Микрозонд внутритканевой радиометрии для измерения яркости in situ в живой ткани

Summary

В данной работе описан метод измерения яркости in situ в живой ткани. Эта работа включает в себя детали конструкции микромасштабных зондов для различных измерений яркости и освещенности, дает рекомендации по монтажу ткани для характеристики яркости и описывает вычислительные методы анализа полученных данных.

Abstract

Организмы кажутся непрозрачными в основном потому, что их внешние слои тканей сильно рассеиваются на падающий свет; Сильно поглощающие пигменты, такие как кровь, обычно имеют узкое поглощение, так что средний свободный путь света за пределами пиков поглощения может быть довольно длинным. Поскольку люди не могут видеть сквозь ткани, они обычно воображают, что такие ткани, как мозг, жир и кости, содержат мало света или вообще не содержат его. Однако фоточувствительные белки опсина экспрессируются во многих из этих тканей, и их функции плохо изучены. Внутреннее сияние ткани также важно для понимания фотосинтеза. Например, гигантские моллюски сильно поглощают, но сохраняют плотную популяцию водорослей глубоко в тканях. Распространение света через такие системы, как отложения и биопленки, может быть сложным, и эти сообщества могут вносить основной вклад в продуктивность экосистем. Поэтому был разработан метод построения оптических микрозондов для измерения скалярного излучения (поток фотонов, пересекающий точку) и нисходящего излучения (поток фотонов, пересекающий плоскость перпендикулярно), чтобы лучше понять эти явления внутри живой ткани. Этот метод также поддается лечению в полевых лабораториях. Эти микрозонды изготовлены из нагретых оптических волокон, которые затем закрепляются в стеклянных пипетках. Чтобы изменить угловую приемку зонда, сфера размером 10-100 мкм из УФ-отверждаемой эпоксидной смолы, смешанной с диоксидом титана, затем прикрепляется к концу вытянутого обрезанного волокна. Зонд вводится в живую ткань, а его положение контролируется с помощью микроманипулятора. Эти зонды способны измерять излучение тканей in situ с пространственным разрешением 10-100 мкм или в масштабе отдельных клеток. Эти зонды были использованы для характеристики света, достигающего жировых и мозговых клеток на 4 мм ниже кожи живой мыши, и для характеристики света, достигающего аналогичных глубин в живой ткани гигантского моллюска, богатой водорослями.

Introduction

Удивительно, но наземные животные и мелководные обитатели океана имеют достаточно света в своем теле для визуальной физиологии и даже фотосинтеза. Например, уровни освещенности в центре головы мыши (за пределами сильных полос поглощения гемоглобина) ослабляются на три-четыре порядка относительно внешнего мира. Это примерно разница между уровнями освещенности в помещении и на улице. Таким образом, непрозрачность ткани или материала из-за сильного рассеяния — это не то же самое, что непрозрачность из-за сильного поглощения света. Свет может продолжать распространяться на большие расстояния в системе с сильным прямым рассеянием, подобно свету, распространяющемуся через водные системы с высокой концентрацией клеток и частиц¹. Это наблюдение особенно заметно в свете того факта, что белки опсина почти повсеместно экспрессируются во всех тканях всех животных. Таким образом, важно понять, как и где свет ослабляется и рассеивается в живой ткани. Однако, в отличие от водных систем, с живой тканью невозможно погрузить прибор в толщу воды и получить измерения яркости и освещенности, и необходима новая техника.

Другие методы, ранее использовавшиеся для характеристики поглощающих и рассеивающих свойств живой ткани, включают измерение отражательной способности ткани и/или интегрирующие сферы^2,3, микроскопические методы, такие как сканирующая конфокальная микроскопия⁴, измерение диффузии лазерного света на поверхности⁵ и методы моделирования^, такие как перенос^{излучения Монте-Карло 6}. Упомянутые экспериментальные методы часто требуют специфического, большого и дорогостоящего оборудования или подробных знаний о структуре ткани и, как правило, ограничены в своей способности характеризовать пространственную структуру света глубоко внутри ткани.

Существуют также аналогичные методы, основанные на зондах, которые используют иглу для подкожных инъекций для введения оптического волокна через ткань ^7,8,9. По нашему опыту, модифицированные иглы эффективны при прокалывании тканей, но требуют значительного усилия и, как правило, разрывают нежные ткани при прохождении через плотно упакованные клетки. Поэтому эти иглы обычно требуют хирургической процедуры, чтобы вставить более миллиметра или около того в слой ткани. Описанный здесь способ с использованием смазанной, натянутой стеклянной опоры способен скользить между клетками с минимальным ранением тканей и без дополнительного хирургического вмешательства.

