Summary
Настоящий протокол устанавливает и характеризует модель ксенотрансплантата пациента (PDX) анапластической карциномы щитовидной железы (ATC) и плоскоклеточного рака головы и шеи (HNSCC), поскольку модели PDX быстро становятся стандартом в области трансляционной онкологии.
Abstract
Модели ксенотрансплантата пациента (PDX) точно сохраняют гистологические и генетические характеристики первичной опухоли и поддерживают ее гетерогенность. Фармакодинамические результаты, основанные на моделях PDX, сильно коррелируют с клинической практикой. Анапластическая карцинома щитовидной железы (АТХ) является наиболее злокачественным подтипом рака щитовидной железы с сильной инвазивностью, плохим прогнозом и ограниченным лечением. Хотя уровень заболеваемости АТХ составляет всего 2-5% случаев рака щитовидной железы, уровень смертности от него достигает 15-50%. Плоскоклеточный рак головы и шеи (HNSCC) является одним из наиболее распространенных злокачественных новообразований головы и шеи, ежегодно во всем мире регистрируется более 600 000 новых случаев. Здесь представлены подробные протоколы для создания PDX-моделей УВД и HNSCC. В данной работе были проанализированы ключевые факторы, влияющие на успешность построения модели, а также проведено сравнение гистопатологических особенностей между моделью PDX и первичной опухолью. Кроме того, клиническая значимость модели была подтверждена путем оценки терапевтической эффективности in vivo репрезентативных клинически используемых препаратов в успешно построенных моделях PDX.
Introduction
Модель PDX представляет собой животную модель, в которой опухолевая ткань человека трансплантируется иммунодефицитным мышам и растет в среде, обеспечиваемой мышами1. Традиционные модели опухолевых клеточных линий страдают от ряда недостатков, таких как отсутствие гетерогенности, неспособность сохранить микроокружение опухоли, уязвимость к генетическим вариациям во время повторных пассажей in vitro и плохое клиническое применение 2,3. Основными недостатками генетически модифицированных животных моделей являются потенциальная потеря геномных особенностей опухолей человека, внедрение новых неизвестных мутаций и сложность определения степени гомологии между опухолями мыши и опухолями человека4. Кроме того, подготовка генно-инженерных моделей животных является дорогостоящей, трудоемкой и относительно неэффективной4.
Модель PDX имеет много преимуществ по сравнению с другими моделями опухолей с точки зрения отражения гетерогенности опухоли. С точки зрения гистопатологии, хотя мышиный аналог со временем заменяет строму человека, модель PDX хорошо сохраняет морфологическую структуру первичной опухоли. Кроме того, модель PDX сохраняет метаболомную идентичность первичной опухоли в течение, по крайней мере, четырех поколений и лучше отражает сложные взаимосвязи между опухолевыми клетками и их микроокружением, что делает ее уникальной в моделировании роста, метастазирования, ангиогенеза и иммуносупрессии опухолевой ткани человека 5,6,7. На клеточном и молекулярном уровнях модель PDX точно отражает меж- и внутриопухолевую гетерогенность опухолей человека, а также фенотипические и молекулярные характеристики исходного рака, включая паттерны экспрессии генов, мутационный статус, число копий, метилирование ДНК и протеомику 8,9. Модели PDX с разными пассажами имеют одинаковую чувствительность к лекарственной терапии, что указывает на высокую стабильность экспрессии генов моделей PDX10,11. Исследования показали отличную корреляцию между реакцией модели PDX на лекарственное средство и клиническими реакциями пациентов на этот препарат12,13. Таким образом, модель PDX стала мощной моделью доклинических и трансляционных исследований, особенно для скрининга лекарств и прогнозирования клинического прогноза.
Рак щитовидной железы является распространенной злокачественной опухолью эндокринной системы и представляет собой злокачественное новообразование человека, которое показало быстрый рост заболеваемости в последние14 лет. Анапластическая карцинома щитовидной железы (АТХ) является наиболее злокачественным раком щитовидной железы, при этом средняя выживаемость пациентов составляет всего 4,8 месяца15. Несмотря на то, что только у меньшинства пациентов с раком щитовидной железы ежегодно диагностируется АТХ в Китае, уровень смертности близок к 100%16,17,18. АТХ обычно быстро растет и проникает в соседние ткани шеи, а также в шейные лимфатические узлы, и около половины пациентов имеют отдаленные метастазы19,20. Плоскоклеточный рак головы и шеи (HNSCC) является шестым по распространенности раком в мире и одной из основных причин смерти от рака, при этом, по оценкам, 600 000 человек страдают от HNSCC каждый год21,22,23. HNSCC включает большое количество опухолей, в том числе в носу, пазухах, рту, миндалинах, глотке и гортани24. ATC и HNSCC являются двумя основными злокачественными новообразованиями головы и шеи. Чтобы облегчить разработку новых терапевтических агентов и персонализированных методов лечения, необходимо разработать надежные и продвинутые доклинические модели животных, такие как модели PDX ATC и HNSCC.
