En intra-vev radiometri mikroprobe for måling av utstråling in situ i levende vev

Summary

I denne artikkelen beskrives en metode for å måle utstråling in situ i levende vev. Dette arbeidet inkluderer detaljer om konstruksjon av mikroskalaprober for forskjellige målinger av utstråling og bestråling, gir veiledning for montering av vev for karakterisering av utstråling, og skisserer beregningsmetoder for å analysere de resulterende dataene.

Abstract

Organismer virker ugjennomsiktige i stor grad fordi deres ytre vevslag sprer seg sterkt til innfallende lys; Sterkt absorberende pigmenter, som blod, har vanligvis smale absorbanser, slik at den gjennomsnittlige frie banen til lys utenfor absorbanstoppene kan være ganske lang. Siden folk ikke kan se gjennom vev, forestiller de seg generelt at vev som hjerne, fett og bein inneholder lite eller ikke noe lys. Imidlertid uttrykkes fotoresponsive opsinproteiner i mange av disse vevene, og deres funksjoner er dårlig forstått. Utstråling internt i vev er også viktig for å forstå fotosyntese. For eksempel absorberer gigantiske muslinger sterkt, men opprettholder en tett populasjon av alger dypt i vevet. Lysutbredelse gjennom systemer som sedimenter og biofilmer kan være komplekse, og disse samfunnene kan være viktige bidragsytere til økosystemproduktivitet. Derfor er det utviklet en metode for å konstruere optiske mikroprober for måling av skalar irradians (fotonfluks som krysser et punkt) og nedstrømmingsbestråling (fotonfluks som krysser et plan vinkelrett) for bedre å forstå disse fenomenene i levende vev. Denne teknikken er også håndterbar i feltlaboratorier. Disse mikrosondene er laget av varmetrukne optiske fibre som deretter festes i trukne glasspipetter. For å endre sondens vinkelaksept, festes en 10-100 μm stor kule av UV-herdbar epoksy blandet med titandioksid til enden av en trukket, trimmet fiber. Sonden settes inn i levende vev, og posisjonen styres ved hjelp av en mikromanipulator. Disse sondene er i stand til å måle in situ vevsutstråling ved romlige oppløsninger på 10-100 μm eller på skalaen til enkeltceller. Disse sondene ble brukt til å karakterisere lyset som når fett- og hjernecellene 4 mm under huden til en levende mus og for å karakterisere lyset som når lignende dybder i levende algerikt gigantisk muslingvev.

Introduction

Overraskende nok har landdyr og grunne havboere nok lys i kroppen til visuell fysiologi og til og med fotosyntese. For eksempel dempes lysnivåene i midten av musens hode (utenfor de sterke hemoglobinabsorbansbåndene) med tre eller fire størrelsesordener i forhold til omverdenen. Dette er omtrent forskjellen mellom lysnivåene inne og ute. Så opasiteten til et vev eller materiale på grunn av sterk spredning er ikke det samme som opasitet på grunn av sterk lysabsorpsjon. Lys kan fortsette å forplante seg over lange avstander i et sterkt fremoverspredningssystem, som ligner på lys som forplanter seg gjennom vannsystemer med høye konsentrasjoner av celler og partikler¹. Denne observasjonen er spesielt fremtredende i lys av det faktum at opsinproteiner er nesten allestedsnærværende uttrykt i alle vev hos alle dyr. Derfor er det viktig å forstå hvordan og hvor lyset dempes og spres i levende vev. Imidlertid, i motsetning til akvatiske systemer, med levende vev, er det umulig å fordype et instrument i vannsøylen og oppnå utstrålings- og bestrålingsmålinger, og en ny teknikk er nødvendig.

Andre metoder som tidligere ble brukt til å karakterisere absorpsjons- og spredningsegenskapene til levende vev, inkluderer måling av vevsrefleksjonsprober og / eller integrering av kuler^2,3, mikroskopiske metoder som skanning av konfokalmikroskopi^4, måling av diffusjon av laserlys på overflaten⁵ og modelleringsteknikker som Monte Carlo strålingsoverføring⁶. De eksperimentelle metodene som nevnes krever ofte spesifikt, stort og dyrt utstyr eller detaljert kunnskap om vevstruktur og er generelt begrenset i deres evne til å karakterisere den romlige strukturen av lys dypt inne i vevet.

Det finnes også lignende sondebaserte metoder som bruker en hypodermisk nål for å sette inn en optisk fiber gjennom vev ^7,8,9. Vår erfaring er at modifiserte nåler er effektive til å punktere vev, men krever betydelig kraft og rives generelt i delikat vev når de passerer gjennom tettpakkede celler. Derfor krever disse nålene vanligvis en kirurgisk prosedyre for å sette inn mer enn en millimeter eller så i et vevslag. Metoden beskrevet her, ved hjelp av en smurt, trukket glassstøtte, er i stand til å glide mellom celler med minimal sår av vevet og uten ytterligere kirurgi.

