Summary
Detta protokoll etablerar och karakteriserar en patient-derived xenograft (PDX) modell av anaplastiskt sköldkörtelcancer (ATC) och skivepitelcancer i huvud och hals (HNSCC), eftersom PDX-modeller snabbt blir standarden inom translationell onkologi.
Abstract
Patient-derived xenograft (PDX) modeller bevarar troget de histologiska och genetiska egenskaperna hos den primära tumören och bibehåller dess heterogenitet. Farmakodynamiska resultat baserade på PDX-modeller är starkt korrelerade med klinisk praxis. Anaplastiskt sköldkörtelcancer (ATC) är den mest maligna subtypen av sköldkörtelcancer, med stark invasivitet, dålig prognos och begränsad behandling. Även om incidensen av ATC står för endast 2% -5% av sköldkörtelcancer, är dess dödlighet så hög som 15% -50%. Skivepitelcancer i huvud och hals (HNSCC) är en av de vanligaste maligniteterna i huvud och hals, med över 600 000 nya fall över hela världen varje år. Här presenteras detaljerade protokoll för att upprätta PDX-modeller av ATC och HNSCC. I detta arbete analyserades de viktigaste faktorerna som påverkar framgångsgraden för modellkonstruktion och de histopatologiska egenskaperna jämfördes mellan PDX-modellen och den primära tumören. Vidare validerades modellens kliniska relevans genom att utvärdera den terapeutiska effekten in vivo av representativa kliniskt använda läkemedel i de framgångsrikt konstruerade PDX-modellerna.
Introduction
PDX-modellen är en djurmodell där mänsklig tumörvävnad transplanteras till immunbristfälliga möss och växer i den miljö som mössen tillhandahåller1. Traditionella tumörcellinjemodeller lider av flera nackdelar, såsom bristen på heterogenitet, oförmågan att behålla tumörmikromiljön, sårbarheten för genetiska variationer under upprepade in vitro-passager och den dåliga kliniska tillämpningen 2,3. De största nackdelarna med genetiskt modifierade djurmodeller är den potentiella förlusten av de genomiska egenskaperna hos mänskliga tumörer, införandet av nya okända mutationer och svårigheten att identifiera graden av homologi mellan mustumörer och humana tumörer4. Dessutom är utarbetandet av genetiskt modifierade djurmodeller dyrt, tidskrävande och relativt ineffektivt4.
PDX-modellen har många fördelar jämfört med andra tumörmodeller när det gäller att reflektera tumörheterogenitet. Ur histopatologins perspektiv, även om musens motsvarighet ersätter det mänskliga stroma över tiden, bevarar PDX-modellen den morfologiska strukturen hos den primära tumörbrunnen. Dessutom bevarar PDX-modellen den metabolomiska identiteten hos den primära tumören i minst fyra generationer och återspeglar bättre de komplexa sambanden mellan tumörceller och deras mikromiljö, vilket gör den unik för att simulera tillväxt, metastasering, angiogenes och immunsuppression av human tumörvävnad 5,6,7. På cellulär och molekylär nivå återspeglar PDX-modellen exakt heterogeniteten mellan och intratumörer hos humana tumörer, liksom de fenotypiska och molekylära egenskaperna hos ursprunglig cancer, inklusive genuttrycksmönster, mutationsstatus, kopieringsnummer och DNA-metylering och proteomik 8,9. PDX-modeller med olika passager har samma känslighet för läkemedelsbehandling, vilket indikerar att genuttrycket av PDX-modeller är mycket stabilt10,11. Studier har visat en utmärkt korrelation mellan PDX-modellens svar på ett läkemedel och patienternas kliniska svar på det läkemedlet12,13. Därför har PDX-modellen vuxit fram som en kraftfull preklinisk och translationell forskningsmodell, särskilt för läkemedelsscreening och klinisk prognosprediktion.
Sköldkörtelcancer är en vanlig malign tumör i det endokrina systemet och är en mänsklig malignitet som har visat en snabb ökning av incidensen de senaste åren14. Anaplastiskt sköldkörtelcancer (ATC) är den mest maligna sköldkörtelcancern, med en medianpatientöverlevnad på endast 4,8 månader15. Även om endast en minoritet av sköldkörtelcancerpatienter diagnostiseras med ATC varje år i Kina, är dödligheten nära 100%16,17,18. ATC växer vanligtvis snabbt och invaderar de intilliggande vävnaderna i nacken samt livmoderhalslymfkörtlarna, och ungefär hälften av patienterna har avlägsna metastaser19,20. Skivepitelcancer i huvud och hals (HNSCC) är den sjätte vanligaste cancerformen i världen och en av de främsta orsakerna till dödsfall i cancer, med uppskattningsvis 600 000 personer som lider av HNSCC varje år21,22,23. HNSCC innehåller ett stort antal tumörer, inklusive de i näsan, bihålorna, munnen, tonsillerna, svalget och struphuvudet24. ATC och HNSCC är två av de viktigaste huvud- och nackmaligniteterna. För att underlätta utvecklingen av nya terapeutiska medel och individanpassade behandlingar är det nödvändigt att utveckla robusta och avancerade prekliniska djurmodeller såsom PDX-modeller av ATC och HNSCC.