В данной статье представлены подробные методы построения подкожной PDX-модели ATC и HNSCC, проанализированы ключевые факторы, влияющие на скорость захвата опухоли в построении модели, и проведено сравнение гистопатологических характеристик между моделью PDX и первичной опухолью. Между тем, в этой работе были проведены фармакодинамические тесты in vivo с использованием успешно построенных моделей PDX с целью проверки их клинической значимости.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных проводились в соответствии с руководящими принципами и протоколами Ассоциации по оценке и аккредитации ухода за лабораторными животными, утвержденными Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Западно-Китайской больницы Сычуаньского университета. Для настоящего исследования использовали мышей с иммунодефицитом NOD-SCID в возрасте 4-6 недель (обоего пола) и самок обнаженных мышей Balb/c в возрасте 4-6 недель. Животные были получены из коммерческого источника (см. Таблицу материалов). Комитет по этике Западно-Китайской больницы разрешил проведение исследования на людях (протокол No 2020353). Каждый пациент предоставил письменное информированное согласие.
1. Экспериментальная подготовка
- Разложите одноразовые лезвия, стерилизованные ножницы и пинцеты и другие инструменты, необходимые для трансплантации опухоли, поместите их на сверхчистый верстак и заранее облучите ультрафиолетом.
- Подготовьте стерильный физиологический раствор и чашки Петри для использования во время теста.
2. Приобретение и транспортировка свежей опухолевой ткани
- Возьмите свежие образцы опухоли (обычно размером более 5 мм х 5 мм) из операционной и поместите их в центрифужную пробирку объемом 15 мл или 50 мл, содержащую стерильный раствор HTK (см. Таблицу материалов) или физиологический раствор. Промаркируйте пробирки центрифуги.
ПРИМЕЧАНИЕ: Свежие образцы опухоли были получены путем хирургического удаления или пункции у пациентов с ATC или HNSCC. - Поместите центрифужные пробирки в заранее подготовленный ящик для льда.
ПРИМЕЧАНИЕ: В течение этого времени оператор трансплантологии должен подготовить необходимые предметы для трансплантации (см. Таблицу материалов). - Убедитесь, что время между сбором проб и транспортировкой в лабораторию для строительства PDX не превышает 2 часов. Во время транспортировки окружайте пробирки, содержащие ткани, смесью ледяной воды или пакетами со льдом, чтобы сохранить активность тканей.
3. Трансплантация опухоли
- Как только опухолевые ткани поступят в лабораторию, запишите и перенумеруйте их.
ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании информация о пациенте хранилась в строгой конфиденциальности. Остальные этапы процедуры выполнялись в лаборатории 2-го уровня биобезопасности (BSL-2). При входе в лабораторию рекомендуется надевать халат поверх рабочей одежды или защитную одежду, головной убор и маску. Лечение опухолевой ткани проводится в кабинете биобезопасности. - Продезинфицируйте центрифужные пробирки, содержащие опухолевые ткани, 75% спиртом и поместите их на операционный стол. Перенесите опухолевые ткани в 6-сантиметровые чашки Петри, заполненные физиологическим раствором, с помощью стерилизованных глазных щипцов. Затем нарежьте их на небольшие кусочки размером примерно 2 мм х 2 мм и 3 мм х 3 мм с помощью лезвия.
- Перенесите кусочки опухолевых тканей в чашку Петри диаметром 6 см, содержащую соответствующее количество физиологического раствора, оберните чашку герметизирующей пленкой, поместите ее в ящик для льда и перенесите в комнату для животных, не содержащую патогенов (SPF) вместе с необходимыми инструментами (ножницами, щипцами и иглами для инокуляции).
- Подготовьте животное, выполнив следующие действия.
- Удалите волосы на правой боковой грудной клетке 4-6-недельных мышей женского или мужского возраста с иммунодефицитом NOD-SCID и продезинфицируйте кожу 75% спиртом. Обезболивают мышей внутрибрюшинной инъекцией 80 мг / кг кетамина и 10 мг / кг ксилазина (см. Таблицу материалов) и смазывают их глаза ветеринарной мазью, чтобы предотвратить сухость. Подтвердите глубину анестезии с помощью потери педального рефлекса.
- Сделайте разрез ножницами на 2 мм через кожу в середине правой боковой грудной клетки мышей.
- Возьмите кусочек опухоли из чашки Петри и поместите его щипцами в троакарную иглу размером 2,4 мм x 2,0 мм (см. Таблицу материалов).
- Удерживайте мышь, подтяните кожу в месте прокола, используйте троакар, содержащий части опухоли, чтобы вставить опухоль через начальный разрез кожи 2 мм, переместитесь в заднюю часть плеча и протолкните сердечник троакара.
- Убедитесь, что опухолевый кусочек вытолкнут и оставлен в переходной пазухе, образованной пункцией троакара, а затем вытащите троакар.