Dette manuskriptet presenterer en metode inspirert av arbeidet til Jorgenson og kolleger om måling av lys i algematter^10,11, ved hjelp av glassstøttede optiske mikroprober og bærbar elektronikk som er egnet til å undersøke dypt inn i tett vev og til konstruksjon og bruk i feltet. Disse sondene kan konstrueres for å karakterisere skalar irradians (lys som treffer et punkt fra alle retninger) og nedstrømsutstråling (lys som krysser et horisontalt plan) inne i levende vev ved høye romlige oppløsninger. Disse sondene ble opprinnelig utviklet for å måle strålingsoverføring i vevet av fotosymbiotiske gigantiske muslinger¹². Standardmålinger av absorpsjon og overføring av det totale vevet var ikke nok til å karakterisere vevets fotosyntetiske ytelse, siden det gjør stor forskjell om alt innfallende lys absorberes av noen få celler som opplever høy intensitet på overflaten av vevet eller mange celler som opplever lave intensiteter gjennom hele vevets volum. I et annet prosjekt ble disse probene brukt til å måle in vivo irradians i en muss hjerne^13,14, og dermed karakterisere lysmiljøet til opsiner uttrykt dypt inne i hjernen. Disse mikrosondene er både små og følsomme nok til å måle stråling i musehjernevev med all pels, hud og bein intakt og demonstrere at fysiologiske lysnivåer lett er høye nok til å stimulere dype hjerneopsiner.

Denne mikrooptiske sonden og måleoppsettet kan være nyttig for forskere som trenger å kvantifisere og karakterisere lyset internt til biologisk vev, spesielt for en mer nyansert forståelse av fotosyntese eller funksjonene til visuelle pigmenter uttrykt utenfor øynene. Denne metoden kan brukes alene eller sammen med andre teknikker for å karakterisere de optiske egenskapene og lysutbredelsen i levende vev til en lav pris, med lite bærbart utstyr innebygd internt og med oppgaveavhengige justerbare parametere.

Protocol

Denne studien er i samsvar med alle relevante etiske forskrifter fra Yale University angående forskning på virveldyr og virvelløse dyr.