Denna artikel introducerar detaljerade metoder för att etablera den subkutana PDX-modellen för ATC och HNSCC, analyserar de viktigaste faktorerna som påverkar tumörhastigheten i modellkonstruktionen och jämför de histopatologiska egenskaperna mellan PDX-modellen och den primära tumören. Under tiden utfördes farmakodynamiska tester in vivo med hjälp av de framgångsrikt konstruerade PDX-modellerna för att validera deras kliniska relevans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utfördes i enlighet med Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care riktlinjer och protokoll som godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee of West China Hospital, Sichuan University. NOD-SCID immunbristfälliga möss i åldern 4-6 veckor gamla (av båda könen) och kvinnliga Balb / c nakna möss i åldern 4-6 veckor gamla användes för den aktuella studien. Djuren erhölls från en kommersiell källa (se Materialförteckning). Den etiska kommittén vid West China Hospital godkände studien med försökspersoner (protokollnummer 2020353). Varje patient gav skriftligt informerat samtycke.
1. Experimentell förberedelse
- Ordna engångsblad, steriliserad sax och pincett och andra instrument som krävs för tumörtransplantation, placera dem på den ultrarena arbetsbänken och bestråla dem med ultraviolett ljus i förväg.
- Förbered sterila saltlösningar och petriskålar för användning under testet.
2. Förvärv och transport av färsk tumörvävnad
- Ta färska tumörprover (vanligtvis större än 5 mm x 5 mm) från operationssalen och placera dem i ett 15 ml eller 50 ml centrifugrör innehållande steril HTK-lösning (se materialförteckning) eller saltlösning. Märk centrifugrören.
OBS: Färska tumörprover erhölls genom kirurgiskt avlägsnande eller punktering från patienter med ATC eller HNSCC. - Lägg centrifugrören i en islåda som förberetts i förväg.
OBS: Under denna tid måste transplantationsoperatören förbereda nödvändiga föremål för transplantation (se materialförteckning). - Se till att tiden mellan provtagning och transport till laboratoriet för PDX-konstruktion inte överstiger 2 timmar. Omge rören som innehåller vävnaderna under transporten med en isvattenblandning eller isklampar för att bevara vävnadsaktiviteten.
3. Tumörtransplantation
- När tumörvävnaderna anländer till laboratoriet, registrera och numrera om dem.
OBS: För den aktuella studien hölls patientinformationen strikt konfidentiell. De återstående stegen i proceduren utfördes i ett laboratorium för biosäkerhetsnivå 2 (BSL-2). När du går in i laboratoriet rekommenderas att bära en smock över arbetskläderna eller skyddskläderna, en hatt och en mask. Behandlingen av tumörvävnad utförs i ett biosäkerhetsskåp. - Desinficera centrifugrören som innehåller tumörvävnaderna med 75% alkohol och placera dem på operationsbordet. Överför tumörvävnaderna till 6 cm petriskålar fyllda med saltlösning med steriliserade oftalmiska pincett. Skär dem sedan i små bitar på ca 2 mm x 2 mm och 3 mm x 3 mm med ett blad.
- Överför bitarna av tumörvävnader till en 6 cm petriskål som innehåller lämplig mängd saltlösning, linda skålen med tätningsfilmen, placera den i en islåda och bär den in i det specifika patogenfria (SPF) djurrummet tillsammans med nödvändiga instrument (en sax, pincett och inokuleringsnålar).
- Förbered djuret enligt stegen nedan.
- Ta bort håret på höger lateral bröstkorg på 4-6 veckor gamla kvinnliga eller manliga NOD-SCID immunbristfälliga möss och desinficera huden med 75% alkohol. Bedöva mössen genom en intraperitoneal injektion av 80 mg/kg ketamin och 10 mg/kg xylazin (se materialtabell) och smörj ögonen med veterinärsalva för att förhindra torrhet. Bekräfta anestesidjupet via förlust av pedalreflex.
- Gör ett 2 mm snitt med sax genom huden i mitten av den högra laterala bröstkorgen på möss.
- Ta en tumörbit från petriskålen och placera den i 2,4 mm x 2,0 mm trokarnålen (se materialtabell) med pincett.
- Håll musen, dra åt huden vid punkteringsstället, använd trokaren som innehåller tumörbitarna för att sätta in tumören genom det första 2 mm hudsnittet, flytta till baksidan av axeln och tryck på trokarkärnan.
- Se till att tumörstycket skjuts ut och lämnas i övergångssinus som bildas av trokarpunktionen och dra sedan ut trokaren.
- Om tumören rör sig med nålen när den dras tillbaka, använd trokaren för att återställa den och suturera snittet.
OBS: I denna studie inokulerades varje mus vid dorsala fram- och bakben. En till tre möss inokulerades per tumörprov från varje patient baserat på tumörstorleken.
