Una microsonda di radiometria intra-tissutale per misurare la radianza in situ nel tessuto vivente

Summary

In questo articolo, viene descritto un metodo per misurare la radianza in situ nei tessuti viventi. Questo lavoro include dettagli sulla costruzione di sonde su microscala per diverse misurazioni di radianza e irradianza, fornisce una guida per il montaggio del tessuto per la caratterizzazione della radianza e delinea metodi computazionali per analizzare i dati risultanti.

Abstract

Gli organismi appaiono opachi in gran parte perché i loro strati di tessuto esterno sono fortemente dispersi alla luce incidente; I pigmenti fortemente assorbenti, come il sangue, hanno tipicamente assorbanze strette, in modo tale che il percorso libero medio della luce al di fuori dei picchi di assorbanza può essere piuttosto lungo. Poiché le persone non possono vedere attraverso i tessuti, generalmente immaginano che tessuti come il cervello, il grasso e le ossa contengano poca o nessuna luce. Tuttavia, le proteine opsina fotosensibili sono espresse all'interno di molti di questi tessuti e le loro funzioni sono poco conosciute. La luminosità interna al tessuto è anche importante per comprendere la fotosintesi. Ad esempio, le vongole giganti assorbono fortemente ma mantengono una densa popolazione di alghe in profondità nel tessuto. La propagazione della luce attraverso sistemi come sedimenti e biofilm può essere complessa e queste comunità possono contribuire in modo significativo alla produttività dell'ecosistema. Pertanto, è stato sviluppato un metodo per costruire microsonde ottiche per misurare l'irraggiamento scalare (flusso di fotoni che interseca un punto) e l'irradianza downwelling (flusso di fotoni che attraversa un piano perpendicolarmente) per comprendere meglio questi fenomeni all'interno del tessuto vivente. Questa tecnica è trattabile anche nei laboratori sul campo. Queste microsonde sono costituite da fibre ottiche estratte dal calore che vengono poi fissate in pipette di vetro tirato. Per modificare l'accettazione angolare della sonda, una sfera di dimensioni 10-100 μm di resina epossidica polimerizzabile ai raggi UV mescolata con biossido di titanio viene quindi fissata all'estremità di una fibra tirata e tagliata. La sonda viene inserita nel tessuto vivente e la sua posizione viene controllata utilizzando un micromanipolatore. Queste sonde sono in grado di misurare la radianza dei tessuti in situ a risoluzioni spaziali di 10-100 μm o sulla scala di singole cellule. Queste sonde sono state utilizzate per caratterizzare la luce che raggiunge le cellule adipose e cerebrali 4 mm sotto la pelle di un topo vivente e per caratterizzare la luce che raggiunge profondità simili all'interno del tessuto di vongole giganti ricco di alghe viventi.

Introduction

Sorprendentemente, gli animali terrestri e gli abitanti dell'oceano poco profondi hanno abbastanza luce all'interno del loro corpo per la fisiologia visiva e persino la fotosintesi. Ad esempio, i livelli di luce al centro della testa di un topo (al di fuori delle forti bande di assorbimento dell'emoglobina) sono attenuati di tre o quattro ordini di grandezza rispetto al mondo esterno. Questa è all'incirca la differenza tra i livelli di luce all'interno e all'esterno. Quindi, l'opacità di un tessuto o materiale dovuta a una forte dispersione non è la stessa dell'opacità dovuta al forte assorbimento della luce. La luce può continuare a propagarsi su lunghe distanze in un sistema fortemente diffuso in avanti, simile alla luce che si propaga attraverso sistemi acquatici con alte concentrazioni di cellule e particelle¹. Questa osservazione è particolarmente saliente alla luce del fatto che le proteine opsina sono espresse quasi ubiquitariamente in tutti i tessuti di tutti gli animali. Pertanto, è importante capire come e dove la luce viene attenuata e dispersa all'interno del tessuto vivente. Tuttavia, a differenza dei sistemi acquatici, con i tessuti viventi, è impossibile immergere uno strumento nella colonna d'acqua e ottenere misurazioni di radianza e irraggiamento, ed è necessaria una nuova tecnica.

Altri metodi precedentemente utilizzati per caratterizzare le proprietà di assorbimento e diffusione dei tessuti viventi includono la misurazione di sonde di riflettanza tissutale e / o l'integrazione di sfere^2,3, metodi microscopici come la microscopia confocale a scansione^4, la misurazione della diffusione della luce laser sulla superficie⁵ e tecniche di modellazione come il trasferimento radiativo Monte Carlo⁶. I metodi sperimentali menzionati spesso richiedono attrezzature specifiche, grandi e costose o conoscenze dettagliate sulla struttura del tessuto e sono generalmente limitati nella loro capacità di caratterizzare la struttura spaziale della luce in profondità all'interno del tessuto.

Esistono anche metodi simili basati su sonde che utilizzano un ago ipodermico per inserire una fibra ottica attraverso il tessuto ^7,8,9. Nella nostra esperienza, gli aghi modificati sono efficaci nel perforare i tessuti, ma richiedono una forza considerevole e generalmente strappano i tessuti delicati quando passano attraverso cellule densamente imballate. Pertanto, questi aghi richiedono generalmente una procedura chirurgica per inserire più di un millimetro o giù di lì in uno strato di tessuto. Il metodo qui descritto, utilizzando un supporto di vetro lubrificato e tirato, è in grado di scivolare tra le cellule con ferite minime del tessuto e senza ulteriori interventi chirurgici.