1. Bygge den optiske mikrosonden

1. Bygge glasshylsen, materiale: Pasteur pipette, 5,75 tommer (se materialfortegnelse)
   1. Ved hjelp av en monterbar alligatorklips (materialfortegnelse) monteres glasspipetten ved den brede enden slik at den koniske enden vender ned mot gulvet og pipettens orientering er vinkelrett på gulvet.
   2. Heng et 50 g plastgrep (materialfortegnelse) fra den koniske enden av pipetten. Plasser en pute med elektrisk tape mellom pipetten og skruegrepet for å forhindre glidning.
   3. Varm den koniske enden av pipetten med en liten butanbrenner (materialfortegnelse). Påfør flammen 1 cm over skruegrepet. Hold fakkelen slik at den lyseste delen av flammen er 3 cm fra glasset og glasset er på tuppen av flammen. Når pipettens lengde har økt med ca. 5 tommer, fjern flammen umiddelbart.
   4. Bruk en liten saks eller en glasskutter til å trimme den trukne enden av pipetten på det punktet hvor den nye pulled-diameteren er omtrent dobbelt så stor som den optiske fiberen som brukes i neste avsnitt (se trinn 1.2). Fil ned eventuelle skarpe områder av den trimmede enden ved hjelp av karborundumpapir (materialfortegnelse). Skyll bort eventuelle resulterende små glasskår eller støv ved hjelp av en sprutflaske isopropylalkohol etterfulgt av trykkluft.
2. Trekke i den optiske fiberen (figur 1D)
   1. Bruk et barberblad til å kutte den optiske fiberen, og fjern en SMA-kontakt på en 200 μm diameter SMA-terminert optisk fiber (Table of Materials). Kutt nær en av SMA-termineringene. Bruk deretter barberbladet til å fjerne de neste 5 cm med plast- og glassfiberjakke slik at den nakne optiske fiberen blir eksponert og stikker ut fra resten av den intakte enheten.
   2. Bruk butanbrenneren til å brenne av polyimidpolymerbelegget fra glassfiberen. Skyll med isopropanol. Tørk av den nakne glassfiberen med en lofri våtserviett.
   3. Det neste trinnet er å montere den nakne fiberen slik at den også kan trekkes med en flamme. Monter den nakne enden av den optiske fiberen direkte i en tangklemme (materialfortegnelse) på et bord eller hyllekant, slik at den SMA-terminerte enden av fiberen henger mot gulvet. Legg vektene for å trekke i form av to små klemmer (totalvekt: 10 g) på den jakkede enden av fiberen ca. 12 tommer ned fra der den nakne optiske fiberen holdes i tangklemmen.
   4. For å trekke fiberen, start med butanfakkelflammen på. Med flammen på, hold butanfakkelen 1 cm fra den nakne fiberen slik at flammen er vinkelrett på den optiske fiberen og 3 cm ned vertikalt fra der tangklemmen holder den nakne fiberen. La fiberen strekke seg, trekke, skille og falle til gulvet.
   5. Undersøk den resulterende trakk optiske fiberenden. Slip forsiktig bort eventuelle uregelmessigheter med karborundumpapir, rengjør med isopropylalkohol og en lofri våtserviett, og tørk med trykkluft.
      MERK: På dette tidspunktet kan man bruke et mikroskop for å karakterisere og dokumentere størrelsen og formen på den trukne fiberen.
   6. Bruk en filmopaquing penn for å mørke sidene av fiberen og forhindre at strølys kommer inn (Table of Materials). Trekk fiberen forsiktig over tuppen av pennen, slik at bare et lite område på spissen er utildekket.
3. Montering av trukket fiber inne i glasspipettehylsen (figur 1A)
   1. Arbeid under et stereomikroskop, sett forsiktig den koniske optiske fiberen fra trinn 1.2 inn i den brede enden av den endrede glasspipetten fra trinn 1.1, og skyv fiberen gjennom til ~ 1 mm naken fiber stikker ut av den koniske enden av pipetten.
   2. Bruk elektrisk tape til å feste den kappede enden av den optiske fiberen til den brede enden av pipetten.
   3. Sett en dråpe cyanoakrylat lim på en liten gauge nål (Table of Materials). Berør limdråpen forsiktig på kuttkanten av den trukne pipetten, og unngå den nakne enden av den trukne fiberen.
   4. La kapillærvirkningen transportere limet inn i pipetten, fukt området mellom pipettens vegg og den optiske fiberen. La limet herde i minst 15 minutter før du flytter sondeenheten.
4. Endre fiberspissen med en spredningskule (figur 1C)
   1. Lag råmaterialet til spredningskulespissen ved å blande en dråpe UV-herdbart lim med titandioksidpulver (materialfortegnelse) ved ~ 1: 1 v / v.
   2. Fest sonden til en mikromanipulator med en monteringsstangholder (materialfortegnelse) slik at sonden er i horisontal retning. Forbered et arbeidsreservoar av spredningsmaterialet ved å dyppe spissen av en ledning eller nål i limet / TiO_2-blandingen fremstilt ovenfor slik at det dannes en dråpe lim. Monter ledningen eller nålen med dråpen nær spissen av den horisontale sonden. Det er praktisk å gjøre dette ved hjelp av et alligatorklips montert på benken.
   3. Sett inn en spredningskule på sondens spiss. Bruk mikromanipulatoren til å skyve spissen av sondens optiske fiber sakte og forsiktig inn i dråpen med lim/TiO₂. Deretter trekker du raskt spissen fra limet. Gjenta to til tre ganger til en sfærisk dråpe lim av ønsket størrelse er avsatt på spissen av den optiske fiberen.
      MERK: Spredningssfæren vil være stabil ved diametre fra to til åtte ganger større enn diameteren til den koniske optiske fiberen. Den endelige optimale størrelsen avhenger av den endelige ønskede applikasjonen.
   4. Herde sfæren ved å koble den SMA-terminerte enden av den optiske fiberen til en fiberkoblet UV-lyskilde (Table of Materials).
      MERK: Lyskilden som ble brukt i denne studien hadde en effekt på 5,3 mW. Ved denne kraften er den anbefalte herdetiden minst 12 timer eller over natten. Etter herding er det et godt tidspunkt å karakterisere og måle størrelsen på den endelige optiske sondespissen.

