생체 조직에서 현장 복사를 측정하기 위한 조직 내 방사선 측정 마이크로프로브

Summary

본 논문에서는 생체 조직에서 현장에서 광도를 측정하는 방법을 설명합니다. 이 작업에는 다양한 방사도 및 방사 조도 측정을 위한 마이크로 스케일 프로브 구성에 대한 세부 정보가 포함되어 있으며, 방사도 특성화를 위한 조직 장착에 대한 지침을 제공하고, 결과 데이터를 분석하기 위한 계산 방법을 간략하게 설명합니다.

Abstract

유기체는 주로 외부 조직 층이 입사광에 강하게 산란되기 때문에 불투명하게 보입니다. 혈액과 같은 강하게 흡수되는 색소는 전형적으로 좁은 흡광도를 가지므로, 흡광도 피크 바깥쪽의 빛의 평균 자유 경로는 상당히 길 수 있다. 사람들은 조직을 통해 볼 수 없기 때문에 일반적으로 뇌, 지방, 뼈와 같은 조직에는 빛이 거의 또는 전혀 포함되어 있지 않다고 상상합니다. 그러나 광반응성 옵신 단백질은 이러한 많은 조직 내에서 발현되며 그 기능은 잘 알려져 있지 않습니다. 조직 내부의 광채도 광합성을 이해하는 데 중요합니다. 예를 들어, 대왕조개는 강하게 흡수하지만 조직 깊숙이 조밀한 조류 개체군을 유지합니다. 퇴적물 및 생물막과 같은 시스템을 통한 빛 전파는 복잡할 수 있으며 이러한 커뮤니티는 생태계 생산성에 주요 기여자가 될 수 있습니다. 따라서 생체 조직 내부의 이러한 현상을 더 잘 이해하기 위해 스칼라 방사 조도(점을 교차하는 광자 플럭스)와 하강 방사 조도(평면을 수직으로 가로지르는 광자 플럭스)를 측정하기 위한 광학 마이크로 프로브를 구성하는 방법이 개발되었습니다. 이 기술은 현장 실험실에서도 다루기 쉽습니다. 이 마이크로 프로브는 열로 당겨진 광섬유로 만들어지며 당겨진 유리 피펫에 고정됩니다. 프로브의 각도 수용을 변경하기 위해 이산화 티타늄과 혼합 된 UV 경화 에폭시의 10-100 μm 크기의 구를 당겨지고 다듬은 섬유의 끝에 고정합니다. 프로브는 생체 조직에 삽입되고 그 위치는 미세 조작기를 사용하여 제어됩니다. 이 프로브는 10-100 μm의 공간 분해능 또는 단일 세포 규모에서 현장 조직 복사도를 측정할 수 있습니다. 이 프로브는 살아있는 마우스의 피부 아래 4mm에 도달하는 지방과 뇌 세포에 도달하는 빛을 특성화하고 살아있는 조류가 풍부한 거대 조개 조직 내에서 비슷한 깊이에 도달하는 빛을 특성화하는 데 사용되었습니다.

Introduction

놀랍게도 육상 동물과 얕은 바다 생물은 시각 생리학과 광합성을 위해 몸 안에 충분한 빛을 가지고 있습니다. 예를 들어, 마우스 머리 중앙의 빛 수준(강한 헤모글로빈 흡광도 밴드 외부)은 외부 세계에 비해 3-4배 정도 감쇠됩니다. 이것은 대략 실내와 실외의 조도 차이입니다. 따라서 강한 산란으로 인한 조직 또는 재료의 불투명도는 강한 광 흡수로 인한 불투명도와 동일하지 않습니다. 빛은 세포와 입자가 고농축된 수생 시스템을 통해 전파되는 빛과 유사하게 강한 전방 산란 시스템에서 장거리로 계속 전파될 수 있습니다¹. 이 관찰은 옵신 단백질이 모든 동물의 모든 조직에서 거의 유비쿼터스하게 발현된다는 사실에 비추어 특히 두드러집니다. 따라서 생체 조직 내에서 빛이 어떻게 그리고 어디서 감쇠되고 산란되는지 이해하는 것이 중요합니다. 그러나 수생 시스템과 달리 살아있는 조직이있는 경우 기기를 물기둥에 담그고 방사도 및 방사 조도 측정을 얻는 것이 불가능하며 새로운 기술이 필요합니다.

생체 조직의 흡수 및 산란 특성을 특성화하기 위해 이전에 사용된 다른 방법으로는 조직 반사율 프로브 및/또는 적분구(2, ³) 측정, 주사 공초점 현미경(scanning confocal microscopy)⁴과 같은 현미경적 방법, 표면⁽5)에서 레이저 광의 확산 측정^, 몬테카를로 복사 전사⁽Monte Carlo radiative transfer⁾⁶와 같은 모델링 기술이 있다. 언급된 실험 방법은 종종 구체적이고 크고 값비싼 장비 또는 조직 구조에 대한 자세한 지식이 필요하며 일반적으로 조직 내 깊은 곳에서 빛의 공간 구조를 특성화하는 능력이 제한적입니다.

피하 주사 바늘을 사용하여 조직을 통해 광섬유를 삽입하는 유사한 프로브 기반 방법도 있습니다 ^7,8,9. 우리의 경험에 따르면 수정된 바늘은 조직에 구멍을 뚫는 데 효과적이지만 상당한 힘이 필요하며 일반적으로 조밀하게 채워진 세포를 통과할 때 섬세한 조직을 찢습니다. 따라서 이러한 바늘은 일반적으로 조직층에 밀리미터 이상을 삽입하는 외과적 절차가 필요합니다. 여기에 설명 된 방법은 윤활 처리 된 당겨진 유리 지지체를 사용하여 조직의 상처를 최소화하고 추가 수술없이 세포 사이를 미끄러질 수 있습니다.