- Если опухоль перемещается вместе с иглой, когда она извлечена, используйте троакар, чтобы восстановить ее и зашить разрез.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании каждая мышь была привита в спинные передние и задние конечности. От одной до трех мышей были инокулированы на образец опухоли от каждого пациента в зависимости от размера опухоли.
4. Сохранение, фиксация и замораживание опухолевой ткани
ПРИМЕЧАНИЕ: Оставшиеся опухолевые ткани были использованы для сохранения, фиксации семян и замораживания ДНК / РНК / белка соответственно.
- Удалите физиологический раствор с поверхности опухоли стерильной марлей перед помещением его в пробирку для криоконсервации, чтобы убедиться, что поверхность опухоли не слишком влажная.
- Поместите четыре-шесть кусочков опухолевой ткани размером 2 мм x 2 мм в пробирку для криоконсервации клеток объемом 2 мл, добавьте в пробирку 1 мл раствора криоконсервации, состоящего из 90% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) и 10% диметилсульфоксида (ДМСО), поместите пробирку в градиентную охлаждающую камеру, заморозьте ее при температуре -80 ° C на ночь и, наконец, Переведите его на жидкий азот.
- Поместите блоки опухолевой ткани размером 3 мм х 3 мм в 10% буферный формалин для фиксации ткани для патологического исследования.
- Поместите тканевый блок размером 3 мм x 3 мм в пробирку для криоконсервации клеток объемом 2 мл, быстро заморозьте его в жидком азоте, а затем перенесите в холодильник с температурой -80 °C для экстракции ДНК / РНК и белка.
- Соберите клиническую информацию о пациентах, такую как история курения, размер опухоли, дифференцировка, патологический подтип, степень рака, стадия рака, отдаленные метастазы, происхождение, история болезни, иммуногистохимия, инфекция вируса папилломы человека (ВПЧ) у пациентов с HNSCC и лечение препаратами.
5. Пассажирование, криоконсервация и реанимация опухолей модели PDX
- Измерьте длину и ширину подкожных опухолей у мышей с помощью штангенциркуля один раз в неделю и рассчитайте объем опухоли по формуле: объем опухоли = 0,5 × длина × ширина2. Нарисуйте кривую роста опухоли.
- Когда опухоль PDX достигнет 2000мм3, передайте ее следующему поколению мышей и выполните повторную трансплантацию опухоли. Выполните подготовку инструментов, следуя шагу 4.
- Усыпляют мышей при вывихе шейки матки после анестезии 80 мг / кг кетамина.
- Продезинфицируйте кожу 75% спиртом. Затем разрежьте кожу вокруг опухоли с помощью ножниц, затем удалите опухоль щипцами и поместите ее в чашку Петри.
- Выполните процедуру трансплантации опухоли после шага 3.
- Выполните консервацию и криоконсервацию опухолей модели PDX после шага 4.
- Для реанимации опухолевой ткани придерживайтесь принципа медленного замораживания и быстрого рассасывания. После извлечения криовиалов из жидкого азота быстро поместите их на водяную баню при температуре 37 °C для быстрого растворения.
- Аккуратно встряхните криовиалы на водяной бане, чтобы ускорить процесс оттаивания.
- Разморозьте, перенесите кусочки опухоли в подготовленный нормальный физиологический раствор для промывания, а затем привите следующее поколение мышей. Для конкретной операции, пожалуйста, ознакомьтесь с процедурой трансплантации тканей на шаге 3.
6. Определение терапевтической эффективности ленватиниба и цисплатина в модели ATC PDX
ПРИМЕЧАНИЕ: Модель ATC PDX была использована для проверки терапевтического эффекта ингибитора тирозинкиназы ленватиниба и химиотерапевтического препарата цисплатина25,26,27.
- Выберите опухолевую ткань поколения P5 модели ATC PDX (THY-017), разрежьте на 3 кусочка ткани размером 2-4 мм и привите подкожно (шаг3 ) в правую заднюю часть десяти 4-6-недельных самок обнаженных мышей Balb/c.
- Выберите 15 мышей с объемом опухоли от 50 до 150мм3 и разделите их на три группы.
- Вводят ленватиниб (10 мг / кг) внутрижелудочно одной группе один раз в день в течение 15 дней, вводят цисплатин (3 мг / кг) внутрибрюшинно одной группе каждые 3 дня, в общей сложности шесть доз, и вводят контрольной группе тот же объем физиологического раствора.
- Измеряйте массу тела и объем опухоли мышей два раза в неделю.