Questo manoscritto presenta un metodo ispirato al lavoro di Jorgenson e colleghi sulla misurazione della luce all'interno delle stuoie algali^10,11, utilizzando microsonde ottiche supportate da vetro ed elettronica portatile che sono suscettibili di sondare in profondità nel tessuto denso e di costruzione e uso sul campo. Queste sonde possono essere costruite per caratterizzare l'irradianza scalare (luce che colpisce un punto da tutte le direzioni) e la radianza discendente (luce che interseca un piano orizzontale) all'interno del tessuto vivente ad alte risoluzioni spaziali. Queste sonde sono state originariamente sviluppate per misurare il trasferimento radiativo all'interno del tessuto delle vongole giganti fotosimbionti¹². Le misurazioni standard di assorbimento e trasmissione del tessuto totale non erano sufficienti per caratterizzare le prestazioni fotosintetiche del tessuto, poiché fa una grande differenza se tutta la luce incidente viene assorbita da poche cellule che sperimentano un'alta intensità sulla superficie del tessuto o molte cellule che sperimentano basse intensità in tutto il volume del tessuto. In un secondo progetto, queste sonde sono state utilizzate per misurare l'irradianza in vivo all'interno del cervello di un topo^13,14, caratterizzando così l'ambiente luminoso delle opsine espresse in profondità nel cervello. Queste micro-sonde sono sia piccole che abbastanza sensibili da misurare l'irradianza all'interno del tessuto cerebrale del topo con tutta la pelliccia, la pelle e le ossa intatte e dimostrano che i livelli di luce fisiologica sono abbastanza alti da stimolare le opsine cerebrali profonde.

Questa sonda micro-ottica e la configurazione di misurazione potrebbero essere utili ai ricercatori che hanno bisogno di quantificare e caratterizzare la luce interna al tessuto biologico, in particolare per una comprensione più sfumata della fotosintesi o delle funzioni dei pigmenti visivi espressi al di fuori degli occhi. Questo metodo può essere utilizzato da solo o in combinazione con altre tecniche per caratterizzare completamente le proprietà ottiche e la propagazione della luce all'interno dei tessuti viventi a basso costo, con piccole apparecchiature portatili costruite internamente e con parametri regolabili dipendenti dal compito.

Protocol

Questo studio è conforme a tutte le normative etiche pertinenti dell'Università di Yale in materia di ricerca sugli animali vertebrati e invertebrati.