이 원고는 조밀한 조직 깊숙이 탐사하고 현장에서 구성 및 사용할 수 있는 유리지지 광학 마이크로프로브와 휴대용 전자 장치를 사용하여 조류 매트^10,11 내의 빛을 측정하는 Jorgenson과 동료들의 작업에서 영감을 받은 방법을 제시합니다. 이 프로브는 높은 공간 분해능에서 생체 조직 내부의 스칼라 복사 조도(모든 방향에서 한 점에 부딪히는 빛)와 하강 조도(수평면과 교차하는 빛)를 특성화하도록 구성할 수 있습니다. 이 탐침은 원래 광생물 거대 조개¹²의 조직 내에서 복사 전달을 측정하기 위해 개발되었습니다. 전체 조직의 흡수 및 투과에 대한 표준 측정은 조직의 광합성 성능을 특성화하기에 충분하지 않았는데, 이는 모든 입사광이 조직 표면에서 높은 강도를 경험하는 소수의 세포에 의해 흡수되는지 또는 조직의 부피 전체에 걸쳐 낮은 강도를 경험하는 많은 세포에 의해 흡수되는지 여부에 큰 차이를 만들기 때문입니다. 두 번째 프로젝트에서, 이 탐침은 마우스의 뇌 내에서 생체 내 방사 조도를 측정하는 데 사용되었으며(^13,14), 따라서 뇌 깊숙이 발현되는 옵신의 빛 환경을 특성화했습니다. 이 마이크로 프로브는 모든 털, 피부 및 뼈가 손상되지 않은 상태에서 마우스 뇌 조직 내의 조도를 측정할 수 있을 만큼 작고 민감하며 생리학적 빛 수준이 심부 뇌 옵신을 자극할 만큼 충분히 높다는 것을 보여줍니다.

이 마이크로 광학 프로브 및 측정 설정은 특히 광합성 또는 눈 밖에서 발현되는 시각 색소의 기능에 대한 보다 미묘한 이해를 위해 생물학적 조직 내부의 빛을 정량화하고 특성화해야 하는 연구자에게 유용할 수 있습니다. 이 방법은 단독으로 또는 다른 기술과 함께 사용하여 저렴한 비용으로 생체 조직 내의 광학적 특성과 빛 전파를 완전히 특성화할 수 있으며, 사내에 내장된 소형 휴대용 장비와 작업에 따라 조정 가능한 매개변수를 사용할 수 있습니다.

Protocol

이 연구는 척추동물 및 무척추동물 연구에 관한 Yale University의 모든 관련 윤리 규정을 준수합니다.