- В конце теста усыпьте мышей (шаг 5.3) и взвесьте опухоли.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В общей сложности было пересажено 18 образцов рака щитовидной железы, и были успешно построены пять моделей рака щитовидной железы PDX (27,8% случаев взятия опухоли), включая четыре случая недифференцированного рака щитовидной железы и один случай анапластического рака щитовидной железы. Была проанализирована корреляция между успешностью построения модели и возрастом, полом, диаметром опухоли, степенью опухоли и дифференцировкой. Несмотря на то, что вероятность успеха образцов опухолей 4 степени была выше, чем у образцов с более низкими степенями, а вероятность успеха недифференцированных образцов опухолей также была выше, чем у высокодифференцированных образцов, результаты корреляционного анализа показали, что эти факторы не были связаны с вероятностью успеха модели PDX (таблица 1). Семнадцать образцов HNSCC были инокулированы, и четыре PDX-модели HNSCCC были успешно построены. Корреляционный анализ между частотой захвата опухоли в построении модели и клиническими параметрами образцов опухоли показал, что степень дифференцировки была связана с вероятностью успеха модели, в то время как возраст, пол, история курения, диаметр опухоли, степень рака, метастазы и инфекция ВПЧ не влияли на частоту захвата опухоли (табл. 2).
Кривые роста опухоли для каждой модели PDX были построены, чтобы лучше понять темпы роста моделей PDX у разных пациентов (рис. 1, рис. 2 и таблица 3). Средние онкогенные циклы (время от инокуляции до размера опухоли 1000 мм3) THY-004 от поколений P0 до P5 составляли 68 дней, 87 дней, 29 дней, 34 дня, 28 дней и 26 дней соответственно. Средние онкогенные циклы THY-012 от поколений P0 до P5 составляли 119 дней, 61 день, 66 дней, 55 дней, 87 дней и 116 дней соответственно. Средние онкогенные циклы THY-017 от поколений P0 до P5 составляли 27 дней, 17 дней, 30 дней, 13 дней, 22 дня и 15 дней соответственно. Средние онкогенные циклы THY-018 от поколений P0 до P3 составляли 134 дня, 70 дней, 48 дней и 48 дней соответственно. Средние онкогенные циклы THY-021 от поколений P0 до P3 составляли 53 дня, 66 дней, 35 дней и 49 дней соответственно. Средние онкогенные циклы OTO-017 от поколений P0 до P4 составляли 118 дней, 86 дней, 67 дней, 129 дней и 88 дней соответственно. Средние онкогенные циклы OTO-022 от поколений P0 до P5 составляли 155 дней, 55 дней, 32 дня, 37 дней, 27 дней и 46 дней соответственно. Средние онкогенные циклы OTO-030 от поколений P0 до P2 составили 133 дня, 93 дня и 104 дня соответственно. Средние онкогенные циклы OTO-031 от поколений P0 до P5 составляли 144 дня, 58 дней, 33 дня, 34 дня, 52 дня и 50 дней соответственно. Образцы ATC стабильно передавались поколению P3 и позже, в то время как в двух случаях образцы HNSCC не смогли сформировать опухоли после перехода к поколению P1. Темпы роста некоторых образцов были относительно медленными в поколении P0, но их темпы роста ускорились после перехода к P1 и более поздним поколениям. Проведено сравнение гистопатологических характеристик опухолей пациента с таковыми у разных поколений моделей PDX. Результаты показали, что опухоли PDX и первичные опухоли, полученные от пациентов, были морфологически почти одинаковы (рис. 3), с небольшими различиями, которые могут быть связаны с гетерогенностью в области выборки между пациентами и разными поколениями PDX.
Противоопухолевую эффективность ленватиниба (многоцелевого ингибитора тирозинкиназы, одобренного для лечения распространенного рака щитовидной железы28) оценивали в модели PDX ATC. Как показано на рисунке 4A, лечение ленватинибом значительно ингибировало рост опухоли в модели ATC PDX по сравнению с контрольной группой с нормальным физиологическим раствором (P < 0,05). В конце эксперимента опухолевую ткань иссекали и взвешивали для определения массы опухоли. По сравнению с контрольной группой масса опухоли в группе лечения ленватинибом была ниже, хотя статистическая разница не была достигнута (рис. 4B). Кроме того, у мышей, получавших ленватиниб, не наблюдалось явных изменений общего состояния и массы тела (рис. 4В). Из-за чрезмерной частоты введения цисплатина во время экспериментов у мышей наблюдалась значительная токсичность, проявляющаяся потерей веса и даже смертью. Противоопухолевая эффективность цисплатина показана на дополнительном рисунке 1.
