Canlı Dokuda Yerinde Işılığı Ölçmek için Bir Doku İçi Radyometri Mikroprobu

Summary

Bu yazıda, canlı dokuda in situ ışımayı ölçmek için bir yöntem anlatılmaktadır. Bu çalışma, farklı parlaklık ve ışıma ölçümleri için mikro ölçekli probların yapımının ayrıntılarını içerir, ışımanın karakterizasyonu için doku montajı için rehberlik sağlar ve elde edilen verileri analiz etmek için hesaplama yöntemlerini ana hatlarıyla belirtir.

Abstract

Organizmalar büyük ölçüde opak görünür, çünkü dış doku katmanları gelen ışığa güçlü bir şekilde saçılır; Kan gibi kuvvetle emici pigmentler tipik olarak dar absorbanslara sahiptir, öyle ki absorbans zirvelerinin dışındaki ışığın ortalama serbest yolu oldukça uzun olabilir. İnsanlar dokuların içini göremedikleri için, genellikle beyin, yağ ve kemik gibi dokuların çok az ışık içerdiğini veya hiç ışık içermediğini hayal ederler. Bununla birlikte, ışığa duyarlı opsin proteinleri bu dokuların çoğunda eksprese edilir ve işlevleri tam olarak anlaşılamamıştır. Fotosentezi anlamak için dokuya iç ışıma da önemlidir. Örneğin, dev istiridyeler güçlü bir şekilde emer, ancak dokunun derinliklerinde yoğun bir alg popülasyonunu korur. Tortular ve biyofilmler gibi sistemler aracılığıyla ışık yayılımı karmaşık olabilir ve bu topluluklar ekosistem verimliliğine büyük katkıda bulunabilir. Bu nedenle, canlı doku içindeki bu fenomenleri daha iyi anlamak için skaler ışımayı (bir noktayla kesişen foton akısı) ve aşağı inen ışımayı (bir düzlemi dik olarak geçen foton akısı) ölçmek için optik mikro-problar oluşturmak için bir yöntem geliştirilmiştir. Bu teknik saha laboratuvarlarında da uygulanabilir. Bu mikro problar, daha sonra çekilmiş cam pipetlere sabitlenen ısı ile çekilen optik fiberlerden yapılmıştır. Probun açısal kabulünü değiştirmek için, titanyum dioksit ile karıştırılmış 10-100 μm boyutunda bir UV kürlenebilir epoksi küresi daha sonra çekilmiş, kesilmiş bir elyafın sonuna sabitlenir. Prob canlı dokuya yerleştirilir ve konumu bir mikromanipülatör kullanılarak kontrol edilir. Bu problar, in situ doku parlaklığını 10-100 μm'lik uzamsal çözünürlüklerde veya tek hücre ölçeğinde ölçebilir. Bu problar, canlı bir farenin derisinin 4 mm altındaki yağ ve beyin hücrelerine ulaşan ışığı karakterize etmek ve canlı alg bakımından zengin dev istiridye dokusu içinde benzer derinliklere ulaşan ışığı karakterize etmek için kullanıldı.

Introduction

Şaşırtıcı bir şekilde, kara hayvanları ve sığ okyanus sakinleri vücutlarında görsel fizyoloji ve hatta fotosentez için yeterli ışığa sahiptir. Örneğin, bir farenin kafasının ortasındaki ışık seviyeleri (güçlü hemoglobin absorbans bantlarının dışında), dış dünyaya göre üç veya dört büyüklük sırası ile zayıflatılır. Bu, kabaca iç ve dış mekanlardaki ışık seviyeleri arasındaki farktır. Bu nedenle, güçlü saçılma nedeniyle bir dokunun veya malzemenin opaklığı, güçlü ışık emilimi nedeniyle opaklık ile aynı değildir. Işık, yüksek konsantrasyonlarda hücre ve parçacıklara sahip sucul sistemlerde yayılan ışığa benzer şekilde, güçlü bir ileri saçılma sisteminde uzun mesafelerde yayılmaya devam edebilir¹. Bu gözlem, opsin proteinlerinin tüm hayvanların tüm dokularında neredeyse her yerde ifade edildiği gerçeği ışığında özellikle dikkat çekicidir. Bu nedenle, ışığın canlı doku içinde nasıl ve nerede zayıfladığını ve dağıldığını anlamak önemlidir. Bununla birlikte, su sistemlerinden farklı olarak, canlı doku ile, bir aleti su kolonuna batırmak ve parlaklık ve parlaklık ölçümleri elde etmek imkansızdır ve yeni bir teknik gereklidir.

Canlı dokunun emilim ve saçılma özelliklerini karakterize etmek için daha önce kullanılan diğer yöntemler arasında doku yansıtma problarının ölçülmesi ve / veya kürelerin entegre edilmesi^2,3, tarama konfokal mikroskobu⁴ gibi mikroskobik yöntemler^, yüzeydeki lazer ışığının difüzyonunu ölçme⁵ ve Monte Carlo ışınım transferi⁶ gibi modelleme teknikleri bulunmaktadır. Bahsedilen deneysel yöntemler genellikle spesifik, büyük ve pahalı ekipman veya doku yapısı hakkında ayrıntılı bilgi gerektirir ve genellikle dokunun derinliklerindeki ışığın mekansal yapısını karakterize etme yetenekleriyle sınırlıdır.

^7,8,9 dokusundan optik fiber yerleştirmek için hipodermik iğne kullanan benzer prob bazlı yöntemler de vardır. Deneyimlerimize göre, modifiye iğneler dokuyu delmede etkilidir, ancak önemli ölçüde kuvvet gerektirir ve genellikle yoğun bir şekilde paketlenmiş hücrelerden geçerken hassas dokuları yırtar. Bu nedenle, bu iğneler genellikle bir doku tabakasına bir milimetreden daha fazlasını yerleştirmek için cerrahi bir prosedür gerektirir. Burada tarif edilen yöntem, yağlanmış, çekilmiş bir cam destek kullanarak, dokunun minimum yaralanmasıyla ve ek cerrahi olmadan hücreler arasında kayabilir.