1. 광학 마이크로 프로브 제작

1. 유리 슬리브 제작, 재질: 파스퇴르 피펫, 5.75인치( 재료 표 참조)
   1. 장착 가능한 앨리게이터 클립(재료 표)을 사용하여 테이퍼진 끝이 바닥을 향하고 피펫의 방향이 바닥에 수직이 되도록 넓은 끝으로 유리 피펫을 장착합니다.
   2. 50g의 플라스틱 바이스 그립(재료 표)을 피펫의 테이퍼 끝에서 걸어 놓습니다. 미끄러짐을 방지하기 위해 피펫과 바이스 그립 사이에 전기 테이프 패드를 놓습니다.
   3. 작은 부탄 토치(Table of Materials)를 사용하여 피펫의 테이퍼진 끝을 가열합니다. 바이스 그립보다 1cm 위에 화염을 가합니다. 불꽃의 가장 밝은 부분이 유리에서 3cm 떨어져 있고 유리가 불꽃 끝에 오도록 횃불을 잡습니다. 피펫의 길이가 약 5인치 증가하면 즉시 불을 제거하십시오.
   4. 작은 가위나 유리 절단기를 사용하여 새 당겨진 직경이 다음 섹션에서 사용된 광섬유의 약 두 배가 되는 지점에서 피펫의 당겨진 끝을 다듬습니다(1.2단계 참조). file 카보런덤 종이(재료 표)를 사용하여 손질된 끝의 날카로운 부분을 정리합니다. 이소프로필 알코올을 분출한 후 압축 공기를 사용하여 생성된 작은 유리 파편이나 먼지를 헹굽니다.
2. 광섬유 당기기(그림 1D)
   1. 면도날을 사용하여 광섬유를 절단하고 직경 200μm의 SMA 종단 광섬유의 SMA 커넥터 1개를 제거합니다(재료 표). SMA 종단 중 하나에 가깝게 잘라냅니다. 그런 다음 면도날을 사용하여 다음 5cm의 플라스틱 및 유리 섬유 재킷을 제거하여 노출된 광섬유가 노출되고 손상되지 않은 어셈블리의 나머지 부분에서 돌출되도록 합니다.
   2. 부탄 토치를 사용하여 유리 섬유에서 폴리이미드 폴리머 코팅을 태웁니다. 이소프로판올로 헹굽니다. 보푸라기가 없는 물티슈를 사용하여 노출된 유리 섬유를 깨끗이 닦습니다.
   3. 다음 단계는 화염으로 당길 수 있도록 베어 파이버를 장착하는 것입니다. 광섬유의 맨 끝을 플라이어 cl에 직접 장착amp (재료 표) 테이블이나 선반 가장자리에 SMA 종단 섬유의 끝이 바닥을 향하도록 합니다. 두 개의 작은 cl 형태로 당기기 위한 추를 추가합니다.amps(총 중량: 10g) 베어 광섬유가 플라이어 클램프에 고정되어 있는 곳에서 약 12인치 아래로 파이버의 재킷 끝에 있습니다.
   4. 섬유를 당기려면 부탄 토치 불꽃을 켠 상태에서 시작하십시오. 화염을 켠 상태에서 부탄 토치를 베어 파이버에서 1cm 떨어진 곳에 잡고 화염이 광섬유에 수직이 되도록 하고 플라이어 클램프가 베어 파이버를 고정하는 위치에서 수직으로 3cm 아래로 내려갑니다. 섬유가 늘어나고, 당기고, 분리되고, 바닥에 떨어지도록 합니다.
   5. 그 결과 당겨진 광섬유 끝을 검사합니다. 카보런덤 종이로 불규칙한 부분을 부드럽게 사포질하고 이소프로필 알코올과 보푸라기가 없는 물티슈로 닦고 압축 공기로 건조시킵니다.
      참고: 이 시점에서 현미경을 사용하여 당겨진 섬유의 크기와 모양을 특성화하고 문서화할 수 있습니다.
   6. 필름 불투명 펜을 사용하여 섬유의 측면을 어둡게 하고 미광의 유입을 방지합니다(재료 표). 펜 끝을 가로질러 섬유를 부드럽게 잡아당겨 끝의 작은 부분만 덮지 않은 상태로 둡니다.
3. 당겨진 섬유를 유리 피펫 슬리브 내부에 장착(그림 1A)
   1. 실체현미경으로 작업하면서 1.2단계의 테이퍼형 광섬유를 1.1단계의 변경된 유리 피펫의 넓은 끝에 조심스럽게 삽입하고 피펫의 테이퍼형 끝에서 ~1mm의 노출된 섬유가 튀어나올 때까지 광섬유를 밀어 넣습니다.
   2. 전기 테이프를 사용하여 광섬유의 재킷 끝을 피펫의 넓은 끝에 고정합니다.
   3. 시아노아크릴레이트 접착제 한 방울을 작은 게이지 바늘에 떨어뜨립니다(재료 표). 당겨진 섬유의 맨 끝을 피하면서 당겨진 피펫의 절단 가장자리에 접착제 방울을 조심스럽게 만집니다.
   4. 모세관 작용으로 접착제가 피펫 안으로 흡수되어 피펫 벽과 광섬유 사이의 영역을 적십니다. 프로브 어셈블리를 이동하기 전에 접착제가 최소 15분 동안 경화되도록 합니다.
4. 산란 구로 섬유 팁 수정(그림 1C)
   1. UV 경화형 접착제 한 방울과 이산화티타늄 분말(재료 표)을 ~1:1 v/v로 혼합하여 산란 볼 팁의 원료를 만듭니다.
   2. 프로브가 수평 방향이 되도록 장착 막대 홀더(재료 표)가 있는 미세 매니퓰레이터에 프로브를 부착합니다. 접착제 방울이 형성되도록 위에서 준비한 접착제/_TiO2 혼합물에 와이어 또는 바늘의 끝을 담그면 산란 재료의 작업 저장소를 준비합니다. 수평 프로브 끝 근처에 물방울이 있는 와이어나 바늘을 장착합니다. 벤치에 장착 된 악어 클립을 사용하여이 작업을 수행하는 것이 편리합니다.
   3. 프로브 끝에 산란 구를 증착합니다. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 프로브의 광섬유 끝을 접착제/TiO₂ 방울에 천천히 조심스럽게 밀어 넣습니다. 그런 다음 접착제에서 팁을 빠르게 빼냅니다. 원하는 크기의 구형 접착제 방울이 광섬유 끝에 증착될 때까지 두세 번 반복합니다.
      참고: 산란 구체는 테이퍼 형 광섬유의 직경보다 2 배에서 8 배 더 큰 직경에서 안정적입니다. 최종 최적 크기는 최종 원하는 응용 프로그램에 따라 다릅니다.
   4. 광섬유의 SMA 종단 끝단을 광섬유 결합 UV 광원에 연결하여 구를 경화합니다(재료 표).
      참고: 이 연구에 사용된 광원의 전력은 5.3mW였습니다. 이 전력에서 권장 경화 시간은 최소 12시간 또는 하룻밤입니다. 경화 후 최종 광학 프로브 팁의 크기를 특성화하고 측정하기에 좋은 시기입니다.

2. 광학 측정을 위한 조직 준비 및 장착(그림 2 및 그림 3)