Рисунок 1: Кривая роста опухоли моделей ATC PDX у разных пациентов. Каждый цвет представляет указанное поколение, а каждая кривая представляет одну опухоль. От одной до трех мышей были привиты в поколении пассажа 0 (P0), а пять мышей были привиты в последующих пассажах (P1-P5). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Кривая роста опухоли моделей HNSCC PDX у разных пациентов. Каждый цвет представляет указанное поколение, а каждая кривая представляет одну опухоль. От одной до трех мышей были привиты в поколении P0, а пять мышей были привиты в P1 и более поздних поколениях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Гистопатологическое исследование. Гистопатологическое сравнение между первичными опухолями пациента и соответствующими PDX (пассаж 1 и пассаж 3) ATC (THY-012, THY-017) и HNSCC (OTO-017) (окрашивание гематоксилин-эозином, 100x). Патологическими подтипами THY-012 и THY-017 были анапластическая карцинома щитовидной железы, а патологическим подтипом OTO-017 был плоскоклеточный рак. Масштабные линейки = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Терапевтическая эффективность ленватиниба в модели ATC PDX. Изменения (A) объема опухоли, (B) массы опухоли и (C) массы тела мышей, несущих ATC PDX, после лечения ленватинибом (10 мг / кг). Статистический анализ проводился с использованием Т-тестов для сравнения леватиниба с контролем. *P < 0,05 по сравнению с контролем считался статистически значимым. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Параметры | Класс | Скорость поглощения опухоли (%) | P |
| Возраст (лет) | <60 | 16.67 (1/6) | 0.615 |
| ≥60 | 33.33 (4/12) | ||
| Род | Мужской | 16.67 (1/6) | 0.615 |
| Женский | 33.33 (4/12) | ||
| Диаметр опухоли | <6см | 37.50 (3/8) | 0.608 |
| ≥6см | 20.00 (2/10) | ||
| Патологическая стадия TNM | Я | 0.00 (0/1) | 1 |
| Ш | 0.00 (0/1) | ||
 |
31.25 (5/16) | ||
| Дифференциация | Высокий | 0.00 (0/7) | 0.059 |
| Бедный | 25.00 (1/4) | ||
| Недифференцированный | 57.14 (4/7) |
Таблица 1: Корреляция между частотой захвата опухоли АТХ и клиническими характеристиками пациентов.
| Параметры | Класс | Скорость поглощения опухоли (%) | P |
| ВПЧ | Отрицательная | 33.33 (2/6) | 1 |
| Неизвестно или положительно | 36.36 (4/11) | ||
| Возраст (лет) | <60 | 33.33 (3/9) | 1 |
| ≥60 | 37.50 (3/8) | ||
| Род | Мужской | 50.00 (5/10) | 0.304 |
| Женский | 14.29 (1/7) | ||
| Статус курения | Когда-либо | 44.44 (4/9) | 0.62 |
| Никогда | 25.00 (2/8) | ||
| Диаметр опухоли | <3см | 40.00 (4/10) | 1 |
| ≥3см | 28.57 (2/7) | ||
| Патологическая стадия TNM | Я | 75.00 (3/4) | 0.423 |
 |
25.00 (2/8) | ||
| Ш | 0.00 (0/1) | ||
|
33.33 (1/3) | ||
| Отдаленные метастазы | Y | 28.57 (2/7) | 0.633 |
| N | 44.44 (4/9) | ||
| Дифференциация | Высокий | 12.50 (1/8) | 0.036* |
| От умеренного до высокого | 100.00 (2/2) | ||
| Умеренный | 0.00 (0/2) | ||
| От умеренного до бедного | 66.67 (2/3) | ||
| * P < 0,05 |
Таблица 2: Корреляция между частотой захвата опухоли HNSCC и клиническими характеристиками пациентов. *P < 0,05.
| Пример имени | Поколение от P до P0 | Поколение от P0 до P1 | Поколение от P1 до P2 | Поколение от P2 до P3 | Поколение от P3 до P4 | Поколение от P4 до P5 |
| THY-004 | 68 | 87 | 29 | 34 | 28 | 26 |
| THY-012 | 119 | 61 | 66 | 55 | 87 | 116 |
| THY-017 | 27 | 17 | 30 | 13 | 22 | 15 |
| THY-018 | 134 | 70 | 48 | 48 | - | - |
| THY-021 | 53 | 66 | 35 | 49 | - | - |
| ОТО-017 | 118 | 86 | 67 | 129 | - | - |
| ОТО-022 | 155 | 55 | 32 | 37 | 27 | 46 |
| ОТО-030 | 133 | 93 | 104 | - | - | - |
| ОТО-031 | 144 | 58 | 33 | 34 | 52 | 50 |
Таблица 3: Средний онкогенный цикл (время от инокуляции до опухоли размером 1,000мм3) моделей ATC и HNSCC.
Дополнительный рисунок 1: Терапевтическая эффективность цисплатина в модели ATC PDX. Изменения (A) объема опухоли, (B) массы опухоли и (C) массы тела мышей, несущих ATC PDX, после лечения цисплатином (3 мг / кг). Статистический анализ проводился с использованием Т-тестов для сравнения цисплатина с контролем. *P < 0,05 по сравнению с контролем считался статистически значимым. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Это исследование успешно установило подкожные PDX-модели ATC и HNSCC. Есть много аспектов, на которые следует обратить внимание в процессе построения модели PDX. Когда опухолевая ткань отделена от пациента, ее следует положить в ящик со льдом и как можно скорее отправить в лабораторию для инокуляции. После того, как опухоль поступит в лабораторию, оператор должен обратить внимание на поддержание стерильного поля и практиковать асептические процедуры. Для образцов пункционной биопсии, поскольку опухолевая ткань особенно мала, инокуляция после смешивания образца с матричным гелем будет более благоприятной для создания модели. Первичная опухолевая ткань также должна быть сохранена, зафиксирована и заморожена настолько, насколько это возможно для будущих исследований. Во время инокуляции воздух в троакаре должен быть максимально удален после того, как опухолевые кусочки были помещены в троакар перед использованием. После инокуляции опухоли рост опухоли следует наблюдать у мышей в течение 1-4 месяцев, а мышей без роста опухоли более 6 месяцев можно усыпить29.
