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Cancer Research

एनाप्लास्टिक थायराइड कार्सिनोमा और सिर और गर्दन स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा के रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट मॉडल की स्थापना और लक्षण वर्णन

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/64623
Automatic Translation
1,3, 2, 3, 4, 3, 3, 1,3, 1,3, 2, 1,3
1Precision Medicine Research Center, Sichuan Provincial Key Laboratory of Precision Medicine, National Clinical Research Center for Geriatrics, West China Hospital, Sichuan University, 2Department of Thyroid Surgery, West China Hospital, Sichuan University, 3Sichuan Kangcheng Biotech Co., 4Sichuan Cancer Hospital

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल एनाप्लास्टिक थायराइड कार्सिनोमा (एटीसी) और सिर और गर्दन स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (एचएनएससीसी) के रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट (पीडीएक्स) मॉडल को स्थापित और चित्रित करता है, क्योंकि पीडीएक्स मॉडल तेजी से ट्रांसलेशनल ऑन्कोलॉजी के क्षेत्र में मानक बन रहे हैं।

Abstract

रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट (पीडीएक्स) मॉडल प्राथमिक ट्यूमर की हिस्टोलॉजिकल और आनुवंशिक विशेषताओं को ईमानदारी से संरक्षित करते हैं और इसकी विषमता को बनाए रखते हैं। पीडीएक्स मॉडल पर आधारित फार्माकोडायनामिक परिणाम नैदानिक अभ्यास के साथ अत्यधिक सहसंबद्ध हैं। एनाप्लास्टिक थायराइड कार्सिनोमा (एटीसी) थायराइड कैंसर का सबसे घातक उपप्रकार है, जिसमें मजबूत आक्रामकता, खराब रोग का निदान और सीमित उपचार है। हालांकि एटीसी की घटना दर थायराइड कैंसर का केवल 2% -5% है, इसकी मृत्यु दर 15% -50% जितनी अधिक है। सिर और गर्दन स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (एचएनएससीसी) सबसे आम सिर और गर्दन की विकृतियों में से एक है, जिसमें हर साल दुनिया भर में 600,000 से अधिक नए मामले सामने आते हैं। इसमें, एटीसी और एचएनएससीसी के पीडीएक्स मॉडल स्थापित करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किए गए हैं। इस काम में, मॉडल निर्माण की सफलता दर को प्रभावित करने वाले प्रमुख कारकों का विश्लेषण किया गया था, और हिस्टोपैथोलॉजिकल विशेषताओं की तुलना पीडीएक्स मॉडल और प्राथमिक ट्यूमर के बीच की गई थी। इसके अलावा, मॉडल की नैदानिक प्रासंगिकता को सफलतापूर्वक निर्मित पीडीएक्स मॉडल में प्रतिनिधि नैदानिक रूप से उपयोग की जाने वाली दवाओं की विवो चिकित्सीय प्रभावकारिता का मूल्यांकन करके मान्य किया गया था।

Introduction

पीडीएक्स मॉडल एक पशु मॉडल है जिसमें मानव ट्यूमर ऊतक को इम्यूनोडेफिशिएंट चूहों में प्रत्यारोपित किया जाता हैऔर चूहों द्वारा प्रदान किए गए वातावरण में बढ़ता है। पारंपरिक ट्यूमर सेल लाइन मॉडल कई नुकसानों से पीड़ित हैं, जैसे विषमता की कमी, ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट को बनाए रखने में असमर्थता, बार-बार इन विट्रो मार्ग के दौरान आनुवंशिक विविधताओं की भेद्यता, और खराब नैदानिक अनुप्रयोग 2,3। आनुवंशिक रूप से इंजीनियर पशु मॉडल की मुख्य कमियां मानव ट्यूमर की जीनोमिक विशेषताओं का संभावित नुकसान, नए अज्ञात उत्परिवर्तन की शुरूआत और माउस ट्यूमर और मानव ट्यूमर4 के बीच होमोलॉजी की डिग्री की पहचान करने में कठिनाई है। इसके अलावा, आनुवंशिक रूप से इंजीनियर पशु मॉडल की तैयारी महंगी, समय लेने वाली और अपेक्षाकृत अक्षमहै।

पीडीएक्स मॉडल में ट्यूमर विषमता को प्रतिबिंबित करने के मामले में अन्य ट्यूमर मॉडल पर कई फायदे हैं। हिस्टोपैथोलॉजी के दृष्टिकोण से, हालांकि माउस समकक्ष समय के साथ मानव स्ट्रोमा को प्रतिस्थापित करता है, पीडीएक्स मॉडल प्राथमिक ट्यूमर की रूपात्मक संरचना को अच्छी तरह से संरक्षित करता है। इसके अलावा, पीडीएक्स मॉडल कम से कम चार पीढ़ियों के लिए प्राथमिक ट्यूमर की चयापचय पहचान का संरक्षण करता है और ट्यूमर कोशिकाओं और उनके माइक्रोएन्वायरमेंट के बीच जटिल अंतर-संबंधों को बेहतर ढंग से दर्शाता है, जिससे यह मानव ट्यूमर ऊतक 5,6,7 के विकास, मेटास्टेसिस, एंजियोजेनेसिस और इम्यूनोसप्रेशन का अनुकरण करने में अद्वितीय है।. सेलुलर और आणविक स्तरों पर, पीडीएक्स मॉडल मानव ट्यूमर के अंतर-और इंट्रा-ट्यूमर विषमता के साथ-साथ मूल कैंसर की फेनोटाइपिक और आणविक विशेषताओं को सटीक रूप से दर्शाता है, जिसमें जीन अभिव्यक्ति पैटर्न, उत्परिवर्तन स्थिति, कॉपी संख्या और डीएनए मिथाइलेशन और प्रोटिओमिक्स 8,9 शामिल हैं। विभिन्न मार्गों के साथ पीडीएक्स मॉडल में ड्रग थेरेपी के लिए समान संवेदनशीलता होती है, यह दर्शाता है कि पीडीएक्स मॉडल की जीन अभिव्यक्ति अत्यधिक स्थिर10,11 है। अध्ययनों ने एक दवा के लिए पीडीएक्स मॉडल की प्रतिक्रिया और उस दवा12,13 के लिए रोगियों की नैदानिक प्रतिक्रियाओं के बीच एक उत्कृष्ट सहसंबंध दिखाया है। इसलिए, पीडीएक्स मॉडल एक शक्तिशाली प्रीक्लिनिकल और ट्रांसलेशनल रिसर्च मॉडल के रूप में उभरा है, विशेष रूप से दवा स्क्रीनिंग और नैदानिक पूर्वानुमान पूर्वानुमान के लिए।

