Microscopia a forza atomica Nanoindentazione basata su sbalzo: misure di proprietà meccaniche su scala nanometrica in aria e fluido

Summary

La quantificazione dell'area di contatto e della forza applicata dalla punta di una sonda a forza atomica (AFM) su una superficie del campione consente la determinazione delle proprietà meccaniche su scala nanometrica. Vengono discusse le migliori pratiche per implementare la nanoindentazione basata su sbalzo AFM in aria o fluido su campioni morbidi e duri per misurare il modulo elastico o altre proprietà nanomeccaniche.

Abstract

Un microscopio a forza atomica (AFM) misura fondamentalmente l'interazione tra la punta di una sonda AFM su scala nanometrica e la superficie del campione. Se la forza applicata dalla punta della sonda e la sua area di contatto con il campione possono essere quantificate, è possibile determinare le proprietà meccaniche su scala nanometrica (ad esempio, elastico o modulo di Young) della superficie da sondare. Qui viene fornita una procedura dettagliata per eseguire esperimenti quantitativi di nanoindentazione basati su cantilever AFM, con esempi rappresentativi di come la tecnica può essere applicata per determinare i moduli elastici di un'ampia varietà di tipi di campione, che vanno da kPa a GPa. Questi includono cellule staminali mesenchimali vive (MSC) e nuclei in tampone fisiologico, sezioni trasversali di pino loblolly disidratate incorporate in resina e scisti di Bakken di varia composizione.

Inoltre, la nanoindentazione basata su sbalzo AFM viene utilizzata per sondare la resistenza alla rottura (cioè la forza di rottura) dei doppi strati fosfolipidici. Importanti considerazioni pratiche come la scelta e lo sviluppo del metodo, la selezione e la calibrazione della sonda, l'identificazione della regione di interesse, l'eterogeneità del campione, le dimensioni e le proporzioni delle caratteristiche, l'usura della punta, la rugosità della superficie e l'analisi dei dati e le statistiche di misurazione sono discusse per aiutare la corretta implementazione della tecnica. Infine, viene dimostrata la co-localizzazione di mappe nanomeccaniche derivate da AFM con tecniche di microscopia elettronica che forniscono ulteriori informazioni sulla composizione elementare.

Introduction

Comprendere le proprietà meccaniche dei materiali è uno dei compiti più fondamentali ed essenziali in ingegneria. Per l'analisi delle proprietà dei materiali sfusi, sono disponibili numerosi metodi per caratterizzare le proprietà meccaniche dei sistemi di materiali, tra cui prove di trazione¹, prove di compressione² e prove di flessione (flessione) a tre o quattro punti³. Mentre questi test su microscala possono fornire informazioni preziose sulle proprietà dei materiali sfusi, sono generalmente condotti fino al fallimento e sono quindi distruttivi. Inoltre, mancano della risoluzione spaziale necessaria per studiare accuratamente le proprietà su micro e nanoscala di molti sistemi di materiali che sono di interesse oggi, come film sottili, materiali biologici e nanocompositi. Per iniziare ad affrontare alcuni dei problemi con i test meccanici su larga scala, principalmente la loro natura distruttiva, i test di microdurezza sono stati adottati dalla mineralogia. La durezza è una misura della resistenza di un materiale alla deformazione plastica in condizioni specifiche. In generale, i test di microdurezza utilizzano una sonda rigida, solitamente realizzata in acciaio temprato o diamantato, per rientrare in un materiale. La profondità di indentazione e/o l'area risultanti possono quindi essere utilizzate per determinare la durezza. Sono stati sviluppati diversi metodi, tra cui Vickers⁴, Knoop⁵ e Brinell⁶ durezza; Ognuno fornisce una misura della durezza del materiale su microscala, ma in condizioni e definizioni diverse, e come tale produce solo dati che possono essere confrontati con test eseguiti nelle stesse condizioni.

La nanoindentazione strumentata è stata sviluppata per migliorare i valori relativi ottenuti tramite i vari metodi di test di microdurezza, migliorare la risoluzione spaziale possibile per l'analisi delle proprietà meccaniche e consentire l'analisi di film sottili. È importante sottolineare che, utilizzando il metodo sviluppato per la prima volta da Oliver e Pharr⁷, l'elastico o modulo di Young, E, di un materiale campione può essere determinato tramite nanoindentazione strumentata. Inoltre, utilizzando una sonda nanoindentatrice piramidale a tre lati Berkovich (la cui funzione di area ideale della punta corrisponde a quella della sonda piramidale a quattro lati Vickers)⁸, è possibile effettuare un confronto diretto tra le misurazioni della durezza su scala nanometrica e su microscala più tradizionali. Con la crescita della popolarità dell'AFM, anche la nanoindentazione basata su sbalzo AFM ha iniziato a ricevere attenzione, in particolare per misurare le proprietà meccaniche dei materiali più morbidi. Di conseguenza, come illustrato schematicamente nella Figura 1, le due tecniche più comunemente impiegate oggi per interrogare e quantificare le proprietà meccaniche su scala nanometrica sono la nanoindentazione strumentata (Figura 1A) e la nanoindentazione basata su sbalzo AFM (Figura 1B)⁹, l'ultima delle quali è il fulcro di questo lavoro.

Figura 1: Confronto tra sistemi di nanoindentazione strumentati e basati su cantilever AFM. Diagrammi schematici che illustrano i sistemi tipici per condurre (A) nanoindentazione strumentata e (B) nanoindentazione a sbalzo AFM. Questa cifra è stata modificata da Qian et ^al.51. Abbreviazione: AFM = microscopia a forza atomica. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Sia la nanoindentazione strumentata che quella basata su sbalzo AFM impiegano una sonda rigida per deformare una superficie campione di interesse e monitorare la forza risultante e lo spostamento in funzione del tempo. Tipicamente, il carico desiderato (cioè forza) o il profilo di spostamento (Z-piezo) viene specificato dall'utente tramite l'interfaccia software e controllato direttamente dallo strumento, mentre viene misurato l'altro parametro. La proprietà meccanica più spesso ottenuta da esperimenti di nanoindentazione è il modulo elastico (E), noto anche come modulo di Young, che ha unità di pressione. Il modulo elastico di un materiale è una proprietà fondamentale relativa alla rigidezza del legame ed è definito come il rapporto tra la tensione di trazione o compressione (σ, la forza applicata per unità di area) e la deformazione assiale (ε, la deformazione proporzionale lungo l'asse di indentazione) durante la deformazione elastica (cioè reversibile o temporanea) prima dell'inizio della deformazione plastica (equazione [1]):

(1)

Va notato che, poiché molti materiali (soprattutto i tessuti biologici) sono in realtà viscoelastici, in realtà il modulo (dinamico o complesso) è costituito sia da componenti elastiche (stoccaggio, in fase) che viscose (perdita, fuori fase). In pratica, ciò che viene misurato in un esperimento di nanoindentazione è il modulo ridotto, E *, che è correlato al vero modulo campione di interesse, E, come mostrato nell'equazione (2):

(2)

Dove punta E e punta ν sono rispettivamente il modulo elastico e il rapporto di Poisson della punta del nanopenetratore, e ν è il rapporto di Poisson stimato del campione. Il rapporto di Poisson è il rapporto negativo tra la deformazione trasversale e quella assiale, e quindi indica il grado di allungamento trasversale di un campione dopo essere sottoposto a deformazione assiale (ad esempio, durante il carico di nanoindentazione), come mostrato nell'equazione (3):

(3)

La conversione dal modulo ridotto a quello effettivo è necessaria perché a) parte della deformazione assiale impartita dalla punta del penetratore può essere convertita in deformazione trasversale (cioè, il campione può deformarsi per espansione o contrazione perpendicolare alla direzione di carico), e b) la punta del penetratore non è infinitamente dura, e quindi l'atto di indentare il campione provoca una certa (piccola) quantità di deformazione della punta. Si noti che nel caso in cui la punta E >> E (cioè la _punta del penetratore è molto più dura del campione, il che è spesso vero quando si utilizza una sonda diamantata), la relazione tra il modulo del campione ridotto e quello effettivo si semplifica notevolmente in E ≈ E*(1 - v²). Mentre la nanoindentazione strumentata è superiore in termini di accurata caratterizzazione della forza e gamma dinamica, la nanoindentazione basata su sbalzo AFM è più veloce, fornisce ordini di grandezza maggiore forza e sensibilità allo spostamento, consente immagini a risoluzione più elevata e una migliore localizzazione dell'indentazione e può simultaneamente sondare proprietà magnetiche ed elettriche su scala nanometrica⁹. In particolare, la nanoindentazione basata su sbalzo AFM è superiore per la quantificazione delle proprietà meccaniche su scala nanometrica di materiali morbidi (ad esempio, polimeri, gel, doppi strati lipidici e cellule o altri materiali biologici), film estremamente sottili (sub-μm) (dove gli effetti del substrato possono entrare in gioco a seconda della profondità di indentazione)^10,11 e materiali bidimensionali sospesi (2D)^12,13,14 come il grafene ^15,16, mica 17, nitruro di boro esagonale (h-BN)¹⁸ o dichalcogenuri dei metalli di transizione (TMDC; ad esempio, MoS₂)¹⁹. Ciò è dovuto alla sua squisita sensibilità alla forza (sub-nN) e allo spostamento (sub-nm), che è importante per determinare con precisione il punto di contatto iniziale e rimanere all'interno della regione di deformazione elastica.

Nella nanoindentazione a sbalzo AFM, lo spostamento di una sonda AFM verso la superficie del campione viene azionato da un elemento piezoelettrico calibrato (Figura 1B), con il cantilever flessibile che alla fine si piega a causa della forza resistiva sperimentata al contatto con la superficie del campione. Questa flessione o deflessione del cantilever viene tipicamente monitorata riflettendo un laser sul retro del cantilever e in un fotorivelatore (rilevatore sensibile alla posizione [PSD]). Insieme alla conoscenza della rigidità a sbalzo (in nN/nm) e della sensibilità alla deflessione (in nm/V), è possibile convertire questa deflessione a sbalzo misurata (in V) nella forza (in nN) applicata al campione. Dopo il contatto, la differenza tra il movimento Z-piezo e la deflessione a sbalzo produce la profondità di indentazione del campione. In combinazione con la conoscenza della funzione dell'area della punta, ciò consente di calcolare l'area di contatto punta-campione. La pendenza delle porzioni di contatto delle curve forza-distanza o forza-spostamento (F-D) risultanti può quindi essere adattata utilizzando un modello di meccanica di contatto appropriato (vedere la sezione Analisi dei dati della discussione) per determinare le proprietà nanomeccaniche del campione. Mentre la nanoindentazione basata su sbalzo AFM possiede alcuni vantaggi distinti rispetto alla nanoindentazione strumentata come descritto sopra, presenta anche diverse sfide pratiche di implementazione, come la calibrazione, l'usura della punta e l'analisi dei dati, che saranno discusse qui. Un altro potenziale svantaggio della nanoindentazione basata su AFM a sbalzo è l'ipotesi di elasticità lineare, poiché il raggio di contatto e le profondità di indentazione devono essere molto più piccoli del raggio del penetratore, che può essere difficile da ottenere quando si lavora con sonde AFM su scala nanometrica e / o campioni che mostrano rugosità superficiale significativa.

Tradizionalmente, la nanoindentazione è stata limitata a singole posizioni o piccoli esperimenti di indentazione della griglia, in cui viene selezionata una posizione desiderata (ad esempio, la regione di interesse [ROI]) e viene eseguito un singolo rientro controllato, più rientri in una singola posizione separati da un certo tempo di attesa e / o una griglia grossolana di rientri vengono eseguiti a una frequenza dell'ordine di Hz. Tuttavia, i recenti progressi nell'AFM consentono l'acquisizione simultanea di proprietà meccaniche e topografia attraverso l'utilizzo di modalità di imaging basate su curve di forza ad alta velocità (indicate da vari nomi commerciali a seconda del produttore del sistema), in cui le curve di forza sono condotte a una velocità di kHz sotto controllo del carico, con la massima forza del campione di punta utilizzata come setpoint di imaging. Sono stati inoltre sviluppati metodi point-and-shoot, che consentono l'acquisizione di un'immagine topografica AFM seguita da una successiva nanoindentazione selettiva nei punti di interesse all'interno dell'immagine, offrendo un controllo spaziale su scala nanometrica sulla posizione della nanoindentazione. Sebbene non sia l'obiettivo principale di questo lavoro, esempi specifici di applicazione selezionati sia di imaging basato sulla curva di forza che di nanoindentazione basata su cantilever point-and-shoot sono presentati nei risultati rappresentativi e possono essere utilizzati in combinazione con il protocollo descritto di seguito, se disponibile sulla particolare piattaforma AFM utilizzata. In particolare, questo lavoro delinea un protocollo generalizzato per l'implementazione pratica della nanoindentazione a sbalzo AFM su qualsiasi sistema AFM capace e fornisce quattro esempi di casi d'uso (due in aria, due in fluido) della tecnica, inclusi risultati rappresentativi e una discussione approfondita delle sfumature, delle sfide e delle considerazioni importanti per impiegare con successo la tecnica.

Protocol

NOTA: A causa dell'ampia varietà di AFM disponibili in commercio e della diversità dei tipi di campioni e delle applicazioni esistenti per la nanoindentazione basata su cantilever, il protocollo che segue è intenzionalmente progettato per essere di natura relativamente generale, concentrandosi sui passaggi condivisi necessari per tutti gli esperimenti di nanoindentazione basati su cantilever, indipendentemente dallo strumento o dal produttore. Per questo motivo, gli autori presumono che il lettore possieda almeno una familiarità di base con il funzionamento dello strumento specifico scelto per eseguire la nanoindentazione basata su cantilever. Tuttavia, oltre al protocollo generale descritto di seguito, una dettagliata procedura operativa standard passo-passo (SOP) specifica per l'AFM e il software utilizzato qui (vedi Tabella dei materiali), incentrata sulla nanoindentazione a sbalzo dei campioni nel fluido, è inclusa come materiale supplementare.

1. Preparazione del campione e configurazione dello strumento

1. Preparare il campione in modo da ridurre al minimo sia la rugosità superficiale (idealmente su scala nanometrica, ~ 10 volte inferiore alla profondità di indentazione prevista) sia la contaminazione senza alterare le proprietà meccaniche dell'area o delle aree di interesse.
2. Selezionare una sonda AFM appropriata per la nanoindentazione del campione previsto in base al mezzo (cioè aria o fluido), al modulo previsto, alla topografia del campione e alle dimensioni delle caratteristiche rilevanti (vedere le considerazioni sulla selezione della sonda nella discussione). Caricare la sonda sul supporto della sonda (vedere la tabella dei materiali) e collegare il supporto della sonda alla testa di scansione AFM.
3. Selezionare una modalità di nanoindentazione appropriata nel software AFM che offra all'utente il controllo delle singole rampe (ad esempio, curve di forza-spostamento).
   NOTA: La modalità specifica differirà tra i diversi produttori di AFM e i singoli strumenti (vedere SOP fornita nel materiale supplementare per maggiori dettagli e un esempio specifico).
4. Allineare il laser sul retro del cantilever della sonda, di fronte alla posizione della punta della sonda e nel PSD.
   NOTA: Vedere l'esempio di applicazione delle cellule staminali mesenchimali per maggiori dettagli su considerazioni importanti quando si allinea il laser e si conduce la nanoindentazione nel fluido, in particolare, evitando detriti galleggianti e / o bolle d'aria, che possono disperdere o rifrangere il raggio. Potrebbe anche essere necessario regolare l'ottica AFM per compensare l'indice di rifrazione del fluido ed evitare di schiantare la sonda quando si innesta la superficie.
   1. Centrare lo spot del raggio laser sul retro del cantilever massimizzando la tensione di somma (Figura 2A).
   2. Centrare lo spot del raggio laser riflesso sul PSD regolando i segnali di deflessione X e Y (cioè orizzontale e verticale) in modo che siano il più vicino possibile allo zero (Figura 2A), fornendo così il massimo intervallo di deflessione rilevabile per produrre una tensione di uscita proporzionale alla deflessione a sbalzo.
5. Se non si è sicuri della topografia del campione, della rugosità superficiale e/o della densità superficiale (nel caso di scaglie o particelle), eseguire una scansione topografica AFM prima di qualsiasi esperimento di nanoindentazione per confermare l'idoneità del campione, come descritto nella fase 1.1 e nella parte di preparazione del campione della discussione.

