En mikrosond inom vävnadsradiometri för mätning av strålning in situ i levande vävnad

Summary

I denna uppsats beskrivs en metod för att mäta utstrålning in situ i levande vävnad. Detta arbete innehåller detaljer om konstruktion av mikroskaliga sonder för olika mätningar av strålning och irradians, ger vägledning för montering av vävnad för karakterisering av utstrålning och skisserar beräkningsmetoder för att analysera resulterande data.

Abstract

Organismer verkar ogenomskinliga till stor del på grund av att deras yttre vävnadsskikt sprider sig starkt till infallande ljus; Starkt absorberande pigment, såsom blod, har vanligtvis smala absorbanser, så att den genomsnittliga fria vägen för ljus utanför absorbanstopparna kan vara ganska lång. Eftersom människor inte kan se genom vävnad, föreställer de sig i allmänhet att vävnader som hjärnan, fett och ben innehåller lite eller inget ljus. Emellertid uttrycks fotoresponsiva opsinproteiner i många av dessa vävnader, och deras funktioner är dåligt förstådda. Utstrålning internt i vävnad är också viktigt för att förstå fotosyntes. Till exempel absorberar jättemusslor starkt men upprätthåller en tät population av alger djupt i vävnaden. Ljusutbredning genom system som sediment och biofilmer kan vara komplex, och dessa samhällen kan vara viktiga bidragsgivare till ekosystemets produktivitet. Därför har en metod för att konstruera optiska mikroprober för mätning av skalär irradians (fotonflöde som skär en punkt) och nedvällningsirradians (fotonflöde som passerar ett plan vinkelrätt) för att bättre förstå dessa fenomen inuti levande vävnad utvecklats. Denna teknik är också dragbar i fältlaboratorier. Dessa mikroprober är gjorda av värmedragna optiska fibrer som sedan säkras i dragna glaspipetter. För att ändra sondens vinkelacceptans säkras sedan en 10-100 μm stor sfär av UV-härdbar epoxi blandad med titandioxid till änden av en dragen, trimmad fiber. Sonden sätts in i levande vävnad, och dess position styrs med hjälp av en mikromanipulator. Dessa sonder kan mäta in situ-vävnadsstrålning vid rumsliga upplösningar på 10-100 μm eller på skalan av enskilda celler. Dessa sonder användes för att karakterisera ljuset som når fett- och hjärncellerna 4 mm under huden på en levande mus och för att karakterisera ljuset som når liknande djup i levande algrik jättemusselvävnad.

Introduction

Överraskande har landdjur och grunda havsboende tillräckligt med ljus i kroppen för visuell fysiologi och till och med fotosyntes. Till exempel dämpas ljusnivåerna i mitten av musens huvud (utanför de starka hemoglobinabsorbansbanden) med tre eller fyra storleksordningar i förhållande till omvärlden. Detta är ungefär skillnaden mellan ljusnivåerna inomhus och utomhus. Så, opaciteten hos en vävnad eller ett material på grund av stark spridning är inte detsamma som opacitet på grund av stark ljusabsorption. Ljus kan fortsätta att fortplanta sig över långa avstånd i ett starkt framåtriktat spridningssystem, liknande ljus som förökar sig genom akvatiska system med höga koncentrationer av celler och partiklar¹. Denna observation är särskilt framträdande mot bakgrund av det faktum att opsinproteiner uttrycks nästan allestädes närvarande i alla vävnader hos alla djur. Därför är det viktigt att förstå hur och var ljuset dämpas och sprids i levande vävnad. Men till skillnad från akvatiska system, med levande vävnad, är det omöjligt att fördjupa ett instrument i vattenspelaren och få strålnings- och strålningsmätningar, och en ny teknik är nödvändig.

Andra metoder som tidigare använts för att karakterisera absorptions- och spridningsegenskaperna hos levande vävnad inkluderar mätning av vävnadsreflektanssonder och/eller integrering av sfärer^2,3, mikroskopiska metoder såsom svepkonfokalmikroskopi^4, mätning av diffusion av laserljus på ytan⁵ och modelleringstekniker såsom Monte Carlo strålningsöverföring⁶. De experimentella metoder som nämns kräver ofta specifik, stor och dyr utrustning eller detaljerad kunskap om vävnadsstruktur och är i allmänhet begränsade i sin förmåga att karakterisera den rumsliga strukturen av ljus djupt inne i vävnaden.

Det finns också liknande sondbaserade metoder som använder en hypodermisk nål för att sätta in en optisk fiber genom vävnad ^7,8,9. Enligt vår erfarenhet är modifierade nålar effektiva vid punktering av vävnad men kräver avsevärd kraft och i allmänhet riva känsliga vävnader när de passerar genom tätt packade celler. Därför kräver dessa nålar i allmänhet ett kirurgiskt ingrepp för att sätta in mer än en millimeter eller så i ett vävnadsskikt. Metoden som beskrivs här, med användning av ett smurt, draget glasstöd, kan glida mellan celler med minimal sårning av vävnaden och utan ytterligare operation.