1. 실험을 위해 샘플을 장착하기 위해 접시를 준비합니다. 부탄 토치를 사용하여 파스퇴르 피펫의 큰 끝을 가열하여 펀치를 만들어 35mm x 10mm 플라스틱 페트리 접시 바닥에 있는 직경 0.5cm의 구멍을 녹입니다. 접시 바닥면의 구멍을 전기 테이프 또는 실험실 테이프로 밀봉하십시오. 효율성을 위해 한 번에 여러 개를 만드십시오.
2. 포장의 지침에 따라 액체 젤라틴(재료 표)을 준비하십시오.
   알림: 화학 등급 젤라틴은 식품보다 광학적으로 덜 투명하고 기계적으로 덜 신뢰할 수 있기 때문에 식료품점에서 판매하는 상업용 식품 등급의 무향 젤라틴이 화학 공급업체의 화학 등급 젤라틴보다 이러한 목적에 더 좋습니다.
3. 사용할 조직의 해부 및 준비를 수행하십시오.
   참고: 경험에 비추어 볼 때 최대 1cm 두께의 편평한 조직은 관심 시스템에 적합한 해부 기술을 사용하여 이 실험에서 성공적으로 측정할 수 있습니다. 거대 조개 조직의 경우, 실험¹²에 사용하기 위해 평평하고 규칙적인 원형의 조개 조직을 만들기 위해 8mm 생검 펀치를 사용했습니다. 이 시스템의 경우, 실험이 끝날 때 샘플이 여전히 실제와 같은 상태인지 확인하기 위해 측정을 완료하는 데 필요한 시간이 주어지면 한 번에 하나의 샘플만 효과적으로 준비할 수 있습니다.
4. 2.1단계의 페트리 접시 2개를 액체 젤라틴으로 1/4 정도 채우고 겔화 직전에 실온(RT)으로 식힙니다. 한 접시에 접시 바닥의 구멍에 형성되는 점성 젤라틴 쿠션에 생검을 놓습니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 페트리 접시가 가득 찰 때까지 생검 주위에 RT 젤라틴을 부드럽게 추가합니다(그림 3). 두 번째 접시에 젤라틴을 채워 빈 샘플을 만듭니다.
5. 젤라틴이 완전히 경화되고 만졌을 때 약간 탄력이 생길 때까지 샘플 접시를 약 10-30분 동안 냉장고에 넣습니다.
   알림: 서늘한 방에서는 필요하지 않을 수 있습니다. 열대 지방에서 작업 할 때,이 단계는 젤라틴을 완전히 경화시키는 데 필요합니다.
6. 미세 매니퓰레이터에서 페트리 접시 마운트 만들기(그림 2)
   1. 6cm x 6cm 정사각형의 1/4 두께의 플렉시 유리를 자릅니다 (재료 표).
   2. 페트리 접시와 같은 직경(~35mm)의 플라스틱 사각형에 구멍을 뚫거나 녹입니다. 페트리 접시가 이 구멍에 꼭 맞고 마찰을 일으키며 제자리에 고정되었는지 확인하십시오. 접시 가장자리에 테이프를 추가하여 크기와 마찰 접촉을 약간 늘립니다.
   3. 플라스틱 사각형 모서리에 직경 1/4의 구멍을 뚫거나 녹입니다. 이 구멍을 사용하여 1/4인치 나사와 볼트를 사용하여 정사각형을 마이크로 매니퓰레이터에 부착합니다.
   4. 플라스틱 사각형을 검은색 전기 테이프로 덮어 프로브에 도달하는 미광을 줄입니다. 마찬가지로 테이프를 사용하여 삽입된 접시의 바닥 아래로 확장되는 사각형의 측면(>10mm) 주위에 스커트를 만들어 미광을 줄입니다(그림 2B).
   5. 볼트와 적절한 하드웨어를 사용하여 페트리 접시 홀더를 미세 매니퓰레이터에 부착하여 샘플의 두께보다 큰 범위에서 3차원 조정 및 잘 해결된 수직 이동을 허용합니다( 재료 표 에 언급된 매니퓰레이터의 파트 1 및 파트 2가 좋은 예입니다). 이 마이크로 매니퓰레이터를 광학 브레드 보드에 부착합니다.

3. 조직 생검을 위한 측정 설정

1. 샘플이 배치될 평면에 도달할 때 빛이 시준되도록 측정이 이루어지는 영역 위에 광원을 장착합니다(그림 2A). 예를 들어, 5cm 시준 렌즈(재료 표)를 5mm 액체 라이트 가이드(재료 표)에 부착하고 광학 브레드 보드에 부착된 바이스 및 프레임을 사용하여 샘플 위로 >0.6m 들어 올립니다(재료 표). 그런 다음 Light Guide를 재료 표에 나열된 플라즈마 광원과 같은 광대역 광원에 연결합니다.
2. 광원을 가리키도록 프로브를 수직 방향 마운트에 부착합니다. cl로 프로브 고정amps, 호스 clamps 또는 테이프를 광학 테이블 포스트에 연결합니다.
   참고: 대왕조개 실험에서는 재료 표에 나열된 미세 조작기와 같이 특별히 설계된 막대 홀더가 사용됩니다. 이 작업에서, 광학 브레드보드(Table of Materials)에 자석에 의해 고정되었다. 매니퓰레이터에 프로브와 샘플을 모두 장착하여 얻을 수 있는 정렬을 위한 추가 자유도는 편리하지만 필수는 아닙니다. 오버 CL이 되지 않도록 주의하십시오.amp 피펫 하우징이 파손될 수 있으므로 포스트에.
3. 수직으로 장착된 프로브 근처에 샘플 매니퓰레이터를 배치합니다. 샘플 매니퓰레이터를 사용하여 s의 위치를 조정합니다.amp프로브가 페트리 접시 바닥의 0.5cm 구멍 중앙에 오도록 stag이자형. 장착된 프로브의 끝을 만지거나 부딪히지 않도록 각별히 주의하십시오.
   참고: 샘플 영역 위에 위치한 붐 장착형 실체현미경이 유용할 수 있습니다. 이러한 방식으로 실험을 시작하기 전에 프로브 팁, 스테이지 및 샘플의 하향식 정렬을 볼 수 있습니다(그림 2A).
4. 프로브 광섬유의 SMA 종단 끝을 USB 광섬유 분광계(재료 표)에 연결하고 USB 케이블을 사용하여 분광계를 컴퓨터에 연결합니다.