В этой рукописи представлен метод, вдохновленный работой Йоргенсона и его коллег по измерению света в водорослевых матах^10,11 с использованием оптических микрозондов на основе стекла и портативной электроники^, которые поддаются глубокому исследованию плотных тканей, а также созданию и использованию в полевых условиях. Эти зонды могут быть сконструированы для характеристики скалярного излучения (свет, падающий на точку со всех сторон) и нисходящего излучения (свет, пересекающий горизонтальную плоскость) внутри живой ткани с высоким пространственным разрешением. Эти зонды были первоначально разработаны для измерения переноса излучения в ткани фотосимбиотических гигантских моллюсков¹². Стандартных измерений поглощения и пропускания всей ткани было недостаточно для характеристики фотосинтетических характеристик ткани, поскольку имеет большое значение, поглощается ли весь падающий свет несколькими клетками, испытывающими высокую интенсивность на поверхности ткани, или многими клетками, испытывающими низкую интенсивность по всему объему ткани. Во втором проекте эти зонды использовались для измерения излучения in vivo в мозге мыши^13,14, тем самым характеризуя световую среду опсинов^, экспрессируемых глубоко в мозге. Эти микрозонды одновременно малы и достаточно чувствительны, чтобы измерить излучение в ткани мозга мыши со всем неповрежденным мехом, кожей и костями и продемонстрировать, что физиологические уровни освещенности достаточно высоки, чтобы стимулировать опсины глубокого мозга.

Этот микрооптический зонд и измерительная установка могут быть полезны исследователям, нуждающимся в количественной оценке и характеристике света внутри биологической ткани, особенно для более тонкого понимания фотосинтеза или функций зрительных пигментов, экспрессируемых вне глаз. Этот метод может быть использован отдельно или в сочетании с другими методами для полной характеристики оптических свойств и распространения света в живой ткани при низких затратах, с небольшим портативным оборудованием, встроенным в дом, и с регулируемыми параметрами, зависящими от задачи.

Protocol

Это исследование соответствует всем соответствующим этическим нормам Йельского университета в отношении исследований позвоночных и беспозвоночных животных.

1. Создание оптического микрозонда

1. Сборка стеклянной втулки, материал: пипетка Пастера, 5,75 дюйма (см. Таблицу материалов)
   1. Используя монтируемый зажим типа «крокодил» (Таблица материалов), установите стеклянную пипетку за широкий конец так, чтобы конический конец был обращен вниз к полу, а ориентация пипетки была перпендикулярна полу.
   2. Повесьте пластиковые тиски весом 50 г (Таблица материалов) на конический конец пипетки. Поместите прокладку изоленты между пипеткой и тисками, чтобы предотвратить соскальзывание.
   3. Нагрейте конический конец пипетки с помощью небольшой бутановой горелки (Таблица материалов). Приложите пламя на 1 см выше тиски. Держите факел так, чтобы самая яркая часть пламени находилась на расстоянии 3 см от стекла, а стекло находилось на кончике пламени. Когда длина пипетки увеличится примерно на 5 дюймов, немедленно удалите пламя.
   4. Маленькими ножницами или стеклорезом обрежьте вытянутый конец пипетки в точке, где новый диаметр вытягивания примерно в два раза больше, чем у оптического волокна, используемого в следующем разделе (см. шаг 1.2). Подпилите все острые участки обрезанного конца, используя карборундовую бумагу (Таблица материалов). Смойте все мелкие осколки стекла или пыль с помощью бутылки с изопропиловым спиртом, а затем сжатого воздуха.
2. Протягивание оптического волокна (рис. 1D)
   1. Используйте лезвие бритвы, чтобы разорвать оптическое волокно, удалив один разъем SMA оптического волокна диаметром 200 мкм с концевой концевой станцией SMA (таблица материалов). Разрез рядом с одним из окончаний СМА. Затем с помощью лезвия бритвы удалите следующие 5 см пластиковой и стекловолоконной оболочки так, чтобы оголенное оптическое волокно обнажилось и выступало из остальной части неповрежденной сборки.
   2. Используйте бутановую горелку, чтобы сжечь полиимидное полимерное покрытие из стекловолокна. Смойте изопропанолом. Протрите голое стекловолокно безворсовой салфеткой.
   3. Следующим шагом является монтаж оголенного волокна, чтобы его также можно было тянуть пламенем. Закрепите оголенный конец оптического волокна непосредственно в зажиме плоскогубцев (таблица материалов) на краю стола или полки, позволяя концу волокна с концами SMA свисать к полу. Добавьте грузы для вытягивания в виде двух небольших зажимов (общий вес: 10 г) на конце волокна с рубашкой примерно на 12 дюймов вниз от того места, где оголенное оптическое волокно удерживается в зажиме плоскогубца.
   4. Чтобы вытянуть волокно, начните с включенного пламени бутановой горелки. При включенном пламени держите бутановую горелку на расстоянии 1 см от оголенного волокна так, чтобы пламя было перпендикулярно оптическому волокну, и на расстоянии 3 см вниз по вертикали от того места, где плоскогубец удерживает оголенное волокно. Позвольте волокну растянуться, потянуться, отделиться и упасть на пол.
   5. Осмотрите получившийся натянутый конец оптического волокна. Аккуратно отшлифуйте неровности карборундовой бумагой, очистите изопропиловым спиртом и безворсовой салфеткой и высушите сжатым воздухом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе можно использовать микроскоп для характеристики и документирования размера и формы вытянутого волокна.
   6. Используйте непрозрачную ручку, чтобы затемнить стороны волокна и предотвратить попадание рассеянного света (Таблица материалов). Аккуратно потяните волокно через кончик ручки, оставив открытым только небольшой участок на кончике.
3. Монтаж натянутого волокна внутри стеклянной втулки дозатора (рис. 1A)
   1. Работая под стереомикроскопом, осторожно вставьте коническое оптическое волокно из шага 1.2 в широкий конец измененной стеклянной пипетки с шага 1.1 и протолкните волокно до тех пор, пока из конического конца пипетки не будет торчать ~ 1 мм голого волокна.
   2. С помощью изоленты прикрепите конец оптического волокна с оболочкой к широкому концу пипетки.
   3. Нанесите каплю цианоакрилатного клея на иглу малого калибра (Таблица материалов). Осторожно прикоснитесь каплей клея к срезанному краю вытянутой пипетки, избегая оголенного конца вытянутого волокна.
   4. Позвольте капиллярному действию впитывать клей в пипетку, смачивая область между стенкой пипетки и оптическим волокном. Дайте клею затвердеть не менее 15 минут, прежде чем перемещать зонд в сборе.
4. Модификация наконечника волокна с помощью рассеивающей сферы (рис. 1C)
   1. Создайте сырье для наконечника рассеивающего шарика, смешав каплю УФ-отверждаемого клея с порошком диоксида титана (таблица материалов) при ~ 1: 1 об. / об.
   2. Прикрепите зонд к микроманипулятору с помощью держателя монтажного стержня (таблица материалов) таким образом, чтобы зонд находился в горизонтальной ориентации. Приготовьте рабочий резервуар рассеивающего материала, окунув кончик проволоки или иглы в приготовленную выше смесь клея/TiO₂ так, чтобы образовалась капля клея. Закрепите проволоку или иглу каплей рядом с кончиком горизонтального зонда. Удобно это делать с помощью зажима типа «крокодил», закрепленного на скамейке.
   3. Нанесите рассеивающую сферу на кончик зонда. Используйте микроманипулятор, чтобы медленно и осторожно протолкнуть наконечник оптического волокна зонда в каплю клея/TiO₂. Затем быстро извлеките наконечник из клея. Повторите два-три раза до тех пор, пока на кончик оптического волокна не наложится сферическая капля клея нужного размера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рассеивающая сфера будет стабильной при диаметрах от двух до восьми раз большем, чем диаметр конического оптического волокна. Окончательный оптимальный размер зависит от конечного желаемого применения.
   4. Отверждайте сферу, подключив конец оптического волокна с концевой SMA к источнику ультрафиолетового света, связанному с волокном (таблица материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Источник света, использованный в этом исследовании, имел мощность 5,3 мВт. При такой мощности рекомендуемое время отверждения составляет не менее 12 часов или за ночь. После отверждения самое время охарактеризовать и измерить размер конечного наконечника оптического зонда.

2. Подготовка и монтаж ткани для оптических измерений (рис. 2 и рис. 3)

1. Подготовьте посуду, чтобы смонтировать образцы для эксперимента. Нагрейте большой конец пипетки Пастера с помощью бутановой горелки, чтобы расплавить отверстие диаметром 0,5 см в дне пластиковой чашки Петри размером 35 мм x 10 мм. Заклейте отверстие на нижней стороне посуды изолентой или лабораторной лентой. Делайте по несколько за раз для эффективности.
2. Приготовьте жидкий желатин (Таблица материалов) согласно инструкции на упаковке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерческий пищевой желатин без запаха из продуктового магазина лучше подходит для этой цели, чем химический желатин от поставщиков химикатов, потому что желатин химического качества менее оптически прозрачен и менее механически надежен, чем пищевой продукт.
3. Выполните вскрытие и препарирование ткани, которая будет использоваться.
   ПРИМЕЧАНИЕ: По опыту, любая плоская ткань толщиной до 1 см может быть успешно измерена в этом эксперименте с использованием любого метода вскрытия, подходящего для интересующей системы. Для гигантской ткани моллюска был использован 8-миллиметровый биопсийный пуансон, чтобы сделать плоский правильный круг ткани моллюска для использования в эксперименте¹². Для этой системы только один образец может быть эффективно подготовлен за один раз, учитывая продолжительность времени, необходимого для завершения измерения, чтобы гарантировать, что образец все еще находится в жизненном состоянии в конце эксперимента.
4. Заполните две чашки Петри, начиная с шага 2.1, на четверть пути жидким желатином и дайте остыть до комнатной температуры (RT) чуть меньше гелеобразования. В одной посуде поместите биопсию в подушку из вязкого желатина, которая образуется в отверстии на дне чашки. Используйте пипетку Пастера, чтобы аккуратно добавить желатин RT вокруг биопсии, пока чашка Петри не заполнится (рис. 3). Наполните второе блюдо желатином, чтобы получился пустой образец.
5. Поместите образцы блюд в холодильник примерно на 10-30 минут, пока желатин полностью не затвердеет и не станет слегка эластичным на ощупь.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В прохладном помещении в этом может не быть необходимости; При работе в тропиках этот этап необходим для полного выверждения желатина.
6. Изготовление крепления для чашки Петри на микроманипуляторе (рисунок 2)
   1. Вырежьте квадрат размером 6 см х 6 см из 1/4 толстого оргстекла (Таблица материалов).
   2. Просверлите или расплавите отверстие в пластиковом квадрате того же диаметра, что и чашка Петри (~35 мм). Убедитесь, что чашка Петри плотно прилегает к этому отверстию и удерживается на месте трением. Добавьте скотч к краям блюда, чтобы немного увеличить размер и фрикционный контакт.
   3. Просверлите или расплавите отверстие диаметром 1/4 в углу пластикового квадрата. Используйте это отверстие, чтобы прикрепить квадрат к микроманипулятору с помощью винта и болта 1/4 дюйма.
   4. Накройте пластиковый квадрат черной изолентой, чтобы уменьшить попадание рассеянного света на зонд. Точно так же используйте ленту, чтобы создать юбку по бокам квадрата, проходящую ниже дна вставленной тарелки (>10 мм), чтобы уменьшить рассеянный свет (рис. 2B).
   5. Используйте болт и соответствующее оборудование, чтобы прикрепить держатель чашки Петри к микроманипулятору, который позволяет выполнять трехмерные регулировки и вертикальное перемещение с хорошим разрешением на протяженность, превышающую толщину образцов (части 1 и части 2 манипулятора, упомянутые в таблице материалов , являются хорошими примерами). Прикрепите этот микроманипулятор к оптическому макету.

3. Измерительная установка для биопсии тканей

1. Установите источник света над областью, где происходит измерение, таким образом, чтобы свет коллимировался, когда он достигает плоскости, в которую будет помещен образец (рис. 2А). Например, прикрепите коллимирующую линзу диаметром 5 см (Таблица материалов) к 5-миллиметровому жидководу (Таблица материалов) и поднимите над образцом >0,6 м с помощью тисков и рамы, прикрепленных к оптическому макету (Таблица материалов). Затем подключите световод к широкополосному источнику света, например к источнику плазменного света, указанному в таблице материалов.
2. Прикрепите зонд к вертикально ориентированному креплению так, чтобы он был направлен на источник света. Закрепите зонд хомутами, хомутами для шлангов или лентой на стойке оптического стола.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В эксперименте с гигантскими моллюсками используется специально разработанный держатель стержня, такой как микроманипулятор, указанный в таблице материалов. В этой работе он был прикреплен магнитами к оптическому макету (Таблица материалов). Дополнительные степени свободы для выравнивания, полученные при наличии как зонда, так и образца на манипуляторах, удобны, но не обязательны. Будьте осторожны, чтобы не пережать стойку, так как это может сломать корпус пипетки.
3. Расположите манипулятор образца рядом с вертикально установленным зондом. С помощью манипулятора для отбора проб отрегулируйте положение предметного столика для отбора проб таким образом, чтобы зонд располагался по центру отверстия 0,5 см в нижней части чашки Петри. Соблюдайте крайнюю осторожность, чтобы не прикоснуться к наконечнику установленного щупа и не ударить его.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Стереомикроскоп, установленный на штанге, расположенный над зоной образца, может быть полезен. Таким образом, перед началом эксперимента можно просмотреть выравнивание наконечника зонда, столика и образца сверху вниз (рис. 2A).
4. Подключите конец оптического волокна зонда с концевой станцией SMA к оптоволоконному спектрометру USB (таблица материалов) и подключите спектрометр к компьютеру с помощью USB-кабеля.

4. Сбор данных

1. Экспериментальная установка
   1. Расположите зонд и манипуляторы в точно выровненном положении, в котором будут собираться данные, как показано на шаге 3.4.
   2. Используйте ватный тампон или иглу тонкого калибра, чтобы осторожно нанести небольшое количество силиконовой смазки (Таблица материалов) на ту часть зонда, которая будет вставлена в ткань, чтобы уменьшить трение между сторонами зонда и образцом ткани. Повторно наносите силиконовую смазку перед каждым базовым уровнем или измерением ткани.
   3. Снимите ленту, закрывающую отверстие в пустой чашке Петри для образцов, и поместите ее в держатель образца (шаг 2.7), убедившись, что она надежно удерживается на месте трением.
   4. С помощью микроманипулятора опустите образец на зонд. Позвольте зонду войти в желатин через отверстие на нижней стороне чашки Петри. Продолжайте до тех пор, пока зонд не окажется примерно в 5 мм от нижней части желатинового слоя.
   5. Включите источник света. Используя программное обеспечение спектрометра, отрегулируйте время интеграции спектрометра до тех пор, пока сигнал не станет максимально высоким, но не насыщенным. Установите количество усредненных сканов от двух до пяти, а значение сглаживающих пикселов — шесть. Полезное время интеграции на этом этапе может варьироваться от 1 до 50 мс для этого базового уровня.
2. Сбор эталонных спектров
   1. Соберите темное измерение.
      1. После того, как параметры спектрометра будут установлены с пустым образцом, отсоедините зондирующее волокно от спектрометра и закройте порт непрозрачной металлической крышкой, которая идет в комплекте со спектрометром.
      2. Получите темновое измерение от спектрометра (часто используя значок темной лампочки в графическом интерфейсе), чтобы охарактеризовать шум спектрометра без входного света. Сохраните это измерение в соответствии со стратегией сбора данных.
   2. Соберите измерение лампы. Снова подключите зондирующее волокно к спектрометру, дождитесь стабилизации сигнала и получите другой спектр. Это измерение характеризует свет, достигающий зонда через желатин в отсутствие ткани.
3. Сбор тканевых спектров
   1. Снимите ленту с нижней части чашки Петри для образцов и поместите ее в держатель образца.
   2. Совместите чашку с образцом с зондом с помощью трехмерных манипуляций так, чтобы биопсия ткани была сосредоточена над кончиком зонда.
   3. Нанесите силиконовый гель на зонд (см. 4.1.2) и медленно опустите образец на зонд до тех пор, пока наконечник зонда не пройдет через желатин, поддерживающий образец ткани, и не войдет в образец ткани.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые спектрометры и компьютерные программы позволяют контролировать обнаруженный свет в режиме реального времени. Используйте это, чтобы определить, когда зонд входит в ткань. Интенсивность спектра резко уменьшится, как только наконечник зонда окажется в непосредственном контакте с тканью.
   4. Убедитесь, что время интегрирования соответствует измерению, убедившись, что измеряемый спектр не является ни слишком шумным, ни насыщенным. При необходимости измените время интеграции.
      1. Каждый раз, когда время интеграции корректируется, выполняйте и сохраняйте новое измерение темновой температуры (этап 4.2.1). Не изменяйте количество усредненных сканов или количество сглаженных пикселов.
      2. Найдя подходящие параметры измерения, проведите измерения и сохраните спектр.
   5. Переместите образец вниз на указанное расстояние с помощью микроманипулятора. Для манипулятора, использованного для этого исследования, каждая маленькая отметка от клеща составляла 0,001 дюйма или 25,4 мкм. Образец был перемещен вниз через пять галочек, или 127 мкм, для каждого измерения. Повторите шаг 4.3.4.
   6. Продолжайте сохранять спектры в каждом вертикальном положении внутри ткани.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для системы, описанной здесь, требуемое время интегрирования варьировалось от 1 мс до 5 с для измерений в одном образце ткани. В конце концов, наконечник зонда выйдет из верхней части ткани и будет виден там (рис. 4A). Это окончательное измерение, которое характеризует свет, падающий на верхнюю часть ткани.
4. Загрузка и обработка данных
   1. Используйте программное обеспечение спектрометра для преобразования всех собранных спектров (темных спектров, спектров ламп и измерений тканей) в текстовые файлы с разделителями.
   2. Используя Matlab или язык программирования по выбору, загрузите все файлы измерений для образца. Для каждого спектра измерения ткани вычтите темновой спектр с соответствующим временем интегрирования, а затем разделите его на время интегрирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании для загрузки и обработки данных использовался скрипт Matlab (дополнительный файл 1).
   3. Рассчитайте процент падающего света, достигающего каждой позиции в ткани, разделив спектры, полученные с помощью зонда внутри ткани, на базовый спектр, полученный в пустом желатине.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Измерение в верхней части ткани (этап 4.3.6) должно быть очень похоже на исходное измерение желатина (этап 4.1) и, при делении, должно быть близко к 100%. В зависимости от контекста эксперимента в качестве эталона можно использовать либо спектр лампы (спектр пустого желатина или спектр из самой верхней части ткани). Тем не менее, все же важно собрать спектр лампы перед началом эксперимента. Это связано с тем, что, если зонд ломается или эксперимент иным образом терпит неудачу, не достигнув верхней части ткани, данные, полученные до отказа, все еще можно использовать, чего нельзя сказать, если нет соответствующего начального эталонного спектра лампы.
   4. Визуализируйте данные; Контурные графики могут быть полезны (рис. 4B).

Representative Results

Этот протокол описывает процедуру построения микрооптического зонда, который может быть использован для измерения излучения вниз (свет, достигающий точки с одного направления) или, с добавлением сферического наконечника, рассеивающего свет, для измерения скалярного излучения (свет, достигающий точки со всех сторон). Эти зонды могут измерять излучение с пространственным разрешением, приближающимся к масштабам длины отдельных клеток внутри живой ткани. В этом протоколе также описывается репрезентативный способ подготовки образца ткани для измерений освещенности с использованием описанного зонда и репрезентативный метод для просмотра и анализа данных.

На рисунке 1 показан результат производства микрозонда. При натяжении оптическое волокно должно сужаться примерно на 3 см и не иметь царапин вдоль конуса. Он также должен быть плоским на конце и иметь диаметр 15-30 мкм (рис. 1D). Плоскостность наконечника можно улучшить, отшлифовав конец карборундовой бумагой или надрезав и снова сломав. Точно так же вытянутая стеклянная пипетка, используемая в качестве корпуса волокна, не должна иметь острых или сломанных краев. Когда рассеивающий шар образуется на конце плоского обрезанного кончика волокна, он должен быть сферическим (рис. 1В). Перед отверждением деформированные могут быть удалены еще одним раундом, вставив шарик в исходную клеевую каплю и быстро вытащив волокно. Быстрая скорость движения позволит вытянуть шарик клея с конца волокна. Более медленные движения приводят к дополнительному образованию клея на волокне. Наблюдение за процессом с помощью препарирующего микроскопа, когда волокно прикреплено к источнику света, полезно для визуализации работы и определения того, работает ли процесс. Важно закрепить волокно внутри стеклянной пипетки клеем и изолентой перед нанесением рассеивающего клея; в противном случае волокно может порваться, или клей может смазаться смещающимся волокном (рис. 1).

На рисунке 2 показана измерительная аппаратура. В этом примере держатели как для образца ткани, так и для зонда имеют возможности регулировки в трех измерениях (рис. 2). Крепление образца и зонда к манипуляторам помогает с выравниванием, но не обязательно; Зонд можно было прикрепить к стационарному столбу. Наиболее разрешенные движения манипуляторов должны быть ориентированы в вертикальном, z-направлении, чтобы можно было точно определить положение в ткани и/или количество движений зондов (рис. 2A). Стереомикроскоп, установленный на штанге, может быть полезен при размещении таким образом, чтобы можно было просматривать столик, зонд и образец через окуляр, чтобы проверить совмещение зонда со столиком, тарелкой и образцом (рис. 2B). Наблюдение за спектрами в режиме реального времени при опускании образца на зонд полезно, потому что, если спектр, измеренный зондом, внезапно изменяется, это говорит о том, что образец успешно расположен внутри сильно рассеивающей или поглощающей ткани или что зонд изгибается или ломается. Резкие изменения формы и интенсивности спектра, скорее всего, указывают на вход в ткань, в то время как резкие изменения интенсивности без изменения формы предполагают, что зонд изгибается или ломается. В верхней части ткани моллюска есть тонкая прозрачная мембрана, через которую зонд не может проникнуть, не сломавшись. В таком случае следует контролировать верхнюю часть ткани, чтобы увидеть, когда зонд вот-вот выйдет, и измерения должны быть остановлены в этой точке, чтобы зонд не сломался.

На рисунке 3 показан образец биопсии ткани, помещенный в чашку Петри с желатином, как описано в разделе 2. В нижней части чашки Петри есть отверстие, позволяющее оптическому зонду вставляться в ткань снизу. Биопсия имеет диаметр 8 мм и центрирована над отверстием в чашке Петри (рис. 3А). Под образцом ткани находится небольшое количество желатина, и желатин заполняется до верхней части чашки над тканью (рис. 3B).

На рисунке 4A показан зонд, когда он начинает выходить из верхней части ткани, а на рисунке 4B показаны репрезентативные данные. Скрипт Matlab (дополнительный файл 2) был использован для генерации трассировок, показанных на рисунке 4B. Ось X — это длина волны, а ось Y — процент света на глубине ткани по отношению к базовому спектру. Индивидуальные измерения глубины ткани обозначены линиями с окраской в серой шкале. Измерения, сделанные глубже в ткани, представлены более темной линией. Базовый спектр представляет собой измерение в образце, содержащем только желатин, и используется для характеристики лампы и реакции зонда на лампу. Желатин имеет небольшое поглощение и рассеяние, что означает, что сигнал поглощения желатина относительно длины волны не является полностью плоским. Следовательно, спектры, взятые по всей ткани, делятся либо на спектр зонда в желатине, либо на спектр зонда в верхней части ткани, так что спектральные данные, показанные на рисунке 4B, представляют процент света только для образца ткани и, таким образом, не зависят от источника света. желатин и специфика каждого отдельного зонда.

Рисунок 1: Этапы изготовления микрооптического внутритканевого радиометрического зонда. (А) Схема оптического зонда. (B) Вид готового оптического зонда. (C) Крупный план рассеивающей сферы, прикрепленной к натянутому оптическому волокну внутри стеклянной подложки пипетки. (D) Вытянутое и очищенное оптическое волокно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Изображения и диаграммы экспериментальной установки для измерения скалярного излучения внутри ткани . (A) Общая схема и изображение экспериментальной установки. (B) Крупный план держателя чашки Петри. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Биопсия тканей моллюсков . (A) Вид сверху и (B) вид сбоку биопсии ткани моллюска, готовой к измерению в измененной чашке Петри, наполненной желатином. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Репрезентативные данные . (A) Микроскопическое изображение того, как зонд выглядит при прохождении через ткань. (B) Репрезентативные данные, полученные с помощью внутритканевого радиометрического зонда. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный файл 1: Скрипт Matlab, используемый для загрузки и обработки данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 2: Скрипт Matlab, используемый для генерации трассировок на рисунке 4B. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

Этот протокол описывает метод систематической характеристики оптической среды через большой объем живой ткани с пространственным разрешением примерно в масштабе отдельных клеток. Этот недорогой, гибкий и управляемый в полевых условиях метод может быть полезен любым исследователям, изучающим распространение света в живых системах. По опыту, по сравнению с существующими методами⁷, эти зонды требуют немного больше практики и навыков для создания, но приводят к меньшему повреждению тканей и способности более полно характеризовать большие объемы плотной ткани.

Этот метод состоит из четырех частей. Первая часть, построение зонда, была вдохновлена предыдущими конструкциями^{устройств 10,11}. Современный подход был разработан для систематического, менее разрушительного сканирования всей толстой ткани, так как вытянутая стеклянная игла может мягко скользить между клетками. Он также подходит для использования в полевых лабораториях^12,13,14. Этот протокол приводит к созданию зондов с наконечниками диаметром ~ 20 мкм для измерения излучения даунвеллинга и дополнительной сферой рассеяния диаметром 50-100 мкм для измерения скалярного излучения. Большие или меньшие скалярные сферы излучения могут быть разработаны путем модификации используемых материалов, например, УФ-отверждаемого клея с другой начальной вязкостью. Вес как при вытягивании пипетки, так и в процессе волокна можно регулировать, чтобы привести к большей или меньшей конуси. Скорость нагрева также может быть изменена в зависимости от расстояния от пламени горелки, чтобы отрегулировать процесс вытягивания и результирующую конусность.

Техника изготовления зонда требует некоторых ручных навыков, проб и ошибок для совершенствования, но с практикой может стать надежной и быстрой. Здесь представлены некоторые нюансы устранения неполадок, выработанные с течением времени. Вытягивание оптического волокна вниз от конца с рубашкой приводит к более равномерным конусам. Важно нанести непрозрачную ручку перед добавлением сферического рассеивающего наконечника, так как смачивающие свойства непрозрачных чернил благоприятно влияют на образование аккуратного шарика клея на кончике волокна. Если получившийся клейкий шарик деформирован, его можно снять и повторить попытку. Для этого микроманипулятор можно использовать для того, чтобы засунуть весь шарик в клейкий резервуар, а затем очень медленно извлечь. Обычно это снимает первую, деформированную попытку, оставляя ее в резервуаре клея и позволяя повторить попытку.

При осторожном обращении эти зонды можно многократно использовать для разных образцов. Самая большая опасность - случайно ударить наконечником зонда во что-то при его перемещении. Между измерениями их следует очищать от клеточного мусора с помощью изопропилового спирта и сжатого воздуха. Зонды также можно хранить в течение нескольких недель, если наконечник зонда ни к чему не прикасается, и на волоконно-оптическом узле нет сил, которые могут раздвинуть ленту и клей, удерживающие зонд внутри стеклянной втулки. Это можно сделать, зажав дозатор из волокна и стекла в нескольких местах к краю высокой полки.

Вторая и третья части этого метода включают механо-оптические аспекты эксперимента и закрепление ткани для измерения. Эта часть метода была разработана специально для измерения внутритканевого скалярного излучения внутри гигантской ткани моллюска¹². Здесь представлены подробные сведения об устранении неполадок, связанных с этими аспектами метода. Во-первых, биопсия должна быть большой относительно зонда. Это предотвращает перемещение зонда ткани во время его прохождения. Кроме того, ткань должна находиться на дне чашки Петри, чтобы эластичность и вес желатина объединялись, чтобы удерживать ткань на месте во время измерения. Также важно, чтобы в помещении было достаточно прохладно, чтобы желатин оставался в эластичном твердом состоянии под экспериментальным источником света. Точно так же помогает использовать светодиод или другой источник со сравнительно небольшим тепловыделением по сравнению с видимым светом.

Геометрические и оптико-механические параметры метода очень гибкие. Например, скалярный зонд излучения использовался для измерения излучения внутри мозга и жировой ткани интактной мыши^13,14. Для этого зонд устанавливался на манипуляторы на стандартную стереотаксическую рамку грызунов, а источник света устанавливался направленным в сторону трибуны мыши. В любой геометрии ключом к успешному использованию этого метода является всегда сбор соответствующих ламповых и темновых эталонных спектров в начале любого измерения. Если зонд сломается во время измерения ткани, и нет первоначальной характеристики без ткани, данные будет трудно или невозможно интерпретировать, и необходимо будет начать заново с новым зондом. В отличие от этого, при наличии соответствующих ссылок в начале, частичные измерения являются полезными данными.

Последняя часть этого метода касается сбора данных. Описано использование волоконно-оптического спектрометра для контроля сигналов от зонда, что обеспечивает простоту связи SMA и предоставляет полностью спектральную информацию о длине волны. Однако для систем с меньшим потоком фотонов также можно соединить эти зонды с фотоэлектронными умножителями или лавинными фотодиодами. В любом случае, все детекторы требуют эталонных измерений для каждого нового измерения. Таким образом, с небольшими корректировками описанных методов сбора данных можно охарактеризовать все различные типы оптических параметров.

Будущим интересным применением этого метода может быть количественная оценка света глубоко в телах крупных млекопитающих и в растениях со сложными свойствами переноса излучения, таких как суккуленты.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1" travel ball bearing center+D11+A2:D31+A2:A2:D31	Edmond Optics	37-935	Part 2 of manipulator for lowering sample
1/4" thick acrylic sheet	McMaster-Carr	8505K754	For making Petri dish holder
3/4" mini spring clamp	Anvil	99693	Use as weight for pulling optical fiber
8 mm biopsy punch	Fisher Scientific	NC9324386	For tissue sample
Butane Torch	McMaster-Carr	MT-51	Heat source for pulling fiber and pipette
Collimating lens	Thorlabs	LLG5A1-A	To collimate light source through liquid light guide
Compressed air	McMaster-Carr	7437K35	For drying pulled fiber and pipette
Cyanoacrylate glue - liquid	McMaster-Carr	66635A31	For securing tapered fiber end at top of pulled pipette
Electrical tape	McMaster-Carr	76455A21	For securing fiber in pipette and for adding grip to clamps
Fine grade carborundum paper	McMaster-Carr	4649A24	Small triangle on exacto knife holder works well
Gelatin	Knox	10043000048679	For securing the tissue biopsy in the petri dish
Glass Pasteur Pipete	Fisher Scientific	13-678-20B	Disposable glass pipette 5.75" in length
Insulin syringes, 31G needle	BD	320440	For applying glue
Isopropanol	McMaster-Carr	54845T42	For cleaning pulled fiber and pipette
Kimwipe	Cole-Parmer	SKU 33670-04	For wiping optical fiber and glass pipette clean
LED driver	Thorlabs	LEDD1B	For powering the UV LEDs
Light source for measurements	Cole-Parmer	UX-78905-05	Low heat white light source for measurements
Linear metric X-Y-Z axis rack and pinion stage	Edmond Optics	55-023	Part 1 of manipulator for lowering sample
Liquid light guide	Thorlabs	LLG5-4T	For light source in measurements
Magnetic feet	Siskiyou	MGB 8-32	For use with magnetic strips
Magnetic strips	Siskiyou	MS-6.0	For mounting magnetically to breadboard
Manipulator #1	Siskiyou	MX10R	4-axis manipulator with pipette holder
Opaquer pen, small	WindowTint	TOP01	For opaquing side of optical fiber to prevent stray light from enter probe
Optical breadboard	Edmond Optics	03-640	For stable affixation of probe holder, sample, microscope and light source
Optical fibers	Ocean Optics	P-100-2-UV-VIS	About 4 fibers are good to have
Plasma light source	Thorlabs	HPLS345	For tissue radiometry measurements
Plastic plier clamp	McMaster-Carr	5070A11	Plier clamp used for weight in pulling pipette
Polystyrene Petri dishes	Thomas scientific	3488N10	Sample holders, enough volume to hold sample thickness plus ~10 mm of gelatin on top
Razor blades	McMaster-Carr	3962A3	For stripping jacketing from optical fiber
Silicone oil lubricant	Thomas scientific	1232E30	For reducing friction between probe and tissue
Software for analyzing data	Matlab		Chosen software for data analysis
Spectrometer + spectrometer software	Avantes	AvaSpec-2048L	Spectrometer can be any brand, this one is compatible with sma-terminated optical fibers and comes with its own software for running the spectrometer
Titanium dioxide powder	Sigma Aldrich	718467-100G	For making scattering sphere
Toolour tabletop clip	Toolour	Toolour0004	For holding pipette while pulling and for holding finished probes
Trigger-action bar clamps	mcMaster-Carr	51755A2	Good for holding optical fibers while pulling or curing
UV curable adhesive	Delo Photobond	GB368	For making scattering sphere
UV light source	Thorlabs	M365FP1	Light source for curing adhesive in scattering ball, this one is sma-fiber compatible, higher intensity = less cure time
White LED light source	Thorlabs	MCWHF2	For characterizing pulled fiber and scattering sphere