Bu el yazması, Jorgenson ve meslektaşlarının alg paspasları^10,11 içindeki ışığı ölçme konusundaki çalışmalarından esinlenerek^, cam destekli optik mikroproblar ve yoğun dokunun derinliklerine inmeye ve sahada inşaat ve kullanıma uygun taşınabilir elektronikler kullanarak bir yöntem sunmaktadır. Bu problar, yüksek uzamsal çözünürlüklerde canlı doku içindeki skaler ışımayı (her yönden bir noktaya çarpan ışık) ve aşağı inen parlaklığı (yatay bir düzlemle kesişen ışık) karakterize etmek için inşa edilebilir. Bu problar başlangıçta fotosimbiyotik dev istiridye dokusu içindeki ışınım transferini ölçmek için geliştirilmiştir¹². Toplam dokunun emilimi ve iletiminin standart ölçümleri, dokunun fotosentetik performansını karakterize etmek için yeterli değildi, çünkü tüm gelen ışığın, dokunun yüzeyinde yüksek yoğunluk yaşayan birkaç hücre tarafından mı yoksa doku hacmi boyunca düşük yoğunluklar yaşayan birçok hücre tarafından mı emildiği büyük bir fark yaratıyor. İkinci bir projede, bu problar bir farenin beynindeki in vivo ışımayı ölçmek için kullanıldı^13,14, böylece beynin derinliklerinde ifade edilen opsinlerin ışık ortamını karakterize etti. Bu mikro problar, fare beyin dokusundaki parlaklığı tüm kürk, cilt ve kemik bozulmadan ölçecek kadar küçük ve hassastır ve fizyolojik ışık seviyelerinin derin beyin opsinlerini uyaracak kadar yüksek olduğunu göstermektedir.

Bu mikro-optik prob ve ölçüm kurulumu, biyolojik dokunun içindeki ışığı ölçmek ve karakterize etmek isteyen araştırmacılar için, özellikle fotosentezin veya gözlerin dışında ifade edilen görsel pigmentlerin işlevlerinin daha nüanslı bir şekilde anlaşılması için yararlı olabilir. Bu yöntem, canlı doku içindeki optik özellikleri ve ışık yayılımını düşük maliyetle, şirket içinde inşa edilmiş küçük taşınabilir ekipmanlarla ve göreve bağlı ayarlanabilir parametrelerle tam olarak karakterize etmek için tek başına veya diğer tekniklerle birlikte kullanılabilir.

Protocol

Bu çalışma, Yale Üniversitesi'nin omurgalı ve omurgasız hayvan araştırmaları ile ilgili tüm ilgili etik düzenlemelerine uygundur.