थायराइड कैंसर अंतःस्रावी तंत्र का एक सामान्य घातक ट्यूमर है और एक मानव दुर्दमता है जिसने हालके वर्षों में घटनाओं में तेजी से वृद्धि दिखाई है। एनाप्लास्टिक थायराइड कार्सिनोमा (एटीसी) सबसे घातक थायराइड कैंसर है, जिसमें औसत रोगी केवल 4.8 महीने15 के जीवित रहता है। हालांकि चीन में हर साल थायराइड कैंसर के रोगियों में से केवल एक अल्पसंख्यक को एटीसी का निदान किया जाता है, मृत्यु दर 100% 16,17,18 के करीब है। एटीसी आमतौर पर तेजी से बढ़ता है और गर्दन के आसन्न ऊतकों के साथ-साथ ग्रीवा लिम्फ नोड्स पर आक्रमण करता है, और लगभग आधे रोगियों में दूर के मेटास्टेस19,20 होते हैं। सिर और गर्दन स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (एचएनएससीसी) दुनिया में छठा सबसे आम कैंसर है और कैंसर से होने वाली मौतों के प्रमुख कारणों में से एक है, जिसमें अनुमानित 600,000 लोग हर साल21,22,23 एचएनएससीसी से पीड़ित होते हैं। एचएनएससीसी में बड़ी संख्या में ट्यूमर शामिल हैं, जिनमें नाक, साइनस, मुंह, टॉन्सिल, ग्रसनी और स्वरविद्या24 शामिल हैं। एटीसी और एचएनएससीसी मुख्य सिर और गर्दन की विकृतियों में से दो हैं। नए चिकित्सीय एजेंटों और व्यक्तिगत उपचार के विकास को सुविधाजनक बनाने के लिए, एटीसी और एचएनएससीसी के पीडीएक्स मॉडल जैसे मजबूत और उन्नत प्रीक्लिनिकल पशु मॉडल विकसित करना आवश्यक है।

यह लेख एटीसी और एचएनएससीसी के चमड़े के नीचे पीडीएक्स मॉडल स्थापित करने के लिए विस्तृत तरीकों का परिचय देता है, मॉडल निर्माण में ट्यूमर लेने की दर को प्रभावित करने वाले प्रमुख कारकों का विश्लेषण करता है, और पीडीएक्स मॉडल और प्राथमिक ट्यूमर के बीच हिस्टोपैथोलॉजिकल विशेषताओं की तुलना करता है। इस बीच, इस काम में, विवो फार्माकोडायनामिक परीक्षणों में सफलतापूर्वक निर्मित पीडीएक्स मॉडल का उपयोग करके उनकी नैदानिक प्रासंगिकता को मान्य करने के लिए प्रदर्शन किया गया था।

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Protocol

सभी पशु प्रयोग ों को एसोसिएशन फॉर असेसमेंट एंड एक्रेडिटेशन ऑफ लेबोरेटरी एनिमल केयर दिशानिर्देशों और वेस्ट चाइना अस्पताल, सिचुआन विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार किया गया था। वर्तमान अध्ययन के लिए 4-6 सप्ताह (दोनों लिंगों के) आयु वर्ग के एनओडी-एससीआईडी इम्यूनोडेफिशिएंट चूहों और 4-6 सप्ताह की आयु की महिला बाल्ब / सी नग्न चूहों का उपयोग किया गया था। जानवरों को एक वाणिज्यिक स्रोत से प्राप्त किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)। वेस्ट चाइना अस्पताल की आचार समिति ने मानव विषयों (प्रोटोकॉल नंबर 2020353) के साथ अध्ययन को अधिकृत किया। प्रत्येक रोगी ने लिखित सूचित सहमति प्रदान की।

1. प्रायोगिक तैयारी

  1. डिस्पोजेबल ब्लेड, स्टरलाइज्ड कैंची और चिमटी, और ट्यूमर प्रत्यारोपण के लिए आवश्यक अन्य उपकरणों की व्यवस्था करें, उन्हें अल्ट्रा-क्लीन वर्कबेंच पर रखें, और उन्हें पहले से पराबैंगनी प्रकाश के साथ विकिरणित करें।
  2. परीक्षण के दौरान उपयोग के लिए बाँझ नमकीन और पेट्री व्यंजन तैयार करें।

2. ताजा ट्यूमर ऊतक का अधिग्रहण और परिवहन

  1. ऑपरेटिंग रूम से ताजा ट्यूमर के नमूने (आमतौर पर आकार में 5 मिमी x 5 मिमी से बड़े) प्राप्त करें, और उन्हें बाँझ एचटीके समाधान ( सामग्री की तालिका देखें) या खारा युक्त 15 एमएल या 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रखें। सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को लेबल करें।
    नोट: ताजा ट्यूमर के नमूने एटीसी या एचएनएससीसी वाले रोगियों से सर्जिकल हटाने या पंचर करके प्राप्त किए गए थे।
  2. सेंट्रीफ्यूज ट्यूब को पहले से तैयार किए गए आइस बॉक्स में डालें।
    नोट: इस समय के दौरान, प्रत्यारोपण ऑपरेटर को प्रत्यारोपण के लिए आवश्यक वस्तुओं को तैयार करना होगा ( सामग्री की तालिका देखें)।
  3. सुनिश्चित करें कि पीडीएक्स निर्माण के लिए नमूना संग्रह और प्रयोगशाला में परिवहन के बीच का समय 2 घंटे से अधिक नहीं है। परिवहन के दौरान, ऊतक गतिविधि को संरक्षित करने के लिए बर्फ-पानी के मिश्रण या बर्फ पैक के साथ ऊतकों वाले ट्यूबों को घेरें।