1. Costruire la microsonda ottica

1. Costruzione del manicotto di vetro, materiale: pipetta Pasteur, 5.75 in(vedi tabella dei materiali)
   1. Utilizzando una clip a coccodrillo montabile (Table of Materials), montare la pipetta di vetro dall'estremità larga in modo che l'estremità conica sia rivolta verso il basso verso il pavimento e l'orientamento della pipetta sia perpendicolare al pavimento.
   2. Appendere un'impugnatura in plastica da 50 g (Table of Materials) all'estremità affusolata della pipetta. Posizionare un tampone di nastro isolante tra la pipetta e l'impugnatura della morsa per evitare lo slittamento.
   3. Riscaldare l'estremità affusolata della pipetta utilizzando una piccola torcia a butano (Table of Materials). Applicare la fiamma 1 cm sopra l'impugnatura della morsa. Tenere la torcia in modo tale che la parte più brillante della fiamma sia a 3 cm dal vetro e il vetro sia sulla punta della fiamma. Quando la lunghezza della pipetta è aumentata di circa 5 pollici, rimuovere immediatamente la fiamma.
   4. Utilizzare piccole forbici o un tagliavetro per tagliare l'estremità tirata della pipetta nel punto in cui il nuovo diametro tirato è circa il doppio di quello della fibra ottica utilizzata nella sezione successiva (vedere punto 1.2). Limare le aree taglienti dell'estremità tagliata usando carta carborundum (tabella dei materiali). Risciacquare via eventuali piccoli frammenti di vetro o polvere risultanti utilizzando un flacone di alcol isopropilico seguito da aria compressa.
2. Tirare la fibra ottica (Figura 1D)
   1. Utilizzare una lametta per recidere la fibra ottica, rimuovendo un connettore SMA di una fibra ottica SMA con terminazione SMA di 200 μm di diametro (Table of Materials). Tagliare vicino a una delle terminazioni SMA. Quindi, utilizzare la lametta per rimuovere i successivi 5 cm di rivestimento in plastica e fibra di vetro in modo che la fibra ottica nuda sia esposta e sporga dal resto del gruppo intatto.
   2. Utilizzare la torcia a butano per bruciare il rivestimento polimerico di poliimmide dalla fibra di vetro. Risciacquare con isopropanolo. Pulire la fibra di vetro nuda con una salvietta priva di lanugine.
   3. Il passo successivo è montare la fibra nuda in modo che possa anche essere tirata con una fiamma. Montare l'estremità nuda della fibra ottica direttamente in un morsetto a pinza (Table of Materials) su un bordo di un tavolo o di uno scaffale, lasciando che l'estremità della fibra con terminazione SMA penda verso il pavimento. Aggiungere i pesi per tirare sotto forma di due piccoli morsetti (peso totale: 10 g) sull'estremità incamiciata della fibra a circa 12 pollici verso il basso da dove la fibra ottica nuda è tenuta nel morsetto della pinza.
   4. Per tirare la fibra, iniziare con la fiamma della torcia a butano. Con la fiamma accesa, tenere la torcia a butano a 1 cm dalla fibra nuda in modo che la fiamma sia perpendicolare alla fibra ottica e 3 cm verso il basso verticalmente da dove il morsetto della pinza trattiene la fibra nuda. Lasciare che la fibra si allunghi, tiri, si separi e cada sul pavimento.
   5. Esaminare l'estremità della fibra ottica tirata risultante. Carteggiare delicatamente eventuali irregolarità con carta carborundum, pulire con alcool isopropilico e una salvietta priva di lanugine e asciugare con aria compressa.
      NOTA: A questo punto, si può usare un microscopio per caratterizzare e documentare le dimensioni e la forma della fibra tirata.
   6. Utilizzare una penna opaca con pellicola per scurire i lati della fibra e impedire l'ingresso di luce diffusa (Table of Materials). Tirare delicatamente la fibra attraverso la punta della penna, lasciando scoperta solo una piccola area sulla punta.
3. Montaggio della fibra tirata all'interno del manicotto della pipetta di vetro (Figura 1A)
   1. Lavorando sotto uno stereomicroscopio, inserire con attenzione la fibra ottica conica dal punto 1.2 nell'estremità larga della pipetta di vetro alterata dal punto 1.1 e spingere la fibra attraverso fino a quando ~ 1 mm di fibra nuda sporge dall'estremità conica della pipetta.
   2. Utilizzando del nastro isolante, fissare l'estremità rivestita della fibra ottica all'estremità larga della pipetta.
   3. Mettere una goccia di adesivo cianoacrilato su un ago di piccolo calibro (Tabella dei materiali). Toccare con attenzione la goccia di adesivo sul bordo tagliato della pipetta tirata, evitando l'estremità nuda della fibra tirata.
   4. Lasciare agire capillarmente per assorbire l'adesivo nella pipetta, bagnando l'area tra la parete della pipetta e la fibra ottica. Lasciare indurire l'adesivo per almeno 15 minuti prima di spostare il gruppo sonda.
4. Modifica della punta della fibra con una sfera di diffusione (Figura 1C)
   1. Creare la materia prima per la punta della sfera di dispersione mescolando una goccia di adesivo polimerizzabile UV con polvere di biossido di titanio (Table of Materials) a ~ 1: 1 v / v.
   2. Collegare la sonda a un micromanipolatore con un supporto per aste di montaggio (Tabella dei materiali) in modo che la sonda abbia un orientamento orizzontale. Preparare un serbatoio funzionante del materiale di dispersione immergendo la punta di un filo o di un ago nella miscela adesiva/TiO₂ preparata sopra in modo tale che si formi una goccia di adesivo. Montare il filo o l'ago con la goccia vicino alla punta della sonda orizzontale. È conveniente farlo usando una clip a coccodrillo montata sulla panca.
   3. Depositare una sfera di dispersione sulla punta della sonda. Utilizzare il micromanipolatore per spingere lentamente e con attenzione la punta della fibra ottica della sonda nella goccia di adesivo/TiO₂. Quindi, ritirare rapidamente la punta dalla colla. Ripetere due o tre volte fino a quando una goccia sferica di adesivo della dimensione desiderata si deposita sulla punta della fibra ottica.
      NOTA: La sfera di diffusione sarà stabile a diametri da due a otto volte superiori al diametro della fibra ottica conica. La dimensione finale ottimale dipende dall'applicazione finale desiderata.
   4. Polimerizzare la sfera collegando l'estremità SMA della fibra ottica a una sorgente di luce UV accoppiata in fibra (Table of Materials).
      NOTA: La sorgente luminosa utilizzata in questo studio aveva una potenza di 5,3 mW. A questa potenza, il tempo di cura raccomandato è di almeno 12 ore o durante la notte. Dopo la polimerizzazione è un buon momento per caratterizzare e misurare le dimensioni della punta finale della sonda ottica.