Иммунодефицитные мыши обычно выбираются в качестве хозяина для построения модели PDX29,30. От поколения P0 до поколения P2 обычно используются мыши с иммунодефицитом (NOD-SCID), не страдающие ожирением, с сильно ослабленным диабетом (NOD-SCID) или мыши NOD Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG). В поколении P3 и далее образцы считаются стабильно передаваемыми, поэтому обнаженные мыши обычно также могут служить хозяином, и опухоли также могут нормально расти. Кроме того, общее время операции, время выделения опухоли, безрецидивная выживаемость и общая выживаемость пациентов, степень злокачественности опухоли и гистологический подтип были связаны с опухолевой моделью PDX31,32,33,34. Место трансплантации также влияет на успешность моделирования PDX, и исследования показали, что почечная капсула и ортотропная трансплантация имеют высокую онкогенную частоту33,35. Кроме того, применение Матригеля может также улучшить онкогенную частоту36,37. Сообщалось, что инфекция, вызванная вирусом папилломы человека (ВПЧ), влияет на успешность трансплантации опухолей HNSCC; ВПЧ-отрицательные опухоли имеют более высокую скорость захвата по сравнению с ВПЧ-положительными опухолями38,39. Это исследование не пришло к такому же выводу, вероятно, из-за небольшого количества выборок и неполной информации об инфекции ВПЧ.
В отличие от моделей ортотопической трансплантации и трансплантации почечной капсулы, подкожная модель более удобна для наблюдения за ростом опухолей, а также способствует операции40,41,42. Основываясь на данных о росте опухоли модели ATC и HNSCC PDX, мы обнаружили, что темпы роста опухолей у разных пациентов были непоследовательными, отражая межопухолевую гетерогенность. Скорость роста опухоли поколения P0 из большинства моделей PDX была относительно медленнее, чем для последних пассажей, что, вероятно, было связано с адаптацией микроокружения мыши. Примечательно, что скорость роста некоторых опухолей, полученных от пациентов, увеличивалась в различных пассажах после поколения P1, что согласуется с укороченным интервалом прохождения, о котором сообщили Pearson et al.43. Гистопатологическое исследование показало, что опухоли PDX сохранили морфологические характеристики первичных опухолей. Корреляция между моделью PDX и клиническими пациентами с АТХ также была отражена в результатах фармакодинамических тестов in vivo, которые продемонстрировали, что ленвартиниб проявлял хороший противоопухолевый эффект, что согласуется с клиническими отчетами25,26,27.
Однако модель PDX имеет и определенные недостатки. Например, время образования опухоли относительно велико, что не подходит для пациентов с запущенными или агрессивными опухолями. Кроме того, временные и финансовые затраты на высокопроизводительный скрининг лекарств слишком высоки44. Действительно, объединение модели PDX с опухолевыми органоидами и создание модели органоида пациента (PDO), соответствующей модели PDX, компенсирует этот недостаток44,45,46. Модели ортотопической трансплантации могут быть использованы для изучения патогенеза и метастатических механизмов опухолей40,41,47. Отсутствие функциональной иммунной системы является еще одним недостатком модели PDX, поэтому все большее число экспериментов использует гуманизированных мышей для построения модели PDX для исследований иммунологии опухолей48,49,50.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
О потенциальном конфликте интересов не сообщается.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Программой научно-технической поддержки провинции Сычуань (гранты No 2019JDRC0019 и 2021ZYD0097), проектом 1.3.5 по дисциплинам передового опыта, Западно-Китайская больница, Сычуаньский университет (грант No ZYJC18026), проектом 1.3.5 по дисциплинам передового опыта - Проект инкубации клинических исследований, Западно-Китайская больница, Сычуаньский университет (грант No 2020HXFH023), Фонды фундаментальных исследований для центральных университетов (SCU2022D025), Проект международного сотрудничества Научно-технического бюро Чэнду (грант No 2022-GH02-00023-HZ), проект «Инновационная искра» Сычуаньского университета (грант No 2019SCUH0015) и Фонд подготовки талантов для медико-инженерной интеграции Западно-китайской больницы - Университета электронных наук и технологий (грант No HXDZ22012).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.4 mm x 2.0 mm trocar | Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd | 18-9065 | |
| Balb/c nude mice | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | 401 | |
| Biosafety cabinet | Suzhou Antai | BSC-1300IIA2 | |
| Blade | Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd | 18-0823 | |
| Centrifuge tube | Corning | 430791/430829 | |
| Cryopreservation tube | Chengdu Dianrui Experimental Instrument Co., Ltd | / | |
| Custodiol HTK-Solution | Custodiol | 2103417 | |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | SIGMA-ALORICH | D5879-500mL | |
| Electronic balance | METTLER | ME104 | |
| Electronic digital caliper | Chengdu Chengliang Tool Group Co., Ltd | 0-220 | |
| fetal bovine serum(FBS) | VivaCell | C04001-500 | |
| IBM SPSS Statistics 26 | IBM | ||
| Ketamine | Jiangsu Zhongmu Beikang Pharmaceutical Co., Ltd | 100761663 | |
| Lenvatinib | ApexBio | A2174 | |
| NOD-SCID immunodeficient mice | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | 406 | |
| Pen-Strep Solution | Biological Industries | 03-03101BCS | |
| Petri dish | WHB | WHB-60/WHB-100 | |
| Saline | Sichuan Kelun | W220051705 | |
| Scissor | Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd | 18-0110 | |
| Tweezer | Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd | 18-1241 | |
| Vet ointment | Pfizer Inc. | P10015353 | |
| Xylazine | Dunhua Shengda Animal Medicine Co., Ltd | 070031777 |
References
- Toolan, H. W. Successful subcutaneous growth and transplantation of human tumors in X-irradiated laboratory animals. Proceedings of The Society for Experimental Biology and Medicine. 77 (3), 572-578 (1951).
