ 软件包的深入信息，请参阅 Hermanowicz 等人 23 。

总之，通过仔细校准探针，可以量化AFM探针尖端施加在样品表面的接触面积和力，以确定纳米级机械性能，特别是弹性模量。已经提供了一个通用的协议，强调了在软样品和硬样品上成功实施基于AFM悬臂的纳米压痕的最佳实践，弹性模量范围从kPa到GPa，并提供了代表性的例子。讨论了探头选择（包括样品表面粗糙度、特征尺寸、探头纵横比和尖端磨损）、探头校准和数据分析（包括接触力学模型和测量统计）等重要考虑因素。最后，已经证明了AFM衍生的纳米力学图与其他表征技术的共同定位，该技术提供了诸如SEM / EDS的成分信息，以及通过基于AFM悬臂的纳米压痕 测量 弹性模量以外的纳米力学性能（即脂质双层破裂力）的示例，以提供该技术的其他协同应用的示例。综上所述，这里提供的示例和讨论应该为寻求使用基于AFM悬臂的纳米压痕来测量几乎任何样品类型的机械性能的研究人员提供一个切入点。

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Disclosures

作者没有利益冲突需要披露。

Acknowledgments

所有AFM实验均在博伊西州立大学表面科学实验室（SSL）进行。SEM表征在博伊西州立材料表征中心（BSCMC）进行。本出版物中报道的有关生物燃料原料的研究得到了美国能源部、能源效率和可再生能源办公室、生物能源技术办公室作为原料转换接口联盟 （FCIC） 的一部分以及美国能源部爱达荷州运营办公室合同 DE-AC07-051ID14517 的部分支持。细胞力学研究得到了美国国立卫生研究院（美国）AG059923、AR075803和P20GM109095的资助，以及美国国家科学基金会（美国）的1929188和2025505资助。模型脂质双层系统工作得到了美国国立卫生研究院（美国）R01 EY030067资助的支持。作者感谢Elton Graugnard博士制作了 图11所示的合成图像。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Atomic force microscope Bruker Dimension Icon Uses Nanoscope control software, including PeakForce Quantitative Nanomechanical Mapping (PF-QNM), FastForce Volume (FFV), and Point-and-Shoot Ramping experimental workspaces
AtomicJ American Institute of Physics https://doi.org/10.1063/1.4881683 Flexible, powerful, free open source Java-based force curve analysis software package. Supports numerous contact mechanic models, such as Hertz, Sneddon DMT, JKR, Maugis, and cone or pyramid (including blunt and truncated). Also includes a variety of initial contact point estimation methods to choose from. Supports batch processing of data and subsequent statistical analysis (e.g., averages, standard deviations, histograms, goodness of fit, etc.). Literature citation is: P. Hermanowicz, M. Sarna, K. Burda, and H. GabryEquation 1, “AtomicJ: An open source software for analysis of force curves” Rev. Sci. Instrum. 85: 063703 (2014), https://doi.org/10.1063/1.4881683
Buffer solution (PBS) Fisher Chemical (NaCl), Sigma Aldrich (KCl), Fisher BioReagents (Na2HPO4 and KH2PO4) S271 (>99% purity NaCl), P9541 (>99% purity KCl), BP332(>99% purity Na2HPO4), BP362 (>99% purity KH2PO4) Phosphate buffered saline (PBS) was prepared in the laboratory as an aqueous solution consisting of 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, and 1.8 mM KH2PO4 dissolved in ultrapure water. Reagents were measured out using an analytical balance, and glassware was cleaned with soap and water followed by autoclaving immediately prior to use.
Chloroform
Diamond tip AFM probe Bruker PDNISP Pre-mounted factory-calibrated cube corner diamond (E = 1140 GPa) tip AFM probe (nominal R = 40 nm) with a stainless steel cantilever (nominal k = 225 N/m, f0 = 50 kHz). Spring constant is measured at the factory (k = 256 N/m for the probe, Serial #13435414, used here) and calibration data (including AFM images of indents showing probe geometry) is provided with the probe.
Diamond ultramicrotome blade Diatome Ultra 35° 2.1 mm width. Also used a standard glass blade for intial rough cut of sample surface before transitioning to diamond blade for final surface preparation
Epoxy Gorilla Glue 26853-31-6 Epoxy resin and hardner were mixed in a 1:1 ratio, a small drop was placed on a stainless steel sample puck (Ted Pella), and V1 grade muscovite mica (Ted Pella) was attached to create an atomically flat surface for preparation of phospholipid membranes.