2. Klargjøre og montere vevet for optiske målinger (figur 2 og figur 3)

1. Forbered oppvasken for å montere prøvene for et eksperiment. Varm den store enden av en Pasteur-pipette ved hjelp av en butanbrenner for å lage et slag for å smelte et hull på 0,5 cm i diameter i bunnen av en petriskål av 35 mm x 10 mm plast. Forsegl hullet på undersiden av fatet med elektrisk tape eller laboratorietape. Lag flere om gangen for effektivitet.
2. Forbered flytende gelatin (materialfortegnelse) i henhold til instruksjonene på pakken.
   MERK: Kommersiell matvarekvalitet smakløs gelatin fra matbutikken er bedre for dette formålet enn kjemisk gelatin fra kjemiske leverandører fordi gelatin av kjemisk kvalitet er mindre optisk klar og mindre mekanisk pålitelig enn matvaren.
3. Utfør disseksjon og forberedelse av vevet som skal brukes.
   MERK: Av erfaring kan ethvert flatt vev opp til 1 cm tykt måles med hell i dette eksperimentet ved hjelp av en hvilken som helst disseksjonsteknikk som passer for systemet av interesse. For gigantisk muslingvev ble en 8 mm biopsistans brukt til å lage en flat, vanlig sirkel av muslingvev til bruk i forsøket¹². For dette systemet kunne bare én prøve effektivt fremstilles om gangen gitt hvor lang tid det tok å fullføre en måling for å sikre at prøven fortsatt var i naturtro tilstand ved slutten av eksperimentet.
4. Fyll to petriskåler fra trinn 2.1 en fjerdedel av veien med flytende gelatin, og la avkjøles til romtemperatur (RT) like før gelering. I en tallerken, plasser biopsien i puten av viskøs gelatin som dannes i hullet i bunnen av fatet. Bruk en Pasteur-pipette til forsiktig å tilsette RT-gelatin rundt biopsien til petriskålen er full (figur 3). Fyll den andre tallerkenen med gelatin for å lage en blank prøve.
5. Sett prøvefatene i kjøleskap i ca 10-30 min til gelatinen er fullstendig herdet og litt elastisk å ta på.
   MERK: I et kjølig rom er dette kanskje ikke nødvendig; Når du arbeider i tropene, er dette trinnet nødvendig for å helbrede gelatinen helt.
6. Lage et feste for petriskålen på mikromanipulatoren (figur 2)
   1. Skjær en 6 cm x 6 cm firkant på 1/4 i tykt pleksiglass (materialfortegnelse).
   2. Bor eller smelt et hull i plastfirkanten med samme diameter som petriskålen (~35 mm). Sørg for at petriskålen sitter godt i dette hullet og holdes på plass med friksjon. Legg tape til kantene på fatet for å øke størrelsen og friksjonskontakten litt.
   3. Bor eller smelt et hull på 1/4 i diameter i hjørnet av plastfirkanten. Bruk dette hullet til å feste firkanten til mikromanipulatoren ved hjelp av en 1/4 i skrue og bolt.
   4. Dekk plastfirkanten med svart elektrisk tape for å redusere strølyset som når sonden. På samme måte kan du bruke tape til å lage et skjørt rundt sidene av firkanten som strekker seg under bunnen av den innsatte tallerkenen (>10 mm) for å redusere strølys (figur 2B).
   5. Bruk en bolt og passende maskinvare for å feste petriskålholderen til en mikromanipulator som muliggjør tredimensjonale justeringer og godt oppløst vertikal bevegelse over et omfang som er større enn tykkelsen på prøvene (del 1 og del 2 av manipulatoren nevnt i materialfortegnelsen er gode eksempler). Fest denne mikromanipulatoren til et optisk brødfjøl.

3. Måleoppsett for vevsbiopsier

1. Monter en lyskilde over området der målingen finner sted, slik at lyset kollimeres når det når planet der prøven skal plasseres (figur 2A). For eksempel, fest en 5 cm kollimerende linse (materialfortegnelse) til en 5 mm flytende lysguide (materialfortegnelse), og hev over prøven med >0,6 m ved hjelp av en skruestikke og ramme festet til en optisk brødplate (materialfortegnelse). Deretter kobler du lysguiden til en bredbåndslyskilde, for eksempel plasmalyskilden som er oppført i materialfortegnelsen.
2. Fest sonden til et vertikalt orientert feste slik at den peker mot lyskilden. Fest sonden med klemmer, slangeklemmer eller tape til en optisk bordstolpe.
   MERK: I det gigantiske muslingeksperimentet brukes en spesielt designet stangholder, for eksempel mikromanipulatoren som er oppført i materialfortegnelsen. I dette arbeidet ble det festet med magneter til en optisk brødfjøl (Table of Materials). De ekstra frihetsgradene for justering oppnådd ved å ha både sonden og prøven på manipulatorer er praktiske, men ikke nødvendige. Vær forsiktig så du ikke klemmer for mye til stolpen, da dette kan ødelegge pipettehuset.
3. Plasser prøvemanipulatoren i nærheten av den vertikalt monterte sonden. Bruk prøvemanipulatoren til å justere posisjonen til prøvetrinnet slik at sonden er sentrert i 0,5 cm-åpningen i bunnen av petriskålen. Vær ekstremt forsiktig for å unngå å berøre eller støte på tuppen av den monterte sonden.
   MERK: Et bommontert stereomikroskop plassert over prøveområdet kan være nyttig. På denne måten kan ovenfra-og-ned-justeringen av probespissen, trinnet og prøven vises før du starter et eksperiment (figur 2A).
4. Koble den SMA-terminerte enden av sondens optiske fiber til et USB-fiberoptisk spektrometer (Table of Materials), og koble spektrometeret til datamaskinen ved hjelp av en USB-kabel.

4. Innsamling av opplysninger

1. Eksperimentelt oppsett
   1. Ha sonden og manipulatorene i den nøyaktige justerte posisjonen der dataene skal samles inn, som i trinn 3.4.
   2. Bruk en bomullspinne eller finmålernål for forsiktig å påføre en liten mengde silikon smøremiddel (Table of Materials) til den delen av sonden som skal settes inn i vevet for å senke friksjonen mellom sidene av sonden og vevsprøven. Påfør silikonsmøremiddelet på nytt før hver grunnlinje- eller vevsmåling.
   3. Fjern tapen som dekker hullet i petriskålen med blank prøve, og legg den i prøveholderen (trinn 2.7), og pass på at den holdes sikkert på plass av friksjon.
   4. Bruk mikromanipulatoren til å senke prøven ned på sonden. La sonden komme inn i gelatinen via hullet på undersiden av petriskålen. Fortsett til sonden er ca. 5 mm fra bunnen av gelatinlaget.
   5. Slå på lyskilden. Bruk spektrometerprogramvaren til å justere spektrometerets integrasjonstid til signalet er så høyt som mulig, men ikke mettende. Angi antall gjennomsnittlige skanninger mellom to og fem og verdien for utjevnende bildepunkter til seks. Brukbare integreringstider på dette stadiet kan variere mellom 1 og 50 ms for denne grunnlinjen.
2. Innsamling av referansespektrene
   1. Samle en mørk måling.
      1. Når spektrometerparametrene er satt med den tomme prøven, løsner sondefiberen fra spektrometeret og dekker porten med det ugjennomsiktige metalldekselet som fulgte med spektrometeret.
      2. Få en mørk måling fra spektrometeret (ofte ved hjelp av det mørke lyspæreikonet i GUI) for å karakterisere støyen fra spektrometeret uten inngangslys. Lagre denne målingen i henhold til datainnsamlingsstrategien.
   2. Samle en lampemåling. Koble sondefiberen til spektrometeret igjen, vent til signalet stabiliserer seg, og skaff deg et annet spektrum. Denne måling karakteriserer lyset som når sonden gjennom gelatinen i fravær av vev.
3. Oppsamling av vevsspektrene
   1. Fjern tapen på bunnen av petriskålen, og legg den i prøveholderen.
   2. Juster prøvefatet med sonden ved hjelp av tredimensjonal manipulering slik at vevsbiopsien er sentrert over sondens spiss.
   3. Påfør silikongel på sonden (se 4.1.2), og senk prøven sakte ned på sonden til sondespissen har passert gjennom gelatinen som støtter vevsprøven og nettopp har kommet inn i vevsprøven.
      MERK: Noen spektrometre og dataprogrammer tillater sanntidsovervåking av det oppdagede lyset. Bruk dette til å bestemme når sonden kommer inn i vevet. Spektrumintensiteten vil brått reduseres så snart sondespissen er i direkte kontakt med vevet.
   4. Kontroller at integrasjonstiden er passende for målingen ved å sikre at det målte spekteret ikke er for støyende eller mettet. Endre integreringstiden om nødvendig.
      1. Hver gang integrasjonstiden justeres, utfør og lagre en ny mørk måling (trinn 4.2.1). Ikke endre antall gjennomsnittlige skanninger eller antall utjevnede piksler.
      2. Etter å ha funnet passende måleparametere, ta målingene og lagre spekteret.
   5. Flytt prøven ned en angitt avstand ved hjelp av mikromanipulatoren. For manipulatoren som ble brukt til denne studien, var hvert lite kryssmerke 0,001 i eller 25,4 μm. Prøven ble flyttet ned gjennom fem hakemerker, eller 127 μm, for hver måling. Gjenta trinn 4.3.4.
   6. Fortsett å lagre spektrene ved hver vertikal posisjon i vevet.
      MERK: For systemet beskrevet her, varierte de nødvendige integrasjonstidene mellom 1 ms og 5 s for målingene i en enkelt vevsprøve. Til slutt vil sondespissen gå ut av toppen av vevet og være synlig der (figur 4A). Dette er den endelige målingen og karakteriserer lyshendelsen på toppen av vevet.
4. Lasting og behandling av dataene
   1. Bruk spektrometerets programvare til å konvertere alle innsamlede spektra (mørke spektra, lampespektra og vevsmålinger) til tekstfiler med skilletegn.
   2. Bruk Matlab eller et kodespråk du ønsker, og last inn alle målefilene for et utvalg. For hvert vevsmålespektrum trekker du fra det mørke spekteret med den matchende integrasjonstiden, og deler det deretter på integrasjonstiden.
      MERK: I denne studien ble det brukt et Matlab-skript for lasting og bearbeiding av dataene (tilleggsfil 1).
   3. Beregn prosentandelen av innfallende lys som når hver posisjon i vevet ved å dele spektrene oppnådd med sonden inne i vevet med baseline-spekteret oppnådd i tom gelatin.
      MERK: Målingen på toppen av vevet (trinn 4.3.6) skal være svært lik basismålingen i gelatin (trinn 4.1), og når den er delt, bør den være nær 100 %. Avhengig av eksperimentell kontekst, kan enten lampespekteret (spekteret fra tom gelatin eller det fra toppen av vevet) brukes som referanse. Det er imidlertid fortsatt viktig å samle et lampespekterum før du starter eksperimentet. Dette skyldes at hvis sonden går i stykker eller eksperimentet ellers mislykkes før det når toppen av vevet, er dataene som er oppnådd før feilen, fortsatt brukbare, noe som ikke er tilfelle hvis det ikke finnes noe tilsvarende innledende lampereferansespektrum.
   4. Visualiser dataene; konturplott kan være nyttig (figur 4B).

Representative Results

Denne protokollen beskriver prosedyren for å konstruere en mikrooptisk sonde som kan brukes til å måle nedstrømsbestrålingen (lyset når et punkt fra en retning) eller, med tillegg av en lysspredende sfærisk spiss, for å måle skalar bestråling (lyset når et punkt fra alle retninger). Disse sondene kan måle utstråling ved romlige oppløsninger som nærmer seg lengdeskalaene til enkeltceller i levende vev. Denne protokollen beskriver også en representativ metode for fremstilling av en vevsprøve for bestrålingsmålinger ved bruk av den beskrevne sonden og en representativ metode for datavisning og analyse.

