Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

הקמה ואפיון של מודלים של קסנוגרפט שמקורם במטופל של קרצינומה אנפלסטית של בלוטת התריס וקרצינומה של תאי קשקש בראש ובצוואר

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/64623
Automatic Translation
1,3, 2, 3, 4, 3, 3, 1,3, 1,3, 2, 1,3
1Precision Medicine Research Center, Sichuan Provincial Key Laboratory of Precision Medicine, National Clinical Research Center for Geriatrics, West China Hospital, Sichuan University, 2Department of Thyroid Surgery, West China Hospital, Sichuan University, 3Sichuan Kangcheng Biotech Co., 4Sichuan Cancer Hospital

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מבסס ומאפיין מודל קסנוגרפט נגזר ממטופל (PDX) של קרצינומה אנפלסטית של בלוטת התריס (ATC) וקרצינומה של תאי קשקש בראש ובצוואר (HNSCC), כאשר מודלים של PDX הופכים במהירות לסטנדרט בתחום האונקולוגיה התרגומית.

Abstract

מודלים של קסנוגרפט הנגזר מהמטופל (PDX) משמרים נאמנה את המאפיינים ההיסטולוגיים והגנטיים של הגידול הראשוני ושומרים על ההטרוגניות שלו. תוצאות פרמקודינמיות המבוססות על מודלים של PDX נמצאות בקורלציה גבוהה עם פרקטיקה קלינית. קרצינומה אנפלסטית של בלוטת התריס (ATC) היא תת-הסוג הממאיר ביותר של סרטן בלוטת התריס, עם פולשניות חזקה, פרוגנוזה גרועה וטיפול מוגבל. למרות ששיעור ההיארעות של ATC מהווה רק 2%-5% ממקרי סרטן בלוטת התריס, שיעור התמותה שלו גבוה עד 15%-50%. קרצינומה של תאי קשקש בראש ובצוואר (HNSCC) היא אחת הממאירויות הנפוצות ביותר בראש ובצוואר, עם מעל 600,000 מקרים חדשים ברחבי העולם מדי שנה. כאן, פרוטוקולים מפורטים מוצגים כדי לקבוע מודלים PDX של ATC ו- HNSCC. בעבודה זו נותחו גורמי המפתח המשפיעים על שיעור ההצלחה של בניית המודל, והושוו המאפיינים ההיסטופתולוגיים בין מודל PDX לבין הגידול הראשוני. יתר על כן, הרלוונטיות הקלינית של המודל אומתה על ידי הערכת היעילות הטיפולית in vivo של תרופות מייצגות בשימוש קליני במודלים PDX שנבנו בהצלחה.

Introduction

מודל PDX הוא מודל חייתי שבו רקמת גידול אנושית מושתלת בעכברים מדוכאי חיסון וגדלה בסביבה שמספקים העכברים1. מודלים מסורתיים של קו תאי גידול סובלים ממספר חסרונות, כגון חוסר הטרוגניות, חוסר היכולת לשמור על המיקרו-סביבה של הגידול, הפגיעות לשינויים גנטיים במהלך מעברים חוזרים במבחנה, והיישום הקליני הלקוי 2,3. החסרונות העיקריים של מודלים מהונדסים גנטית של בעלי חיים הם אובדן פוטנציאלי של התכונות הגנומיות של גידולים אנושיים, הכנסת מוטציות חדשות ולא ידועות, והקושי לזהות את מידת ההומולוגיה בין גידולי עכברים לגידולים אנושיים4. בנוסף, הכנת מודלים של בעלי חיים מהונדסים גנטית היא יקרה, גוזלת זמן ויחסית לא יעילה4.

למודל PDX יתרונות רבים על פני מודלים אחרים של גידולים מבחינת שיקוף הטרוגניות הגידול. מנקודת המבט של היסטופתולוגיה, למרות שמקבילו העכבר מחליף את הסטרומה האנושית לאורך זמן, מודל PDX משמר היטב את המבנה המורפולוגי של הגידול הראשוני. בנוסף, מודל PDX משמר את הזהות המטבולית של הגידול הראשוני למשך ארבעה דורות לפחות ומשקף טוב יותר את יחסי הגומלין המורכבים בין תאי הגידול לבין המיקרו-סביבה שלהם, מה שהופך אותו לייחודי בהדמיית גידול, גרורות, אנגיוגנזה ודיכוי חיסוני של רקמת גידול אנושית 5,6,7. ברמה התאית והמולקולרית, מודל PDX משקף במדויק את ההטרוגניות הבין-גידולית והתוך-גידולית של גידולים אנושיים, כמו גם את המאפיינים הפנוטיפיים והמולקולריים של הסרטן המקורי, כולל דפוסי ביטוי גנים, מצב מוטציה, מספר העתק, מתילציה של DNA ופרוטאומיקה 8,9. מודלים של PDX עם מעברים שונים הם בעלי אותה רגישות לטיפול תרופתי, מה שמצביע על כך שביטוי הגנים של מודלים PDX יציב מאוד10,11. מחקרים הראו מתאם מצוין בין התגובה של מודל PDX לתרופה לבין התגובה הקלינית של חולים לתרופהזו 12,13. לכן, מודל PDX התגלה כמודל מחקר פרה-קליני ותרגומי רב עוצמה, במיוחד עבור סינון תרופות וחיזוי פרוגנוזה קלינית.