2. Preparazione e montaggio del tessuto per le misurazioni ottiche (Figura 2 e Figura 3)

1. Preparare i piatti per montare i campioni per un esperimento. Riscaldare l'estremità grande di una pipetta Pasteur usando una torcia a butano per fare un punzone per fondere un foro di 0,5 cm di diametro sul fondo di una capsula di Petri di plastica da 35 mm x 10 mm. Sigillare il foro sul lato inferiore del piatto con nastro isolante o nastro da laboratorio. Realizzane diversi alla volta per l'efficienza.
2. Preparare la gelatina liquida (tabella dei materiali) secondo le istruzioni sulla confezione.
   NOTA: la gelatina insapore alimentare commerciale dal negozio di alimentari è migliore per questo scopo rispetto alla gelatina di grado chimico dei fornitori chimici perché la gelatina di grado chimico è meno otticamente chiara e meno meccanicamente affidabile del prodotto alimentare.
3. Eseguire la dissezione e la preparazione del tessuto che verrà utilizzato.
   NOTA: Per esperienza, qualsiasi tessuto piatto fino a 1 cm di spessore può essere misurato con successo in questo esperimento utilizzando qualsiasi tecnica di dissezione appropriata per il sistema di interesse. Per il tessuto di vongole giganti, è stato utilizzato un punzone bioptico di 8 mm per creare un cerchio piatto e regolare di tessuto di vongole da utilizzare nell'esperimento¹². Per questo sistema, è stato possibile preparare efficacemente un campione alla volta, dato il tempo necessario per completare una misurazione per garantire che il campione fosse ancora in condizioni realistiche alla fine dell'esperimento.
4. Riempire due piastre di Petri dal punto 2.1 un quarto del percorso con la gelatina liquida e lasciare raffreddare a temperatura ambiente (RT) poco prima della gelificazione. In un piatto, posizionare la biopsia nel cuscino di gelatina viscosa che si forma nel foro sul fondo del piatto. Utilizzare una pipetta Pasteur per aggiungere delicatamente gelatina RT intorno alla biopsia fino a quando la capsula di Petri è piena (Figura 3). Riempire il secondo piatto con gelatina per fare un campione bianco.
5. Mettere i piatti campione in frigorifero per circa 10-30 minuti fino a quando la gelatina è completamente polimerizzata e leggermente elastica al tatto.
   NOTA: In una stanza fresca, questo potrebbe non essere necessario; Quando si lavora ai tropici, questo passaggio è necessario per curare completamente la gelatina.
6. Realizzazione di un supporto per la capsula di Petri sul micromanipolatore (Figura 2)
   1. Tagliare un quadrato di 6 cm x 6 cm di 1/4 in plexiglass spesso (Tabella dei materiali).
   2. Praticare o fondere un foro nel quadrato di plastica dello stesso diametro della capsula di Petri (~35 mm). Assicurarsi che la piastra di Petri si adatti perfettamente a questo foro e sia tenuta in posizione con attrito. Aggiungere del nastro ai bordi del piatto per aumentare leggermente le dimensioni e il contatto di attrito.
   3. Forare o fondere un foro di 1/4 di diametro nell'angolo del quadrato di plastica. Utilizzare questo foro per fissare il quadrato al micromanipolatore utilizzando una vite e un bullone da 1/4 di pollice.
   4. Coprire il quadrato di plastica con nastro adesivo nero per ridurre la luce diffusa che raggiunge la sonda. Allo stesso modo, utilizzare del nastro adesivo per creare una gonna attorno ai lati del quadrato che si estende sotto il fondo del piatto inserito (>10 mm) per ridurre la luce diffusa (Figura 2B).
   5. Utilizzare un bullone e un hardware appropriato per collegare il supporto della piastra di Petri a un micromanipolatore che consenta regolazioni tridimensionali e movimenti verticali ben risolti su un'estensione superiore allo spessore dei campioni (la parte 1 e la parte 2 del manipolatore menzionato nella tabella dei materiali sono buoni esempi). Fissare questo micromanipolatore su una breadboard ottica.

3. Impostazione della misurazione per biopsie tissutali

1. Montare una sorgente luminosa sopra l'area in cui avviene la misurazione in modo tale che la luce sia collimata quando raggiunge il piano in cui verrà collocato il campione (Figura 2A). Ad esempio, attaccare una lente collimante di 5 cm (Table of Materials) a una guida di luce liquida di 5 mm (Table of Materials) e sollevare sopra il campione di >0,6 m usando una morsa e una cornice attaccate a una breadboard ottica (Table of Materials). Quindi, collegare la guida luminosa a una sorgente luminosa a banda larga, ad esempio la sorgente luminosa al plasma elencata nella tabella dei materiali.
2. Collegare la sonda a un supporto orientato verticalmente in modo che punti verso la sorgente luminosa. Fissare la sonda con morsetti, morsetti per tubi flessibili o nastro adesivo a un montante ottico del tavolo.
   NOTA: Nell'esperimento delle vongole giganti, viene utilizzato un portacanne appositamente progettato, come il micromanipolatore elencato nella tabella dei materiali. In questo lavoro, è stato fissato da magneti a una breadboard ottica (Table of Materials). I gradi aggiuntivi di libertà per l'allineamento ottenuti avendo sia la sonda che il campione sui manipolatori sono convenienti ma non richiesti. Fare attenzione a non bloccare eccessivamente il palo, poiché ciò potrebbe rompere l'alloggiamento della pipetta.
3. Posizionare il manipolatore di campioni vicino alla sonda montata verticalmente. Utilizzare il manipolatore del campione per regolare la posizione dello stadio del campione in modo che la sonda sia centrata nell'apertura di 0,5 cm nella parte inferiore della capsula di Petri. Prestare estrema attenzione per evitare di toccare o urtare la punta della sonda montata.
   NOTA: può essere utile uno stereomicroscopio montato su braccio posizionato sopra l'area del campione. In questo modo, l'allineamento dall'alto verso il basso della punta della sonda, dello stadio e del campione può essere visualizzato prima di iniziare un esperimento (Figura 2A).
4. Collegare l'estremità SMA della fibra ottica della sonda a uno spettrometro a fibra ottica USB (Table of Materials) e collegare lo spettrometro al computer utilizzando un cavo USB.