Figura 2: Monitor del rilevatore sensibile alla posizione. (A) Display PSD che indica un laser correttamente allineato che si riflette sul retro della sonda a sbalzo e sul centro del PSD (come evidenziato dalla grande tensione di somma e dalla mancanza di deflessione verticale o orizzontale) prima di innestarsi sulla superficie del campione (cioè sonda fuori contatto con il campione). (B) La tensione di deflessione verticale aumenta quando il cantilever viene deviato (ad esempio, quando la sonda entra in contatto con il campione). Abbreviazioni: PSD = rilevatore sensibile alla posizione; VERT = verticale; HORIZ = orizzontale; AMPL = ampiezza; n/d = non applicabile. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

2. Calibrazione della sonda

NOTA: Sono necessari tre valori per quantificare le proprietà meccaniche di un campione utilizzando i dati della curva F-D raccolti durante la nanoindentazione a sbalzo: la sensibilità di deflessione (DS) del sistema a sbalzo/PSD (NM/V o V/nm), la costante della molla a sbalzo (nN/nm) e l'area di contatto della sonda, spesso espressa in termini di raggio effettivo della punta della sonda (nm) ad una data profondità di indentazione inferiore al raggio della sonda nel caso di una sonda sferica mancia.

1. Calibrare il DS del sistema sonda/AFM facendo ramping su un materiale estremamente duro (ad esempio, zaffiro, E = 345 GPa) in modo che la deformazione del campione sia ridotta al minimo e quindi il movimento Z misurato del piezo dopo l'inizio del contatto punta-campione venga convertito esclusivamente in deflessione a sbalzo.
   NOTA: La calibrazione DS deve essere eseguita nelle stesse condizioni degli esperimenti di nanoindentazione pianificati (cioè temperatura, mezzo, ecc.) per riflettere accuratamente il DS del sistema durante gli esperimenti. Un lungo periodo di riscaldamento laser (30 minuti) può essere necessario per la massima precisione per consentire il raggiungimento dell'equilibrio termico e la stabilità della potenza di uscita del laser stabile e della stabilità di puntamento. Il DS deve essere rimisurato ogni volta che il laser viene riallineato, anche se viene utilizzata la stessa sonda, poiché il DS dipende dall'intensità e dalla posizione del laser sul cantilever, nonché dalla qualità della riflessione della sonda (ad esempio, la degradazione del rivestimento posteriore della sonda influenzerà il DS) e dalla sensibilità della PSD²⁰.
   1. Impostare ed eseguire le impronte di calibrazione DS sullo zaffiro per ottenere approssimativamente la stessa deflessione della sonda (in V o nm) dei rientri del campione pianificati, poiché lo spostamento misurato è una funzione dell'angolo di deflessione della punta e diventa non lineare per grandi deflessioni.
   2. Determinare il DS (in nm/V) o, in alternativa, la sensibilità della leva ottica inversa (in V/nm), dalla pendenza della porzione lineare del regime di contatto dopo il punto di contatto iniziale nella curva F-D risultante, come mostrato nella Figura 3A.
   3. Ripetere la rampa almeno 5x, registrando ogni valore DS. Utilizzare la media dei valori per la massima precisione. Se la deviazione standard relativa (RSD) delle misurazioni supera ~ 1%, rimisurare il DS, poiché a volte le prime curve F-D non sono ideali a causa dell'introduzione iniziale di forze di attrazione.
   4. Se la costante della molla del cantilever, k, non è calibrata in fabbrica (ad esempio, tramite vibrometria laser Doppler [LDV]), calibrare la costante della molla.
      NOTA: Il metodo di regolazione termica è ottimale per cantilever relativamente morbidi con k < 10 N/m (vedere la sezione costante di molla della discussione per un elenco e una descrizione dei metodi alternativi, in particolare per i cantilever rigidi con k > 10 N/m). Come mostrato nella Figura 3B, C, la regolazione termica è tipicamente integrata nel software di controllo AFM.
2. Se la sonda non viene fornita con una misurazione del raggio di punta calibrata in fabbrica (ad esempio, tramite imaging al microscopio elettronico a scansione [SEM]), misurare il raggio di punta effettivo, R.
   NOTA: Esistono due metodi comuni per misurare il raggio della punta (vedere la sezione di discussione corrispondente), ma il più comune per le punte della sonda su scala nanometrica è il metodo della ricostruzione della punta cieca (BTR), che utilizza uno standard di rugosità (vedi Tabella dei materiali) contenente numerose caratteristiche estremamente nitide (sub-nm) che servono a visualizzare efficacemente la punta, piuttosto che l'immagine della punta del campione.
   1. Se si utilizza il metodo BTR, visualizzare il campione di rugosità (caratterizzazione della punta) utilizzando una frequenza di scansione lenta (<0,5 Hz) e guadagni di feedback elevati per ottimizzare il tracciamento delle caratteristiche molto nitide. Scegli una dimensione dell'immagine e una densità di pixel (risoluzione) in base al raggio di punta previsto (ad esempio, un'immagine di 1024 x 1024 pixel di un'area di 3 μm x 3 μm avrà una risoluzione laterale di ~ 3 nm).
   2. Utilizzare il software di analisi delle immagini AFM (vedere la tabella dei materiali) per modellare la punta della sonda e stimarne il raggio finale e il diametro effettivo della punta alla profondità di rientranza del campione prevista, come mostrato nella Figura 3D-F.
3. Dopo aver completato la calibrazione della sonda, immettere i valori DS, k e R nel software dello strumento, come mostrato nella Figura 4A.
   1. Immettere una stima del rapporto di Poisson del campione, ν, per consentire la conversione del modulo ridotto misurato nel^{modulo 9 effettivo} del campione. Se si utilizza un modello di meccanica di contatto conico o conisferico basato sulla forma della punta e sulla profondità di indentazione, è necessario inserire anche il semiangolo della punta (Figura 4C).
      NOTA: Il modulo è relativamente insensibile a piccoli errori o incertezze nel rapporto di Poisson stimato. Una stima di ν = 0,2-0,3 è un buon punto di partenza per molti materiali²¹.

Figura 3: Taratura della sonda. (A) Determinazione della sensibilità alla deflessione. Risultato di una misura rappresentativa della sensibilità alla deflessione effettuata su un substrato di zaffiro (E = 345 GPa) per una sonda standard della modalità maschiatura (k nominale = 42 N/m; vedi Tabella dei materiali) con un rivestimento in alluminio riflettente. Vengono mostrati l'approccio misurato (traccia blu) e le curve di retrazione o ritiro (traccia rossa). La sensibilità di deflessione misurata di 59,16 nm/V è stata determinata adattando la curva di attacco tra i punti di contatto a scatto e di turn-around, come indicato dalla regione tra le linee rosse tratteggiate verticali. La regione di deflessione negativa evidente nella curva di ritrazione/prelievo prima di staccare la superficie è indicativa dell'adesione punta-campione. (B,C) Sintonizzazione termica. Spettri di rumore termico a sbalzo rappresentativi (tracce blu) con corrispondenti adattamenti (tracce rosse) per due diverse sonde. (B) Impostazione della regolazione termica e parametri di adattamento per una sonda di imaging AFM basata sulla curva di forza standard (vedi Tabella dei materiali) con la sua costante nominale della molla k = 0,4 N/m utilizzata come ipotesi iniziale. L'adattamento dello spettro di rumore termico a sbalzo produce una frequenza di risonanza fondamentale di f 0 = 79,8 kHz, che è ragionevolmente in accordo con il valore nominale di f₀ = 70 kHz. Il fattore Q misurato è 58,1. La bontà di adattamento (R² = 0,99) si basa sull'accordo dell'adattamento con i dati tra le due linee rosse tratteggiate verticali. Si noti che è importante conoscere e inserire sia la temperatura ambiente che la sensibilità alla deflessione per risultati accurati. (C) Spettro di rumore termico a sbalzo e adattamento corrispondente (cioè sintonizzazione termica) con costante di molla calcolata risultante k = 0,105 N/m per un cantilever estremamente morbido utilizzato per eseguire misure nanomeccaniche su cellule vive e nuclei isolati. Si noti la frequenza di risonanza naturale significativamente più bassa di ~ 2-3 kHz. (D-F) Ricostruzione della punta cieca. Flusso di lavoro rappresentativo di ricostruzione della punta cieca per una sonda a punta diamantata (nominale R = 40 nm; vedi tabella dei materiali). (D) Un'immagine di 5 μm x 5 μm di un campione di caratterizzazione della punta costituito da una serie di punte di titanio estremamente nitide (sub-nm) che servono a fotografare la punta della sonda AFM. (E) Modello ricostruito risultante (immagine in altezza invertita) della punta della sonda. (F) Risultati del raccordo di ricostruzione della punta cieca, compreso un raggio finale stimato di R = 29 nm e un diametro effettivo della punta di 40 nm ad un'altezza selezionata dall'utente di 8 nm (cioè profondità di rientro << R) dall'apice della punta, calcolati convertendo l'area di contatto punta-campione a tale altezza in un diametro effettivo assumendo un profilo circolare (cioè A = πr 2 = π(d/2)²) per l'uso con modelli di meccanica a contatto sferico. Abbreviazioni: AFM = microscopia a forza atomica; ETD = diametro effettivo della punta. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Input dell'interfaccia software. (A) Costanti di taratura della sonda. Interfaccia utente del software (vedere Tabella dei materiali) per inserire la sensibilità di deflessione misurata, la costante della molla e il raggio della punta per consentire misurazioni nanomeccaniche quantitative. Il rapporto di Poisson sia della sonda che del campione è necessario per calcolare l'elastico o il modulo di Young del campione dalle curve di forza di nanoindentazione basate su cantilever. (B) Finestra di controllo della rampa. Interfaccia utente software (vedi Tabella dei materiali) per l'impostazione di esperimenti di nanoindentazione basati su cantilever, organizzati nei parametri che descrivono la rampa stessa (cioè il profilo di indentazione), l'innesco dello strumento (ad esempio, il controllo della forza rispetto allo spostamento), la successiva analisi della forza e i limiti di movimento (per migliorare la sensibilità di misura restringendo l'intervallo su cui il convertitore A / D deve operare nel controllo del piezo Z e nella lettura della deflessione PSD). (C) Il semiangolo della punta (basato sulla geometria della sonda o sulla misura diretta) è importante se viene impiegato un modello di meccanica di contatto conica, piramidale o conisferica (ad esempio, Sneddon). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

3. Raccogliere dati di spostamento della forza (F-D)

NOTA: i valori dei parametri qui presentati (vedere la Figura 4B) possono variare a seconda della forza e dell'intervallo di rientro per un determinato campione.

1. Naviga il campione sotto la testa AFM e interagisci sulla regione di interesse desiderata.
   1. Monitorare il segnale di deflessione verticale (Figura 2B) o eseguire una piccola rampa iniziale (~50-200 nm) (Figura 4B) per verificare che la punta e il campione siano in contatto (vedere Figura 5A).
   2. Regolare leggermente la posizione della testa AFM verso l'alto (in passi corrispondenti a ~ 50% della dimensione della rampa completa) e rampare di nuovo. Ripetere l'operazione fino a quando la punta e il campione non sono appena fuori contatto, come evidenziato da una rampa quasi piatta (Figura 5B) e da una minima deflessione verticale del cantilever (Figura 2A).
   3. Una volta che non è presente alcuna interazione evidente punta-campione (confrontare la Figura 2A e la Figura 2B ), abbassare la testa AFM di una quantità corrispondente a ~50%-100% della dimensione della rampa per garantire che la punta della sonda non si schianti contro il campione mentre si sposta manualmente la testa AFM. Rampa di nuovo, ripetendo fino a quando non si osserva una curva buona (Figura 5D) o una curva simile alla Figura 5C. In quest'ultimo caso, eseguire un'ulteriore piccola regolazione AFM di abbassamento della testa pari a ~ 20% -50% della dimensione della rampa per ottenere un buon contatto e una curva di forza simile a quella mostrata nella Figura 5D.
2. Regolare i parametri della rampa (come descritto di seguito e mostrato in Figura 4B) per ottimizzare lo strumento, la sonda e il campione, e ottenere rampe simili a quelle mostrate nella Figura 5D.
   1. Selezionare una dimensione di rampa appropriata (ad esempio, movimento totale Z-piezo attraverso un ciclo di rampa) a seconda del campione (ad esempio, spessore, modulo previsto, rugosità superficiale) e profondità di rientro desiderata.
      NOTA: Per i campioni più rigidi, è probabile che si verifichi una minore deformazione del campione (e quindi una maggiore deflessione della sonda per un dato movimento Z-piezoelettrico), quindi la dimensione della rampa può generalmente essere inferiore rispetto ai campioni più morbidi. Le dimensioni tipiche delle rampe per campioni rigidi e cantilever possono essere di decine di nm, mentre per campioni morbidi e rampe a sbalzo possono avere dimensioni comprese tra centinaia di nm e pochi μm; Esempi specifici di candidature selezionate sono presentati nella sezione Risultati rappresentativi. Si noti che le dimensioni minime e massime possibili delle rampe dipendono dallo strumento.
   2. Selezionare una frequenza di rampa appropriata (1 Hz è un buon punto di partenza per la maggior parte dei campioni).
      NOTA: La velocità di rampa può essere limitata da velocità/larghezze di banda elettroniche di controllo e/o rilevamento. In combinazione con la dimensione della rampa, la velocità della rampa determina la velocità della punta. La velocità della punta è particolarmente importante da considerare quando si indentano materiali morbidi in cui gli effetti viscoelastici possono causare artefatti di isteresi ^9,22.
   3. Scegli se utilizzare una rampa attivata (con controllo del carico) o non attivata (a spostamento controllato).
      NOTA: in una rampa attivata, il sistema si avvicina al campione in fasi definite dall'utente (in base alle dimensioni della rampa e alla risoluzione o al numero di punti dati) fino a quando non viene rilevata la soglia di attivazione desiderata (ad esempio, forza di setpoint o deflessione a sbalzo), a quel punto il sistema si ritrarrà nella sua posizione originale e visualizzerà la curva F-D. In una rampa non attivata, il sistema estende semplicemente il piezo Z alla distanza specificata dalla dimensione della rampa definita dall'utente e visualizza la curva F-D misurata. Le rampe attivate sono preferite per la maggior parte dei casi d'uso, ma le rampe non attivate possono essere utili quando si studiano materiali morbidi che non presentano un punto di contatto nitido e facilmente identificabile.
      1. Se si sceglie una rampa attivata, impostare la soglia di attivazione (forza massima consentita definita dall'utente o deflessione della rampa) per ottenere il rientro desiderato nel campione.
         NOTA: l'uso di una soglia di trigger significa che una rampa può terminare (cioè, la sonda può iniziare a ritrarsi) prima di raggiungere la dimensione completa della rampa (estensione Z-piezoelettrica) specificata. I valori possono variare da pochi nN a pochi μN, a seconda del sistema di campionamento della punta.
      2. Impostare la posizione della rampa per determinare la porzione della portata massima del piezo Z che verrà utilizzata per eseguire la rampa . Assicurarsi che l'intervallo totale della dimensione della rampa non inizi o finisca al di fuori dell'intervallo massimo Z-piezo (vedere esempi rappresentativi nella Figura 6), altrimenti una porzione della curva F-D non rappresenterà alcuna misura fisica (cioè, il piezo Z sarà completamente esteso o retratto, non in movimento).
   4. Impostare il numero di campioni/rampa (ad esempio, 512 campioni/rampa ) per ottenere la risoluzione desiderata della misura (cioè la densità puntiforme della curva F-D).
      NOTA: i campioni/rampe massimi possono essere limitati da vincoli software (dimensioni del file) o hardware (ad esempio, velocità di conversione da analogico a digitale [A/D], a seconda della velocità di rampa). È anche possibile limitare l'intervallo Z-piezoelettrico o di deflessione consentito (vedere i parametri limite nella Figura 4B) per aumentare la risoluzione effettiva del convertitore A/D del sistema.
   5. Impostare la rotazione a X per ridurre le forze di taglio sul campione e sulla punta spostando simultaneamente leggermente la sonda nella direzione X (parallela al cantilever) mentre si rientrava nella direzione Z (perpendicolare al cantilever). Utilizzare un valore per la rotazione a X uguale all'angolo di offset del supporto della sonda rispetto alla normale alla superficie (12° è tipico).
      NOTA: La rotazione a X è necessaria perché il cantilever è montato nel supporto della sonda con una piccola angolazione rispetto alla superficie per consentire al raggio laser incidente di riflettersi nella PSD. Inoltre, gli angoli anteriore e posteriore della punta della sonda possono differire l'uno dall'altro (cioè, la punta della sonda può essere asimmetrica). Informazioni più specifiche possono essere ottenute dai singoli produttori di sonde e AFM.

Figura 5: Ottimizzazione della separazione punta-campione dopo l'innesto per ottenere buone curve di forza. Esempi sequenziali di curve rappresentative forza-spostamento ottenute durante l'indentazione in fluido (soluzione salina tamponata con fosfato) su un nucleo di cellule staminali mesenchimali vive con un cantilever calibrato di nitruro di silicio morbido (k nominale = 0,04 N/m) terminante in una punta emisferica di raggio di 5 μm (vedi Tabella dei materiali). Le curve sono state ottenute nel processo di coinvolgimento della superficie cellulare e ottimizzazione dei parametri di indentazione, con l'approccio della sonda mostrato in blu e la ritrazione / ritiro in rosso. (A) La punta è già impegnata e a contatto con il campione prima di iniziare la rampa, con conseguente grande deflessione a sbalzo e forze, senza una linea di base piatta di precontatto. (B) Dopo aver spostato manualmente la punta sufficientemente lontano dal campione, una rampa di 2 μm non attivata produce una curva F-D quasi piatta (cioè praticamente nessuna variazione di forza). In condizioni ambientali, la curva sarebbe più piatta, ma in fluido, la viscosità del fluido può causare lievi deflessioni del cantilever della sonda durante una rampa come si vede qui, anche senza contatto superficiale. (C) Dopo essersi avvicinati leggermente alla superficie prima di iniziare la rampa, le curve di avvicinamento e di ritrazione mostrano un leggero aumento della forza (maggiore pendenza) vicino al punto di inversione della rampa (cioè transizione dall'avvicinamento al ritiro). Il segno rivelatore da cercare è che le curve di avvicinamento (blu) e ritiro (rosso) iniziano a sovrapporsi (regione indicata dal cerchio nero), il che è indicativo di un'interazione fisica con la superficie. (D) Una curva F-D ideale acquisita dopo l'ottimizzazione dei parametri di rampa e avvicinandosi leggermente (~1 μm) più vicina alla superficie della cella rispetto a C in modo che la sonda trascorra circa metà della rampa a contatto con la cella, consentendo una deformazione sufficiente per adattarsi alla porzione di contatto della curva di avvicinamento e determinare il modulo elastico. La linea di base relativamente lunga, piatta e a bassa rumorosità rende più facile per l'algoritmo di raccordo determinare il punto di contatto. Abbreviazione: F-D = forza-spostamento. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 6: Dimensioni e posizione della rampa. Monitor Z-piezo che mostra l'estensione della rampa (barra blu) rispetto all'intervallo di movimento Z-piezoelettrico totale disponibile (barra verde). (A) La posizione Z-piezoelettrica è vicina alla metà del suo raggio di movimento, come indicato sia dalla barra blu che si trova approssimativamente al centro della barra verde sia dall'attuale tensione Z-piezoelettrica (-78,0 V) approssimativamente compresa tra i suoi valori completamente retratti (-212,2 V) ed estesi (+102,2 V). (B) Z-piezo è esteso rispetto ad A, senza tensione di polarizzazione applicata. (C) Z-piezo è retratto rispetto ad A e B. (D) La posizione Z-piezoelettrica è la stessa di C a -156,0 V, ma la dimensione della rampa è stata aumentata rispetto ad A-C per sfruttare maggiormente l'intera gamma di movimento del piezo Z. € La dimensione della rampa è troppo grande per la posizione attuale della rampa, con conseguente estensione del piezo Z fino alla fine del suo intervallo. Ciò causerà la linea piatta della curva F-D poiché il sistema non può estendere ulteriormente il piezo Z. Abbreviazione: F-D = forza-spostamento. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

4. Analisi della curva F-D

1. Scegliere un pacchetto software di analisi dei dati appropriato. Selezionare e caricare i dati da analizzare.
   NOTA: molti produttori AFM e programmi software di elaborazione delle immagini AFM dispongono di supporto integrato per l'analisi della curva F-D. In alternativa, la maggiore flessibilità e le caratteristiche di un pacchetto dedicato di analisi della curva F-D, come il pacchetto software open source AtomicJ, possono essere utili²³, in particolare per l'elaborazione in batch e l'analisi statistica di grandi set di dati o l'implementazione di complessi modelli di meccanica dei contatti.
2. Valori calibrati di input per la costante della molla, DS e raggio della punta della sonda, insieme alle stime del modulo di Young e del rapporto di Poisson per la punta della sonda (in base alla sua composizione materiale) e al rapporto di Poisson del campione.
   NOTA: se si utilizza un penetratore a punta diamantata, i valori E punta = 1140 GPa e _punta ν₌ 0,07 possono essere utilizzati^21,24,25,26. Per una sonda al silicio standard, E punta = 170 GPa e _punta ν₌ 0,27 possono tipicamente essere usati, anche se il modulo di Young del silicio varia a seconda dell'orientamento cristallografico²⁷.
3. Scegli un modello di meccanica a contatto di nanoindentazione appropriato per la punta e il campione.
   NOTA: Per i molti modelli di punta sferica comuni (ad esempio, Hertz, Maugis, DMT, JKR), è imperativo che la profondità di indentazione nel campione sia inferiore al raggio della punta; altrimenti la geometria sferica della punta della sonda lascia il posto a una forma conica o piramidale (Figura 4C). Per i modelli conici (ad esempio, Sneddon²⁸) e piramidali, il semiangolo della punta (cioè l'angolo tra la parete laterale della punta e una linea bisecante perpendicolare all'estremità della punta; Figura 4C) deve essere noto e di solito è disponibile presso il produttore della sonda. Per ulteriori informazioni sui modelli di meccanica dei contatti, consultare la sezione Analisi dei dati di thedDiscussion.
4. Eseguire l'algoritmo di raccordo. Verificare il corretto adattamento delle curve F-D; un basso errore residuo corrispondente a una media R 2 vicino all'unità (ad esempio, R² > 0,9) è tipicamente indicativo di una buona aderenza al modello scelto^29,30. Controllare a campione le singole curve per ispezionare visivamente la curva, l'adattamento del modello e i punti di contatto calcolati, se lo si desidera (ad esempio, vedere la Figura 7 e la sezione Analisi dei dati della discussione).

Representative Results

Curve forza-spostamento
La Figura 7 mostra curve F-D rappresentative e quasi ideali ottenute da esperimenti di nanoindentazione eseguiti in aria su campioni di pino loblolly incorporati in resina (Figura 7A) e in fluido (soluzione salina tamponata con fosfato [PBS]) su nuclei di cellule staminali mesenchimali (MSC) (Figura 7B). L'uso di qualsiasi modello di meccanica di contatto si basa sulla determinazione accurata e affidabile del punto di contatto iniziale punta-campione. Pertanto, la linea di base relativamente piatta e a basso rumore che precede il punto di contatto iniziale e la pendenza regolare della porzione di contatto delle curve F-D mostrata nella Figura 7 le rende ideali per l'analisi per estrarre proprietà meccaniche, come evidenziato dall'eccellente accordo tra le curve di attacco (tracce blu) e i corrispondenti adattamenti (tracce verdi) nei riquadri.

Al contrario, ci sono diversi problemi comuni che un utente può incontrare durante l'esecuzione di nanoindentazione basata su cantilever che porterà a curve F-D non ideali. Uno dei problemi più comuni, in particolare subito dopo l'inserimento, è che la punta della sonda è già in contatto con il campione prima dell'inizio di una rampa (Figura 5A), che impedisce l'acquisizione della linea di base necessaria fuori contatto per determinare il punto di contatto iniziale. Ciò può anche portare a forze eccessivamente elevate nel caso di rampe non attivate (cioè a spostamento controllato). Ciò è particolarmente preoccupante quando si esegue una grande rampa con un cantilever rigido, poiché le forze risultanti possono rompere il cantilever e / o danneggiare il campione o la punta. Per evitare ciò, monitorare la tensione di deflessione verticale durante e dopo l'innesto iniziale. Se la tensione di deflessione verticale misurata è positiva (assumendo un corretto allineamento iniziale) come mostrato nella figura 2B, allora il cantilever viene deviato e la punta è a contatto con il campione. Tensioni positive maggiori corrispondono a deflessioni a sbalzo più grandi, ma indipendentemente dall'entità della deflessione, l'utente deve sollevare manualmente la testa AFM (ad esempio, utilizzando un motore passo-passo) lontano dal campione. La tensione di deflessione verticale dovrebbe diminuire lentamente e potrebbe anche scendere temporaneamente sotto lo zero nel caso di forti forze di attrazione del campione di punta, ma alla fine raggiungerà 0 V (o vicino a 0 V) una volta che la punta non è più a contatto con il campione (Figura 2A). Da questo punto, l'utente può riprendere l'ottimizzazione dei parametri della rampa e l'esecuzione dei trattini.

Un altro problema comune (in particolare per le rampe non attivate) è che l'intera curva F-D appaia quasi piatta, senza alcun segno evidente di interazione punta-campione, come mostrato in precedenza nella Figura 5B. Se disponibile sullo strumento, la soluzione a questo problema è abbassare manualmente la testa SPM di ~ 10% in meno rispetto alla dimensione della rampa (per evitare di schiantare la punta della sonda) e rampare di nuovo, ripetendo fino a quando non si osserva un evidente aumento della forza dovuto all'interazione punta-campione (Figura 5C, D) prima di procedere all'ottimizzazione di altri parametri di rampa.

Usura della punta
La Figura 8 presenta un esempio di usura della punta in un ambiente sperimentale. Una singola sonda AFM rigida in modalità maschiatura al silicio (vedi Tabella dei materiali) è stata utilizzata per visualizzare diverse grandi aree di un campione di scisto di Bakken (vedere l'esempio di applicazione corrispondente per maggiori dettagli) utilizzando un metodo di imaging basato sulla curva di forza rapida (velocità kHz), e il metodo BTR è stato utilizzato per modellare la geometria della punta e stimare il raggio finale della punta prima e dopo ciascuna delle tre immagini consecutive. I campioni di scisto in esame consistevano in una matrice di argilla e materiale organico (E ~ 5 GPa) con inclusioni minerali inorganiche molto più dure disperse in tutto (E > 30 GPa). Poiché il campione conteneva variazioni significative nella topografia superficiale (±2 μm) nelle grandi aree di scansione (85 μm x 85 μm) riprese, la velocità di scansione è stata impostata al minimo consentito sullo strumento utilizzato, 0,1 Hz. Con una velocità di acquisizione della curva di forza di 2 kHz e una velocità di scansione di 0,1 Hz, nel corso di una singola immagine di 1024 x 1024 pixel ci sono state oltre 20 milioni di interazioni punta-campione. Di conseguenza, la punta della sonda ha subito un'usura significativa rispetto al suo stato incontaminato (Figura 8A) nel corso dell'imaging del campione, aumentando di oltre un ordine di grandezza da un raggio finale effettivo di ~ 11 nm come ricevuto a ~ 129 nm alla conclusione delle tre immagini (Figura 8D). Durante la prima immagine la punta sembra essere stata rotta, con conseguente grande cambiamento morfologico visto nella Figura 8B. In ogni immagine successiva, la punta diventa progressivamente più arrotondata, un ottimo esempio del fenomeno più comune dell'usura graduale (vedi discussione). I raggi di punta stimati dai modelli BTR sono inclusi nella Figura 8.

Al contrario, la Figura 8E,F presenta i modelli BTR di una sonda a punta di diamante (vedi Tabella dei materiali) acquisiti a 6 mesi di distanza, con migliaia di nanoindentazioni e centinaia di milioni di interazioni basate sull'imaging della curva di forza basate su punta e campione che si verificano nel mezzo. Come si può vedere dai raggi di punta stimati di 29 nm (Figura 8E) e 28 nm (Figura 8F), il raggio di punta della sonda non è cambiato entro i limiti del metodo BTR, evidenziando l'estrema resistenza all'usura del diamante. Va notato, tuttavia, che le sonde a punta diamantata (come tutte le sonde AFM) sono suscettibili alla contaminazione da detriti debolmente aderenti che possono influire sulla funzione dell'area della punta e sulla durezza effettiva. Di conseguenza, la pulizia del campione rimane vitale per la conservazione della punta e misurazioni nanomeccaniche accurate.

Esempi di applicazione
Attraverso la scelta giudiziosa della composizione del materiale della sonda, della costante della molla a sbalzo e della geometria e del raggio della punta, la nanoindentazione basata su cantilever può essere utilizzata per quantificare le proprietà meccaniche su scala nanometrica di materiali con moduli elastici che vanno da kPa a GPa, sia in condizioni fluide che ambientali. Seguono esempi applicativi selezionati per evidenziare alcuni dei numerosi casi d'uso possibili per la nanoindentazione basata su cantilever.

Studio delle proprietà meccaniche del pino loblolly per applicazioni di biocarburanti
Gli alberi di pino Loblolly (Pinus taeda) sono una specie di conifere a crescita rapida che sono molto abbondanti negli Stati Uniti meridionali, occupando oltre 13 milioni di ettari³¹. A causa della loro abbondanza, i pini loblolly sono una coltura commerciale critica negli Stati Uniti meridionali, comunemente usati sia per il legname che per la poltiglia. Inoltre, sono una risorsa importante per la produzione di biocarburanti cellulosici di seconda generazione³². È importante sottolineare che la domanda è cresciuta per le materie prime per biocarburanti cellulosici a causa dell'Energy Independence and Security Act (EISA) del 2007, che impone che entro il 2022 l'utilizzo totale di carburante rinnovabile nell'industria dei trasporti degli Stati Uniti dovrebbe essere di 36 miliardi di galloni, con 16 miliardi di galloni derivati dalla biomassa cellulosica. Di conseguenza, a causa del rapido tasso di crescita del pino loblolly e della facilità con i progetti agroforestali, negli ultimi anni è diventato una materia prima per biocarburanti di grande interesse³³. La conoscenza delle proprietà meccaniche del pino loblolly, compresa la variabilità tra i singoli alberi, le frazioni anatomiche (ad esempio, legno bianco, corteccia, aghi) e le aree cellulari (ad esempio, parete cellulare rispetto all'interno), può consentire la separazione mirata dei flussi di biomassa per ottimizzare la lavorazione meccanica e la conversione termochimica³⁴.

La figura 9 presenta un'immagine rappresentativa della topografia AFM (sensore di altezza) (figura 9A) e la corrispondente mappa del modulo elastico (figura 9B) di un campione di sezione trasversale di legno bianco ottenuto da un ramo su un pino loblolly di 23 anni con un raggio di ~ 30 nm di curvatura sonda a punta diamantata montata su un cantilever in acciaio inossidabile (k = 256 N/m). Le mappe topografiche e dei moduli sono state generate simultaneamente utilizzando l'imaging AFM basato sulla curva di forza rapida kHz, con la mappa del modulo che presenta risultati semi-quantitativi basati su valori nominali per le costanti di calibrazione della sonda (cioè costante di molla, sensibilità alla deflessione e raggio di punta) e adattando le curve di forza in tempo reale al modello di meccanica di contatto DMT (Derjaguin, Muller e Toporov)³⁵. I campioni in sezione trasversale tagliati per essere <3 mm in tutte e tre le dimensioni (lunghezza x larghezza x altezza) sono stati preparati per l'imaging mediante disidratazione seriale utilizzando concentrazioni crescenti di etanolo (33%, 55%, 70%, 90% e 100%)³⁶, prima di infiltrarsi con resina (vedi Tabella dei materiali) e polimerizzare a 60 °C durante la notte. I campioni completamente polimerizzati incorporati in resina sono stati prima macinati, quindi ultramicrotomizzati con un disco diamantato operante a una velocità di taglio di ~ 1 mm / s con uno spessore di alimentazione decrescente da 1 μm fino a 50-70 nm per fetta per produrre una superficie piana suscettibile di imaging AFM. Tuttavia, come si può vedere dalla barra della scala di colori nella Figura 9A, la superficie risultante in questo caso è ancora relativamente ruvida, forse a causa della presenza di detriti residui sulla superficie del campione e / o lama ultramicrotomo, che porta a "chiacchiere" della lama durante il sezionamento, mentre altri campioni hanno mostrato una topografia superficiale molto più liscia.

La Figura 9C riproduce l'immagine topografica AFM dalla Figura 9A, ma con mirini bianchi che indicano le posizioni per otto array di 50 nanoindent ciascuno da eseguire lungo pareti cellulari selezionate all'interno del ROI, poiché l'obiettivo del progetto in questione era capire come le proprietà nanomeccaniche del pino loblolly differiscono tra vari tipi di tessuto e l'età degli alberi. Una soglia di trigger di 1 μN è stata tipicamente impiegata per le rampe (dimensione nominale della rampa di 60 nm condotta a una frequenza di rampa di 1 Hz), portando a una profondità di indentazione di ~ 10 nm lungo le pareti cellulari (8 ± 2 nm in tutti i campioni studiati) o leggermente più profonda (14 ± 4 nm) all'interno della cella, che sono leggermente più morbide delle pareti cellulari. I rientri all'interno di ciascuna linea sono stati distanziati ≥100 nm per garantire che fossero ben separati e sono stati raccolti 1.024 punti dati per rampa per produrre curve di avvicinamento e ritrazione ben caratterizzate. Combinando l'imaging basato sulla curva di forza rapida con la nanoindentazione a sbalzo point-and-shoot, è stato possibile generare statistiche e determinare le differenze nei moduli tra le strutture cellulari. Ad esempio, come mostrato nella Tabella 1, è stato riscontrato che il modulo elastico medio dell'interno della cellula era circa la metà di quello della parete cellulare attraverso campioni di legno bianco derivati da più rami di alberi di varie età.

Campione	Ubicazione	E* (GPa)	E (GPa)	Deformazione (nm)	Conteggio (n)
1	Interno	1,5 ± 0,4	1,4 ± 0,4	14 ± 2	199
	Muro	4,7 ± 1,3	4,3 ± 1,3	7 ± 2	202
2	Interno	1,3 ± 0,3	1,2 ± 0,3	16 ± 3	198
	Muro	3,2 ± 0,9	2,9 ± 0,9	9 ± 2	199
3	Interno	1,9 ± 0,6	1,7 ± 0,6	12 ± 3	198
	Muro	5,7 ± 1,2	5,2 ± 1,2	6 ± 1	199
4	Interno	2,4 ± 0,8	2,2 ± 0,8	11 ± 3	202
	Muro	4.2 ± 2.1	3,8 ± 2,1	9 ± 4	193
5	Interno	2,6 ± 0,8	2,3 ± 0,8	10 ± 2	198
	Muro	4,3 ± 1,6	3,9 ± 1,6	7 ± 2	199
Nella media	Interno	1,9 ± 0,6	1,8 ± 0,6	13 ± 3
	Muro	4,4 ± 1,4	4,0 ± 1,4	8 ± 2

Tabella 1: Statistiche del modulo elastico di Loblolly pine: pareti cellulari versus interno cellulare. Misurati moduli elastici delle pareti cellulari rispetto agli interni delle celle per cinque campioni di rami di legno bianco di pino loblolly raccolti da due alberi di età diverse. Tutti i valori del modulo sono stati calcolati adattando la porzione di avvicinamento della curva di spostamento della forza al modello DMT e assumendo un rapporto di Poisson di 0,3 per il campione. I moduli sono riportati come media ± deviazione standard per ogni posizione del campione, con il numero di curve di forza (conteggio, n) analizzate per produrre il risultato riportato indicato. I moduli ridotti misurati (E*) sono stati convertiti in moduli campione effettivi (E), assumendo un modulo di Young di 1.140 GPa e un rapporto di Poisson di 0,07 per il penetratore a punta di diamante impiegato. Viene inoltre mostrata la deformazione media del campione per il carico applicato di 1 μN.

Nanomeccanica correlata e microspettroscopia elettronica su scisti di Bakken
I depositi di scisto di Bakken si trovano all'interno del bacino di Williston nel Montana e nel Nord Dakota negli Stati Uniti e in alcune parti del Saskatchewan in Canada. Sono il secondo più grande serbatoio di idrocarburi negli Stati Uniti, ma lo studio dei depositi è ancora agli inizi³⁷. Un'indagine sulle proprietà nanomeccaniche dello scisto di Bakken in funzione della composizione e della maturità termica è stata condotta co-localizzando la nanoindentazione basata su cantilever AFM con l'imaging al microscopio elettronico a scansione (SEM) e la caratterizzazione della composizione elementare della spettroscopia a dispersione di energia (EDS), come mostrato nella Figura 10. In particolare, la mappatura SEM-EDS è stata utilizzata per caratterizzare la distribuzione elementare (Figura 10C), determinando così la presenza e la posizione di varie inclusioni minerali all'interno della matrice di scisto. L'imaging AFM basato sulla curva di forza rapida (velocità kHz) (Figura 10B) è stato co-localizzato con le mappe SEM-EDS definendo un'origine otticamente identificabile nell'immagine SEM dell'elettrone secondario (SE) (Figura 10A) e tracciando il movimento dello stadio sia dell'AFM che del SEM³⁸. Utilizzando nuovamente una sonda a punta diamantata montata su un rigido cantilever in acciaio inossidabile, è stata possibile mappare le variazioni del modulo elastico per grandi regioni (85 μm x 85 μm) contenenti inclusioni di interesse (Figura 10D). Si noti che la mappa del modulo presentata nella Figura 10D è di natura qualitativa piuttosto che quantitativa, poiché le costanti di calibrazione della sonda appropriate non sono state inserite nel software prima dell'acquisizione dell'imaging e dei dati.

Le immagini AFM in Figura 10B e Figura 10D evidenziano anche uno degli svantaggi della sonda a punta di diamante impiegata, vale a dire la sua incapacità di tracciare con precisione le caratteristiche di proporzioni elevate (vedere la regione ovale nera in Figura 10B) a causa della geometria della punta angolare del cubo. La risoluzione ridotta e l'incapacità di tracciare con precisione le caratteristiche ripide possono essere viste più chiaramente nella Figura 11, dove la stessa area generale di un campione di scisto di Bakken è stata ripresa dalla punta del diamante dell'angolo del cubo (Figura 11A) e da una sonda AFM al silicio in modalità di maschiatura rigida significativamente più nitida e con proporzioni più elevate (Figura 11B). Più specificamente, l'immagine mostrata in Figura 11B è stata acquisita con la sonda caratterizzata in Figura 8A-D, tra i modelli BTR in Figura 8A (R = 11 nm) e Figura 8B (R = 43 nm). Per un confronto diretto, le coppie di immagini Figura 11C,D, insieme a Figura 11E,F, presentano immagini ingrandite delle stesse caratteristiche della superficie del campione ottenute rispettivamente con la punta di diamante e la sonda al silicio, mostrando l'effetto della geometria e del raggio della punta sulla risoluzione e sulla fedeltà dell'immagine. La Figura 11G presenta un'immagine 3D composita che combina la topografia della superficie acquisita con la sonda al silicio nitida e ad alto aspetto (Figura 8A,B) e i valori del modulo acquisiti con la sonda a punta di diamante (Figura 8E,F) codificata come pelle colorata sovrapposta.

Oltre alle immagini di grandi dimensioni mostrate in Figura 10 e Figura 11, sono state acquisite immagini più piccole (10 μm x 10 μm) basate sulla curva di forza rapida utilizzando la sonda a punta di diamante completamente calibrata. Queste immagini si sono concentrate su aree senza inclusioni minerali inorganiche otticamente visibili per studiare le proprietà della matrice organica circostante in modo più dettagliato. Utilizzando una risoluzione in pixel di 512 x 512 (cioè ~ 20 nm x 20 nm pixel di campionamento), sono state acquisite e salvate >262.000 singole curve F-D con ogni immagine di 10 μm x 10 μm, consentendo statistiche eccellenti. I dati F-D sono stati elaborati in batch e analizzati utilizzando il pacchetto software AtomicJ²³ per implementare il modello di meccanica dei contatti Derjaguin-Muller-Toporov (DMT)³⁵. Dopo il montaggio, i dati sono stati puliti per rimuovere le curve che hanno portato a un modulo elastico calcolato <0 (non fisico) o >30 GPa (poiché lo studio si è concentrato sulla porzione non minerale dello scisto, E << 30 GPa) simile ad altri studi^39,40, nonché dati con un modello di adattamento R² < ^0,7. Mentre il cutoff R² è in qualche modo arbitrario, è stato scelto di rimuovere solo i dati che il modello ovviamente non poteva adattarsi con precisione. Con l'eccezione di un valore anomalo che includeva una grande inclusione minerale nell'area di imaging, le curve rimosse rappresentavano meno dello 0,5% dei dati totali per ciascuna immagine. Una sintesi dei risultati statistici figura nella tabella 2. I moduli elastici calcolati variano da 3,5 a 6,1 GPa, nell'intervallo di ciò che studi simili hanno trovato anche ^39,40.

Campione	E (GPa)	Resa dopo la pulizia dei dati	Conteggio (n)
1	6,1 ± 3,8	93.70%	7,36,874
2	5,1 ± 2,6	99.70%	7,84,267
3	3,5 ± 1,9	99.60%	7,83,427

Tabella 2: Statistiche del modulo elastico degli scisti di Bakken. Moduli elastici misurati delle matrici organiche in tre campioni di scisto di Bakken di diversa composizione e maturità termica. Il campione 1 è un controllo, mentre i campioni 2 e 3 sono stati ricotti rispettivamente per 12 ore e 48 ore per simulare artificialmente la maturazione termica. I moduli elastici sono riportati come media ± deviazione standard per ogni posizione del campione, con il numero di curve di forza (conteggio, n) incluso nell'analisi dopo aver utilizzato la procedura di pulizia dei dati descritta nel testo indicato. I moduli medi calcolati (3,5-6,1 GPa) rientrano nell'intervallo riportato in altri studi simili come quello di Li et ^al.40, che ha trovato un intervallo di moduli di 2,9-11,8 GPa.

Cambiamenti di rigidità nucleare delle cellule staminali mesenchimali dovuti a stimoli esterni
Le cellule staminali mesenchimali (MSC) sono cellule progenitrici che possono diventare condrociti, adipociti, osteoblasti e miociti⁴¹. La differenziazione delle MSC in questi vari tipi di tessuto è influenzata da stimoli meccanici esterni sulla cellula attraverso il complesso Linker of the Cytoskeleton and Nucleoskeleton (LINC), che collega fisicamente la membrana cellulare esterna alla membrana nucleare⁴¹. Il complesso LINC è composto da proteine SUN e Nesprin che interagiscono con il citoscheletro cellulare per rilevare le forze fisiche sulla cellula e facilitare l'importazione nucleare dei fattori meccanosensibili β-catenina e YAP per avviare il processo di differenziazione^42,43,44. Insieme all'importazione nucleare di β-catenina e YAP dopo la meccanostimolazione delle cellule, anche il citoscheletro subisce un riarrangiamento, compresa la formazione di filamenti di F-actina attorno al nucleo e la traslocazione nucleare di actina^44,45,46. Poiché la meccanostimolazione avvia cambiamenti nel citoscheletro cellulare e nell'ingresso nucleare dell'actina, la rigidità complessiva (modulo) delle cellule e dei nuclei è influenzata e può essere misurata mediante nanoindentazione basata su cantilever AFM. Studi precedenti lo hanno confermato rilevando una diminuzione del modulo cellulare e nucleare dopo la rottura del complesso LINC e inversamente un aumento del modulo cellulare e nucleare dopo la meccanostimolazione delle MSC⁴⁷. La ricerca attuale sta ancora studiando i meccanismi per l'importazione di actina nel nucleo e come la polimerizzazione dell'actina influisce sul modulo cellulare e nucleare dopo la meccanostimolazione.

Per studiare le proprietà meccaniche delle cellule vive, gli esperimenti devono essere condotti in una soluzione tampone, tipicamente PBS. La conduzione di nanoindentazioni a sbalzo in fluidi pone problemi unici, in particolare per la misurazione di campioni molto morbidi come MSC (E≈ 2 kPa). In particolare, i moduli a bassa elasticità delle cellule viventi richiedono l'uso di un ampio raggio di sonda per ridurre lo stress impartito alla struttura cellulare ed evitare la perforazione della membrana. Inoltre, sono necessari cantilever costanti di molla molto bassi (k = 0,04 N/m) per misurare tali moduli elastici bassi, ma ciò aumenta la probabilità di falso innesto a causa della resistenza viscosa del fluido, portando alla deflessione del cantilever morbido durante la fase iniziale di abbassamento rapido del processo di innesto AFM. Per contrastare la maggiore propensione ai falsi innesti, potrebbe essere necessario utilizzare un setpoint di innesto più ampio (ad esempio, la soglia di attivazione della tensione di deflessione per terminare il processo di innesto). Poiché i cantilever più morbidi possono generalmente essere deformati elasticamente in misura maggiore rispetto ai cantilever rigidi, la maggiore flessione sperimentata con un setpoint di innesto più elevato nel fluido non è generalmente dannosa per tali sonde morbide. Inoltre, è imperativo che le soluzioni utilizzate in un ambiente fluido siano prive di detriti e bolle, poiché detriti galleggianti o bolle possono interferire transitoriamente con la trasmissione del laser attraverso il fluido al PSD o aderire al cantilever e bloccare il laser. L'interferenza con il raggio laser avrà un impatto negativo sulle curve F-D risultanti e spesso si traduce in un falso rilevamento di crash o in un falso innesto. Infine, la nanoindentazione su cellule vive richiede anche più input da parte dell'utente rispetto a materiali più duri e inanimati. In particolare, poiché le celle e il loro ambiente fluido sono molto più dinamici, potrebbe essere necessario regolare attivamente l'altezza della sonda per ogni rampa per garantire una buona curva F-D.

Nella nanoindentazione delle cellule vive, è spesso necessaria una deformazione del campione molto più grande per ottenere la stessa deflessione a sbalzo rispetto ai campioni più rigidi. Questa deformazione più grande può portare a risultati sperimentali che deviano dall'ipotesi di elasticità lineare del modello di Hertz, e quindi potrebbe essere necessario applicare un fattore di correzione per tenere conto del comportamento iperelastico per un'accurata analisi F-D⁴⁸. È stato scoperto che il rapporto geometrico di dimensione , dove R ₂ è il raggio del penetratore e R₁ è il raggio della cella (vedi Figura 12A), può essere usato per prevedere l'aderenza dei dati risultanti alla meccanica hertziana. Il rapporto di dimensione geometrica ideale è risultato essere β = 0,3, con valori di β <0,3 che portano a sottostimare il modulo elastico e valori di β > 0,3 che portano a sovrastimare il modulo elastico quando analizzato con la teoria del contatto di Hertz⁴⁸. Un modo comune per evitare effetti non lineari è quello di mantenere piccole le deformazioni. In questo studio, la profondità di indentazione era limitata a 500 nm-1 μm.

Un set di dati rappresentativo che mostra i risultati di una singola serie di esperimenti di nanoindentazione su MSC e nuclei isolati è mostrato nella Figura 12B. Nei dati presentati nella Figura 12B, precalibrati (costante di molla via LDV e raggio di punta via SEM), sono state utilizzate sonde emisferiche di raggio di 5 μm con una costante nominale della molla di k = 0,04 N/m per studiare le differenze di modulo tra MSC vive intatte e nuclei MSC isolati, che sono serviti come controlli per testare gli effetti delle deformazioni statiche e dinamiche sulle proprietà meccaniche cellulari e nucleari⁴⁶ . A causa delle differenze e delle sfide nell'impegnarsi sulle cellule e sui nuclei, i dati del modulo estratto tendono a mostrare una grande variazione (cioè la distribuzione dei valori). Di conseguenza, il set di dati nella figura 12B presenta un 75^{° percentile} dei dati raccolti. A causa di questa variabilità innata tra le cellule vive e della conseguente diffusione delle misurazioni, si raccomanda di condurre esperimenti di nanoindentazione replicata su un gran numero di campioni con almeno tre repliche biologiche al fine di generare statistiche affidabili per l'analisi e l'interpretazione dei dati³⁰.

Proprietà meccaniche dei doppi strati lipidici contenenti colesterolo
Le membrane lipidiche supportate con un contenuto di colesterolo (Chol) molto elevato (>50 mol%), tipico della composizione presente nelle membrane delle lenti dell'occhio, sono state preparate e incubate su mica muscovite⁴⁹ appena scissa. Un'immagine topografica rappresentativa AFM di tale membrana lipidica supportata (SLM) preparata in un rapporto di miscelazione Chol/POPC (POPC = 1-palmitoil-2-oleoil-glicero-3-fosfocolina) di 1 è mostrato nella Figura 13A, con il profilo di altezza lungo la linea viola nell'immagine mostrata sotto la figura. L'SLM nella Figura 13A copriva completamente la superficie della mica esposta con un tempo di incubazione sufficiente (~25 min) e una concentrazione lipidica sufficiente (0,3 mg/ml), come evidenziato dalla mancanza di caratteristiche distinguibili nell'immagine topografica. Allo stesso modo, il profilo di altezza attraverso l'immagine fornisce dettagli strutturali riguardanti la rugosità della superficie della membrana, con l'SLM liscio come previsto.

La Figura 13B presenta una raccolta di sezioni di avvicinamento delle curve di forza catturate sull'SLM mostrate nella Figura 13A. Per ottenere statistiche migliori sulle proprietà meccaniche dell'SLM, le curve di forza sono state raccolte in punti equidistanti distanziati di almeno 100 nm, coprendo quasi l'intera larghezza dell'SLM. La spaziatura tra i punti (≥10 volte la profondità di rientro) è stata scelta per evitare che il rientro si verifichi troppo vicino tra loro. Le curve di forza mostrano un chiaro evento di svolta, come evidenziato dalla discontinuità o dal salto improvviso tra le distanze di separazione ~0 e ~5 nm nella sezione di avvicinamento delle curve di forza dove la forza scende precipitosamente da ~10 nN a ~5 nN. La forza media di rottura per la membrana mostrata nella figura 13A (rapporto di miscelazione Chol/POPC di 1) basata sulle curve di avvicinamento nella figura 13B è calcolata in 9,25 ± 0,27 nN.

Al contrario, la Figura 13C mostra un'immagine topografica AFM della membrana parziale o delle chiazze di membrana formate da membrane nuovamente incubatrici con un rapporto di miscelazione Chol/POPC di 1, ma con una concentrazione molto più bassa di lipidi (~15 μg/mL) e con un tempo di incubazione più breve (~5-6 min)⁴⁹. Il profilo dell'altezza lungo la linea rossa attraverso la patch della membrana al centro dell'immagine è mostrato sotto la figura. La misurazione attraverso il doppio strato parziale fornisce lo spessore dell'SLM, mostrato dalle linee tratteggiate nere nella Figura 13C per essere ~ 7 nm. Tuttavia, questo spessore misurato incorpora anche uno strato d'acqua di 1-2 nm tra la membrana e il disco di mica⁵⁰. Va notato che la membrana parziale è spesso solo debolmente attaccata alla superficie della mica, il che può causare la rimozione delle particelle lipidiche dal bordo delle macchie parziali della membrana durante la scansione, ma un tempo di incubazione leggermente più lungo o la riduzione della forza di imaging possono eliminare questa difficoltà.

La calibrazione della sonda AFM è fondamentale per quantificare con precisione le proprietà meccaniche SLM. In particolare, sebbene la costante della molla della punta rimanga costante nell'aria o nel fluido, la sensibilità di deflessione deve essere calibrata nello stesso mezzo in cui vengono eseguiti gli esperimenti. È fondamentale calibrare la sensibilità di deflessione immediatamente prima di ogni serie di acquisizioni della curva di forza per garantire risultati riproducibili, poiché l'allineamento laser e/o la riflettività del rivestimento posteriore possono cambiare nel tempo, in particolare nel fluido. Le sonde molto affilate sono scoraggiate per catturare le curve di forza della membrana, poiché perforano facilmente l'SLM e potrebbero portare a misurare una forza di rottura erroneamente bassa o nessuna svolta. Tuttavia, l'uso ripetuto della stessa punta senza un'adeguata pulizia aumenta la possibilità che i detriti si accumulino sulla punta e quindi opacizzino la punta o influiscano sulle forze di attrazione del campione di punta. Una mancanza di eventi di rottura evidenti nelle curve di forza di avvicinamento può anche corrispondere a spingere solo sulla mica piuttosto che sulla membrana effettiva; Pertanto, è necessaria la conferma visiva della formazione della membrana prima di catturare le curve di forza.

Figura 7: Curve rappresentative di spostamento della forza (F-D) nell'aria e nel fluido. Curve di forza rappresentative ottenute su (A) un pino loblolly in aria con adattamento del modello DMT di accompagnamento e (B) un nucleo MSC vivo in PBS con un adattamento del modello Hertz di accompagnamento. Gli inserti nei pannelli A e B mostrano uno zoom della regione di contatto delle curve di attacco corrispondenti (tracce blu) con adattamento di accompagnamento (tracce verdi). In ogni pannello, il punto di contatto iniziale punta-campione (come determinato dall'algoritmo di raccordo) è indicato da un diamante verde, mentre il punto di inversione di tendenza (cioè la transizione dall'approccio alla ritrazione o al ritiro) è indicato da un cerchio ciano. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 8: Confronto tra il silicio e l'usura della punta della sonda diamantata. (A-D) Punta della sonda al silicio. Serie di modelli creati con il metodo di ricostruzione della punta cieca a seguito dell'imaging di un campione di caratterizzazione della punta, dimostrando l'evoluzione nel raggio di una sonda rigida a punta di silicio a sbalzo (vedi Tabella dei materiali) a causa della progressiva usura della punta sperimentata nel corso di tre immagini sequenziali basate sulla curva di forza di un campione di scisto di Bakken, condotto a una frequenza di scansione lineare di 0,1 Hz e una frequenza di campionamento della curva di forza di 2 kHz (cioè ~ 20 milioni di interazioni tip-campione / immagine). (A) Suggerimento ricevuto (pronto all'uso), prima dell'uso. R = 11 nm. (B) Punta dopo un'immagine (R = 43 nm). (C) Punta dopo due immagini (R = 94 nm). (D) Punta dopo tre immagini (R = 129 nm). (E,F) Punta della sonda diamantata. Modelli BTR della stessa sonda a punta di diamante (vedi Tabella dei materiali) ottenuti a ~ 6 mesi di distanza. Tra l'acquisizione delle immagini della punta utilizzate per generare i modelli mostrati in E e F, sono state eseguite migliaia di nanoindentazioni con la sonda e si sono verificate centinaia di milioni di interazioni punta-campione durante l'imaging basato sulla curva di forza. Tuttavia, a causa della durezza del diamante, il raggio stimato dell'estremità della punta di ~ 30 nm non è cambiato entro i limiti di incertezza della tecnica BTR tra l'acquisizione delle immagini iniziali (E) e successive (F) della punta. L'asperità osservata nel modello precedente (indicata dal cerchio nero nel pannello E) è molto probabilmente un artefatto del metodo BTR o dovuta alla presenza di un contaminante su scala nanometrica (ad esempio, particella di polvere) sul lato della punta. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 9: Topografia AFM e mappe del modulo di un campione di pino loblolly. Dati AFM rappresentativi acquisiti in aria su un campione di pino loblolly in sezione trasversale incorporato in resina per consentire misurazioni di nanoindentazione a sbalzo sulle pareti cellulari. (A) Immagine topografica AFM che copre più celle acquisite tramite una modalità di imaging basata su una curva di forza rapida, presentata come una rappresentazione pseudo-3D. (B) Mappa elastica o del modulo di Young generata in tempo reale dal software AFM analizzando la curva di forza acquisita in ogni pixel e adattando i dati al modello DMT, mostrando che le pareti cellulari sono più rigide degli interni delle celle. Si noti che sono stati utilizzati i parametri di calibrazione della sonda nominali, piuttosto che misurati, quindi i valori del modulo devono essere trattati come qualitativi o solo semiquantitativi. (C) Panoramica del ROI che indica le posizioni (otto linee costituite da 50 mirini bianchi ciascuna distanziati ≥100 nm) in cui sono stati eseguiti 400 nanoindent (dimensione nominale della rampa di 60 nm, con una soglia di trigger di 1 μN corrispondente a una profondità media di indentazione di ~ 10 nm) lungo le pareti cellulari selezionate dopo l'acquisizione dell'immagine AFM per consentire la localizzazione dei rientri con precisione su scala nanometrica. Barre della scala = 20 μm (A,B). Abbreviazioni: AFM = microscopia a forza atomica; DMT = Derjaguin-Muller-Toporov. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 10: AFM e SEM/EDS co-localizzati di un campione di scisto di Bakken. (A) Immagine SEM elettronica secondaria di una porzione di un campione di scisto di Bakken. (B) Immagine topografica AFM della regione indicata dalla casella nera in A. L'ovale nero indica una regione in cui il basso rapporto d'aspetto della sonda porta all'imaging del fianco della sonda piuttosto che alla caratteristica topografica della superficie ripida e ad alto rapporto di aspetto. (C) Mappa della composizione elementare EDS ottenuta per l'immagine SEM mostrata in A. (D) Elastico derivato dall'AFM o mappa del modulo di Young generata nel corso dell'ottenimento dell'immagine topografica AFM in B, che mostra che l'inclusione minerale al centro delle immagini A-D è significativamente più difficile della matrice organica circostante. Barre della scala = 50 μm. Abbreviazioni: AFM = microscopia a forza atomica; SEM = microscopia elettronica a scansione; EDS = spettroscopia a dispersione di energia. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 11: Effetto del raggio e della forma della punta della sonda sull'aspetto delle caratteristiche ad alto rapporto d'aspetto. Confronto della risoluzione delle caratteristiche ottenuta utilizzando (A) un rapporto d'aspetto R≈ basso di 30 nm (semiangolo della punta = 47°) sonda a punta diamantata (vedi Tabella dei materiali) o (B) una sonda di silicio rigido R≈ 10 nm (semiangolo della punta ≈ 19°) (k nominale = 200 N/m; vedi Tabella dei materiali) per visualizzare la stessa posizione su un campione di scisto di Bakken. (C-F) Immagini ingrandite delle regioni blu (C, D) e arancioni (E, F) in A e B ottenute con il raggio più ampio della sonda a punta di diamante a basso rapporto di curvatura (C, E) o la sonda in modalità di maschiatura al silicio rigido (D, F) più nitida e con proporzioni più elevate, evidenziando la riduzione della risoluzione delle caratteristiche e l'introduzione di artefatti della parete laterale della punta nell'immagine topografica AFM ottenuta con la sonda a punta di diamante grazie al suo raggio di punta più ampio e mezzo angolo. Le aree evidenziate in C-F contengono caratteristiche ripide e profonde simili a pozzi che dimostrano i compromessi in termini di risoluzione laterale, tracciamento accurato e fedeltà dell'immagine tra una sonda al silicio più facilmente offuscata, inizialmente affilata, o una sonda a punta di diamante più smussata e resistente all'usura. (G) Immagine 3D composita generata combinando la topografia AFM acquisita con la sonda al silicio rigido nitida e con proporzioni più elevate con dati di modulo (pelle colorata sovrapposta) derivata dall'imaging della curva di forza rapida della stessa area del campione con la sonda a punta di diamante. Le caratteristiche evidenziate dalle caselle blu e bianche in A e B sono indicate anche in G. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 12: Nanoindentazione basata su cantilever su cellule o nuclei. (A) Una cella con raggio R ₁ situata su un substrato piatto e rigido è dentellata ad una profondità d da un penetratore sferico con raggio R₂. Questa figura è stata riprodotta da Ding et ^al.48. (B) Grafici di valori individuali di misure rappresentative del modulo ottenute da esperimenti di nanoindentazione basati su AFM a sbalzo su MSC di topo e nuclei isolati estratti da MSC di topo. Un totale di 10 celle e 10 nuclei sono stati misurati cinque volte ciascuno ad una profondità di indentazione di 500-600 nm (scelto per consentire l'uso del modello di meccanica di contatto di Hertz). I dati grezzi della curva F-D risultanti sono stati elaborati utilizzando Atomic J²³ per calcolare i moduli elastici. A causa della grande variabilità innata delle cellule, viene tracciato un 75^° percentile dei dati. I nuclei cellulari e isolati non hanno mostrato alcuna differenza statistica nel modulo elastico, con moduli medi misurati rispettivamente di 0,75 ± 0,22 kPa e 0,73 ± 0,22 kPa. Dati simili sono stati raccolti e analizzati per determinare le differenze nella rigidità nucleare dovute alla stimolazione meccanica, ai knockout proteici e ai trattamenti chimici. Abbreviazioni: MSC = cellula staminale mesenchimale; AFM = microscopia a forza atomica; F-D = spostamento di forza. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 13: Morfologia e proprietà nanomeccaniche dei doppi strati lipidici. (A) Immagine topografica AFM che mostra la variazione minima di altezza di una membrana lipidica supportata completa (SLM) composta da Chol/POPC con un rapporto di miscelazione di 1 che si è formata su tutta la superficie di mica esposta con un lungo tempo di incubazione (~25 min) e un'elevata concentrazione lipidica (0,3 mg/ml). Il profilo dell'altezza lungo la linea viola al centro dell'immagine è mostrato sotto la figura, fornendo dettagli strutturali della superficie della membrana. Come previsto, l'SLM è estremamente fluido. (B) Raccolta delle sezioni di avvicinamento delle curve di forza catturate sull'SLM mostrato in A. Le curve di forza sono state raccolte in punti equidistanti a ≥100 nm di distanza l'uno dall'altro, coprendo quasi l'intero SLM. Le curve di forza mostrano un chiaro evento di svolta, come evidenziato dalla discontinuità o dal salto improvviso nella sezione di avvicinamento delle curve di forza. La forza di rottura media è di 9,25 ± 0,27 nN. (C) Membrane parziali o patch di membrana formate da membrane in incubazione con un rapporto di miscelazione Chol/POPC di 1 con un tempo di incubazione più breve (~5-6 min) e una concentrazione lipidica inferiore (~15 μg/ml) rispetto ad A⁴⁹. Il profilo dell'altezza lungo la linea rossa sulla patch è mostrato sotto l'immagine. Il doppio strato parziale consente di misurare lo spessore dell'SLM, mostrato dalle linee tratteggiate nere nel profilo di altezza. Si noti che lo spessore misurato incorpora anche uno strato d'acqua di 1-2 nm tra la membrana e il disco di mica⁵⁰. Questa figura è stata adattata da Khadka et ^al.49 con il permesso di Elsevier. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Discussion

Preparazione del campione
Per la nanoindentazione in aria, i metodi di preparazione comuni includono la criosezione (ad esempio, campioni di tessuto), la macinazione e / o la lucidatura seguita da ultramicrotoming (ad esempio, campioni biologici incorporati in resina), la fresatura ionica o la preparazione di fasci ionici focalizzati (ad esempio, campioni di durezza semiconduttori, porosi o misti non suscettibili di lucidatura), lucidatura meccanica o elettrochimica (ad esempio, leghe metalliche) o deposizione di film sottili (ad esempio, strato atomico o deposizione chimica da vapore, epitassia a fascio molecolare). L'obiettivo è quello di creare un campione con rugosità superficiale minima (idealmente scala nm, ≤0,1 volte la profondità di indentazione prevista). Con molti dei metodi precedenti, potrebbe essere necessario risciacquare successivamente il campione e/o sonicarlo in solvente filtrato ad alta purezza (ad esempio, grado HPLC) ed essiccato con gas azoto (N₂) ad altissima purezza (99,999%) per rimuovere i detriti di particolato. In alternativa, scaglie (ad esempio, materiali 2D) o particelle (ad esempio, nanoparticelle o microcapsule) possono essere rivestite di spin o gettate a goccia da soluzioni preparate utilizzando solventi filtrati ad alta purezza. In questo caso, l'obiettivo è quello di ottenere una densità superficiale che produca più scaglie o particelle non sovrapposte all'interno del campo visivo in qualsiasi area scelta casualmente sul campione. Per la nanoindentazione nel fluido (spesso impiegata per campioni biologici che richiedono una soluzione tampone per rimanere vitali), la deposizione o la preparazione di campioni su un substrato liscio (rugosità superficiale su scala nanometrica) (ad esempio, vetrino da microscopio, piastra di Petri o mica muscovite appena scissa) è necessaria^46,47,49.

Considerazioni sulla selezione della sonda
La selezione di una sonda appropriata è della massima importanza per l'analisi quantitativa delle curve F-D, poiché l'interazione punta-campione è la proprietà fondamentale misurata nella nanoindentazione a sbalzo. Le seguenti domande sono di particolare importanza quando si sceglie una sonda per un determinato esperimento. Qual è la rugosità superficiale prevista (o misurata) del campione e l'intervallo del modulo elastico? I campioni di rugosità elevata possono causare un'usura accelerata rispetto ai campioni più lisci a causa delle maggiori forze laterali presenti sulla punta durante il tracciamento delle caratteristiche ripide, oltre ad aumentare la probabilità di eventi di rottura della punta⁵³. Allo stesso modo, più difficile è il campione, più velocemente indosserà la punta della sonda. Inoltre, quante immagini e/o nanoindent sono necessari? Con meno imaging e rientranza, ci si può aspettare meno usura della punta. Come descritto più dettagliatamente di seguito, l'usura della punta può essere ridotta utilizzando rivestimenti in carbonio diamantato (DLC) o virtualmente eliminata utilizzando sonde a punta diamantata (con l'elevato costo di acquisizione compensato nel tempo dalla durata quasi infinita della sonda).

Un'altra considerazione nella scelta di una sonda appropriata è la dimensione delle caratteristiche di interesse. Per la nanoindentazione, è spesso meglio utilizzare la dimensione della punta più grande possibile mantenendo la risoluzione spaziale necessaria per il campione o i campioni in questione e il contenuto informativo desiderato, perché le punte più grandi hanno meno probabilità di subire improvvisi cambiamenti nella geometria della punta a causa della frattura e mostreranno anche tassi di usura inferiori⁵⁴. È anche importante considerare se esistono altri metodi AFM da co-localizzare con la nanoindentazione, come AFM⁵⁵ conduttivo, microscopia a forza a sonda Kelvin (KPFM)⁵⁶ o microscopia a forza magnetica (MFM)⁵⁷. Se devono essere utilizzate ulteriori metrologie come queste, la punta della sonda potrebbe dover essere elettricamente conduttiva o magnetica, il che influirà sulla composizione del materiale e quindi su una serie di proprietà, tra cui durezza, resistenza all'usura e raggio della punta. Allo stesso modo, se l'indentazione verrà eseguita in fluido, la composizione del rivestimento posteriore riflettente della sonda (se presente) è un'altra considerazione importante, in quanto deve essere resistente alla corrosione (ad esempio, un rivestimento posteriore Au è comune per le sonde fluide). Infine, e forse la cosa più importante, la costante della molla della sonda a sbalzo deve essere abbinata alla gamma prevista di moduli elastici da misurare. Se la costante della molla non corrisponde bene al modulo del campione, può verificarsi uno dei due casi. Se il cantilever è troppo rigido, verrà misurata poca o nessuna deflessione e la caratterizzazione diventa impossibile; Al contrario, se il cantilever è troppo morbido, non sarà in grado di deformare il campione abbastanza da misurarne le proprietà meccaniche.

Usura della punta
L'usura può essere definita in molti modi; per la discussione sull'usura della punta della sonda AFM qui, sarà definita come qualsiasi cambiamento nella topografia superficiale della punta della sonda dovuto alla deformazione plastica senza alcuna perdita di materiale, nonché qualsiasi rimozione di materiale dalla superficie dovuta a interazioni fisiche⁵⁸. In un senso più ampio, l'usura può anche comportare reazioni chimiche come l'ossidazione e l'idratazione. Nelle normali applicazioni AFM, la risoluzione spaziale laterale è solitamente limitata dal raggio di punta⁵⁹ e l'interazione punta-campione è la proprietà primaria misurata. Poiché il raggio della punta è un parametro chiave nella modellazione della meccanica di contatto del sistema punta-campione e successivamente nella determinazione delle proprietà meccaniche, l'usura della punta è particolarmente preoccupante quando si eseguono esperimenti di nanoindentazione ed è una limitazione chiave per l'interpretazione accurata dei risultati della nanoindentazione⁵³. A causa della natura normalmente graduale dell'usura della punta (a parte gli eventi di rottura della punta), non è possibile quantificare l'usura della punta dovuta a un singolo ciclo di nanoindentazione (cioè rampa). Inoltre, il movimento perpendicolare della punta della sonda rispetto al campione in nanoindentazione (scontando l'imaging basato sulla curva di forza rapida) si presta a ridurre il tasso di usura, poiché la modalità primaria di usura della punta è tipicamente quella delle forze di taglio che si sviluppano durante le modalità di scansione⁶⁰. Pertanto, la fonte primaria di usura della punta negli esperimenti di nanoindentazione è qualsiasi imaging eseguito dopo la calibrazione iniziale della sonda (in particolare, la sensibilità di deflessione e le misurazioni del raggio della punta) ma prima della nanoindentazione. Si raccomanda pertanto che, se si utilizzano sonde di silicio o nitruro di silicio, il raggio della punta sia prima che dopo ogni esperimento per monitorare e tenere conto di eventuali usura della punta utilizzando uno dei metodi sopra descritti (ad esempio, analisi SEM o BTR).

Materiali della sonda
Carbonio diamantato (DLC)
Attraverso l'uso di punte di sonda rivestite con DLC o punte diamantate, l'usura della punta può essere notevolmente ridotta o annullata del tutto⁵³. La maggiore resistenza all'usura di questi materiali alternativi per la punta è molto allettante per la misurazione delle proprietà meccaniche, in particolare dei materiali molto rigidi. È stato dimostrato che le punte delle sonde DLC possono mostrare un aumento di 1.600 volte della resistenza all'usura rispetto alle normali punte della sonda in silicio⁵⁴. Questo drammatico aumento della resistenza all'usura può essere attribuito a diversi fattori. In primo luogo, i legami presenti in DLC (C-C e C = C) e la sua interfaccia con il silicio (Si-O, Si-C) sono alcuni dei legami più forti di qualsiasi coppia elementare e molto più forti dei legami Si-Si presenti nelle punte di silicio. Il DLC ha anche l'effetto di diminuire l'attrito, che a sua volta riduce le sollecitazioni di taglio all'interno della punta, riducendo così l'usura. Inoltre, la chimica superficiale del DLC è diversa da quella di una punta in silicio, poiché le punte in silicio possono subire l'incisione tribochimica in condizioni di umidità ambientale, mentre le punte DLC non lo fanno (o almeno non in alcun modo significativo rispetto alla modalità di usura primaria)⁵⁴. Lo svantaggio principale delle punte rivestite con DLC (oltre all'aumento del prezzo rispetto alle punte in silicone standard non rivestite) è l'aumento del raggio della punta dovuto al rivestimento stesso. La maggior parte dei raggi di punta della sonda DLC sono ≥30 nm, mentre le punte non rivestite con DLC possono raggiungere in modo affidabile 1-2 nm nel raggio⁶¹. Tuttavia, un raggio di punta più ampio può spesso essere auspicabile per gli esperimenti di nanoindentazione per ridurre l'errore nelle misurazioni delle proprietà, poiché le discrepanze su scala nanometrica tra la funzione ideale di profondità dell'area e la funzione di profondità dell'area effettiva, a causa di difetti o asperità della sonda, influenzeranno in modo sproporzionato le misurazioni effettuate con sonde di raggio più piccolo a causa dell'errore relativo più grande. Inoltre, nonostante la sua superiore resistenza all'usura, il rivestimento DLC può eventualmente usurarsi in punti, portando a un'usura differenziale tra il nucleo in silicio esposto e il rivestimento DLC rimanente. Sfortunatamente, la resistenza all'usura del rivestimento DLC può anche essere limitata dall'adesione del rivestimento alla punta in silicone piuttosto che dalla durezza effettiva del solo rivestimento.

Diamante
Il diamante è ben noto come uno dei materiali più duri e resistenti all'usura sulla Terra. Tuttavia, è stato dimostrato che un'usura significativa può ancora verificarsi nelle punte diamantate quando si utilizzano forze di grandi dimensioni (60 μN) in un tentativo deliberato di esplorare l'usura della punta⁶². Al contrario, nei normali scenari di nanoindentazione e imaging in cui le forze esercitate sulla punta sono molto inferiori, non ci sono stati studi rigorosi sull'usura della punta del diamante. Tuttavia, come si vede nella Figura 8E,F, la modellazione BTR della stessa punta della sonda diamantata in condizioni identiche sullo stesso campione di caratterizzazione della punta a 6 mesi di distanza ha generato modelli di forma della punta praticamente indistinguibili (cioè nessuna evidenza visibile di usura). Tra la prima e la seconda immagine BTR, la sonda è stata utilizzata per eseguire migliaia di nanoindentazioni e ha subito centinaia di milioni di interazioni tip-campione durante l'imaging di una varietà di materiali rigidi (E > 15 GPa), tra cui legno (pino loblolly), scisto, grafite pirolitica altamente ordinata (HOPG) e vari film sottili di grafene. Significativamente, il raggio di punta stimato è cambiato di ~ 1 nm tra le due immagini nella Figura 8E, F, che è ben all'interno dell'errore⁶³ del metodo BTR. Sebbene non sia uno studio completo, questo confronto dimostra l'eccellente durata di una sonda diamantata in normali condizioni sperimentali di nanoindentazione (e persino di imaging). I principali svantaggi associati all'uso delle punte diamantate (oltre al costoso costo iniziale) sono l'aumento del raggio della punta e, in qualche modo più preoccupante, il basso rapporto d'aspetto della geometria dell'angolo del cubo della maggior parte delle punte diamantate disponibili in commercio. La figura 11A,B presenta immagini AFM comparative affiancate della stessa area di un campione di scisto di Bakken acquisite con una sonda di silicio affilata con un raggio nominale di punta di 8 nm e un semiangolo medio di ~19° rispetto a una sonda a punta diamantata con un raggio nominale di punta di 40 nm e un angolo laterale medio di 47°. Quando le aree ingrandite vengono confrontate (Figura 11C, D e Figura 11E, F), è evidente che la sonda a punta di diamante non è in grado di risolvere e tracciare con precisione le caratteristiche più ripide (proporzioni più elevate) all'interno dell'immagine. Invece, dove sono presenti caratteristiche ripide, la parete laterale della punta entra in contatto con il bordo superiore e il sistema AFM segue essenzialmente la parete laterale della sonda fino a quando l'estremità della punta non entra nuovamente in contatto con la superficie e riprende il normale inseguimento.

Corrispondenza costante molla/modulo
Come accennato in precedenza, la costante della molla della sonda a sbalzo deve essere abbinata alla gamma prevista di moduli elastici da misurare. Per aiutare nella scelta di una sonda appropriata, la Tabella 3 presenta costanti nominali a molla a sbalzo nominali suggerite adatte per selezionati ampi intervalli di moduli elastici del campione attesi che vanno da pochi MPa a 100 GPa nel caso di punte di sonda di raggio ~30-40 nm spesso impiegate per la nanoindentazione⁵². Sono disponibili sonde a molla costante inferiore (k < 0,1 N/m) per materiali ancora più morbidi (gamma kPa) come le celle.

Costante molla (N/m)	Intervallo del modulo del campione previsto
0.25	≤ 15 MPa
5	5 – 500 MPa
40	200 – 8.000 (0,2 – 8 GPa)
200	1.000 – 50.000 (1 – 50 GPa)
450	10.000 – 100.000 (10 – 100 GPa)

Tabella 3: Costanti ideali della molla della sonda per misurare vari intervalli di moduli. Costanti nominali approssimative della molla della sonda per una misurazione ottimale dei moduli elastici in intervalli variabili da pochi MPa a 100 GPa, assumendo un raggio tipico della sonda di ~30-40 nm⁵².

Oltre alla costante della molla, nel caso speciale dei materiali biologici, il raggio della punta e le forze applicate durante l'imaging e la nanoindentazione devono essere attentamente considerati per evitare danni. Nell'esempio applicativo che coinvolge la misurazione delle proprietà meccaniche dei doppi strati lipidici contenenti colesterolo, presentato nella sezione dei risultati rappresentativi, una punta relativamente affilata (10 nm) è stata specificamente utilizzata per l'analisi della forza di rottura nei doppi strati lipidici. Al contrario, se il ROI del materiale è abbastanza grande (ad esempio, come nel caso delle cellule e dei nuclei cellulari) e vi è preoccupazione per quanto riguarda il potenziale di perforazione, le punte emisferiche su scala micron più grandi, come quelle utilizzate nelle misurazioni della rigidità sui nuclei MSC descritte in uno degli esempi di applicazione nella sezione dei risultati rappresentativi sono ideali e forniscono risultati eccellenti per i soft, campioni fragili come cellule vive e nuclei isolati. Kain et al. presentano una discussione approfondita su come scegliere la combinazione ottimale di raggio della sonda e costante di molla per ottenere la massima sensibilità di misura possibile per tali campioni⁶⁴.

Calibrazione della sonda
Sensibilità alla deflessione
La sensibilità di deflessione mette in relazione il movimento del piezo Z (e quindi la deflessione del cantilever quando si rientra, assumendo il funzionamento nel limite di piccole deflessioni) con una variazione misurata di tensione sulla PSD⁶⁵. La sensibilità alla deflessione (a volte indicata anche come sensibilità della leva ottica inversa [InvOLS]) può essere riportata in nm/V o V/nm. Di seguito viene fornita una panoramica dei metodi di calibrazione della sensibilità alla deflessione più comuni.

Contatto con superfici dure
Il metodo più semplice e popolare per determinare la sensibilità alla deflessione del laser a rimbalzo del fascio / sonda AFM / sistema PSD è il metodo⁶⁵ giustamente chiamato "contatto superficiale duro". La sua semplicità, la facilità di integrazione nei flussi di lavoro del software di controllo AFM e la natura in situ contribuiscono all'attrattiva e all'uso diffuso del metodo di contatto con superfici dure. Per implementare questo metodo, la punta della sonda AFM viene lanciata contro un materiale molto più rigido del cantilever. La pendenza della porzione a contatto della curva forza-spostamento (visualizzata come Volt del segnale di errore di deflessione verticale sul PSD in funzione del movimento Z-piezoelettrico in nm o tensione applicata) fornisce quindi la sensibilità alla deflessione (Figura 3A). L'uso di un substrato rigido assicura che tutta la deflessione misurata derivi dalla flessione a sbalzo piuttosto che da una convoluzione della deformazione del campione e dallo spostamento del cantilver. Nel caso di cantilever morbidi (ad esempio, k < 10 N/m), silicio (E ≈ 170 GPa)²⁷ o mica¹⁷ sono materiali facilmente accessibili e facilmente utilizzabili (o in alternativa vetro, E≈ 70 GPa, o plastica opportunamente dura nel caso di cellule immobilizzate su un vetrino da microscopio o capsula di Petri), mentre per i cantilever più rigidi, come quelli utilizzati per alcuni esperimenti di nanoindentazione (ad esempio, k > 200 N/m; Tabella 3), può essere necessario utilizzare zaffiro (E≈ 345 GPa)^26,66 per garantire che non si verifichino deformazioni del campione. Poiché questo metodo dipende dalla misurazione dello spostamento della forza, lo Z-piezo dello scanner AFM deve impiegare un sensore di altezza ad anello chiuso o essere ben calibrato (se funziona in modalità ad anello aperto) utilizzando una varietà di standard di altezza. Il maggior contributo all'errore nel metodo di contatto con la superficie dura è il movimento dello spot laser sul cantilever a causa delle fluttuazioni termiche. I cambiamenti nella temperatura del cantilever sono più comunemente causati dal laser di rilevamento, sebbene anche il riscaldamento Joule nell'elettronica circostante possa contribuire. Sono state segnalate differenze di temperatura complessive di 6 °C tra il cantilever e l'aria ambiente, che possono portare a spostamenti di spot laser di diversi micron⁶⁷. Per tenere conto di eventuali riscaldamenti, è consigliabile attendere ≥30 minuti dopo l'allineamento iniziale del punto laser per consentire al cantilever di entrare in equilibrio termico con l'ambiente circostante per i risultati migliori e più accurati. La media delle pendenze delle curve di avvicinamento e di prelievo per ciascuna misurazione di sensibilità terrà conto di eventuali effetti di attrito della punta o di scorrimento e dovrebbe essere attuata se possibile⁶⁸. Inoltre, la media tra più misurazioni di sensibilità aiuterà a valutare l'affidabilità e la riproducibilità della misurazione. Buone misurazioni di sensibilità dovrebbero comportare deviazioni del ≤1% ed essere eseguite approssimativamente alla stessa deflessione dei nanorientri sperimentali previsti per massimizzare l'efficacia della calibrazione⁶⁹. Il principale svantaggio del metodo di contatto con superficie dura è che il contatto fisico necessario per la calibrazione può potenzialmente causare danni alle fragili punte in silicio (ad esempio, opacità o creazione di artefatti della punta come una doppia punta).

Metodo del rumore termico
Il metodo del rumore termico per determinare la sensibilità di deflessione richiede la taratura preventiva della costante della molla a sbalzo e la capacità di misurare lo spettro del rumore termico del cantilever⁶⁷. Il metodo del rumore termico è spesso integrato nel moderno software di controllo AFM e può essere utilizzato in tandem con il metodo Sader (vedi sotto) per una rapida analisi e calcolo sia della costante della molla che della sensibilità alla deflessione. Tuttavia, può essere difficile o impossibile utilizzare il metodo del rumore termico su cantilever più rigidi (k > 10 N/m) a causa della diminuzione dell'ampiezza delle vibrazioni. Inoltre, l'incertezza relativa riportata del metodo del rumore termico è significativamente maggiore, ~ 20% rispetto al metodo di contatto superficiale duro descritto sopra⁷⁰. Questa tecnica non può essere utilizzata se si utilizza il metodo della regolazione termica per determinare la costante della molla descritto qui di seguito⁶⁷.

Costante di molla
Il gold standard per misurare le costanti delle molle a sbalzo è la vibrometria laser Doppler (LDV) e ora ci sono molte sonde disponibili in commercio che vengono fornite con informazioni di calibrazione della costante della molla derivate da LDV fornite dal produttore per ogni singola sonda (vedi Tabella dei materiali). Tuttavia, mentre la misurazione accurata della costante della molla a sbalzo è una necessità assoluta per le misurazioni nanomeccaniche quantitative, i metodi pratici per farlo nel tipico laboratorio per sonde non calibrate sono molto vari e possono essere alquanto complessi. Pertanto, qui viene fornita solo una breve panoramica dei due metodi di calibrazione costante della molla più comuni in loco, con un elenco di metodi aggiuntivi e citazioni bibliografiche appropriate da consultare per ulteriori informazioni.

Metodo di sintonizzazione termica
Probabilmente il metodo più comune disponibile negli AFM commerciali di oggi, il metodo di regolazione termica per determinare le costanti delle molle a sbalzo è integrato nel software di controllo per molti sistemi. Sebbene non sia ideale per cantilever più rigidi (k > 10 N/m) a causa del ridotto rilevamento della deflessione a sbalzo e della limitata larghezza di banda elettronica, il metodo di regolazione termica è relativamente facile da implementare ed è valido per un'ampia gamma di geometrie di punta⁷¹. Il metodo della sintonizzazione termica utilizza la misurazione e l'adattamento dello spettro di rumore termico del cantilver, seguito dall'applicazione del teorema di equipartizione per calcolare l'energia potenziale del cantilever, con il cantilever generalmente modellato come un semplice oscillatore armonico⁷². Il metodo di regolazione termica ha un errore di ~ 5% -10% per le sonde morbide ed è applicabile per qualsiasi forma a sbalzo^73,74. Per informazioni più dettagliate, vedere i riferimenti citati in questa sezione.

Metodo Sader
Il metodo Sader è un altro metodo spesso integrato nel software di controllo di molti moderni AFM^75,76,77. Il metodo Sader utilizza il carico idrodinamico sperimentato da un cantilever mentre vibra in un mezzo fluido (di solito aria o acqua) insieme alle dimensioni della vista in pianta a sbalzo e al fattore di qualità per calcolare la costante della molla a sbalzo. Il metodo Sader porta a un errore di ~ 10% -15% per la costante della molla a sbalzo⁷⁴. I documenti corrispondenti sul "metodo originale"76,78, sul "metodo generale"^79, un'estensione del metodo generale ⁷⁷ e la documentazione specifica dello strumento possono fornire ulteriori dettagli.

Altri metodi
Ci sono molti altri metodi che sono stati sviluppati e implementati per determinare la costante di molla dei cantilever AFM che vanno oltre lo scopo di questo documento. Sebbene nessuno di questi metodi sia facile da implementare o diffuso come i metodi di calibrazione Sader o thermal tune, ognuno di essi possiede vantaggi e svantaggi unici; La letteratura citata fornisce dettagli sulla loro applicazione e implementazione. In particolare, Sikora fornisce un'eccellente revisione di molti metodi di calibrazione della costante di molla ed è un'ottima risorsa sull'argomento⁷². Un elenco non esaustivo di altri metodi per determinare le costanti di molla include vibrometria laser Doppler (LDV)73,74,80, dispositivi basati su sistemi microelettrici-meccanici (MEMS)⁸¹, cantilever di riferimento 82,83, massa aggiunta (sia dinamica ⁷⁵ che statica ⁸⁴), bilancia di precisione^85,86, attuazione elettromagnetica ⁸⁷ e analisi agli elementi finiti (FEA) ^88,89.

Raggio della punta
I metodi comuni per determinare il raggio della punta includono sia l'imaging SEM elettronico secondario che il metodo di ricostruzione della punta cieca (BTR).

Analisi SEM
L'imaging SEM elettronico secondario può fornire una risoluzione fino a 1 nm, consentendo di confrontare direttamente e facilmente le immagini progressive dell'usura. Uno svantaggio dell'imaging SEM è che, poiché esistono solo strumenti AFM-SEM combinati altamente sperimentali⁹⁰, la sonda AFM deve in genere essere smontata e trasportata al SEM per l'analisi, che può richiedere molto tempo e potenzialmente sottoporre la sonda a contaminazione. Un altro aspetto negativo di SEM è che l'immagine risultante è intrinsecamente una proiezione 2D della punta, senza informazioni quantitative 3D disponibili. È necessario prestare attenzione ad allineare la sonda nello stesso identico orientamento ogni volta affinché i risultati comparativi siano significativi, poiché anche piccoli cambiamenti nell'angolo incidente del fascio di elettroni possono alterare le dimensioni apparenti e la forma della punta della sonda. Infine, l'imaging SEM può essere afflitto da effetti di carica e contaminazione da carbonio, che possono sfocare l'immagine o causare modifiche fisiche alla punta della sonda, rispettivamente.

Ricostruzione della punta cieca
A differenza del SEM, il metodo BTR è una tecnica in situ in cui la geometria della punta 3D viene modellata sulla base dell'imaging di un campione con numerose caratteristiche nitide (alto rapporto d'aspetto) molto più piccole del raggio della sonda. Questo metodo funziona perché in AFM, l'immagine osservata è sempre una convoluzione della forma della punta della sonda e della forma della caratteristica del campione, quindi modellando caratteristiche estremamente nitide come infinitamente nitide, la forma della punta può essere stimata. Sfortunatamente, oltre all'ipotesi di picchi infinitamente nitidi (cioè caratteristiche superficiali molto più piccole del raggio della punta), la tecnica BTR può essere influenzata dal rumore di imaging e dai parametri di scansione, quindi le immagini comparative dovrebbero essere ottenute utilizzando parametri di imaging molto simili. Inoltre, poiché vengono utilizzate più "immagini" della punta per ricostruire la sua geometria, un calcolo inverso diretto uno-a-uno della forma della punta è impossibile. A causa della sua natura, il metodo BTR è praticamente in grado di informare l'utente del limite superiore della forma della punta⁶³ e l'atto di visualizzare la sonda per implementare il metodo BTR può portare all'usura della punta (ad esempio, opacità o scheggiatura della punta della sonda).

Calibrazione relativa
A volte, una particolare proprietà della sonda non può essere misurata prontamente e accuratamente. Ad esempio, la costante della molla dei cantilever più rigidi è difficile o impossibile da misurare con il metodo della regolazione termica a causa delle limitazioni di larghezza di banda e deflessione⁹¹. Come discusso sopra, esistono altri metodi per determinare la costante della molla, ma poiché il metodo della sintonizzazione termica è integrato in molti AFM moderni, è spesso implementato per un semplice uso quotidiano. Allo stesso modo, la sensibilità alla deflessione deve sempre essere calibrata prima della sperimentazione per la conversione del movimento laser sul PSD alla deflessione fisica del cantilever della sonda. In pratica, tuttavia, la misurazione del raggio della punta è la fase di calibrazione più dispendiosa in termini di tempo e quella che ha maggiori probabilità di danneggiare la punta della sonda. Se non è possibile misurare direttamente il raggio della punta tramite SEM o BTR, è possibile utilizzare una procedura di calibrazione relativa come alternativa per determinare il raggio effettivo della punta, a condizione che sia disponibile un campione di riferimento standard con rugosità superficiale minima (idealmente atomicamente piatta) e un modulo ben noto vicino al modulo sperimentale previsto. Esempi di tali standard di riferimento ideali per la calibrazione relativa includono mica moscovite 17,92,93,94,95 e HOPG ^96, ma servono anche a evidenziare la difficoltà di identificare standard di riferimento adeguati per campioni più morbidi con moduli nell'intervallo da kPa a MPa. Per eseguire una calibrazione relativa, prima la sensibilità di deflessione deve essere calibrata come descritto nel protocollo principale. In secondo luogo, la costante nominale della molla per la sonda deve essere inserita (di solito fornita con la sonda) o misurata tramite uno dei metodi sopra descritti. Il terzo passo è l'indentazione sulla superficie del campione standard del modulo di riferimento utilizzando parametri appropriati. Infine, i dati raccolti della curva F-D dovrebbero essere analizzati e il parametro del raggio di punta regolato fino a quando il modulo ridotto misurato sperimentalmente corrisponde al modulo ridotto atteso. Si deve tener conto della profondità media di deformazione raggiunta sul campione di riferimento, poiché tale profondità deve essere mantenuta quando si rientra sul campione sperimentale di interesse affinché la taratura sia pertinente. Ora può verificarsi l'indentazione sul campione di interesse, regolando i parametri della rampa in modo che corrispondano alla profondità di deformazione raggiunta sul materiale di riferimento standard del modulo.

Un vantaggio del metodo di calibrazione relativa è che evita potenziali errori accumulati causati da una calibrazione imprecisa della sensibilità di deflessione, della costante della molla e del raggio di punta⁵². Inoltre, è forse leggermente più veloce e meno probabile che danneggi la sonda rispetto al metodo BTR. I maggiori svantaggi del metodo di calibrazione relativo sono: 1) la necessità di un campione di riferimento di alta qualità con rugosità superficiale su scala nm- ad Angstrom e proprietà meccaniche ben note simili a quelle del campione di interesse che possono essere analizzate con la stessa sonda del campione sperimentale, e 2) la necessità di ottenere la stessa profondità di deformazione o molto simile sia sul campione di riferimento che su quello sperimentale affinché la calibrazione sia valida. Di conseguenza, è preferibile misurare direttamente il raggio della punta, se possibile.

Analisi dei dati
Il metodo di analisi utilizzato per determinare le proprietà meccaniche del campione dalle curve F-D misurate è importante tanto quanto la qualità dei dati di nanoindentazione stessi. Esistono diverse teorie comuni della meccanica di contatto che modellano le relazioni forza-spostamento basate su diverse ipotesi sottostanti (e quindi, applicabili in diversi scenari). Questi modelli di meccanica di contatto includono Hertz 97, Sneddon 28, JKR (Johnson, Kendall e Roberts)⁹⁸, DMT (Derjaguin, Muller e Toporov) ^35,99, MD (Maugis-Dugdale) 100 e MYD (Muller, Yushchenko e Derjaguin) ^101,102. Un'analisi approfondita e un confronto di vari modelli di meccanica dei contatti e la loro applicazione per l'analisi è stata presentata altrove 29,30,103,104. Sebbene esuli dallo scopo di questo articolo, la Tabella 4 fornisce una breve panoramica di alcuni dei modelli di meccanica di contatto più comuni. Di particolare rilievo, modelli più complessi come JKR, DMT e altri incorporano gli effetti dell'adesione del campione di punta 30,35,98,99,100,101,102,103,104^, che può essere significativa ed è spesso facilmente identificabile dalla comparsa di deflessione negativa nella curva di forza (vedi Figura 3). In pratica, il modello di analisi scelto viene utilizzato per adattare i dati F-D raccolti e determinare le proprietà meccaniche, come il modulo elastico. Per adattare correttamente i dati, è necessaria una linea di base piatta per determinare il punto di contatto iniziale o un punto di contatto efficace che si adatti alla porzione dei dati sperimentali con la maggiore correlazione con il modello.

Teoria	Applicabilità	Ipotesi	Limitazioni
Hertz	Semplice; Spesso utilizzato per campioni in fluido.	Nessuna adesione.	Non valido per i sistemi con forze di attrazione presenti.
Derjaguin-Muller-Toporov (DMT)	Rigido con piccole deformazioni.	Adesione a corto raggio nella regione di contatto più adesione a lungo raggio al di fuori della regione di contatto.	La geometria limitata può causare una sottostima dell'area di contatto.
Johnson-Kendall-Roberts (JKR)	Morbido con grandi deformazioni.	Forze adesive a corto raggio solo nella regione di contatto.	Può sottostimare il carico a causa dell'adesione.
Maugis – Dugdale (MD)	Questa soluzione generale copre gli altri modelli adesivi.	Interfaccia di esempio di punta modellata come una fessura.	Soluzione analitica che coinvolge equazioni parametriche.

Tabella 4: Modelli comuni di meccanica di contatto. Modelli di meccanica di contatto comuni selezionati con applicabilità, ipotesi e limitazioni annotate.

L'applicazione pratica dei modelli sopra menzionati per l'analisi delle curve F-D richiede l'uso di software informatici per consentire l'elaborazione batch su larga scala di migliaia o milioni di curve in un breve lasso di tempo ed eseguire analisi statistiche sui risultati. Il codice scritto interno viene spesso utilizzato nell'analisi dei dati F-D e vari produttori AFM forniscono anche pacchetti software. Tuttavia, a causa della sua natura open source, facilità d'uso e informazioni supplementari dettagliate, gli autori raccomandano l'uso di AtomicJ²³. Il programma consente un'analisi semplice e accurata dei dati F-D utilizzando una qualsiasi delle teorie sopra descritte e molte altre. Poiché il codice è open source, è facile da manipolare e personalizzare per casi d'uso specifici senza la necessità di creare codice complesso da zero. Fare riferimento a Hermanowicz et ^al.23 per informazioni approfondite sul pacchetto software AtomicJ.

In conclusione, attraverso un'attenta calibrazione della sonda, l'area di contatto e la forza applicata dalla punta di una sonda AFM su una superficie del campione possono essere quantificate per consentire la determinazione delle proprietà meccaniche su scala nanometrica, in particolare il modulo elastico. Un protocollo generalizzato che evidenzia le migliori pratiche per implementare con successo la nanoindentazione a sbalzo AFM in aria o fluido su campioni sia morbidi che duri, con moduli elastici che vanno da kPa a GPa, è stato presentato con esempi rappresentativi forniti. Sono state discusse considerazioni importanti come la selezione della sonda (compresa la rugosità della superficie del campione, le dimensioni delle caratteristiche, le proporzioni della sonda e l'usura della punta), la calibrazione della sonda e l'analisi dei dati (compresi i modelli di meccanica dei contatti e le statistiche di misura). Infine, è stata dimostrata la co-localizzazione di mappe nanomeccaniche derivate da AFM con altre tecniche di caratterizzazione che forniscono informazioni composizionali come SEM / EDS, nonché un esempio di misurazione di una proprietà nanomeccanica diversa dal modulo elastico (cioè forza di rottura del doppio strato lipidico) tramite nanoindentazione basata su sbalzo AFM per fornire esempi di ulteriori applicazioni sinergiche della tecnica. Nel loro insieme, gli esempi e la discussione forniti qui dovrebbero fornire un punto di ingresso per i ricercatori che cercano di impiegare la nanoindentazione basata su sbalzo AFM per misurare le proprietà meccaniche di praticamente qualsiasi tipo di campione.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Atomic force microscope	Bruker	Dimension Icon	Uses Nanoscope control software, including PeakForce Quantitative Nanomechanical Mapping (PF-QNM), FastForce Volume (FFV), and Point-and-Shoot Ramping experimental workspaces
AtomicJ	American Institute of Physics	https://doi.org/10.1063/1.4881683	Flexible, powerful, free open source Java-based force curve analysis software package. Supports numerous contact mechanic models, such as Hertz, Sneddon DMT, JKR, Maugis, and cone or pyramid (including blunt and truncated). Also includes a variety of initial contact point estimation methods to choose from. Supports batch processing of data and subsequent statistical analysis (e.g., averages, standard deviations, histograms, goodness of fit, etc.). Literature citation is: P. Hermanowicz, M. Sarna, K. Burda, and H. Gabry, “AtomicJ: An open source software for analysis of force curves” Rev. Sci. Instrum. 85: 063703 (2014), https://doi.org/10.1063/1.4881683
Buffer solution (PBS)	Fisher Chemical (NaCl), Sigma Aldrich (KCl), Fisher BioReagents (Na2HPO4 and KH2PO4)	S271 (>99% purity NaCl), P9541 (>99% purity KCl), BP332(>99% purity Na2HPO4), BP362 (>99% purity KH2PO4)	Phosphate buffered saline (PBS) was prepared in the laboratory as an aqueous solution consisting of 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, and 1.8 mM KH2PO4 dissolved in ultrapure water. Reagents were measured out using an analytical balance, and glassware was cleaned with soap and water followed by autoclaving immediately prior to use.
Chloroform
Diamond tip AFM probe	Bruker	PDNISP	Pre-mounted factory-calibrated cube corner diamond (E = 1140 GPa) tip AFM probe (nominal R = 40 nm) with a stainless steel cantilever (nominal k = 225 N/m, f0 = 50 kHz). Spring constant is measured at the factory (k = 256 N/m for the probe, Serial #13435414, used here) and calibration data (including AFM images of indents showing probe geometry) is provided with the probe.
Diamond ultramicrotome blade	Diatome	Ultra 35°	2.1 mm width. Also used a standard glass blade for intial rough cut of sample surface before transitioning to diamond blade for final surface preparation
Epoxy	Gorilla Glue	26853-31-6	Epoxy resin and hardner were mixed in a 1:1 ratio, a small drop was placed on a stainless steel sample puck (Ted Pella), and V1 grade muscovite mica (Ted Pella) was attached to create an atomically flat surface for preparation of phospholipid membranes.
Ethanol
LR white resin, medium grade (catalyzed)	Electron Microscopy Sciences	14381	500 mL bottle, Lot #150629
Mesenchymal stem cells (MSCs)	N/A	N/A	MSCs for nanomechanical studies were primary cells harvested from 8-10 week old male C57BL/6 mice as described in Goelzer, M. et al. "Lamin A/C Is Dispensable to Mechanical Repression of Adipogenesis" Int J Mol Sci 22: 6580 (2021) doi:10.3390/ijms22126580 and Peister, A. et al. "Adult stem cells from bone marrow (MSCs) isolated from different strains of inbred mice vary in surface epitopes, rates of proliferation, and differentiation potential" Blood 103: 1662-1668 (2004), doi:10.1182/blood-2003-09-3070.
Modulus standards	Bruker	PFQNM-SMPKIT-12M	Used HOPG (E = 18 GPa) and PS (E = 2.7 GPa). Also contains 2x PDMS (Tack 0, E = 2.5 MPa; Tack 4, E = 3.5 MPa), PS-LDPE (E = 2.0/0.2 GPa), fused silica (E = 72.9 GPa), sapphire (E - 345 GPa), and tip characterization (titanium roughness) sample. All samples come pre-mounted on a 12 mm diameter steel disc (sample puck).
Muscovite mica	Ted Pella	50-12	12 mm diameter, V1 grade muscovite mica
Nanscope Analysis	Bruker	Version 2.0	Free AFM image processing and analysis software package, but designed for, and proprietary/limited to Bruker AFMs; similar functionality is available from free, platform-independent AFM image processing and analysis software packages such as Gwyddion, WSxM, and others. Has built-in capabilities for force curve analysis, but AtomicJ is more flexible/full featured (e.g., more built-in contact mechanics models to choose from, statistical analysis of force curve fitting results, etc.) for force curve analysis and handles batch processing of force curves.
Phospholipids: POPC, Cholesterol (ovine)	Avanti Polar Lipids	POPC: CAS # 26853-31-6, Cholesterol: CAS # 57-88-5	POPC lipid dissolved in chloroform (25 mg/mL) was obtained from vendor and used without further purification. Cholesterol powder from the same vendor was dissolved in chloroform (20 mg/mL).
Probe holder (fluid, lipid bilayers)	Bruker	MTFML-V2	Specific to the particular AFM used; MTFML-V2 is a glass probe holder for scanning in fluid on a MultiMode AFM.
Probe holder (fluid, MSCs)	Bruker	FastScan Bio Z-scanner	Used with Dimension FastScan head (XY flexure scanners). Serial number MXYPOM5-1B154.
Probe holder (standard, ambient)	Bruker	DAFMCH	Specific to the particular AFM used; DAFMCH is the standard contact and tapping mode probe holder for the Dimension Icon AFM, suitable for nanoindentation (PF-QNM, FFV, and point-and-shoot ramping)
Sample Puck	Ted Pella	16218	Product number is for 15 mm diameter stainless steel sample puck. Also available in 6 mm, 10 mm, 12 mm, and 20 mm diameters at https://www.tedpella.com/AFM_html/AFM.aspx#anchor842459
Sapphire substrate	Bruker	PFQNM-SMPKIT-12M	Extremely hard surface (E = 345 GPa) for measuring deflection sensitivity of probes (want all of the deflection to come from the probe, not the substrate). Part of the PF-QNM/modulus standards kit.
Scanning electron microscope	Hitachi	S-3400N-II	Located at Boise State. Used to perform co-localized SEM/EDS on all samples except additively manufactured (AM) Ti-6Al-4V.
Silicon AFM probes (standard)	NuNano	Scout 350	Standard tapping mode silicon probe with reflective aluminum backside coating; k = 42 N/m (nominal), f0 = 350 kHz. Nominal R = 5 nm. Also available uncoated or with reflective gold backside coating. Probes with similar specifications are available from other manufacturers (e.g., Bruker TESPA-V2).
Silicon AFM probes (stiff)	Bruker	RTESPA-525, RTESPA-525-30	Rotated tip etched silicon probes with reflective aluminum backside coating; k = 200 N/m (nominal), f0 = 525 kHz. Nominal R = 8 nm for RTESPA-525, R = 30 nm for RTESPA-525-30. Spring constant of each RTESPA-525-30 is measured individually at the factory via laser Doppler vibrometry and supplied with the probe.
Silicon carbide grit paper (abrasive discs)	Allied	50-10005	120 grit
Silicon nitride AFM probes (soft, large radius hemispherical tip)	Bruker	MLCT-SPH-5UM, MLCT-SPH-5UM-DC	Also MLCT-SPH-1UM-DC. New product line of factory-calibrated (probe radius and spring constants of all cantilevers) large radius (R = 1 or 5 mm) hemispherical tip (at the end of a 23 mm long cylindrical shaft) probes. DC = drift compensation coating. 6 cantilevers/probe (A-F). Nominal spring constants: A, k = 0.07 N/m; B, k = 0.02 N/m; C, k = 0.01 N/m; D, k = 0.03 N/m; E, k = 0.1 N/m; F, k = 0.6 N/m.
Silicon nitride AFM probes (soft, medium sharp tip)	Bruker	DNP	4 cantilevers/probe (A-d). Nominal spring constants: A, k = 0.35 N/m; B, k = 0.12 N/m; C, k = 0.24 N/m; D, k = 0.06 N/m. Nominal radii of curvature, R = 10 nm.
Silicon nitride AFM probes (soft, sharp tip)	Bruker	ScanAsyst-Air	Nominal values: resonance frequency, f0 = 70 kHz; spring constant, k = 0.4 N/m; radius of curvature, R = 2 nm. Designed for force curve based AFM imaging.
Superglue	Henkel	Loctite 495	Cyanoacrylate based instant adhesive. Lots of roughly equivalent products are readily available.
Syringe pump	New Era Pump Systems	NE1000US	One channel syringe pump system with infusion and withdrawal capacity
Tip characterization standard	Bruker	PFQNM-SMPKIT-12M	Titanium (Ti) roughness standard. Part of the PF-QNM/modulus standards kit.
Ultrahigh purity nitrogen (UHP N2), 99.999%	Norco	SPG TUHPNI - T	T size compressed gas cylinder of ultrahigh purity (99.999%) nitrogen for drying samples
Ultramicrotome	Leica	EM UC6	Equipped with a glass blade (standard, for intial sample preparation) and a diamond blade (for final preparation)
Ultrapure water	Thermo Fisher	Barnstead Nanopure Model 7146	Model has been discontinued, but equivalent products are available. Produces ≥18.2 MΩ*cm ultrapure water with 1-5 ppb TOC (total organic content), per inline UV monitoring. Includes 0.2 µm particulate filter, ion exchange columns, and UV oxidation chamber.
Variable Speed Grinder	Buehler	EcoMet 3000	Used with silicon carbide grit papers during hand polishing.
Vibration isolation table (active)	Herzan	TS-140	Used with Bruker MultiMode AFM. Sits on a TMC 65-531 vibration isolation table. Bruker Dimension Icon AFM utilizes strictly passive vibration isolation (comes from manufacturer with custom acoustic hood, air table, and granite slab).
Vibration isolation table (passive)	TMC	65-531	35" x 30" vibration isolation table with optional air damping (disabled). Used with Bruker MultiMode AFM. Herzan TS-140 "Table Stable" active vibration control table is located on top.