סרטן בלוטת התריס הוא גידול ממאיר שכיח של המערכת האנדוקרינית והוא ממאירות אנושית שהראתה עלייה מהירה בהיארעות בשנים האחרונות14. קרצינומה אנפלסטית של בלוטת התריס (ATC) היא סרטן בלוטת התריס הממאיר ביותר, עם הישרדות חולה חציונית של 4.8 חודשים בלבד15. למרות שרק מיעוט מחולי סרטן בלוטת התריס מאובחנים עם ATC מדי שנה בסין, שיעור התמותה קרוב ל -100% 16,17,18. ATC בדרך כלל גדל במהירות ופולש לרקמות הסמוכות של הצוואר כמו גם לבלוטות הלימפה הצוואריות, וכמחצית מהחולים סובלים מגרורות מרוחקות19,20. קרצינומה של תאי קשקש בראש ובצוואר (HNSCC) היא הסרטן השישי בשכיחותו בעולם ואחד הגורמים המובילים למוות מסרטן, עם הערכה של 600,000 אנשים הסובלים מ- HNSCC מדי שנה21,22,23. HNSCC כולל מספר רב של גידולים, כולל אלה באף, בסינוסים, בפה, בשקדים, בלוע ובגרון24. ATC ו- HNSCC הן שתיים מהממאירויות העיקריות בראש ובצוואר. על מנת להקל על פיתוחם של חומרים טיפוליים חדשניים וטיפולים מותאמים אישית, יש צורך לפתח מודלים פרה-קליניים חזקים ומתקדמים לבעלי חיים, כגון מודלים PDX של ATC ו-HNSCC.

מאמר זה מציג שיטות מפורטות לביסוס מודל PDX תת-עורי של ATC ו-HNSCC, מנתח את גורמי המפתח המשפיעים על קצב לקיחת הגידול בבניית המודל, ומשווה את המאפיינים ההיסטופתולוגיים בין מודל PDX לבין הגידול הראשוני. בינתיים, בעבודה זו, בדיקות פרמקודינמיות in vivo בוצעו באמצעות מודלים PDX שנבנו בהצלחה על מנת לאמת את הרלוונטיות הקלינית שלהם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות ולפרוטוקולים של האגודה להערכה והסמכה לטיפול בחיות מעבדה שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של בית החולים מערב סין, אוניברסיטת סצ'ואן. במחקר הנוכחי נעשה שימוש בעכברים מדוכאי חיסון NOD-SCID בגילאי 4-6 שבועות (משני המינים) ובנקבות עכברים עירומים בגילאי 4-6 שבועות. בעלי החיים התקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים). ועדת האתיקה של בית החולים במערב סין אישרה את המחקר עם נבדקים אנושיים (פרוטוקול מספר 2020353). כל מטופל נתן הסכמה מדעת בכתב.

1. הכנה ניסיונית

  1. סדרו להבים חד פעמיים, מספריים ופינצטה מעוקרים ומכשירים אחרים הדרושים להשתלת גידול, הניחו אותם על שולחן העבודה הנקי במיוחד והקרינו אותם מראש באור אולטרה סגול.
  2. הכינו תמיסת מלח סטרילית וכלי פטרי לשימוש במהלך הבדיקה.

2. רכישה והובלה של רקמת גידול טרייה

  1. יש לקחת דגימות גידול טריות (בדרך כלל גדולות מ-5 מ"מ x 5 מ"מ) מחדר הניתוח, ולהניחן בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל או 50 מ"ל המכיל תמיסת HTK סטרילית (ראה טבלת חומרים) או מלוחים. תייגו את צינורות הצנטריפוגות.
    הערה: דגימות גידול טריות התקבלו על ידי הסרה כירורגית או ניקוב מחולים עם ATC או HNSCC.
  2. הכניסו את צינורות הצנטריפוגות לקופסת קרח שהוכנה מראש.
    הערה: במהלך תקופה זו, על מפעיל ההשתלה להכין את הפריטים הדרושים להשתלה (ראה טבלת חומרים).
  3. יש לוודא שהזמן בין איסוף הדגימות להעברתן למעבדה לבניית PDX אינו עולה על שעתיים. במהלך ההובלה, הקיפו את הצינורות המכילים את הרקמות בתערובת מי קרח או חבילות קרח כדי לשמר את פעילות הרקמות.

3. השתלת גידול

  1. ברגע שרקמות הגידול מגיעות למעבדה, רשמו וספרו אותן מחדש.
    הערה: במחקר הנוכחי, המידע על המטופל נשמר בסודיות מוחלטת. שאר שלבי ההליך בוצעו במעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL-2). בעת הכניסה למעבדה מומלץ ללבוש עשן מעל בגדי העבודה או בגדי מגן, כובע ומסכה. הטיפול ברקמת הגידול מתבצע בארון בטיחות ביולוגית.
  2. יש לחטא את צינורות הצנטריפוגות המכילות את רקמות הגידול ב-75% אלכוהול, ולהניח אותן על שולחן הניתוחים. מעבירים את רקמות הגידול לצלחות פטרי 6 ס"מ מלאות במי מלח באמצעות מלקחיים אופתלמיים מעוקרים. לאחר מכן, לחתוך אותם לחתיכות קטנות של כ 2 מ"מ x 2 מ"מ ו 3 מ"מ x 3 מ"מ באמצעות להב.
  3. מעבירים את חתיכות רקמות הגידול לצלחת פטרי בקוטר 6 ס"מ המכילה את כמות המלח המתאימה, עוטפים את הצלחת בסרט האיטום, מניחים אותה בקופסת קרח ונושאים אותה לחדר בעלי חיים ספציפי נטול פתוגן (SPF) יחד עם המכשירים הדרושים (זוג מספריים, מלקחיים ומחטי חיסון).
  4. הכינו את בעל החיים לפי השלבים הבאים.
    1. הסר את השיער בבית החזה הצדדי הימני של עכברים מדוכאי חיסון NOD-SCID בני 4-6 שבועות, וחטא את העור עם 75% אלכוהול. יש להרדים את העכברים על ידי הזרקה תוך צפקית של 80 מ"ג/ק"ג קטמין ו-10 מ"ג/ק"ג קסילזין (ראו טבלת חומרים), ולמרוח את עיניהם במשחה וטרינרית למניעת יובש. יש לוודא את עומק ההרדמה באמצעות איבוד רפלקס הדוושה.
    2. בצע חתך 2 מ"מ עם מספריים דרך העור באמצע בית החזה הצדדי הימני של עכברים.
  5. קחו חתיכת גידול מצלחת הפטרי, והכניסו אותה למחט טרוקאר בגודל 2.4 מ"מ x 2.0 מ"מ (ראו טבלת חומרים) בעזרת מלקחיים.
  6. החזיקו את העכבר, הדקו את העור באתר הניקוב, השתמשו בטרוקאר המכיל את חתיכות הגידול כדי להחדיר את הגידול דרך חתך העור הראשוני בקוטר 2 מ"מ, עברו לחלק האחורי של הכתף ודחפו את ליבת הטרוקאר.
  7. ודא כי חתיכת הגידול נדחף החוצה ונשאר בסינוס המעבר שנוצר על ידי נקב הטרוקאר, ולאחר מכן למשוך את הטרוקאר.
  8. אם הגידול נע עם המחט כאשר הוא נסוג, השתמש בטרוקאר כדי לאפס אותו ולתפור את החתך.
    הערה: במחקר זה, כל עכבר חוסן בגפיים הקדמיות והאחוריות הגב. אחד עד שלושה עכברים חוסנו לכל דגימת גידול מכל חולה בהתבסס על גודל הגידול.