Detta manuskript presenterar en metod inspirerad av Jorgensons och kollegors arbete med att mäta ljus i algmattor^10,11, med hjälp av glasstödda optiska mikrosonder och bärbar elektronik som är mottagliga för att undersöka djupt in i tät vävnad och för konstruktion och användning i fält. Dessa sonder kan konstrueras för att karakterisera skalär irradians (ljus som träffar en punkt från alla håll) och nedvällande strålning (ljus som skär ett horisontellt plan) inuti levande vävnad vid höga rumsliga upplösningar. Dessa sonder utvecklades ursprungligen för att mäta strålningsöverföring i vävnaden hos fotosymbiotiska jättemusslor¹². Standardmätningar av absorption och överföring av den totala vävnaden var inte tillräckliga för att karakterisera vävnadens fotosyntetiska prestanda, eftersom det gör stor skillnad om allt infallande ljus absorberas av några celler som upplever hög intensitet vid vävnadens yta eller många celler som upplever låga intensiteter i hela vävnadens volym. I ett andra projekt användes dessa sonder för att mäta in vivo-instrålning i en mus hjärna^13,14 och karakteriserade därmed ljusmiljön för opsiner som uttrycks djupt inne i hjärnan. Dessa mikrosonder är både små och känsliga nog för att mäta instrålning i mushjärnvävnad med all päls, hud och ben intakt och visa att fysiologiska ljusnivåer lätt är tillräckligt höga för att stimulera djupa hjärnopsiner.

Denna mikrooptiska sond och mätinställning kan vara användbar för forskare som behöver kvantifiera och karakterisera ljuset inuti biologisk vävnad, särskilt för en mer nyanserad förståelse av fotosyntes eller funktionerna hos visuella pigment som uttrycks utanför ögonen. Denna metod kan användas ensam eller tillsammans med andra tekniker för att fullt ut karakterisera de optiska egenskaperna och ljusutbredningen i levande vävnad till en låg kostnad, med liten bärbar utrustning inbyggd internt och med uppgiftsberoende justerbara parametrar.

Protocol

Denna studie överensstämmer med alla relevanta etiska regler från Yale University angående ryggradsdjur och ryggradslösa djurförsök.