Ethanol
LR white resin, medium grade (catalyzed) Electron Microscopy Sciences 14381 500 mL bottle, Lot #150629
Mesenchymal stem cells (MSCs) N/A N/A MSCs for nanomechanical studies were primary cells harvested from 8-10 week old male C57BL/6 mice as described in Goelzer, M. et al. "Lamin A/C Is Dispensable to Mechanical Repression of Adipogenesis" Int J Mol Sci 22: 6580 (2021) doi:10.3390/ijms22126580 and Peister, A. et al. "Adult stem cells from bone marrow (MSCs) isolated from different strains of inbred mice vary in surface epitopes, rates of proliferation, and differentiation potential" Blood 103: 1662-1668 (2004), doi:10.1182/blood-2003-09-3070.
Modulus standards Bruker PFQNM-SMPKIT-12M Used HOPG (E = 18 GPa) and PS (E = 2.7 GPa). Also contains 2x PDMS (Tack 0, E = 2.5 MPa; Tack 4, E = 3.5 MPa), PS-LDPE (E = 2.0/0.2 GPa), fused silica (E = 72.9 GPa), sapphire (E - 345 GPa), and tip characterization (titanium roughness) sample. All samples come pre-mounted on a 12 mm diameter steel disc (sample puck).
Muscovite mica Ted Pella 50-12 12 mm diameter, V1 grade muscovite mica
Nanscope Analysis Bruker Version 2.0 Free AFM image processing and analysis software package, but designed for, and proprietary/limited to Bruker AFMs; similar functionality is available from free, platform-independent AFM image processing and analysis software packages such as Gwyddion, WSxM, and others. Has built-in capabilities for force curve analysis, but AtomicJ is more flexible/full featured (e.g., more built-in contact mechanics models to choose from, statistical analysis of force curve fitting results, etc.) for force curve analysis and handles batch processing of force curves.
Phospholipids: POPC, Cholesterol (ovine) Avanti Polar Lipids POPC: CAS # 26853-31-6, Cholesterol: CAS # 57-88-5 POPC lipid dissolved in chloroform (25 mg/mL) was obtained from vendor and used without further purification. Cholesterol powder from the same vendor was dissolved in chloroform (20 mg/mL). 
Probe holder (fluid, lipid bilayers) Bruker MTFML-V2 Specific to the particular AFM used; MTFML-V2 is a glass probe holder for scanning in fluid on a MultiMode AFM.
Probe holder (fluid, MSCs) Bruker FastScan Bio Z-scanner Used with Dimension FastScan head (XY flexure scanners). Serial number MXYPOM5-1B154.
Probe holder (standard, ambient) Bruker DAFMCH Specific to the particular AFM used; DAFMCH is the standard contact and tapping mode probe holder for the Dimension Icon AFM, suitable for nanoindentation (PF-QNM, FFV, and point-and-shoot ramping)
Sample Puck Ted Pella 16218 Product number is for 15 mm diameter stainless steel sample puck. Also available in 6 mm, 10 mm, 12 mm, and 20 mm diameters at https://www.tedpella.com/AFM_html/AFM.aspx#anchor842459
Sapphire substrate Bruker PFQNM-SMPKIT-12M Extremely hard surface (E = 345 GPa) for measuring deflection sensitivity of probes (want all of the deflection to come from the probe, not the substrate). Part of the PF-QNM/modulus standards kit.
Scanning electron microscope Hitachi S-3400N-II Located at Boise State. Used to perform co-localized SEM/EDS on all samples except additively manufactured (AM) Ti-6Al-4V.