4. שימור רקמת גידול, קיבוע והקפאת חלבונים

הערה: שאר רקמות הגידול שימשו לשימור זרעים, קיבוע והקפאת DNA/RNA/חלבון, בהתאמה.

  1. הסר את המלח מפני השטח של הגידול עם גזה סטרילית לפני הצבתו בצינור ההקפאה כדי להבטיח שמשטח הגידול אינו רטוב מדי.
  2. שים ארבע עד שש חתיכות של רקמת גידול בגודל 2 מ"מ x 2 מ"מ בצינור שימור קריוגני של תאים בנפח 2 מ"ל, הוסף 1 מ"ל של תמיסת שימור קריוגנית המורכבת מ-90% נסיוב בקר עוברי (FBS) ו-10% דימתיל סולפוקסיד (DMSO) לתוך הצינור, הכנס את הצינור לקופסת קירור הדרגתית, הקפיא אותו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך הלילה, ולבסוף, העבירו אותו לחנקן נוזלי.
  3. מניחים את גושי רקמת הגידול בגודל 3 מ"מ x 3 מ"מ בפורמלין חוצץ 10% לקיבוע רקמות לבדיקה פתולוגית.
  4. הכנס את בלוק הרקמה בגודל 3 מ"מ x 3 מ"מ לתוך צינור שימור קריוגני של תאים בנפח 2 מ"ל, הקפיא אותו במהירות בחנקן נוזלי ולאחר מכן העבר למקרר של -80 מעלות צלזיוס לצורך מיצוי DNA/RNA וחלבונים.
  5. לאסוף את המידע הקליני של החולים, כגון היסטוריית העישון, גודל הגידול, התמיינות, תת-סוג פתולוגי, דרגת סרטן, שלב סרטן, גרורות מרוחקות, מוצא, היסטוריה רפואית, אימונוהיסטוכימיה, זיהום בנגיף הפפילומה האנושי (HPV) בחולי HNSCC ותרופות טיפוליות.

5. העברה, הקפאה והחייאה של גידולים מודל PDX

  1. למדוד את אורך ורוחב הגידולים התת עוריים בעכברים באמצעות קליפרים ורנייר פעם בשבוע, ולחשב את נפח הגידול על פי הנוסחה: נפח הגידול = 0.5 × אורך × רוחב2. צייר את עקומת הצמיחה של הגידול.
  2. כאשר הגידול PDX מגיע ל-2,000 מ"מ3, מעבירים אותו לדור הבא של עכברים, ומבצעים השתלה חוזרת של הגידול. בצע את הכנת המכשירים לאחר שלב 4.
  3. הרדימו את העכברים על ידי פריקת צוואר הרחם לאחר הרדמה עם 80 מ"ג / ק"ג קטמין.
  4. יש לחטא את העור עם 75% אלכוהול. לאחר מכן, לחתוך את העור סביב הגידול באמצעות מספריים, ולאחר מכן להסיר את הגידול עם מלקחיים, ומניחים אותו בצלחת פטרי.
  5. בצע את הליך השתלת הגידול לאחר שלב 3.
  6. בצע שימור והקפאה של גידולים מודל PDX לאחר שלב 4.
  7. עבור החייאה של רקמת הגידול, בצע את העיקרון של הקפאה איטית התמוססות מהירה. לאחר הוצאת cryovials מחנקן נוזלי, במהירות לשים אותם באמבט מים ב 37 ° C להתמוססות מהירה.
  8. נערו בעדינות את הקריובלים באמבט המים כדי להאיץ את תהליך ההפשרה.
  9. מפשירים, מעבירים את חתיכות הגידול לתמיסת מלח רגילה מוכנה לשטיפה, ואז מחסנים את הדור הבא של העכברים. עבור הניתוח הספציפי, אנא עיין בהליך השתלת הרקמה בשלב 3.

6. קביעת היעילות הטיפולית של לנווטיניב וציספלטין במודל ATC PDX

הערה: מודל ATC PDX שימש לבדיקת ההשפעה הטיפולית של מעכב טירוזין קינאז לנווטיניב והתרופה הכימותרפית ציספלטין25,26,27.