3. ट्यूमर प्रत्यारोपण

  1. एक बार जब ट्यूमर ऊतक प्रयोगशाला में पहुंच जाते हैं, तो उन्हें रिकॉर्ड करें और फिर से नंबर दें।
    नोट: वर्तमान अध्ययन के लिए, रोगी की जानकारी को सख्ती से गोपनीय रखा गया था। प्रक्रिया के शेष चरणों को जैव सुरक्षा स्तर 2 (बीएसएल -2) प्रयोगशाला में किया गया था। प्रयोगशाला में प्रवेश करते समय, काम के कपड़े या सुरक्षात्मक कपड़े, एक टोपी और एक मास्क पहनने की सिफारिश की जाती है। ट्यूमर ऊतक का उपचार एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में आयोजित किया जाता है।
  2. 75% अल्कोहल के साथ ट्यूमर ऊतकों वाले सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को कीटाणुरहित करें, और उन्हें ऑपरेटिंग टेबल पर रखें। ट्यूमर के ऊतकों को 6 सेमी पेट्री व्यंजनों में स्थानांतरित करें जो निष्फल नेत्र बल का उपयोग करके खारा से भरे होते हैं। इसके बाद, उन्हें ब्लेड का उपयोग करके लगभग 2 मिमी x 2 मिमी और 3 मिमी x 3 मिमी के छोटे टुकड़ों में काट लें।
  3. ट्यूमर के ऊतकों के टुकड़ों को 6 सेमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें जिसमें उचित मात्रा में खारा हो, पकवान को सीलिंग फिल्म के साथ लपेटें, इसे एक बर्फ बॉक्स में रखें, और इसे आवश्यक उपकरणों (कैंची, बल, और टीकाकरण सुइयों की एक जोड़ी) के साथ विशिष्ट रोगज़नक़-मुक्त (एसपीएफ) पशु कमरे में ले जाएं।
  4. नीचे दिए गए चरणों का पालन करके जानवर तैयार करें।
    1. 4-6 सप्ताह की मादा या पुरुष एनओडी-एससीआईडी इम्यूनोडेफिशिएंट चूहों के दाहिने पार्श्व वक्ष पर बालों को हटा दें, और 75% अल्कोहल के साथ त्वचा को कीटाणुरहित करें। 80 मिलीग्राम / किग्रा केटामाइन और 10 मिलीग्राम / किग्रा ज़ाइलेज़िन के इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा चूहों को एनेस्थेटाइज करें ( सामग्री की तालिका देखें), और सूखापन को रोकने के लिए पशु चिकित्सक मरहम के साथ उनकी आंखों को स्मीयर करें। पेडल रिफ्लेक्स के नुकसान के माध्यम से संज्ञाहरण की गहराई की पुष्टि करें।
    2. चूहों के दाहिने पार्श्व वक्ष के बीच में त्वचा के माध्यम से कैंची के साथ 2 मिमी चीरा लगाएं।
  5. पेट्री डिश से एक ट्यूमर का टुकड़ा लें, और इसे 2.4 मिमी x 2.0 मिमी ट्रोकार सुई ( सामग्री की तालिका देखें) में बल के साथ रखें।
  6. माउस को पकड़ें, पंचर साइट पर त्वचा को कसें, प्रारंभिक 2 मिमी त्वचा चीरा के माध्यम से ट्यूमर को डालने के लिए ट्यूमर के टुकड़ों वाले ट्रोकार का उपयोग करें, कंधे के पीछे जाएं, और ट्रोकर कोर को धक्का दें।
  7. सुनिश्चित करें कि ट्यूमर के टुकड़े को बाहर धकेल दिया जाता है और ट्रोकर पंचर द्वारा गठित संक्रमणकालीन साइनस में छोड़ दिया जाता है, और फिर ट्रोकर को बाहर खींचें।
  8. यदि ट्यूमर वापस लेने पर सुई के साथ चलता है, तो इसे रीसेट करने और चीरे को सिकोड़ने के लिए ट्रोकार का उपयोग करें।
    नोट: इस अध्ययन में, प्रत्येक माउस को पृष्ठीय अग्र भाग और पिछले अंगों पर टीका लगाया गया था। ट्यूमर के आकार के आधार पर प्रत्येक रोगी से प्रति ट्यूमर नमूने में एक से तीन चूहों को टीका लगाया गया था।

4. ट्यूमर ऊतक संरक्षण, निर्धारण और प्रोटीन फ्रीजिंग

नोट: शेष ट्यूमर ऊतकों का उपयोग क्रमशः बीज संरक्षण, निर्धारण, और डीएनए / आरएनए / प्रोटीन फ्रीजिंग के लिए किया गया था।