- Gillet, J. P., et al. Redefining the relevance of established cancer cell lines to the study of mechanisms of clinical anti-cancer drug resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (46), 18708-18713 (2011).
- Hausser, H. J., Brenner, R. E. Phenotypic instability of Saos-2 cells in long-term culture. Biochemical & Biophysical Research Communications. 333 (1), 216-222 (2005).
- Pérez-Mancera, P., Guerra, C., Barbacid, M., Tuvesonet, D. A. What we have learned about pancreatic cancer from mouse models. Gastroenterology. 142 (5), 1079-1092 (2012).
- Bruna, A., et al. A biobank of breast cancer explants with preserved intra-tumor heterogeneity to screen anticancer compounds. Cell. 167 (1), 260-274 (2016).
- Choi, S., et al. Lessons from patient-derived xenografts for better in vitro modeling of human cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 79-80, 222-237 (2014).
- Blomme, A., et al. Murine stroma adopts a human-like metabolic phenotype in the PDX model of colorectal cancer and liver metastases. Oncogene. 37 (9), 1237-1250 (2018).
- Wang, D., et al. Molecular heterogeneity of non-small cell lung carcinoma patient-derived xenografts closely reflect their primary tumors. International Journal of Cancer. 140 (3), 662-673 (2016).
- Jung, J., et al. Generation and molecular characterization of pancreatic cancer patient-derived xenografts reveals their heterologous nature. Oncotarget. 7 (38), 62533-62546 (2016).
- Keysar, S., et al. A patient tumor transplant model of squamous cell cancer identifies PI3K inhibitors as candidate therapeutics in defined molecular bins. Molecular Oncology. 7 (4), 776-790 (2013).
- Rubio-Viqueira, B., et al. An in vivo platform for translational drug development in pancreatic cancer. Clinical Cancer Research. 12 (15), 4652-4661 (2006).
- Fiebig, H. H., et al. Development of three human small cell lung cancer models in nude mice. Recent Results in Cancer Research. 97, 77-86 (1985).
- Morelli, M. P., et al. Prioritizing phase I treatment options through preclinical testing on personalized tumorgraft. Journal of Clinical Oncology. 30 (4), 45-48 (2012).
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA. 68 (6), 394-424 (2018).
- Onoda, N., et al. Evaluation of the 8th edition TNM classification for anaplastic thyroid carcinoma. Cancers. 12 (3), 552 (2020).
- Nel, C., et al. Anaplastic carcinoma of the thyroid: A clinicopathologic study of 82 cases. Mayo Clinic Proceedings. 60 (1), 51-58 (1985).
- Mazzaferri, E. L. Increasing incidence of thyroid cancer in the United States, 1973-2002. Yearbook of Medicine. 2007, 496-499 (2007).
- Kebebew, E., Greenspan, F. S., Clark, O. H., Woeber, K. A., Mcmillan, A. Anaplastic thyroid carcinoma. Treatment outcome and prognostic factors. Cancer. 103 (7), 1330-1335 (2005).
- Lin, B., et al. The incidence and survival analysis for anaplastic thyroid cancer: A SEER database analysis. American Journal of Translational Research. 11 (9), 5888-5896 (2019).
- Maniakas, A., Dadu, R., Busaidy, N. L., Wang, J. R., Zafereo, M. Evaluation of overall survival in patients with anaplastic thyroid carcinoma, 2000-2019. JAMA Oncology. 6 (9), 1397-1404 (2020).
- Gilardi, M., et al. Tipifarnib as a precision therapy for HRAS-mutant head and neck squamous cell carcinomas. Molecular Cancer Therapeutics. 19 (9), 1784-1796 (2020).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Chow, L. Q. M.