Figur 1 viser resultatet av mikrosondeproduksjonen. Når den trekkes, skal den optiske fiberen avsmalne i ca 3 cm og ikke ha noen riper langs konisken. Den skal også være flat på enden og ha en diameter på 15-30 μm (figur 1D). Flatheten på spissen kan forbedres ved å slipe enden med karborundumpapir eller score og bryte igjen. På samme måte bør den trukne glasspipetten som brukes som fiberhuset, ikke ha noen skarpe eller ødelagte kanter. Når spredningskulen dannes på enden av fiberens flate, kuttede spiss, bør den være sfærisk (figur 1C). Før herding kan misdannede fjernes ved en ny runde med å sette ballen inn i foreldredråpen og raskt trekke fiberen ut. En rask bevegelseshastighet vil trekke limkulen fra enden av fiberen. Langsommere bevegelser resulterer i ytterligere limbygging på fiberen. Å se på prosessen ved hjelp av et dissekerende mikroskop mens fiberen er festet til en lyskilde, er nyttig for å visualisere arbeidet og avgjøre om prosessen fungerer. Det er viktig å sikre fiberen inne i glasspipetten med lim og elektrisk tape før du påfører spredningslimet; ellers kan fiberen gå i stykker, eller limet kan smøre med den skiftende fiberen (figur 1).

Figur 2 viser måleapparatet. I dette eksemplet har holderne for både vevsprøven og sonden justeringsmuligheter i tre dimensjoner (figur 2). Å feste både prøven og sonden til manipulatorer hjelper med justeringen, men er ikke avgjørende; Sonden kunne festes til en stasjonær stolpe. De mest oppløste bevegelsene til manipulatorene bør orienteres i vertikal z-retning slik at posisjonen i vevet og/eller mengden sondene beveger seg kan bestemmes nøyaktig (figur 2A). Et bommontert stereomikroskop kan være nyttig når det plasseres slik at man kan se scenen, sonden og prøven gjennom okularet for å kontrollere sondens justering med scenen, fatet og prøven (figur 2B). Det er nyttig å se på spektrene i sanntid mens du senker prøven på sonden, fordi hvis spekteret målt av sonden plutselig endres, antyder dette at prøven er vellykket plassert inne i det svært spredende eller absorberende vevet eller at sonden bøyer eller bryter. Brå skift i form og intensitet av spekteret indikerer mest sannsynlig vevinngang, mens brå intensitetsendringer uten endring i form tyder på at sonden bøyer eller bryter. På toppen av muslingvevet er det en tynn klar membran som sonden ikke kan trenge gjennom uten å bryte. I et tilfelle som dette bør toppen av vevet overvåkes for å se når sonden er i ferd med å gå ut, og målingene bør stoppes på det punktet slik at sonden ikke går i stykker.

Figur 3 viser vevsbiopsiprøven i en petriskål med gelatin, som beskrevet i avsnitt 2. Det er et hull i bunnen av petriskålen for å tillate den optiske sondens innføring i vevet fra undersiden. Biopsien er 8 mm i diameter og sentrert over hullet i petriskålen (figur 3A). Det er en liten mengde gelatin under vevsprøven, og gelatinen fylles til toppen av fatet over vevet (figur 3B).

Figur 4A viser sonden idet den begynner å gå ut av toppen av vevet, og figur 4B viser de representative dataene. Et Matlab-skript (tilleggsfil 2) ble brukt til å generere sporene i figur 4B. X-aksen er bølgelengden, og y-aksen er prosentandelen lys ved en vevsdybde i forhold til grunnlinjespekteret. Individuelle målinger for vevsdybde er indikert med linjene med gråskalafarging. Målinger tatt dypere i vevet er representert av en mørkere linje. Baseline-spekteret er målingen i en gelatin-eneste prøve og brukes til å karakterisere lampen og sondens respons på lampen. Gelatin har svak absorpsjon og spredning, noe som betyr at signalet for gelatinabsorpsjon mot bølgelengde ikke er helt flatt. Derfor er spektrene tatt gjennom hele vevet enten delt av sondens spektrum i gelatin eller av sondens spektrum på toppen av vevet, slik at spektraldataene vist i figur 4B representerer prosentandelen lys bare for vevsprøven og er dermed uavhengig av lyskilden, gelatinen, og spesifikasjonene til hver enkelt sonde.