  1. क्रायोप्रिजर्वेशन ट्यूब में रखने से पहले ट्यूमर की सतह से खारा निकालें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि ट्यूमर की सतह अत्यधिक गीली नहीं है।
  2. 2 एमएल सेल क्रायोप्रिजर्वेशन ट्यूब में 2 मिमी x 2 मिमी ट्यूमर ऊतक के चार से छह टुकड़े डालें, ट्यूब में 90% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 10% डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) से बना 1 एमएल क्रायोप्रिजर्वेशन समाधान जोड़ें, ट्यूब को ग्रेडिएंट कूलिंग बॉक्स में डालें, इसे रात भर -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें, और अंत में, इसे तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित करें।
  3. पैथोलॉजिकल परीक्षा के लिए ऊतक निर्धारण के लिए 10% बफर फॉर्मेलिन में 3 मिमी x 3 मिमी ट्यूमर ऊतक ब्लॉक रखें।
  4. 3 मिमी x 3 मिमी ऊतक ब्लॉक को 2 एमएल सेल क्रायोप्रिजर्वेशन ट्यूब में डालें, जल्दी से इसे तरल नाइट्रोजन में फ्रीज करें, और फिर डीएनए / आरएनए और प्रोटीन निष्कर्षण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में स्थानांतरित करें।
  5. रोगियों की नैदानिक जानकारी एकत्र करें, जैसे कि धूम्रपान इतिहास, ट्यूमर का आकार, भेदभाव, पैथोलॉजिकल उपप्रकार, कैंसर ग्रेड, कैंसर चरण, दूर मेटास्टेसिस, उत्पत्ति, चिकित्सा इतिहास, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री, एचएनएससीसी रोगियों में मानव पेपिलोमावायरस (एचपीवी) संक्रमण, और उपचार दवा।

5. पीडीएक्स मॉडल ट्यूमर की पासिंग, क्रायोप्रिजर्वेशन, और पुनर्जीवन।

  1. सप्ताह में एक बार वर्नियर कैलिपर्स का उपयोग करके चूहों में चमड़े के नीचे के ट्यूमर की लंबाई और चौड़ाई को मापें, और सूत्र के अनुसार ट्यूमर की मात्रा की गणना करें: ट्यूमर की मात्रा = 0.5 × लंबाई × चौड़ाई2। ट्यूमर के विकास वक्र को खींचें।
  2. जब पीडीएक्स ट्यूमर 2,000 मिमी3 तक पहुंच जाता है, तो इसे चूहों की अगली पीढ़ी को पारित करें, और ट्यूमर पुन: प्रत्यारोपण करें। चरण 4 का पालन करते हुए उपकरणों की तैयारी करें।
  3. 80 मिलीग्राम / किग्रा केटामाइन के साथ एनेस्थेटाइज करने के बाद गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा चूहों को इच्छामृत्यु करें।
  4. 75% अल्कोहल के साथ त्वचा को कीटाणुरहित करें। फिर, कैंची का उपयोग करके ट्यूमर के आसपास की त्वचा को काट लें, फिर ट्यूमर को बल के साथ हटा दें, और इसे पेट्री डिश में रखें।
  5. चरण 3 के बाद ट्यूमर प्रत्यारोपण प्रक्रिया करें।
  6. चरण 4 के बाद पीडीएक्स मॉडल ट्यूमर के संरक्षण और क्रायोप्रिजर्वेशन का प्रदर्शन करें।
  7. ट्यूमर ऊतक के पुनर्जीवन के लिए, धीमी ठंड और त्वरित विघटन के सिद्धांत का पालन करें। तरल नाइट्रोजन से क्रायोवियल निकालने के बाद, जल्दी से उन्हें तेजी से घुलने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में रखें।
  8. पिघलने की प्रक्रिया में तेजी लाने के लिए पानी के स्नान में क्रायोवियल को धीरे से हिलाएं।
  9. पिघलें, ट्यूमर के टुकड़ों को धोने के लिए तैयार सामान्य खारा में स्थानांतरित करें, और फिर अगली पीढ़ी के चूहों को टीका लगाएं। विशिष्ट ऑपरेशन के लिए, कृपया चरण 3 में ऊतक प्रत्यारोपण प्रक्रिया देखें।

6. एटीसी पीडीएक्स मॉडल में लेनवाटिनिब और सिस्प्लाटिन की चिकित्सीय प्रभावकारिता का निर्धारण

नोट: एटीसी पीडीएक्स मॉडल का उपयोग टायरोसिन किनेज इनहिबिटर लेनवाटिनिब और कीमोथेरेपी दवा सिस्प्लैटिन25,26,27 के चिकित्सीय प्रभाव का परीक्षण करने के लिए किया गया था।

  1. एटीसी पीडीएक्स मॉडल (टीएचवाई -017) के पी 5 पीढ़ी के ट्यूमर ऊतक का चयन करें, 2-4 मिमी 3 ऊतक टुकड़ों में काट लें, और दस 4-6 सप्ताह की मादा बाल्ब / सी नग्न चूहों की दाईं पीठ पर चमड़े के नीचे (चरण3 ) टीका लगाएं।
  2. 50-150 मिमी3 के बीच ट्यूमर वॉल्यूम वाले 15 चूहों का चयन करें, और उन्हें तीन समूहों में विभाजित करें।
  3. 15 दिनों के लिए रोजाना एक बार एक समूह को लेनवाटिनिब (10 मिलीग्राम / किग्रा) इंट्रागैस्ट्रिक रूप से प्रशासित करें, कुल छह खुराक के लिए हर 3 दिनों में एक समूह को सिस्प्लाटिन (3 मिलीग्राम / किग्रा) इंट्रापरिटोनियल रूप से प्रशासित करें, और नियंत्रण समूह को सामान्य खारा की समान मात्रा के साथ प्रशासित करें।
  4. प्रति सप्ताह दो बार चूहों के शरीर के वजन और ट्यूमर की मात्रा को मापें।
  5. परीक्षण के अंत में, चूहों (चरण 5.3) को इच्छामृत्यु दें, और ट्यूमर का वजन करें।