  1. בחר את רקמת הגידול מדור P5 של דגם ATC PDX (THY-017), חתוך ל-2-4 מ"מ 3 חתיכות רקמה, וחסן תת עורית (שלב3 ) לגב הימני של עשר נקבות עכברים עירומות בנות 4-6 שבועות.
  2. בחר 15 עכברים עם נפח הגידול בין 50-150 מ"מ3, ולחלק אותם לשלוש קבוצות.
  3. יש לתת לנווטיניב (10 מ"ג/ק"ג) תוך גסטרית לקבוצה אחת פעם ביום במשך 15 יום, לתת ציספלטין (3 מ"ג/ק"ג) תוך צפקית לקבוצה אחת כל 3 ימים ובסך הכל שש מנות, ולתת את קבוצת הביקורת עם אותו נפח של מי מלח רגילים.
  4. למדוד את משקל הגוף ואת נפח הגידול של העכברים פעמיים בשבוע.
  5. בתום הבדיקה מרדימים את העכברים (שלב 5.3), ושוקלים את הגידולים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בסך הכל הושתלו 18 דגימות של סרטן בלוטת התריס, וחמישה מודלים PDX של סרטן בלוטת התריס נבנו בהצלחה (שיעור נטילת גידול של 27.8%), כולל ארבעה מקרים של סרטן בלוטת התריס לא ממוין ומקרה אחד של סרטן בלוטת התריס אנפלסטי. נבדק הקשר בין שיעור ההצלחה של בניית המודל לבין גיל, מין, קוטר הגידול, דרגת הגידול והבידול. למרות ששיעור ההצלחה של דגימות גידול בדרגה 4 היה גבוה יותר מאשר בדגימות עם ציונים נמוכים יותר, וגם שיעור ההצלחה של דגימות גידול לא ממויינות היה גבוה מזה של דגימות מובחנות מאוד, תוצאות ניתוח המתאם הראו כי גורמים אלה לא היו קשורים לשיעור ההצלחה של מודל PDX (טבלה 1). שבע עשרה דגימות HNSCC חוסנו, וארבעה דגמי PDX של HNSCCC נבנו בהצלחה. ניתוח המתאם בין שיעור לקיחת הגידול בבניית המודל לבין הפרמטרים הקליניים של דגימות הגידול הראה כי מידת ההתמיינות הייתה קשורה לשיעור ההצלחה של המודל, בעוד שגיל, מין, היסטוריית עישון, קוטר הגידול, דרגת סרטן, גרורות וזיהום HPV לא השפיעו על שיעור לקיחת הגידול (טבלה 2).

עקומות גדילת הגידול עבור כל מודל PDX תוכננו כדי להבין טוב יותר את קצבי הצמיחה של מודלי PDX ממטופלים שונים (איור 1, איור 2 וטבלה 3). מחזורי הגידול הממוצעים (זמן מהחיסון ועד גודל גידול של 1,000 מ"מ3) של THY-004 מדורות P0 עד P5 היו 68 ימים, 87 ימים, 29 ימים, 34 ימים, 28 ימים ו-26 ימים, בהתאמה. המחזורים הגידוליים הממוצעים של THY-012 מדורות P0 עד P5 היו 119 ימים, 61 ימים, 66 ימים, 55 ימים, 87 ימים ו-116 ימים, בהתאמה. המחזורים הגידוליים הממוצעים של THY-017 מדורות P0 עד P5 היו 27 ימים, 17 ימים, 30 יום, 13 ימים, 22 ימים ו-15 ימים, בהתאמה. המחזורים הגידוליים הממוצעים של THY-018 מדורות P0 עד P3 היו 134 ימים, 70 יום, 48 ימים ו-48 יום, בהתאמה. המחזורים הגידוליים הממוצעים של THY-021 מדורות P0 עד P3 היו 53 ימים, 66 ימים, 35 ימים ו-49 ימים, בהתאמה. המחזורים הגידוליים הממוצעים של OTO-017 מדורות P0 עד P4 היו 118 ימים, 86 ימים, 67 ימים, 129 ימים ו-88 ימים, בהתאמה. מחזורי הגידול הממוצעים של OTO-022 מדורות P0 עד P5 היו 155 ימים, 55 ימים, 32 ימים, 37 ימים, 27 ימים ו-46 ימים, בהתאמה. מחזורי הגידול הממוצעים של OTO-030 מדורות P0 עד P2 היו 133 ימים, 93 ימים ו-104 ימים, בהתאמה. מחזורי הגידול הממוצעים של OTO-031 מדורות P0 עד P5 היו 144 ימים, 58 ימים, 33 ימים, 34 ימים, 52 ימים ו-50 יום, בהתאמה. דגימות ה-ATC הועברו ביציבות לדור P3 ומאוחר יותר, בעוד ששני מקרים של דגימות HNSCC לא הצליחו ליצור גידולים לאחר שעברו לדור P1. קצב הגידול של חלק מהדגימות היה איטי יחסית בדור ה-P0, אך קצב הגידול שלהן הואץ לאחר שעברו לדור ה-P1 ולדורות מאוחרים יותר. המאפיינים ההיסטופתולוגיים של גידולי החולה עם אלה של דורות שונים של מודלים PDX הושוו. התוצאות הראו שגידולי PDX וגידולים ראשוניים שמקורם בחולה היו כמעט דומים מבחינה מורפולוגית (איור 3), עם הבדלים קלים שעשויים לנבוע מההטרוגניות באזור הדגימה בין מטופלים לדורות שונים של PDX.

