Nanoindentação baseada em cantilever por microscopia de força atômica: medidas de propriedades mecânicas em nanoescala no ar e fluido

Summary

A quantificação da área de contato e da força aplicadas por uma ponta de sonda de microscópio de força atômica (AFM) à superfície de uma amostra permite a determinação de propriedades mecânicas em nanoescala. As melhores práticas para implementar nanoindentação baseada em balil AFM em ar ou fluido em amostras moles e duras para medir módulo elástico ou outras propriedades nanomecânicas são discutidas.

Abstract

Um microscópio de força atômica (AFM) mede fundamentalmente a interação entre uma ponta de sonda AFM em nanoescala e a superfície da amostra. Se a força aplicada pela ponta da sonda e sua área de contato com a amostra puderem ser quantificadas, é possível determinar as propriedades mecânicas em nanoescala (por exemplo, elástico ou módulo de Young) da superfície a ser sondada. Um procedimento detalhado para a realização de experimentos quantitativos de nanoindentação baseados em balil AFM é fornecido aqui, com exemplos representativos de como a técnica pode ser aplicada para determinar os módulos elásticos de uma ampla variedade de tipos de amostras, variando de kPa a GPa. Estes incluem células-tronco mesenquimais vivas (CTMs) e núcleos em tampão fisiológico, seções transversais de pinheiro loblolly desidratadas embebidas em resina e xistos de Bakken de composição variável.

Além disso, a nanoindentação baseada em balil AFM é usada para sondar a força de ruptura (ou seja, força de ruptura) de bicamadas fosfolipídicas. Considerações práticas importantes, como escolha e desenvolvimento do método, seleção e calibração da sonda, identificação da região de interesse, heterogeneidade da amostra, tamanho e proporção das características, desgaste da ponta, rugosidade da superfície e análise de dados e estatísticas de medição são discutidas para auxiliar na implementação adequada da técnica. Finalmente, a co-localização de mapas nanomecânicos derivados de AFM com técnicas de microscopia eletrônica que fornecem informações adicionais sobre a composição elementar é demonstrada.

Introduction

Compreender as propriedades mecânicas dos materiais é uma das tarefas mais fundamentais e essenciais na engenharia. Para a análise das propriedades de materiais a granel, existem inúmeros métodos disponíveis para caracterizar as propriedades mecânicas de sistemas de materiais, incluindo ensaios de tração¹, ensaios de compressão² e ensaios de flexão de três ou quatro pontos³. Embora esses testes em microescala possam fornecer informações inestimáveis sobre as propriedades do material a granel, eles geralmente são conduzidos até a falha e, portanto, são destrutivos. Além disso, eles não têm a resolução espacial necessária para investigar com precisão as propriedades em micro e nanoescala de muitos sistemas materiais que são de interesse hoje, como filmes finos, materiais biológicos e nanocompósitos. Para começar a resolver alguns dos problemas dos ensaios mecânicos em larga escala, principalmente sua natureza destrutiva, foram adotados ensaios de microdureza a partir da mineralogia. A dureza é uma medida da resistência de um material à deformação plástica em condições específicas. Em geral, os testes de microdureza usam uma sonda rígida, geralmente feita de aço temperado ou diamante, para recuar em um material. A profundidade e/ou área de indentação resultante pode então ser usada para determinar a dureza. Vários métodos foram desenvolvidos, incluindo dureza Vickers⁴, Knoop⁵ e Brinell⁶ ; Cada um fornece uma medida de dureza do material em microescala, mas sob condições e definições diferentes, e como tal só produz dados que podem ser comparados com ensaios realizados sob as mesmas condições.

A nanoindentação instrumentada foi desenvolvida para melhorar os valores relativos obtidos através dos vários métodos de ensaio de microdureza, melhorar a resolução espacial possível para a análise de propriedades mecânicas e permitir a análise de filmes finos. É importante ressaltar que, utilizando o método desenvolvido pela primeira vez por Oliver e Pharr⁷, o módulo elástico ou módulo de Young, E, de um material de amostra pode ser determinado via nanoindentação instrumentada. Além disso, empregando uma sonda piramidal nanoindenter de três lados de Berkovich (cuja função ideal da área da ponta coincide com a da sonda piramidal de quatro lados Vickers)⁸, a comparação direta entre medidas de dureza em nanoescala e em microescala mais tradicionais pode ser feita. Com o crescimento da popularidade do AFM, a nanoindentação baseada em balil AFM começou a receber atenção também, particularmente para medir as propriedades mecânicas de materiais mais macios. Como resultado, como descrito esquematicamente na Figura 1, as duas técnicas mais comumente empregadas atualmente para interrogar e quantificar propriedades mecânicas em nanoescala são a nanoindentação instrumentada (Figura 1A) e a nanoindentação baseada em balil AFM (Figura 1B)⁹, esta última o foco deste trabalho.

Figura 1: Comparação de sistemas de nanoindentação instrumentados e baseados em balanço. Diagramas esquemáticos descrevendo sistemas típicos para condução de (A) nanoindentação instrumentada e (B) nanoindentação baseada em balil AFM. Esse valor foi modificado de Qian et ^al.51. Abreviação: AFM = microscopia de força atômica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tanto a nanoindentação instrumentada quanto a nanoindentação baseada em balil AFM empregam uma sonda rígida para deformar uma superfície de amostra de interesse e monitorar a força e o deslocamento resultantes em função do tempo. Normalmente, o perfil de deslocamento de carga (ou seja, força) ou (Z-piezo) desejado é especificado pelo usuário através da interface do software e controlado diretamente pelo instrumento, enquanto o outro parâmetro é medido. A propriedade mecânica mais frequentemente obtida a partir de experimentos de nanoindentação é o módulo de elasticidade (E), também conhecido como módulo de Young, que possui unidades de pressão. O módulo de elasticidade de um material é uma propriedade fundamental relacionada à rigidez de aderência e é definido como a razão entre a tensão de tração ou compressão (σ, a força aplicada por unidade de área) e a deformação axial (ε, a deformação proporcional ao longo do eixo de indentação) durante a deformação elástica (isto é, reversível ou temporária) antes do início da deformação plástica (equação [1]):

(1º)

Deve-se notar que, como muitos materiais (especialmente tecidos biológicos) são de fato viscoelásticos, na realidade, o módulo (dinâmico ou complexo) consiste em componentes elásticos (armazenamento, em fase) e viscosos (perda, fora de fase). Na prática real, o que é medido em um experimento de nanoindentação é o módulo reduzido, E *, que está relacionado ao verdadeiro módulo de interesse da amostra, E, como mostrado na equação (2):

(2º)

Onde E_ponta e _{ν são} o módulo elástico e a razão de Poisson, respectivamente, da ponta nanoindenter, e ν é a razão de Poisson estimada da amostra. A razão de Poisson é a razão negativa da deformação transversal para axial e, portanto, indica o grau de alongamento transversal de uma amostra ao ser submetida à deformação axial (por exemplo, durante o carregamento de nanoindentação), como mostrado na equação (3):

(3º)

A conversão do módulo reduzido para o módulo real é necessária porque a) parte da deformação axial transmitida pela ponta do indenter pode ser convertida em deformação transversal (isto é, a amostra pode deformar via expansão ou contração perpendicular à direção do carregamento), e b) a ponta do indenter não é infinitamente dura e, portanto, o ato de recuar a amostra resulta em alguma (pequena) quantidade de deformação da ponta. Note que no caso em que a ponta E >> E (ou seja, a _ponta indenter é muito mais dura do que a amostra, o que geralmente é verdade quando se usa uma sonda de diamante), a relação entre o módulo de amostra reduzido e real simplifica muito para E ≈ E*(1 - v²). Enquanto a nanoindentação instrumentada é superior em termos de caracterização precisa da força e faixa dinâmica, a nanoindentação baseada em balil AFM é mais rápida, fornece ordens de magnitude maior sensibilidade à força e ao deslocamento, permite imagens de maior resolução e melhor localização de recuo, e pode sondar simultaneamente propriedades magnéticas e elétricas em nanoescala⁹. Em particular, a nanoindentação baseada em balanço AFM é superior para a quantificação de propriedades mecânicas na escala nanométrica de materiais moles (por exemplo, polímeros, géis, bicamadas lipídicas e células ou outros materiais biológicos), filmes extremamente finos (sub-μm) (onde os efeitos do substrato podem entrar em jogo dependendo da profundidade de indentação)^10,11 e materiais bidimensionais (2D) suspensos12,13,14, como o grafeno^15,16, mica¹⁷, nitreto de boro hexagonal (h-BN)18 ou dicalcogênios de metais de transição (TMDCs; por exemplo, MoS₂)¹⁹. Isso se deve à sua requintada sensibilidade à força (sub-nN) e ao deslocamento (sub-nm), que é importante para determinar com precisão o ponto de contato inicial e permanecer dentro da região de deformação elástica.

Na nanoindentação baseada em balil AFM, o deslocamento de uma sonda AFM em direção à superfície da amostra é acionado por um elemento piezoelétrico calibrado (Figura 1B), com o cantilever flexível eventualmente dobrando devido à força resistiva experimentada ao entrar em contato com a superfície da amostra. Esta flexão ou deflexão do cantilever é tipicamente monitorada refletindo um laser na parte de trás do cantilever e em um fotodetector (detector sensível à posição [PSD]). Aliado ao conhecimento da rigidez do cantilever (em nN/nm) e da sensibilidade à deflexão (em nm/V), é possível converter essa deflexão medida do cantilever (em V) na força (em nN) aplicada à amostra. Após o contato, a diferença entre o movimento Z-piezo e a deflexão do cantilever produz a profundidade de indentação da amostra. Combinado com o conhecimento da função de área de ponta, isso permite o cálculo da área de contato ponta-amostra. A inclinação das porções em contato das curvas de força-distância ou força-deslocamento (F-D) resultantes pode então ser ajustada usando um modelo de mecânica de contato apropriado (veja a seção Análise de Dados da discussão) para determinar as propriedades nanomecânicas da amostra. Embora a nanoindentação baseada em baltilever AFM possua algumas vantagens distintas sobre a nanoindentação instrumentada, como descrito acima, ela também apresenta vários desafios práticos de implementação, como calibração, desgaste da ponta e análise de dados, que serão discutidos aqui. Outra desvantagem potencial da nanoindentação baseada em balil AFM é a suposição de elasticidade linear, já que o raio de contato e as profundidades de indentação precisam ser muito menores do que o raio de indenter, o que pode ser difícil de alcançar quando se trabalha com sondas AFM em nanoescala e/ou amostras exibindo rugosidade superficial significativa.

Tradicionalmente, a nanoindentação tem sido limitada a locais individuais ou pequenos experimentos de recuo de grade, em que um local desejado (ou seja, região de interesse [ROI]) é selecionado e um único recuo controlado, vários recuos em um único local separados por algum tempo de espera e/ou uma grade grosseira de recuos são realizados a uma taxa da ordem de Hz. No entanto, avanços recentes no AFM permitem a aquisição simultânea de propriedades mecânicas e topografia através da utilização de modos de imagem baseados em curvas de força de alta velocidade (referidos por vários nomes comerciais dependendo do fabricante do sistema), em que as curvas de força são conduzidas a uma taxa de kHz sob controle de carga, com a força máxima da ponta-amostra utilizada como o setpoint da imagem. Métodos point-and-shoot também foram desenvolvidos, permitindo a aquisição de uma imagem de topografia AFM seguida de subsequente nanoindentação seletiva em pontos de interesse dentro da imagem, proporcionando controle espacial em nanoescala sobre a localização da nanoindentação. Embora não seja o foco principal deste trabalho, exemplos específicos de aplicação selecionados de imagens baseadas em curva de força e nanoindentação baseada em cantilever point-and-shoot são apresentados nos resultados representativos e podem ser usados em conjunto com o protocolo descrito abaixo, se disponíveis na plataforma AFM específica empregada. Especificamente, este trabalho descreve um protocolo generalizado para a implementação prática de nanoindentação baseada em baltil AFM em qualquer sistema AFM capaz e fornece quatro exemplos de casos de uso (dois no ar, dois no fluido) da técnica, incluindo resultados representativos e uma discussão aprofundada das nuances, desafios e considerações importantes para empregar a técnica com sucesso.

Protocol

NOTA: Devido à grande variedade de AFMs disponíveis comercialmente e à diversidade de tipos de amostra e aplicações que existem para nanoindentação baseada em cantilever, o protocolo a seguir é intencionalmente projetado para ser relativamente geral por natureza, concentrando-se nas etapas compartilhadas necessárias para todos os experimentos de nanoindentação baseados em cantilever, independentemente do instrumento ou fabricante. Por causa disso, os autores supõem que o leitor possua pelo menos familiaridade básica com a operação do instrumento específico escolhido para a realização da nanoindentação baseada em cantilever. No entanto, além do protocolo geral descrito abaixo, um procedimento operacional padrão (POP) detalhado passo a passo específico para o AFM e o software usado aqui (veja Tabela de Materiais), focado na nanoindentação baseada em cantilever de amostras em fluido, está incluído como Material Suplementar.

1. Preparação da amostra e configuração do instrumento

1. Prepare a amostra de forma a minimizar a rugosidade superficial (idealmente em escala nanométrica, ~10x menor que a profundidade de indentação pretendida) e a contaminação sem alterar as propriedades mecânicas da(s) área(s) de interesse.
2. Selecione uma sonda AFM apropriada para nanoindentação da amostra pretendida com base no meio (ou seja, ar ou fluido), módulo esperado, topografia da amostra e tamanhos de características relevantes (consulte as considerações de seleção de sonda na discussão). Coloque a sonda no suporte da sonda (consulte Tabela de Materiais) e conecte o suporte da sonda à cabeça de varredura do AFM.
3. Selecione um modo de nanoindentação apropriado no software AFM que permita ao usuário o controle de rampas individuais (ou seja, curvas de deslocamento de força).
   NOTA: O modo específico será diferente entre diferentes fabricantes de AFM e instrumentos individuais (consulte o SOP fornecido no Material Suplementar para obter mais detalhes e um exemplo específico).
4. Alinhe o laser na parte de trás do cantilever da sonda, em frente ao local da ponta da sonda e no PSD.
   NOTA: Veja o exemplo de aplicação de células-tronco mesenquimais para obter mais detalhes sobre considerações importantes ao alinhar o laser e conduzir nanoindentação em fluido, em particular, evitando detritos flutuantes e/ou bolhas de ar, que podem espalhar ou refratar o feixe. A óptica AFM também pode precisar ser ajustada para compensar o índice de refração do fluido e evitar a colisão da sonda ao acoplar a superfície.
   1. Centralize o ponto do feixe de laser na parte posterior do cantiléver, maximizando a tensão de soma (Figura 2A).
   2. Centralize o ponto de feixe de laser refletido no PSD ajustando os sinais de deflexão X e Y (isto é, horizontal e vertical) para que fiquem o mais próximo possível de zero (Figura 2A), fornecendo assim a faixa de deflexão máxima detectável para produzir uma tensão de saída proporcional à deflexão do cantiléver.
5. Se não tiver certeza da topografia da amostra, rugosidade da superfície e/ou densidade da superfície (no caso de flocos ou partículas), realize uma varredura de levantamento topográfico AFM antes de qualquer experimento de nanoindentação para confirmar a adequação da amostra, conforme descrito na etapa 1.1 e na parte de preparação da amostra da discussão.