1. Bygga den optiska mikrosonden

1. Bygga glashylsan, material: Pasteurpipett, 5,75 tum (se materialförteckning)
   1. Använd en monterbar alligatorklämma (Table of Materials), montera glaspipetten vid den breda änden så att den avsmalnande änden är vänd nedåt mot golvet och pipettens orientering är vinkelrät mot golvet.
   2. Häng ett 50 g skruvstädsgrepp i plast (Table of Materials) från pipettens avsmalnande ände. Placera en dyna med elektrisk tejp mellan pipetten och skruvstädsgreppet för att förhindra glidning.
   3. Värm pipettens avsmalnande ände med en liten butanbrännare (Table of Materials). Applicera lågan 1 cm ovanför skruvstädets grepp. Håll ficklampan så att den ljusaste delen av lågan är 3 cm från glaset och glaset är vid flammans spets. När pipettens längd har ökat med cirka 5 tum, ta omedelbart bort lågan.
   4. Använd en liten sax eller en glasskärare för att trimma pipettens dragna ände vid den punkt där den nya dragdiametern är ungefär dubbelt så stor som den optiska fibern som används i nästa avsnitt (se steg 1.2). Fila ner alla skarpa områden i den trimmade änden med karborundpapper (materialförteckning). Skölj bort eventuella små glasskärvor eller damm med en sprutflaska isopropylalkohol följt av tryckluft.
2. Dra i den optiska fibern (bild 1D)
   1. Använd ett rakblad för att skära av den optiska fibern och ta bort en SMA-kontakt med en SMA-terminerad optisk fiber med en diameter på 200 μm (Table of Materials). Klipp nära en av SMA-avslutningarna. Använd sedan rakbladet för att ta bort nästa 5 cm plast- och glasfibermantel så att den nakna optiska fibern exponeras och sticker ut från resten av den intakta enheten.
   2. Använd butanbrännaren för att bränna bort polyimidpolymerbeläggningen från glasfibern. Skölj med isopropanol. Torka av den nakna glasfibern med en luddfri servett.
   3. Nästa steg är att montera den nakna fibern så att den också kan dras med en låga. Montera den nakna änden av den optiska fibern direkt i en tångklämma (Table of Materials) på ett bord eller hyllkant, så att den SMA-avslutade änden av fibern hänger mot golvet. Lägg till vikterna för att dra i form av två små klämmor (totalvikt: 10 g) på den mantlade änden av fibern ca 12 i dun från där den nakna optiska fibern hålls i tångklämman.
   4. För att dra fibern, börja med butanbrännarens flamma på. Med lågan på, håll butanbrännaren 1 cm från den nakna fibern så att lågan är vinkelrät mot den optiska fibern och 3 cm ner vertikalt från där tångklämman håller den nakna fibern. Låt fibern sträcka, dra, separera och släppa till golvet.
   5. Undersök den resulterande dragna optiska fiberänden. Slipa försiktigt bort eventuella oegentligheter med karborundpapper, rengör med isopropylalkohol och en luddfri torka och torka med tryckluft.
      OBS: Vid denna tidpunkt kan man använda ett mikroskop för att karakterisera och dokumentera storleken och formen på den dragna fibern.
   6. Använd en film-ogenomskinlig penna för att mörka fiberns sidor och förhindra inträde av ströljus (materialtabell). Dra försiktigt fibern över pennans spets och lämna bara ett litet område vid spetsen avtäckt.
3. Montering av den dragna fibern inuti glaspipetthylsan (figur 1A)
   1. Arbeta under ett stereomikroskop, sätt försiktigt in den avsmalnande optiska fibern från steg 1.2 i den breda änden av den förändrade glaspipetten från steg 1.1 och tryck igenom fibern tills ~ 1 mm bar fiber sticker ut ur pipettens avsmalnande ände.
   2. Använd elektrisk tejp för att säkra den mantlade änden av den optiska fibern till pipettens breda ände.
   3. Sätt en droppe cyanoakrylatlim på en liten nål (Table of Materials). Rör försiktigt droppen lim till den dragna pipettens skärkant och undvik den nakna änden av den dragna fibern.
   4. Låt kapillärverkan transportera limet in i pipetten och fukta området mellan pipettens vägg och den optiska fibern. Låt häftämnet härda i minst 15 minuter innan du flyttar sondenheten.
4. Ändra fiberspetsen med en spridningssfär (figur 1C)
   1. Skapa råmaterialet för spridningskulspetsen genom att blanda en droppe UV-härdbart lim med titandioxidpulver (materialförteckning) vid ~ 1: 1 v / v.
   2. Fäst sonden på en mikromanipulator med en monteringsstångshållare (Table of Materials) så att sonden är i horisontell orientering. Bered en arbetsbehållare av spridningsmaterialet genom att doppa spetsen på en tråd eller nål i limmet/_{TiO2-blandningen} som beretts ovan så att en droppe lim bildas. Montera tråden eller nålen med droppen nära spetsen på den horisontella sonden. Det är bekvämt att göra detta med hjälp av ett alligatorklämma monterat på bänken.
   3. Sätt en spridningssfär på sondens spets. Använd mikromanipulatorn för att långsamt och försiktigt trycka spetsen på sondens optiska fiber in i droppen av lim / TiO₂. Dra sedan snabbt ut spetsen från limet. Upprepa två till tre gånger tills en sfärisk droppe lim av önskad storlek avsätts på spetsen av den optiska fibern.
      OBS: Spridningssfären kommer att vara stabil vid diametrar från två till åtta gånger större än diametern på den avsmalnande optiska fibern. Den slutliga optimala storleken beror på den slutliga önskade applikationen.
   4. Bota sfären genom att ansluta den SMA-avslutade änden av den optiska fibern till en fiberkopplad UV-ljuskälla (materialförteckning).
      OBS: Ljuskällan som användes i denna studie hade en effekt på 5,3 mW. Vid denna effekt är den rekommenderade härdningstiden minst 12 timmar eller över natten. Efter härdning är en bra tid att karakterisera och mäta storleken på den slutliga optiska sondspetsen.