4. 데이터 수집

1. 실험 설정
   1. 프로브와 매니퓰레이터를 3.4단계에서와 같이 데이터가 수집될 정확한 정렬 위치에 놓으십시오.
   2. 면봉이나 미세 바늘을 사용하여 조직에 삽입될 프로브 부분에 소량의 실리콘 윤활제(재료 표)를 조심스럽게 도포하여 프로브 측면과 조직 사이의 마찰을 낮춥니다.amp르. 각 기준선 또는 조직 측정 전에 실리콘 윤활제를 다시 바르십시오.
   3. 빈 샘플 페트리 접시의 구멍을 덮고 있는 테이프를 제거하고 샘플 홀더(2.7단계)에 넣고 마찰에 의해 제자리에 단단히 고정되었는지 확인합니다.
   4. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 샘플을 프로브 위로 내립니다. 프로브가 페트리 접시 밑면에 있는 구멍을 통해 젤라틴에 들어가도록 합니다. 프로브가 젤라틴 층의 바닥에서 약 5mm가 될 때까지 계속합니다.
   5. 광원을 켭니다. 분광계 소프트웨어를 사용하여 신호가 가능한 한 높지만 포화되지 않을 때까지 분광계 통합 시간을 조정합니다. 평균 스캔 수를 2에서 5 사이로 설정하고 스무딩 픽셀 값을 6으로 설정합니다. 이 단계에서 사용 가능한 통합 시간은 이 기준선에 대해 1-50ms 사이일 수 있습니다.
2. 기준 스펙트럼 수집
   1. 어두운 측정값을 수집합니다.
      1. 분광계 매개변수가 블랭크 샘플로 설정되면 분광계에서 프로브 광섬유를 분리하고 분광계와 함께 제공된 불투명 금속 덮개로 포트를 덮습니다.
      2. 분광계에서 어두운 측정값을 얻고(종종 GUI의 어두운 전구 아이콘 사용) 입력 조명이 없는 분광계의 노이즈를 특성화합니다. 데이터 수집 전략에 따라 이 측정값을 저장합니다.
   2. 램프 측정값을 수집합니다. 프로브 광섬유를 분광계에 다시 연결하고 신호가 안정화될 때까지 기다렸다가 다른 스펙트럼을 획득합니다. 이 측정은 조직이 없을 때 젤라틴을 통해 프로브에 도달하는 빛을 특성화합니다.
3. 조직 스펙트럼 수집
   1. 샘플 페트리 접시 바닥에 있는 테이프를 제거하고 샘플 홀더에 넣습니다.
   2. 조직 생검이 프로브 끝 위의 중앙에 오도록 3차원 조작을 사용하여 샘플 접시를 프로브와 정렬합니다.
   3. 프로브에 실리콘 젤을 바르고(4.1.2 참조) 프로브 팁이 조직 샘플을 지지하는 젤라틴을 통과하고 조직 샘플에 막 들어갈 때까지 샘플을 프로브 위로 천천히 내립니다.
      알림: 일부 분광계 및 컴퓨터 프로그램을 사용하면 감지된 빛을 실시간으로 모니터링할 수 있습니다. 이를 사용하여 프로브가 조직에 들어가는 시기를 결정합니다. 스펙트럼 강도는 프로브 팁이 조직과 직접 접촉하자마자 갑자기 감소합니다.
   4. 측정된 스펙트럼이 너무 잡음이 많거나 포화되지 않는지 확인하여 적분 시간이 측정에 적합한지 확인합니다. 필요한 경우 통합 시간을 변경합니다.
      1. 통합 시간이 조정될 때마다 새로운 어두운 측정을 수행하고 저장합니다(4.2.1단계). 평균 스캔 수 또는 평활화된 픽셀 수를 변경하지 마십시오.
      2. 적절한 측정 파라미터를 찾은 후 측정을 수행하고 스펙트럼을 저장합니다.
   5. 미세 매니퓰레이터를 사용하여 샘플을 지정된 거리 아래로 이동합니다. 이 연구에 사용된 매니퓰레이터의 경우 각 작은 눈금 표시는 0.001인치 또는 25.4μm였습니다. 샘플은 각 측정에 대해 5개의 눈금 표시 또는 127μm를 통해 아래로 이동되었습니다. 4.3.4단계를 반복합니다.
   6. 조직 내의 각 수직 위치에서 스펙트럼을 계속 저장합니다.
      참고: 여기에 설명된 시스템의 경우 단일 조직 샘플 내에서 측정하기 위해 필요한 통합 시간이 1ms에서 5초 사이로 다양했습니다. 결국 프로브 팁은 조직의 상단을 빠져나와 그곳에서 볼 수 있습니다(그림 4A). 이것은 최종 측정이며 조직 상단에서 입사되는 빛을 특성화합니다.
4. 데이터 로드 및 처리
   1. 분광계의 소프트웨어를 사용하여 수집된 모든 스펙트럼(다크 스펙트럼, 램프 스펙트럼 및 조직 측정)을 구분된 텍스트 파일로 변환합니다.
   2. Matlab 또는 선택한 코딩 언어를 사용하여 샘플에 대한 모든 측정 파일을 로드합니다. 각 조직 측정 스펙트럼에 대해 일치하는 통합 시간으로 어두운 스펙트럼을 뺀 다음 통합 시간으로 나눕니다.
      참고: 이 연구에서는 데이터를 로드하고 처리하기 위해 Matlab 스크립트를 사용했습니다(보충 파일 1).
   3. 조직 내부의 프로브로 얻은 스펙트럼을 빈 젤라틴에서 얻은 기준선 스펙트럼으로 나누어 조직의 각 위치에 도달하는 입사광의 백분율을 계산합니다.
      알림: 조직 상단의 측정(4.3.6단계)은 젤라틴의 기준선 측정(4.1단계)과 매우 유사해야 하며 나누었을 때 100%에 가까워야 합니다. 실험 상황에 따라 램프 스펙트럼(빈 젤라틴의 스펙트럼 또는 조직 맨 위의 스펙트럼)을 참조로 사용할 수 있습니다. 그러나 실험을 시작하기 전에 램프 스펙트럼을 수집하는 것이 여전히 중요합니다. 이는 프로브가 파손되거나 실험이 조직의 상단에 도달하기 전에 실패하는 경우 실패 전에 얻은 데이터를 계속 사용할 수 있기 때문에 해당 초기 램프 기준 스펙트럼이 없는 경우에는 그렇지 않습니다.
   4. 데이터를 시각화합니다. 등고선도가 도움이 될 수 있습니다(그림 4B).