Figura 2: Monitor do detector sensível à posição. (A) Visor PSD indicando um laser devidamente alinhado refletindo na parte traseira do cantilever da sonda e no centro do PSD (como evidenciado pela tensão de soma grande e ausência de deflexão vertical ou horizontal) antes de acoplar na superfície da amostra (ou seja, sonda fora de contato com a amostra). (B) A tensão de deflexão vertical aumenta quando o cantilever é desviado (por exemplo, quando a sonda entra em contato com a amostra). Abreviações: PSD = detector sensível à posição; VERT = vertical; HORIZ = horizontal; AMPL = amplitude; n/d = não aplicável. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Calibração da sonda

NOTA: Três valores são necessários para quantificar as propriedades mecânicas de uma amostra usando os dados da curva F-D coletados durante a nanoindentação baseada em cantilever: a sensibilidade à deflexão (DS) do sistema cantilever/PSD (nm/V ou V/nm), a constante da mola cantilever (nN/nm) e a área de contato da sonda, frequentemente expressa em termos do raio efetivo da ponta da sonda (nm) em uma dada profundidade de recuo menor que o raio da sonda no caso de uma sonda esférica ponta.

1. Calibrar o DS do sistema sonda/AFM rampando sobre um material extremamente duro (por exemplo, safira, E = 345 GPa) de modo que a deformação da amostra seja minimizada e, assim, o movimento Z medido do piezo após o início do contato ponta-amostra seja convertido apenas em deflexão do cantilever.
   NOTA: A calibração do DS deve ser realizada nas mesmas condições que os experimentos de nanoindentação planejados (ou seja, temperatura, meio, etc.) para refletir com precisão o DS do sistema durante os experimentos. Um longo período de aquecimento do laser (30 min) pode ser necessário para a máxima precisão, a fim de permitir que o equilíbrio térmico seja alcançado e a potência de saída do laser estável e a estabilidade do ponto sejam estabelecidas. O DS deve ser remedido toda vez que o laser é realinhado, mesmo que a mesma sonda seja usada, pois o DS depende da intensidade e posição do laser no cantilever, bem como da qualidade da reflexão da sonda (ou seja, a degradação do revestimento traseiro da sonda afetará o DS) e da sensibilidade do PSD²⁰.
   1. Configure e execute os recuos de calibração do DS na safira para obter aproximadamente a mesma deflexão da sonda (em V ou nm) que os recuos de amostra planejados, uma vez que o deslocamento medido é uma função do ângulo de deflexão da ponta e torna-se não linear para grandes deflexões.
   2. Determinar o DS (em nm/V), ou, alternativamente, a sensibilidade inversa da alavanca óptica (em V/nm), a partir da inclinação da porção linear do regime de contato após o ponto de contato inicial na curva F-D resultante, como mostrado na Figura 3A.
   3. Repita a rampa pelo menos 5x, registrando cada valor de DS. Use a média dos valores para máxima precisão. Se o desvio padrão relativo (RSD) das medidas exceder ~1%, remeça o DS, pois às vezes as primeiras curvas F-D não são ideais devido à introdução inicial de forças adesivas.
   4. Se a constante de mola do cantilever da sonda, k, não for calibrada de fábrica (por exemplo, via vibrometria Doppler a laser [LDV]), calibre a constante da mola.
      NOTA: O método de ajuste térmico é ideal para balanços relativamente macios com k < 10 N/m (veja a seção constante de mola da discussão para obter uma lista e descrição de métodos alternativos, particularmente para balanços rígidos com k > 10 N/m). Como mostrado na Figura 3B, C, o ajuste térmico é normalmente integrado ao software de controle AFM.
2. Se a sonda não vier com uma medição de raio de ponta calibrada de fábrica (por exemplo, por meio de imagens de microscópio eletrônico de varredura [MEV]), meça o raio efetivo da ponta, R.
   NOTA: Existem dois métodos comuns para medir o raio da ponta (veja a seção de discussão correspondente), mas o mais comum para pontas de sonda em escala nanométrica é o método de reconstrução de ponta cega (BTR), que utiliza um padrão de rugosidade (consulte Tabela de Materiais) contendo inúmeras características extremamente nítidas (sub-nm) que servem para efetivamente obter imagens da ponta, em vez da imagem da ponta da amostra.
   1. Se empregar o método BTR, imagine a amostra de rugosidade (caracterização da ponta) usando uma taxa de varredura lenta (<0,5 Hz) e altos ganhos de feedback para ajudar a otimizar o rastreamento das características muito nítidas. Escolha um tamanho de imagem e densidade de pixels (resolução) com base no raio de ponta esperado (por exemplo, uma imagem de 1024 x 1024 pixels de uma área de 3 μm x 3 μm terá resolução lateral de ~3 nm).
   2. Use o software de análise de imagens AFM (consulte Tabela de Materiais) para modelar a ponta da sonda e estimar seu raio final e diâmetro efetivo da ponta na profundidade de recuo esperada da amostra, como mostrado na Figura 3D-F.
3. Ao concluir a calibração da sonda, insira os valores de DS, k e R no software do instrumento, como mostra a Figura 4A.
   1. Insira uma estimativa da razão de Poisson da amostra, ν, para permitir a conversão do módulo reduzido medido para o módulo de amostra real⁹. Se empregarmos um modelo de mecânica de contato cônico ou conisférico baseado na forma da ponta e na profundidade de indentação, também é necessário inserir o meio ângulo da ponta (Figura 4C).
      NOTA: O módulo é relativamente insensível a pequenos erros ou incertezas na razão de Poisson estimada. Uma estimativa de ν = 0,2-0,3 é um bom ponto de partida para muitos materiais²¹.

Figura 3: Calibração da sonda. (A) Determinação da sensibilidade à deflexão. Resultado de uma medição representativa da sensibilidade à deflexão realizada em um substrato de safira (E = 345 GPa) para uma sonda de modo de rosca padrão (k nominal = 42 N/m; ver Tabela de Materiais) com um revestimento de alumínio traseiro refletivo. São mostradas as curvas de aproximação medida (traço azul) e retração ou retirada (traço vermelho). A sensibilidade de deflexão medida de 59,16 nm/V foi determinada pelo ajuste da curva de aproximação entre os pontos de encaixe e virada de volta, conforme indicado pela região entre as linhas vermelhas pontilhadas verticais. A região de deflexão negativa evidente na curva de retração/retirada antes do arrancamento da superfície é indicativa de adesão ponta-amostra. (B,C) Sintonia térmica. Espectros representativos de ruído térmico de cantilever (traços azuis) com ajustes correspondentes (traços vermelhos) para duas sondas diferentes. (B) Configuração de ajuste térmico e parâmetros de ajuste para uma sonda de imagem AFM baseada em curva de força padrão (ver Tabela de Materiais) com sua constante nominal de mola k = 0,4 N/m usada como palpite inicial. O ajuste do espectro de ruído térmico do cantilever produz uma frequência de ressonância fundamental de f 0 = 79,8 kHz, que está em concordância razoavelmente boa com o valor nominal de f₀ = 70 kHz. O fator Q medido é 58,1. A qualidade do ajuste (R² = 0,99) é baseada na concordância do ajuste com os dados entre as duas linhas vermelhas tracejadas verticais. Observe que é importante conhecer e inserir a temperatura ambiente e a sensibilidade à deflexão para obter resultados precisos. (C) Espectro de ruído térmico do cantilever e ajuste correspondente (isto é, sintonia térmica) com a constante de mola calculada resultante k = 0,105 N/m para um cantilever extremamente macio usado para realizar medições nanomecânicas em células vivas e núcleos isolados. Observe a frequência de ressonância natural significativamente menor de ~2-3 kHz. (D-F) Reconstrução de ponta cega. Fluxo de trabalho representativo de reconstrução de ponta cega para uma sonda de ponta de diamante (R nominal = 40 nm; ver Tabela de Materiais). (D) Imagem de 5 μm x 5 μm de uma amostra de caracterização da ponta que consiste em uma série de pontas de titânio extremamente nítidas (sub-nm) que servem para obter imagens da ponta da sonda AFM. (E) Modelo resultante reconstruído (imagem de altura invertida) da ponta da sonda. (F) Resultados do ajuste da reconstrução da ponta cega, incluindo um raio final estimado de R = 29 nm e diâmetro efetivo da ponta de 40 nm a uma altura selecionada pelo usuário de 8 nm (ou seja, profundidade de recuo << R) a partir do ápice da ponta, calculados convertendo a área de contato ponta-amostra nessa altura em um diâmetro efetivo assumindo um perfil circular (ou seja, A = πr 2 = π(d/2)²) para uso com modelos de mecânica de contato esférica. Abreviações: AFM = microscopia de força atômica; ETD = diâmetro efetivo da ponta. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Entradas de interface de software. (A) Constantes de calibração da sonda. Interface do usuário do software (consulte Tabela de Materiais) para inserir a sensibilidade de deflexão medida, a constante de mola e o raio da ponta para permitir medições nanomecânicas quantitativas. A razão de Poisson da sonda e da amostra é necessária para calcular o módulo elástico ou de Young da amostra a partir das curvas de força de nanoindentação baseadas em cantilever. (B) Janela de controle de rampa. Interface de usuário do software (consulte Tabela de Materiais) para configurar experimentos de nanoindentação baseados em cantilever, organizados nos parâmetros que descrevem a rampa em si (ou seja, perfil de recuo), acionamento do instrumento (por exemplo, controle de força versus deslocamento), análise de força subsequente e limites de movimento (para melhorar a sensibilidade de medição estreitando a faixa sobre a qual o conversor A/D tem que operar no controle do Z-piezo e na leitura da deflexão PSD). (C) O meio ângulo da ponta (baseado na geometria da sonda ou na medida direta) é importante se um modelo de mecânica de contato cônico, piramidal ou conisférico (por exemplo, Sneddon) for empregado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Coletar dados de deslocamento de força (F-D)

NOTA: Os valores dos parâmetros apresentados aqui (consulte a Figura 4B) podem variar dependendo da faixa de força e recuo para uma determinada amostra.

1. Navegue pela amostra sob o cabeçalho AFM e envolva-se na região de interesse desejada.
   1. Monitorar o sinal de deflexão vertical (Figura 2B) ou executar uma pequena rampa inicial (~50-200 nm) (Figura 4B) para verificar se a ponta e a amostra estão em contato (ver Figura 5A).
   2. Ajuste a posição da cabeça do AFM ligeiramente para cima (em passos correspondentes a ~50% do tamanho total da rampa) e rampa novamente. Repetir até que a ponta e a amostra estejam fora de contato, como evidenciado por uma rampa quase plana (Figura 5B) e mínima deflexão vertical do cantilever (Figura 2A).
   3. Uma vez que nenhuma interação óbvia ponta-amostra esteja presente (compare a Figura 2A e a Figura 2B), diminua a cabeça do AFM em uma quantidade correspondente a ~50%-100% do tamanho da rampa para garantir que a ponta da sonda não colida com a amostra enquanto move manualmente a cabeça do AFM. Rampa novamente, repetindo-se até que se observe uma boa curva (Figura 5D) ou uma curva semelhante à Figura 5C. Neste último caso, execute um pequeno ajuste adicional de abaixamento da cabeça do AFM igual a ~20%-50% do tamanho da rampa para obter um bom contato e uma curva de força semelhante à mostrada na Figura 5D.
2. Ajuste os parâmetros da rampa (conforme descrito abaixo e mostrado em Figura 4B) para otimizar o instrumento, a sonda e a amostra, e obter rampas semelhantes às mostradas em Figura 5D.
   1. Selecione um tamanho de rampa apropriado (ou seja, movimento Z-piezo total através de um ciclo de rampa) dependendo da amostra (por exemplo, espessura, módulo esperado, rugosidade superficial) e da profundidade de indentação desejada.
      NOTA: Para amostras mais rígidas, é provável que ocorra menos deformação da amostra (e, portanto, mais deflexão da sonda para um dado movimento Z-piezo), de modo que o tamanho da rampa geralmente pode ser menor do que para amostras mais macias. Os tamanhos típicos de rampa para amostras rígidas e cantilevers podem ser de dezenas de nm, enquanto para amostras macias e cantilevers as rampas podem ser de centenas de nm a alguns μm de tamanho; Exemplos específicos de aplicação selecionados são apresentados na seção Resultados representativos. Observe que os tamanhos mínimo e máximo possível de rampa dependem do instrumento.
   2. Selecione uma taxa de rampa apropriada (1 Hz é um bom ponto de partida para a maioria das amostras).
      NOTA: A taxa de rampa pode ser limitada por velocidades/larguras de banda eletrônicas de controle e/ou detecção. Em combinação com o tamanho da rampa, a taxa de rampa determina a velocidade da ponta. A velocidade da ponta é particularmente importante de ser considerada ao recuar materiais moles onde efeitos viscoelásticos podem causar artefatos de histerese ^9,22.
   3. Escolha se deseja empregar uma rampa acionada (com carga controlada) ou não acionada (com deslocamento controlado).
      NOTA: Em uma rampa acionada, o sistema abordará a amostra em etapas definidas pelo usuário (com base no tamanho da rampa e resolução ou número de pontos de dados) até que o limite de gatilho desejado (ou seja, força de setpoint ou deflexão de cantilever) seja detectado, momento em que o sistema se retrairá para sua posição original e exibirá a curva F-D. Em uma rampa não acionada, o sistema simplesmente estende o Z-piezo a distância especificada pelo tamanho da rampa definido pelo usuário e exibe a curva F-D medida. As rampas acionadas são preferidas para a maioria dos casos de uso, mas as rampas não acionadas podem ser úteis ao investigar materiais macios que não exibem um ponto de contato nítido e facilmente identificável.
      1. Se uma rampa acionada for escolhida, defina o limite de gatilho (força máxima permitida definida pelo usuário ou deflexão da rampa) para resultar no recuo desejado na amostra.
         NOTA: O uso de um limite de gatilho significa que uma rampa pode terminar (ou seja, a sonda pode começar a se retrair) antes de atingir o tamanho total da rampa (extensão Z-piezo) especificado. Os valores podem variar de alguns nN a alguns μN, dependendo do sistema de amostra-ponta.
      2. Defina a posição da rampa para determinar a porção do alcance máximo do Z-piezo que será usada para executar a rampa. Certifique-se de que o intervalo total do tamanho da rampa não comece ou termine fora do intervalo Z-piezo máximo (veja exemplos representativos na Figura 6), caso contrário, uma parte da curva F-D não representará nenhuma medida física (ou seja, o Z-piezo será totalmente estendido ou retraído, não se movendo).
   4. Defina o número de amostras/rampa (por exemplo, 512 amostras/ rampa) para alcançar a resolução desejada da medição (ou seja, densidade de pontos da curva F-D).
      NOTA: O máximo de amostras/rampa pode ser limitado por restrições de software (tamanho do arquivo) ou hardware (por exemplo, velocidade de conversão analógica para digital [A/D], dependendo da taxa da rampa). Também é possível limitar a faixa Z-piezo ou de deflexão permitida (ver parâmetros de limites na Figura 4B) para aumentar a resolução efetiva do conversor A/D do sistema.
   5. Ajuste o X-gire para reduzir as forças de cisalhamento na amostra e na ponta, movendo simultaneamente a sonda ligeiramente na direção X (paralela ao cantilever) enquanto recua na direção Z (perpendicular ao cantilever). Use um valor para o X-girar igual ao ângulo de deslocamento do suporte da sonda em relação à superfície normal (12° é típico).
      NOTA: O X-girate é necessário porque o cantilever é montado no suporte da sonda em um pequeno ângulo em relação à superfície para permitir que o feixe de laser incidente reflita no PSD. Além disso, os ângulos frontal e traseiro da ponta da sonda podem diferir entre si (ou seja, a ponta da sonda pode ser assimétrica). Informações mais específicas podem ser obtidas de fabricantes individuais de sonda e AFM.