1. Optik mikro probun oluşturulması

1. Cam manşonun oluşturulması, malzeme: Pasteur pipet, 5,75 inç ( bkz.
   1. Takılabilir bir timsah klipsi (Malzeme Tablosu) kullanarak, cam pipeti, konik ucu yere bakacak ve pipetin yönü zemine dik olacak şekilde geniş uca monte edin.
   2. Pipetin konik ucundan 50 g'lık plastik bir mengene sapı (Malzeme Tablosu) asın. Kaymayı önlemeye yardımcı olmak için pipet ile mengene tutacağı arasına bir elektrik bandı pedi yerleştirin.
   3. Pipetin konik ucunu küçük bir bütan meşalesi kullanarak ısıtın (Malzeme Tablosu). Alevi mengene tutamağının 1 cm yukarısına uygulayın. Meşaleyi, alevin en parlak kısmı camdan 3 cm uzakta olacak ve cam alevin ucunda olacak şekilde tutun. Pipetin uzunluğu yaklaşık 5 inç arttığında alevi hemen çıkarın.
   4. Yeni çekilen çapın bir sonraki bölümde kullanılan optik fiberin kabaca iki katı olduğu noktada pipetin çekilmiş ucunu kesmek için küçük makas veya cam kesici kullanın (bkz. adım 1.2). Carborundum kağıdı kullanarak kesilmiş ucun keskin alanlarını dosyalayın (Malzeme Tablosu). Elde edilen küçük cam kırıklarını veya tozu bir şişe izopropil alkol ve ardından basınçlı hava kullanarak durulayın.
2. Optik fiberin çekilmesi (Şekil 1D)
   1. Optik fiberi kesmek için bir tıraş bıçağı kullanın ve 200 μm çapında SMA ile sonlandırılmış optik fiberin bir SMA konektörünü çıkarın (Malzeme Tablosu). SMA sonlandırmalarından birine yakın kesin. Ardından, sonraki 5 cm'lik plastik ve fiberglas kılıfı çıkarmak için tıraş bıçağını kullanın, böylece çıplak optik fiber açığa çıkar ve bozulmamış düzeneğin geri kalanından çıkıntı yapar.
   2. Poliimid polimer kaplamayı cam elyafından yakmak için bütan torcunu kullanın. İzopropanol ile durulayın. Tüy bırakmayan bir mendil kullanarak çıplak cam elyafını silin.
   3. Bir sonraki adım, çıplak elyafı monte etmektir, böylece bir alevle de çekilebilir. Optik fiberin çıplak ucunu doğrudan bir masa veya raf kenarındaki bir pense kelepçesine (Malzeme Tablosu) monte edin ve fiberin SMA ile sonlandırılmış ucunun zemine doğru sarkmasına izin verin. Fiberin ceketli ucuna, çıplak optik fiberin pense kelepçesinde tutulduğu yerden yaklaşık 12 inç aşağı doğru iki küçük kelepçe (toplam ağırlık: 10 g) şeklinde çekmek için ağırlıkları ekleyin.
   4. Elyafı çekmek için, bütan meşale alevi ile başlayın. Alev açıkken, bütan meşalesini çıplak fiberden 1 cm uzakta tutun, böylece alev optik fibere dik ve pense kelepçesinin çıplak fiberi tuttuğu yerden dikey olarak 3 cm aşağı doğru olur. Elyafın gerilmesine, çekilmesine, ayrılmasına ve yere düşmesine izin verin.
   5. Elde edilen çekilen optik fiber ucunu inceleyin. Düzensizlikleri karborundum kağıtla nazikçe zımparalayın, izopropil alkol ve tüy bırakmayan bir mendille temizleyin ve basınçlı hava ile kurulayın.
      NOT: Bu noktada, çekilen lifin boyutunu ve şeklini karakterize etmek ve belgelemek için bir mikroskop kullanılabilir.
   6. Elyafın kenarlarını koyulaştırmak ve başıboş ışığın girmesini önlemek için film opaklayıcı bir kalem kullanın (Malzeme Tablosu). Elyafı kalemin ucundan yavaşça çekin ve ucunda sadece küçük bir alanı açıkta bırakın.
3. Çekilen fiberin cam pipet manşonunun içine monte edilmesi (Şekil 1A)
   1. Bir stereomikroskop altında çalışırken, adım 1.2'deki konik optik fiberi, adım 1.1'den itibaren değiştirilmiş cam pipetin geniş ucuna dikkatlice yerleştirin ve fiberi, pipetin konik ucundan ~1 mm çıplak fiber yapışana kadar itin.
   2. Elektrik bandını kullanarak optik fiberin ceketli ucunu pipetin geniş ucuna sabitleyin.
   3. Küçük çaplı bir iğne üzerine bir damla siyanoakrilat yapıştırıcı koyun (Malzeme Tablosu). Yapıştırıcı damlasını, çekilen pipetin kesilmiş kenarına dikkatlice dokundurarak, çekilen elyafın çıplak ucundan kaçının.
   4. Kılcal hareketin yapıştırıcıyı pipete fitillemesine izin verin ve pipetin duvarı ile optik fiber arasındaki alanı ıslatın. Prob tertibatını hareket ettirmeden önce yapıştırıcının en az 15 dakika kürlenmesine izin verin.
4. Fiber ucun bir saçılma küresi ile değiştirilmesi (Şekil 1C)
   1. Bir damla UV ile kürlenebilir yapıştırıcıyı ~ 1: 1 v / v'de titanyum dioksit tozu (Malzeme Tablosu) ile karıştırarak saçılma bilyası ucu için hammadde oluşturun.
   2. Probu, prob yatay yönde olacak şekilde bir montaj çubuğu tutucusu (Malzeme Tablosu) ile bir mikromanipülatöre takın. Bir telin veya iğnenin ucunu, yukarıda hazırlanan yapıştırıcı / TiO₂ karışımına batırarak, bir yapışkan damlacık oluşturacak şekilde saçılma malzemesinin çalışma rezervuarını hazırlayın. Teli veya iğneyi yatay probun ucuna yakın damlacıkla monte edin. Bunu, tezgaha monte edilmiş bir timsah klipsi kullanarak yapmak uygundur.
   3. Probun ucuna bir saçılma küresi koyun. Probun optik fiberinin ucunu yapıştırıcı/TiO₂ damlacığına yavaşça ve dikkatlice itmek için mikromanipülatörü kullanın. Ardından, ucu yapıştırıcıdan hızla çekin. Optik fiberin ucunda istenen boyutta küresel bir yapışkan damlacığı birikinceye kadar iki ila üç kez tekrarlayın.
      NOT: Saçılma küresi, konik optik fiberin çapından iki ila sekiz kat daha büyük çaplarda kararlı olacaktır. Son optimum boyut, istenen son uygulamaya bağlıdır.
   4. Optik fiberin SMA ile sonlandırılmış ucunu fiber bağlantılı bir UV ışık kaynağına bağlayarak küreyi iyileştirin (Malzeme Tablosu).
      NOT: Bu çalışmada kullanılan ışık kaynağı 5.3 mW gücündeydi. Bu güçte, önerilen kürlenme süresi en az 12 saat veya bir gecedir. Kürlemeden sonra, son optik prob ucunun boyutunu karakterize etmek ve ölçmek için iyi bir zamandır.