היעילות האנטי-סרטנית של לנווטיניב (מעכב טירוזין קינאז רב-תכליתי שאושר לטיפול בסרטן בלוטת התריס מתקדם28) הוערכה במודל PDX של ATC. כפי שניתן לראות באיור 4A, טיפול בלנווטיניב עיכב באופן משמעותי את צמיחת הגידול במודל ATC PDX בהשוואה לקבוצת הביקורת הרגילה במי מלח (P < 0.05). בתום הניסוי נכרתה רקמת הגידול ונשקלה כדי לקבוע את משקל הגידול. בהשוואה לקבוצת הביקורת, משקל הגידול בקבוצת הטיפול בלנווטיניב היה נמוך יותר, אם כי לא הושג הבדל סטטיסטי (איור 4B). נוסף על כך, לא נצפו שינויים ברורים במצב הכללי ובמשקל הגוף בעכברים שטופלו בלנווטיניב (איור 4C). בשל התדירות המוגזמת של מתן ציספלטין במהלך הניסויים, העכברים הראו רעילות משמעותית, המתבטאת בירידה במשקל ואף במוות. היעילות האנטי-סרטנית של ציספלטין מוצגת באיור משלים 1.

Figure 1
איור 1: עקומת גדילה של גידולים במודלים של ATC PDX ממטופלים שונים. כל צבע מייצג את הדור שצוין, וכל עקומה מייצגת גידול יחיד. אחד עד שלושה עכברים חוסנו במעבר 0 (P0), וחמישה עכברים חוסנו במעברים הבאים (P1-P5). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: עקומת גדילה של גידולים במודלים של HNSCC PDX ממטופלים שונים. כל צבע מייצג את הדור שצוין, וכל עקומה מייצגת גידול יחיד. אחד עד שלושה עכברים חוסנו בדור P0, וחמישה עכברים חוסנו בדור P1 ובדורות מאוחרים יותר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: מחקר היסטופתולוגי. השוואה היסטופתולוגית בין גידולים ראשוניים של המטופל לבין PDX תואם (מעבר 1 ומעבר 3) של ATC (THY-012, THY-017) ו- HNSCC (OTO-017) (צביעת המטוקסילין-אאוזין, פי 100). תת-הסוגים הפתולוגיים של THY-012 ו-THY-017 היו קרצינומה אנאפלסטית של בלוטת התריס, ותת-הסוג הפתולוגי של OTO-017 היה קרצינומה של תאי קשקש. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: היעילות הטיפולית של לנווטיניב במודל ATC PDX. שינויים בנפח הגידול (A), (B) משקל הגידול ו-(C) משקל הגוף של עכברים נושאי ATC PDX לאחר טיפול בלנווטיניב (10 מ"ג/ק"ג). ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות מבחני T כדי להשוות בין לבטיניב לביקורת. *P < 0.05 לעומת ביקורת נחשב מובהק סטטיסטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

פרמטרים מחלקה שיעור לקיחת הגידול (%) P
גיל (שנים) <60 16.67 (1/6) 0.615
≥60 33.33 (4/12)
מין זכר 16.67 (1/6) 0.615
נקבה 33.33 (4/12)
קוטר הגידול <6 ס"מ 37.50 (3/8) 0.608
≥6 ס"מ 20.00 (2/10)
שלב TNM פתולוגי אני 0.00 (0/1) 1
Ш 0.00 (0/1)
Equation 2 31.25 (5/16)
בידול גבוה 0.00 (0/7) 0.059
עני 25.00 (1/4)
מובחן 57.14 (4/7)

טבלה 1: מתאם בין שיעור נטילת הגידול ATC לבין המאפיינים הקליניים של החולים.

פרמטרים מחלקה שיעור לקיחת הגידול (%) P
HPV שלילי 33.33 (2/6) 1
לא ידוע או חיובי 36.36 (4/11)
גיל (שנים) <60 33.33 (3/9) 1
≥60 37.50 (3/8)
מין זכר 50.00 (5/10) 0.304
נקבה 14.29 (1/7)
סטטוס עישון אי פעם 44.44 (4/9) 0.62
אף פעם 25.00 (2/8)
קוטר הגידול <3 ס"מ 40.00 (4/10) 1
≥3 ס"מ 28.57 (2/7)
שלב TNM פתולוגי אני 75.00 (3/4) 0.423
Equation 1 25.00 (2/8)
Ш 0.00 (0/1)
Equation 2 33.33 (1/3)
גרורות מרוחקות Y 28.57 (2/7) 0.633
N 44.44 (4/9)
בידול גבוה 12.50 (1/8) 0.036*
בינוני עד גבוה 100.00 (2/2)
מתון 0.00 (0/2)
בינוני עד עני 66.67 (2/3)
* P < 0.05

טבלה 2: מתאם בין שיעור נטילת הגידול HNSCC לבין המאפיינים הקליניים של החולים. *P < 0.05.

שם לדוגמה דור P עד P0 דור P0 עד P1 דור P1 עד P2 דור P2 עד P3 דור P3 עד P4 דור P4 עד P5
THY-004 68 87 29 34 28 26
THY-012 119 61 66 55 87 116
THY-017 27 17 30 13 22 15
THY-018 134 70 48 48 - -
THY-021 53 66 35 49 - -
OTO-017 118 86 67 129 - -
OTO-022 155 55 32 37 27 46
OTO-030 133 93 104 - - -
OTO-031 144 58 33 34 52 50

טבלה 3: המחזור הגידולי הממוצע (זמן מהחיסון ועד גודל גידול של 1,000 מ"מ3) של דגמי ATC ו-HNSCC.