4. Bevarande av tumörvävnad, fixering och proteinfrysning
OBS: De återstående tumörvävnaderna användes för frökonservering, fixering respektive DNA / RNA / proteinfrysning.
- Ta bort saltlösningen från tumörytan med en steril gasväv innan du placerar den i kryokonserveringsröret för att säkerställa att tumörytan inte är alltför våt.
- Lägg fyra till sex bitar av 2 mm x 2 mm tumörvävnad i ett 2 ml cellkryokonserveringsrör, tillsätt 1 ml kryokonserveringslösning bestående av 90% fetalt bovint serum (FBS) och 10% dimetylsulfoxid (DMSO) i röret, sätt röret i en gradientkylbox, frys den vid -80 ° C över natten och slutligen, Överför det till flytande kväve.
- Placera tumörvävnadsblocken 3 mm x 3 mm i 10% buffrat formalin för vävnadsfixering för patologisk undersökning.
- Sätt vävnadsblocket på 3 mm x 3 mm i ett kryokonserveringsrör på 2 ml celler, frys det snabbt i flytande kväve och överför det sedan till ett kylskåp på −80 °C för DNA/RNA och proteinextraktion.
- Samla in patienternas kliniska information, såsom rökhistoria, tumörstorlek, differentiering, patologisk subtyp, cancergrad, cancerstadium, avlägsen metastasering, ursprung, medicinsk historia, immunhistokemi, human papillomvirus (HPV) -infektion hos HNSCC-patienter och behandlingsmedicinering.
5. Passaging, kryokonservering och återupplivning av PDX-modelltumörer
- Mät längden och bredden på de subkutana tumörerna hos möss med hjälp av vernier-bromsok en gång i veckan och beräkna tumörvolymen enligt formeln: tumörvolym = 0,5 × längd× bredd 2. Rita tumörtillväxtkurvan.
- När PDX-tumören når 2 000 mm3, passera den till nästa generation möss och utför tumörtransplantation. Utför beredningen av instrumenten enligt steg 4.
- Avliva mössen genom cervikal dislokation efter bedövning med 80 mg/kg ketamin.
- Desinficera huden med 75% alkohol. Skär sedan huden som omger tumören med sax, ta sedan bort tumören med pincett och placera den i en petriskål.
- Utför tumörtransplantationsproceduren efter steg 3.
- Utför bevarande och kryokonservering av PDX-modellens tumörer enligt steg 4.
- För återupplivning av tumörvävnaden, följ principen om långsam frysning och snabb upplösning. När du har tagit ut kryovialerna från flytande kväve, placera dem snabbt i ett vattenbad vid 37 ° C för snabb upplösning.
- Skaka försiktigt kryovialerna i vattenbadet för att påskynda upptiningsprocessen.
- Tina, överför tumörbitarna till den beredda normala saltlösningen för tvättning och inokulera sedan nästa generation möss. För den specifika operationen, se vävnadstransplantationsproceduren i steg 3.
6. Bestämning av den terapeutiska effekten av lenvatinib och cisplatin i ATC PDX-modellen
OBS: ATC PDX-modellen användes för att testa den terapeutiska effekten av tyrosinkinashämmaren lenvatinib och det kemoterapeutiska läkemedlet cisplatin25,26,27.
- Välj P5-generationens tumörvävnad i en ATC PDX-modell (THY-017), skär i 2-4 mm 3 vävnadsbitar och inokulera subkutant (steg3 ) till höger bakom tio 4-6 veckors kvinnliga Balb / c nakna möss.
- Välj 15 möss med tumörvolymer mellan 50-150 mm3 och dela dem i tre grupper.
- Administrera lenvatinib (10 mg/kg) intragastriskt till en grupp en gång dagligen i 15 dagar, administrera cisplatin (3 mg/kg) intraperitonealt till en grupp var 3:e dag i totalt sex doser och administrera kontrollgruppen med samma volym normal saltlösning.
- Mät mössens kroppsvikt och tumörvolym två gånger per vecka.
- I slutet av testet, avliva mössen (steg 5.3) och väg tumörerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Totalt 18 sköldkörtelcancerprover transplanterades och fem PDX-modeller av sköldkörtelcancer konstruerades framgångsrikt (27,8% tumörfrekvens), inklusive fyra fall av odifferentierad sköldkörtelcancer och ett fall av anaplastisk sköldkörtelcancer. Korrelationen mellan framgångsgraden för modellkonstruktion och ålder, kön, tumördiameter, tumörkvalitet och differentiering analyserades. Även om modellens framgångsgrad för tumörprover av grad 4 var högre än för prover med lägre kvaliteter, och framgångsgraden för odifferentierade tumörprover också var högre än för mycket differentierade prover, visade korrelationsanalysresultaten att dessa faktorer inte var associerade med framgångsgraden för PDX-modellen (tabell 1). Sjutton HNSCC-prover inokulerades och fyra PDX-modeller av HNSCCC konstruerades framgångsrikt. Korrelationsanalysen mellan tumörtagningshastigheten i modellkonstruktionen och de kliniska parametrarna för tumörproverna visade att graden av differentiering var associerad med modellens framgångsgrad, medan ålder, kön, rökningshistoria, tumördiameter, cancergrad, metastaser och HPV-infektion inte påverkade tumörhastigheten (tabell 2).