2. Förbereda och montera vävnaden för optiska mätningar (figur 2 och figur 3)

1. Förbered diskarna för att montera proverna för ett experiment. Värm den stora änden av en Pasteurpipett med en butanbrännare för att göra en stans för att smälta ett hål med en diameter på 0,5 cm i botten av en petriskål av 35 mm x 10 mm plast. Försegla hålet på undersidan av skålen med elektrisk tejp eller labtejp. Gör flera åt gången för effektivitet.
2. Förbered flytande gelatin (materialförteckning) enligt anvisningarna på förpackningen.
   OBS: Kommersiellt smaklöst gelatin av livsmedelskvalitet från mataffären är bättre för detta ändamål än gelatin av kemisk kvalitet från kemiska leverantörer eftersom gelatinet av kemisk kvalitet är mindre optiskt klart och mindre mekaniskt tillförlitligt än livsmedelsprodukten.
3. Utför dissektion och beredning av vävnaden som ska användas.
   OBS: Av erfarenhet kan vilken platt vävnad som helst upp till 1 cm tjock framgångsrikt mätas i detta experiment med vilken dissektionsteknik som helst som är lämplig för systemet av intresse. För jättemusselvävnad användes en 8 mm biopsistans för att göra en platt, regelbunden cirkel av musselvävnad för användning i experimentet¹². För detta system kunde endast ett prov effektivt beredas åt gången med tanke på den tid som krävs för att slutföra en mätning för att säkerställa att provet fortfarande var i naturtroget skick vid experimentets slut.
4. Fyll två petriskålar från steg 2.1 en fjärdedel av vägen med flytande gelatin och låt svalna till rumstemperatur (RT) strax före gelering. I en maträtt placerar du biopsin i kudden av visköst gelatin som bildas i hålet i botten av skålen. Använd en Pasteur-pipett för att försiktigt tillsätta RT-gelatin runt biopsin tills petriskålen är full (figur 3). Fyll den andra skålen med gelatin för att göra ett tomt prov.
5. Ställ provfaten i kylskåp i cirka 10-30 minuter tills gelatinet är helt härdat och något elastiskt vid beröring.
   OBS: I ett svalt rum kanske detta inte är nödvändigt; När du arbetar i tropikerna krävs detta steg för att fullständigt bota gelatinet.
6. Gör ett fäste för petriskålen på mikromanipulatorn (figur 2)
   1. Skär en 6 cm x 6 cm kvadrat av 1/4 i tjockt plexiglas (Materialtabell).
   2. Borra eller smält ett hål i plastrutan med samma diameter som petriskålen (~ 35 mm). Se till att petriskålen sitter tätt i detta hål och hålls på plats med friktion. Lägg tejp i skålens kanter för att öka storleken och friktionskontakten något.
   3. Borra eller smälta ett hål med en diameter på 1/4 tum i hörnet av plasttorget. Använd detta hål för att fästa torget på mikromanipulatorn med en 1/4 i skruv och bult.
   4. Täck plastrutan med svart elektrisk tejp för att minska det ströljus som når sonden. Använd på samma sätt tejp för att skapa en kjol runt fyrkantens sidor som sträcker sig under botten av den infogade skålen (>10 mm) för att minska ströljus (figur 2B).
   5. Använd en bult och lämplig hårdvara för att fästa petriskålhållaren på en mikromanipulator som möjliggör tredimensionella justeringar och väl upplöst vertikal rörelse över en utsträckning som är större än provernas tjocklek (del 1 och del 2 av manipulatorn som nämns i materialtabellen är bra exempel). Fäst denna mikromanipulator på en optisk brödbräda.

3. Mätuppställning för vävnadsbiopsier

1. Montera en ljuskälla ovanför det område där mätningen äger rum så att ljuset kollimeras när det når det plan där provexemplaret ska placeras (figur 2A). Fäst till exempel en 5 cm kollimeringslins (Table of Materials) på en 5 mm flytande ljusledare (Table of Materials) och höj över provet med >0,6 m med hjälp av ett skruvstycke och en ram fäst vid en optisk breadboard (Table of Materials). Anslut sedan ljusledaren till en bredbandsljuskälla, till exempel plasmaljuskällan som anges i materialförteckningen.
2. Fäst sonden på ett vertikalt orienterat fäste så att den pekar mot ljuskällan. Fäst sonden med klämmor, slangklämmor eller tejp på en optisk bordsstolpe.
   OBS: I det gigantiska musselexperimentet används en specialdesignad stånghållare, såsom mikromanipulatorn som anges i materialtabellen. I detta arbete säkrades det med magneter till en optisk brödbräda (Table of Materials). De ytterligare frihetsgraderna för inriktning som erhålls genom att ha både sonden och provet på manipulatorer är lämpliga men inte nödvändiga. Var försiktig så att du inte klämmer fast för mycket på stolpen, eftersom det kan bryta pipetthuset.
3. Placera provmanipulatorn nära den vertikalt monterade sonden. Använd provmanipulatorn för att justera provstegets position så att sonden centreras i 0,5 cm öppningen längst ner på petriskålen. Var mycket försiktig för att undvika att vidröra eller stöta på spetsen på den monterade sonden.
   OBS: Ett bommonterat stereomikroskop placerat över provområdet kan vara användbart. På så sätt kan uppifrån och ned-justeringen av sondspetsen, steget och provet visas innan ett experiment påbörjas (figur 2A).
4. Anslut den SMA-avslutade änden av sondens optiska fiber till en USB-fiberoptisk spektrometer (Table of Materials) och anslut spektrometern till datorn med en USB-kabel.

4. Insamling av uppgifter

1. Experimentell installation
   1. Ha sonden och manipulatorerna i exakt inriktad position där data kommer att samlas in, som i steg 3.4.
   2. Använd en bomullspinne eller finnål för att försiktigt applicera en liten mängd silikonsmörjmedel (Table of Materials) på den del av sonden som kommer att sättas in i vävnaden för att sänka friktionen mellan sondens sidor och vävnadsprovet. Applicera silikonsmörjmedlet igen före varje baslinje- eller vävnadsmätning.
   3. Ta bort tejpen som täcker hålet i petriskålen och placera den i provhållaren (steg 2.7) och se till att den hålls ordentligt på plats genom friktion.
   4. Använd mikromanipulatorn för att sänka provet på sonden. Låt sonden komma in i gelatinet via hålet på undersidan av petriskålen. Fortsätt tills sonden är ca 5 mm från gelatinskiktets botten.
   5. Slå på ljuskällan. Använd spektrometerns programvara och justera spektrometerns integrationstid tills signalen är så hög som möjligt men inte mättad. Ange antalet genomsnittliga skanningar mellan två och fem och värdet för utjämningspixlar till sex. Användbara integreringstider i det här skedet kan variera mellan 1–50 ms för den här baslinjen.
2. Insamling av referensspektra
   1. Samla en mörk mätning.
      1. När spektrometerns parametrar har ställts in med det tomma provet, lossa sondfibern från spektrometern och täck porten med det ogenomskinliga metallhöljet som medföljde spektrometern.
      2. Hämta en mörk mätning från spektrometern (ofta med hjälp av den mörka glödlampaikonen i GUI) för att karakterisera bruset från spektrometern utan ingångsljus. Spara denna mätning enligt datainsamlingsstrategin.
   2. Samla in ett lampmått. Anslut sondfibern till spektrometern, vänta tills signalen stabiliseras och förvärva ett annat spektrum. Denna mätning kännetecknar ljuset som når sonden genom gelatinet i frånvaro av vävnad.
3. Insamling av vävnadsspektra
   1. Ta bort tejpen på botten av Petriskålen och placera den i provhållaren.
   2. Rikta in provskålen mot sonden med hjälp av tredimensionell manipulation så att vävnadsbiopsin centreras ovanför sondens spets.
   3. Applicera silikongel på sonden (se 4.1.2) och sänk långsamt ner provet på sonden tills sondspetsen har passerat genom gelatinet som stöder vävnadsprovet och just har kommit in i vävnadsprovet.
      OBS: Vissa spektrometrar och datorprogram tillåter realtidsövervakning av det detekterade ljuset. Använd detta för att bestämma när sonden kommer in i vävnaden. Spektrumintensiteten minskar plötsligt så snart sondspetsen är i direkt kontakt med vävnaden.
   4. Kontrollera att integreringstiden är lämplig för mätningen genom att säkerställa att det uppmätta spektrumet varken är för bullrigt eller mättat. Ändra integrationstiden om det behövs.
      1. Varje gång integrationstiden justeras, utför och lagra en ny mörk mätning (steg 4.2.1). Ändra inte antalet genomsnittliga skanningar eller antalet utjämnade pixlar.
      2. Efter att ha hittat lämpliga mätparametrar, ta mätningarna och spara spektrumet.
   5. Flytta provet ner ett angivet avstånd med hjälp av mikromanipulatorn. För manipulatorn som användes för denna studie var varje liten bockmarkering 0,001 tum eller 25,4 μm. Provet flyttades ner genom fem skalstreck, eller 127 μm, för varje mätning. Upprepa steg 4.3.4.
   6. Fortsätt att spara spektra vid varje vertikal position i vävnaden.
      OBS: För det system som beskrivs här varierade de nödvändiga integrationstiderna mellan 1 ms och 5 s för mätningarna i ett enda vävnadsprov. Så småningom kommer sondspetsen att lämna toppen av vävnaden och vara synlig där (figur 4A). Detta är den slutliga mätningen och kännetecknar ljusinfallet på toppen av vävnaden.
4. Laddning och bearbetning av data
   1. Använd spektrometerns programvara för att konvertera alla insamlade spektra (mörka spektra, lampspektra och vävnadsmätningar) till avgränsade textfiler.
   2. Använd Matlab eller ett valfritt kodningsspråk och ladda alla mätfiler för ett prov. För varje vävnadsmätningsspektrum, subtrahera det mörka spektrumet med matchande integrationstid och dela det sedan med integrationstiden.
      OBS: I denna studie användes ett Matlab-skript för att ladda och bearbeta data (kompletterande fil 1).
   3. Beräkna procentandelen infallande ljus som når varje position i vävnaden genom att dividera spektra erhållna med sonden inuti vävnaden med baslinjespektrumet erhållet i tomt gelatin.
      OBS: Mätningen på toppen av vävnaden (steg 4.3.6) bör vara mycket lik baslinjemätningen i gelatin (steg 4.1) och, när den delas upp, bör vara nära 100%. Beroende på det experimentella sammanhanget kan antingen lampspektrum (spektrumet från tomt gelatin eller det från toppen av vävnaden) användas som referens. Det är dock fortfarande viktigt att samla ett lampspektrum innan experimentet påbörjas. Detta beror på att om sonden bryts eller experimentet på annat sätt misslyckas innan det når toppen av vävnaden, är de data som erhållits före felet fortfarande användbara, vilket inte är fallet om det inte finns något motsvarande initialt lampreferensspektrum.
   4. Visualisera data; konturdiagram kan vara till hjälp (figur 4B).

Representative Results

Detta protokoll beskriver proceduren för att konstruera en mikrooptisk sond som kan användas för att mäta den nedvällande strålningen (ljuset når en punkt från en riktning) eller, med tillägg av en ljusspridande sfärisk spets, för att mäta skalärstrålningen (ljuset når en punkt från alla riktningar). Dessa sonder kan mäta bestrålning vid rumsliga upplösningar som närmar sig längdskalorna för enskilda celler inuti levande vävnad. Detta protokoll beskriver också en representativ metod för beredning av ett vävnadsprov för strålningsmätningar med användning av den beskrivna sonden och en representativ metod för datavisning och analys.