תרשים משלים 1: היעילות הטיפולית של ציספלטין במודל ATC PDX. שינויים בנפח הגידול (A), (B) משקל הגידול ו-(C) משקל הגוף של עכברים נושאי ATC PDX לאחר טיפול בציספלטין (3 מ"ג/ק"ג). ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות מבחני T כדי להשוות ציספלטין עם הביקורת. *P < 0.05 לעומת ביקורת נחשב מובהק סטטיסטית. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מחקר זה ביסס בהצלחה את המודלים התת-עוריים PDX של ATC ו-HNSCC. ישנם היבטים רבים שיש לשים לב אליהם במהלך תהליך בניית מודל PDX. כאשר רקמת הגידול מופרדת מהמטופל, יש להכניס אותה לקופסת הקרח ולשלוח אותה למעבדה לחיסון בהקדם האפשרי. לאחר שהגידול מגיע למעבדה, על המפעיל לשים לב לשמירה על שדה סטרילי ולתרגל הליכים אספטיים. עבור דגימות ביופסיית מחט, מכיוון שרקמת הגידול קטנה במיוחד, חיסון לאחר ערבוב הדגימה עם ג'ל המטריקס יתרום יותר לביסוס המודל. כמו כן, יש לשמר, לקבע ולהקפיא את רקמת הגידול הראשונית ככל האפשר לצורך מחקר עתידי. במהלך החיסון, האוויר בטרוקאר צריך להיות מגורש ככל האפשר לאחר חתיכות הגידול הוכנסו לתוך הטרוקאר לפני השימוש. לאחר חיסון הגידול, יש לראות את צמיחת הגידול בעכברים במשך 1-4 חודשים, ועכברים ללא צמיחת הגידול במשך יותר מ -6 חודשים ניתן להרדים29.

עכברים מדוכאי חיסון נבחרים בדרך כלל כמארחים לבניית מודל PDX29,30. מדור P0 ועד דור P2 משתמשים בדרך כלל בעכברים שאינם סובלים מהשמנת יתר, סוכרתיים-בעלי פגיעה חמורה במערכת החיסון (NOD-SCID) או עכברי NOD Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG). בדור P3 ומעבר לו, הדגימות נחשבות לעוברות ביציבות, כך שעכברים עירומים יכולים בדרך כלל לשמש גם כפונדקאי, וגידולים יכולים גם לגדול באופן נורמלי. בנוסף, זמן הניתוח הכולל, זמן בידוד הגידול, הישרדות ללא מחלה ושיעור ההישרדות הכולל של החולים, דרגת הגידול הממאיר ותת-הסוג ההיסטולוגי היו קשורים כולם לגידול מודל PDX31,32,33,34. לאתר ההשתלה יש גם השפעה על שיעור ההצלחה של מודלים PDX, ומחקרים הראו כי קפסולה כליה והשתלות אורתוטרופיות יש שיעור גידולי גבוה33,35. בנוסף, השימוש במטריג'ל עשוי גם לשפר את שיעור הגידול36,37. דווח כי זיהום בנגיף הפפילומה האנושי (HPV) משפיע על שיעור ההצלחה של השתלות בגידולי HNSCC; לגידולים שליליים ל- HPV יש שיעור נטילה מעולה בהשוואה לגידולים חיוביים ל- HPV38,39. מחקר זה לא הגיע לאותה מסקנה, כנראה בשל מספרי המדגם הקטנים ומידע חלקי על זיהום HPV.

בשונה מהמודלים של השתלת קפסולות אורתוטופיות וכליות, המודל התת עורי נוח יותר לצפייה בצמיחת גידולים והוא גם תורם לניתוח40,41,42. בהתבסס על נתוני צמיחת הגידול של מודל ATC ו- HNSCC PDX, מצאנו כי שיעורי הצמיחה של גידולים מחולים שונים לא היו עקביים, ושיקפו הטרוגניות בין גידולים. קצב צמיחת הגידול של דור P0 מרוב דגמי PDX היה איטי יחסית מאשר במעברים האחרונים, ככל הנראה בשל הסתגלות המיקרו-סביבה של העכבר. יש לציין כי קצב הגדילה של כמה גידולים שמקורם בחולה גדל במעברים שונים לאחר דור P1, בהתאם למרווח המעבר המקוצר שדווח על ידי פירסון ועמיתיו 43. בדיקה היסטופתולוגית הראתה כי גידולי PDX שמרו על המאפיינים המורפולוגיים של הגידולים הראשוניים. המתאם בין מודל PDX לבין חולי ATC קליניים בא לידי ביטוי גם בתוצאות הבדיקות הפרמקודינמיות in vivo, אשר הראו כי Lenvartinib הציג השפעה טובה נגד גידולים, עקבי עם דיווחים קליניים25,26,27.

עם זאת, מודל PDX יש גם חסרונות מסוימים. לדוגמה, זמן היווצרות הגידול ארוך יחסית, שאינו מתאים לחולים עם גידולים מתקדמים או אגרסיביים. בנוסף, הזמן והעלויות הכספיות של בדיקת תרופות בתפוקה גבוהה גבוהות מדי44. ואכן, שילוב מודל PDX עם אורגנואידים סרטניים והקמת מודל אורגנואיד הנגזר ממטופל (PDO) המתאים למודל PDX יפצו על מחסור זה44,45,46. מודלים להשתלה אורתוטופית יכולים לשמש לחקר הפתוגנזה והמנגנונים הגרורתיים של גידולים40,41,47. היעדר מערכת חיסון מתפקדת הוא חסרון נוסף של מודל PDX, ולכן מספר גדל והולך של ניסויים משתמשים בעכברים אנושיים כדי לבנות את מודל PDX למחקר אימונולוגיה של גידולים48,49,50.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לא נחשפים ניגודי עניינים פוטנציאליים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית התמיכה במדע וטכנולוגיה של מחוז סצ'ואן (מענק מס '2019JDRC0019 ו- 2021ZYD0097), פרויקט 1.3.5 לדיסציפלינות של מצוינות, בית החולים מערב סין, אוניברסיטת סצ'ואן (מענק מס 'ZYJC18026), פרויקט 1.3.5 לדיסציפלינות של מצוינות-פרויקט הדגירה של מחקר קליני, בית החולים מערב סין, אוניברסיטת סצ'ואן (מענק מס '2020HXFH023), קרנות המחקר הבסיסיות לאוניברסיטאות המרכזיות (SCU2022D025), פרויקט שיתוף הפעולה הבינלאומי של לשכת המדע והטכנולוגיה של צ'נגדו (מענק מס '2022-GH02-00023-HZ), פרויקט ניצוץ החדשנות של אוניברסיטת סצ'ואן (מענק מס '2019SCUH0015), וקרן הכשרת הכישרונות לאינטגרציה רפואית-הנדסית של בית החולים מערב סין - האוניברסיטה למדע וטכנולוגיה אלקטרוניים (מענק מס 'HXDZ22012).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.4 mm x 2.0 mm trocar Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd 18-9065
Balb/c nude mice Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. 401
Biosafety cabinet Suzhou Antai BSC-1300IIA2
Blade Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd 18-0823
Centrifuge tube  Corning 430791/430829
Cryopreservation tube Chengdu Dianrui Experimental Instrument Co., Ltd /
Custodiol HTK-Solution Custodiol 2103417
Dimethyl sulfoxide(DMSO) SIGMA-ALORICH D5879-500mL
Electronic balance METTLER ME104
Electronic digital caliper Chengdu Chengliang Tool Group Co., Ltd 0-220
fetal bovine serum(FBS) VivaCell C04001-500
IBM SPSS Statistics 26 IBM
Ketamine Jiangsu Zhongmu Beikang Pharmaceutical Co., Ltd  100761663
Lenvatinib ApexBio A2174
NOD-SCID immunodeficient mice Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. 406
Pen-Strep Solution Biological Industries 03-03101BCS
Petri dish WHB WHB-60/WHB-100
Saline  Sichuan Kelun W220051705
Scissor Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd 18-0110
Tweezer Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd 18-1241
Vet ointment Pfizer Inc. P10015353
Xylazine Dunhua Shengda Animal Medicine Co., Ltd 070031777