Tumörtillväxtkurvorna för varje PDX-modell plottades för att bättre förstå tillväxthastigheterna för PDX-modellerna från olika patienter (figur 1, figur 2 och tabell 3). De genomsnittliga tumörframkallande cyklerna (tid från inokulering till en tumörstorlek på 1 000 mm3) av THY-004 från generationerna P0 till P5 var 68 dagar, 87 dagar, 29 dagar, 34 dagar, 28 dagar respektive 26 dagar. De genomsnittliga tumörframkallande cyklerna av THY-012 från generationerna P0 till P5 var 119 dagar, 61 dagar, 66 dagar, 55 dagar, 87 dagar respektive 116 dagar. De genomsnittliga tumörframkallande cyklerna för THY-017 från generationerna P0 till P5 var 27 dagar, 17 dagar, 30 dagar, 13 dagar, 22 dagar respektive 15 dagar. De genomsnittliga tumörframkallande cyklerna av THY-018 från generationerna P0 till P3 var 134 dagar, 70 dagar, 48 dagar respektive 48 dagar. De genomsnittliga tumörframkallande cyklerna av THY-021 från generationerna P0 till P3 var 53 dagar, 66 dagar, 35 dagar respektive 49 dagar. De genomsnittliga tumörframkallande cyklerna av OTO-017 från generationerna P0 till P4 var 118 dagar, 86 dagar, 67 dagar, 129 dagar respektive 88 dagar. De genomsnittliga tumörframkallande cyklerna av OTO-022 från generationerna P0 till P5 var 155 dagar, 55 dagar, 32 dagar, 37 dagar, 27 dagar respektive 46 dagar. De genomsnittliga tumörframkallande cyklerna av OTO-030 från generationerna P0 till P2 var 133 dagar, 93 dagar respektive 104 dagar. De genomsnittliga tumörframkallande cyklerna av OTO-031 från generationerna P0 till P5 var 144 dagar, 58 dagar, 33 dagar, 34 dagar, 52 dagar respektive 50 dagar. ATC-proverna överfördes stabilt till P3-generationen och senare, medan två fall av HNSCC-prover misslyckades med att bilda tumörer efter att ha gått över till P1-generationen. Tillväxttakten för vissa prover var relativt långsam i P0-generationen, men deras tillväxthastigheter accelererades efter att ha gått över till P1 och senare generationer. De histopatologiska egenskaperna hos patienttumörerna med de hos olika generationer av PDX-modeller jämfördes. Resultaten visade att PDX-tumörer och patient-härledda primära tumörer var morfologiskt nästan lika (Figur 3), med små skillnader som kan bero på heterogeniteten i provtagningsområdet mellan patienter och olika generationer av PDX.
Antitumöreffekten av lenvatinib (en tyrosinkinashämmare med flera mål godkänd för behandling av avancerad sköldkörtelcancer28) utvärderades i PDX-modellen av ATC. Som visas i figur 4A hämmade lenvatinibbehandling signifikant tumörtillväxten i ATC PDX-modellen jämfört med den normala saltlösningskontrollgruppen (P < 0,05). I slutet av experimentet skars tumörvävnaden ut och vägdes för att bestämma tumörvikten. Jämfört med kontrollgruppen var tumörvikten i lenvatinibbehandlingsgruppen lägre, även om en statistisk skillnad inte uppnåddes (figur 4B). Dessutom observerades inga uppenbara förändringar i allmän status och kroppsvikt hos möss som behandlades med lenvatinib (figur 4C). På grund av den överdrivna frekvensen av cisplatinadministrering under experimenten visade mössen signifikant toxicitet, manifesterad av viktminskning och jämn död. Effekten av cisplatins antitumöreffekt visas i kompletterande figur 1.