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Representative Results

कुल 18 थायराइड कैंसर के नमूनों को प्रत्यारोपित किया गया था, और थायराइड कैंसर के पांच पीडीएक्स मॉडल का सफलतापूर्वक निर्माण किया गया था (27.8% ट्यूमर लेने की दर), जिसमें अविभाजित थायराइड कैंसर के चार मामले और एनाप्लास्टिक थायराइड कैंसर का एक मामला शामिल था। मॉडल निर्माण की सफलता दर और उम्र, लिंग, ट्यूमर व्यास, ट्यूमर ग्रेड और भेदभाव के बीच सहसंबंध का विश्लेषण किया गया था। यद्यपि ग्रेड 4 ट्यूमर नमूनों की मॉडल सफलता दर कम ग्रेड वाले नमूनों की तुलना में अधिक थी, और उदासीन ट्यूमर नमूनों की सफलता दर भी अत्यधिक विभेदित नमूनों की तुलना में अधिक थी, सहसंबंध विश्लेषण परिणामों से पता चला कि ये कारक पीडीएक्स मॉडल की सफलता दर से जुड़े नहीं थे (तालिका 1). सत्रह एचएनएससीसी नमूनों को टीका लगाया गया था, और एचएनएससीसीसी के चार पीडीएक्स मॉडल सफलतापूर्वक बनाए गए थे। मॉडल निर्माण में ट्यूमर लेने की दर और ट्यूमर के नमूनों के नैदानिक मापदंडों के बीच सहसंबंध विश्लेषण से पता चला है कि भेदभाव की डिग्री मॉडल सफलता दर से जुड़ी थी, जबकि उम्र, लिंग, धूम्रपान इतिहास, ट्यूमर व्यास, कैंसर ग्रेड, मेटास्टेसिस और एचपीवी संक्रमण ने ट्यूमर लेने की दर को प्रभावित नहीं किया (तालिका 2)।

प्रत्येक पीडीएक्स मॉडल के लिए ट्यूमर विकास वक्रों को विभिन्न रोगियों (चित्रा 1, चित्रा 2, और तालिका 3) से पीडीएक्स मॉडल की वृद्धि दर को बेहतर ढंग से समझने के लिए प्लॉट किया गया था। पी0 से पी5 पीढ़ी तक टीएचआई-004 के औसत ट्यूमरोजेनिक चक्र (टीकाकरण से 1,000 मिमी3 के ट्यूमर आकार तक का समय) क्रमशः 68 दिन, 87 दिन, 29 दिन, 34 दिन, 28 दिन और 26 दिन थे। पी0 से पी5 तक पी2 से टीएचआई-012 के औसत ट्यूमरोजेनिक चक्र क्रमशः 119 दिन, 61 दिन, 66 दिन, 55 दिन, 87 दिन और 116 दिन थे। पी0 से पी5 तक पी0 से पी5 तक टीएचआई-017 के औसत ट्यूमरोजेनिक चक्र क्रमशः 27 दिन, 17 दिन, 30 दिन, 13 दिन, 22 दिन और 15 दिन थे। पी0 से पी3 पीढ़ी तक टीएचआई-018 के औसत ट्यूमरोजेनिक चक्र क्रमशः 134 दिन, 70 दिन, 48 दिन और 48 दिन थे। पी0 से पी3 पीढ़ी तक टीएचवाई-021 के औसत ट्यूमरोजेनिक चक्र क्रमशः 53 दिन, 66 दिन, 35 दिन और 49 दिन थे। पी0 से पी4 पीढ़ी तक ओटीओ-017 के औसत ट्यूमरोजेनिक चक्र क्रमशः 118 दिन, 86 दिन, 67 दिन, 129 दिन और 88 दिन थे। पी0 से पी5 तक ओटीओ-022 के औसत ट्यूमरोजेनिक चक्र क्रमशः 155 दिन, 55 दिन, 32 दिन, 37 दिन, 27 दिन और 46 दिन थे। पी0 से पी2 पीढ़ी तक ओटीओ-030 के औसत ट्यूमरोजेनिक चक्र क्रमशः 133 दिन, 93 दिन और 104 दिन थे। पी0 से पी5 तक ओटीओ-031 के औसत ट्यूमरोजेनिक चक्र क्रमशः 144 दिन, 58 दिन, 33 दिन, 34 दिन, 52 दिन और 50 दिन थे। एटीसी नमूने स्थिर रूप से पी 3 पीढ़ी और बाद में पारित किए गए थे, जबकि एचएनएससीसी नमूनों के दो मामले पी 1 पीढ़ी से गुजरने के बाद ट्यूमर बनाने में विफल रहे। कुछ नमूनों की वृद्धि दर पी 0 पीढ़ी में अपेक्षाकृत धीमी थी, लेकिन पी 1 और बाद की पीढ़ियों से गुजरने के बाद उनकी वृद्धि दर तेज हो गई थी। पीडीएक्स मॉडल की विभिन्न पीढ़ियों के साथ रोगी ट्यूमर की हिस्टोपैथोलॉजिकल विशेषताओं की तुलना की गई थी। परिणामों से पता चला कि पीडीएक्स ट्यूमर और रोगी-व्युत्पन्न प्राथमिक ट्यूमर रूपात्मक रूप से लगभग समान थे (चित्रा 3), मामूली अंतर के साथ जो रोगियों और पीडीएक्स की विभिन्न पीढ़ियों के बीच नमूना क्षेत्र में विषमता के कारण हो सकता है।