4. Raccolta dei dati

1. Configurazione sperimentale
   1. Avere la sonda e i manipolatori nella posizione esattamente allineata in cui verranno raccolti i dati, come nel passaggio 3.4.
   2. Utilizzare un batuffolo di cotone o un ago di spessore fine per applicare con attenzione una piccola quantità di lubrificante siliconico (Table of Materials) alla parte della sonda che verrà inserita nel tessuto per ridurre l'attrito tra i lati della sonda e il campione di tessuto. Riapplicare il lubrificante siliconico prima di ogni misurazione di base o tessuto.
   3. Rimuovere il nastro che copre il foro nella capsula di Petri del campione bianco e posizionarlo nel supporto del campione (punto 2.7), assicurandosi che sia tenuto saldamente in posizione per attrito.
   4. Utilizzare il micromanipolatore per abbassare il campione sulla sonda. Lasciare che la sonda entri nella gelatina attraverso il foro sul lato inferiore della capsula di Petri. Continuare fino a quando la sonda si trova a circa 5 mm dal fondo dello strato di gelatina.
   5. Accendere la sorgente luminosa. Utilizzando il software dello spettrometro, regolare il tempo di integrazione dello spettrometro fino a quando il segnale è il più alto possibile ma non satura. Imposta il numero di scansioni medie tra due e cinque e il valore dei pixel di arrotondamento su sei. I tempi di integrazione utilizzabili in questa fase possono variare tra 1 e 50 ms per questa linea di base.
2. Raccolta degli spettri di riferimento
   1. Raccogli una misura scura.
      1. Una volta impostati i parametri dello spettrometro con il campione bianco, staccare la fibra della sonda dallo spettrometro e coprire la porta con il coperchio metallico opaco fornito con lo spettrometro.
      2. Ottenere una misurazione del buio dallo spettrometro (spesso usando l'icona della lampadina scura nella GUI) per caratterizzare il rumore dello spettrometro senza luce di ingresso. Salvare questa misurazione in base alla strategia di acquisizione dati.
   2. Raccogli una misura della lampada. Ricollegare la fibra della sonda allo spettrometro, attendere che il segnale si stabilizzi e acquisire un altro spettro. Questa misurazione caratterizza la luce che raggiunge la sonda attraverso la gelatina in assenza di tessuto.
3. Raccolta degli spettri tissutali
   1. Rimuovere il nastro sul fondo della capsula di Petri del campione e posizionarlo nel supporto del campione.
   2. Allineare il piatto campione con la sonda utilizzando la manipolazione tridimensionale in modo che la biopsia tissutale sia centrata sopra la punta della sonda.
   3. Applicare gel di silicone sulla sonda (vedere 4.1.2) e abbassare lentamente il campione sulla sonda fino a quando la punta della sonda non ha attraversato la gelatina che sostiene il campione di tessuto ed è appena entrata nel campione di tessuto.
      NOTA: Alcuni spettrometri e programmi per computer consentono il monitoraggio in tempo reale della luce rilevata. Utilizzare questo per determinare quando la sonda entra nel tessuto. L'intensità dello spettro diminuirà bruscamente non appena la punta della sonda è in contatto diretto con il tessuto.
   4. Verificare che il tempo di integrazione sia appropriato per la misurazione assicurandosi che lo spettro misurato non sia né troppo rumoroso né saturo. Modificare il tempo di integrazione, se necessario.
      1. Ogni volta che il tempo di integrazione viene regolato, eseguire e memorizzare una nuova misurazione del buio (passo 4.2.1). Non modificate il numero di scansioni medie o il numero di pixel arrotondati.
      2. Dopo aver trovato i parametri di misurazione adatti, prendere le misure e salvare lo spettro.
   5. Spostare il campione verso il basso di una distanza specificata utilizzando il micromanipolatore. Per il manipolatore utilizzato per questo studio, ogni piccolo segno di zecca era di 0,001 pollici o 25,4 μm. Il campione è stato spostato verso il basso attraverso cinque segni di tick, o 127 μm, per ogni misurazione. Ripetere il passaggio 4.3.4.
   6. Continuare a salvare gli spettri in ogni posizione verticale all'interno del tessuto.
      NOTA: Per il sistema qui descritto, i tempi di integrazione richiesti variavano da 1 ms a 5 s per le misurazioni all'interno di un singolo campione di tessuto. Alla fine, la punta della sonda uscirà dalla parte superiore del tessuto e sarà visibile lì (Figura 4A). Questa è la misurazione finale e caratterizza la luce incidente nella parte superiore del tessuto.
4. Caricamento ed elaborazione dei dati
   1. Utilizzare il software dello spettrometro per convertire tutti gli spettri raccolti (spettri scuri, spettri di lampada e misurazioni dei tessuti) in file di testo delimitati.
   2. Utilizzando Matlab o un linguaggio di codifica preferito, caricare tutti i file di misurazione per un campione. Per ogni spettro di misurazione del tessuto, sottrarre lo spettro scuro con il tempo di integrazione corrispondente, quindi dividerlo per il tempo di integrazione.
      NOTA: In questo studio, è stato utilizzato uno script Matlab per caricare ed elaborare i dati (file supplementare 1).
   3. Calcolare la percentuale di luce incidente che raggiunge ogni posizione nel tessuto dividendo gli spettri ottenuti con la sonda all'interno del tessuto per lo spettro basale ottenuto nella gelatina vuota.
      NOTA: La misurazione nella parte superiore del tessuto (fase 4.3.6) dovrebbe essere molto simile alla misurazione basale in gelatina (fase 4.1) e, quando divisa, dovrebbe essere vicina al 100%. A seconda del contesto sperimentale, lo spettro della lampada (lo spettro della gelatina vuota o quello della parte superiore del tessuto) può essere utilizzato come riferimento. Tuttavia, è ancora importante raccogliere uno spettro di lampade prima di iniziare l'esperimento. Questo perché, se la sonda si rompe o l'esperimento fallisce prima di raggiungere la parte superiore del tessuto, i dati ottenuti prima del fallimento sono ancora utilizzabili, il che non è il caso se non esiste uno spettro di riferimento iniziale della lampada corrispondente.
   4. Visualizzare i dati; i grafici di contorno possono essere utili (Figura 4B).