2. Dokunun optik ölçümler için hazırlanması ve montajı (Şekil 2 ve Şekil 3)

1. Bir deney için örnekleri monte etmek üzere bulaşıkları hazırlayın. 35 mm x 10 mm plastik Petri kabının dibinde 0,5 cm çapında bir delik açmak üzere zımba yapmak için bütan meşale kullanarak bir Pasteur pipetinin büyük ucunu ısıtın. Çanağın alt tarafındaki deliği elektrik bandı veya laboratuvar bandı ile kapatın. Verimlilik için bir seferde birkaç tane yapın.
2. Sıvı jelatini (Malzeme Tablosu) paket üzerindeki talimatlara göre hazırlayın.
   NOT: Marketten gelen ticari gıda sınıfı tatsız jelatin, bu amaç için kimyasal tedarikçilerden kimyasal sınıf jelatinden daha iyidir, çünkü kimyasal sınıf jelatin, gıda ürününden optik olarak daha az berrak ve mekanik olarak daha az güvenilirdir.
3. Kullanılacak dokunun diseksiyonunu ve hazırlanmasını gerçekleştirin.
   NOT: Deneyimlere göre, 1 cm kalınlığa kadar olan herhangi bir düz doku, bu deneyde, ilgili sisteme uygun herhangi bir diseksiyon tekniği kullanılarak başarıyla ölçülebilir. Dev istiridye dokusu için, deney^12'de kullanılmak üzere düz, düzenli bir istiridye dokusu çemberi oluşturmak için 8 mm'lik bir biyopsi zımba kullanıldı. Bu sistem için, numunenin deneyin sonunda hala canlı durumda olduğundan emin olmak için bir ölçümü tamamlamak için gereken süre göz önüne alındığında, bir seferde yalnızca bir numune etkili bir şekilde hazırlanabilir.
4. Adım 2.1'den itibaren iki Petri kabını yolun dörtte birini sıvı jelatin ile doldurun ve jelasyondan kısa bir süre sonra oda sıcaklığına (RT) soğumaya bırakın. Bir tabakta, biyopsiyi, yemeğin altındaki delikte oluşan viskoz jelatin yastığına yerleştirin. Petri kabı dolana kadar biyopsi etrafına nazikçe RT jelatin eklemek için bir Pasteur pipeti kullanın (Şekil 3). Boş bir numune yapmak için ikinci kabı jelatinle doldurun.
5. Örnek yemekleri, jelatin tamamen kürlenene ve dokunuşa hafifçe elastik olana kadar yaklaşık 10-30 dakika buzdolabına koyun.
   NOT: Serin bir odada, bu gerekli olmayabilir; Tropiklerde çalışırken, jelatini tamamen iyileştirmek için bu adım gereklidir.
6. Petri kabı için mikromanipülatörde bir montaj yapmak (Şekil 2)
   1. 6 cm x 6 cm'lik bir kareyi 1/4 kalınlığında pleksiglas olarak kesin (Malzeme Tablosu).
   2. Plastik karede Petri kabı ile aynı çapa (~ 35 mm) sahip bir delik açın veya eritin. Petri kabının bu deliğe sıkıca oturduğundan ve sürtünme ile yerinde tutulduğundan emin olun. Boyutu ve sürtünme temasını hafifçe artırmak için çanağın kenarlarına bant ekleyin.
   3. Plastik karenin köşesinde 1/4 çapında bir delik açın veya eritin. Vida ve cıvatada 1/4 kullanarak kareyi mikromanipülatöre bağlamak için bu deliği kullanın.
   4. Proba ulaşan başıboş ışığı azaltmak için plastik kareyi siyah elektrik bandı ile örtün. Benzer şekilde, başıboş ışığı azaltmak için yerleştirilen çanağın tabanının (>10 mm) altına uzanan karenin kenarları etrafında bir etek oluşturmak için bant kullanın (Şekil 2B).
   5. Petri çanak tutucusunu, numunelerin kalınlığından daha büyük bir ölçüde üç boyutlu ayarlamalara ve iyi çözümlenmiş dikey harekete izin veren bir mikromanipülatöre bağlamak için bir cıvata ve uygun donanım kullanın ( Malzeme Tablosunda belirtilen manipülatörün bölüm 1 ve bölüm 2'si iyi örneklerdir). Bu mikromanipülatörü optik bir breadboard'a yapıştırın.

3. Doku biyopsileri için ölçüm kurulumu

1. Ölçümün yapıldığı alanın üzerine, numunenin yerleştirileceği düzleme ulaştığında ışığın kolimasyonu olacak şekilde bir ışık kaynağı monte edin (Şekil 2A). Örneğin, 5 mm'lik bir sıvı ışık kılavuzuna (Malzeme Tablosu) 5 cm'lik bir kolimasyon lensi (Malzeme Tablosu) takın ve optik breadboard'a (Malzeme Tablosu) bağlı bir mengene ve çerçeve kullanarak numunenin üzerine >0,6 m yükseltin. Ardından, ışık kılavuzunu Malzeme Tablosu'nda listelenen plazma ışık kaynağı gibi geniş bant bir ışık kaynağına bağlayın.
2. Probu, ışık kaynağına işaret edecek şekilde dikey olarak yönlendirilmiş bir montaja takın. Probu kelepçelerle, hortum kelepçeleriyle veya bantla optik bir masa direğine sabitleyin.
   NOT: Dev istiridye deneyinde, Malzeme Tablosunda listelenen mikromanipülatör gibi özel olarak tasarlanmış bir çubuk tutucu kullanılmıştır. Bu çalışmada, mıknatıslarla optik bir breadboard'a (Malzeme Tablosu) sabitlenmiştir. Hem probun hem de numunenin manipülatörler üzerinde bulundurulmasıyla elde edilen hizalama için ek serbestlik dereceleri uygundur, ancak gerekli değildir. Direğe aşırı kenetlenmemeye dikkat edin, çünkü bu pipet muhafazasını kırabilir.
3. Numune manipülatörünü, dikey olarak monte edilmiş probun yakınına yerleştirin. Numune aşamasının konumunu, prob Petri kabının altındaki 0,5 cm'lik açıklıkta ortalanacak şekilde ayarlamak için numune manipülatörünü kullanın. Monte edilmiş probun ucuna dokunmamak veya çarpmamak için çok dikkatli olun.
   NOT: Numune alanının üzerine yerleştirilmiş boma monte edilmiş bir stereomikroskop yararlı olabilir. Bu şekilde, prob ucunun, aşamasının ve numunenin yukarıdan aşağıya hizalaması, bir deneye başlamadan önce görüntülenebilir (Şekil 2A).
4. Probun optik fiberinin SMA ile sonlandırılmış ucunu bir USB fiber optik spektrometreye (Malzeme Tablosu) bağlayın ve spektrometreyi bir USB kablosu kullanarak bilgisayara bağlayın.

4. Veri toplama

1. Deneysel kurulum
   1. Probu ve manipülatörleri, adım 3.4'te olduğu gibi, verilerin toplanacağı tam olarak hizalanmış konumda bulundurun.
   2. Probun kenarları ile doku numunesi arasındaki sürtünmeyi azaltmak için probun dokuya yerleştirilecek kısmına az miktarda silikon yağlayıcı (Malzeme Tablosu) dikkatlice uygulamak için pamuklu çubuk veya ince ölçülü iğne kullanın. Her taban çizgisi veya doku ölçümünden önce silikon yağlayıcıyı tekrar uygulayın.
   3. Boş numune Petri kabındaki deliği kaplayan bandı çıkarın ve sürtünme ile güvenli bir şekilde yerinde tutulduğundan emin olarak numune tutucuya yerleştirin (adım 2.7).
   4. Numuneyi probun üzerine indirmek için mikromanipülatörü kullanın. Probun jelatine petri kabının alt tarafındaki delikten girmesine izin verin. Prob, jelatin tabakasının tabanından yaklaşık 5 mm olana kadar devam edin.
   5. Işık kaynağını açın. Spektrometre yazılımını kullanarak, sinyal mümkün olduğunca yüksek ancak doygun olmayana kadar spektrometre entegrasyon süresini ayarlayın. Ortalama tarama sayısını iki ile beş arasında ve düzgünleştirici piksel değerini altı olarak ayarlayın. Bu aşamada kullanılabilir entegrasyon süreleri, bu taban çizgisi için 1-50 ms arasında değişebilir.
2. Referans spektrumlarının toplanması
   1. Karanlık bir ölçüm toplayın.
      1. Spektrometre parametreleri boş numune ile ayarlandıktan sonra, prob fiberini spektrometreden ayırın ve portu spektrometre ile birlikte gelen opak metal kapakla örtün.
      2. Spektrometrenin gürültüsünü giriş ışığı olmadan karakterize etmek için spektrometreden karanlık bir ölçüm elde edin (genellikle GUI'deki karanlık ampul simgesini kullanarak). Bu ölçümü veri toplama stratejisine göre kaydedin.
   2. Bir lamba ölçümü toplayın. Prob fiberini spektrometreye yeniden bağlayın, sinyalin stabilize olmasını bekleyin ve başka bir spektrum elde edin. Bu ölçüm, doku yokluğunda jelatin yoluyla proba ulaşan ışığı karakterize eder.
3. Doku spektrumlarının toplanması
   1. Numune Petri kabının altındaki bandı çıkarın ve numune tutucuya yerleştirin.
   2. Üç boyutlu manipülasyon kullanarak numune kabını probla hizalayın, böylece doku biyopsisi probun ucunun üzerinde ortalanır.
   3. Proba silikon jel uygulayın (bkz. 4.1.2) ve prob ucu doku örneğini destekleyen jelatinden geçene ve doku örneğine yeni girene kadar numuneyi yavaşça probun üzerine indirin.
      NOT: Bazı spektrometreler ve bilgisayar programları, algılanan ışığın gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar. Probun dokuya ne zaman girdiğini belirlemek için bunu kullanın. Spektrum yoğunluğu, prob ucu doku ile doğrudan temas eder etmez aniden azalacaktır.
   4. Ölçülen spektrumun çok gürültülü veya doygun olmadığından emin olarak entegrasyon süresinin ölçüm için uygun olduğunu doğrulayın. Gerekirse entegrasyon süresini değiştirin.
      1. Entegrasyon süresi her ayarlandığında, yeni bir karanlık ölçüm gerçekleştirin ve saklayın (adım 4.2.1). Ortalama tarama sayısını veya düzgünleştirilmiş piksel sayısını değiştirmeyin.
      2. Uygun ölçüm parametrelerini bulduktan sonra, ölçümleri yapın ve spektrumu kaydedin.
   5. Mikromanipülatörü kullanarak numuneyi belirli bir mesafeden aşağı taşıyın. Bu çalışma için kullanılan manipülatör için, her küçük onay işareti 0.001 inç veya 25.4 μm idi. Numune, her ölçüm için beş onay işareti veya 127 μm boyunca aşağı taşındı. 4.3.4 adımını yineleyin.
   6. Spektrumları doku içindeki her dikey pozisyonda kaydetmeye devam edin.
      NOT: Burada açıklanan sistem için, tek bir doku numunesi içindeki ölçümler için gerekli entegrasyon süreleri 1 ms ila 5 s arasında değişmiştir. Sonunda, prob ucu dokunun tepesinden çıkacak ve orada görünür olacaktır (Şekil 4A). Bu son ölçümdür ve dokunun üstündeki ışık olayını karakterize eder.
4. Verilerin yüklenmesi ve işlenmesi
   1. Toplanan tüm spektrumları (karanlık spektrumlar, lamba spektrumları ve doku ölçümleri) sınırlandırılmış metin dosyalarına dönüştürmek için spektrometrenin yazılımını kullanın.
   2. Matlab veya tercih ettiğiniz bir kodlama dilini kullanarak bir numune için tüm ölçüm dosyalarını yükleyin. Her doku ölçüm spektrumu için, karanlık spektrumu eşleşen entegrasyon süresiyle çıkarın ve ardından entegrasyon süresine bölün.
      NOT: Bu çalışmada, verilerin yüklenmesi ve işlenmesi için Matlab betiği kullanılmıştır (Ek Dosya 1).
   3. Doku içindeki prob ile elde edilen spektrumu, boş jelatinde elde edilen taban çizgisi spektrumuna bölerek dokudaki her pozisyona ulaşan gelen ışık yüzdesini hesaplayın.
      NOT: Dokunun üstündeki ölçüm (adım 4.3.6), jelatindeki temel ölçüme (adım 4.1) çok benzer olmalı ve bölündüğünde% 100'e yakın olmalıdır. Deneysel bağlama bağlı olarak, lamba spektrumu (boş jelatinden veya dokunun en üstünden gelen spektrum) referans olarak kullanılabilir. Bununla birlikte, deneye başlamadan önce bir lamba spektrumu toplamak hala önemlidir. Bunun nedeni, prob kırılırsa veya deney dokunun tepesine ulaşmadan önce başarısız olursa, arızadan önce elde edilen veriler hala kullanılabilir durumdadır, bu da karşılık gelen ilk lamba referans spektrumu yoksa durum böyle değildir.
   4. Verileri görselleştirin; kontur grafikleri yardımcı olabilir (Şekil 4B).

Representative Results

Bu protokol, aşağı doğru inen ışımayı (bir yönden bir noktaya ulaşan ışık) ölçmek veya ışık saçan küresel bir ucun eklenmesiyle skaler ışımayı (her yönden bir noktaya ulaşan ışık) ölçmek için kullanılabilecek bir mikro-optik prob oluşturma prosedürünü açıklar. Bu problar, canlı doku içindeki tek hücrelerin uzunluk ölçeklerine yaklaşan uzamsal çözünürlüklerde ışımayı ölçebilir. Bu protokol ayrıca, açıklanan probu kullanarak ışıma ölçümleri için bir doku örneği hazırlamak için temsili bir yöntem ve veri görüntüleme ve analizi için temsili bir yöntem açıklamaktadır.

Şekil 1'de mikro prob üretiminin çıktısı görülmektedir. Çekildiğinde, optik fiber yaklaşık 3 cm boyunca konik olmalı ve konik boyunca herhangi bir çizik olmamalıdır. Ayrıca sonunda düz olmalı ve çapı 15-30 μm olmalıdır (Şekil 1D). Ucun düzlüğü, ucun karborundum kağıdı ile zımparalanması veya puanlama ve tekrar kırılma ile iyileştirilebilir. Benzer şekilde, elyafın muhafazası olarak kullanılan çekilmiş cam pipetin keskin veya kırık kenarları olmamalıdır. Saçılma topu, elyafın düz, kesilmiş ucunun ucunda oluştuğunda, küresel olmalıdır (Şekil 1C). Kürlenmeden önce, şekilsiz olanlar, topu ana yapışkan damlacığa sokmak ve lifi hızlı bir şekilde dışarı çekmek için başka bir tur ile çıkarılabilir. Hızlı bir hareket hızı, tutkal topunu elyafın ucundan çekecektir. Daha yavaş hareketler, elyaf üzerinde ek yapışkan oluşumuna neden olur. Fiber bir ışık kaynağına bağlıyken diseksiyon mikroskobu kullanarak süreci izlemek, işi görselleştirmek ve işlemin çalışıp çalışmadığını belirlemek için yararlıdır. Saçılma yapıştırıcısını uygulamadan önce cam pipetin içindeki elyafı tutkal ve elektrik bandı ile sabitlemek önemlidir; aksi takdirde, lif kırılabilir veya yapıştırıcı kayan lifle bulaşabilir (Şekil 1).

Şekil 2'de ölçüm cihazı görülmektedir. Bu örnekte, hem doku örneği hem de prob tutucuları üç boyutlu ayarlama yeteneklerine sahiptir (Şekil 2). Hem numunenin hem de probun manipülatörlere bağlanması hizalamaya yardımcı olur, ancak gerekli değildir; Prob sabit bir direğe bağlanabilir. Manipülatörlerin en çözümlü hareketleri dikey, z yönünde yönlendirilmelidir, böylece dokudaki pozisyon ve / veya probların hareket ettiği miktar doğru bir şekilde belirlenebilir (Şekil 2A). Boma monte edilmiş bir stereomikroskop, probun sahne, tabak ve numune ile hizalanmasını kontrol etmek için sahneyi, probu ve numuneyi göz merceğinden görebilecek şekilde yerleştirildiğinde yararlı olabilir (Şekil 2B). Numuneyi probun üzerine indirirken spektrumları gerçek zamanlı olarak izlemek yararlıdır, çünkü prob tarafından ölçülen spektrum aniden değişirse, bu, numunenin yüksek oranda saçılan veya emilen dokunun içine başarıyla yerleştirildiğini veya probun büküldüğünü veya kırıldığını gösterir. Spektrumun şeklindeki ve yoğunluğundaki ani değişimler büyük olasılıkla doku girişini gösterirken, şekilde bir değişiklik olmadan ani yoğunluk değişiklikleri probun büküldüğünü veya kırıldığını gösterir. İstiridye dokusunun üst kısmında, probun kırılmadan nüfuz edemeyeceği ince ve berrak bir zar vardır. Böyle bir durumda, probun ne zaman çıkmak üzere olduğunu görmek için dokunun üst kısmı izlenmeli ve probun kırılmaması için ölçümler o noktada durdurulmalıdır.

Şekil 3 , bölüm 2'de açıklandığı gibi, bir Petri jelatin kabına gömülü doku biyopsi örneğini göstermektedir. Petri kabının dibinde, optik probun dokuya alttan yerleştirilmesine izin vermek için bir delik vardır. Biyopsi 8 mm çapındadır ve Petri kabındaki deliğin üzerinde ortalanmıştır (Şekil 3A). Doku örneğinin altında az miktarda jelatin vardır ve jelatin, dokunun üstündeki kabın üstüne doldurulur (Şekil 3B).

Şekil 4A, probu dokunun tepesinden çıkmaya başlarken gösterir ve Şekil 4B, temsili verileri gösterir. Şekil 4B'deki izleri oluşturmak için bir Matlab betiği (Ek Dosya 2) kullanılmıştır. X ekseni dalga boyudur ve y ekseni, taban çizgisi spektrumuna göre bir doku derinliğindeki ışığın yüzdesidir. Doku derinliği için bireysel ölçümler, gri tonlamalı renklendirme ile çizgilerle gösterilir. Dokuda daha derine inen ölçümler daha koyu bir çizgi ile temsil edilir. Temel spektrum, yalnızca jelatin içeren bir numunedeki ölçümdür ve lambayı ve probun lambaya tepkisini karakterize etmek için kullanılır. Jelatin hafif emilim ve saçılmaya sahiptir, yani dalga boyuna karşı jelatin emilim sinyali tamamen düz değildir. Bu nedenle, doku boyunca alınan spektrumlar ya jelatin içindeki probun spektrumuna ya da dokunun üstündeki probun spektrumuna bölünür, böylece Şekil 4B'de gösterilen spektral veriler sadece doku örneği için ışık yüzdesini temsil eder ve böylece ışık kaynağından bağımsızdır, jelatin ve her bir probun özellikleri.