Figur 1 visar produktionen av mikrosond. När den dras ska den optiska fibern avsmalna i ca 3 cm och inte ha några repor längs avsmalningen. Den ska också vara platt i slutet och ha en diameter på 15-30 μm (figur 1D). Spetsens planhet kan förbättras genom att slipa änden med karborundpapper eller skåra och bryta igen. På samma sätt bör den dragna glaspipetten som används som fiberhölje inte ha några skarpa eller trasiga kanter. När spridningskulan bildas på änden av fiberns plana, skurna spets, ska den vara sfärisk (figur 1C). Innan härdning kan missformade avlägsnas genom ytterligare en omgång för att sätta in bollen i den överordnade självhäftande droppen och snabbt dra ut fibern. En snabb rörelsehastighet kommer att dra limbollen från fiberns ände. Långsammare rörelser resulterar i ytterligare limbyggnad på fibern. Att titta på processen med hjälp av ett dissekeringsmikroskop medan fibern är fäst vid en ljuskälla är till hjälp för att visualisera arbetet och bestämma om processen fungerar. Det är viktigt att säkra fibern inuti glaspipetten med lim och elektrisk tejp innan spridningslimmet appliceras; annars kan fibern gå sönder, eller limet kan smeta med den skiftande fibern (figur 1).

Figur 2 visar mätapparaturen. I detta exempel har hållarna för både vävnadsprovet och sonden justeringsmöjligheter i tre dimensioner (figur 2). Att fästa både provet och sonden på manipulatorer hjälper till med inriktningen men är inte nödvändigt; Sonden kan fästas på en stationär stolpe. De mest upplösta rörelserna hos manipulatorerna bör orienteras i vertikal z-riktning så att positionen i vävnaden och/eller mängden sonderna rör sig kan bestämmas exakt (figur 2A). Ett bommonterat stereomikroskop kan vara användbart när det placeras så att man kan se scenen, sonden och provet genom okularet för att kontrollera sondens inriktning med scenen, skålen och provet (figur 2B). Att titta på spektra i realtid medan du sänker provet på sonden är till hjälp eftersom om spektrumet som mäts av sonden plötsligt förändras, tyder detta på att provet framgångsrikt ligger inuti den mycket spridande eller absorberande vävnaden eller att sonden böjer eller bryter. Plötsliga förändringar i spektrumets form och intensitet indikerar sannolikt vävnadsingång, medan plötsliga intensitetsförändringar utan formförändring tyder på att sonden böjer eller bryter. På toppen av musselvävnaden finns ett tunt klart membran som sonden inte kan tränga igenom utan att bryta. I ett fall som detta bör toppen av vävnaden övervakas för att se när sonden är på väg att gå ut, och mätningarna bör stoppas vid den punkten så att sonden inte går sönder.

Figur 3 visar vävnadsbiopsiprovet inbäddat i en petriskål med gelatin, som beskrivs i avsnitt 2. Det finns ett hål i botten av petriskålen för att tillåta den optiska sondens införande i vävnaden underifrån. Biopsin är 8 mm i diameter och centrerad över hålet i petriskålen (figur 3A). Det finns en liten mängd gelatin under vävnadsprovet och gelatinet fylls till toppen av skålen ovanför vävnaden (figur 3B).

Figur 4A visar sonden när den börjar lämna toppen av vävnaden, och figur 4B visar representativa data. Ett Matlab-skript (kompletterande fil 2) användes för att generera spåren i figur 4B. X-axeln är våglängden och y-axeln är procentandelen ljus vid ett vävnadsdjup i förhållande till baslinjespektrumet. Individuella mätningar för vävnadsdjup indikeras av linjerna med gråskalefärgning. Mätningar som tas djupare i vävnaden representeras av en mörkare linje. Baslinjespektrumet är mätningen i ett gelatinprov och används för att karakterisera lampan och sondens svar på lampan. Gelatin har lätt absorption och spridning, vilket innebär att signalen för gelatinabsorption mot våglängden inte är helt platt. Därför divideras de spektra som finns i vävnaden antingen med sondens spektrum i gelatin eller med sondens spektrum högst upp i vävnaden, så att de spektraldata som visas i figur 4B representerar den procentuella andelen ljus endast för vävnadsprovet och således är oberoende av ljuskällan. gelatinet och detaljerna för varje enskild sond.