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Toolan, H. W. Successful subcutaneous growth and transplantation of human tumors in X-irradiated laboratory animals. Proceedings of The Society for Experimental Biology and Medicine. 77 (3), 572-578 (1951).
  2. Gillet, J. P., et al. Redefining the relevance of established cancer cell lines to the study of mechanisms of clinical anti-cancer drug resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (46), 18708-18713 (2011).
  3. Hausser, H. J., Brenner, R. E. Phenotypic instability of Saos-2 cells in long-term culture. Biochemical & Biophysical Research Communications. 333 (1), 216-222 (2005).
  4. Pérez-Mancera, P., Guerra, C., Barbacid, M., Tuvesonet, D. A. What we have learned about pancreatic cancer from mouse models. Gastroenterology. 142 (5), 1079-1092 (2012).
  5. Bruna, A., et al. A biobank of breast cancer explants with preserved intra-tumor heterogeneity to screen anticancer compounds. Cell. 167 (1), 260-274 (2016).
  6. Choi, S., et al. Lessons from patient-derived xenografts for better in vitro modeling of human cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 79-80, 222-237 (2014).
  7. Blomme, A., et al. Murine stroma adopts a human-like metabolic phenotype in the PDX model of colorectal cancer and liver metastases. Oncogene. 37 (9), 1237-1250 (2018).
  8. Wang, D., et al. Molecular heterogeneity of non-small cell lung carcinoma patient-derived xenografts closely reflect their primary tumors. International Journal of Cancer. 140 (3), 662-673 (2016).
  9. Jung, J., et al. Generation and molecular characterization of pancreatic cancer patient-derived xenografts reveals their heterologous nature. Oncotarget. 7 (38), 62533-62546 (2016).
  10. Keysar, S., et al. A patient tumor transplant model of squamous cell cancer identifies PI3K inhibitors as candidate therapeutics in defined molecular bins. Molecular Oncology. 7 (4), 776-790 (2013).
  11. Rubio-Viqueira, B., et al. An in vivo platform for translational drug development in pancreatic cancer. Clinical Cancer Research. 12 (15), 4652-4661 (2006).
  12. Fiebig, H. H., et al. Development of three human small cell lung cancer models in nude mice. Recent Results in Cancer Research. 97, 77-86 (1985).
  13. Morelli, M. P., et al. Prioritizing phase I treatment options through preclinical testing on personalized tumorgraft. Journal of Clinical Oncology. 30 (4), 45-48 (2012).
  14. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA. 68 (6), 394-424 (2018).
  15. Onoda, N., et al. Evaluation of the 8th edition TNM classification for anaplastic thyroid carcinoma. Cancers. 12 (3), 552 (2020).
  16. Nel, C., et al. Anaplastic carcinoma of the thyroid: A clinicopathologic study of 82 cases. Mayo Clinic Proceedings. 60 (1), 51-58 (1985).
  17. Mazzaferri, E. L. Increasing incidence of thyroid cancer in the United States, 1973-2002. Yearbook of Medicine. 2007, 496-499 (2007).
  18. Kebebew, E., Greenspan, F. S., Clark, O. H., Woeber, K. A., Mcmillan, A. Anaplastic thyroid carcinoma. Treatment outcome and prognostic factors. Cancer. 103 (7), 1330-1335 (2005).
  19. Lin, B., et al. The incidence and survival analysis for anaplastic thyroid cancer: A SEER database analysis. American Journal of Translational Research. 11 (9), 5888-5896 (2019).
  20. Maniakas, A., Dadu, R., Busaidy, N. L., Wang, J. R., Zafereo, M. Evaluation of overall survival in patients with anaplastic thyroid carcinoma, 2000-2019. JAMA Oncology. 6 (9), 1397-1404 (2020).
  21. Gilardi, M., et al. Tipifarnib as a precision therapy for HRAS-mutant head and neck squamous cell carcinomas. Molecular Cancer Therapeutics. 19 (9), 1784-1796 (2020).
  22. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2016. CA. 66 (1), 7-30 (2016).
  23. Chow, L. Q. M. Head and neck cancer. New England Journal of Medicine. 382 (1), 60-72 (2020).
  24. Swiecicki, P. L., Brennan, J. R., Mierzwa, M., Spector, M. E., Brenner, J. C. Head and neck squamous cell carcinoma detection and surveillance: Advances of liquid biomarkers. Laryngoscope. 129 (8), 1836-1843 (2019).
  25. Wang, R., et al. Distribution and activity of lenvatinib in brain tumor models of human anaplastic thyroid cancer cells in severe combined immune deficient mice. Molecular Cancer Therapeutics. 18 (5), 947-956 (2019).
  26. Takahashi, S., et al. A phase II study of the safety and efficacy of lenvatinib in patients with advanced thyroid cancer. Future Oncology. 15 (7), 717-726 (2019).
  27. Ferrari, S. M., et al. Lenvatinib exhibits antineoplastic activity in anaplastic thyroid cancer in vitro and in vivo. Oncology Reports. 39 (5), 2225-2234 (2018).