लेनवाटिनिब (उन्नत थायरॉयड कैंसर28 के उपचार के लिए अनुमोदित एक बहु-लक्ष्य टायरोसिन किनेज अवरोधक) की एंटी-ट्यूमर प्रभावकारिता का मूल्यांकन एटीसी के पीडीएक्स मॉडल में किया गया था। जैसा कि चित्रा 4 ए में दिखाया गया है, लेनवाटिनिब उपचार ने सामान्य खारा नियंत्रण समूह (पी < 0.05) की तुलना में एटीसी पीडीएक्स मॉडल में ट्यूमर के विकास को काफी रोक दिया। प्रयोग के अंत में, ट्यूमर के वजन को निर्धारित करने के लिए ट्यूमर ऊतक को आबकारी और वजन किया गया था। नियंत्रण समूह की तुलना में, लेनवाटिनिब उपचार समूह का ट्यूमर वजन कम था, हालांकि एक सांख्यिकीय अंतर हासिल नहीं किया गया था (चित्रा 4 बी)। इसके अलावा, लेनवाटिनिब (चित्रा 4 सी) के साथ इलाज किए गए चूहों में सामान्य स्थिति और शरीर के वजन में कोई स्पष्ट परिवर्तन नहीं देखा गया था। प्रयोगों के दौरान सिस्प्लाटिन प्रशासन की अत्यधिक आवृत्ति के कारण, चूहों ने महत्वपूर्ण विषाक्तता दिखाई, जो वजन घटाने और यहां तक कि मृत्यु से प्रकट हुई। सिस्प्लाटिन की एंटी-ट्यूमर प्रभावकारिता पूरक चित्र 1 में दिखाई गई है।

Figure 1
चित्रा 1: विभिन्न रोगियों से एटीसी पीडीएक्स मॉडल के ट्यूमर विकास वक्र। प्रत्येक रंग निर्दिष्ट पीढ़ी का प्रतिनिधित्व करता है, और प्रत्येक वक्र एक एकल ट्यूमर का प्रतिनिधित्व करता है। एक से तीन चूहों को 0 (पी 0) पीढ़ी में टीका लगाया गया था, और पांच चूहों को बाद के मार्ग (पी 1-पी 5) में टीका लगाया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: विभिन्न रोगियों से एचएनएससीसी पीडीएक्स मॉडल के ट्यूमर विकास वक्र। प्रत्येक रंग निर्दिष्ट पीढ़ी का प्रतिनिधित्व करता है, और प्रत्येक वक्र एक एकल ट्यूमर का प्रतिनिधित्व करता है। पी 0 पीढ़ी में एक से तीन चूहों को टीका लगाया गया था, और पांच चूहों को पी 1 और बाद की पीढ़ियों में टीका लगाया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: हिस्टोपैथोलॉजिकल अध्ययन। रोगी प्राथमिक ट्यूमर और एटीसी (टीएचवाई -012, टीएचवाई -017) और एचएनएससीसी (ओटीओ -017) (हेमटोक्सिलिन-ईओसिन धुंधला, 100 एक्स) के संबंधित पीडीएक्स (मार्ग 1 और मार्ग 3) के बीच हिस्टोपैथोलॉजिकल तुलना। टीएचआई -012 और टीवाई -017 के पैथोलॉजिकल उपप्रकार एनाप्लास्टिक थायराइड कार्सिनोमा थे, और ओटीओ -017 का पैथोलॉजिकल उपप्रकार स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा था। स्केल सलाखों = 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एटीसी पीडीएक्स मॉडल में लेनवाटिनिब की चिकित्सीय प्रभावकारिता। लेनवाटिनिब (10 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ उपचार के बाद एटीसी पीडीएक्स-असर चूहों के (ए) ट्यूमर की मात्रा, (बी) ट्यूमर के वजन और (सी) शरीर के वजन में परिवर्तन। नियंत्रण के साथ लेवाटिनिब की तुलना करने के लिए टी-परीक्षणों का उपयोग करके सांख्यिकीय विश्लेषण किए गए थे। * पी < 0.05 बनाम नियंत्रण को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पैरामीटर कक्षा ट्यूमर लेने की दर (%) P
आयु (वर्ष) <60 16.67 (1/6) 0.615
≥60 33.33 (4/12)
लिंग नर 16.67 (1/6) 0.615
मादा 33.33 (4/12)
ट्यूमर का व्यास <6 सेमी 37.50 (3/8) 0.608
≥6 सेमी 20.00 (2/10)
पैथोलॉजिकल टीएनएम चरण। मैं 0.00 (0/1) 1
Ш 0.00 (0/1)
Equation 2 31.25 (5/16)
अवकलन उच्च 0.00 (0/7) 0.059
गरीब 25.00 (1/4)
अविभेदित 57.14 (4/7)

तालिका 1: एटीसी ट्यूमर लेने की दर और रोगियों की नैदानिक विशेषताओं के बीच सहसंबंध।

पैरामीटर कक्षा ट्यूमर लेने की दर (%) P
एचपीवी नेगटिव 33.33 (2/6) 1
अज्ञात या सकारात्मक 36.36 (4/11)
आयु (वर्ष) <60 33.33 (3/9) 1
≥60 37.50 (3/8)
लिंग नर 50.00 (5/10) 0.304
मादा 14.29 (1/7)
धूम्रपान की स्थिति कभी 44.44 (4/9) 0.62
कभी नहीं 25.00 (2/8)
ट्यूमर का व्यास <3 सेमी 40.00 (4/10) 1
≥3 सेमी 28.57 (2/7)
पैथोलॉजिकल टीएनएम चरण। मैं 75.00 (3/4) 0.423
Equation 1 25.00 (2/8)
Ш 0.00 (0/1)
Equation 2 33.33 (1/3)
दूर मेटास्टेसिस Y 28.57 (2/7) 0.633
N 44.44 (4/9)
अवकलन उच्च 12.50 (1/8) 0.036*
मध्यम से उच्च 100.00 (2/2)
मध्यम 0.00 (0/2)
मध्यम से गरीब 66.67 (2/3)
* पी < 0.05

तालिका 2: एचएनएससीसी ट्यूमर लेने की दर और रोगियों की नैदानिक विशेषताओं के बीच सहसंबंध। * पी < 0.05.