Representative Results

Questo protocollo descrive la procedura per la costruzione di una sonda micro-ottica che può essere utilizzata per misurare l'irradianza downwelling (la luce che raggiunge un punto da una direzione) o, con l'aggiunta di una punta sferica a diffusione di luce, per misurare l'irradianza scalare (la luce che raggiunge un punto da tutte le direzioni). Queste sonde possono misurare l'irradianza a risoluzioni spaziali che si avvicinano alle scale di lunghezza delle singole cellule all'interno del tessuto vivente. Questo protocollo descrive anche un metodo rappresentativo per preparare un campione di tessuto per le misurazioni dell'irradianza utilizzando la sonda descritta e un metodo rappresentativo per la visualizzazione e l'analisi dei dati.

La figura 1 mostra l'output della produzione di microsonde. Una volta tirata, la fibra ottica dovrebbe assottigliarsi per circa 3 cm e non presentare graffi lungo la conicità. Dovrebbe anche essere piatto all'estremità e avere un diametro di 15-30 μm (Figura 1D). La planarità della punta può essere migliorata levigando l'estremità con carta carborundum o incidendo e rompendo di nuovo. Allo stesso modo, la pipetta di vetro tirata utilizzata come alloggiamento della fibra non dovrebbe avere bordi taglienti o rotti. Quando la sfera di dispersione si forma all'estremità della punta piatta e tagliata della fibra, dovrebbe essere sferica (Figura 1C). Prima di polimerizzare, quelli deformi possono essere rimossi con un altro giro di inserimento della palla nella goccia adesiva genitore e rapidamente estraendo la fibra. Una rapida velocità di movimento tirerà la palla di colla dall'estremità della fibra. Movimenti più lenti si traducono in un ulteriore adesivo sulla fibra. Osservare il processo utilizzando un microscopio da dissezione mentre la fibra è collegata a una fonte di luce è utile per visualizzare il lavoro e determinare se il processo sta funzionando. È importante fissare la fibra all'interno della pipetta di vetro con colla e nastro isolante prima di applicare l'adesivo di dispersione; in caso contrario, la fibra potrebbe rompersi o l'adesivo potrebbe spalmarsi con la fibra in movimento (Figura 1).

La figura 2 mostra l'apparato di misura. In questo esempio, i supporti sia per il campione di tessuto che per la sonda hanno capacità di regolazione in tre dimensioni (Figura 2). Attaccare sia il campione che la sonda ai manipolatori aiuta con l'allineamento ma non è essenziale; La sonda potrebbe essere attaccata a un palo fisso. I movimenti più risolti dei manipolatori devono essere orientati nella direzione verticale z in modo che la posizione nel tessuto e/o la quantità di movimenti delle sonde possano essere determinate con precisione (Figura 2A). Uno stereomicroscopio montato su braccio può essere utile se posizionato in modo tale da poter visualizzare lo stadio, la sonda e il campione attraverso l'oculare per verificare l'allineamento della sonda con il palco, il piatto e il campione (Figura 2B). Osservare gli spettri in tempo reale mentre si abbassa il campione sulla sonda è utile perché se lo spettro misurato dalla sonda cambia improvvisamente, ciò suggerisce che il campione è localizzato con successo all'interno del tessuto altamente disperso o assorbente o che la sonda si sta piegando o rompendo. Cambiamenti bruschi nella forma e nell'intensità dello spettro molto probabilmente indicano l'ingresso del tessuto, mentre bruschi cambiamenti di intensità senza un cambiamento di forma suggeriscono che la sonda si sta piegando o rompendo. Nella parte superiore del tessuto delle vongole, c'è una sottile membrana trasparente che la sonda non può penetrare senza rompersi. In un caso come questo, la parte superiore del tessuto dovrebbe essere monitorata per vedere quando la sonda sta per uscire e le misurazioni dovrebbero essere fermate in quel punto in modo che la sonda non si rompa.

La Figura 3 mostra il campione di biopsia tissutale incorporato in una capsula di Petri di gelatina, come descritto nella sezione 2. C'è un foro nella parte inferiore della piastra di Petri per consentire l'inserimento della sonda ottica nel tessuto da sotto. La biopsia ha un diametro di 8 mm ed è centrata sul foro nella capsula di Petri (Figura 3A). C'è una piccola quantità di gelatina sotto il campione di tessuto e la gelatina viene riempita nella parte superiore del piatto sopra il tessuto (Figura 3B).

La Figura 4A mostra la sonda mentre inizia ad uscire dalla parte superiore del tessuto e la Figura 4B mostra i dati rappresentativi. È stato utilizzato uno script Matlab (file supplementare 2) per generare le tracce nella Figura 4B. L'asse x è la lunghezza d'onda e l'asse y è la percentuale di luce alla profondità di un tessuto rispetto allo spettro di base. Le singole misurazioni per la profondità del tessuto sono indicate dalle linee con colorazione in scala di grigi. Le misurazioni effettuate più in profondità nel tessuto sono rappresentate da una linea più scura. Lo spettro di base è la misurazione in un campione di sola gelatina e viene utilizzato per caratterizzare la risposta della lampada e della sonda alla lampada. La gelatina ha un leggero assorbimento e diffusione, il che significa che il segnale per l'assorbimento della gelatina rispetto alla lunghezza d'onda non è completamente piatto. Pertanto, gli spettri presi in tutto il tessuto sono divisi per lo spettro della sonda nella gelatina o per lo spettro della sonda nella parte superiore del tessuto, in modo che i dati spettrali mostrati nella figura 4B rappresentino la percentuale di luce solo per il campione di tessuto e siano, quindi, indipendenti dalla sorgente luminosa, la gelatina e le specifiche di ogni singola sonda.