- Swiecicki, P. L., Brennan, J. R., Mierzwa, M., Spector, M. E., Brenner, J. C. Head and neck squamous cell carcinoma detection and surveillance: Advances of liquid biomarkers. Laryngoscope. 129 (8), 1836-1843 (2019).
- Wang, R., et al. Distribution and activity of lenvatinib in brain tumor models of human anaplastic thyroid cancer cells in severe combined immune deficient mice. Molecular Cancer Therapeutics. 18 (5), 947-956 (2019).
- Takahashi, S., et al. A phase II study of the safety and efficacy of lenvatinib in patients with advanced thyroid cancer. Future Oncology. 15 (7), 717-726 (2019).
- Ferrari, S. M., et al. Lenvatinib exhibits antineoplastic activity in anaplastic thyroid cancer in vitro and in vivo. Oncology Reports. 39 (5), 2225-2234 (2018).
- Cabanillas, M. E., Habra, M. A. Lenvatinib: Role in thyroid cancer and other solid tumors. Cancer Treatment Reviews. 42, 47-55 (2016).
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The generation and application of patient-derived xenograft model for cancer research. Cancer Research and Treatment. 50 (1), 1-10 (2018).
- Peng, S., et al. Tumor grafts derived from patients with head and neck squamous carcinoma authentically maintain the molecular and histologic characteristics of human cancers. Journal of Translational Medicine. 11, 198 (2013).
- Derose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Chen, X., Shen, C., Wei, Z., Zhang, R., Xiao, K. Patient-derived non-small cell lung cancer xenograft mirrors complex tumor heterogeneity. Cancer Biology and Medicine. 18 (1), 184-198 (2021).
- Choi, Y. Y., et al. Establishment and characterisation of patient-derived xenografts as paraclinical models for gastric cancer. Scientific Reports. 6, 22172 (2016).
- Maider, I. V., Andrés, C., Alberto, B. Preclinical models for precision oncology. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. 1872 (2), 239-246 (2018).
- Okada, S., Vaeteewoottacharn, K., Kariya, R. Establishment of a patient-derived tumor xenograft model and application for precision cancer medicine. Chemical & Pharmaceutical Bulletin. 66 (3), 225-230 (2018).
- Michael, G., et al. Tumor take rate optimization for colorectal carcinoma patient-derived xenograft models. BioMed Research International. 2016, 1715053 (2016).
- Bernardo, C., Costa, C., Sousa, N., Amado, F., Santos, L. Patient-derived bladder cancer xenografts: a systematic review. Translational Research. 166 (4), 324-331 (2015).
- Facompre, N. D., et al. Barriers to generating PDX models of HPV-related head and neck. Laryngoscope. 127 (12), 2777-2783 (2017).
- Kang, H. N., Kim, J. H., Park, A. Y., Choi, J. W., Kim, H. R. Establishment and characterization of patient-derived xenografts as paraclinical models for head and neck cancer. BMC Cancer. 20 (1), 316 (2020).
- Ahn, S. H., et al. An orthotopic model of papillary thyroid carcinoma in athymic nude mice. Archives of Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 134 (2), 190-197 (2008).
- Nucera, C., et al. A novel orthotopic mouse model of human anaplastic thyroid carcinoma. Thyroid. 19 (10), 1077-1084 (2009).
- De Rose, F., et al. Galectin-3 targeting in thyroid orthotopic tumors opens new ways to characterize thyroid cancer. Journal of Nuclear Medicine. 60 (6), 770-776 (2019).
- Pearson, A. T., et al. Patient-derived xenograft (PDX) tumors increase growth rate with time. Oncotarget. 7 (7), 7993-8005 (2016).
- Huo, K. G., D'Arcangelo, E., Tsao, M. S. Patient-derived cell line, xenograft and organoid models in lung cancer therapy. Translational Lung Cancer Research. 9 (5), 2214-2232 (2020).
- Kumari, R., Xu, X., Li, H. Q. Translational and clinical relevance of PDX-derived organoid models in oncology drug discovery and development. Current Protocols. 2 (7), e431 (2022).
- Takahashi, N., et al. Construction of in vitro patient-derived tumor models to evaluate anticancer agents and cancer immunotherapy. Oncology Letters. 21 (5), 406 (2021).
- Barasch, A., et al. Photobiomodulation effects on head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) in an orthotopic animal model. Supportive Care in Cancer. 28 (6), 2721-2727 (2020).
- Wang, M., et al. Humanized mice in studying efficacy and mechanisms of PD-1-targeted cancer immunotherapy. FASEB Journal. 32 (3), 1537-1549 (2018).
- Wu, C., Wang, X., Shang, H., Wei, H. Construction of a humanized PBMC-PDX model to study the efficacy of a bacterial marker in lung cancer immunotherapy. Disease Markers. 2022, 1479246 (2022).
- Yao, L. C., et al. Creation of PDX-bearing humanized mice to study immuno-oncology. Methods in Molecular Biology. 1953, 241-252 (2019).