Figur 1: Tillverkningssteg för den mikrooptiska radiometrisonden inom vävnaden . A) En skiss över den optiska sonden. (B) En vy av den färdiga optiska sonden. (C) En närbild av spridningssfären fäst vid den dragna optiska fibern inuti glaspipetstödet. (D) Den dragna och rengjorda optiska fibern. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2: Bilder och diagram över experimentuppställningen för mätning av skalär irradians inuti vävnaden . (A) En övergripande schematisk och bild av experimentuppställningen. (B) En närbild av provet petriskålhållare. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 3: Musselvävnadsbiopsi . (A) Ovanifrån och (B) sidovyer av en biopsi av musselvävnad redo att mätas i den förändrade petriskålen fylld med gelatin. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 4: Representativa data . (A) Mikroskopbild av hur sonden ser ut när den kommer upp genom vävnaden. b) Representativa data som erhållits med sonden inom vävnadsradiometrin. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Kompletterande fil 1: Matlab-skript som används för att ladda och bearbeta data. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande fil 2: Matlab-skript som används för att generera spåren i figur 4B. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Discussion

Detta protokoll beskriver en teknik för att systematiskt karakterisera den optiska miljön genom en stor volym levande vävnad med en rumslig upplösning ungefär på skalan av enskilda celler. Denna billiga, flexibla och fältdragbara metod kan vara användbar för alla forskare som studerar ljusets utbredning inom levande system. Av erfarenhet, jämfört med befintliga metoder⁷, kräver dessa sonder lite mer övning och skicklighet att bygga men resulterar i mindre vävnadsskador och förmågan att mer omfattande karakterisera större volymer tät vävnad.

Denna metod består av fyra delar. Den första delen, att bygga sonden, inspirerades av tidigare enhetsdesigner^10,11. Det nuvarande tillvägagångssättet utvecklades för systematiska, mindre destruktiva skanningar av hela tjock vävnad, eftersom den dragna glasnålen försiktigt kan glida mellan celler. Det är också mottagligt för användning i ett fältlaboratorium^12,13,14. Detta protokoll resulterar i prober med ~ 20 μm diameter spetsar för mätning av nedvällningsstrålningen och en valfri 50-100 μm diameter spridningssfär för mätning av skalär instrålning. Större eller mindre skalärbestrålningssfärer kan utvecklas genom att modifiera de material som används, till exempel ett UV-härdbart lim med en annan initial viskositet. Vikten i både pipettdragningen och fiberprocessen kan justeras för att resultera i mer eller mindre avsmalning. Uppvärmningshastigheten kan också modifieras genom avståndet från fackelflamman för att justera dragprocessen och den resulterande avsmalningen.

Sondkonstruktionstekniken kräver viss manuell skicklighet och försök och fel för att bli perfekt men kan bli pålitlig och snabb med övning. Här presenteras några felsökningsnyanser som utvecklats över tiden. Att dra ner den optiska fibern från den mantlade änden resulterar i mer konsekventa avsmalningar. Det är viktigt att applicera den ogenomskinliga pennan innan du lägger till den sfäriska spridningsspetsen, eftersom vätningsegenskaperna hos det ogenomskinliga bläcket positivt påverkar bildandet av en snygg limboll vid fiberspetsen. Om den resulterande limkulan är missformad är det möjligt att dra av den och försöka igen. För att göra detta kan mikromanipulatorn användas för att skjuta hela bollen in i limbehållaren och sedan dras tillbaka mycket långsamt. Detta drar vanligtvis bort det första, missformade försöket, lämnar det i limbehållaren och gör det möjligt att försöka igen.

Behandlade med försiktighet kan dessa sonder användas upprepade gånger för olika prover. Den största faran är att av misstag slå sondspetsen i något medan du flyttar den. Mellan mätningarna ska de rengöras av cellulärt skräp med isopropylalkohol och tryckluft. Sonderna kan också förvaras i veckor så länge sondspetsen inte vidrör någonting och det inte finns några krafter på den fiberoptiska enheten som kan dra isär tejpen och limet som håller sonden inuti glashylsan. Detta kan åstadkommas genom att spänna fast fiber- och glaspipetten på flera ställen vid kanten av en hög hylla.

Den andra och tredje delen av denna metod involverar de mekano-optiska aspekterna av experimentet och säkrar vävnaden för mätning. Denna del av metoden utvecklades specifikt för mätning av intravävnadskalära instrålning inuti jättemusselvävnad¹². Här presenteras detaljer för felsökning av dessa aspekter av metoden. För det första bör biopsin vara stor i förhållande till sonden. Detta förhindrar sonden från att flytta vävnaden när den passerar. Dessutom bör vävnaden sitta på botten av petriskålen så att gelatinets elasticitet och vikt kombineras för att hålla vävnaden på plats under mätningen. Det är också viktigt att rummet är tillräckligt svalt för att hålla gelatinet i ett elastiskt, fast tillstånd under den experimentella ljuskällan. På samma sätt, det hjälper att använda en LED eller annan källa med relativt liten värmeproduktion i förhållande till synligt ljus.

Metodens geometriska och optomekaniska parametrar är mycket flexibla. Till exempel användes den skalära irradianssonden för att mäta instrålning inuti en intakt mus hjärna och fettvävnad^13,14. För att göra detta monterades sonden på manipulatorerna på en standard gnagare stereotaktisk ram, och ljuskällan monterades pekande mot musens rostrum. I vilken geometri som helst är nyckeln till framgångsrik användning av denna metod att alltid samla in lämpliga lamp- och mörka referensspektra i början av en given mätning. Om en sond bryts under en vävnadsmätning och det inte finns någon initial karakterisering utan vävnaden på plats, kommer data att vara svåra eller omöjliga att tolka, och det kommer att vara nödvändigt att börja om med en ny sond. Däremot, med lämpliga referenser på plats i början, är partiella mätningar användbara data.