Figur 1: Tumörtillväxtkurva för ATC PDX-modeller från olika patienter. Varje färg representerar den angivna generationen, och varje kurva representerar en enda tumör. En till tre möss inokulerades vid passagegenereringen 0 (P0) och fem möss inokulerades i de efterföljande passagerna (P1-P5). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Tumörtillväxtkurva för HNSCC PDX-modellerna från olika patienter. Varje färg representerar den angivna generationen, och varje kurva representerar en enda tumör. En till tre möss inokulerades vid P0-generationen och fem möss inokulerades vid P1 och senare generationer. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Histopatologisk studie. Histopatologisk jämförelse mellan patientens primära tumörer och motsvarande PDX (passage 1 och passage 3) av ATC (THY-012, THY-017) och HNSCC (OTO-017) (hematoxylin-eosinfärgning, 100x). De patologiska subtyperna av THY-012 och THY-017 var anaplastiskt sköldkörtelcancer, och den patologiska subtypen av OTO-017 var skivepitelcancer. Skalstreck = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Den terapeutiska effekten av lenvatinib i ATC PDX-modellen. Förändringar i (A) tumörvolym, (B) tumörvikt och (C) kroppsvikt hos ATC PDX-bärande möss efter behandling med lenvatinib (10 mg/kg). Statistiska analyser utfördes med T-test för att jämföra levatinib med kontroll. *P < 0,05 jämfört med kontroll ansågs vara statistiskt signifikant. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Parametrar | Klass | Tumör ta hastighet (%) | P |
| Ålder (år) | <60 | 16.67 (1/6) | 0.615 |
| ≥60 | 33.33 (4/12) | ||
| Genus | Manlig | 16.67 (1/6) | 0.615 |
| Kvinnlig | 33.33 (4/12) | ||
| Tumör diameter | <6 cm | 37.50 (3/8) | 0.608 |
| ≥6 cm | 20.00 (2/10) | ||
| Patologiskt TNM-stadium | Jag | 0.00 (0/1) | 1 |
| Ш | 0.00 (0/1) | ||
 |
31.25 (5/16) | ||
| Differentiering | Hög | 0.00 (0/7) | 0.059 |
| Fattig | 25.00 (1/4) | ||
| Odifferentierad | 57.14 (4/7) |
Tabell 1: Korrelation mellan ATC-tumören och patienternas kliniska egenskaper.
| Parametrar | Klass | Tumör ta hastighet (%) | P |
| HPV | Negativ | 33.33 (2/6) | 1 |
| Okänd eller positiv | 36.36 (4/11) | ||
| Ålder (år) | <60 | 33.33 (3/9) | 1 |
| ≥60 | 37.50 (3/8) | ||
| Genus | Manlig | 50.00 (5/10) | 0.304 |
| Kvinnlig | 14.29 (1/7) | ||
| Rökning status | Någonsin | 44.44 (4/9) | 0.62 |
| Aldrig | 25.00 (2/8) | ||
| Tumör diameter | <3 cm | 40.00 (4/10) | 1 |
| ≥3 cm | 28.57 (2/7) | ||
| Patologiskt TNM-stadium | Jag | 75.00 (3/4) | 0.423 |
 |
25.00 (2/8) | ||
| Ш | 0.00 (0/1) | ||
|
33.33 (1/3) | ||
| Avlägsen metastasering | Y | 28.57 (2/7) | 0.633 |
| N | 44.44 (4/9) | ||
| Differentiering | Hög | 12.50 (1/8) | 0.036* |
| Måttlig till hög | 100.00 (2/2) | ||
| Moderat | 0.00 (0/2) | ||
| Måttlig till dålig | 66.67 (2/3) | ||
| * P < 0,05 |
Tabell 2: Korrelation mellan HNSCC-tumörfrekvensen och patienternas kliniska egenskaper. *P < 0,05.
| Exempel på namn | Generation P till P0 | Generation P0 till P1 | Generation P1 till P2 | Generation P2 till P3 | Generation P3 till P4 | Generation P4 till P5 |
| THY-004 | 68 | 87 | 29 | 34 | 28 | 26 |
| THY-012 | 119 | 61 | 66 | 55 | 87 | 116 |
| THY-017 | 27 | 17 | 30 | 13 | 22 | 15 |
| THY-018 | 134 | 70 | 48 | 48 | - | - |
| THY-021 | 53 | 66 | 35 | 49 | - | - |
| OTO-017 | 118 | 86 | 67 | 129 | - | - |
| OTO-022 | 155 | 55 | 32 | 37 | 27 | 46 |
| OTO-030 | 133 | 93 | 104 | - | - | - |
| OTO-031 | 144 | 58 | 33 | 34 | 52 | 50 |
Tabell 3: Den genomsnittliga tumörframkallande cykeln (tid från inokulering till en tumörstorlek på 1 000 mm3) för ATC- och HNSCC-modellerna.
Kompletterande figur 1: Den terapeutiska effekten av cisplatin i ATC PDX-modellen. Förändringar i (A) tumörvolym, (B) tumörvikt och (C) kroppsvikt hos ATC PDX-bärande möss efter behandling med cisplatin (3 mg/kg). Statistiska analyser utfördes med T-test för att jämföra cisplatin med kontrollen. *P < 0,05 jämfört med kontroll ansågs vara statistiskt signifikant. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna studie har framgångsrikt etablerat de subkutana PDX-modellerna av ATC och HNSCC. Det finns många aspekter att uppmärksamma under PDX-modellkonstruktionen. När tumörvävnaden separeras från patienten ska den läggas i isboxen och skickas till laboratoriet för inokulering så snart som möjligt. Efter att tumören anländer till laboratoriet måste operatören vara uppmärksam på att upprätthålla ett sterilt fält och öva aseptiska förfaranden. För nålbiopsiprover, eftersom tumörvävnaden är särskilt liten, skulle inokulering efter blandning av provet med matrisgelen vara mer gynnsam för att etablera modellen. Den primära tumörvävnaden bör också bevaras, fixeras och frysas så mycket som möjligt för framtida forskning. Under ympning måste luften i trokaren utvisas så mycket som möjligt efter att tumörbitarna har satts in i trokaren före användning. Efter tumörinokulering bör tumörtillväxten observeras hos möss i 1-4 månader, och möss utan tumörtillväxt i mer än 6 månader kan avlivas29.
Immunbristfälliga möss väljs i allmänhet som värd för PDX-modellkonstruktion29,30. Från P0-generationen till P2-generationen används vanligtvis icke-överviktiga diabetiker-allvarligt komprometterade immunbristmöss (NOD-SCID) eller NOD Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl / SzJ (NSG) möss. I P3-generationen och därefter anses proverna vara stabilt godkända, så nakna möss kan vanligtvis också fungera som värd, och tumörer kan också växa normalt. Dessutom var den totala operationstiden, tumörisoleringstiden, sjukdomsfri överlevnad och total överlevnad hos patienterna, tumörmalign grad och den histologiska subtypen alla associerade med PDX-modellens tumörigenicitet31,32,33,34. Transplantationsstället har också en inverkan på framgångsgraden för PDX-modellering, och studier har visat att njurkapsel och ortotrop transplantation har en hög tumörfrekvens33,35. Dessutom kan användningen av Matrigel också förbättra tumörfrekvensen36,37. Det har rapporterats att infektion med humant papillomvirus (HPV) påverkar framgångsgraden för transplantation i HNSCC-tumörer; HPV-negativa tumörer har en överlägsen take rate jämfört med HPV-positiva tumörer38,39. Denna studie nådde inte samma slutsats, förmodligen på grund av det lilla provantalet och ofullständig information om HPV-infektion.
Till skillnad från de ortotopiska och njurkapseltransplantationsmodellerna är den subkutana modellen mer lämplig för att observera tillväxten av tumörer och bidrar också till operation40,41,42. Baserat på tumörtillväxtdata från ATC- och HNSCC PDX-modellen fann vi att tillväxthastigheterna för tumörer från olika patienter var inkonsekventa, vilket återspeglar heterogenitet mellan tumörer. Tumörtillväxthastigheten för P0-generationen från de flesta PDX-modeller var relativt långsammare än för de senare passagerna, vilket sannolikt berodde på anpassningen av musmikromiljön. I synnerhet ökade tillväxthastigheten från vissa patienthärledda tumörer i olika passager efter P1-generationen, i överensstämmelse med det förkortade passageintervallet som rapporterats av Pearson et al.43. Histopatologisk undersökning visade att PDX-tumörerna behöll de morfologiska egenskaperna hos de primära tumörerna. Korrelationen mellan PDX-modellen och de kliniska ATC-patienterna återspeglades också i resultaten av de farmakodynamiska in vivo-testerna, som visade att Lenvartinib uppvisade en god antitumöreffekt, i överensstämmelse med kliniska rapporter25,26,27.
PDX-modellen har emellertid också vissa nackdelar. Till exempel är tumörbildningstiden relativt lång, vilket är olämpligt för patienter med avancerade eller aggressiva tumörer. Dessutom är tids- och penningkostnaderna för läkemedelsscreening med hög kapacitet för höga44. Att kombinera PDX-modellen med tumörorganoider och etablera en patient-härledd organoidmodell (PDO) motsvarande PDX-modellen skulle faktiskt kompensera för denna brist44,45,46. Ortotopiska transplantationsmodeller kan användas för att studera patogenes och metastatiska mekanismer hos tumörer40,41,47. Bristen på ett funktionellt immunförsvar är en annan nackdel med PDX-modellen, så allt fler experiment använder humaniserade möss för att konstruera PDX-modellen för tumörimmunologisk forskning48,49,50.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga potentiella intressekonflikter avslöjas.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Sichuanprovinsens vetenskapliga och tekniska stödprogram (bidrag nr 2019JDRC0019 och 2021ZYD0097), 1.3.5-projektet för spetskompetensdiscipliner, West China Hospital, Sichuan University (bidrag nr ZYJC18026), 1.3.5-projektet för discipliner av excellens-Clinical Research Incubation Project, West China Hospital, Sichuan University (bidrag nr 2020HXFH023), de grundläggande forskningsfonderna för de centrala universiteten (SCU2022D025), det internationella samarbetsprojektet från Chengdu Science and Technology Bureau (bidragsnummer 2022-GH02-00023-HZ), Innovation Spark-projektet vid Sichuan University (bidragsnummer 2019SCUH0015) och Talent Training Fund for Medical-engineering Integration of West China Hospital - University of Electronic Science and Technology (bidrag nr. HXDZ22012).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.4 mm x 2.0 mm trocar | Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd | 18-9065 | |
| Balb/c nude mice | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | 401 | |
| Biosafety cabinet | Suzhou Antai | BSC-1300IIA2 | |
| Blade | Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd | 18-0823 | |
| Centrifuge tube | Corning | 430791/430829 | |
| Cryopreservation tube | Chengdu Dianrui Experimental Instrument Co., Ltd | / | |
| Custodiol HTK-Solution | Custodiol | 2103417 | |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | SIGMA-ALORICH | D5879-500mL | |
| Electronic balance | METTLER | ME104 | |
| Electronic digital caliper | Chengdu Chengliang Tool Group Co., Ltd | 0-220 | |
| fetal bovine serum(FBS) | VivaCell | C04001-500 | |
| IBM SPSS Statistics 26 | IBM | ||
| Ketamine | Jiangsu Zhongmu Beikang Pharmaceutical Co., Ltd | 100761663 | |
| Lenvatinib | ApexBio | A2174 | |
| NOD-SCID immunodeficient mice | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | 406 | |
| Pen-Strep Solution | Biological Industries | 03-03101BCS | |
| Petri dish | WHB | WHB-60/WHB-100 | |
| Saline | Sichuan Kelun | W220051705 | |
| Scissor | Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd | 18-0110 | |
| Tweezer | Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd | 18-1241 | |
| Vet ointment | Pfizer Inc. | P10015353 | |
| Xylazine | Dunhua Shengda Animal Medicine Co., Ltd | 070031777 |
References
- Toolan, H. W. Successful subcutaneous growth and transplantation of human tumors in X-irradiated laboratory animals. Proceedings of The Society for Experimental Biology and Medicine. 77 (3), 572-578 (1951).
- Gillet, J. P., et al. Redefining the relevance of established cancer cell lines to the study of mechanisms of clinical anti-cancer drug resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (46), 18708-18713 (2011).
- Hausser, H. J., Brenner, R. E. Phenotypic instability of Saos-2 cells in long-term culture. Biochemical & Biophysical Research Communications. 333 (1), 216-222 (2005).
- Pérez-Mancera, P., Guerra, C., Barbacid, M., Tuvesonet, D. A. What we have learned about pancreatic cancer from mouse models. Gastroenterology. 142 (5), 1079-1092 (2012).
- Bruna, A., et al. A biobank of breast cancer explants with preserved intra-tumor heterogeneity to screen anticancer compounds. Cell. 167 (1), 260-274 (2016).
- Choi, S., et al. Lessons from patient-derived xenografts for better in vitro modeling of human cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 79-80, 222-237 (2014).
- Blomme, A., et al. Murine stroma adopts a human-like metabolic phenotype in the PDX model of colorectal cancer and liver metastases. Oncogene. 37 (9), 1237-1250 (2018).
- Wang, D., et al. Molecular heterogeneity of non-small cell lung carcinoma patient-derived xenografts closely reflect their primary tumors. International Journal of Cancer. 140 (3), 662-673 (2016).
- Jung, J., et al. Generation and molecular characterization of pancreatic cancer patient-derived xenografts reveals their heterologous nature. Oncotarget. 7 (38), 62533-62546 (2016).
- Keysar, S., et al. A patient tumor transplant model of squamous cell cancer identifies PI3K inhibitors as candidate therapeutics in defined molecular bins. Molecular Oncology. 7 (4), 776-790 (2013).
- Rubio-Viqueira, B., et al. An in vivo platform for translational drug development in pancreatic cancer. Clinical Cancer Research. 12 (15), 4652-4661 (2006).
- Fiebig, H. H., et al. Development of three human small cell lung cancer models in nude mice. Recent Results in Cancer Research. 97, 77-86 (1985).
- Morelli, M. P., et al. Prioritizing phase I treatment options through preclinical testing on personalized tumorgraft. Journal of Clinical Oncology. 30 (4), 45-48 (2012).
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA. 68 (6), 394-424 (2018).
- Onoda, N., et al. Evaluation of the 8th edition TNM classification for anaplastic thyroid carcinoma. Cancers. 12 (3), 552 (2020).
- Nel, C., et al. Anaplastic carcinoma of the thyroid: A clinicopathologic study of 82 cases. Mayo Clinic Proceedings. 60 (1), 51-58 (1985).
- Mazzaferri, E. L. Increasing incidence of thyroid cancer in the United States, 1973-2002. Yearbook of Medicine. 2007, 496-499 (2007).
- Kebebew, E., Greenspan, F. S., Clark, O. H., Woeber, K. A., Mcmillan, A. Anaplastic thyroid carcinoma. Treatment outcome and prognostic factors. Cancer. 103 (7), 1330-1335 (2005).
- Lin, B., et al. The incidence and survival analysis for anaplastic thyroid cancer: A SEER database analysis. American Journal of Translational Research. 11 (9), 5888-5896 (2019).
- Maniakas, A., Dadu, R., Busaidy, N. L., Wang, J. R., Zafereo, M. Evaluation of overall survival in patients with anaplastic thyroid carcinoma, 2000-2019. JAMA Oncology. 6 (9), 1397-1404 (2020).
- Gilardi, M., et al. Tipifarnib as a precision therapy for HRAS-mutant head and neck squamous cell carcinomas. Molecular Cancer Therapeutics. 19 (9), 1784-1796 (2020).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Chow, L. Q. M.
- Swiecicki, P. L., Brennan, J. R., Mierzwa, M., Spector, M. E., Brenner, J. C. Head and neck squamous cell carcinoma detection and surveillance: Advances of liquid biomarkers. Laryngoscope. 129 (8), 1836-1843 (2019).
- Wang, R., et al. Distribution and activity of lenvatinib in brain tumor models of human anaplastic thyroid cancer cells in severe combined immune deficient mice. Molecular Cancer Therapeutics. 18 (5), 947-956 (2019).
- Takahashi, S., et al. A phase II study of the safety and efficacy of lenvatinib in patients with advanced thyroid cancer. Future Oncology. 15 (7), 717-726 (2019).
- Ferrari, S. M., et al. Lenvatinib exhibits antineoplastic activity in anaplastic thyroid cancer in vitro and in vivo. Oncology Reports. 39 (5), 2225-2234 (2018).
- Cabanillas, M. E., Habra, M. A. Lenvatinib: Role in thyroid cancer and other solid tumors. Cancer Treatment Reviews. 42, 47-55 (2016).
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The generation and application of patient-derived xenograft model for cancer research. Cancer Research and Treatment. 50 (1), 1-10 (2018).
- Peng, S., et al. Tumor grafts derived from patients with head and neck squamous carcinoma authentically maintain the molecular and histologic characteristics of human cancers. Journal of Translational Medicine. 11, 198 (2013).
- Derose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Chen, X., Shen, C., Wei, Z., Zhang, R., Xiao, K. Patient-derived non-small cell lung cancer xenograft mirrors complex tumor heterogeneity. Cancer Biology and Medicine. 18 (1), 184-198 (2021).
- Choi, Y. Y., et al. Establishment and characterisation of patient-derived xenografts as paraclinical models for gastric cancer. Scientific Reports. 6, 22172 (2016).
- Maider, I. V., Andrés, C., Alberto, B. Preclinical models for precision oncology. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. 1872 (2), 239-246 (2018).
- Okada, S., Vaeteewoottacharn, K., Kariya, R. Establishment of a patient-derived tumor xenograft model and application for precision cancer medicine. Chemical & Pharmaceutical Bulletin. 66 (3), 225-230 (2018).
- Michael, G., et al. Tumor take rate optimization for colorectal carcinoma patient-derived xenograft models. BioMed Research International. 2016, 1715053 (2016).
- Bernardo, C., Costa, C., Sousa, N., Amado, F., Santos, L. Patient-derived bladder cancer xenografts: a systematic review. Translational Research. 166 (4), 324-331 (2015).
- Facompre, N. D., et al. Barriers to generating PDX models of HPV-related head and neck. Laryngoscope. 127 (12), 2777-2783 (2017).
- Kang, H. N., Kim, J. H., Park, A. Y., Choi, J. W., Kim, H. R. Establishment and characterization of patient-derived xenografts as paraclinical models for head and neck cancer. BMC Cancer. 20 (1), 316 (2020).
- Ahn, S. H., et al. An orthotopic model of papillary thyroid carcinoma in athymic nude mice. Archives of Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 134 (2), 190-197 (2008).
- Nucera, C., et al. A novel orthotopic mouse model of human anaplastic thyroid carcinoma. Thyroid. 19 (10), 1077-1084 (2009).
- De Rose, F., et al. Galectin-3 targeting in thyroid orthotopic tumors opens new ways to characterize thyroid cancer. Journal of Nuclear Medicine. 60 (6), 770-776 (2019).
- Pearson, A. T., et al. Patient-derived xenograft (PDX) tumors increase growth rate with time. Oncotarget. 7 (7), 7993-8005 (2016).
- Huo, K. G., D'Arcangelo, E., Tsao, M. S. Patient-derived cell line, xenograft and organoid models in lung cancer therapy. Translational Lung Cancer Research. 9 (5), 2214-2232 (2020).
- Kumari, R., Xu, X., Li, H. Q. Translational and clinical relevance of PDX-derived organoid models in oncology drug discovery and development. Current Protocols. 2 (7), e431 (2022).
- Takahashi, N., et al. Construction of in vitro patient-derived tumor models to evaluate anticancer agents and cancer immunotherapy. Oncology Letters. 21 (5), 406 (2021).
- Barasch, A., et al. Photobiomodulation effects on head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) in an orthotopic animal model. Supportive Care in Cancer. 28 (6), 2721-2727 (2020).
- Wang, M., et al. Humanized mice in studying efficacy and mechanisms of PD-1-targeted cancer immunotherapy. FASEB Journal. 32 (3), 1537-1549 (2018).
- Wu, C., Wang, X., Shang, H., Wei, H. Construction of a humanized PBMC-PDX model to study the efficacy of a bacterial marker in lung cancer immunotherapy. Disease Markers. 2022, 1479246 (2022).
- Yao, L. C., et al. Creation of PDX-bearing humanized mice to study immuno-oncology. Methods in Molecular Biology. 1953, 241-252 (2019).