Figur 1: Stadier av fremstilling av den mikrooptiske intravevsradiometrisonden . (A) Et skjema over den optiske sonden. (B) En visning av den ferdige optiske sonden. (C) Et nærbilde av spredningssfæren festet til den trukket optiske fiberen inne i glasspipetstøtten. (D) Den trukne og rengjorte optiske fiberen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Bilder og diagrammer av eksperimentoppsettet for måling av skalar irradians inne i vevet . (A) Et overordnet skjema og bilde av det eksperimentelle oppsettet. (B) Et nærbilde av petriskålholderen for prøven. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3 Muslingvevsbiopsi. (A) Topp og (B) sidevisning av en biopsi av muslingvev klar til å måles i den endrede petriskålen fylt med gelatin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4: Representative data . (A) Mikroskopbilde av hvordan sonden ser ut når den kommer opp gjennom vevet. (B) Representative data oppnådd med intravevsradiometrisonden. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfil 1: Matlab-skript som brukes til å laste inn og behandle dataene. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 2: Matlab-skript som brukes til å generere sporene i figur 4B. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Denne protokollen beskriver en teknikk for systematisk karakterisering av det optiske miljøet gjennom et stort volum levende vev med en romlig oppløsning omtrent på skalaen av enkeltceller. Denne billige, fleksible og felthåndterbare metoden kan være nyttig for alle forskere som studerer forplantning av lys i levende systemer. Fra erfaring, sammenlignet med eksisterende metoder⁷, krever disse sondene litt mer øvelse og dyktighet for å bygge, men resulterer i mindre vevskader og evnen til å karakterisere større volumer av tett vev mer omfattende.

Denne metoden består av fire deler. Den første delen, å bygge sonden, ble inspirert av tidligere enhetsdesign^10,11. Den nåværende tilnærmingen ble utviklet for systematiske, mindre destruktive skanninger av hele tykt vev, da den trukne glassnålen forsiktig kan gli mellom celler. Det er også egnet for bruk i et feltlaboratorium^12,13,14. Denne protokollen resulterer i sonder med ~20 μm diameterspisser for måling av nedstrømsutstrålingen og en valgfri spredningssfære på 50-100 μm diameter for måling av skalar bestråling. Større eller mindre skalarstrålingskuler kan utvikles ved å modifisere materialene som brukes, for eksempel et UV-herdbart lim med en annen startviskositet. Vekten i både pipetttrekkingen og fiberprosessen kan justeres for å resultere i mer eller mindre avsmalning. Oppvarmingshastigheten kan også endres gjennom avstanden fra fakkelflammen for å justere trekkeprosessen og den resulterende koniske.

Sondekonstruksjonsteknikken krever litt manuell dyktighet og prøving og feiling for å perfeksjonere, men kan bli pålitelig og rask med praksis. Her presenteres noen feilsøkingsnyanser utviklet over tid. Å trekke den optiske fiberen ned fra den kappede enden resulterer i mer konsistente koniske tapere. Det er viktig å påføre den opaquerende pennen før du legger til den sfæriske spredningsspissen, siden fuktegenskapene til den ugjennomsiktige blekket gunstig påvirker dannelsen av en ryddig limball på fiberspissen. Hvis den resulterende limkulen er misdannet, er det mulig å trekke den av og prøve igjen. For å gjøre dette kan mikromanipulatoren brukes til å skyve hele ballen inn i limbeholderen og deretter trekkes veldig sakte ut. Dette trekker vanligvis det første, misdannede forsøket av, etterlater det i limbeholderen og gjør det mulig å prøve igjen.

Behandlet med forsiktighet, kan disse sondene brukes gjentatte ganger for forskjellige prøver. Den største faren er ved et uhell å slå sondespissen inn i noe mens du flytter den. Mellom målingene skal de rengjøres av cellulært rusk ved bruk av isopropylalkohol og trykkluft. Sondene kan også lagres i flere uker så lenge sondespissen ikke berører noe, og det er ingen krefter på den fiberoptiske enheten som kan trekke fra hverandre tapen og limet som holder sonden inne i glasshylsen. Dette kan oppnås ved å klemme fiber- og glasspipetten flere steder til kanten av en høy hylle.

Den andre og tredje delen av denne metoden involverer de mekano-optiske aspektene av forsøket og sikring av vevet for måling. Denne delen av metoden ble utviklet spesielt for måling av intra-vev skalar irradians inne i gigantisk muslingvev¹². Her presenteres detaljer for feilsøking av disse aspektene ved metoden. Først bør biopsien være stor i forhold til sonden. Dette forhindrer sonden i å bevege vevet når det passerer. I tillegg skal vevet sitte på bunnen av petriskålen slik at elastisiteten og vekten av gelatinen kombineres for å holde vevet på plass under målingen. Det er også viktig at rommet er kjølig nok til å opprettholde gelatinen i en elastisk, fast tilstand under den eksperimentelle lyskilden. På samme måte hjelper det å bruke en LED eller annen kilde med relativt lite varmeutvikling i forhold til synlig lys.

De geometriske og optomekaniske parametrene til metoden er svært fleksible. For eksempel ble skalar irradianssonden brukt til å måle irradians inne i hjernen til en intakt mus og fettvev^13,14. For å gjøre dette ble sonden montert på manipulatorene på en standard stereotaktisk ramme for gnagere, og lyskilden ble montert som pekte mot musens talerstol. I enhver geometri er nøkkelen til vellykket bruk av denne metoden å alltid samle passende lampe og mørke referansespektra ved starten av en gitt måling. Hvis en sonde går i stykker under en vevsmåling og det ikke er noen initial karakterisering uten vevet på plass, vil dataene være vanskelige eller umulige å tolke, og det vil være nødvendig å starte på nytt med en ny sonde. I kontrast, med passende referanser på plass i starten, er delvise målinger brukbare data.