Representative Results

이 프로토콜은 하강 조도(한 방향에서 한 지점에 도달하는 빛)를 측정하는 데 사용할 수 있는 마이크로 광학 프로브를 구성하거나 광 산란 구형 팁을 추가하여 스칼라 복사 조도(모든 방향에서 한 지점에 도달하는 빛)를 측정하는 절차를 설명합니다. 이 프로브는 살아있는 조직 내부의 단일 세포 길이 척도에 접근하는 공간 분해능에서 방사 조도를 측정할 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 기술된 프로브를 사용하여 조도 측정을 위한 조직 샘플을 제조하기 위한 대표적인 방법 및 데이터 보기 및 분석을 위한 대표적인 방법을 설명한다.

그림 1 은 마이크로 프로브 생산의 출력을 보여줍니다. 잡아당길 때 광섬유는 약 3cm 정도 가늘어져야 하며 테이퍼를 따라 흠집이 없어야 합니다. 또한 끝이 평평해야 하며 직경이 15-30μm여야 합니다(그림 1D). 팁의 평탄도는 카보 런덤 종이로 끝을 샌딩하거나 점수를 매기고 다시 부수어 향상시킬 수 있습니다. 마찬가지로, 섬유의 하우징으로 사용되는 당겨진 유리 피펫은 날카롭거나 부러진 모서리가 없어야 합니다. 산란 볼이 섬유의 평평하고 절단된 팁의 끝에 형성되면 구형이어야 합니다(그림 1C). 경화하기 전에 모체 접착제 방울에 볼을 삽입하고 섬유를 빠르게 빼내는 또 다른 라운드로 기형을 제거할 수 있습니다. 빠른 이동 속도는 섬유 끝에서 접착제 공을 당깁니다. 움직임이 느려지면 섬유에 접착제가 추가로 형성됩니다. 섬유가 광원에 부착된 상태에서 해부 현미경을 사용하여 공정을 관찰하면 작업을 시각화하고 공정이 작동하는지 판단하는 데 도움이 됩니다. 산란 접착제를 바르기 전에 접착제와 전기 테이프로 유리 피펫 내부의 섬유를 고정하는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면 섬유가 끊어지거나 접착제가 이동하는 섬유로 번질 수 있습니다(그림 1).

도 2 는 측정 장치를 나타낸다. 이 예에서 조직 샘플과 프로브의 홀더는 모두 3차원으로 조정할 수 있습니다(그림 2). 샘플과 프로브를 매니퓰레이터에 부착하면 정렬에 도움이 되지만 필수는 아닙니다. 프로브는 고정 된 기둥에 부착 될 수 있습니다. 매니퓰레이터의 가장 분해된 움직임은 조직 내 위치 및/또는 프로브의 움직임 정도를 정확하게 결정할 수 있도록 수직 z 방향으로 배향되어야 합니다(그림 2A). 붐 장착형 실체현미경은 접안렌즈를 통해 스테이지, 프로브 및 샘플을 볼 수 있도록 배치하여 스테이지, 접시 및 샘플과 프로브의 정렬을 확인할 때 유용할 수 있습니다(그림 2B). 프로브에 의해 측정된 스펙트럼이 갑자기 변경되면 샘플이 고도로 산란되거나 흡수되는 조직 내부에 성공적으로 위치하거나 프로브가 구부러지거나 파손되고 있음을 시사하기 때문에 샘플을 프로브 위로 낮추면서 실시간으로 스펙트럼을 관찰하는 것이 도움이 됩니다. 스펙트럼의 모양과 강도의 급격한 변화는 조직 입구를 나타낼 가능성이 높으며, 모양 변화 없이 급격한 강도 변화는 프로브가 구부러지거나 파손되고 있음을 나타냅니다. 조개 조직의 상단에는 프로브가 깨지지 않고 침투할 수 없는 얇고 투명한 막이 있습니다. 이와 같은 경우 조직의 상단을 모니터링하여 프로브가 빠져 나가려고 할 때를 확인하고 프로브가 파손되지 않도록 해당 지점에서 측정을 중지해야합니다.

도 3 은 섹션 2에 기술된 바와 같이, 젤라틴의 페트리 접시에 매립된 조직 생검 샘플을 보여준다. 페트리 접시 바닥에는 광학 프로브가 아래에서 조직으로 삽입될 수 있도록 구멍이 있습니다. 생검은 직경이 8mm이고 페트리 접시의 구멍 중앙에 있습니다(그림 3A). 조직 샘플 아래에는 소량의 젤라틴이 있고 젤라틴은 조직 위의 접시 상단에 채워져 있습니다(그림 3B).

도 4A는 이의 프로브가 조직의 상부에서 빠져나가기 시작할 때를 보여주고, 도 4B는 대표적인 데이터를 나타낸다. Matlab 스크립트(보충 파일 2)는 그림 4B의 트레이스를 생성하는 데 사용되었습니다. x축은 파장이고 y축은 기준선 스펙트럼에 대한 조직 깊이에서 빛의 백분율입니다. 조직 깊이에 대한 개별 측정은 그레이 스케일 색상의 선으로 표시됩니다. 조직 깊숙이 측정한 값은 더 어두운 선으로 표시됩니다. 기준선 스펙트럼은 젤라틴 전용 샘플의 측정이며 램프와 램프에 대한 프로브의 반응을 특성화하는 데 사용됩니다. 젤라틴은 약간의 흡수와 산란을 가지고 있어 파장에 대한 젤라틴 흡수 신호가 완전히 평평하지 않습니다. 그러므로, 조직 전체에 걸쳐 취해진 스펙트럼은 젤라틴에 있는 프로브의 스펙트럼에 의해 또는 조직의 상단에 있는 프로브의 스펙트럼에 의해 분할되어, 그림 4B에 도시된 스펙트럼 데이터가 조직 샘플에 대한 빛의 백분율만을 나타내고, 따라서, 광원과 무관하다, 젤라틴, 및 각 개별 프로브의 특성.