Figura 1: Fasi di fabbricazione della sonda micro-ottica intra-tessuto . (A) Uno schema della sonda ottica. (B) Una vista della sonda ottica finita. (C) Un primo piano della sfera di diffusione attaccata alla fibra ottica tirata all'interno del supporto del pipet di vetro. (D) La fibra ottica tirata e pulita. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Immagini e diagrammi della configurazione sperimentale per misurare l'irraggiamento scalare all'interno del tessuto . (A) Uno schema generale e un'immagine della configurazione sperimentale. (B) Un primo piano del portapiastre di Petri del campione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Biopsia del tessuto delle vongole. (A) Vista superiore e (B) laterale di una biopsia di tessuto di vongole pronta per essere misurata nella capsula di Petri alterata piena di gelatina. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Dati rappresentativi . (A) Immagine al microscopio di come appare la sonda quando sale attraverso il tessuto. (B) Dati rappresentativi ottenuti con la sonda di radiometria intratissutale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

File supplementare 1: script Matlab utilizzato per caricare ed elaborare i dati. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 2: script Matlab utilizzato per generare le tracce nella Figura 4B. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

Questo protocollo descrive una tecnica per caratterizzare sistematicamente l'ambiente ottico attraverso un grande volume di tessuto vivente con una risoluzione spaziale approssimativamente sulla scala delle singole cellule. Questo metodo economico, flessibile e trattabile sul campo potrebbe essere utile a tutti i ricercatori che studiano la propagazione della luce all'interno dei sistemi viventi. Per esperienza, rispetto ai metodi esistenti⁷, queste sonde richiedono un po 'più di pratica e abilità per costruire, ma si traducono in meno danni ai tessuti e la capacità di caratterizzare in modo più completo volumi più grandi di tessuto denso.

Questo metodo comprende quattro parti. La prima parte, la costruzione della sonda, è stata ispirata dai precedenti progetti di dispositivi^10,11. L'approccio attuale è stato sviluppato per scansioni sistematiche e meno distruttive dell'intero tessuto spesso, poiché l'ago di vetro tirato può scivolare delicatamente tra le cellule. È anche suscettibile per l'uso in un laboratorio di campo^12,13,14. Questo protocollo produce sonde con punte di diametro ~ 20 μm per misurare la radianza di downwelling e una sfera di diffusione opzionale di 50-100 μm di diametro per misurare l'irradianza scalare. Sfere di irradianza scalare più grandi o più piccole potrebbero essere sviluppate modificando i materiali utilizzati, ad esempio un adesivo polimerizzabile UV con una diversa viscosità iniziale. Il peso sia nella tirata della pipetta che nel processo della fibra può essere regolato per ottenere una maggiore o minore conicità. La velocità di riscaldamento può anche essere modificata attraverso la distanza dalla fiamma della torcia per regolare il processo di trazione e la concità risultante.

La tecnica di costruzione della sonda richiede alcune abilità manuali e tentativi ed errori per perfezionarsi, ma può diventare affidabile e veloce con la pratica. Qui vengono presentate alcune sfumature di risoluzione dei problemi sviluppate nel tempo. Tirando giù la fibra ottica dall'estremità rivestita si ottiene una conicità più coerente. È importante applicare la penna opaca prima di aggiungere la punta di diffusione sferica, poiché le proprietà bagnanti dell'inchiostro opaco influenzano favorevolmente la formazione di una sfera ordinata di adesivo sulla punta della fibra. Se la sfera adesiva risultante è deformata, è possibile estrarla e riprovare. Per fare ciò, il micromanipolatore può essere utilizzato per far scorrere l'intera sfera nel serbatoio dell'adesivo e quindi ritirata molto lentamente. Questo di solito tira fuori il primo tentativo deforme, lasciandolo nel serbatoio dell'adesivo e rendendo possibile riprovare.

Trattate con cura, queste sonde possono essere utilizzate ripetutamente per diversi campioni. Il pericolo più grande è quello di colpire accidentalmente la punta della sonda in qualcosa mentre la si sposta. Tra una misurazione e l'altra, devono essere puliti dai detriti cellulari utilizzando alcol isopropilico e aria compressa. Le sonde possono anche essere conservate per settimane purché la punta della sonda non tocchi nulla e non ci siano forze sul gruppo in fibra ottica che potrebbero separare il nastro e incollare tenendo la sonda all'interno del manicotto di vetro. Ciò può essere ottenuto bloccando la pipetta in fibra e vetro in diversi punti sul bordo di uno scaffale alto.

La seconda e la terza parte di questo metodo riguardano gli aspetti meccano-ottici dell'esperimento e la messa in sicurezza del tessuto per la misurazione. Questa parte del metodo è stata sviluppata specificamente per misurare l'irradianza scalare intra-tissutale all'interno del tessuto di vongole giganti¹². Qui vengono presentati i dettagli per la risoluzione di questi aspetti del metodo. In primo luogo, la biopsia dovrebbe essere grande rispetto alla sonda. Ciò impedisce alla sonda di spostare il tessuto mentre transita. Inoltre, il tessuto dovrebbe sedersi sul fondo della piastra di Petri in modo che l'elasticità e il peso della gelatina si combinino per mantenere il tessuto in posizione durante la misurazione. È anche importante che la stanza sia abbastanza fredda da mantenere la gelatina in uno stato elastico e solido sotto la fonte di luce sperimentale. Allo stesso modo, aiuta a utilizzare un LED o un'altra sorgente con relativamente poca generazione di calore rispetto alla luce visibile.