नमूना नाम पीढ़ी P से P0 पीढ़ी P0 से P1 पीढ़ी P1 से P2 पीढ़ी P2 से P3 पीढ़ी P3 से P4 पीढ़ी P4 से P5
THY-004 68 87 29 34 28 26
THY-012 119 61 66 55 87 116
THY-017 27 17 30 13 22 15
THY-018 134 70 48 48 - -
THY-021 53 66 35 49 - -
OTO-017 118 86 67 129 - -
OTO-022 155 55 32 37 27 46
OTO-030 133 93 104 - - -
OTO-031 144 58 33 34 52 50

तालिका 3: एटीसी और एचएनएससीसी मॉडल के औसत ट्यूमरोजेनिक चक्र (टीकाकरण से 1,000 मिमी3 के ट्यूमर आकार तक का समय)।

पूरक चित्रा 1: एटीसी पीडीएक्स मॉडल में सिस्प्लाटिन की चिकित्सीय प्रभावकारिता। सिस्प्लाटिन (3 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ उपचार के बाद एटीसी पीडीएक्स-असर चूहों के (ए) ट्यूमर की मात्रा, (बी) ट्यूमर वजन और (सी) शरीर के वजन में परिवर्तन। नियंत्रण के साथ सिस्प्लाटिन की तुलना करने के लिए टी-परीक्षणों का उपयोग करके सांख्यिकीय विश्लेषण किए गए थे। * पी < 0.05 बनाम नियंत्रण को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस अध्ययन ने एटीसी और एचएनएससीसी के चमड़े के नीचे पीडीएक्स मॉडल को सफलतापूर्वक स्थापित किया है। पीडीएक्स मॉडल निर्माण की प्रक्रिया के दौरान ध्यान देने के लिए कई पहलू हैं। जब ट्यूमर ऊतक रोगी से अलग हो जाता है, तो इसे बर्फ के बॉक्स में डाल दिया जाना चाहिए और जितनी जल्दी हो सके टीकाकरण के लिए प्रयोगशाला में भेजा जाना चाहिए। ट्यूमर के प्रयोगशाला में आने के बाद, ऑपरेटर को बाँझ क्षेत्र को बनाए रखने और सड़न रोकनेवाली प्रक्रियाओं का अभ्यास करने पर ध्यान देना चाहिए। सुई बायोप्सी के नमूनों के लिए, क्योंकि ट्यूमर ऊतक विशेष रूप से छोटा है, मैट्रिक्स जेल के साथ नमूने को मिलाने के बाद टीकाकरण मॉडल स्थापित करने के लिए अधिक अनुकूल होगा। प्राथमिक ट्यूमर ऊतक को भविष्य के शोध के लिए जितना संभव हो उतना संरक्षित, तय और जमे हुए होना चाहिए। टीकाकरण के दौरान, ट्यूमर के टुकड़ों को उपयोग से पहले ट्रोकर में डालने के बाद ट्रोकर में हवा को जितना संभव हो उतना निष्कासित करने की आवश्यकता होती है। ट्यूमर टीकाकरण के बाद, ट्यूमर की वृद्धि चूहों में 1-4 महीने तक देखी जानी चाहिए, और 6 महीने से अधिक समय तक ट्यूमर के विकास के बिनाचूहों को इच्छामृत्यु दी जा सकती है।

इम्यूनोडेफिशिएंसी चूहों को आम तौर पर पीडीएक्स मॉडल निर्माण 29,30 के लिए मेजबान के रूप में चुना जाता है। पी0 पीढ़ी से पी2 पीढ़ी तक, गैर-मोटापे से ग्रस्त मधुमेह-गंभीर रूप से कमजोर प्रतिरक्षा की कमी (एनओडी-एससीआईडी) चूहों या एनओडी सीजी-पीआरकेडीसीसिड इल2आरजीटीएम1डब्ल्यूजेएल/एसजेडजे (एनएसजी) चूहों का आमतौर पर उपयोग किया जाता है। पी 3 पीढ़ी और उससे आगे में, नमूनों को स्थिर रूप से पारित माना जाता है, इसलिए नग्न चूहे आमतौर पर मेजबान के रूप में भी काम कर सकते हैं, और ट्यूमर भी सामान्य रूप से बढ़ सकते हैं। इसके अतिरिक्त, कुल ऑपरेशन समय, ट्यूमर अलगाव समय, रोग-मुक्त अस्तित्व, और रोगियों की समग्र जीवित रहने की दर, ट्यूमर घातक डिग्री, और हिस्टोलॉजिकल उपप्रकार सभी पीडीएक्स मॉडल ट्यूमरजेनेसिटी31,32,33,34 से जुड़े थे। प्रत्यारोपण साइट का पीडीएक्स मॉडलिंग की सफलता दर पर भी प्रभाव पड़ता है, और अध्ययनों से पता चला है कि गुर्दे के कैप्सूल और ऑर्थोट्रोपिक प्रत्यारोपण में उच्च ट्यूमरोजेनिक दर33,35 है। इसके अलावा, मैट्रिगेल के उपयोग से ट्यूमरोजेनिक दर36,37 में भी सुधार हो सकता है। यह बताया गया है कि मानव पेपिलोमावायरस (एचपीवी) संक्रमण एचएनएससीसी ट्यूमर में प्रत्यारोपण की सफलता दर को प्रभावित करता है; एचपीवी-पॉजिटिव ट्यूमर38,39 की तुलना में एचपीवी-नकारात्मक ट्यूमर की बेहतर टेक रेट है। यह अध्ययन एक ही निष्कर्ष पर नहीं पहुंचा, शायद एचपीवी संक्रमण पर छोटी नमूना संख्या और अधूरी जानकारी के कारण।