Den siste delen av denne metoden gjelder datainnsamlingen. Bruken av et fiberoptisk spektrometer for overvåking av signaler fra sonden er beskrevet, noe som sikrer enkel SMA-kobling og gir fullspektral bølgelengdeinformasjon. For systemer med lavere fotonfluks er det imidlertid også mulig å koble disse sondene til fotomultiplikatorrør eller skredfotodioder. I alle fall krever alle detektorene referansemålinger for hver nye måling. Derfor, med bare små justeringer av de beskrevne datainnsamlingsmetodene, kan alle forskjellige typer optiske parametere karakteriseres.

Fremtidig interessant bruk av denne metoden kan være kvantifisering av lys dypt inne i kroppene til større pattedyr og i planter med komplekse strålingsoverføringsegenskaper, som sukkulenter.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1" travel ball bearing center+D11+A2:D31+A2:A2:D31	Edmond Optics	37-935	Part 2 of manipulator for lowering sample
1/4" thick acrylic sheet	McMaster-Carr	8505K754	For making Petri dish holder
3/4" mini spring clamp	Anvil	99693	Use as weight for pulling optical fiber
8 mm biopsy punch	Fisher Scientific	NC9324386	For tissue sample
Butane Torch	McMaster-Carr	MT-51	Heat source for pulling fiber and pipette
Collimating lens	Thorlabs	LLG5A1-A	To collimate light source through liquid light guide
Compressed air	McMaster-Carr	7437K35	For drying pulled fiber and pipette
Cyanoacrylate glue - liquid	McMaster-Carr	66635A31	For securing tapered fiber end at top of pulled pipette
Electrical tape	McMaster-Carr	76455A21	For securing fiber in pipette and for adding grip to clamps
Fine grade carborundum paper	McMaster-Carr	4649A24	Small triangle on exacto knife holder works well
Gelatin	Knox	10043000048679	For securing the tissue biopsy in the petri dish
Glass Pasteur Pipete	Fisher Scientific	13-678-20B	Disposable glass pipette 5.75" in length
Insulin syringes, 31G needle	BD	320440	For applying glue
Isopropanol	McMaster-Carr	54845T42	For cleaning pulled fiber and pipette
Kimwipe	Cole-Parmer	SKU 33670-04	For wiping optical fiber and glass pipette clean
LED driver	Thorlabs	LEDD1B	For powering the UV LEDs
Light source for measurements	Cole-Parmer	UX-78905-05	Low heat white light source for measurements
Linear metric X-Y-Z axis rack and pinion stage	Edmond Optics	55-023	Part 1 of manipulator for lowering sample
Liquid light guide	Thorlabs	LLG5-4T	For light source in measurements
Magnetic feet	Siskiyou	MGB 8-32	For use with magnetic strips
Magnetic strips	Siskiyou	MS-6.0	For mounting magnetically to breadboard
Manipulator #1	Siskiyou	MX10R	4-axis manipulator with pipette holder
Opaquer pen, small	WindowTint	TOP01	For opaquing side of optical fiber to prevent stray light from enter probe
Optical breadboard	Edmond Optics	03-640	For stable affixation of probe holder, sample, microscope and light source
Optical fibers	Ocean Optics	P-100-2-UV-VIS	About 4 fibers are good to have
Plasma light source	Thorlabs	HPLS345	For tissue radiometry measurements
Plastic plier clamp	McMaster-Carr	5070A11	Plier clamp used for weight in pulling pipette
Polystyrene Petri dishes	Thomas scientific	3488N10	Sample holders, enough volume to hold sample thickness plus ~10 mm of gelatin on top
Razor blades	McMaster-Carr	3962A3	For stripping jacketing from optical fiber
Silicone oil lubricant	Thomas scientific	1232E30	For reducing friction between probe and tissue
Software for analyzing data	Matlab		Chosen software for data analysis
Spectrometer + spectrometer software	Avantes	AvaSpec-2048L	Spectrometer can be any brand, this one is compatible with sma-terminated optical fibers and comes with its own software for running the spectrometer
Titanium dioxide powder	Sigma Aldrich	718467-100G	For making scattering sphere
Toolour tabletop clip	Toolour	Toolour0004	For holding pipette while pulling and for holding finished probes
Trigger-action bar clamps	mcMaster-Carr	51755A2	Good for holding optical fibers while pulling or curing
UV curable adhesive	Delo Photobond	GB368	For making scattering sphere
UV light source	Thorlabs	M365FP1	Light source for curing adhesive in scattering ball, this one is sma-fiber compatible, higher intensity = less cure time
White LED light source	Thorlabs	MCWHF2	For characterizing pulled fiber and scattering sphere