Den sista delen av denna metod gäller datainsamlingen. Användningen av en fiberoptisk spektrometer för övervakning av signaler från sonden beskrivs, vilket säkerställer enkel SMA-koppling och ger fullständigt spektral våglängdsinformation. För system med lägre fotonflöde är det emellertid också möjligt att koppla dessa sonder till fotomultiplikatorrör eller lavinfotodioder. I vilket fall som helst kräver alla detektorer referensmätningar för varje ny mätning. Därför, med endast små justeringar av de beskrivna datainsamlingsmetoderna, kan alla olika typer av optiska parametrar karakteriseras.

Framtida intressanta användningsområden för denna metod kan vara kvantifiering av ljus djupt inne i kropparna hos större däggdjur och inom växter med komplexa strålningsöverföringsegenskaper, såsom suckulenter.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1" travel ball bearing center+D11+A2:D31+A2:A2:D31	Edmond Optics	37-935	Part 2 of manipulator for lowering sample
1/4" thick acrylic sheet	McMaster-Carr	8505K754	For making Petri dish holder
3/4" mini spring clamp	Anvil	99693	Use as weight for pulling optical fiber
8 mm biopsy punch	Fisher Scientific	NC9324386	For tissue sample
Butane Torch	McMaster-Carr	MT-51	Heat source for pulling fiber and pipette
Collimating lens	Thorlabs	LLG5A1-A	To collimate light source through liquid light guide
Compressed air	McMaster-Carr	7437K35	For drying pulled fiber and pipette
Cyanoacrylate glue - liquid	McMaster-Carr	66635A31	For securing tapered fiber end at top of pulled pipette
Electrical tape	McMaster-Carr	76455A21	For securing fiber in pipette and for adding grip to clamps
Fine grade carborundum paper	McMaster-Carr	4649A24	Small triangle on exacto knife holder works well
Gelatin	Knox	10043000048679	For securing the tissue biopsy in the petri dish
Glass Pasteur Pipete	Fisher Scientific	13-678-20B	Disposable glass pipette 5.75" in length
Insulin syringes, 31G needle	BD	320440	For applying glue
Isopropanol	McMaster-Carr	54845T42	For cleaning pulled fiber and pipette
Kimwipe	Cole-Parmer	SKU 33670-04	For wiping optical fiber and glass pipette clean
LED driver	Thorlabs	LEDD1B	For powering the UV LEDs
Light source for measurements	Cole-Parmer	UX-78905-05	Low heat white light source for measurements
Linear metric X-Y-Z axis rack and pinion stage	Edmond Optics	55-023	Part 1 of manipulator for lowering sample
Liquid light guide	Thorlabs	LLG5-4T	For light source in measurements
Magnetic feet	Siskiyou	MGB 8-32	For use with magnetic strips
Magnetic strips	Siskiyou	MS-6.0	For mounting magnetically to breadboard
Manipulator #1	Siskiyou	MX10R	4-axis manipulator with pipette holder
Opaquer pen, small	WindowTint	TOP01	For opaquing side of optical fiber to prevent stray light from enter probe
Optical breadboard	Edmond Optics	03-640	For stable affixation of probe holder, sample, microscope and light source
Optical fibers	Ocean Optics	P-100-2-UV-VIS	About 4 fibers are good to have
Plasma light source	Thorlabs	HPLS345	For tissue radiometry measurements
Plastic plier clamp	McMaster-Carr	5070A11	Plier clamp used for weight in pulling pipette
Polystyrene Petri dishes	Thomas scientific	3488N10	Sample holders, enough volume to hold sample thickness plus ~10 mm of gelatin on top
Razor blades	McMaster-Carr	3962A3	For stripping jacketing from optical fiber
Silicone oil lubricant	Thomas scientific	1232E30	For reducing friction between probe and tissue
Software for analyzing data	Matlab		Chosen software for data analysis
Spectrometer + spectrometer software	Avantes	AvaSpec-2048L	Spectrometer can be any brand, this one is compatible with sma-terminated optical fibers and comes with its own software for running the spectrometer
Titanium dioxide powder	Sigma Aldrich	718467-100G	For making scattering sphere
Toolour tabletop clip	Toolour	Toolour0004	For holding pipette while pulling and for holding finished probes
Trigger-action bar clamps	mcMaster-Carr	51755A2	Good for holding optical fibers while pulling or curing
UV curable adhesive	Delo Photobond	GB368	For making scattering sphere
UV light source	Thorlabs	M365FP1	Light source for curing adhesive in scattering ball, this one is sma-fiber compatible, higher intensity = less cure time
White LED light source	Thorlabs	MCWHF2	For characterizing pulled fiber and scattering sphere