ऑर्थोटोपिक और रीनल कैप्सूल प्रत्यारोपण मॉडल से अलग, चमड़े के नीचे का मॉडल ट्यूमर के विकास को देखने के लिए अधिक सुविधाजनक है और ऑपरेशन40,41,42 के लिए भी अनुकूल है। एटीसी और एचएनएससीसी पीडीएक्स मॉडल के ट्यूमर विकास डेटा के आधार पर, हमने पाया कि विभिन्न रोगियों से ट्यूमर की वृद्धि दर असंगत थी, जो अंतर-ट्यूमर विषमता को दर्शाती है। अधिकांश पीडीएक्स मॉडल से पी 0 पीढ़ी की ट्यूमर वृद्धि दर बाद के मार्गों की तुलना में अपेक्षाकृत धीमी थी, जो माउस माइक्रोएन्वायरमेंट के अनुकूलन के कारण होने की संभावना थी। विशेष रूप से, पी 1 पीढ़ी के बाद विभिन्न मार्गों में कुछ रोगी-व्युत्पन्न ट्यूमर से वृद्धि दर में वृद्धि हुई, जो पियर्सन एट अल .43 द्वारा रिपोर्ट किए गए छोटे मार्ग अंतराल के अनुरूप है। हिस्टोपैथोलॉजिकल परीक्षा से पता चला कि पीडीएक्स ट्यूमर ने प्राथमिक ट्यूमर की रूपात्मक विशेषताओं को बरकरार रखा। पीडीएक्स मॉडल और नैदानिक एटीसी रोगियों के बीच सहसंबंध विवो फार्माकोडायनामिक परीक्षणों के परिणामों में भी परिलक्षित हुआ, जिसने प्रदर्शित किया कि लेनवार्टिनिब ने नैदानिक रिपोर्ट25,26,27 के अनुरूप एक अच्छा एंटी-ट्यूमर प्रभाव प्रदर्शित किया।

हालांकि, पीडीएक्स मॉडल के कुछ नुकसान भी हैं। उदाहरण के लिए, ट्यूमर गठन का समय अपेक्षाकृत लंबा है, जो उन्नत या आक्रामक ट्यूमर वाले रोगियों के लिए अनुपयुक्त है। इसके अलावा, उच्च-थ्रूपुट दवा स्क्रीनिंग का समय और मौद्रिक लागतबहुत अधिक है। दरअसल, पीडीएक्स मॉडल को ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स के साथ जोड़ना और पीडीएक्स मॉडल के अनुरूप रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड (पीडीओ) मॉडल स्थापित करना इस कमीकी भरपाई करेगा 44,45,46. ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण मॉडल का उपयोग ट्यूमर40,41,47 के रोगजनन और मेटास्टैटिक तंत्र का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। एक कार्यात्मक प्रतिरक्षा प्रणाली की कमी पीडीएक्स मॉडल का एक और नुकसान है, इसलिए प्रयोगों की बढ़ती संख्या ट्यूमर इम्यूनोलॉजी अनुसंधान 48,49,50 के लिए पीडीएक्स मॉडल का निर्माण करने के लिए मानवकृत चूहों का उपयोग कर रही है।

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Disclosures

हितों के किसी संभावित टकराव का खुलासा नहीं किया गया है।

Acknowledgments

इस काम को सिचुआन प्रांत विज्ञान और प्रौद्योगिकी सहायता कार्यक्रम (अनुदान संख्या 2019 जेडीआरसी 0019 और 2021 जेडवाईडी 0097), उत्कृष्टता के विषयों के लिए 1.3.5 परियोजना, पश्चिम चीन अस्पताल, सिचुआन विश्वविद्यालय (अनुदान संख्या जेडवाईजेसी 18026), उत्कृष्टता के विषयों के लिए 1.3.5 परियोजना-नैदानिक अनुसंधान इनक्यूबेशन परियोजना, पश्चिम चीन अस्पताल, सिचुआन विश्वविद्यालय (अनुदान संख्या 2020 एचएक्सएफएच 2020) द्वारा समर्थित किया गया था। चेंगदू विज्ञान और प्रौद्योगिकी ब्यूरो की अंतर्राष्ट्रीय सहयोग परियोजना (अनुदान संख्या 2022-जीएच02-00023-एचजेड), सिचुआन विश्वविद्यालय की इनोवेशन स्पार्क परियोजना (अनुदान संख्या 2019एससीयूएच0015), और पश्चिम चीन अस्पताल के मेडिकल-इंजीनियरिंग एकीकरण के लिए प्रतिभा प्रशिक्षण निधि - इलेक्ट्रॉनिक विज्ञान और प्रौद्योगिकी विश्वविद्यालय (अनुदान संख्या एचएक्सडीजेड 22012)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.4 mm x 2.0 mm trocar Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd 18-9065
Balb/c nude mice Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. 401
Biosafety cabinet Suzhou Antai BSC-1300IIA2
Blade Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd 18-0823
Centrifuge tube  Corning 430791/430829
Cryopreservation tube Chengdu Dianrui Experimental Instrument Co., Ltd /
Custodiol HTK-Solution Custodiol 2103417
Dimethyl sulfoxide(DMSO) SIGMA-ALORICH D5879-500mL
Electronic balance METTLER ME104
Electronic digital caliper Chengdu Chengliang Tool Group Co., Ltd 0-220
fetal bovine serum(FBS) VivaCell C04001-500
IBM SPSS Statistics 26 IBM
Ketamine Jiangsu Zhongmu Beikang Pharmaceutical Co., Ltd  100761663
Lenvatinib ApexBio A2174
NOD-SCID immunodeficient mice Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. 406
Pen-Strep Solution Biological Industries 03-03101BCS
Petri dish WHB WHB-60/WHB-100
Saline  Sichuan Kelun W220051705
Scissor Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd 18-0110
Tweezer Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd 18-1241
Vet ointment Pfizer Inc. P10015353
Xylazine Dunhua Shengda Animal Medicine Co., Ltd 070031777

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References

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एनाप्लास्टिक थायराइड कार्सिनोमा और सिर और गर्दन स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा के रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट मॉडल की स्थापना और लक्षण वर्णन
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