  28. Cabanillas, M. E., Habra, M. A. Lenvatinib: Role in thyroid cancer and other solid tumors. Cancer Treatment Reviews. 42, 47-55 (2016).
  29. Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The generation and application of patient-derived xenograft model for cancer research. Cancer Research and Treatment. 50 (1), 1-10 (2018).
  30. Peng, S., et al. Tumor grafts derived from patients with head and neck squamous carcinoma authentically maintain the molecular and histologic characteristics of human cancers. Journal of Translational Medicine. 11, 198 (2013).
  31. Derose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).
  32. Chen, X., Shen, C., Wei, Z., Zhang, R., Xiao, K. Patient-derived non-small cell lung cancer xenograft mirrors complex tumor heterogeneity. Cancer Biology and Medicine. 18 (1), 184-198 (2021).
  33. Choi, Y. Y., et al. Establishment and characterisation of patient-derived xenografts as paraclinical models for gastric cancer. Scientific Reports. 6, 22172 (2016).
  34. Maider, I. V., Andrés, C., Alberto, B. Preclinical models for precision oncology. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. 1872 (2), 239-246 (2018).
  35. Okada, S., Vaeteewoottacharn, K., Kariya, R. Establishment of a patient-derived tumor xenograft model and application for precision cancer medicine. Chemical & Pharmaceutical Bulletin. 66 (3), 225-230 (2018).
  36. Michael, G., et al. Tumor take rate optimization for colorectal carcinoma patient-derived xenograft models. BioMed Research International. 2016, 1715053 (2016).
  37. Bernardo, C., Costa, C., Sousa, N., Amado, F., Santos, L. Patient-derived bladder cancer xenografts: a systematic review. Translational Research. 166 (4), 324-331 (2015).
  38. Facompre, N. D., et al. Barriers to generating PDX models of HPV-related head and neck. Laryngoscope. 127 (12), 2777-2783 (2017).
  39. Kang, H. N., Kim, J. H., Park, A. Y., Choi, J. W., Kim, H. R. Establishment and characterization of patient-derived xenografts as paraclinical models for head and neck cancer. BMC Cancer. 20 (1), 316 (2020).
  40. Ahn, S. H., et al. An orthotopic model of papillary thyroid carcinoma in athymic nude mice. Archives of Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 134 (2), 190-197 (2008).
  41. Nucera, C., et al. A novel orthotopic mouse model of human anaplastic thyroid carcinoma. Thyroid. 19 (10), 1077-1084 (2009).
  42. De Rose, F., et al. Galectin-3 targeting in thyroid orthotopic tumors opens new ways to characterize thyroid cancer. Journal of Nuclear Medicine. 60 (6), 770-776 (2019).
  43. Pearson, A. T., et al. Patient-derived xenograft (PDX) tumors increase growth rate with time. Oncotarget. 7 (7), 7993-8005 (2016).
  44. Huo, K. G., D'Arcangelo, E., Tsao, M. S. Patient-derived cell line, xenograft and organoid models in lung cancer therapy. Translational Lung Cancer Research. 9 (5), 2214-2232 (2020).
  45. Kumari, R., Xu, X., Li, H. Q. Translational and clinical relevance of PDX-derived organoid models in oncology drug discovery and development. Current Protocols. 2 (7), e431 (2022).
  46. Takahashi, N., et al. Construction of in vitro patient-derived tumor models to evaluate anticancer agents and cancer immunotherapy. Oncology Letters. 21 (5), 406 (2021).
  47. Barasch, A., et al. Photobiomodulation effects on head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) in an orthotopic animal model. Supportive Care in Cancer. 28 (6), 2721-2727 (2020).
  48. Wang, M., et al. Humanized mice in studying efficacy and mechanisms of PD-1-targeted cancer immunotherapy. FASEB Journal. 32 (3), 1537-1549 (2018).
  49. Wu, C., Wang, X., Shang, H., Wei, H. Construction of a humanized PBMC-PDX model to study the efficacy of a bacterial marker in lung cancer immunotherapy. Disease Markers. 2022, 1479246 (2022).
  50. Yao, L. C., et al. Creation of PDX-bearing humanized mice to study immuno-oncology. Methods in Molecular Biology. 1953, 241-252 (2019).

Tags

חקר הסרטן גיליון 196
הקמה ואפיון של מודלים של קסנוגרפט שמקורם במטופל של קרצינומה אנפלסטית של בלוטת התריס וקרצינומה של תאי קשקש בראש ובצוואר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wu, M., Liu, Y., Zhao, Y., Zhang,… More

Wu, M., Liu, Y., Zhao, Y., Zhang, Y., Huang, L., Du, Q., Zhang, T., Zhong, Z., Luo, H., Xiao, K. Establishment and Characterization of Patient-Derived Xenograft Models of Anaplastic Thyroid Carcinoma and Head and Neck Squamous Cell Carcinoma. J. Vis. Exp. (196), e64623, doi:10.3791/64623 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter