Summary
Denne protokol etablerer og karakteriserer en patientafledt xenograft (PDX) model af anaplastisk skjoldbruskkirtelkarcinom (ATC) og pladecellekarcinom i hoved og hals (HNSCC), da PDX-modeller hurtigt er ved at blive standarden inden for translationel onkologi.
Abstract
Patientafledte xenograft (PDX) modeller bevarer trofast de histologiske og genetiske egenskaber ved den primære tumor og opretholder dens heterogenitet. Farmakodynamiske resultater baseret på PDX-modeller er stærkt korreleret med klinisk praksis. Anaplastisk skjoldbruskkirtelkarcinom (ATC) er den mest ondartede undertype af kræft i skjoldbruskkirtlen med stærk invasivitet, dårlig prognose og begrænset behandling. Selvom forekomsten af ATC kun tegner sig for 2% -5% af kræft i skjoldbruskkirtlen, er dødeligheden så høj som 15% -50%. Hoved og hals pladecellekarcinom (HNSCC) er en af de mest almindelige hoved- og halsmaligniteter med over 600.000 nye tilfælde over hele verden hvert år. Heri præsenteres detaljerede protokoller for at etablere PDX-modeller af ATC og HNSCC. I dette arbejde blev nøglefaktorerne, der påvirker succesraten for modelkonstruktion, analyseret, og de histopatologiske træk blev sammenlignet mellem PDX-modellen og den primære tumor. Desuden blev modellens kliniske relevans valideret ved at evaluere in vivo terapeutisk effekt af repræsentative klinisk anvendte lægemidler i de succesfuldt konstruerede PDX-modeller.
Introduction
PDX-modellen er en dyremodel, hvor humant tumorvæv transplanteres til immundefekte mus og vokser i det miljø, som museneleverer 1. Traditionelle tumorcellelinjemodeller lider af flere ulemper, såsom manglen på heterogenitet, manglende evne til at bevare tumormikromiljøet, sårbarheden over for genetiske variationer under gentagne in vitro-passager og den dårlige kliniske anvendelse 2,3. De største ulemper ved genetisk manipulerede dyremodeller er det potentielle tab af genomiske træk ved humane tumorer, indførelsen af nye ukendte mutationer og vanskeligheden ved at identificere graden af homologi mellem musetumorer og humane tumorer4. Derudover er udarbejdelsen af gensplejsede dyremodeller dyr, tidskrævende og relativt ineffektiv4.
PDX-modellen har mange fordele i forhold til andre tumormodeller med hensyn til at afspejle tumorheterogenitet. Fra histopatologiens perspektiv, selvom musens modstykke erstatter den menneskelige stroma over tid, bevarer PDX-modellen den morfologiske struktur af den primære tumorbrønd. Derudover bevarer PDX-modellen den primære tumors metabolomiske identitet i mindst fire generationer og afspejler bedre det komplekse indbyrdes forhold mellem tumorceller og deres mikromiljø, hvilket gør den unik til simulering af vækst, metastase, angiogenese og immunosuppression af humant tumorvæv 5,6,7. På cellulært og molekylært niveau afspejler PDX-modellen nøjagtigt inter- og intratumorheterogeniteten af humane tumorer såvel som de fænotypiske og molekylære egenskaber ved oprindelig kræft, herunder genekspressionsmønstre, mutationsstatus, kopinummer og DNA-methylering og proteomics 8,9. PDX-modeller med forskellige passager har samme følsomhed over for lægemiddelterapi, hvilket indikerer, at genekspressionen af PDX-modeller er meget stabil10,11. Undersøgelser har vist en fremragende sammenhæng mellem PDX-modellens respons på et lægemiddel og patienternes kliniske respons på det pågældende lægemiddel12,13. Derfor har PDX-modellen vist sig som en stærk præklinisk og translationel forskningsmodel, især til lægemiddelscreening og klinisk prognoseforudsigelse.
Kræft i skjoldbruskkirtlen er en almindelig ondartet tumor i det endokrine system og er en menneskelig malignitet, der har vist en hurtig stigning i forekomsten i de senere år14. Anaplastisk thyreoideakarcinom (ATC) er den mest ondartede kræft i skjoldbruskkirtlen med en median patientoverlevelse på kun 4,8 måneder15. Selvom kun et mindretal af patienter med kræft i skjoldbruskkirtlen diagnosticeres med ATC hvert år i Kina, er dødeligheden tæt på 100% 16,17,18. ATC vokser normalt hurtigt og invaderer det tilstødende væv i nakken såvel som de cervikale lymfeknuder, og omkring halvdelen af patienterne har fjerne metastaser19,20. Hoved og hals pladecellekarcinom (HNSCC) er den sjette mest almindelige kræft i verden og en af de førende årsager til kræftdødsfald, med anslået 600.000 mennesker, der lider af HNSCC hvert år21,22,23. HNSCC omfatter et stort antal tumorer, herunder dem i næse, bihuler, mund, mandler, svælg og strubehoved24. ATC og HNSCC er to af de vigtigste hoved- og halsmaligniteter. For at lette udviklingen af nye terapeutiske midler og personlige behandlinger er det nødvendigt at udvikle robuste og avancerede prækliniske dyremodeller såsom PDX-modeller af ATC og HNSCC.
Denne artikel introducerer detaljerede metoder til etablering af den subkutane PDX-model af ATC og HNSCC, analyserer nøglefaktorerne, der påvirker tumorens optagelseshastighed i modelkonstruktion, og sammenligner de histopatologiske egenskaber mellem PDX-modellen og den primære tumor. I mellemtiden blev in vivo farmakodynamiske tests udført ved hjælp af de vellykkede konstruerede PDX-modeller for at validere deres kliniske relevans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care retningslinjer og protokoller godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee of West China Hospital, Sichuan University. NOD-SCID immundefekte mus i alderen 4-6 uger gamle (af begge køn) og kvindelige Balb / c nøgne mus i alderen 4-6 uger gamle blev brugt til denne undersøgelse. Dyrene blev hentet fra en kommerciel kilde (se materialetabel). Den etiske komité på West China Hospital godkendte undersøgelsen med mennesker (protokolnummer 2020353). Hver patient gav skriftligt informeret samtykke.
1. Eksperimentel forberedelse
- Arranger engangsblade, steriliseret saks og pincet og andre instrumenter, der kræves til tumortransplantation, læg dem på det ultrarene arbejdsbord og bestråle dem med ultraviolet lys på forhånd.
- Forbered sterile saltvand og petriskåle til brug under testen.
2. Erhvervelse og transport af frisk tumorvæv
- Få friske tumorprøver (normalt større end 5 mm x 5 mm i størrelse) fra operationsstuen, og læg dem i et 15 ml eller 50 ml centrifugerør indeholdende steril HTK-opløsning (se materialetabel) eller saltvand. Mærk centrifugeglassene.
BEMÆRK: Friske tumorprøver blev opnået ved kirurgisk fjernelse eller punktering fra patienter med ATC eller HNSCC. - Sæt centrifugerørene i en isboks, der er forberedt på forhånd.
BEMÆRK: I løbet af denne tid skal transplantationsoperatøren forberede de nødvendige genstande til transplantation (se materialetabel). - Sørg for, at tiden mellem prøveindsamling og transport til laboratoriet for PDX-konstruktion ikke overstiger 2 timer. Under transporten omgives rørene, der indeholder vævene, med en is-vand-blanding eller ispakker for at bevare vævsaktiviteten.
3. Tumortransplantation
- Når tumorvævene ankommer til laboratoriet, skal du registrere og omnummerere dem.
BEMÆRK: I denne undersøgelse blev patientoplysningerne holdt strengt fortrolige. De resterende trin i proceduren blev udført i et laboratorium for biosikkerhedsniveau 2 (BSL-2). Når du kommer ind i laboratoriet, anbefales det at bære en smock over arbejdstøjet eller beskyttelsesbeklædningen, en hat og en maske. Behandlingen af tumorvæv udføres i et biosikkerhedsskab. - Desinficer centrifugerørene indeholdende tumorvævene med 75% alkohol, og læg dem på operationsbordet. Overfør tumorvævene til 6 cm petriskåle fyldt med saltvand ved hjælp af steriliserede oftalmiske tang. Skær dem derefter i små stykker på ca. 2 mm x 2 mm og 3 mm x 3 mm ved hjælp af et blad.
- Overfør stykkerne af tumorvæv til en 6 cm petriskål, der indeholder den passende mængde saltvand, pakk skålen med forseglingsfilmen, læg den i en iskasse og bær den ind i det specifikke patogenfrie (SPF) dyrerum sammen med de nødvendige instrumenter (en saks, tang og podningsnåle).
- Forbered dyret ved at følge nedenstående trin.
- Fjern hårene på højre laterale brystkasse hos 4-6 uger gamle kvindelige eller mandlige NOD-SCID immundefekte mus, og desinficer huden med 75% alkohol. Bedøv musene med en intraperitoneal injektion af 80 mg / kg ketamin og 10 mg / kg xylazin (se materialetabel), og smør deres øjne med dyrlægesalve for at forhindre tørhed. Bekræft anæstesidybden via tab af pedalrefleks.
- Lav et 2 mm snit med en saks gennem huden i midten af musens højre laterale thorax.
- Tag et tumorstykke fra petriskålen, og læg det i 2,4 mm x 2,0 mm trokarnålen (se materialetabellen) med tang.
- Hold musen, stram huden på punkteringsstedet, brug trokaren, der indeholder tumorstykkerne, til at indsætte tumoren gennem det indledende 2 mm hudsnit, flyt til bagsiden af skulderen og skub trocarkernen.
- Sørg for, at tumorstykket skubbes ud og efterlades i overgangssinus dannet af trocarpunktionen, og træk derefter trokaren ud.
- Hvis tumoren bevæger sig med nålen, når den trækkes tilbage, skal du bruge trokaren til at nulstille den og sutur snittet.
BEMÆRK: I denne undersøgelse blev hver mus podet ved dorsale for- og bagben. En til tre mus blev podet pr. tumorprøve fra hver patient baseret på tumorstørrelsen.
4. Bevarelse af tumorvæv, fiksering og proteinfrysning
BEMÆRK: De resterende tumorvæv blev anvendt til frøbevarelse, fiksering og henholdsvis DNA / RNA / proteinfrysning.
- Fjern saltvand fra tumoroverfladen med en steril gasbind, inden den placeres i kryopræserveringsrøret for at sikre, at tumoroverfladen ikke er for våd.
- Sæt fire til seks stykker 2 mm x 2 mm tumorvæv i et 2 ml cellekryopræserveringsrør, tilsæt 1 ml kryopræserveringsopløsning bestående af 90% føtalt bovint serum (FBS) og 10% dimethylsulfoxid (DMSO) i røret, sæt røret i en gradientkøleboks, frys det ved -80 ° C natten over og endelig, Overfør det til flydende nitrogen.
- Anbring 3 mm x 3 mm tumorvævsblokke i 10% bufret formalin til vævsfiksering til patologisk undersøgelse.
- Sæt 3 mm x 3 mm vævsblokken i et 2 ml cellekryopræserveringsrør, frys det hurtigt i flydende nitrogen, og overfør det derefter til et -80 °C køleskab til DNA / RNA og proteinekstraktion.
- Indsaml patienternes kliniske oplysninger, såsom rygehistorie, tumorstørrelse, differentiering, patologisk subtype, kræftgrad, kræftstadium, fjern metastase, oprindelse, sygehistorie, immunhistokemi, human papillomavirus (HPV) infektion hos HNSCC-patienter og behandlingsmedicin.
5. Passaging, kryopræservering og genoplivning af PDX-modeltumorer
- Mål længden og bredden af de subkutane tumorer hos mus ved hjælp af vernierkalibre en gang om ugen, og beregn tumorvolumenet i henhold til formlen: tumorvolumen = 0,5 × længde × bredde2. Tegn tumorvækstkurven.
- Når PDX-tumoren når 2.000 mm3, skal du føre den til den næste generation af mus og udføre tumortransplantation. Udfør forberedelsen af instrumenterne efter trin 4.
- Aflive musene ved cervikal dislokation efter bedøvelse med 80 mg / kg ketamin.
- Desinficere huden med 75% alkohol. Skær derefter huden omkring tumoren ved hjælp af en saks, fjern derefter tumoren med tang og læg den i en petriskål.
- Udfør tumortransplantationsproceduren efter trin 3.
- Udfør konservering og kryopræservering af PDX-modeltumorerne efter trin 4.
- Til genoplivning af tumorvævet skal du følge princippet om langsom frysning og hurtig opløsning. Når du har taget kryoialerne ud af flydende nitrogen, anbringes de hurtigt i et vandbad ved 37 °C for hurtig opløsning.
- Ryst forsigtigt cryovialerne i vandbadet for at fremskynde optøningsprocessen.
- Optø, overfør tumorstykkerne til den forberedte normale saltvand til vask, og inokuler derefter den næste generation af mus. For den specifikke operation, se venligst vævstransplantationsproceduren i trin 3.
6. Bestemmelse af den terapeutiske virkning af lenvatinib og cisplatin i ATC PDX-modellen
BEMÆRK: ATC PDX-modellen blev brugt til at teste den terapeutiske virkning af tyrosinkinasehæmmeren lenvatinib og det kemoterapeutiske lægemiddel cisplatin25,26,27.
- Vælg P5-generations tumorvæv i en ATC PDX-model (THY-017), skær i 2-4 mm 3 vævsstykker, og pod subkutant (trin3 ) til højre bag på ti 4-6 ugers kvindelige Balb / c nøgne mus.
- Vælg 15 mus med tumorvolumener mellem 50-150 mm3, og opdel dem i tre grupper.
- Lenvatinib (10 mg/kg) administreres intragastrisk til én gruppe én gang dagligt i 15 dage, cisplatin (3 mg/kg) administreres intraperitonealt til én gruppe hver 3. dag i i alt seks doser, og kontrolgruppen administreres med samme mængde normalt saltvand.
- Mål musenes kropsvægt og tumorvolumen to gange om ugen.
- Ved afslutningen af testen skal du aflive musene (trin 5.3) og veje tumorerne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I alt 18 skjoldbruskkirtelkræftprøver blev transplanteret, og fem PDX-modeller af kræft i skjoldbruskkirtlen blev konstrueret med succes (27,8% tumoroptagelseshastighed), herunder fire tilfælde af udifferentieret skjoldbruskkirtelkræft og et tilfælde af anaplastisk skjoldbruskkirtelkræft. Sammenhængen mellem succesraten for modelkonstruktion og alder, køn, tumordiameter, tumorkvalitet og differentiering blev analyseret. Selvom modellens succesrate for grad 4 tumorprøver var højere end for prøver med lavere kvaliteter, og succesraten for udifferentierede tumorprøver også var højere end for stærkt differentierede prøver, viste korrelationsanalyseresultaterne, at disse faktorer ikke var forbundet med succesraten for PDX-modellen (tabel 1). Sytten HNSCC-prøver blev podet, og fire PDX-modeller af HNSCCC blev konstrueret med succes. Korrelationsanalysen mellem tumoroptagelseshastigheden i modelkonstruktionen og de kliniske parametre for tumorprøverne viste, at graden af differentiering var forbundet med modellens succesrate, mens alder, køn, rygehistorie, tumordiameter, kræftgrad, metastase og HPV-infektion ikke påvirkede tumoroptagelseshastigheden (tabel 2).
Tumorvækstkurverne for hver PDX-model blev plottet for bedre at forstå væksthastighederne for PDX-modellerne fra forskellige patienter (figur 1, figur 2 og tabel 3). De gennemsnitlige tumorigene cyklusser (tid fra podning til en tumorstørrelse på 1.000 mm3) af THY-004 fra generationer P0 til P5 var henholdsvis 68 dage, 87 dage, 29 dage, 34 dage, 28 dage og 26 dage. De gennemsnitlige tumorigene cyklusser af THY-012 fra generationer P0 til P5 var henholdsvis 119 dage, 61 dage, 66 dage, 55 dage, 87 dage og 116 dage. De gennemsnitlige tumorigene cyklusser af THY-017 fra generation P0 til P5 var henholdsvis 27 dage, 17 dage, 30 dage, 13 dage, 22 dage og 15 dage. De gennemsnitlige tumorigene cyklusser af THY-018 fra generationer P0 til P3 var henholdsvis 134 dage, 70 dage, 48 dage og 48 dage. De gennemsnitlige tumorigene cyklusser af THY-021 fra generationer P0 til P3 var henholdsvis 53 dage, 66 dage, 35 dage og 49 dage. De gennemsnitlige tumorigene cyklusser af OTO-017 fra generationerne P0 til P4 var henholdsvis 118 dage, 86 dage, 67 dage, 129 dage og 88 dage. De gennemsnitlige tumorigene cyklusser af OTO-022 fra generationer P0 til P5 var henholdsvis 155 dage, 55 dage, 32 dage, 37 dage, 27 dage og 46 dage. De gennemsnitlige tumorigene cyklusser af OTO-030 fra generationerne P0 til P2 var henholdsvis 133 dage, 93 dage og 104 dage. De gennemsnitlige tumorigene cyklusser af OTO-031 fra generationer P0 til P5 var henholdsvis 144 dage, 58 dage, 33 dage, 34 dage, 52 dage og 50 dage. ATC-prøverne blev stabilt overført til P3-generationen og senere, mens to tilfælde af HNSCC-prøver ikke dannede tumorer efter at have passeret til P1-generationen. Vækstraterne for nogle prøver var relativt langsomme i P0-generationen, men deres vækstrater blev accelereret efter at have passeret til P1 og senere generationer. De histopatologiske egenskaber hos patienttumorerne med dem fra forskellige generationer af PDX-modeller blev sammenlignet. Resultaterne viste, at PDX-tumorer og patientafledte primære tumorer var morfologisk næsten ens (figur 3), med små forskelle, der kan skyldes heterogeniteten i prøveudtagningsområdet mellem patienter og forskellige generationer af PDX.
Antitumoreffekten af lenvatinib (en multi-target tyrosinkinasehæmmer godkendt til behandling af fremskreden thyreoideacancer28) blev evalueret i PDX-modellen af ATC. Som vist i figur 4A hæmmede lenvatinibbehandling signifikant tumorvæksten i ATC PDX-modellen sammenlignet med den normale saltvandskontrolgruppe (P < 0,05). Ved afslutningen af eksperimentet blev tumorvævet udskåret og vejet for at bestemme tumorvægten. Sammenlignet med kontrolgruppen var tumorvægten af lenvatinibbehandlingsgruppen lavere, selvom der ikke blev opnået en statistisk forskel (figur 4B). Derudover blev der ikke observeret nogen tydelige ændringer i generel status og kropsvægt hos mus, der blev behandlet med lenvatinib (figur 4C). På grund af den overdrevne hyppighed af cisplatinadministration under forsøgene viste musene signifikant toksicitet, manifesteret ved vægttab og endda død. Cisplatins antitumoreffekt er vist i supplerende figur 1.
Figur 1: Tumorvækstkurve for ATC PDX-modeller fra forskellige patienter. Hver farve repræsenterer den angivne generation, og hver kurve repræsenterer en enkelt tumor. En til tre mus blev podet ved passage 0 (P0) generation, og fem mus blev podet i de efterfølgende passager (P1-P5). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Tumorvækstkurve for HNSCC PDX-modellerne fra forskellige patienter. Hver farve repræsenterer den angivne generation, og hver kurve repræsenterer en enkelt tumor. En til tre mus blev podet ved P0-generationen, og fem mus blev podet ved P1 og senere generationer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Histopatologisk undersøgelse. Histopatologisk sammenligning mellem patientens primære tumorer og tilsvarende PDX'er (passage 1 og passage 3) af ATC (THY-012, THY-017) og HNSCC (OTO-017) (hæmatoxylin-eosinfarvning, 100x). De patologiske undertyper af THY-012 og THY-017 var anaplastisk skjoldbruskkirtelcarcinom, og den patologiske undertype af OTO-017 var pladecellekarcinom. Skalabjælker = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Den terapeutiske effekt af lenvatinib i ATC PDX-modellen. Ændringer i (A) tumorvolumen, (B) tumorvægt og (C) kropsvægt hos ATC PDX-bærende mus efter behandling med lenvatinib (10 mg/kg). Statistiske analyser blev udført ved hjælp af T-tests for at sammenligne levatinib med kontrol. *P < 0,05 versus kontrol blev anset for at være statistisk signifikant. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Parametre | Klasse | Tumor tage sats (%) | P |
| Alder (år) | <60 | 16.67 (1/6) | 0.615 |
| ≥60 | 33.33 (4/12) | ||
| Køn | Mandlig | 16.67 (1/6) | 0.615 |
| Kvindelig | 33.33 (4/12) | ||
| Tumor diameter | <6cm | 37.50 (3/8) | 0.608 |
| ≥6cm | 20.00 (2/10) | ||
| Patologisk TNM stadium | Jeg | 0.00 (0/1) | 1 |
| Ш | 0.00 (0/1) | ||
 |
31.25 (5/16) | ||
| Differentiering | Høj | 0.00 (0/7) | 0.059 |
| Fattig | 25.00 (1/4) | ||
| Udifferentierede | 57.14 (4/7) |
Tabel 1: Korrelation mellem ATC-tumorens optagelseshastighed og patienternes kliniske egenskaber.
| Parametre | Klasse | Tumor tage sats (%) | P |
| HPV | Negativ | 33.33 (2/6) | 1 |
| Ukendt eller positiv | 36.36 (4/11) | ||
| Alder (år) | <60 | 33.33 (3/9) | 1 |
| ≥60 | 37.50 (3/8) | ||
| Køn | Mandlig | 50.00 (5/10) | 0.304 |
| Kvindelig | 14.29 (1/7) | ||
| Status som ryger | Nogensinde | 44.44 (4/9) | 0.62 |
| Aldrig | 25.00 (2/8) | ||
| Tumor diameter | <3cm | 40.00 (4/10) | 1 |
| ≥3cm | 28.57 (2/7) | ||
| Patologisk TNM stadium | Jeg | 75.00 (3/4) | 0.423 |
 |
25.00 (2/8) | ||
| Ш | 0.00 (0/1) | ||
|
33.33 (1/3) | ||
| Fjern metastase | Y | 28.57 (2/7) | 0.633 |
| N | 44.44 (4/9) | ||
| Differentiering | Høj | 12.50 (1/8) | 0.036* |
| Moderat til høj | 100.00 (2/2) | ||
| Moderat | 0.00 (0/2) | ||
| Moderat til dårlig | 66.67 (2/3) | ||
| * P < 0,05 |
Tabel 2: Korrelation mellem HNSCC tumor take rate og patienternes kliniske egenskaber. *P < 0,05.
| Eksempel navn | Generation P til P0 | Generation P0 til P1 | Generation P1 til P2 | Generation P2 til P3 | Generation P3 til P4 | Generation P4 til P5 |
| THY-004 | 68 | 87 | 29 | 34 | 28 | 26 |
| THY-012 | 119 | 61 | 66 | 55 | 87 | 116 |
| THY-017 | 27 | 17 | 30 | 13 | 22 | 15 |
| THY-018 | 134 | 70 | 48 | 48 | - | - |
| THY-021 | 53 | 66 | 35 | 49 | - | - |
| OTO-017 | 118 | 86 | 67 | 129 | - | - |
| OTO-022 | 155 | 55 | 32 | 37 | 27 | 46 |
| OTO-030 | 133 | 93 | 104 | - | - | - |
| OTO-031 | 144 | 58 | 33 | 34 | 52 | 50 |
Tabel 3: Den gennemsnitlige tumorigene cyklus (tid fra podning til en tumorstørrelse på 1.000 mm3) af ATC- og HNSCC-modellerne.
Supplerende figur 1: Den terapeutiske effekt af cisplatin i ATC PDX-modellen. Ændringer i (A) tumorvolumen, (B) tumorvægt og (C) kropsvægt hos ATC PDX-bærende mus efter behandling med cisplatin (3 mg/kg). Statistiske analyser blev udført ved hjælp af T-tests for at sammenligne cisplatin med kontrollen. *P < 0,05 versus kontrol blev anset for at være statistisk signifikant. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne undersøgelse har med succes etableret de subkutane PDX-modeller af ATC og HNSCC. Der er mange aspekter at være opmærksom på under processen med PDX-modelkonstruktion. Når tumorvævet adskilles fra patienten, skal det sættes i isboksen og sendes til laboratoriet til podning så hurtigt som muligt. Når tumoren ankommer til laboratoriet, skal operatøren være opmærksom på at opretholde et sterilt felt og øve aseptiske procedurer. For nålebiopsiprøver, fordi tumorvævet er særligt lille, ville podning efter blanding af prøven med matrixgelen være mere befordrende for etablering af modellen. Det primære tumorvæv bør også bevares, fastgøres og fryses så meget som muligt til fremtidig forskning. Under podning skal luften i trokaren udvises så meget som muligt, efter at tumorstykkerne er blevet sat i trokaren før brug. Efter tumorinokulation skal tumorvæksten observeres hos mus i 1-4 måneder, og mus uden tumorvækst i mere end 6 måneder kan aflives29.
Immundefekte mus vælges generelt som vært for PDX-modelkonstruktion29,30. Fra P0-generationen til P2-generationen anvendes generelt ikke-overvægtige diabetiker-alvorligt kompromitterede immundefekte (NOD-SCID) mus eller NOD Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl / SzJ (NSG) mus. I P3-generationen og videre anses prøverne for at være stabilt bestået, så nøgne mus kan normalt også tjene som vært, og tumorer kan også vokse normalt. Derudover var den samlede operationstid, tumorisolationstid, sygdomsfri overlevelse og samlet overlevelsesrate for patienterne, tumorens ondartede grad og den histologiske undertype alle forbundet med PDX-model tumorigenicitet31,32,33,34. Transplantationsstedet har også indflydelse på succesraten for PDX-modellering, og undersøgelser har vist, at nyrekapsel og ortotrop transplantation har en høj tumorigen hastighed33,35. Derudover kan brugen af Matrigel også forbedre den tumorigene hastighed36,37. Det er blevet rapporteret, at human papillomavirus (HPV) infektion påvirker succesraten for transplantation i HNSCC tumorer; HPV-negative tumorer har en overlegen optagelseshastighed sammenlignet med HPV-positive tumorer38,39. Denne undersøgelse nåede ikke den samme konklusion, sandsynligvis på grund af de små prøvenumre og ufuldstændige oplysninger om HPV-infektion.
Forskellig fra de ortopiske og renale kapseltransplantationsmodeller er den subkutane model mere bekvem til at observere væksten af tumorer og er også befordrende for operation40,41,42. Baseret på tumorvækstdataene fra ATC- og HNSCC PDX-modellen fandt vi, at vækstraterne for tumorer fra forskellige patienter var inkonsekvente, hvilket afspejler intertumorheterogenitet. Tumorvæksthastigheden for P0-generationen fra de fleste PDX-modeller var relativt langsommere end for de sidstnævnte passager, hvilket sandsynligvis skyldtes tilpasningen af musemikromiljøet. Især steg væksthastigheden fra nogle patientafledte tumorer i forskellige passager efter P1-generationen, i overensstemmelse med det forkortede passageinterval rapporteret af Pearson et al.43. Histopatologisk undersøgelse viste, at PDX-tumorerne bevarede de morfologiske egenskaber ved de primære tumorer. Korrelationen mellem PDX-modellen og de kliniske ATC-patienter blev også afspejlet i resultaterne af in vivo farmakodynamiske tests, som viste, at Lenvartinib udviste en god antitumoreffekt, i overensstemmelse med kliniske rapporter25,26,27.
PDX-modellen har dog også visse ulemper. For eksempel er tumordannelsestiden relativt lang, hvilket er uegnet til patienter med avancerede eller aggressive tumorer. Desuden er tids- og pengeomkostningerne ved screening af lægemidler med høj kapacitet for høje44. Faktisk ville kombinationen af PDX-modellen med tumororganoider og etablering af en patientafledt organoid (PDO) model svarende til PDX-modellen kompensere for denne mangel44,45,46. Ortopiske transplantationsmodeller kan bruges til at studere patogenese og metastatiske mekanismer af tumorer40,41,47. Manglen på et funktionelt immunsystem er en anden ulempe ved PDX-modellen, så et stigende antal eksperimenter bruger humaniserede mus til at konstruere PDX-modellen til tumorimmunologisk forskning48,49,50.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen potentielle interessekonflikter oplyses.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Sichuan-provinsens videnskabs- og teknologistøtteprogram (bevilling nr. 2019JDRC0019 og 2021ZYD0097), 1.3.5-projektet for ekspertisediscipliner, West China Hospital, Sichuan University (bevilling nr. ZYJC18026), 1.3.5-projektet for discipliner af ekspertise-klinisk forskningsinkubationsprojekt, West China Hospital, Sichuan University (bevilling nr. 2020HXFH023), grundforskningsfondene for de centrale universiteter (SCU2022D025), det internationale samarbejdsprojekt fra Chengdu Science and Technology Bureau (tilskud nr. 2022-GH02-00023-HZ), Innovation Spark-projektet fra Sichuan University (tilskud nr. 2019SCUH0015) og talentuddannelsesfonden for medicinsk ingeniørintegration af West China Hospital - University of Electronic Science and Technology (tilskud nr. HXDZ22012).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.4 mm x 2.0 mm trocar | Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd | 18-9065 | |
| Balb/c nude mice | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | 401 | |
| Biosafety cabinet | Suzhou Antai | BSC-1300IIA2 | |
| Blade | Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd | 18-0823 | |
| Centrifuge tube | Corning | 430791/430829 | |
| Cryopreservation tube | Chengdu Dianrui Experimental Instrument Co., Ltd | / | |
| Custodiol HTK-Solution | Custodiol | 2103417 | |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | SIGMA-ALORICH | D5879-500mL | |
| Electronic balance | METTLER | ME104 | |
| Electronic digital caliper | Chengdu Chengliang Tool Group Co., Ltd | 0-220 | |
| fetal bovine serum(FBS) | VivaCell | C04001-500 | |
| IBM SPSS Statistics 26 | IBM | ||
| Ketamine | Jiangsu Zhongmu Beikang Pharmaceutical Co., Ltd | 100761663 | |
| Lenvatinib | ApexBio | A2174 | |
| NOD-SCID immunodeficient mice | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | 406 | |
| Pen-Strep Solution | Biological Industries | 03-03101BCS | |
| Petri dish | WHB | WHB-60/WHB-100 | |
| Saline | Sichuan Kelun | W220051705 | |
| Scissor | Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd | 18-0110 | |
| Tweezer | Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd | 18-1241 | |
| Vet ointment | Pfizer Inc. | P10015353 | |
| Xylazine | Dunhua Shengda Animal Medicine Co., Ltd | 070031777 |
References
- Toolan, H. W. Successful subcutaneous growth and transplantation of human tumors in X-irradiated laboratory animals. Proceedings of The Society for Experimental Biology and Medicine. 77 (3), 572-578 (1951).
- Gillet, J. P., et al. Redefining the relevance of established cancer cell lines to the study of mechanisms of clinical anti-cancer drug resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (46), 18708-18713 (2011).
- Hausser, H. J., Brenner, R. E. Phenotypic instability of Saos-2 cells in long-term culture. Biochemical & Biophysical Research Communications. 333 (1), 216-222 (2005).
- Pérez-Mancera, P., Guerra, C., Barbacid, M., Tuvesonet, D. A. What we have learned about pancreatic cancer from mouse models. Gastroenterology. 142 (5), 1079-1092 (2012).
- Bruna, A., et al. A biobank of breast cancer explants with preserved intra-tumor heterogeneity to screen anticancer compounds. Cell. 167 (1), 260-274 (2016).
- Choi, S., et al. Lessons from patient-derived xenografts for better in vitro modeling of human cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 79-80, 222-237 (2014).
- Blomme, A., et al. Murine stroma adopts a human-like metabolic phenotype in the PDX model of colorectal cancer and liver metastases. Oncogene. 37 (9), 1237-1250 (2018).
- Wang, D., et al. Molecular heterogeneity of non-small cell lung carcinoma patient-derived xenografts closely reflect their primary tumors. International Journal of Cancer. 140 (3), 662-673 (2016).
- Jung, J., et al. Generation and molecular characterization of pancreatic cancer patient-derived xenografts reveals their heterologous nature. Oncotarget. 7 (38), 62533-62546 (2016).
- Keysar, S., et al. A patient tumor transplant model of squamous cell cancer identifies PI3K inhibitors as candidate therapeutics in defined molecular bins. Molecular Oncology. 7 (4), 776-790 (2013).
- Rubio-Viqueira, B., et al. An in vivo platform for translational drug development in pancreatic cancer. Clinical Cancer Research. 12 (15), 4652-4661 (2006).
- Fiebig, H. H., et al. Development of three human small cell lung cancer models in nude mice. Recent Results in Cancer Research. 97, 77-86 (1985).
- Morelli, M. P., et al. Prioritizing phase I treatment options through preclinical testing on personalized tumorgraft. Journal of Clinical Oncology. 30 (4), 45-48 (2012).
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA. 68 (6), 394-424 (2018).
- Onoda, N., et al. Evaluation of the 8th edition TNM classification for anaplastic thyroid carcinoma. Cancers. 12 (3), 552 (2020).
- Nel, C., et al. Anaplastic carcinoma of the thyroid: A clinicopathologic study of 82 cases. Mayo Clinic Proceedings. 60 (1), 51-58 (1985).
- Mazzaferri, E. L. Increasing incidence of thyroid cancer in the United States, 1973-2002. Yearbook of Medicine. 2007, 496-499 (2007).
- Kebebew, E., Greenspan, F. S., Clark, O. H., Woeber, K. A., Mcmillan, A. Anaplastic thyroid carcinoma. Treatment outcome and prognostic factors. Cancer. 103 (7), 1330-1335 (2005).
- Lin, B., et al. The incidence and survival analysis for anaplastic thyroid cancer: A SEER database analysis. American Journal of Translational Research. 11 (9), 5888-5896 (2019).
- Maniakas, A., Dadu, R., Busaidy, N. L., Wang, J. R., Zafereo, M. Evaluation of overall survival in patients with anaplastic thyroid carcinoma, 2000-2019. JAMA Oncology. 6 (9), 1397-1404 (2020).
- Gilardi, M., et al. Tipifarnib as a precision therapy for HRAS-mutant head and neck squamous cell carcinomas. Molecular Cancer Therapeutics. 19 (9), 1784-1796 (2020).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Chow, L. Q. M.