그림 1: 미세 광학 조직 내 방사선 측정 프로브의 제조 단계 . (A) 광학 프로브의 개략도. (B) 완성된 광학 프로브의 모습. (C) 유리 피펫 지지대 내부의 당겨진 광섬유에 부착된 산란 구의 클로즈업. (D) 당겨지고 청소된 광섬유. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 조직 내부의 스칼라 방사 조도를 측정하기 위한 실험 설정의 이미지 및 다이어그램. (A) 실험 설정의 전체 개략도 및 이미지. (B) 샘플 페트리 접시 홀더의 클로즈업. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 조개 조직 생검. (A) 상단 및 (B) 젤라틴으로 채워진 변경된 페트리 접시에서 측정할 준비가 된 조개 조직 생검의 측면도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 대표 데이터 . (A) 프로브가 조직을 통해 올라올 때 어떻게 보이는지에 대한 현미경 이미지. (B) 조직 내 방사선 측정 프로브로 얻은 대표적인 데이터. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1: 데이터를 로드하고 처리하는 데 사용되는 Matlab 스크립트입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 2: 그림 4B에서 추적을 생성하는 데 사용된 Matlab 스크립트. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

이 프로토콜은 대략 단일 세포 규모의 공간 분해능을 가진 대량의 생체 조직을 통해 광학 환경을 체계적으로 특성화하는 기술을 설명합니다. 이 저렴하고 유연하며 다루기 쉬운 방법은 살아있는 시스템 내에서 빛의 전파를 연구하는 모든 연구자에게 유용 할 수 있습니다. 경험에 비추어 볼 때, 기존의 방법⁷과 비교했을 때, 이러한 프로브는 구축에 약간의 연습과 기술이 필요하지만 조직 손상이 적고 더 많은 양의 조밀한 조직을 보다 포괄적으로 특성화할 수 있습니다.

이 방법은 네 부분으로 구성됩니다. 프로브 제작의 첫 번째 부분은 이전 장치 설계^10,11에서 영감을 받았습니다. 현재의 접근법은 당겨진 유리 바늘이 세포 사이를 부드럽게 미끄러질 수 있기 때문에 두꺼운 조직 전체를 체계적이고 덜 파괴적인 스캔을 위해 개발되었습니다. 또한 현장 실험실^12,13,14에서 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 다운웰링 조도를 측정하기 위한 ~20μm 직경의 팁과 스칼라 방사 조도를 측정하기 위한 50-100μm 직경의 산란 구(옵션)가 있는 프로브를 생성합니다. 더 크거나 더 작은 스칼라 방사 조도 구체는 사용 된 재료, 예를 들어 초기 점도가 다른 UV 경화형 접착제를 수정하여 개발할 수 있습니다. 피펫 풀링과 섬유 공정 모두에서 무게를 조정하여 테이퍼를 더 많거나 적게 만들 수 있습니다. 가열 속도는 또한 당기는 과정과 결과 테이퍼를 조정하기 위해 토치 불꽃으로부터의 거리를 통해 수정될 수 있습니다.

프로브 구성 기술은 완벽하기 위해 약간의 수동 기술과 시행착오가 필요하지만 연습을 통해 신뢰할 수 있고 빨라질 수 있습니다. 여기에서는 시간이 지남에 따라 개발 된 몇 가지 문제 해결 뉘앙스가 제시됩니다. 재킷 끝에서 광섬유를 아래로 당기면 더 일관된 테이퍼가 생성됩니다. 구형 산란 팁을 추가하기 전에 불투명 펜을 적용하는 것이 중요한데, 이는 불투명 잉크의 습윤 특성이 섬유 팁에서 깔끔한 접착제 볼의 형성에 유리하게 영향을 미치기 때문입니다. 결과 접착 볼이 기형인 경우 볼을 잡아당겨 다시 시도할 수 있습니다. 이를 위해 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 전체 볼을 접착 저장소로 밀어 넣은 다음 매우 천천히 빼낼 수 있습니다. 이것은 일반적으로 첫 번째 기형 시도를 해제하여 접착 저장소에 남겨두고 다시 시도할 수 있도록 합니다.

주의해서 처리하면 이러한 프로브를 다른 샘플에 반복적으로 사용할 수 있습니다. 가장 큰 위험은 프로브 팁을 이동하는 동안 실수로 무언가에 부딪히는 것입니다. 측정 사이에 이소프로필 알코올과 압축 공기를 사용하여 세포 파편을 청소해야 합니다. 프로브 팁이 아무 것도 건드리지 않고 유리 슬리브 내부에 프로브를 고정하는 테이프와 접착제를 분리할 수 있는 광섬유 어셈블리에 힘이 가해지지 않는 한 프로브를 몇 주 동안 보관할 수도 있습니다. 이것은 섬유와 유리 피펫을 높은 선반의 가장자리에 여러 곳에 고정하여 수행할 수 있습니다.

이 방법의 두 번째 및 세 번째 부분은 실험의 기계-광학적 측면과 측정을 위한 조직 고정을 포함합니다. 이 방법의 이 부분은 거대 조개 조직 내부의 조직 내 스칼라 방사 조도를 측정하기 위해 특별히 개발되었습니다(¹²). 여기서는 방법의 이러한 측면을 해결하기 위한 세부 정보를 제공합니다. 첫째, 생검은 프로브에 비해 커야 합니다. 이렇게 하면 프로브가 통과할 때 조직이 움직이는 것을 방지할 수 있습니다. 또한 조직은 측정 중에 조직을 제자리에 유지하기 위해 젤라틴의 탄성과 무게가 결합되도록 페트리 접시의 바닥에 위치해야 합니다. 또한 실험용 광원 아래에서 젤라틴을 탄성 있고 고체 상태로 유지할 수 있을 만큼 방이 충분히 차가워야 합니다. 마찬가지로 가시광선에 비해 발열이 비교적 적은 LED 또는 기타 광원을 사용하는 것이 도움이 됩니다.

이 방법의 기하학적 및 광기계적 매개변수는 매우 유연합니다. 예를 들어, 스칼라 방사 조도 프로브는 손상되지 않은 마우스의 뇌와 지방 조직 내부의 방사 조도를 측정하는 데 사용되었습니다^13,14. 이를 위해 프로브를 표준 설치류 정위 프레임의 매니퓰레이터에 장착하고 광원을 마우스의 연단을 향하도록 장착했습니다. 모든 지오메트리에서 이 방법을 성공적으로 사용하기 위한 핵심은 주어진 측정을 시작할 때 항상 적절한 램프 및 어두운 기준 스펙트럼을 수집하는 것입니다. 조직 측정 중에 프로브가 파손되고 조직이 제자리에 있지 않은 상태에서 초기 특성 분석이 이루어지지 않으면 데이터를 해석하기 어렵거나 불가능하며 새 프로브로 다시 시작해야 합니다. 반대로, 처음에 적절한 참조가 있으면 부분 측정이 사용 가능한 데이터입니다.

이 방법의 마지막 부분은 데이터 수집과 관련이 있습니다. 프로브의 신호를 모니터링하기 위한 광섬유 분광계의 사용에 대해 설명하며, 이는 SMA 결합의 용이성을 보장하고 완전한 스펙트럼 파장 정보를 제공합니다. 그러나 광자 플럭스가 낮은 시스템의 경우 이러한 프로브를 광전자 증배관 또는 애벌랜치 광다이오드에 결합하는 것도 가능합니다. 어떤 경우든 모든 검출기는 각각의 새로운 측정에 대해 기준 측정이 필요합니다. 그러므로, 설명된 데이터 수집 방법에 대한 약간의의 조정만으로, 모든 상이한 유형의 광학 파라미터들이 특성화될 수 있다.

이 방법의 향후 흥미로운 용도는 더 큰 포유류의 몸 깊숙한 곳과 다육 식물과 같은 복잡한 복사 전달 특성을 가진 식물 내에서 빛을 정량화하는 것일 수 있습니다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1" travel ball bearing center+D11+A2:D31+A2:A2:D31	Edmond Optics	37-935	Part 2 of manipulator for lowering sample
1/4" thick acrylic sheet	McMaster-Carr	8505K754	For making Petri dish holder
3/4" mini spring clamp	Anvil	99693	Use as weight for pulling optical fiber
8 mm biopsy punch	Fisher Scientific	NC9324386	For tissue sample
Butane Torch	McMaster-Carr	MT-51	Heat source for pulling fiber and pipette
Collimating lens	Thorlabs	LLG5A1-A	To collimate light source through liquid light guide
Compressed air	McMaster-Carr	7437K35	For drying pulled fiber and pipette
Cyanoacrylate glue - liquid	McMaster-Carr	66635A31	For securing tapered fiber end at top of pulled pipette
Electrical tape	McMaster-Carr	76455A21	For securing fiber in pipette and for adding grip to clamps
Fine grade carborundum paper	McMaster-Carr	4649A24	Small triangle on exacto knife holder works well
Gelatin	Knox	10043000048679	For securing the tissue biopsy in the petri dish
Glass Pasteur Pipete	Fisher Scientific	13-678-20B	Disposable glass pipette 5.75" in length
Insulin syringes, 31G needle	BD	320440	For applying glue
Isopropanol	McMaster-Carr	54845T42	For cleaning pulled fiber and pipette
Kimwipe	Cole-Parmer	SKU 33670-04	For wiping optical fiber and glass pipette clean
LED driver	Thorlabs	LEDD1B	For powering the UV LEDs
Light source for measurements	Cole-Parmer	UX-78905-05	Low heat white light source for measurements
Linear metric X-Y-Z axis rack and pinion stage	Edmond Optics	55-023	Part 1 of manipulator for lowering sample
Liquid light guide	Thorlabs	LLG5-4T	For light source in measurements
Magnetic feet	Siskiyou	MGB 8-32	For use with magnetic strips
Magnetic strips	Siskiyou	MS-6.0	For mounting magnetically to breadboard
Manipulator #1	Siskiyou	MX10R	4-axis manipulator with pipette holder
Opaquer pen, small	WindowTint	TOP01	For opaquing side of optical fiber to prevent stray light from enter probe
Optical breadboard	Edmond Optics	03-640	For stable affixation of probe holder, sample, microscope and light source
Optical fibers	Ocean Optics	P-100-2-UV-VIS	About 4 fibers are good to have
Plasma light source	Thorlabs	HPLS345	For tissue radiometry measurements
Plastic plier clamp	McMaster-Carr	5070A11	Plier clamp used for weight in pulling pipette
Polystyrene Petri dishes	Thomas scientific	3488N10	Sample holders, enough volume to hold sample thickness plus ~10 mm of gelatin on top
Razor blades	McMaster-Carr	3962A3	For stripping jacketing from optical fiber
Silicone oil lubricant	Thomas scientific	1232E30	For reducing friction between probe and tissue
Software for analyzing data	Matlab		Chosen software for data analysis
Spectrometer + spectrometer software	Avantes	AvaSpec-2048L	Spectrometer can be any brand, this one is compatible with sma-terminated optical fibers and comes with its own software for running the spectrometer
Titanium dioxide powder	Sigma Aldrich	718467-100G	For making scattering sphere
Toolour tabletop clip	Toolour	Toolour0004	For holding pipette while pulling and for holding finished probes
Trigger-action bar clamps	mcMaster-Carr	51755A2	Good for holding optical fibers while pulling or curing
UV curable adhesive	Delo Photobond	GB368	For making scattering sphere
UV light source	Thorlabs	M365FP1	Light source for curing adhesive in scattering ball, this one is sma-fiber compatible, higher intensity = less cure time
White LED light source	Thorlabs	MCWHF2	For characterizing pulled fiber and scattering sphere