I parametri geometrici e optomeccanici del metodo sono molto flessibili. Ad esempio, la sonda di irradianza scalare è stata utilizzata per misurare l'irradianza all'interno del cervello e del tessuto adiposo di un topo intatto^13,14. Per fare ciò, la sonda è stata montata sui manipolatori su un telaio stereotassico standard per roditori e la sorgente luminosa è stata montata puntando verso la tribuna del topo. In qualsiasi geometria, la chiave per l'uso di successo di questo metodo è raccogliere sempre spettri di riferimento appropriati per lampade e scuri all'inizio di ogni misurazione. Se una sonda si rompe durante una misurazione tissutale e non c'è una caratterizzazione iniziale senza il tessuto in atto, i dati saranno difficili o impossibili da interpretare e sarà necessario ricominciare da capo con una nuova sonda. Al contrario, con riferimenti appropriati all'inizio, le misurazioni parziali sono dati utilizzabili.

L'ultima parte di questo metodo riguarda l'acquisizione dei dati. Viene descritto l'uso di uno spettrometro a fibre ottiche per il monitoraggio dei segnali dalla sonda, che garantisce la facilità di accoppiamento SMA e fornisce informazioni sulla lunghezza d'onda spettrale. Tuttavia, per sistemi con flusso di fotoni inferiore, è anche possibile accoppiare queste sonde a tubi fotomoltiplicatori o fotodiodi a valanga. In ogni caso, tutti i rivelatori richiedono misure di riferimento per ogni nuova misurazione. Pertanto, con solo lievi aggiustamenti ai metodi di raccolta dei dati descritti, è possibile caratterizzare tutti i diversi tipi di parametri ottici.

I futuri usi interessanti di questo metodo potrebbero essere la quantificazione della luce in profondità all'interno dei corpi di mammiferi più grandi e all'interno di piante con complesse proprietà di trasferimento radiativo, come le piante grasse.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1" travel ball bearing center+D11+A2:D31+A2:A2:D31	Edmond Optics	37-935	Part 2 of manipulator for lowering sample
1/4" thick acrylic sheet	McMaster-Carr	8505K754	For making Petri dish holder
3/4" mini spring clamp	Anvil	99693	Use as weight for pulling optical fiber
8 mm biopsy punch	Fisher Scientific	NC9324386	For tissue sample
Butane Torch	McMaster-Carr	MT-51	Heat source for pulling fiber and pipette
Collimating lens	Thorlabs	LLG5A1-A	To collimate light source through liquid light guide
Compressed air	McMaster-Carr	7437K35	For drying pulled fiber and pipette
Cyanoacrylate glue - liquid	McMaster-Carr	66635A31	For securing tapered fiber end at top of pulled pipette
Electrical tape	McMaster-Carr	76455A21	For securing fiber in pipette and for adding grip to clamps
Fine grade carborundum paper	McMaster-Carr	4649A24	Small triangle on exacto knife holder works well
Gelatin	Knox	10043000048679	For securing the tissue biopsy in the petri dish
Glass Pasteur Pipete	Fisher Scientific	13-678-20B	Disposable glass pipette 5.75" in length
Insulin syringes, 31G needle	BD	320440	For applying glue
Isopropanol	McMaster-Carr	54845T42	For cleaning pulled fiber and pipette
Kimwipe	Cole-Parmer	SKU 33670-04	For wiping optical fiber and glass pipette clean
LED driver	Thorlabs	LEDD1B	For powering the UV LEDs
Light source for measurements	Cole-Parmer	UX-78905-05	Low heat white light source for measurements
Linear metric X-Y-Z axis rack and pinion stage	Edmond Optics	55-023	Part 1 of manipulator for lowering sample
Liquid light guide	Thorlabs	LLG5-4T	For light source in measurements
Magnetic feet	Siskiyou	MGB 8-32	For use with magnetic strips
Magnetic strips	Siskiyou	MS-6.0	For mounting magnetically to breadboard
Manipulator #1	Siskiyou	MX10R	4-axis manipulator with pipette holder
Opaquer pen, small	WindowTint	TOP01	For opaquing side of optical fiber to prevent stray light from enter probe
Optical breadboard	Edmond Optics	03-640	For stable affixation of probe holder, sample, microscope and light source
Optical fibers	Ocean Optics	P-100-2-UV-VIS	About 4 fibers are good to have
Plasma light source	Thorlabs	HPLS345	For tissue radiometry measurements
Plastic plier clamp	McMaster-Carr	5070A11	Plier clamp used for weight in pulling pipette
Polystyrene Petri dishes	Thomas scientific	3488N10	Sample holders, enough volume to hold sample thickness plus ~10 mm of gelatin on top
Razor blades	McMaster-Carr	3962A3	For stripping jacketing from optical fiber
Silicone oil lubricant	Thomas scientific	1232E30	For reducing friction between probe and tissue
Software for analyzing data	Matlab		Chosen software for data analysis
Spectrometer + spectrometer software	Avantes	AvaSpec-2048L	Spectrometer can be any brand, this one is compatible with sma-terminated optical fibers and comes with its own software for running the spectrometer
Titanium dioxide powder	Sigma Aldrich	718467-100G	For making scattering sphere
Toolour tabletop clip	Toolour	Toolour0004	For holding pipette while pulling and for holding finished probes
Trigger-action bar clamps	mcMaster-Carr	51755A2	Good for holding optical fibers while pulling or curing
UV curable adhesive	Delo Photobond	GB368	For making scattering sphere
UV light source	Thorlabs	M365FP1	Light source for curing adhesive in scattering ball, this one is sma-fiber compatible, higher intensity = less cure time
White LED light source	Thorlabs	MCWHF2	For characterizing pulled fiber and scattering sphere