Resim 1: Mikro-optik doku içi radyometri probunun üretim aşamaları . (A) Optik probun bir şeması. (B) Bitmiş optik probun görünümü. (C) Cam pipet desteğinin içindeki çekilmiş optik fibere tutturulmuş saçılma küresinin yakın çekimi. (D) Çekilen ve temizlenen optik fiber. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Doku içindeki skaler ışımayı ölçmek için deney düzeneğinin görüntüleri ve diyagramları. (A) Deney düzeneğinin genel şeması ve görüntüsü. (B) Örnek Petri çanak tutucusunun yakın çekimi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: İstiridye dokusu biyopsisi. (A) Üst ve (B) jelatinle doldurulmuş değiştirilmiş Petri kabında ölçülmeye hazır istiridye dokusu biyopsisinin yan görünümleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Temsili veriler . (A) Probun dokudan çıkarken nasıl göründüğüne dair mikroskop görüntüsü. (B) Doku içi radyometri probu ile elde edilen temsili veriler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Verilerin yüklenmesi ve işlenmesi için kullanılan Matlab betiği. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 2: Şekil 4B'deki izleri oluşturmak için kullanılan Matlab betiği. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Bu protokol, optik ortamı, yaklaşık olarak tek hücreler ölçeğinde uzamsal bir çözünürlüğe sahip büyük hacimli bir canlı doku aracılığıyla sistematik olarak karakterize etmek için bir tekniği tanımlar. Bu ucuz, esnek ve sahada izlenebilir yöntem, ışığın canlı sistemler içinde yayılmasını inceleyen herhangi bir araştırmacı için yararlı olabilir. Deneyimlere göre, mevcut yöntemlerle karşılaştırıldığında⁷, bu problar inşa etmek için biraz daha fazla pratik ve beceri gerektirir, ancak daha az doku hasarı ve daha büyük hacimli yoğun dokuyu daha kapsamlı bir şekilde karakterize etme yeteneği ile sonuçlanır.

Bu yöntem dört bölümden oluşmaktadır. Probu inşa eden ilk bölüm, önceki cihaz tasarımlarından esinlenmiştir^10,11. Mevcut yaklaşım, çekilen cam iğne hücreler arasında yavaşça kayabildiğinden, kalın dokunun tamamının sistematik, daha az yıkıcı taramaları için geliştirilmiştir. Ayrıca bir saha laboratuvarında kullanım için uygundur^12,13,14. Bu protokol, aşağı kuyu parlaklığını ölçmek için ~ 20 μm çapında uçlara sahip problar ve skaler ışımayı ölçmek için isteğe bağlı 50-100 μm çapında bir saçılma küresi ile sonuçlanır. Daha büyük veya daha küçük skaler ışınım küreleri, kullanılan malzemelerin, örneğin farklı bir başlangıç viskozitesine sahip UV ile kürlenebilir bir yapıştırıcının modifiye edilmesiyle geliştirilebilir. Hem pipet çekme hem de elyaf prosesindeki ağırlık, az ya da çok konik olacak şekilde ayarlanabilir. Isıtma hızı, çekme işlemini ve ortaya çıkan konikliği ayarlamak için torç alevinden uzaklığı boyunca da değiştirilebilir.

Prob yapım tekniği, mükemmelleştirmek için bazı manuel beceri ve deneme yanılma gerektirir, ancak pratikle güvenilir ve hızlı hale gelebilir. Burada, zaman içinde geliştirilen bazı sorun giderme nüansları sunulmaktadır. Optik fiberi ceketli uçtan aşağı çekmek, daha tutarlı koniklerle sonuçlanır. Küresel saçılma ucunu eklemeden önce opaklama kalemini uygulamak önemlidir, çünkü opak mürekkebin ıslatma özellikleri, lif ucunda düzenli bir yapışkan topunun oluşumunu olumlu yönde etkiler. Elde edilen yapışkan top şekilsiz ise, onu çıkarmak ve tekrar denemek mümkündür. Bunu yapmak için, mikromanipülatör, tüm topu yapışkan hazneye kaydırmak ve daha sonra çok yavaş bir şekilde geri çekmek için kullanılabilir. Bu genellikle ilk, şekilsiz girişimi çeker, yapışkan haznede bırakır ve tekrar denemeyi mümkün kılar.

Özenle işlenen bu problar, farklı numuneler için tekrar tekrar kullanılabilir. En büyük tehlike, prob ucunu hareket ettirirken yanlışlıkla bir şeye çarpmaktır. Ölçümler arasında, izopropil alkol ve basınçlı hava kullanılarak hücresel döküntülerden temizlenmelidir. Problar, prob ucu hiçbir şeye dokunmadığı sürece haftalarca saklanabilir ve fiber optik tertibat üzerinde, probu cam manşonun içinde tutan bandı ve yapıştırıcıyı ayırabilecek herhangi bir kuvvet yoktur. Bu, fiber ve cam pipeti birkaç yerde yüksek bir rafın kenarına sıkıştırarak gerçekleştirilebilir.

Bu yöntemin ikinci ve üçüncü kısımları, deneyin mekano-optik yönlerini ve ölçüm için dokunun sabitlenmesini içerir. Yöntemin bu kısmı, dev istiridye dokusu¹² içindeki doku içi skaler ışımayı ölçmek için özel olarak geliştirilmiştir. Burada, yöntemin bu yönlerini gidermeye yönelik ayrıntılar sunulmaktadır. İlk olarak, biyopsi proba göre büyük olmalıdır. Bu, probun dokuyu hareket ettirirken hareket etmesini önler. Ek olarak, doku Petri kabının dibine oturmalıdır, böylece jelatinin elastikiyeti ve ağırlığı, ölçüm sırasında dokuyu yerinde tutmak için birleşir. Odanın jelatini deneysel ışık kaynağı altında elastik, katı bir halde tutacak kadar soğuk olması da önemlidir. Benzer şekilde, görünür ışığa göre nispeten az ısı üretimine sahip bir LED veya başka bir kaynağın kullanılmasına yardımcı olur.