- Swiecicki, P. L., Brennan, J. R., Mierzwa, M., Spector, M. E., Brenner, J. C. Head and neck squamous cell carcinoma detection and surveillance: Advances of liquid biomarkers. Laryngoscope. 129 (8), 1836-1843 (2019).
- Wang, R., et al. Distribution and activity of lenvatinib in brain tumor models of human anaplastic thyroid cancer cells in severe combined immune deficient mice. Molecular Cancer Therapeutics. 18 (5), 947-956 (2019).
- Takahashi, S., et al. A phase II study of the safety and efficacy of lenvatinib in patients with advanced thyroid cancer. Future Oncology. 15 (7), 717-726 (2019).
- Ferrari, S. M., et al. Lenvatinib exhibits antineoplastic activity in anaplastic thyroid cancer in vitro and in vivo. Oncology Reports. 39 (5), 2225-2234 (2018).
- Cabanillas, M. E., Habra, M. A. Lenvatinib: Role in thyroid cancer and other solid tumors. Cancer Treatment Reviews. 42, 47-55 (2016).
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The generation and application of patient-derived xenograft model for cancer research. Cancer Research and Treatment. 50 (1), 1-10 (2018).
- Peng, S., et al. Tumor grafts derived from patients with head and neck squamous carcinoma authentically maintain the molecular and histologic characteristics of human cancers. Journal of Translational Medicine. 11, 198 (2013).
- Derose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Chen, X., Shen, C., Wei, Z., Zhang, R., Xiao, K. Patient-derived non-small cell lung cancer xenograft mirrors complex tumor heterogeneity. Cancer Biology and Medicine. 18 (1), 184-198 (2021).
- Choi, Y. Y., et al. Establishment and characterisation of patient-derived xenografts as paraclinical models for gastric cancer. Scientific Reports. 6, 22172 (2016).
- Maider, I. V., Andrés, C., Alberto, B. Preclinical models for precision oncology. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. 1872 (2), 239-246 (2018).
- Okada, S., Vaeteewoottacharn, K., Kariya, R. Establishment of a patient-derived tumor xenograft model and application for precision cancer medicine. Chemical & Pharmaceutical Bulletin. 66 (3), 225-230 (2018).
- Michael, G., et al. Tumor take rate optimization for colorectal carcinoma patient-derived xenograft models. BioMed Research International. 2016, 1715053 (2016).
- Bernardo, C., Costa, C., Sousa, N., Amado, F., Santos, L. Patient-derived bladder cancer xenografts: a systematic review. Translational Research. 166 (4), 324-331 (2015).
- Facompre, N. D., et al. Barriers to generating PDX models of HPV-related head and neck. Laryngoscope. 127 (12), 2777-2783 (2017).
- Kang, H. N., Kim, J. H., Park, A. Y., Choi, J. W., Kim, H. R. Establishment and characterization of patient-derived xenografts as paraclinical models for head and neck cancer. BMC Cancer. 20 (1), 316 (2020).
- Ahn, S. H., et al. An orthotopic model of papillary thyroid carcinoma in athymic nude mice. Archives of Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 134 (2), 190-197 (2008).
- Nucera, C., et al. A novel orthotopic mouse model of human anaplastic thyroid carcinoma. Thyroid. 19 (10), 1077-1084 (2009).
- De Rose, F., et al. Galectin-3 targeting in thyroid orthotopic tumors opens new ways to characterize thyroid cancer. Journal of Nuclear Medicine. 60 (6), 770-776 (2019).
- Pearson, A. T., et al. Patient-derived xenograft (PDX) tumors increase growth rate with time. Oncotarget. 7 (7), 7993-8005 (2016).
- Huo, K. G., D'Arcangelo, E., Tsao, M. S. Patient-derived cell line, xenograft and organoid models in lung cancer therapy. Translational Lung Cancer Research. 9 (5), 2214-2232 (2020).
- Kumari, R., Xu, X., Li, H. Q. Translational and clinical relevance of PDX-derived organoid models in oncology drug discovery and development. Current Protocols. 2 (7), e431 (2022).
- Takahashi, N., et al. Construction of in vitro patient-derived tumor models to evaluate anticancer agents and cancer immunotherapy. Oncology Letters. 21 (5), 406 (2021).
- Barasch, A., et al. Photobiomodulation effects on head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) in an orthotopic animal model. Supportive Care in Cancer. 28 (6), 2721-2727 (2020).
- Wang, M., et al. Humanized mice in studying efficacy and mechanisms of PD-1-targeted cancer immunotherapy. FASEB Journal. 32 (3), 1537-1549 (2018).
- Wu, C., Wang, X., Shang, H., Wei, H. Construction of a humanized PBMC-PDX model to study the efficacy of a bacterial marker in lung cancer immunotherapy. Disease Markers. 2022, 1479246 (2022).
- Yao, L. C., et al. Creation of PDX-bearing humanized mice to study immuno-oncology. Methods in Molecular Biology. 1953, 241-252 (2019).