Figura 5: Otimização da separação ponta-amostra após o acoplamento para obter boas curvas de força. Exemplos sequenciais de curvas representativas de força-deslocamento obtidas durante o recuo em fluido (solução salina tamponada com fosfato) em um núcleo de células-tronco mesenquimais vivas com um cantilever de nitreto de silício macio calibrado ( k nominal = 0,04 N/m) terminando em uma ponta hemisférica de 5 μm de raio (ver Tabela de Materiais). As curvas foram obtidas no processo de acoplamento da superfície celular e otimização dos parâmetros de indentação, com abordagem de sonda mostrada em azul e retração/retirada em vermelho. (A) A ponta já está engatada e em contato com a amostra antes do início da rampa, levando a grandes deflexões e forças de cantiléver, sem linha de base plana de pré-contato. (B) Depois de mover manualmente a ponta suficientemente longe da amostra, uma rampa de 2 μm não acionada resulta em uma curva F-D que é quase plana (ou seja, praticamente nenhuma mudança na força). Em condições ambientais, a curva seria mais plana, mas em fluido, a viscosidade do meio pode causar ligeiras deflexões do cantilever da sonda durante uma rampa como visto aqui, mesmo sem contato com a superfície. (C) Após aproximar-se um pouco mais da superfície antes de iniciar a rampa, as curvas de aproximação e retração mostram um ligeiro aumento de força (aumento da inclinação) próximo ao ponto de virada da rampa (ou seja, transição da aproximação para a retirada). O sinal revelador a procurar é que as curvas de aproximação (azul) e retirada (vermelho) começam a se sobrepor (região indicada pelo círculo preto), o que é indicativo de uma interação física com a superfície. (D) Uma curva F-D ideal adquirida após otimização dos parâmetros da rampa e aproximando-se ligeiramente (~1 μm) mais próxima da superfície celular do que em C , de modo que a sonda gaste aproximadamente metade da rampa em contato com a célula, permitindo deformação suficiente para ajustar a porção de contato da curva de aproximação e determinar o módulo de elasticidade. A linha de base relativamente longa, plana e de baixo ruído torna mais fácil para o algoritmo de ajuste determinar o ponto de contato. Abreviação: F-D = força-deslocamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Tamanho e posição da rampa. Monitor Z-piezo mostrando a extensão da rampa (barra azul) em relação à faixa de movimento Z-piezo total disponível (barra verde). (A) A posição Z-piezo está próxima ao meio de sua amplitude de movimento, como indicado tanto pela barra azul estar localizada aproximadamente no meio da barra verde quanto pela tensão Z-piezo atual (-78,0 V) estar aproximadamente entre seus valores totalmente retraídos (-212,2 V) e estendidos (+102,2 V). (B) Z-piezo é estendido em relação a A, sem tensão de polarização aplicada. (C) Z-piezo é retraído em relação a A e B. (D) A posição Z-piezo é a mesma que em C em -156,0 V, mas o tamanho da rampa foi aumentado em relação a A-C para aproveitar mais da amplitude de movimento total do Z-piezo. € O tamanho da rampa é muito grande para a posição atual da rampa, resultando no Z-piezo sendo estendido até o final de sua gama. Isso fará com que a curva F-D fique plana, pois o sistema não pode estender o Z-piezo ainda mais. Abreviação: F-D = força-deslocamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Análise da curva F-D

1. Escolha um pacote de software de análise de dados apropriado. Selecione e carregue os dados a serem analisados.
   NOTA: Muitos fabricantes de AFM e programas de software de processamento de imagem AFM têm suporte incorporado para análise de curva F-D. Alternativamente, a maior flexibilidade e os recursos de um pacote dedicado de análise de curvas F-D, como o pacote de software de código aberto AtomicJ, podem ser benéficos²³, particularmente para processamento em lote e análise estatística de grandes conjuntos de dados ou implementação de modelos complexos de mecânica de contato.
2. Valores calibrados de entrada para a constante de mola, DS e raio da ponta da sonda, juntamente com estimativas do módulo de Young e razão de Poisson para a ponta da sonda (com base em sua composição de material) e a razão de Poisson da amostra.
   OBS: Se utilizar um indenter de ponta de diamante, os valores de_ponta E = 1140 GPa e ponta ν₌ 0,07 podem ser utilizados^21,24,25,26. Para uma sonda de silício padrão, a ponta E = 170 GPa e _{a ponta} ν = 0,27 podem ser tipicamente usadas, embora o módulo de silício de Young varie dependendo da orientação cristalográfica²⁷.
3. Escolha um modelo de mecânica de contato de nanoindentação apropriado para a ponta e a amostra.
   NOTA: Para os muitos modelos de ponta esférica comuns (por exemplo, Hertz, Maugis, DMT, JKR), é imperativo que a profundidade de recuo na amostra seja menor do que o raio da ponta; caso contrário, a geometria esférica da ponta da sonda dá lugar a uma forma cônica ou piramidal (Figura 4C). Para modelos cônicos (por exemplo, Sneddon²⁸) e piramidais, o meio ângulo da ponta (ou seja, o ângulo entre a parede lateral da ponta e uma linha de bissetriz perpendicular à extremidade da ponta; Figura 4C) deve ser conhecido e geralmente está disponível no fabricante da sonda. Para obter mais informações sobre modelos de mecânica de contato, consulte a seção Análise de dados do dDiscussion.
4. Execute o algoritmo de ajuste. Verificar o ajuste adequado das curvas F-D; um baixo erro residual correspondente a uma unidade próxima de R 2 média (por exemplo, R² > 0,9) é tipicamente indicativo de um bom ajuste ao modelo escolhido^29,30. Verifique pontualmente as curvas individuais para inspecionar visualmente a curva, o ajuste do modelo e os pontos de contato calculados, se desejado (por exemplo, consulte a Figura 7 e a seção Análise de dados da discussão).

Representative Results

Curvas força-deslocamento
A Figura 7 mostra curvas F-D representativas e quase ideais obtidas de experimentos de nanoindentação realizados no ar em amostras de pinheiro loblolly emblocadas em resina (Figura 7A) e em fluido (solução salina tamponada com fosfato [PBS]) em núcleos de células-tronco mesenquimais (CTM) (Figura 7B). O uso de qualquer modelo de mecânica de contato depende da determinação precisa e confiável do ponto de contato inicial ponta-amostra. Assim, a linha de base relativamente plana e de baixo ruído que precede o ponto de contato inicial e a inclinação suave da porção de contato das curvas F-D mostradas na Figura 7 as tornam ideais para análise para extrair propriedades mecânicas, como evidenciado pela excelente concordância entre as curvas de aproximação (traços azuis) e os ajustes correspondentes (traços verdes) nas inserções.

Por outro lado, há vários problemas comuns que um usuário pode encontrar ao executar nanoindentação baseada em cantilever que levará a curvas F-D não ideais. Um dos problemas mais comuns, particularmente imediatamente após o engajamento, é a ponta da sonda já estar em contato com a amostra antes do início de uma rampa (Figura 5A), o que impede a aquisição da linha de base fora de contato necessária para determinar o ponto de contato inicial. Isso também pode levar a forças excessivamente grandes no caso de rampas não acionadas (ou seja, deslocamento controlado). Isso é particularmente preocupante ao executar uma grande rampa com um cantilever rígido, pois as forças resultantes podem quebrar o cantilever e/ou danificar a amostra ou a ponta. Para evitar isso, monitore a tensão de deflexão vertical durante e após o engates inicial. Se a tensão de deflexão vertical medida for positiva (supondo um alinhamento inicial adequado), como mostrado na Figura 2B, então o cantilever está sendo desviado e a ponta está em contato com a amostra. Tensões positivas maiores correspondem a maiores deflexões do cantilever, mas independentemente da magnitude da deflexão, o usuário deve elevar manualmente a cabeça do AFM (por exemplo, empregando um motor de passo) para longe da amostra. A tensão de deflexão vertical deve diminuir lentamente e pode até cair temporariamente abaixo de zero no caso de fortes forças adesivas da ponta-amostra, mas eventualmente atingirá 0 V (ou perto de 0 V) quando a ponta não estiver mais em contato com a amostra (Figura 2A). A partir deste ponto, o usuário pode retomar a otimização dos parâmetros de rampa e executar recuos.

Outro problema comum (particularmente para rampas não acionadas) é que toda a curva F-D pareça quase plana, sem nenhum sinal óbvio de interação ponta-amostra, como mostrado anteriormente na Figura 5B. Se disponível no instrumento, a solução para isso é baixar manualmente a cabeça do SPM em ~10% menos do que o tamanho da rampa (para evitar a queda da ponta da sonda) e rampa novamente, repetindo até que um aumento óbvio na força seja observado devido à interação ponta-amostra (Figura 5C,D) antes de prosseguir para otimizar outros parâmetros da rampa.

Desgaste da ponta
A Figura 8 apresenta um exemplo de desgaste da ponta em ambiente experimental. Uma única sonda AFM rígida em modo de toque de silício (ver Tabela de Materiais) foi usada para obter imagens de várias grandes áreas de uma amostra de xisto de Bakken (veja o exemplo de aplicação correspondente para obter mais detalhes) usando um método de imagem baseado em curva de força rápida (taxa de kHz), e o método BTR foi usado para modelar a geometria da ponta e estimar o raio final da ponta antes e depois de cada uma das três imagens consecutivas. As amostras de xisto investigadas consistiram de uma matriz de argila e material orgânico (E ~5 GPa) com inclusões minerais inorgânicas muito mais duras dispersas ao longo (E > 30 GPa). Como a amostra continha variações significativas na topografia da superfície (±2 μm) ao longo das grandes áreas de varredura (85 μm x 85 μm) fotografadas, a taxa de varredura foi ajustada para o mínimo permitido no instrumento utilizado, 0,1 Hz. Com uma taxa de aquisição de curva de força de 2 kHz e uma taxa de varredura de 0,1 Hz, ao longo de uma única imagem de 1024 x 1024 pixels, houve mais de 20 milhões de interações ponta-amostra. Como resultado, a ponta da sonda experimentou um desgaste significativo em relação ao seu estado puro (Figura 8A) ao longo da obtenção de imagens da amostra, aumentando em mais de uma ordem de magnitude de um raio final efetivo de ~11 nm, conforme recebido, para ~129 nm na conclusão das três imagens (Figura 8D). Durante a primeira imagem a ponta parece ter sido quebrada, resultando na grande alteração morfológica vista na Figura 8B. Em cada imagem subsequente, a ponta torna-se progressivamente mais arredondada, um excelente exemplo do fenômeno mais comum de desgaste gradual (ver discussão). Os raios de ponta estimados dos modelos BTR estão incluídos na Figura 8.

Em contraste, a Figura 8E,F apresenta modelos BTR de uma sonda de ponta de diamante (ver Tabela de Materiais) adquirida com 6 meses de intervalo, com milhares de nanorecuos e centenas de milhões de interações ponta-amostra baseadas em curva de força ocorrendo entre elas. Como pode ser visto pelos raios de ponta estimados de 29 nm (Figura 8E) e 28 nm (Figura 8F), o raio da ponta da sonda não se alterou dentro dos limites do método BTR, destacando a extrema resistência ao desgaste do diamante. Deve-se notar, no entanto, que as sondas de ponta de diamante (como todas as sondas AFM) são suscetíveis à contaminação por detritos fracamente aderidos que podem afetar a função da área da ponta e a dureza efetiva. Assim, a limpeza da amostra permanece vital para a preservação da ponta e medições nanomecânicas precisas.

Exemplos de aplicação
Através da escolha criteriosa da composição do material da sonda, constante de mola cantiléver, geometria e raio da ponta, a nanoindentação baseada em balil pode ser usada para quantificar as propriedades mecânicas em nanoescala de materiais com módulos elásticos que variam de kPa a GPa, tanto em condições fluidas quanto em condições ambientais. Seguem-se exemplos de aplicação selecionados para destacar alguns dos vários casos de uso possíveis para nanoindentação baseada em cantilever.

Investigação das propriedades mecânicas do pinus loblolly para aplicações em biocombustíveis
O pinheiro-bravo (Pinus taeda) é uma espécie de madeira macia de crescimento rápido que é altamente abundante no sul dos Estados Unidos, ocupando mais de 13 milhões de hectares³¹. Por causa de sua abundância, os pinheiros loblolly são uma cultura comercial crítica no sul dos EUA, comumente usada para madeira e celulose. Além disso, são um importante recurso para a produção de biocombustíveis celulósicos de segunda geração³². É importante ressaltar que a demanda tem crescido por matéria-prima de biocombustível celulósico devido à Lei de Independência e Segurança Energética (EISA) de 2007, que determina que, até 2022, o uso total de combustível renovável na indústria de transporte dos EUA deve ser de 36 bilhões de galões, com 16 bilhões de galões sendo derivados de biomassa celulósica. Nesse sentido, devido à rápida taxa de crescimento do pinheiro-manso e à facilidade para projetos agroflorestais, tornou-se matéria-prima de grande interesse para biocombustíveis nos últimos anos³³. O conhecimento das propriedades mecânicas do pinheiro loblolly, incluindo a variabilidade entre árvores individuais, frações anatômicas (por exemplo, madeira branca, casca, agulhas) e áreas celulares (por exemplo, parede celular versus interior), pode permitir a separação direcionada de fluxos de biomassa para otimizar o processamento mecânico e a conversão termoquímica³⁴.

A Figura 9 apresenta uma imagem representativa da topografia AFM (sensor de altura) (Figura 9A) e o mapa do módulo elástico correspondente (Figura 9B) de uma amostra transversal de madeira branca obtida de um ramo em uma sonda de pinus loblolly de 23 anos com um raio de ~30 nm de curvatura da ponta do diamante montada em um cantilever de aço inoxidável (k = 256 N/m). Os mapas de topografia e módulo foram gerados simultaneamente usando imagens de AFM baseadas em curvas de força de taxa de velocidade de kHz, com o mapa de módulo apresentando resultados semiquantitativos baseados em valores nominais para as constantes de calibração da sonda (i.e., constante de mola, sensibilidade à deflexão e raio da ponta) e ajustando as curvas de força em tempo real ao modelo de mecânica de contato DMT (Derjaguin, Muller e Toporov)³⁵. Amostras seccionadas transversalmente aparadas para <3 mm nas três dimensões (comprimento x largura x altura) foram preparadas para aquisição de imagens por desidratação seriada usando concentrações crescentes de etanol (33%, 55%, 70%, 90% e 100%)³⁶, antes de infiltrarem com resina (ver Tabela de Materiais) e polimerizarem a 60 °C durante a noite. Amostras totalmente curadas embutidas em resina foram primeiro moídas, depois ultramicrotomadas com uma lâmina de diamante operando a uma velocidade de corte de ~1 mm/s com uma espessura de alimentação diminuindo de 1 μm para 50-70 nm por fatia para produzir uma superfície plana passível de imagens AFM. No entanto, como pode ser visto pela barra de escala de cores na Figura 9A, a superfície resultante neste caso ainda é relativamente rugosa, talvez devido à presença de debris residuais na superfície da amostra e/ou lâmina de ultramicrótomo, levando à "tagarelice" da lâmina durante o corte, enquanto outras amostras exibiram topografia de superfície muito mais lisa.

A Figura 9C reproduz a imagem da topografia AFM da Figura 9A, mas com miras brancas indicando os locais para oito arranjos de 50 nanorecuos cada a serem realizados ao longo de paredes celulares selecionadas dentro da ROI, já que o objetivo do projeto em questão era entender como as propriedades nanomecânicas do pinheiro loblolly diferem entre vários tipos de tecido e idade das árvores. Um limiar de gatilho de 1 μN foi tipicamente empregado para as rampas (tamanho nominal de rampa de 60 nm conduzido a uma taxa de rampa de 1 Hz), levando a uma profundidade de indentação de ~10 nm ao longo das paredes celulares (8 ± 2 nm em todas as amostras estudadas) ou ligeiramente mais profundo (14 ± 4 nm) no interior das células, que são um pouco mais suaves do que as paredes celulares. Recuos dentro de cada linha foram espaçados ≥100 nm para garantir que estivessem bem separados, e 1.024 pontos de dados foram coletados por rampa para produzir curvas de aproximação e retração bem caracterizadas. Combinando imagens baseadas em curvas de força rápida com nanoindentação baseada em cantilever point-and-shoot, foi possível gerar estatísticas e determinar diferenças nos módulos entre as estruturas celulares. Por exemplo, como mostrado na Tabela 1, verificou-se que o módulo de elasticidade médio do interior da célula era cerca de metade do da parede celular em amostras de madeira branca derivadas de múltiplos ramos de árvores de idades variadas.

Amostra	Localização	E* (GPa)	E (GPa)	Deformação (nm)	Contagem (n)
1	Interior	1,5 ± 0,4	1.4 ± 0.4	14 ± 2	199
	Parede	4.7 ± 1.3	4.3 ± 1.3	7 ± 2	202
2	Interior	1.3 ± 0.3	1.2 ± 0.3	16 ± 3	198
	Parede	3.2 ± 0.9	2.9 ± 0.9	9 ± 2	199
3	Interior	1,9 ± 0,6	1.7 ± 0.6	12 ± 3	198
	Parede	5.7 ± 1.2	5.2 ± 1.2	6 ± 1	199
4	Interior	2.4 ± 0.8	2.2 ± 0.8	11 ± 3	202
	Parede	4.2 ± 2.1	3.8 ± 2.1	9 ± 4	193
5	Interior	2.6 ± 0.8	2.3 ± 0.8	10 ± 2	198
	Parede	4.3 ± 1.6	3.9 ± 1.6	7 ± 2	199
Média	Interior	1,9 ± 0,6	1,8 ± 0,6	13 ± 3
	Parede	4.4 ± 1.4	4.0 ± 1.4	8 ± 2

Tabela 1: Estatísticas do módulo elástico de Loblolly pine: paredes celulares versus interior celular. Módulos elásticos medidos das paredes celulares versus interiores celulares para cinco amostras de ramos de madeira branca de pinheiro loblolly coletadas de duas árvores de diferentes idades. Todos os valores do módulo foram calculados ajustando-se a porção de aproximação da curva de deslocamento de força ao modelo DMT e assumindo uma razão de Poisson de 0,3 para a amostra. Os módulos são apresentados como média ± desvio padrão para cada local de amostragem, sendo indicado o número de curvas de força (contagem, n) para produzir o resultado relatado. Os módulos reduzidos medidos (E*) foram convertidos em módulos reais da amostra (E), assumindo um módulo de Young de 1.140 GPa e uma razão de Poisson de 0,07 para o indenter de ponta de diamante empregado. Também é mostrada a deformação média da amostra para a carga aplicada de 1 μN.

Nanomecânica correlacionada e microespectroscopia eletrônica em xistos de Bakken
Depósitos de xisto Bakken são encontrados dentro da Bacia de Williston em Montana e Dakota do Norte nos Estados Unidos e partes de Saskatchewan no Canadá. Eles são o segundo maior reservatório de hidrocarbonetos dos Estados Unidos, mas o estudo dos depósitos ainda está em sua infância³⁷. Uma investigação das propriedades nanomecânicas do xisto de Bakken em função da composição e maturidade térmica foi conduzida pela co-localização de nanoindentação baseada em balil AFM com imagens de microscopia eletrônica de varredura (MEV) e caracterização da composição elementar por espectroscopia de energia dispersiva (EDS), como mostrado na Figura 10. Especificamente, o mapeamento por MEV-EDS foi utilizado para caracterizar a distribuição elementar (Figura 10C), determinando a presença e localização de várias inclusões minerais dentro da matriz de xisto. A imagem AFM baseada em curva de força rápida (taxa de kHz) (Figura 10B) foi co-localizada com os mapas de MEV-EDS, definindo uma origem opticamente identificável na imagem de MEV de elétrons secundários (SE) (Figura 10A) e rastreando o movimento do estágio do AFM e do MEV³⁸. Utilizando novamente uma sonda de ponta diamantada montada em um cantilever rígido de aço inoxidável, foi possível mapear as variações no módulo de elasticidade para grandes regiões (85 μm x 85 μm) contendo inclusões de interesse (Figura 10D). Observe que o mapa do módulo apresentado na Figura 10D é de natureza qualitativa e não quantitativa, pois as constantes de calibração da sonda adequadas não foram inseridas no software antes da aquisição das imagens e dos dados.

As imagens AFM na Figura 10B e na Figura 10D também destacam uma das desvantagens da sonda de ponta de diamante empregada, ou seja, sua incapacidade de rastrear com precisão características de alta taxa de aspecto (veja a região oval preta na Figura 10B) devido à sua geometria da ponta do canto do cubo. A resolução reduzida e a incapacidade de rastrear com precisão características íngremes podem ser vistas mais claramente na Figura 11, onde a mesma área geral de uma amostra de xisto Bakken foi fotografada pela ponta de diamante do canto do cubo (Figura 11A) e uma sonda AFM de silicone com modo de batida rígida significativamente mais nítida e com maior relação de aspecto (Figura 11B). Mais especificamente, a imagem mostrada na Figura 11B foi adquirida com a sonda caracterizada na Figura 8A-D, entre os modelos BTR da Figura 8A (R = 11 nm) e da Figura 8B (R = 43 nm). Para comparação direta, os pares de imagens Figura 11C,D, juntamente com Figura 11E,F, apresentam imagens ampliadas das mesmas características da superfície da amostra obtidas com a ponta de diamante e a sonda de silicone, respectivamente, mostrando o efeito da geometria e do raio da ponta na resolução e fidelidade da imagem. A Figura 11G apresenta uma imagem 3D composta combinando a topografia da superfície adquirida com a sonda de silicone de aspecto alto e nítido (Figura 8A,B) e os valores dos módulos adquiridos com a sonda de ponta de diamante (Figura 8E,F) codificada como a pele colorida sobreposta.

Além das grandes imagens mostradas na Figura 10 e na Figura 11, imagens menores (10 μm x 10 μm) baseadas em curvas de força rápida foram adquiridas usando a sonda de ponta de diamante totalmente calibrada. Estas imagens focaram em áreas sem inclusões minerais inorgânicas opticamente visíveis para investigar as propriedades da matriz orgânica circundante em mais detalhes. Empregando uma resolução de pixels de 512 x 512 (ou seja, ~20 nm x 20 nm pixels de amostragem), >262.000 curvas F-D individuais foram capturadas e salvas a cada imagem de 10 μm x 10 μm, permitindo excelentes estatísticas. Os dados de F-D foram processados em batelada e analisados usando o software AtomicJ²³ para implementar o modelo de mecânica de contato de Derjaguin-Müller-Toporov (DMT)³⁵. Após o ajuste, os dados foram limpos para remover curvas que resultaram em um módulo de elasticidade calculado <0 (não físico) ou >30 GPa (já que o estudo foi focado na porção não mineral do xisto, E << 30 GPa) semelhante a outros estudos^39,40, bem como dados com ajuste de modelo R² < ^0,7. Embora o corte do R² seja um tanto arbitrário, ele foi escolhido para remover apenas os dados que o modelo obviamente não poderia ajustar com precisão. Com exceção de um outlier que incluía uma grande inclusão mineral na área de imagem, as curvas removidas representaram menos de 0,5% do total de dados para cada imagem. Um resumo dos resultados estatísticos pode ser encontrado na Tabela 2. Os módulos elásticos calculados variam de 3,5 a 6,1 GPa, dentro da faixa do que estudos semelhantes também^{encontraram39,40}.

Amostra	E (GPa)	Rendimento após a limpeza de dados	Contagem (n)
1	6.1 ± 3.8	93.70%	7,36,874
2	5.1 ± 2.6	99.70%	7,84,267
3	3.5 ± 1.9	99.60%	7,83,427

Tabela 2: Estatísticas do módulo elástico dos xistos de Bakken. Foram medidos os módulos elásticos das matrizes orgânicas em três amostras de xisto Bakken de diferentes composições e maturação térmica. A amostra 1 é um controle, enquanto as amostras 2 e 3 foram recozidas por 12 h e 48 h, respectivamente, para simular artificialmente a maturação térmica. Os módulos elásticos são apresentados como média ± desvio padrão para cada local da amostra, com o número de curvas de força (contagem, n) incluído na análise após o emprego do procedimento de limpeza dos dados descrito no texto indicado. Os módulos médios calculados (3,5-6,1 GPa) estão dentro da faixa relatada em outros estudos semelhantes, como o de Li et ^al.40, que encontraram uma faixa de módulo de 2,9-11,8 GPa.

A rigidez nuclear das células-tronco mesenquimais muda devido a estímulos externos
As células-tronco mesenquimais (CTMs) são células progenitoras que podem se tornar condrócitos, adipócitos, osteoblastos e miócitos⁴¹. A diferenciação das CTM nesses vários tipos de tecidos é afetada por estímulos mecânicos externos na célula através do complexo Linker of the Cytoskeleton and Nucleoskeleton (LINC), que liga fisicamente a membrana celular externa à membrana nuclear⁴¹. O complexo LINC é composto pelas proteínas SUN e Nesprin que interagem com o citoesqueleto celular para detectar forças físicas sobre a célula e facilitar a importação nuclear dos fatores mecanossensíveis β-catenina e YAP para iniciar o processo de diferenciação^42,43,44. Juntamente com a importação nuclear de β-catenina e YAP após a mecanoestimulação das células, o citoesqueleto também sofre rearranjos, incluindo a formação de filamentos de F-actina ao redor do núcleo, bem como a translocação nuclear de actina^44,45,46. Como a mecanoestimulação inicia mudanças no citoesqueleto celular e na entrada nuclear da actina, a rigidez geral (módulo) das células e núcleos é afetada e pode ser medida por nanoindentação baseada em cantilever AFM. Estudos anteriores confirmaram isso ao detectar uma diminuição no módulo celular e nuclear após a ruptura do complexo LINC e, inversamente, um aumento no módulo celular e nuclear após a mecanoestimulação das^{CTMs 47}. Pesquisas atuais ainda investigam os mecanismos de importação de actina para o núcleo e como a polimerização da actina afeta o módulo celular e nuclear após mecanoestimulação.

Para investigar as propriedades mecânicas de células vivas, os experimentos devem ser conduzidos em uma solução tampão, tipicamente PBS. A condução de nanoindentação à base de cantilever em fluido apresenta problemas únicos, especificamente para a medição de amostras muito moles, como MSCs (E≈ 2 kPa). Em particular, os baixos módulos elásticos das células vivas requerem o uso de um grande raio de sonda para reduzir o estresse transmitido na estrutura celular e evitar a perfuração da membrana. Além disso, balanços constantes de mola muito baixos (k = 0,04 N/m) são necessários para medir módulos elásticos tão baixos, mas isso aumenta a probabilidade de falso acoplamento devido ao arrasto viscoso do fluido, levando à deflexão do cantilever macio durante a etapa inicial de abaixamento rápido do processo de engates de AFM. Para neutralizar a maior propensão para engates falsos, pode ser necessário utilizar um setpoint de engate maior (ou seja, limiar de gatilho de tensão de deflexão para encerrar o processo de engajamento). Uma vez que os cantilevers mais macios geralmente podem ser elasticamente deformados em maior extensão do que os cantilevers rígidos, a maior flexão experimentada com um setpoint de acoplamento mais alto no fluido geralmente não é prejudicial para tais sondas macias. Além disso, é imperativo que as soluções utilizadas em um ambiente fluido estejam livres de detritos e bolhas, pois detritos flutuantes ou bolhas podem interferir transitoriamente na transmissão do laser através do fluido para o PSD ou aderir ao cantilever e bloquear o laser. A interferência com o feixe de laser afetará negativamente as curvas F-D resultantes e muitas vezes resulta em falsa detecção de colisão ou falso engajamento. Finalmente, a nanoindentação em células vivas também requer mais entrada do usuário do que em materiais inanimados mais duros. Em particular, como as células e seu ambiente fluido são muito mais dinâmicos, pode ser necessário ajustar ativamente a altura da sonda para cada rampa para garantir que uma boa curva F-D seja obtida.

Na nanoindentação de células vivas, uma deformação de amostra muito maior é frequentemente necessária para resultar na mesma deflexão de cantilever em relação a amostras mais rígidas. Essa maior deformação pode resultar em resultados experimentais que se desviam da suposição de elasticidade linear do modelo de Hertz e, portanto, um fator de correção pode precisar ser aplicado para explicar o comportamento hiperelástico para uma análise precisa da F-D⁴⁸. Verificou-se que a razão de tamanho geométrica , onde R ₂ é o raio do indenter e R₁ é o raio da célula (ver Figura 12A), pode ser usada para prever a aderência dos dados resultantes à mecânica hertziana. A razão geométrica ideal foi encontrada β = 0,3, com valores de β <0,3 levando a subestimar o módulo de elasticidade e valores de β > 0,3 levando a superestimar o módulo de elasticidade quando analisados com a teoria de contato de Hertz⁴⁸. Uma maneira comum de evitar efeitos não lineares é manter as deformações pequenas. Neste estudo, a profundidade de indentação foi limitada a 500 nm-1 μm.

Um conjunto de dados representativos mostrando os resultados de um único conjunto de experimentos de nanoindentação em CTMs e núcleos isolados é mostrado na Figura 12B. Nos dados apresentados na Figura 12B, pré-calibradas (constante de mola via LDV e raio de ponta via MEV), sondas hemisféricas de raio de 5 μm com constante nominal de mola de k = 0,04 N/m foram utilizadas para investigar diferenças no módulo entre CTMs vivas intactas e núcleos de CTM isolados, que serviram como controles para testar os efeitos de deformações estáticas e dinâmicas sobre as propriedades mecânicas celulares e nucleares⁴⁶. Devido às diferenças e desafios no engajamento das células e núcleos, os dados extraídos do módulo tendem a exibir uma grande variação (i.e., distribuição de valores). Nesse sentido, o conjunto de dados da Figura 12B apresenta um percentil 75^dos dados coletados. Devido a essa variabilidade inata entre células vivas e consequente disseminação de medidas, recomenda-se a realização de experimentos de nanoindentação replicada em grande número de amostras com pelo menos três réplicas biológicas, a fim de gerar estatísticas robustas para análise e interpretação dos dados³⁰.

Propriedades mecânicas de bicamadas lipídicas contendo colesterol
Membranas lipídicas suportadas com conteúdo muito alto (>50 mol%) de colesterol (Chol), típico da composição encontrada nas membranas do cristalino, foram preparadas e incubadas em mica muscovita recém-clivada⁴⁹. Uma imagem representativa da topografia AFM de tal membrana lipídica suportada (SLM) preparada em uma razão de mistura Chol/POPC (POPC = 1-palmitoil-2-oleoil-glicero-3-fosfocolina) de 1 é mostrada na Figura 13A, com o perfil de altura ao longo da linha roxa na imagem mostrada abaixo da figura. O MLS da Figura 13A cobriu completamente a superfície exposta da mica com tempo de incubação suficiente (~25 min) e concentração lipídica suficiente (0,3 mg/mL), como evidenciado pela falta de características distinguíveis na imagem de topografia. Da mesma forma, o perfil de altura ao longo da imagem fornece detalhes estruturais em relação à rugosidade da superfície da membrana, com o SLM liso como esperado.

A Figura 13B apresenta uma coleção dos cortes de aproximação das curvas de força capturadas no MLS mostradas na Figura 13A. Para obter melhores estatísticas em relação às propriedades mecânicas do MLS, curvas de força foram coletadas em pontos equidistantes espaçados pelo menos 100 nm, cobrindo quase toda a largura do MMS. O espaçamento entre os pontos (≥10x a profundidade de indentação) foi escolhido para evitar que o recuo ocorresse muito próximo. As curvas de força mostram um evento de ruptura claro, como evidenciado pela descontinuidade ou salto repentino entre as distâncias de separação de ~0 e ~5 nm na seção de aproximação das curvas de força, onde a força cai vertiginosamente de ~10 nN para ~5 nN. A força de avanço média para a membrana mostrada na Figura 13A (razão de mistura Chol/POPC de 1) com base nas curvas de aproximação da Figura 13B é calculada como sendo de 9,25 ± 0,27 nN.

Em contraste, a Figura 13C mostra uma imagem de topografia AFM da membrana parcial ou remendos de membrana formados por membranas novamente incubadas a uma razão de mistura Chol/POPC de 1, mas em uma concentração muito menor de lipídios (~15 μg/mL) e com um tempo de incubação mais curto (~5-6 min)⁴⁹. O perfil de altura ao longo da linha vermelha através do patch de membrana no centro da imagem é mostrado abaixo da figura. A medição através da bicamada parcial fornece a espessura do SLM, mostrada pelas linhas tracejadas pretas na Figura 13C como sendo ~7 nm. No entanto, essa espessura medida também incorpora uma camada de água de 1-2 nm entre a membrana e o disco de mica⁵⁰. Deve-se notar que a membrana parcial é frequentemente apenas fracamente aderida à superfície da mica, o que pode fazer com que partículas lipídicas sejam removidas da borda dos remendos parciais da membrana durante a varredura, mas um tempo de incubação um pouco maior ou a diminuição da força de imagem pode eliminar essa dificuldade.

A calibração da sonda AFM é crucial para quantificar com precisão as propriedades mecânicas do SLM. Em particular, embora a constante da mola de ponta permaneça consistente no ar ou no meio fluido, a sensibilidade à deflexão deve ser calibrada no mesmo meio em que os experimentos são realizados. É fundamental calibrar a sensibilidade à deflexão imediatamente antes de cada conjunto de aquisições de curvas de força para garantir resultados reprodutíveis, pois o alinhamento do laser e/ou a refletividade do revestimento traseiro podem mudar ao longo do tempo, particularmente no fluido. Sondas muito afiadas são desencorajadas para capturar curvas de força de membrana, pois perfuram facilmente o SLM e podem levar à medição de uma força de avanço erroneamente baixa ou nenhum avanço. No entanto, o uso repetido da mesma ponta sem a limpeza adequada aumenta a chance de acúmulo de detritos na ponta e, assim, embotar a ponta ou afetar as forças adesivas da ponta-amostra. A falta de eventos de ruptura evidentes nas curvas de força de aproximação também pode corresponder a empurrar apenas na mica em vez da membrana real; Assim, a confirmação visual da formação da membrana antes das curvas de força de captura é necessária.

Figura 7: Curvas representativas de força-deslocamento (F-D) no ar e no fluido. Curvas de força representativas obtidas em (A) um pinheiro loblolly no ar com ajuste de modelo DMT acompanhante, e (B) um núcleo MSC vivo em PBS com um ajuste de modelo Hertz acompanhante. As inserções nos painéis A e B mostram um zoom da região de contato das curvas de aproximação correspondentes (traços azuis) com ajuste de acompanhamento (traços verdes). Em cada painel, o ponto de contato inicial da ponta da amostra (conforme determinado pelo algoritmo de ajuste) é indicado por um diamante verde, enquanto o ponto de retorno (ou seja, transição da aproximação para a retração ou retirada) é indicado por um círculo ciano. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: Comparação do desgaste da ponta da sonda de silicone versus diamante. (A-D) Ponteira da sonda de silicone. Série de modelos criados pelo método de reconstrução de ponta cega após a obtenção de imagens de uma amostra de caracterização da ponta, demonstrando a evolução no raio de uma sonda de ponta de silicone de cantilever rígida (ver Tabela de Materiais) devido ao desgaste progressivo da ponta experimentado ao longo de três imagens sequenciais baseadas na curva de força de 85 μm x 85 μm (1024 x 1024 pixels) de uma amostra de xisto Bakken, conduzido a uma taxa de varredura de linha de 0,1 Hz e taxa de amostragem da curva de força de 2 kHz (ou seja, ~20 milhões de interações/imagem ponta-amostra). (A) Gorjeta conforme recebida (fora da caixa), antes do uso. R = 11 nm. (B) Ponta após uma imagem (R = 43 nm). (C) Ponta após duas imagens (R = 94 nm). (D) Ponta após três imagens (R = 129 nm). (E,F) Ponteira da sonda diamantada. Modelos BTR da mesma sonda de ponta de diamante (ver Tabela de Materiais) obtidos com ~6 meses de intervalo. Entre a aquisição das imagens da ponta usadas para gerar os modelos mostrados em E e F, milhares de nanorecuos foram realizados com a sonda e centenas de milhões de interações ponta-amostra durante a obtenção de imagens baseadas em curva de força ocorreram. No entanto, devido à dureza do diamante, o raio final estimado da ponta de ~30 nm não se alterou dentro dos limites de incerteza da técnica BTR entre a aquisição das imagens iniciais (E) e de acompanhamento (F) da ponta. A aspereza observada no modelo anterior (indicada pelo círculo preto no painel E é provavelmente um artefato do método BTR ou devido à presença de um contaminante em nanoescala (por exemplo, partícula de poeira) no lado da ponta. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 9: Mapas de topografia e módulo de AFM de uma amostra de pinheiro loblolly. Dados representativos de AFM adquiridos no ar em uma amostra de pinheiro loblolly com seção transversal embutida em resina para permitir medições de nanoindentação baseadas em cantilever nas paredes celulares. (A) Imagem de topografia AFM cobrindo múltiplas células adquiridas através de um modo de imagem baseado em curva de força rápida, apresentado como uma representação pseudo-3D. (B) Mapa do módulo de elasticidade ou de Young gerado em tempo real pelo software AFM, analisando a curva de força adquirida em cada pixel e ajustando os dados ao modelo DMT, mostrando que as paredes celulares são mais rígidas que o interior das células. Note que os parâmetros de calibração nominal, em vez de medidos, foram usados, de modo que os valores do módulo devem ser tratados como qualitativos ou apenas semiquantitativos. (C) Visão geral da ROI indicando os locais (oito linhas consistindo de 50 miras brancas cada uma espaçadas ≥100 nm de distância) onde 400 nanoindents (tamanho nominal de rampa de 60 nm, com um limiar de gatilho de 1 μN correspondente a uma profundidade média de indentação de ~10 nm) foram realizados ao longo de paredes celulares selecionadas após a aquisição da imagem AFM para permitir a localização de recuos com precisão nanométrica. Barras de escala = 20 μm (A,B). Abreviações: AFM = microscopia de força atômica; DMT = Derjaguin-Muller-Toporov. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 10: AFM co-localizado e MEV/EDS de uma amostra de xisto de Bakken. (A) Imagem de microscopia eletrônica eletrônica de varredura secundária de uma porção de uma amostra de xisto de Bakken. (B) Imagem topográfica AFM da região indicada pela caixa preta em A. Oval preto indica uma região onde a baixa proporção da sonda leva à imagem da parede lateral da sonda, em vez da característica de topografia de superfície íngreme e alta taxa de aspecto. (C) Mapa de composição elementar da EDS obtido para a imagem de MEV mostrada em A. (D) Mapa elástico derivado do AFM ou módulo de Young gerado durante a obtenção da imagem da topografia do AFM em B, mostrando que a inclusão mineral no centro das imagens A-D é significativamente mais dura do que a matriz orgânica circundante. Barras de escala = 50 μm. Abreviações: AFM = microscopia de força atômica; MEV = microscopia eletrônica de varredura; EDS = espectroscopia de energia dispersiva. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 11: Efeito do raio e da forma da ponta da sonda na aparência de recursos de alta taxa de aspecto. Comparação da resolução de feição obtida usando (A) uma sonda de ponta de diamante de R≈ 30 nm de baixa proporção (meio ângulo da ponta = 47°) (ver Tabela de Materiais) ou (B) uma sonda de ponta de diamante de R≈ 10 nm de altura (meio ângulo da ponta ≈ 19°) (k nominal = 200 N/m; ver Tabela de Materiais) para obter imagens do mesmo local em uma amostra de xisto Bakken. (C-F) Imagens ampliadas das regiões encaixotadas azul (C,D) e laranja (E,F) em A e B obtidas com a sonda de ponta de diamante de raio de curvatura menor razão de aspecto (C,E) ou com a sonda de modo de toque de silicone rígido de silicone mais nítida e com maior relação de aspecto (D,F), destacando a resolução de feição reduzida e a introdução de artefatos de parede lateral da ponta na imagem de topografia AFM obtida com a sonda de ponta de diamante devido ao seu maior raio de ponta e meio ângulo. As áreas destacadas em C-F contêm características íngremes e profundas que demonstram as compensações em termos de resolução lateral, rastreamento preciso e fidelidade de imagem entre uma sonda de silício mais facilmente embotada e inicialmente afiada ou uma sonda de ponta de diamante mais suave e resistente ao desgaste. (G) Imagem 3D composta gerada pela combinação da topografia AFM adquirida com a sonda de silicone rígido de maior proporção nítida e com dados de módulo (pele colorida sobreposta) derivados da imagem da curva de força rápida da mesma área da amostra com a sonda de ponta de diamante. As características destacadas pelas caixas azuis e brancas em A e B também são indicadas em G. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 12: Nanoindentação baseada em cantilever em células ou núcleos. (A) Uma célula com raio R ₁ localizada em um substrato plano e rígido é recuada a uma profundidade d por um indenter esférico com raio R₂. Esse dado foi reproduzido de Ding et ^al.48. (B) Gráficos de valores individuais de medidas representativas de módulos obtidos de experimentos de nanoindentação baseados em balil AFM em CTMs de camundongos e núcleos isolados extraídos de CTMs de camundongos. Um total de 10 células e 10 núcleos foram medidos cinco vezes cada a uma profundidade de indentação de 500-600 nm (escolhido para permitir o uso do modelo de mecânica de contato de Hertz). Os dados brutos resultantes da curva F-D foram processados usando o Atomic J²³ para calcular os módulos elásticos. Devido à grande variabilidade inata das células, um percentil 75^dos dados é plotado. Núcleos celulares e isolados não apresentaram diferença estatística no módulo de elasticidade, com módulos médios medidos de 0,75 ± 0,22 kPa e 0,73 ± 0,22 kPa, respectivamente. Dados semelhantes foram coletados e analisados para determinar diferenças na rigidez nuclear devido à estimulação mecânica, knockouts proteicos e tratamentos químicos. Abreviações: CTM = células-tronco mesenquimais; AFM = microscopia de força atômica; F-D = força-deslocamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 13: Morfologia e propriedades nanomecânicas das bicamadas lipídicas. (A) Imagem de topografia AFM mostrando a variação mínima de altura de uma membrana lipídica suportada completa (SLM) composta de Chol/POPC em uma razão de mistura de 1 que se formou em toda a superfície exposta da mica com um longo tempo de incubação (~25 min) e alta concentração de lipídios (0,3 mg/mL). O perfil de altura ao longo da linha roxa no meio da imagem é mostrado abaixo da figura, fornecendo detalhes estruturais da superfície da membrana. Como esperado, o SLM é extremamente suave. (B) Coleta de seções de aproximação das curvas de força capturadas no SLM mostrado em A. Curvas de força foram coletadas em pontos equidistantes ≥100 nm de distância, cobrindo quase todo o MMS. As curvas de força mostram um claro evento de ruptura, como evidenciado pela descontinuidade ou salto repentino na seção de aproximação das curvas de força. A força de avanço média é de 9,25 ± 0,27 nN. (C) Membrana parcial ou remendos de membrana formados por membranas incubadas em uma relação de mistura Chol/POPC de 1 com um menor tempo de incubação (~5-6 min) e menor concentração lipídica (~15 μg/mL) em relação a A⁴⁹. O perfil de altura ao longo da linha vermelha no patch é mostrado abaixo da imagem. A bicamada parcial permite a medição da espessura do SLM, mostrada pelas linhas tracejadas pretas no perfil de altura. Note que a espessura medida também incorpora uma camada de água de 1-2 nm entre a membrana e o disco de mica⁵⁰. Essa figura foi adaptada de Khadka et ^al.49 com permissão da Elsevier. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Preparo da amostra
Para nanoindentação no ar, os métodos de preparação comuns incluem criossecção (por exemplo, amostras de tecido), moagem e/ou polimento seguido de ultramicrotomografia (por exemplo, amostras biológicas embutidas em resina), moagem de íons ou preparação de feixe de íons focalizado (por exemplo, amostras de dureza semicondutora, porosa ou mista não passíveis de polimento), polimento mecânico ou eletroquímico (por exemplo, ligas metálicas) ou deposição de filme fino (por exemplo, camada atômica ou deposição química de vapor, epitaxia por feixe molecular). O objetivo é criar uma amostra com rugosidade superficial mínima (idealmente em escala nm, ≤0,1x a profundidade de indentação pretendida). Com muitos dos métodos anteriores, a amostra pode precisar ser posteriormente lavada com e/ou sonicada, em solvente filtrado de alta pureza (por exemplo, grau HPLC) e seca com gás nitrogênio (N₂) de pureza ultra-alta (99,999%) para remover detritos particulados. Alternativamente, flocos (por exemplo, materiais 2D) ou partículas (por exemplo, nanopartículas ou microcápsulas) podem ser revestidos por spin ou lançados por gota de soluções preparadas usando solventes filtrados de alta pureza. Neste caso, o objetivo é alcançar uma densidade superficial que produza múltiplos flocos ou partículas não sobrepostos dentro do campo de visão em qualquer área escolhida aleatoriamente na amostra. Para nanoindentação em fluido (frequentemente empregada para amostras biológicas que requerem solução tampão para permanecer viável), é necessária a deposição ou preparação de amostras em um substrato liso (rugosidade superficial em escala nanométrica) (por exemplo, lâmina de microscópio, placa de Petri ou mica muscovita recém-clivada)^46,47,49.

Considerações sobre a seleção do teste
A seleção de uma sonda apropriada é de extrema importância para a análise quantitativa de curvas F-D, pois a interação ponta-amostra é a propriedade fundamental que está sendo medida na nanoindentação baseada em cantilever. As perguntas a seguir são de particular importância ao escolher uma sonda para um determinado experimento. Qual é a rugosidade superficial esperada (ou medida) da amostra e a faixa de módulo elástico? Amostras de alta rugosidade podem causar desgaste acelerado em comparação com amostras mais lisas devido ao aumento das forças laterais presentes na ponta ao rastrear características íngremes, bem como aumentar a probabilidade de eventos de quebra da ponta⁵³. Da mesma forma, quanto mais dura for a amostra, mais rápido ela desgastará a ponta da sonda. Além disso, quantas imagens e/ou nanorecuos são necessários? Com menos imagens e recuo, menos desgaste das pontas pode ser esperado. Conforme descrito em maiores detalhes abaixo, o desgaste da ponta pode ser diminuído utilizando revestimentos de carbono semelhante ao diamante (DLC) ou virtualmente eliminado usando sondas de ponta de diamante (com o alto custo de aquisição compensado ao longo do tempo pela vida útil quase infinita da sonda).

Outra consideração na escolha de uma sonda apropriada é o tamanho das características de interesse. Para nanoindentação, muitas vezes é melhor usar o maior tamanho de ponta possível, mantendo a resolução espacial necessária para a(s) amostra(s) em questão e o conteúdo de informação desejado, porque pontas maiores são menos propensas a sofrer mudanças bruscas de geometria da ponta devido à fratura e também exibirão taxas de desgaste mais baixas⁵⁴. Também é importante considerar se existem outros métodos de AFM a serem co-localizados com nanoindentação, como AFM^{condutivo 55}, microscopia de força de sonda Kelvin (KPFM)⁵⁶ ou microscopia de força magnética (MFM)⁵⁷. Se metrologias adicionais como essas forem utilizadas, a ponta da sonda pode precisar ser eletricamente condutora ou magnética, o que afetará a composição do material e, portanto, uma série de propriedades, incluindo dureza, resistência ao desgaste e raio da ponta. Da mesma forma, se a indentação for realizada em fluido, a composição do revestimento traseiro reflexivo da sonda (se presente) é outra consideração importante, pois deve ser resistente à corrosão (por exemplo, um revestimento traseiro Au é comum para sondas fluidas). Finalmente, e talvez o mais importante, a constante de mola do cantilever da sonda deve ser correspondida à faixa esperada de módulos elásticos a serem medidos. Se a constante de mola não coincidir bem com o módulo da amostra, pode ocorrer um dos dois casos. Se o cantilever for muito rígido, pouca ou nenhuma deflexão será medida e a caracterização se tornará impossível; Por outro lado, se o cantilever for muito macio, ele não será capaz de deformar a amostra o suficiente para medir suas propriedades mecânicas.

Desgaste da ponta
O desgaste pode ser definido de várias maneiras; para a discussão do desgaste da ponta da sonda AFM aqui, será definido como qualquer alteração na topografia da superfície da ponta da sonda devido à deformação plástica sem qualquer perda de material, bem como qualquer remoção de material da superfície devido a interações físicas⁵⁸. Em um sentido mais amplo, o desgaste também pode envolver reações químicas, como oxidação e hidratação. Em aplicações normais de AFM, a resolução espacial lateral é geralmente limitada pelo raio da ponta⁵⁹, e a interação ponta-amostra é a principal propriedade medida. Uma vez que o raio da ponta é um parâmetro-chave na modelagem da mecânica de contato do sistema ponta-amostra e, posteriormente, na determinação das propriedades mecânicas, o desgaste da ponta é particularmente preocupante na realização de experimentos de nanoindentação e é uma limitação chave para a interpretação precisa dos resultados da nanoindentação⁵³. Devido à natureza normalmente gradual do desgaste da ponta (além dos eventos de quebra da ponta), não é possível quantificar o desgaste da ponta devido a um único ciclo de nanoindentação (ou seja, rampa). Além disso, o movimento perpendicular da ponta da sonda em relação à amostra em nanoindentação (descontando imagens baseadas em curvas de força rápida) se presta a reduzir a taxa de desgaste, já que o principal modo de desgaste da ponta é tipicamente forças de cisalhamento que se desenvolvem durante os modos de varredura⁶⁰. Como tal, a principal fonte de desgaste da ponta em experimentos de nanoindentação é qualquer imagem realizada após a calibração inicial da sonda (em particular, medições de sensibilidade à deflexão e raio da ponta), mas antes da nanoindentação. Portanto, recomenda-se que, se forem usadas sondas de nitreto de silício ou silício, o raio da ponta seja verificado antes e depois de cada experimento para monitorar e contabilizar qualquer desgaste da ponta usando um dos métodos descritos acima (por exemplo, análise por MEV ou BTR).

Materiais da sonda
Carbono semelhante ao diamante (DLC)
Através do uso de pontas de sonda revestidas com DLC ou pontas de diamante, o desgaste da ponta pode ser amplamente reduzido ou negado por completo⁵³. A maior resistência ao desgaste desses materiais de ponta alternativos é muito atraente para a medição de propriedades mecânicas, particularmente de materiais muito rígidos. Foi demonstrado que as pontas da sonda DLC podem mostrar um aumento de 1.600 vezes na resistência ao desgaste em comparação com as pontas normais da sonda de silicone⁵⁴. Esse aumento dramático na resistência ao desgaste pode ser atribuído a vários fatores. Primeiro, as ligações presentes no DLC (C-C e C=C) e sua interface com o silício (Si-O, Si-C) são algumas das ligações mais fortes de quaisquer pares elementares, e muito mais fortes do que as ligações Si-Si presentes nas pontas de silício. O DLC também tem o efeito de diminuir o atrito, o que, por sua vez, diminui as tensões de cisalhamento dentro da ponta, reduzindo assim o desgaste. Além disso, a química da superfície do DLC é diferente daquela de uma ponta de silício, pois as pontas de silício podem sofrer condicionamento triboquímico em condições de umidade ambiente, enquanto as pontas de DLC não o fazem (ou pelo menos não de forma significativa em comparação com o modo de desgaste primário)⁵⁴. A principal desvantagem das pontas revestidas com DLC (além do aumento do preço em relação às pontas de silício não revestidas padrão) é o aumento do raio da ponta devido ao próprio revestimento. A maioria dos raios da ponta da sonda DLC é de ≥30 nm, enquanto as pontas não revestidas com DLC podem atingir de forma confiável 1-2 nm no raio⁶¹. No entanto, um raio de ponta maior pode muitas vezes ser desejável para experimentos de nanoindentação para reduzir o erro em medições de propriedades, já que discrepâncias em nanoescala entre a função área-profundidade ideal e a função área-profundidade real, devido a defeitos ou asperezas da sonda, afetarão desproporcionalmente as medições feitas com sondas de raio menor devido ao maior erro relativo. Além disso, apesar de sua resistência ao desgaste superior, o revestimento DLC pode eventualmente se desgastar em pontos, levando ao desgaste diferencial entre o núcleo de silício exposto e o revestimento DLC restante. Infelizmente, a resistência ao desgaste do revestimento DLC também pode ser limitada pela adesão do revestimento à ponta de silício, em vez da dureza real do revestimento sozinho.

Diamante
O diamante é bem conhecido como um dos materiais mais duros e resistentes ao desgaste na Terra. No entanto, foi demonstrado que um desgaste significativo ainda pode ocorrer em pontas de diamante quando se usam forças grandes (60 μN) em uma tentativa deliberada de explorar o desgaste da ponta⁶². Por outro lado, em cenários normais de nanoindentação e imagem onde as forças exercidas na ponta são muito menores, não houve estudos rigorosos de desgaste da ponta de diamante. No entanto, como visto na Figura 8E,F, a modelagem BTR da mesma ponta de sonda de diamante sob condições idênticas na mesma amostra de caracterização da ponta com 6 meses de intervalo gerou modelos de forma de ponta virtualmente indistinguíveis (ou seja, nenhuma evidência discernível de desgaste). Entre a primeira e a segunda imagens BTR, a sonda foi usada para realizar milhares de nanorecuos e passou por centenas de milhões de interações ponta-amostra enquanto imageava uma variedade de materiais rígidos (E > 15 GPa), incluindo madeira (pinho loblolly), xisto, grafite pirolítico altamente ordenado (HOPG) e vários filmes finos de grafeno. Significativamente, o raio da ponta estimado mudou em ~1 nm entre as duas imagens na Figura 8E,F, o que está bem dentro do erro⁶³ do método BTR. Embora não seja um estudo completo, esta comparação demonstra a excelente durabilidade de uma sonda de diamante sob condições normais de nanoindentação experimental (e até mesmo de imagem). As principais desvantagens associadas ao uso de pontas de diamante (além do custo inicial caro) são o aumento do raio da ponta e, de certa forma mais preocupante, a baixa proporção da geometria do canto do cubo da maioria das pontas de diamante disponíveis comercialmente. A Figura 11A,B apresenta imagens AFM comparativas lado a lado da mesma área de uma amostra de xisto de Bakken adquiridas com uma sonda de silicone nítida com um raio de ponta nominal de 8 nm e meio ângulo médio de ~19° versus uma sonda de ponta de diamante com um raio de ponta nominal de 40 nm e ângulo lateral médio de 47°. Quando as áreas ampliadas são comparadas (Figura 11C,D e Figura 11E,F), é facilmente evidente que a sonda da ponta do diamante é incapaz de resolver e rastrear com precisão as características mais íngremes (maior proporção) dentro da imagem. Em vez disso, onde características íngremes estão presentes, a parede lateral da ponta faz contato com a borda superior e o sistema AFM essencialmente rastreia a parede lateral da sonda até que a extremidade da ponta faça contato com a superfície novamente e o rastreamento normal seja retomado.

Correspondência constante/módulo de mola
Como mencionado acima, a constante de mola do cantilever da sonda deve ser combinada com a faixa esperada de módulos elásticos a serem medidos. Para auxiliar na escolha de uma sonda apropriada, a Tabela 3 apresenta constantes de mola de cantilever nominais sugeridas adequadas para amplas faixas selecionadas de módulos elásticos de amostra esperados, variando de poucos MPa a 100 GPa no caso de pontas de sonda de raio de ~30-40 nm frequentemente empregadas para nanoindentação⁵². Sondas constantes de mola mais baixas (k < 0,1 N/m) estão disponíveis para materiais ainda mais macios (faixa de kPa), como células.

Constante de mola (N/m)	Intervalo esperado do módulo de amostra
0.25	≤ 15 MPa
5	5 – 500 MPa
40	200 – 8.000 (0,2 – 8 GPa)
200	1.000 – 50.000 (1 – 50 GPa)
450	10.000 – 100.000 (10 – 100 GPa)

Tabela 3: Constantes de mola de sonda ideais para medir várias faixas de módulo. Constantes de mola de sonda nominais aproximadas para medição ideal de módulos elásticos em faixas variáveis de poucos MPa a 100 GPa, assumindo um raio de sonda típico de ~30-40 nm⁵².

Além da constante de mola, no caso especial de materiais biológicos, o raio da ponta e as forças aplicadas durante a imagem e a nanoindentação devem ser cuidadosamente considerados para evitar danos. No exemplo de aplicação envolvendo a medição das propriedades mecânicas de bicamadas lipídicas contendo colesterol, apresentado na seção de resultados representativos, uma ponta relativamente afiada (10 nm) foi usada especificamente para a análise da força de ruptura em bicamadas lipídicas. Em contraste, se a ROI do material for grande o suficiente (por exemplo, como é o caso das células e núcleos celulares) e houver preocupação com o potencial de punção, pontas hemisféricas de maior escala de mícrons, como as usadas nas medidas de rigidez em núcleos de CTM descritas em um dos exemplos de aplicação na seção de resultados representativos, são ideais e fornecem excelentes resultados para macios, amostras frágeis, como células vivas e núcleos isolados. Kain e col. apresentam uma discussão aprofundada sobre como escolher a combinação ideal de raio de sonda e constante de mola para alcançar a maior sensibilidade de medição possível para tais amostras⁶⁴.

Calibração da sonda
Sensibilidade à deflexão
A sensibilidade à deflexão relaciona o movimento do Z-piezo (e, portanto, a deflexão do cantiléver ao recuar sobre um substrato infinitamente rígido, assumindo operação no limite de pequenas deflexões) a uma mudança medida na tensão no PSD⁶⁵. A sensibilidade à deflexão (também conhecida como sensibilidade inversa da alavanca óptica [InvOLS]) pode ser relatada em nm/V ou V/nm. Uma visão geral dos métodos de calibração de sensibilidade à deflexão mais comuns é fornecida abaixo.

Contato com a superfície dura
O método mais fácil e popular para determinar a sensibilidade à deflexão do sistema beam bounce laser/AFM probe/PSD é o apropriadamente chamado de método de "contato com a superfície dura"⁶⁵. Sua simplicidade, facilidade de integração em fluxos de trabalho de software de controle AFM e natureza in situ aumentam o apelo e o uso generalizado do método de contato com a superfície dura. Para implementar este método, a ponta da sonda AFM é rampa contra um material muito mais rígido do que o cantilever. A inclinação da porção em contato da curva força-deslocamento (exibida como Volts do sinal de erro de deflexão vertical no PSD em função do movimento Z-piezo em nm ou tensão aplicada) então fornece a sensibilidade à deflexão (Figura 3A). O uso de um substrato rígido garante que toda a deflexão medida surja da flexão do cantiléver, em vez de uma convolução da deformação da amostra e do deslocamento do cantilever. No caso de balanços macios (por exemplo, k < 10 N/m), silício (E ≈ 170 GPa)²⁷ ou mica¹⁷ são materiais facilmente acessíveis e facilmente utilizados (ou, alternativamente, vidro, E≈ 70 GPa, ou plástico adequadamente duro no caso de células imobilizadas em uma lâmina de microscópio ou placa de Petri), enquanto para cantiléveres mais rígidos, como aqueles usados para alguns experimentos de nanoindentação (por exemplo, k > 200 N/m; Tabela 3), a safira (E≈ 345 GPa)^26,66 pode precisar ser usada para garantir que nenhuma deformação da amostra ocorra. Como esse método depende da medição de deslocamento de força, o Z-piezo do scanner AFM deve empregar um sensor de altura de malha fechada ou ser bem calibrado (se estiver operando em modo de malha aberta) usando uma variedade de padrões de altura. O maior contribuinte para o erro no método de contato com a superfície dura é o movimento do ponto laser no cantilever devido a flutuações térmicas. Mudanças na temperatura do cantilever são mais comumente causadas pelo laser de detecção, embora o aquecimento Joule na eletrônica circundante também possa contribuir. Foram relatadas diferenças gerais de temperatura de 6 °C entre o cantilever e o ar ambiente, o que pode levar a deslocamentos de pontos de laser de vários mícrons⁶⁷. Para dar conta de qualquer aquecimento, é aconselhável esperar ≥30 minutos após o alinhamento inicial do ponto laser para permitir que o cantilever entre em equilíbrio térmico com seu entorno para obter os melhores e mais precisos resultados. A média das inclinações das curvas de aproximação e retirada para cada medida de sensibilidade será responsável por qualquer efeito de atrito ou deslizamento da ponta e deve ser decretada, se possível,⁶⁸. Além disso, a média entre múltiplas medições de sensibilidade ajudará a avaliar a confiabilidade e a reprodutibilidade da medição. Boas medidas de sensibilidade devem resultar em desvios de ≤1% e ser realizadas aproximadamente na mesma deflexão dos nanoindents experimentais esperados para maximizar a eficácia da calibração⁶⁹. A principal desvantagem do método de contato com a superfície dura é que o contato físico necessário para a calibração pode potencialmente causar danos a pontas frágeis de silício (por exemplo, embotamento ou criação de artefatos de ponta, como uma ponta dupla).

Método do ruído térmico
O método de ruído térmico para determinar a sensibilidade à deflexão requer a calibração prévia da constante da mola do cantilever e a capacidade de medir o espectro de ruído térmico do cantilever⁶⁷. O método de ruído térmico é frequentemente integrado ao software de controle AFM moderno e pode ser usado em conjunto com o método Sader (veja abaixo) para análise e cálculo rápidos da constante da mola e da sensibilidade à deflexão. No entanto, pode ser difícil ou impossível usar o método de ruído térmico em balanços mais rígidos (k > 10 N/m) devido à diminuição da amplitude de vibração. Além disso, a incerteza relativa relatada do método de ruído térmico é significativamente maior, ~20% em comparação com o método de contato com a superfície dura descrito acima^{de 70}. Esta técnica não pode ser utilizada se o método de ajuste térmico para a determinação da constante de mola descrito abaixo estiver sendo empregado⁶⁷.

Constante da mola
O padrão ouro para medir constantes de mola de cantilever é a vibrometria Doppler a laser (LDV), e agora existem muitas sondas comercialmente disponíveis que vêm com informações de calibração constante de mola derivadas de LDV fornecidas pelo fabricante para cada sonda individual (consulte a Tabela de Materiais). No entanto, embora a medição precisa da constante da mola cantilever seja uma necessidade absoluta para medições nanomecânicas quantitativas, os métodos práticos para fazê-lo no laboratório típico para sondas não calibradas são amplamente variados e podem ser um tanto complexos. Como tal, apenas uma breve visão geral dos dois métodos de calibração constante de mola mais comuns no local é fornecida aqui, com uma lista de métodos adicionais e citações apropriadas da literatura para consultar para obter mais informações.

Método de ajuste térmico
Provavelmente o método mais comum disponível nos AFMs comerciais atuais, o método de ajuste térmico para determinar constantes de mola de cantiléver é incorporado ao software de controle para muitos sistemas. Embora não seja ideal para balanços mais rígidos (k > 10 N/m) devido à detecção de deflexão reduzida do cantilever e à largura de banda eletrônica limitada, o método de ajuste térmico é relativamente fácil de implementar e é válido para uma ampla gama de geometrias de ponta⁷¹. O método de ajuste térmico utiliza a medição e ajuste do espectro de ruído térmico do cantilever, seguido da aplicação do teorema da equipartição para calcular a energia potencial do cantilever, com o cantilever geralmente modelado como um oscilador harmônico simples⁷². O método de ajuste térmico tem um erro de ~5%-10% para sondas macias e é aplicável para qualquer forma de cantilever^73,74. Para obter informações mais detalhadas, consulte as referências citadas nesta seção.

Método Sader
O método Sader é outro método frequentemente integrado ao software de controle de muitos AFMs modernos^75,76,77. O método Sader usa a carga hidrodinâmica experimentada por um cantilever enquanto ele vibra em um meio fluido (geralmente ar ou água), juntamente com as dimensões de visão de plano do cantilever e o fator de qualidade para calcular a constante de mola do cantilever. O método Sader leva a um erro de ~10%-15% para a constante de mola cantilever⁷⁴. Artigos correspondentes sobre o "método original"76,78, "método geral"^79, uma extensão do método geral ⁷⁷ e documentação específica do instrumento podem fornecer mais detalhes.

Outros métodos
Existem vários outros métodos que foram desenvolvidos e implementados para determinar a constante de mola de balanços AFM que estão além do escopo deste artigo. Embora nenhum desses métodos seja tão fácil de implementar ou tão difundido quanto os métodos Sader ou de calibração de ajuste térmico, cada um deles possui vantagens e desvantagens únicas; A literatura citada fornece detalhes sobre sua aplicação e implementação. Em particular, a Sikora fornece uma excelente revisão de muitos métodos de calibração constante de mola e é um excelente recurso sobre o tópico⁷². Uma lista não exaustiva de outros métodos para determinar constantes de mola inclui vibrometria laser Doppler (LDV)73,74,80, dispositivos baseados em sistemas micro-elétrico-mecânicos (MEMS)⁸¹, cantilever de referência 82,83, massa adicionada (dinâmica ⁷⁵ e estática ⁸⁴), balança de precisão^85,86, atuação eletromagnética ⁸⁷ e análise de elementos finitos (FEA) ^88,89.

Raio da ponta
Métodos comuns para determinar o raio da ponta incluem imagens por MEV de elétrons secundários e o método de reconstrução da ponta cega (BTR).

Análise de MEV
A imagem por MEV eletrônica secundária pode fornecer resolução de até 1 nm, permitindo que imagens progressivas de desgaste sejam direta e facilmente comparadas. Uma desvantagem da imagem por MEV é que, como existem apenas ferramentas combinadas altamente experimentais AFM-SEM 90, a sonda^AFM normalmente deve ser desmontada e transportada para a MEV para análise, o que pode ser demorado e potencialmente sujeitar a sonda à contaminação. Outra desvantagem do MEV é que a imagem resultante é inerentemente uma projeção 2D da ponta, sem informações 3D quantitativas disponíveis. Deve-se tomar cuidado para alinhar a sonda na mesma orientação cada vez para que os resultados comparativos sejam significativos, pois mesmo pequenas mudanças no ângulo incidente do feixe de elétrons podem alterar o tamanho e a forma aparentes da ponta da sonda. Finalmente, a imagem por MEV pode ser atormentada por efeitos de carregamento e contaminação por carbono, que podem borrar a imagem ou causar alterações físicas na ponta da sonda, respectivamente.

Reconstrução de ponta cega
Em contraste com o MEV, o método BTR é uma técnica in situ na qual a geometria da ponta 3D é modelada com base na imagem de uma amostra com numerosas características nítidas (alta taxa de aspecto) muito menores do que o raio da sonda. Esse método funciona porque, no AFM, a imagem observada é sempre uma convolução da forma da ponta da sonda e da forma da característica da amostra, portanto, modelando características extremamente nítidas como infinitamente nítidas, a forma da ponta pode ser estimada. Infelizmente, além da suposição de pontas infinitamente nítidas (ou seja, características de superfície muito menores do que o raio da ponta), a técnica BTR pode ser influenciada por ruído de imagem e parâmetros de varredura, de modo que imagens comparativas devem ser obtidas usando parâmetros de imagem muito semelhantes. Além disso, como várias "imagens" da ponta são usadas para reconstruir sua geometria, um cálculo inverso direto da forma da ponta é impossível. Devido à sua natureza, o método BTR só é capaz de informar o usuário sobre o limite superior da forma da ponta⁶³, e o ato de criar imagens da sonda para implementar o método BTR pode levar ao desgaste da ponta (por exemplo, embotamento ou lascamento da ponta da sonda).

Calibração relativa
Às vezes, uma determinada propriedade de sonda não pode ser medida com facilidade e precisão. Por exemplo, a constante de mola de balanços mais rígidos é difícil ou impossível de medir com o método de ajuste térmico devido a limitações de largura de banda e deflexão⁹¹. Como discutido acima, outros métodos para determinar a constante de mola existem, mas como o método de ajuste térmico é integrado em muitos AFMs modernos, muitas vezes é implementado para uso diário simples. Da mesma forma, a sensibilidade à deflexão deve ser sempre calibrada antes da experimentação para a conversão do movimento do laser no PSD para a deflexão física do cantilever da sonda. Na prática, no entanto, a medição do raio da ponta é a etapa de calibração mais demorada e a que tem maior probabilidade de danificar a ponta da sonda. Se não for possível medir diretamente o raio da ponta via MEV ou BTR, então um procedimento de calibração relativa pode ser utilizado como uma alternativa para determinar o raio efetivo da ponta, desde que uma amostra de referência padrão com rugosidade superficial mínima (idealmente atomicamente plana) e um módulo bem conhecido próximo ao módulo experimental esperado esteja disponível. Exemplos desses padrões de referência ideais para calibração relativa incluem a mica muscovita 17,92,93,94,95 e o HOPG ^96, mas também servem para destacar a dificuldade em identificar padrões de referência adequados para amostras mais macias com módulos na faixa de kPa a MPa. Para realizar uma calibração relativa, primeiramente deve-se calibrar a sensibilidade à deflexão conforme descrito no protocolo principal. Em segundo lugar, a constante nominal de mola para a sonda deve ser introduzida (normalmente fornecida com a sonda) ou medida através de um dos métodos acima descritos. O terceiro passo é o recuo na superfície da amostra padrão de referência do módulo usando parâmetros apropriados. Finalmente, os dados coletados da curva F-D devem ser analisados e o parâmetro raio da ponta ajustado até que o módulo reduzido medido experimentalmente corresponda ao módulo reduzido esperado. Deve ser tomada nota da profundidade média de deformação atingida na amostra de referência, uma vez que esta profundidade deve ser mantida aquando do recuo da amostra experimental de interesse para que a calibração seja relevante. Agora, pode ocorrer recuo na amostra de interesse, ajustando os parâmetros da rampa para corresponder à profundidade de deformação alcançada no material de referência padrão do módulo.

Uma vantagem do método de calibração relativa é que ele evita potenciais erros acumulados causados por calibração imprecisa da sensibilidade de deflexão, constante de mola e raio de ponta⁵². Além disso, talvez seja um pouco mais rápido e menos provável de danificar a sonda do que o método BTR. As maiores desvantagens do método de calibração relativa são: 1) a necessidade de uma amostra de referência de alta qualidade com rugosidade superficial em escala de nm a Angstrom e propriedades mecânicas bem conhecidas semelhantes às da amostra de interesse, que podem ser analisadas com a mesma sonda que a amostra experimental, e 2) a exigência de atingir a mesma profundidade de deformação ou muito semelhante nas amostras de referência e experimentais para que a calibração seja válida. Assim, é preferível medir diretamente o raio da ponta, se possível.

Análise de dados
O método de análise usado para determinar as propriedades mecânicas da amostra a partir das curvas F-D medidas é tão importante quanto a qualidade dos dados de nanoindentação em si. Existem várias teorias comuns de mecânica de contato que modelam relações força-deslocamento com base em diferentes pressupostos subjacentes (e, portanto, aplicáveis em diferentes cenários). Esses modelos de mecânica de contato incluem Hertz 97, Sneddon 28, JKR (Johnson, Kendall e Roberts)⁹⁸, DMT (Derjaguin, Muller e Toporov)^35,99, MD (Maugis-Dugdale)100 e MYD (Muller, Yushchenko e Derjaguin)^101,102. Uma análise e comparação aprofundadas de vários modelos de mecânica de contato e sua aplicação para análise foi apresentada em outra publicação29,30,103,104. Embora esteja além do escopo deste artigo, a Tabela 4 fornece uma breve visão geral de alguns dos modelos de mecânica de contato mais comuns. De particular destaque, modelos mais complexos como JKR, DMT e outros incorporam os efeitos da adesão ponta-amostra 30,35,98,99,100,101,102,103,104^, que podem ser significativos e muitas vezes são facilmente identificáveis pelo aparecimento de deflexão negativa na curva de força (ver Figura 3). Na prática, o modelo de análise escolhido é usado para ajustar os dados de F-D coletados e determinar as propriedades mecânicas, como o módulo de elasticidade. Para ajustar adequadamente os dados, uma linha de base plana é necessária para determinar o ponto de contato inicial ou um ponto de contato efetivo que se ajuste à parte dos dados experimentais com a maior correlação com o modelo.

Teoria	Aplicabilidade	Suposições	Limitações
Hertz	Simples; frequentemente usado para amostras em fluido.	Sem adesão.	Inválido para sistemas que possuem forças adesivas presentes.
Derjaguin-Muller-Toporov (DMT)	Rígido com pequenas deformações.	Adesão de curto alcance na região de contato mais adesão de longo alcance fora da região de contato.	Geometria restrita pode causar uma subestimação da área de contato.
Johnson-Kendall-Roberts (JKR)	Mole com grandes deformações.	Forças adesivas de curto alcance apenas na região de contato.	Pode subestimar a carga devido à aderência.
Maugis – Dugdale (MD)	Esta solução geral abrange os outros modelos de adesivos.	Interface de exemplo de ponta modelada como uma rachadura.	Solução analítica envolvendo equações paramétricas.

Tabela 4: Modelos de mecânica de contato comum. Modelos de mecânica de contato comuns selecionados com aplicabilidade, suposições e limitações observadas.

A aplicação prática dos modelos mencionados acima para análise de curvas F-D requer o uso de programas computacionais para permitir o processamento em larga escala de milhares ou milhões de curvas em um curto espaço de tempo e realizar análises estatísticas sobre os resultados. O código escrito interno é frequentemente usado na análise de dados F-D, e vários fabricantes de AFM também fornecem pacotes de software. No entanto, devido à sua natureza de código aberto, facilidade de uso e informações complementares detalhadas, os autores recomendam o uso do AtomicJ²³. O programa permite a análise simples e precisa de dados F-D usando qualquer uma das teorias descritas acima, bem como várias outras. Como o código é de código aberto, é fácil manipular e personalizar para casos de uso específicos sem a necessidade de criar código complexo do zero. Consulte Hermanowicz et ^al.23 para obter informações detalhadas sobre o pacote de software AtomicJ.

Em conclusão, através da calibração cuidadosa da sonda, a área de contato e a força aplicadas por uma ponta de sonda AFM à superfície de uma amostra podem ser quantificadas para permitir a determinação de propriedades mecânicas em nanoescala, em particular o módulo de elasticidade. Um protocolo generalizado destacando as melhores práticas para implementar com sucesso a nanoindentação baseada em balil AFM no ar ou fluido em amostras moles e duras, com módulos elásticos variando de kPa a GPa, foi apresentado com exemplos representativos fornecidos. Considerações importantes, como seleção da sonda (incluindo rugosidade da superfície da amostra, tamanhos de características, proporção da sonda e desgaste da ponta), calibração da sonda e análise de dados (incluindo modelos de mecânica de contato e estatísticas de medição) foram discutidas. Finalmente, a co-localização de mapas nanomecânicos derivados de AFM com outras técnicas de caracterização fornecendo informações composicionais como MEV/EDS foi demonstrada, bem como um exemplo de medição de uma propriedade nanomecânica diferente do módulo elástico (i.e., força de ruptura da bicamada lipídica) via nanoindentação baseada em cantilever AFM para fornecer exemplos de aplicações sinérgicas adicionais da técnica. Tomados em conjunto, os exemplos e a discussão fornecidos aqui devem fornecer um ponto de entrada para pesquisadores que buscam empregar nanoindentação baseada em balil AFM para medir as propriedades mecânicas de praticamente qualquer tipo de amostra.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Atomic force microscope	Bruker	Dimension Icon	Uses Nanoscope control software, including PeakForce Quantitative Nanomechanical Mapping (PF-QNM), FastForce Volume (FFV), and Point-and-Shoot Ramping experimental workspaces
AtomicJ	American Institute of Physics	https://doi.org/10.1063/1.4881683	Flexible, powerful, free open source Java-based force curve analysis software package. Supports numerous contact mechanic models, such as Hertz, Sneddon DMT, JKR, Maugis, and cone or pyramid (including blunt and truncated). Also includes a variety of initial contact point estimation methods to choose from. Supports batch processing of data and subsequent statistical analysis (e.g., averages, standard deviations, histograms, goodness of fit, etc.). Literature citation is: P. Hermanowicz, M. Sarna, K. Burda, and H. Gabry, “AtomicJ: An open source software for analysis of force curves” Rev. Sci. Instrum. 85: 063703 (2014), https://doi.org/10.1063/1.4881683
Buffer solution (PBS)	Fisher Chemical (NaCl), Sigma Aldrich (KCl), Fisher BioReagents (Na2HPO4 and KH2PO4)	S271 (>99% purity NaCl), P9541 (>99% purity KCl), BP332(>99% purity Na2HPO4), BP362 (>99% purity KH2PO4)	Phosphate buffered saline (PBS) was prepared in the laboratory as an aqueous solution consisting of 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, and 1.8 mM KH2PO4 dissolved in ultrapure water. Reagents were measured out using an analytical balance, and glassware was cleaned with soap and water followed by autoclaving immediately prior to use.
Chloroform
Diamond tip AFM probe	Bruker	PDNISP	Pre-mounted factory-calibrated cube corner diamond (E = 1140 GPa) tip AFM probe (nominal R = 40 nm) with a stainless steel cantilever (nominal k = 225 N/m, f0 = 50 kHz). Spring constant is measured at the factory (k = 256 N/m for the probe, Serial #13435414, used here) and calibration data (including AFM images of indents showing probe geometry) is provided with the probe.
Diamond ultramicrotome blade	Diatome	Ultra 35°	2.1 mm width. Also used a standard glass blade for intial rough cut of sample surface before transitioning to diamond blade for final surface preparation
Epoxy	Gorilla Glue	26853-31-6	Epoxy resin and hardner were mixed in a 1:1 ratio, a small drop was placed on a stainless steel sample puck (Ted Pella), and V1 grade muscovite mica (Ted Pella) was attached to create an atomically flat surface for preparation of phospholipid membranes.
Ethanol
LR white resin, medium grade (catalyzed)	Electron Microscopy Sciences	14381	500 mL bottle, Lot #150629
Mesenchymal stem cells (MSCs)	N/A	N/A	MSCs for nanomechanical studies were primary cells harvested from 8-10 week old male C57BL/6 mice as described in Goelzer, M. et al. "Lamin A/C Is Dispensable to Mechanical Repression of Adipogenesis" Int J Mol Sci 22: 6580 (2021) doi:10.3390/ijms22126580 and Peister, A. et al. "Adult stem cells from bone marrow (MSCs) isolated from different strains of inbred mice vary in surface epitopes, rates of proliferation, and differentiation potential" Blood 103: 1662-1668 (2004), doi:10.1182/blood-2003-09-3070.
Modulus standards	Bruker	PFQNM-SMPKIT-12M	Used HOPG (E = 18 GPa) and PS (E = 2.7 GPa). Also contains 2x PDMS (Tack 0, E = 2.5 MPa; Tack 4, E = 3.5 MPa), PS-LDPE (E = 2.0/0.2 GPa), fused silica (E = 72.9 GPa), sapphire (E - 345 GPa), and tip characterization (titanium roughness) sample. All samples come pre-mounted on a 12 mm diameter steel disc (sample puck).
Muscovite mica	Ted Pella	50-12	12 mm diameter, V1 grade muscovite mica
Nanscope Analysis	Bruker	Version 2.0	Free AFM image processing and analysis software package, but designed for, and proprietary/limited to Bruker AFMs; similar functionality is available from free, platform-independent AFM image processing and analysis software packages such as Gwyddion, WSxM, and others. Has built-in capabilities for force curve analysis, but AtomicJ is more flexible/full featured (e.g., more built-in contact mechanics models to choose from, statistical analysis of force curve fitting results, etc.) for force curve analysis and handles batch processing of force curves.
Phospholipids: POPC, Cholesterol (ovine)	Avanti Polar Lipids	POPC: CAS # 26853-31-6, Cholesterol: CAS # 57-88-5	POPC lipid dissolved in chloroform (25 mg/mL) was obtained from vendor and used without further purification. Cholesterol powder from the same vendor was dissolved in chloroform (20 mg/mL).
Probe holder (fluid, lipid bilayers)	Bruker	MTFML-V2	Specific to the particular AFM used; MTFML-V2 is a glass probe holder for scanning in fluid on a MultiMode AFM.
Probe holder (fluid, MSCs)	Bruker	FastScan Bio Z-scanner	Used with Dimension FastScan head (XY flexure scanners). Serial number MXYPOM5-1B154.
Probe holder (standard, ambient)	Bruker	DAFMCH	Specific to the particular AFM used; DAFMCH is the standard contact and tapping mode probe holder for the Dimension Icon AFM, suitable for nanoindentation (PF-QNM, FFV, and point-and-shoot ramping)
Sample Puck	Ted Pella	16218	Product number is for 15 mm diameter stainless steel sample puck. Also available in 6 mm, 10 mm, 12 mm, and 20 mm diameters at https://www.tedpella.com/AFM_html/AFM.aspx#anchor842459
Sapphire substrate	Bruker	PFQNM-SMPKIT-12M	Extremely hard surface (E = 345 GPa) for measuring deflection sensitivity of probes (want all of the deflection to come from the probe, not the substrate). Part of the PF-QNM/modulus standards kit.
Scanning electron microscope	Hitachi	S-3400N-II	Located at Boise State. Used to perform co-localized SEM/EDS on all samples except additively manufactured (AM) Ti-6Al-4V.
Silicon AFM probes (standard)	NuNano	Scout 350	Standard tapping mode silicon probe with reflective aluminum backside coating; k = 42 N/m (nominal), f0 = 350 kHz. Nominal R = 5 nm. Also available uncoated or with reflective gold backside coating. Probes with similar specifications are available from other manufacturers (e.g., Bruker TESPA-V2).
Silicon AFM probes (stiff)	Bruker	RTESPA-525, RTESPA-525-30	Rotated tip etched silicon probes with reflective aluminum backside coating; k = 200 N/m (nominal), f0 = 525 kHz. Nominal R = 8 nm for RTESPA-525, R = 30 nm for RTESPA-525-30. Spring constant of each RTESPA-525-30 is measured individually at the factory via laser Doppler vibrometry and supplied with the probe.
Silicon carbide grit paper (abrasive discs)	Allied	50-10005	120 grit
Silicon nitride AFM probes (soft, large radius hemispherical tip)	Bruker	MLCT-SPH-5UM, MLCT-SPH-5UM-DC	Also MLCT-SPH-1UM-DC. New product line of factory-calibrated (probe radius and spring constants of all cantilevers) large radius (R = 1 or 5 mm) hemispherical tip (at the end of a 23 mm long cylindrical shaft) probes. DC = drift compensation coating. 6 cantilevers/probe (A-F). Nominal spring constants: A, k = 0.07 N/m; B, k = 0.02 N/m; C, k = 0.01 N/m; D, k = 0.03 N/m; E, k = 0.1 N/m; F, k = 0.6 N/m.
Silicon nitride AFM probes (soft, medium sharp tip)	Bruker	DNP	4 cantilevers/probe (A-d). Nominal spring constants: A, k = 0.35 N/m; B, k = 0.12 N/m; C, k = 0.24 N/m; D, k = 0.06 N/m. Nominal radii of curvature, R = 10 nm.
Silicon nitride AFM probes (soft, sharp tip)	Bruker	ScanAsyst-Air	Nominal values: resonance frequency, f0 = 70 kHz; spring constant, k = 0.4 N/m; radius of curvature, R = 2 nm. Designed for force curve based AFM imaging.
Superglue	Henkel	Loctite 495	Cyanoacrylate based instant adhesive. Lots of roughly equivalent products are readily available.
Syringe pump	New Era Pump Systems	NE1000US	One channel syringe pump system with infusion and withdrawal capacity
Tip characterization standard	Bruker	PFQNM-SMPKIT-12M	Titanium (Ti) roughness standard. Part of the PF-QNM/modulus standards kit.
Ultrahigh purity nitrogen (UHP N2), 99.999%	Norco	SPG TUHPNI - T	T size compressed gas cylinder of ultrahigh purity (99.999%) nitrogen for drying samples
Ultramicrotome	Leica	EM UC6	Equipped with a glass blade (standard, for intial sample preparation) and a diamond blade (for final preparation)
Ultrapure water	Thermo Fisher	Barnstead Nanopure Model 7146	Model has been discontinued, but equivalent products are available. Produces ≥18.2 MΩ*cm ultrapure water with 1-5 ppb TOC (total organic content), per inline UV monitoring. Includes 0.2 µm particulate filter, ion exchange columns, and UV oxidation chamber.
Variable Speed Grinder	Buehler	EcoMet 3000	Used with silicon carbide grit papers during hand polishing.
Vibration isolation table (active)	Herzan	TS-140	Used with Bruker MultiMode AFM. Sits on a TMC 65-531 vibration isolation table. Bruker Dimension Icon AFM utilizes strictly passive vibration isolation (comes from manufacturer with custom acoustic hood, air table, and granite slab).
Vibration isolation table (passive)	TMC	65-531	35" x 30" vibration isolation table with optional air damping (disabled). Used with Bruker MultiMode AFM. Herzan TS-140 "Table Stable" active vibration control table is located on top.