Yöntemin geometrik ve optomekanik parametreleri çok esnektir. Örneğin, skaler ışıma probu, sağlam bir farenin beyni ve yağ dokusu^13,14 içindeki ışımayı ölçmek için kullanıldı. Bunu yapmak için, prob standart bir kemirgen stereotaktik çerçeve üzerinde manipülatörlere monte edildi ve ışık kaynağı farenin kürsüsüne doğru işaret edecek şekilde monte edildi. Herhangi bir geometride, bu yöntemin başarılı bir şekilde kullanılmasının anahtarı, herhangi bir ölçümün başlangıcında her zaman uygun lamba ve karanlık referans spektrumlarını toplamaktır. Bir doku ölçümü sırasında bir prob kırılırsa ve doku yerinde olmadan ilk karakterizasyon yoksa, verilerin yorumlanması zor veya imkansız olacaktır ve yeni bir prob ile baştan başlamak gerekecektir. Buna karşılık, başlangıçta uygun referanslar bulunduğunda, kısmi ölçümler kullanılabilir verilerdir.

Bu yöntemin son kısmı veri toplama ile ilgilidir. Probdan gelen sinyalleri izlemek için bir fiber optik spektrometrenin kullanımı açıklanmaktadır, bu da SMA bağlantısının kolaylığını sağlar ve tam spektral dalga boyu bilgisi sağlar. Bununla birlikte, daha düşük foton akısına sahip sistemler için, bu probları fotoçarpan tüplerine veya çığ fotodiyotlarına bağlamak da mümkündür. Her durumda, tüm dedektörler her yeni ölçüm için referans ölçümler gerektirir. Bu nedenle, açıklanan veri toplama yöntemlerinde sadece küçük ayarlamalarla, tüm farklı optik parametre türleri karakterize edilebilir.

Bu yöntemin gelecekteki ilginç kullanımları, daha büyük memelilerin vücutlarının derinliklerinde ve sulu meyveler gibi karmaşık ışınım transfer özelliklerine sahip bitkilerde ışığın nicelleştirilmesi olabilir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1" travel ball bearing center+D11+A2:D31+A2:A2:D31	Edmond Optics	37-935	Part 2 of manipulator for lowering sample
1/4" thick acrylic sheet	McMaster-Carr	8505K754	For making Petri dish holder
3/4" mini spring clamp	Anvil	99693	Use as weight for pulling optical fiber
8 mm biopsy punch	Fisher Scientific	NC9324386	For tissue sample
Butane Torch	McMaster-Carr	MT-51	Heat source for pulling fiber and pipette
Collimating lens	Thorlabs	LLG5A1-A	To collimate light source through liquid light guide
Compressed air	McMaster-Carr	7437K35	For drying pulled fiber and pipette
Cyanoacrylate glue - liquid	McMaster-Carr	66635A31	For securing tapered fiber end at top of pulled pipette
Electrical tape	McMaster-Carr	76455A21	For securing fiber in pipette and for adding grip to clamps
Fine grade carborundum paper	McMaster-Carr	4649A24	Small triangle on exacto knife holder works well
Gelatin	Knox	10043000048679	For securing the tissue biopsy in the petri dish
Glass Pasteur Pipete	Fisher Scientific	13-678-20B	Disposable glass pipette 5.75" in length
Insulin syringes, 31G needle	BD	320440	For applying glue
Isopropanol	McMaster-Carr	54845T42	For cleaning pulled fiber and pipette
Kimwipe	Cole-Parmer	SKU 33670-04	For wiping optical fiber and glass pipette clean
LED driver	Thorlabs	LEDD1B	For powering the UV LEDs
Light source for measurements	Cole-Parmer	UX-78905-05	Low heat white light source for measurements
Linear metric X-Y-Z axis rack and pinion stage	Edmond Optics	55-023	Part 1 of manipulator for lowering sample
Liquid light guide	Thorlabs	LLG5-4T	For light source in measurements
Magnetic feet	Siskiyou	MGB 8-32	For use with magnetic strips
Magnetic strips	Siskiyou	MS-6.0	For mounting magnetically to breadboard
Manipulator #1	Siskiyou	MX10R	4-axis manipulator with pipette holder
Opaquer pen, small	WindowTint	TOP01	For opaquing side of optical fiber to prevent stray light from enter probe
Optical breadboard	Edmond Optics	03-640	For stable affixation of probe holder, sample, microscope and light source
Optical fibers	Ocean Optics	P-100-2-UV-VIS	About 4 fibers are good to have
Plasma light source	Thorlabs	HPLS345	For tissue radiometry measurements
Plastic plier clamp	McMaster-Carr	5070A11	Plier clamp used for weight in pulling pipette
Polystyrene Petri dishes	Thomas scientific	3488N10	Sample holders, enough volume to hold sample thickness plus ~10 mm of gelatin on top
Razor blades	McMaster-Carr	3962A3	For stripping jacketing from optical fiber
Silicone oil lubricant	Thomas scientific	1232E30	For reducing friction between probe and tissue
Software for analyzing data	Matlab		Chosen software for data analysis
Spectrometer + spectrometer software	Avantes	AvaSpec-2048L	Spectrometer can be any brand, this one is compatible with sma-terminated optical fibers and comes with its own software for running the spectrometer
Titanium dioxide powder	Sigma Aldrich	718467-100G	For making scattering sphere
Toolour tabletop clip	Toolour	Toolour0004	For holding pipette while pulling and for holding finished probes
Trigger-action bar clamps	mcMaster-Carr	51755A2	Good for holding optical fibers while pulling or curing
UV curable adhesive	Delo Photobond	GB368	For making scattering sphere
UV light source	Thorlabs	M365FP1	Light source for curing adhesive in scattering ball, this one is sma-fiber compatible, higher intensity = less cure time
White LED light source	Thorlabs	MCWHF2	For characterizing pulled fiber and scattering sphere