Silicon AFM probes (standard) NuNano Scout 350 Standard tapping mode silicon probe with reflective aluminum backside coating; k = 42 N/m (nominal), f0 = 350 kHz. Nominal R = 5 nm. Also available uncoated or with reflective gold backside coating. Probes with similar specifications are available from other manufacturers (e.g., Bruker TESPA-V2).
Silicon AFM probes (stiff) Bruker RTESPA-525, RTESPA-525-30  Rotated tip etched silicon probes with reflective aluminum backside coating; k = 200 N/m (nominal), f0 = 525 kHz. Nominal R = 8 nm for RTESPA-525, R = 30 nm for RTESPA-525-30. Spring constant of each RTESPA-525-30 is measured individually at the factory via laser Doppler vibrometry and supplied with the probe.
Silicon carbide grit paper (abrasive discs) Allied 50-10005 120 grit
Silicon nitride AFM probes (soft, large radius hemispherical tip) Bruker MLCT-SPH-5UM, MLCT-SPH-5UM-DC Also MLCT-SPH-1UM-DC. New product line of factory-calibrated (probe radius and spring constants of all cantilevers) large radius (R = 1 or 5 mm) hemispherical tip (at the end of a 23 mm long cylindrical shaft) probes. DC = drift compensation coating. 6 cantilevers/probe (A-F). Nominal spring constants: A, k = 0.07 N/m; B, k = 0.02 N/m; C, k = 0.01 N/m; D, k = 0.03 N/m; E, k = 0.1 N/m; F, k = 0.6 N/m.
Silicon nitride AFM probes (soft, medium sharp tip) Bruker DNP 4 cantilevers/probe (A-d). Nominal spring constants: A, k = 0.35 N/m; B, k = 0.12 N/m; C, k = 0.24 N/m; D, k = 0.06 N/m. Nominal radii of curvature, R = 10 nm.
Silicon nitride AFM probes (soft, sharp tip) Bruker ScanAsyst-Air Nominal values: resonance frequency, f0 = 70 kHz; spring constant, k = 0.4 N/m; radius of curvature, R = 2 nm. Designed for force curve based AFM imaging.
Superglue Henkel Loctite 495 Cyanoacrylate based instant adhesive. Lots of roughly equivalent products are readily available.
Syringe pump New Era Pump Systems NE1000US One channel syringe pump system with infusion and withdrawal capacity
Tip characterization standard Bruker PFQNM-SMPKIT-12M Titanium (Ti) roughness standard. Part of the PF-QNM/modulus standards kit.
Ultrahigh purity nitrogen (UHP N2), 99.999% Norco SPG TUHPNI - T T size compressed gas cylinder of ultrahigh purity (99.999%) nitrogen for drying samples
Ultramicrotome Leica EM UC6 Equipped with a glass blade (standard, for intial sample preparation) and a diamond blade (for final preparation)
Ultrapure water Thermo Fisher Barnstead Nanopure Model 7146 Model has been discontinued, but equivalent products are available. Produces ≥18.2 MΩ*cm ultrapure water with 1-5 ppb TOC (total organic content), per inline UV monitoring. Includes 0.2 µm particulate filter, ion exchange columns, and UV oxidation chamber.
Variable Speed Grinder Buehler EcoMet 3000 Used with silicon carbide grit papers during hand polishing.
Vibration isolation table (active) Herzan TS-140 Used with Bruker MultiMode AFM. Sits on a TMC 65-531 vibration isolation table. Bruker Dimension Icon AFM utilizes strictly passive vibration isolation (comes from manufacturer with custom acoustic hood, air table, and granite slab).
Vibration isolation table (passive) TMC 65-531 35" x 30" vibration isolation table with optional air damping (disabled). Used with Bruker MultiMode AFM. Herzan TS-140 "Table Stable" active vibration control table is located on top.

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